KR20090017182A

KR20090017182A - 저먼 카모마일 오일을 함유하는 아토피성 피부염 완화제

Info

Publication number: KR20090017182A
Application number: KR1020070081736A
Authority: KR
Inventors: 이순희
Original assignee: 이순희
Priority date: 2007-08-14
Filing date: 2007-08-14
Publication date: 2009-02-18

Abstract

본 발명은 아토피성 피부염 완화제에 관한 것으로, 구체적으로는 아토피성 피부염 완화효과가 우수하면서도 장기간 사용에 대한 부작용이 적은 저먼 카모마일 오일을 함유한 아토피성 피부염 완화제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 아토피성 피부염 완화제는 저먼 카모마일 오일을 함유하여, 아토피성 피부염으로 인해 유발되는 Th2 세포로부터의 IL-4의 생성 증가, B세포의 IgE 생성 증가, 비만세포의 탈과립으로 인한 히스타민의 증가와 같은 현상을 막아줌으로써 아토피성 피부염의 증상을 완화하는 효과를 지닌다. 기존에 사용되던 스테로이드, 항히스타민제, 면역억제제를 기반으로 한 아토피성 피부염 치료제와는 달리, 본 발명의 아토피성 피부염 완화제는 장기간 사용하더라도 부작용이 적은 특징이 있다.

저먼 카모마일 오일, 아토피성 피부염.

Description

저먼 카모마일 오일을 함유하는 아토피성 피부염 완화제 {Composition Comprising German Chamomile Oil for Treatment of Atopic Dermatitis}

최근 사회적, 환경적, 음식 문화 및 삶의 방식의 변화에 의해서 아토피성 피부염은 전 세계적으로 증가하는 추세로써 1970년 이후에 태어난 사람들의 8.9~20.4%가 이 질환을 앓고 있으며, 2차 대전 이후 유병률(prevalence)이 증가하였고 현재는 10~15%의 어린이들이 유년기 동안에 아토피성 피부염에 걸리는 것으로 보고되어 있다. 국내의 경우 2000년도 대한 소아알레르기 및 호흡기학회에서 시행한 설문조사에 의하면 우리나라 초등학생의 유병률은 24.9%, 중학생은 12.8%가 아토피 피부염을 앓고 있는 것으로 조사되어(김정희. 2004. 아토피 피부염의 최신 지견. 소아알레르기 및 호흡기학회지 14, no. 1: 12-23), 그 예방과 치료에 관심이 집중되고 있다.

아토피성 피부염은 주로 유소아기부터 발생하며, 증가된 IgE 합성과 연관된 만성 염증성 피부질환으로 직접적인 원인은 아직 정확히 규명되지 않았으나, 발생원인은 유전적, 면역학적, 환경적인 요인에 의하며, 감염, 스트레스, 계절과 기후변화, 자극에 의해 호전과 악화를 반복하고, 특히 서구화된 생활습관이 가장 큰 원인으로 알려져 있다(Jujo, K., H. Renz, J. Abe, E. W. Gelfand, and D. Y. M. Leung. 1992. Decreased interferon gamma and increased interleukin-4 production in atopic dermatitis promotes IgE synthesis. J. Allergy Clin . Immunol. 90: 323-331). 아토피성 피부염의 주증상은 피부건조증과 소양증으로써, 각질층의 장벽기능이 손상되어 외부의 자극물질이나 항원에 쉽게 반응하는 비정상적인 피부혈관 반응이나 면역학적 이상반응이 관여하는 것으로 알려져 있다(Cooper, K. D. 1994. Atopic dermatitis: Recent trends in pathogenesis and therapy. J. Invest . Dermatol . 102, no. 1: 128-138).

