KR20090037212A

KR20090037212A - Ｄｎａ-메틸전이효소-3ｂ를 이용한 류마티스 관절염 예후진단용 마커 및 이를 이용한 류마티스 관절염 중증도 예측및 판단 방법

Info

Publication number: KR20090037212A
Application number: KR1020070102741A
Authority: KR
Inventors: 강영모; 남언정; 박재용
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2007-10-11
Publication date: 2009-04-15
Also published as: KR100937144B1

Abstract

본 발명은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis) 예후 진단용 마커 및 이를 이용한 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 DNA-메틸전이효소-3B(DNMT3B) 유전자의 다형성에 근거한 류마티스 관절염 예후 진단용 마커, 이를 이용한 류마티스 관절염 예후 진단키트, 마이크로어레이 및 류마티스 관절염에 대한 유전적 중증도를 예측 및 판단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 류마티스 관절염 예후 진단용 마커 및 이를 이용한 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단하는 방법은 류마티스 관절염의 관절파괴위험도가 높은 유전자형을 밝혀 류마티스 관절염 중증도가 높은 환자를 용이하게 진단하고 이를 예방할 수 있는 효과가 있다.

류마티스 관절염, 다형성, DNA-메틸전이효소-3B

Description

ＤＮＡ-메틸전이효소-3Ｂ를 이용한 류마티스 관절염 예후 진단용 마커 및 이를 이용한 류마티스 관절염 중증도 예측 및 판단 방법{Makers for the diagnosis of prognosis of rheumatoid arthritis using DNMT3B gene and method for predicting severity and analyzing prognosis of rheumatoid arthritis using the same}

본 발명은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)의 예후 진단용 마커 및 이를 이용한 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단하는 방법에 관한 것이다.

류마티스 관절염(rheumatoid arthritis, RA)은 관절을 포함한 전신에 만성 염증을 일으키는 자가 면역성 질환으로, 남성보다 여성에게 더 많이 발병하고 있고, 그 원인에 대해서는 아직까지 명확하게 밝혀진 것이 없으며, 다만 유전적 요인과 환경적 요인 등에 의해 유발되는 것으로 추측되고 있을 뿐이다. 따라서 류마티스 관절염의 발병원인을 밝히기 위한 많은 연구들이 진행되고 있으며, 최근 들어 유전적인 인자가 류마티스 관절염의 감수성 및 예후 진단에 중요한 역할을 하며, 전반적인 면역 반응에 걸친 후생유전적(epigenetic) 제어의 불균형이 류마티스 관절염을 포함한 자가면역 질환을 일으킨다는 내용이 보고된 바 있다(Richardson B. et al., Clin Immunol, 109, 72-79, 2003).

또한, DNA의 메틸화(methylation) 현상은 후생유전적 메카니즘의 주된 형태로서, 염색질(chromatin) 구조의 변형을 통해 유전자 발현을 억제하고(Herman JG., N. Engl . J. Med., 349, 2042-54, 2003), 이러한 DNA의 메틸화가 류마티스 관절염의 발병에 중요한 역할을 하는 것이 밝혀졌으며, 특히, 류마티스 관절염 샘플로부터 분리된 T 세포의 게놈 DNA가 저메틸화가 되어 있고, DNA 메틸전이효소(DNMT) 의 활성이 감소되었다는 내용이 보고된 바 있으며(Richardson B. et al., Arthritis Rheum, 33, 1665-1673, 1990), 류마티스 관절염이 DNA 메틸화와 연관성이 있다는 내용이 보고된 바 있다(Kim YI. et al., J. Lab. Clin . Med ., 128, 165-172, 1996).

그러나 이와 같은 류마티스 관절염의 발병 원인 및 기전에 대한 많은 연구와 그 결과를 이용한 다양한 신약개발에도 불구하고 아직까지 완치에 이르게 하는 치료제는 개발되어 있지 않은 상태이다. 따라서 류마티스 관절염이 진단되었을 때 질병의 진행에 따른 관절파괴의 중증도를 예측하는 것은 장기 치료에 따른 계획을 수립하고 치료 약제를 선정하는데 있어 매우 중요한 사안이다. 이전의 연구에서 규명되어 있는 항-CCP 항체, 조직적합성 항원인 HLA-DR4, 류마티스 인자 등이 예후 예측에 이용되어 왔으나 이들 만으로는 정확한 예후 예측이 아직 어려운 실정이다.