아토피성 피부염에서 혈중 호산구수와 혈청 IgE양의 증가가 나타나며(Ueharra 1990), 이는 아토피성 피부염의 대표적인 지표로써 아토피성 피부염의 초기반응은 항원의 자극에 의해 항체 IgE가 생산된 후 항체가 비만세포 표면의 high affinity receptor에 결합하였을 때 항원이 재침입하면 수용체와 결합하고 있는 항체와 결합하여 비만세포 내로 신호를 빠르게 전달하여 알레르기를 일으키는 화학적 매개물질(cytokine, histamine, leukotrienes)을 분비하여 염증과 가려움증을 나타낸다(Barnes, P. J. 2000. New direction in allergic: Mechanism-based anti-inflamma-tory therapies. J. Allergy Clin . Immunol . 106: 5-18). 인체 방어 기전인 면역체계는 helper T cell(Th) 세포의 활성화를 중심으로 이루어지며, 활성화된 Th 세포는 그들이 분비하는 사이토카인의 종류와 분비한 사이토카인에 의한 면역조절기능에 따라 제1형과 2형으로 나누며, 이 두 종류의 균형이 깨어지면 여러 가지 면역질환을 겪게 되는데, 알레르기 질환은 균형이 type-2 helper T cell(Th2)쪽으로 치우친 결과로 유발된 면역질환이다(Inagaki, N., and H. Nagai. 2001. Drugs for the treatment of allergic diseases. Pharmacol . 86, no. 3: 275-280). 활성화된 Th2 세포가 분비하는 사이토카인 중 interleukin(IL)- 4는 B세포에서 IgE, IgG1를 생산하도록 유도하고, IL-5는 호산구증가증(eosinophilia)을 유발하며, IL-10은 지연형 과민반응을 억제하는 것으로 알려져 있다(Foster, P. S., M. Maritinez, D. P. Huston, and D. B. Corry. 2002. Interleukin-4, -5, and -13: emerging therapeutic targets in allergic disease. Phamacology Therapeutics 94, no. 3: 253-264).

현재까지 아토피성 피부염은 고질적인 피부질환으로서 치료방법으로는 스테로이드와 항히스타민제, 면역억제제 등이 사용되어 왔으나 이런 제제를 장기간 사용하고 남용을 하면 여러 가지 부작용을 일으키기 때문에 이에 대한 대체의학적 보완요법에 관심을 두게 되었으며, 미국을 중심으로 피부질환 치료를 위해 화장품의 원료나 미용 마사지 제품으로 사용하고 있는 천연물질을 이용하고 있다. 이 중 아로마테라피(aromatheraphy)에 사용되는 식물성 aroma oil은 질병의 치료를 위한 의약품이나 미용 마사지, 화장품의 원료, 방향제, 방취제로 광범위하게 사용되고 있다(이승자. 2005. 자외선으로 손상된 피부의 라벤더오일 유효성 연구. 박사학위논 문, 계명대학교 대학원). 천연 식물성 향기 물질의 정유로서의 aroma oil은 질병을 예방하거나 치료를 위해 불면증, 우울증, 만성두통, 스트레스 등의 신경정신과 질환과 알레르기성 비염, 천식 등의 호흡기 질환, 피부과 질환, 근육통 및 고혈압 등과 같은 주요 질환에 대체요법(alternative theraphy)적인 측면에서 사용되고 있다(Lawless, J. 1999. The illustrated encyclopedia of essential oils . New York: Elements Books).

Aroma oil은 천연정유(natural essential oil)로서 독특한 향기와 치료성분을 가진 휘발성 유기화합물로 추출부위에 따라 꽃, 잎, 줄기, 뿌리로 분류할 수 있으며, 알코올, 알데하이드, 에스테르, 케톤, 옥사이드 등을 포함하는 여러 가지 유기화합물로 구성되어 있으며, 피부, 순환계, 후각계를 통하여 뇌의 변연계(limbic system)를 자극하여 종류에 따라 불안, 스트레스해소, 피로회복, 근육이완, 불면증, 항히스타민 작용, 항알러지 작용, 면역증진 등의 효과를 나타낸다(Cerrato, P. 1998. Atomatherapy: Is it for real? RN, 61, no. 6: 51-52). Aroma oil을 신체에 적용시키는 방법에는 직접 피부에 바르는 방법, 후각을 통해 대뇌 변연계에 자극을 주어 호르몬을 형성시키는 방법 등 여러 가지가 있으나 피부를 통하는 방법이 가장 많이 사용되고 있다. 피부를 통해 흡수된 오일의 성분은 진피층까지 흡수되어 모세혈관과 임파순환을 통해 전신 순환계에 이르게 된다. Essential oil을 흡입할 경우 흡입된 생리물질은 뇌에까지 이르러 뇌파와 행동에 영향을 미침으로써 긴장완화와 정서적 안정과 같은 정신적 효과를 얻을 수 있다(Buckle, J. 1999. Clinical aromatherapy in nursing. London: Arnold). 특히 essential oil을 피부에 침투시 킴으로써 보다 깊은 치유효과를 얻을 수 있는데 이것은 미네랄과 비타민은 호흡기를 통해서는 10%만 인체에 흡수되지만 피부를 통해서는 85%까지 세포조직에 흡수되기 때문이다(장명옥, 최정숙. 2004. Chamomile, Thyme essential oil의 계면활성제 유발 피부염증에 대한 유효성 연구. 한국미용학회지 10, no. 3: 233-243).