현재까지 류마티스 관절염에 대한 진단은 미국 관절염 학회의 진단 기준을 따르고 있으며 객관적인 지표로서의 류마티스 인자의 존재는 그 양성율이 3개월 이내에서 33%, 12개월 이상에 있어서도 88% 정도일 뿐, 확실하게 진단하는데는 이르지 못하고 있다. 치료 방법으로는 관절의 손상을 최소화하고, 기능 손실을 방지하며 통증을 줄이기 위하여 일반적으로 진통소염제를 다양한 항류마티스제제(DMARD)와 병합 투여하는 약물치료 방법이 사용되고 있고, 최근에는 생물학적 치료제가 개발되어 항 류마티스약제와 함께 병용치료로 이용되고 있으며, 질병의 중증도가 심각한 경우에는 수술요법이 시행되고 있다. 그러나 이와 같은 치료 방법은 상당히 뛰어난 효과에도 불구하고 관절변형이 지속될 수 있고 약제 부작용으로 적절한 치료가 어려운 경우도 있으며, 신약개발 비용에 따른 약가상승으로 많은 비용이 드는 단점이 있기 때문에 류마티스 관절염의 예후 및 중증도를 적절히 진단 및 예측할 수 있는 방법들의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 최근 완성된 인간 유전자 지도를 바탕으로 유전자의 다형성이 개개인의 외모, 지능, 성격 등을 결정할 뿐만 아니라 질병에 대한 감수성과 질병이 발생한 후 중증도와 진행속도 등을 결정할 것으로 예상되며, 인간 개개인의 특성이 다양한 만큼 그 특성을 결정하는 유전인자도 매우 다양할 것으로 예상된다. 일반적으로 개체간의 유전적 차이는 개체간의 DNA 염기서열의 차이에 의해 초래되고 이러한 염기서열의 차이는 변이(mutation)와 다형성(polymorphism)으로 구분되는데, 다형성은 미세한 표현형의 차이(phenotypic change)를 초래하며 그 빈도가 인구의 1% 이상인 경우 다형성 유전형으로 정의된다.

단일염기다형성(SNP: single nucleotide polymorphism)은 유전체(genome) 상에서 A,T,C,G 로 구성되는 염기서열의 한 개가 다른 염기서열로 변한 것을 말한다. 이러한 SNP의 2/3는 염기서열 중 C 와 T 간의 변이인 것으로 알려져 있고, SNP 변이는 보통 유전체상의 염기서열에서 1000개당 한번 꼴로 나타난다고 알려져 있다. 또한 SNP는 인간의 유전체에서 발생하는 변이의 약 90%를 차지하고 있고, 비슷한 형질이나 같은 가계도를 가지고 있는 사람들은 동일하거나 또는 비슷한 SNP 패턴을 보이기 때문에 임상에서 개체의 질병에 대한 감수성(susceptibility)을 예측하는 지표로 사용될 수 있고, 약물에 대한 효과 및 부작용을 예측할 수 있는 지표로 사용될 수 있을 것이다. 나아가 개체의 유전적 특성에 적합한 진단 및 치료전략을 구사하는 맞춤의학(personalized medicine)에 이용될 수 있고, SNP 패턴과 질병기록을 잘 통합할 수 있다면 여러 가지 질병의 치료를 위한 의료 통계를 구축할 수 있을 것이다.

따라서 최근 들어 이러한 유전자의 다형성을 이용한 질병들에 대한 감수성을 예측하고 진단하는 방법들이 개발되고 있으며, 특히 류마티스 관절염과 관련된 유전자의 다형성과 류마티스 관절염과의 연관성에 대한 연구들이 활발히 진행되고 있다. 이와 관련된 종래 기술로는 대표적인 체내효소인 GST(Glutathione S-transferase) M1 유전자의 다형성이 류마티스 관절염의 발생에 감수성과 연관성이 있다는 내용이 개시된 바 있고(윤보라 등, 대한류마티스학회지, 10(3):243- 252, 2003), 류마티스 관절염의 관절파괴가 진행되는 과정에 형질전환 성장인자 베타 1(TGF-β1)의 유전자 다형성이 중요한 역할을 한다는 것이 규명된 바 있으며(Kim. SH et al., Scand J Rheumatology, 33: 389-394, 2004), 혈관신생에 핵심적인 역할을 하는 혈관내피세포 성장인자(VEGF) 유전자의 다형성이 류마티스 관절염의 발병에 관여하고 있다는 내용이 개시된 바 있다(Han SW, Rheumatology, 43: 1173-1177, 2004).