본 발명에서는 기존에 사용되던 스테로이드, 항히스타민제, 면역억제제를 기반으로 한 아토피성 피부염 치료제와는 달리 안전성이 우수하여 장기간 사용하더라도 부작용에 대한 우려가 적은 아토피성 피부염 완화제를 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명에서는 저먼 카모마일 오일(German chamomile oil)을 함유하는 아토피성 피부염 완화제를 제공한다.

본 발명에 따른 아토피성 피부염 완화제의 유효성분은 저먼 카모마일 오일로써, 전체 성분 중 저먼 카모마일 오일의 함량이 낮으면 효과가 떨어지고, 함량이 너무 높으면 피부자극을 유발할 수 있으므로 2~5중량%의 범위 내에서 포함시키는 것이 바람직하다.

저먼 카모마일 오일은 카모마일 꽃을 수증기로 증류하여 추출한 것으로서 오일의 색이 청색잉크와 같은 푸른빛을 띠기 때문에 blue chamomile이라고도 하며, 학명은 Matricaria chamomile로 사용된다. Tisserand(Tisserend, R. 1987. The art of aromatherapy . London: Inner Traditions)는 essential oil의 적절한 사용은 면역계를 자극한다고 하였으며, Jakovlev 등(Jakovlev, V., O. Issac, K. Thiemer, and R. Kunde. 1979. Pharmacological investigations with compounds of chamomile. II. New investigations on the antiphlogistic effects of a bisabolol and bisabolol oxide. Planta . Medica . 35: 125-140)은 저먼 카모마일 오일이 항염증 효과가 있고 소염효과는 비사보롤과 비사보롤 옥사이드 성분에 기인한다고 했다. Burns와 Blamey(Burns, E. E., and C. Blamey. 1994. Soothing scents in childbirth. International Journal of Aromatherapy 6: 24-28)는 분만 중인 585명의 여성들을 대상으로 라벤다, 클라라 세이지, 페퍼민트, 유칼리투스, 만다린, 카모마일, 쟈스민, 로즈, 유향, 레몬오일을 사용하여 아로마테라피를 수행했을 때 불안을 감소시키고, 수축을 증가시키고, 통증을 감소시킨다고 보고하였다. Harborne(Harborne, J. B. 1987. Economic and medicinal plant research. Phytochemistry 26, no. 5: 1555)는 저먼 카모마일 오일이 림프구의 수치를 증가시켜 면역자극제 효과가 있다고 보고하였다. 독일 카밀레의 꽃은 강렬한 향료로 가장 인기 있는 허브차 중의 하나이고 구풍제, 진정제 그리고 강장제로도 전통적으로 사용되어 왔다(Kobayashi, Y., R. Takahashi, and F. Ogino. 2005. Antipruritic effect of the single oral administration of German chamomile flower extract and its combined effect with antiallergic agents in ddY mice. Ethnopharmacology 101, no. 1-3: 308-312). 허브류 중 국화과에 속하는 꽃인 저먼 카모마일은 28종의 terpenes(α-bisabolol, chamazulene, bisabolol oxide 등), 36종의 flavonoids(apigenin 등), 52종의 유기산 등 120여종의 화합물들이 함유되어 있으며, 달콤한 과일향으로 진정작용과 강력한 완화작용에 의해 심신의 긴장과 피로를 풀어주며, 건성, 가려운 피부치료(민감성, 알레르기)에 효과적이다(Lawrence, M. B., and R. J. R. Tobacco. 1996. Progress in essential oil. Perfumer and Flavorist 21: 55-68). 저먼 카모마일 오일의 화학성분 중 Chamazulens는 지질 과산화 억제 효과가 있으며, 염증성 질환, 피부염 치료에 효과가 탁월하다고 보고되었다(Tisserend, R. 1987. The art of aromatherapy . London: Inner Traditions).

그러나 현재까지 저먼 카모마일 오일이 아토피성 피부염에 대한 직접적인 증상완화 효과와 관련한 과학적 근거가 밝혀진 바 없으며, 이에 본 발명에서는 2,4-dinitrochlorobenzen(DNCB)으로 아토피성 피부염을 유발한 BALB/c 마우스에 저먼 카모마일 오일을 도포하여 아토피성 피부염으로 인한 Th2 세포에서 IL-4의 생성 증가, 활성화된 B세포의 IgE 생성 증가, 비만세포의 탈과립으로 인한 히스타민의 증가와 같은 일련의 과정을 확인함으로써 저먼 카모마일 오일의 항히스타민 작용, 항알레르기 작용, 면역증진 효과를 규명하고, 더불어 이를 이용한 완화제를 제공한다.