그러나 종래의 류마티스 관절염과 관련된 유전자의 다형성들은 질환에 대한 감수성을 진단하고 예측하기 위한 용도로 사용하는데 있어서 그 효율이 매우 낮은 단점이 있으며, 또한 류마티스 관절염에 대한 유전적 감수성은 여러 유전자들의 다형성들이 관여하고 있기 때문에 종래의 류마티스 관절염과 관련된 유전자의 다형성 이 외에도 새로운 유전자의 다형성 발굴이 필요하다.

이에 본 발명자들은 DNA의 메틸화를 매개하는 DNA 메틸전이효소 3B(DNA methyltransferase 3B, 이하“DNMT3B”이라고 함) 유전자의 다형성과 한국인에서의 류마티스 관절염 발생 위험도 및 관절파괴의 진행속도와의 상관관계를 조사한 결과, 본 발명의 DNMT3B 유전자 다형성이 한국인에서 류마티스 관절염의 관절파괴와 같은 질병예후를 결정하는 유전적 인자로 작용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 DNMT3B 유전자의 다형성 부위를 포함하는 류마티스 관절염 예후 진단용 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 DNMT3B 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 류마티스 관절염 예후 진단용 키트 및 류마티스 관절염 예후 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 류마티스 관절염 예후 진단용 마커를 이용한 류마티스 관절염의 중증도를 예측 및 판단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 DNMT3B 유전자의 다형성 부위를 포함하는 류마티스 예후 진단용 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 DNMT3B 유전자의 다형성 부위와 혼성화 할 수 있거나 증폭할 수 있는 류마티스 관절염 예후 진단용 키트 및 류마티스 관절염 예후 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 류마티스 관절염 예후 진단용 마커를 이용한 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단하는 방법을 제공한다.

본 발명은 DNA-메틸전이효소-3B(DNMT3B) 유전자의 다형성 부위를 포함하는 류마티스 관절염 예후 진단용 마커를 제공함에 특징이 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 10 - 200개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 류마티스 관절염 예후 진단용 마커를 제공한다. 본 발명에서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 연속적인 뉴클레오티드, 바람직하게는 50 - 100개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형은 CC, CT 또는 TT일 수 있다.

한편, 본 발명에서 사용된 상기 DNA-메틸전이효소-3B(DNMT3B) 유전자의 다형성 부위는 ‘-283C/T'로 표시하였고, 이는 DNMT3B 유전자(진뱅크 번호: NT_028392)의 엑손 1A 전사(transcription) 시작점으로부터 -283번째 염기에 해당하며, 상기 다형성 부위를 포함하고 있는 DNMT3B 유전자의 염기서열을 서열번호 1에 기재하였다 .

또한, 본 발명에서 사용된 상기 “진단”이라는 용어는 질병 예후의 예측 및 질병 중증도를 결정하거나 도출시키는데 사용되는 모든 유형의 분석을 포함하며, 상기 “예후(prognosis)”라는 용어는 류마티스 관절염에 의한 관절파괴의 진행속도, 즉, 류마티스 관절염의 중증도의 증가 및 감소를 나타낸다. 그리고 본 발명에 서 사용된 “다형성(polymorphism)”이란 용어는 유전학적으로 결정된 집단 내에서 2 이상의 대체적 서열 또는 대체적 대립형질의 발생을 의미한다.

본 발명에서 사용된 상기 DNA-메틸전이효소-3B(DNMT3B) 유전자는 염색체 안정성 및 유전자 발현을 조절하는 주된 후생유전적 기작중의 하나인 DNA 메틸화(DNA methylation)를 매개하는 유전자이다(Jones, P.A. et al., Nat. Genet. 21, 163-167, 1999; 및 Baylin, S.B. et al., Trends Genet. 16, 168-174., 2000). DNA 메틸화는 DNA 메틸전이효소 (DNA methyltransferases, DNMTs)에 의해 매개되는데, 세 종류의 DNMTs (DNMT1, DNMT3A 및 DNMT3B)가 인간으로부터 동정된 바 있다(Yen, R.W., et al., Nucleic Acids Res., 20, 2287-2291, 1992; Xie, S., et al., Gene, 236, 87-95, 1999; 및 Bestor, T.H., Human Mol . Genet., 9, 2395-2402, 2000). 이러한 DNMT 유전자들은 다양한 인간 암종에서 과발현되고 있으며(Robertson, K.D., et al., Nucleic Acids Res., 27, 2291-2298, 1999), 특히, DNMT3B 유전자는 비메틸화된 CpG 부분을 de nove 메틸화시키며 DNMT1과 함께 메틸화를 유지시키는 역할을 하는 것으로 밝혀졌고(Liang G. et al., Mol Cell Biol., 22,480-91, 2002; Okano M., Nat Genet., 19, 219-20, 1998), 쉔 등은 비-히스패닉계 백인들에서 DNMT3B 유전자의 46359C>T 다형성이 폐암 발생 위험도와의 관계에 있어서 46369 CT 유전자형이 46359 CC 유전자형에 비해 폐암 발생 위험도가 높다고 보고된 바 있다(Shen, H., et al., Cancer Res., 62, 4992-4995, 2002). 그러나 아직까지 DNMT3B의 다형성과 류마티스 관절염과의 연관성에 관한 연구는 보고된 바 없다.

따라서 본 발명자들은 류마티스 관절염에 있어서 관절파괴 위험도를 예측하기 위한 표적 유전자로 DNA 메틸화와 연관성이 있는 DNMT3B 유전자를 선택하였고, 상기 DNMT3B 유전자의 다형성 부위가 면역 시스템, 류마티스 관절염의 진행속도 및 위험도와 상관성이 있을 것이라고 추정하였다.

이에 본 발명자들은 새로운 한국인의 류마티스 관절염 예후 진단용 마커를 발굴하기 위하여 DNMT3B 유전자의 -283C/T 다형성이 류마티스 관절염의 발생 위험도 및 예후와 상관관계를 가지고 있는지 조사하였다. 이를 위하여, 먼저 309명의 류마티스 관절염 환자와 대조군으로는 297명의 건강한 성인을 선출하였고(실시예 1 참조), 이들로부터 DNA를 각각 추출한 후, DNMT3B 유전자의 전사시작점으로부터 -283번째 염기, 즉, 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 얻기 위하여 DNMT3B 유전자의 염기서열을 기초로 하여 제작한 프라이머들을 가지고 PCR을 수행한 후, 실시간-시퀀싱 분석 및 통계 분석을 통해 DNMT3B의 -283C/T 다형성의 유전자형을 분석하였다(실시예 2 및 3 참조).

그 결과, DNMT3B의 -283C/T 다형성의 유전자형은 환자군에서 CC형, CT형 및 TT형이 각각 243명(78.6%), 64명(20.7%) 및 2명(0.6%)인 것으로 나타났고, 대조군에서는 CC형, CT형 및 TT형이 각각 251명(84.5%), 45명(15.2%) 및 1명(0.3%)인 것으로 나타났다(표 1 참조). 따라서 환자군 및 대조군에서 DNMT3B의 -283C/T 다형성 의 유전자형 빈도는 모두 CC > CT > TT의 순서로 같은 양상을 보이고 있어 유의한 차이를 나타내지 않았다. 그러나 T 대립유전자의 빈도는 환자군에서 11%, 대조군에서는 8%를 보이고 있어, T 대립유전자의 빈도는 환자군에서 더 높게 나타났지만 통계적 유의성은 없었다(p=0.077).

또한, 본 발명자들은 DNMT3B의 -283C/T 다형성이 류마티스 관절염의 진행 속도와 어떠한 상관관계가 있는지 조사하기 위하여, 류마티스 관절염 환자들 중 142명을 대상으로 이들 각각의 -283C/T 다형성의 유전자형(CC, CT 및 TT)에 대한 선형 회귀선(linear regression line) 분석을 수행하였다(실시예 3 참조).

그 결과, DNMT3B 유전자의 -283C/T 다형성은 류마티스 관절염의 진행 속도와 상관관계에 있어서 유의성이 있는 것으로 나타났다(T 대립유전자에 대한 y=9.546χ+ 19.998, p<0.001 이며, CC형에 대한 y=6.185χ+ 34.424, p<0.001). 즉, 적어도 하나의 T 대립유전자를 가지고 있는 회귀선 기울기는 9.546으로써, 이는 CC형(p=0.014)의 기울기보다 월등히 높은 것으로 나타났다(도 1 참조). 따라서 류마티스 관절염의 진행속도는 T 대립유전자를 가지고 있는 환자가 CC형의 유전자형을 가지고 있는 환자에 비해 훨씬 빠르게 진행하고 있음을 알 수 있었다.

이에 본 발명자들은 상기의 결과로부터, DNMT3B의 -283번째 염기, 즉 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형이 적어도 하나의 T 대립유전자를 가진 CT 및 TT일 경우, CC일 경우일 때 보다 류마티스 관절염의 위험도가 증가한다 는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 마커가 류마티스 관절염의 중증도를 예측 및 판단하는데 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 류마티스 관절염 예후 진단용 키트를 제공한다.

상기 진단용 키트에는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라, 중합 반응에 필요한 시약, 예를 들면 dNTP, 각 종의 중합효소 및 발색제 등을 포함할 수 있다.

상기 “증폭할 수 있는 프라이머”란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서 상기 프라이머로는 바람직하게 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 프라이머 일 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 10 - 200개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 류마티스 관절염 예후 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 “프로브 폴리뉴클레오티드”는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500(1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격해야 한다. 이렇게 함으로써 다른 대립형질성 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다. 상기 혼성화란 엄격한 조건, 예를 들면 1M 이하의 염 농도 및 25℃ 이상의 온도하에서 보통 수행될 수 있다. 예를 들면, 5×SSPE (750 mM NaCl, 50 mM Na Phosphate, 5 mM EDTA, pH 7.4) 및 25∼30℃의 조건이 대립형질 특이적 프로브 혼성화에 적합할 수 있다.

본 발명의 류마티스 관절염과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드의 기판 상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

나아가 본 발명은 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로,

a) 검체로부터 핵산시료를 수득하는 단계;

b) 상기 a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계;

c) 상기 b)단계에서 증폭된 폴리뉴클레오티드 중 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단 방법을 제공한다.

상기 방법 중 a)단계의 검체는 류마티스 관절염의 감수성 또는 중증도를 진단하고자 하는 검체로서, 혈액, 타액, 소변 등과 같이 대상 환자로부터 얻은 분비물이 사용될 수 있으며, 혈액을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니고, DNA를 추출할 수 있는 검체의 모든 부분이 대상이 될 수 있다.

또한, 상기 a)단계의 검체로부터 핵산을 얻는 단계는 페놀/클로로포름 추출법 및 프로테아제 K 처리방법과 같은 통상의 DNA 분리방법에 의하여 수행될 수 있으며, 또한 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR) (Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560, 1989, Landegren 등, Science 241, 1077, 1988), 전사증폭(transcription amplification) (Kwoh 등, Proc . Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173, 1989) 및 자가유지 서열 복제 (Guatelli 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA 87, 1874, 1990) 및 핵산에 근거한 서열 증폭 (NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 c)단계의 유전자형 결정은 시퀀싱 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행될 수 있다.

나아가, 각각의 검체로부터 상기 c) 단계의 유전자형 결정을 통해 수득한 DNMT3B의 -283C/T 다형성의 유전자형 결과들은 당업계에서 일반적으로 사용되는 통계학적 분석 방법을 이용하여 통계처리 할 수 있으며, 예를 들면, 스튜던트 t-검정 (Student's t-test), 카이-스퀘어 테스트 (Chi-square test), 선형 회귀선 분석(linear regression line analysis), 다중 기호 회귀 분석 (multiple logistic regression analysis) 등을 통해 얻은 연속 변수 (continuous variables), 절대 변수 (categorical variables), 대응비 (odds ratio), 95% 신뢰구간 (confidence interval) 등의 변수를 이용하여 분석할 수 있다.

그러므로 상기 c) 단계에서 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형을 결정하여 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단하고자 할 때, 상기 c) 단계에서 결정된 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형이 CC 일 경우에는 류마티스 관절염의 관절파괴 위험도가 감소되는 것으로 판단할 수 있다.

또한, 상기 c) 단계에서 결정된 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형이 CT 또는 TT일 경우에는 류마티스 관절염의 관절파괴 위험도가 증가되는 것으로 판단할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용을 한정하지는 않는다.

< 실시예 1>

연구 대상의 선정

본 발명자들은 DNMT3B 유전자의 다형성이 류마티스 관절염과 상관관계가 있는지 확인하기 위하여 먼저 실험 대상자들로서 309명의 류마티스 관절염 환자 및 대조군으로 297명의 건강한 성인을 선출하였다. 상기 환자군은 경북대학교 병원(대한민국, 대구)에서 2001년 11월에서 2005년 12월까지 1987년 개정된 미국 류마티스 학회의 분류 기준법에 따라 류마티스 관절염으로 진단받은 309명을 대상으로 하였고, 대조군은 건강 점검 설문지에 건강에 아무런 이상이 없다고 기재된 건강한 297명을 대상으로 하였다. 본 실험은 경북대학교 병원의 임상연구윤리위원회로부터 동 의를 얻었고, 각 대상자들은 실험에 참여하기 위한 사전 동의를 하였다. 관절질환의 방사선학적 정도(radiographic severity)는 숙련된 류마티스 전문의(YMK) 및 골격계 방사선 전문의(JL)에 의해 변형된 샤프(Sharp) 방법을 이용하여 후방-전방 및 사선촬영으로 측정하였다. 또한 측정자는 각각 환자들의 정보에 대하여 모르게 하였다.

309명의 류마티스 관절염 환자들은 61명의 남성 및 248명의 여성을 포함하고 있으며, 이들의 평균 연령은 49.6세(평균±SD 49.5 ± 14.2)였다. 질환의 평균 지속기간 및 발병시의 평균 연령은 각각 7.2년 및 42.3세이다. 또한, 269명의 환자들 중 233명의 환자(77.3%)들은 류마티스 인자(RF)를 가지고 있었고, 212명의 환자(78.8%)들은 항-CCP(cyclic citrullinated peptide) 항체를 가지고 있었다. 상기 297명의 대조군은 123명의 남성 및 174명의 여성을 포함하고 있으며, 이들의 연령 분포는 23세 ~ 69세였다(평균±SD 45.4 ± 13.7).

< 실시예 2>

DNMT3B 유전자의 다형성 분석

DNMT3B 유전자에 존재하는 -287C/T 다형성을 확인하기 위하여, 먼저 말초혈액에서 퀴아젠(Quiagen) 게놈 DNA 분리 키트(Quiagen사)를 이용하여 상기 실시예 1에서 선출된 환자군 및 대조군으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 이후, 상기 추출된 게놈 DNA로부터 DNMT3B 유전자의 엑손 1A 5' 비번역 부위(UTR)에 위치하는 전사시작점으로부터 -283번째 염기를 포함하는 DNA 단편을 얻기 위하여 상기 추출된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기에 기재한 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머쌍을 사용하여 Han. SW. 등에 의해 발표된 문헌(Han. SW. et al., Rheumatology, 43, 1173-7, 2004)에 기재된 방법으로 PCR을 수행하여 약 74bp의 DNA 단편을 수득하였다. 이때, 상기 프라이머 중 역방향 프라이머(서열번호 3)에는 바이오틴(biotin)이 표지되어 있다. 이후, 상기 방법으로 증폭하여 수득한 DNA 단편에서 DNMT3B 유전자의 전사시작점으로부터 -283번째 염기, 즉, 서열번호 1에 기재된 DNMT3B 유전자의 염기서열 중 548번째 염기의 유전자형을 확인하기 위하여, 하기에 기재된 서열번호 4의 시퀀싱 프라이머와 ddNTP를 첨가한 후 단일 염기 확장(single base extension)을 수행하였고, 이후 실시간 시퀀싱 반응을 수행하였다. 상기 시퀀싱 반응은 피로시퀀서(Pyrosequencer) 및 PSQ 96 SNP 시약 키트 (PSQTM 96MA, Biotage AB)를 사용하여 수행하였고, 이후 PSQ 96 시스템의 SNP 소프트웨어를 이용하여 유전자형 분석을 수행하였다.

서열번호 2 : 정방향 프라이머

5'-tgtctccgttcgggttga-3'

서열번호 3 : 역방향 프라이머

5'-gtggggtcagacgtccaaaa-3'

서열번호 4 : 시퀀싱 프라이머

5'-aaaaggccccagaag-3'

< 실시예 3>

통계학적 분석을 통한 DNMT3B 유전자의 다형성과 류마티스 관절염과의 연관성

본 발명자들은 상기 실시예 2에서 수행한 대조군 및 환자군들에 대한 DNMT3B 유전자의 전사시작점으로부터 -283번째 염기, 즉, 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형 분석결과를 SPSS 시스템(12.0 버전 소프트웨어, 시카고, 미국)을 이용하여 통계분석 하였다. 각 그룹들 사이의 유전자형 분포 및 대립유전자 빈도에 있어서의 차이는 독립성에 대한 카이- 스퀘어 테스트(chi sqaure test) 및 피셔의 정확도 테스트(Fisher's exact test)를 이용하여 통계적 유의성에 대해 측정하였고, -283C/T 다형성에 대한 하디-웨인버그(Hardy-Weinberg) 평형은 카이 스퀘어 테스트를 이용하여 측정하였으며, 상기 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 본 발명자들은 류마티스 관절염의 위험도와 DNMT3B의 다형성과의 관계를 확인하기 위하여, 류마티스 관절염 환자들 중 142명을 대상으로 변동분석(ANOVA)에 의한 그룹들 간의 질병 지속기간 및 발병 시의 연령을 포함하는 연속변수에서의 차이를 측정하였다. 방사선학적(radiographic) 관절 손상 진행은 다른 대립유전자를 가진 각각의 그룹 내(CC형, CT형 또는 TT형)에서 질병 지속기간에 걸친 선형 회귀선의 변형된 샤프 스코어로 표시하였다. 각각 선형 회귀선의 통계적 유의성은 스피어만(spearman) 상관계수 분석을 이용하여 측정하였고, 상기 회귀선의 기울기 차이는 중선형회귀(multiple linear regression) 모델을 기초로 한 다양한 더미(dummy) 및 시간 사이의 상호작용을 이용하여 분석하였다. 분석 결과는 도 1에 나타내었다.

	CC	CT	TT	p-밸유^*	C 대립유전자	T 대립유전자	p-밸유^T
환자군(n=309)	243(78.6%)	64(20.7%)	2(0.6%)		0.89	0.11
대조군(n=297)	251(84.5%)	45(15.2%)	1(0.3%)	0.133	0.92	0.08	0.077
우성 효과	(CC 대 CT + TT)			0.075

^*피셔 정확도 테스트에 의해 분석된 데이타이고 유전자형 분포에 대한 p-밸유값 이다.

^T 피셔 정확도 테스트에 의해 분석된 데이터이고 대립유전자 빈도에 대한 p-밸유값 이다.

상기와 같은 통계 분석 결과, 하디-웨인버그(Hardy-Weinberg) 기대값으로부터 DNMT3B 유전자의 -283C/T 다형성의 유전자형 빈도수는 유의성있게 벗어나지 않는 것으로 나타났다(p>0.05, 결과 미도시). 또한, 142명의 류마티스 관절염 환자들에 대한 DNMT3B 유전자 -283C/T 다형성의 유전자형들과 류마티스 관절염의 지속기간 및 변형된 샤프 스코어간의 상관관계는 유의성이 있는 것으로 나타났다(T 대립유전자에 대한 y=9.546χ+ 19.998, p<0.001 이며, CC형에 대한 y=6.185χ+ 34.424, p<0.001). 즉, 적어도 하나의 T 대립유전자를 가지고 있는 회귀선 기울이는 9.546으로써 이는 CC형(p=0.014)의 기울기보다 월등히 높은 것으로 나타났다(도 1 참조). 따라서 류마티스 관절염의 진행속도는 T 대립유전자를 가지고 있는 환자가 CC형의 유전자형을 가지고 있는 환자에 비해 훨씬 빠르며 따라서 관절파괴의 위험도가 높음을 알 수 있었다. 아울러, 환자군 및 대조군의 비교에 있어서, DNMT3B -283C/T의 유전자형 빈도는 환자군에서 CC형, CT형 및 TT형이 각각 243명(78.6%), 64명(20.7%) 및 2명(0.6%)인 것으로 나타났고, 대조군에서는 CC형, CT형 및 TT형은 각각 251명(84.5%), 45명(15.2%) 및 1명(0.3%)인 것으로 나타났다(표 1 참조). 즉, 환자군 및 대조군에서 DNMT3B의 -283C/T 다형성 유전자형 빈도는 모두 CC>CT>TT의 순으로 같은 양상을 보이고 있었다. 그러나 T 대립유전자의 빈도는 환자군에서 11%, 대조군에서는 8%를 보이고 있어 T 대립유전자의 빈도는 환자군에서 더 높게 나타났으나 통계적 유의성은 없었다(p=0.077).

따라서 류마티스 관절염의 위험도와 DNMT3B의 -283C/T 다형성과의 상관관계를 확인한 결과, -283C/T 다형성의 유전자형, 즉, 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형이 적어도 하나의 T 대립유전자를 가진 CT형 및 TT형일 경우가 T 대립유전자를 가지고 있지 않은 CC형일 때 보다 류마티스 관절염의 관절파괴 위험도가 높음을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 DNA-메틸전이효소-3B(DNMT3B) 유전자의 다형성에 근거한 류마티스 관절염 예후를 판단하는 류마티스 관절염 예후 진단용 마커, 진단키트, 마이크로어레이 및 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단하는 방법은 류마티스 관절염의 중증도를 예측할 수 있는 유전적 소인을 가려내어 류마티스 관절염의 예후를 알아냄으로써 류마티스 관절염의 예후를 예측하고 판단하는데 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 류마티스 관절염 환자를 대상으로 서열번호 1의 DNA-메틸전이효소-3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형(CC, CT 및 TT)에 대한 질병 지속시간 및 수정된 샤프 스코어(modified Sharp score)간의 상관관계를 나타낸 그림이다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Makers for the diagnosis of prognosis of rheumatoid arthritis using DNMT3B gene and method for predicting severity and analyzing prognosis of rheumatoid arthritis using the same <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1689 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 taaatcattc attcattcaa cacatattta ttgagcatct actgagatcc tgtccttagt 60 ttactgcgtg gagacagacc acaagcaggt aaacaagcaa atatgtaagt cccaggtcag 120 ataaatttta ggaagtgctg ttttccagtg gttcaatggt catcccaggg cagaggtggg 180 gagacctgct gagggcggct tctccctcag tcagtccatg cctgcagggt ctggaaccca 240 ggtagccaga gacccgctgg tcttctttcc cctcccctgc cctcccctcc cttcaagatg 300 gctgacaaag gccgggctgg gtggaaggaa gggaggaagg gcgaggcaga gggtccaaag 360 caggatgaca ggcaggggca ccgcggcgcc ccggtggcac tgcggctgga ggtgggggtt 420 aaagcggaga ctctggtgct gtgtgactac agtgggggcc ctgccctctc tgagcccccg 480 cctccaggcc tgtgtgtgtg tctccgttcg ggttgaaagg agcccgggaa aaaggcccca 540 gaaggagtgg ttttggacgt ctgaccccac ccctcccgct tagggcttct gatcccccag 600 ggtgatttca ctggcccggg gttgggaggg cagggggcca gggggcggag cccgcggaga 660 ggggcggagg ggaggctccg agcgatttca aatttccctc gtccccgccc ccccgttccc 720 cccgcgcccg ggcggggatc tgagtggctg cggcgggggc acccccgggc gggggcgggg 780 caagagccgg gccggggcta caaggggagt cggcaccgcc ccctccccac ccactcccgc 840 tgccccgtcc ggcccgcgcc gcttcctcgc agcagctgct cccggctccg cggccgcagc 900 ccgcgtggac gctccgagcg ccccccgacg gacgggaccg gctccctggc ggtcgggcga 960 gcgggcggca acgctgcccg gccggcagcg ctggggttaa gtggcccaag taaacctagc 1020 tcggcgatcg gcgccggaga ttcgcgagcc cagcgccctg cacggccgcc agccggcctc 1080 ccgccagcca gccccgaccc gcggctccgc cgcccagccg cgccccagcc agccctgcgg 1140 caggtgagcg ccccggggcc ccggggaggc tcggccgcca gctgcttcga gggctgctag 1200 gggaggggac ggcgggggct cccgaagctg ccggggagag accctctcca gggacctccc 1260 gaggaggggc tctcgccggg ttggagaccc ggctgggttt gcggggtgag gaaacgtcca 1320 cggaccctgc ttggggtgga acggggacag cgggtgggac gcgggggaca tacgtctgac 1380 ggggaccgga gatactagag gaagggacgc gtctgctgcc tccaggagcc cgaagaggag 1440 agaagcttgc tcgcagggag ggggacgcgc tggcttcccg gggtccagac tcgaggagga 1500 ggaggtgccc gtcgagagca tgaacagggg ctttgctcat gggcaggggg tgtaattacc 1560 tggcctctgc cttgggaaaa gttaaggggc agaggaggtg aggaggggtt tctgccatgc 1620 aggtgggcgt ccgccccttg caactgggat gtggggtctt caggcgaggc gctgtccctt 1680 cccccaatc 1689 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 2 tgtctccgtt cgggttga 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 3 gtggggtcag acgtccaaaa 20 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer <400> 4 aaaaggcccc agaag 15

Claims

서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 10 - 200개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드로 이루어진 류마티스 관절염 예후 진단용 마커.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 50- 100개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 류마티스 관절염 예후 진단용 마커.
제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기가 CC, CT 및 TT로 구성되는 유전자형으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 류마티스 관절염 예후 진단용 마커.
서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 10 - 200개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 류마티스 관절염 예후 진단용 마이크로어레이.
서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 류마티스 관절염 예후 진단용 키트.
제5항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 2 내지 4로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 프라이머인 것을 특징으로 하는 진단용 키트.
a) 검체로부터 핵산시료를 수득하는 단계;

b) 상기 a)단계에서 수득한 핵산시료에서 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계;

c) 상기 b)단계에서 증폭된 폴리뉴클레오티드 중 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는 류마티스 관절염 중증도를 예측 및 판단하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 c) 단계에서 결정된 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형이 CC일 경우에는 류마티스 관절염의 관절파괴 위험도가 감소되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 c) 단계에서 결정된 서열번호 1의 DNMT3B 유전자의 548번째 염기의 유전자형이 CT 또는 TT일 경우에는 류마티스 관절염의 관절파괴 위험도가 증가되었다고 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 c)단계의 유전자형 결정은 시퀀싱(sequencing) 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specific hybridization, DASH), PCR 연장 분석 또는 TaqMan 기법에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.