본 발명에서는 저먼 카모마일 오일의 아토피성 피부염에 대한 발현제어 효과 및 그 기전을 알아보고자 BALB/c 마우스에 DNCB로 아토피성 피부염을 유발한 후 저먼 카모마일 오일을 4주간 도포하면서 혈액학적, 면역학적, 조직학적, 행동학적 지표를 관찰하였으며, 실험군은 무처치군, 아토피유발 도포대조군, 아토피유발 후 조조바 오일을 도포한 용매대조군과 저먼 카모마일 오일을 도포한 실험군으로 나누었다.

실험결과, BALB/c 마우스에 DNCB로 아토피성 피부염을 유발시킨 후 저먼 카모마일 오일을 4주간 배부에 도포하였을 때 혈액 중 백혈구 수 특히 염증발현과 관련된 호중구와 단핵구의 수가 정상 수준으로 저하되었으며 아토피 발현 시 증가되 는 것으로 알려진 IL-4 생성 및 IgG1의 수준이 아토피 발현 직후(오일 도포전)에 비해 유의하게 낮아 졌으며 아토피 발현의 대표적인 지표치인 혈청내 IgE와 histamine의 생성을 억제시켰고 아울러 피부조직 내 염증정도를 완화시킴을 확인할 수 있었으므로, 저먼 카모마일 오일은 만성적인 아토피성 피부염의 치료 및 예방에 효과가 있는 것으로 판단된다.

1. 재료 및 방법

1.1 시약 및 기기

Rat anti-mouse IgE capture antibody는 PharMingen사(USA)의 제품을 goat-anti mouse IgG1 및 IgG2a는 Serotec사(USA)의 제품을 DNCB, phytohem- agglutinin(PHA) lipopolysaccharide(LPS), ABTS(3-ethylbenzthiazoline-6 -sulfonic acid)는 Sigma사(USA)의 제품을 RPMI-1640은 Hyclone사(USA)의 제품을 histamine ELISA kit는 IBL사(Germany)의 제품을 사용하였으며 그 외 일반시약들은 특급품을 사용하였다. 저먼 카모마일 오일은 유기농 인증기관으로부터 인정받은(ECOCERT-F-32600) 100% pure and natural essential oil인 Sanoflore사(France) 제품을, jojoba oil(조조바 오일)은 Desert Whale사(USA) 제품을 사용하였다. 이 실험에 사용한 저먼 카모마일 오일과 조조바 오일의 성분은 표 1 및 표 2와 같다.

실험기기는 ELISA washer(Bio-Tek, ELx50, USA), ELISA reader(Bio-Tek, EL800, USA), coulter counter(Beckman, ACT-10, USA), rotary microtome(SHANDON, AS325, USA), auto hematology analyzer(HEMAVET, HV-950FS, USA), microtome cryostat(Leica, CM1850, Germany), light microscope(Olympus, BX50F, Japan), microscopic digital camera(Polaroid, DMCIe, USA) 및 실험실에서 사용하는 일반기기를 사용하였다.

표 1. Composition of German chamomile oil ( wt %)

표 2. Composition of jojoba oil ( wt %)

1.2 실험동물 및 처치

실험동물은 생후 7주령 된 웅성 BALB/c 마우스를 (주)대한 바이오링크(Korea)로부터 구입하여 1주일간 사육실(22±1℃, 50±5%)에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 전 실험기간 동안 물과 사료의 양은 제한 없이 공급하였다.

실험군은 아무런 처치를 하지 않은 무처치군, DNCB를 경피도포하여 아토피 피부를 유발한 후 saline을 도포한 도포대조군, DNCB를 경피도포하여 아토피 피부를 유발한 후 조조바 오일을 도포한 용매대조군, DNCB를 경피도포하여 아토피 피부를 유발한 후 저먼 카모마일 오일을 도포한 실험군으로 분류하여 각 군마다 10마리씩 총 40마리를 실험에 사용하였다.

실험 사육한 마우스를 실험 0주, 실험 2주(아토피 유발 직후), 실험 4주(오 일도포 2주)에 각각 안와정맥총(periorbital plexus)에서 capillary tube를 이용하여 약 300㎕의 혈액을 채취한 후 분리한 혈청을 면역학적 분석에 사용하였다. 실험 6주째 날(오일도포 4주)에 4시간 동안 절식시킨 후 ether 마취하에 개복하여 적출한 피부조직은 조직학적 검사에 사용하였고, 적출한 비장으로부터 분리한 비장세포는 사이토카인 분석에 사용하였다. 후대정맥에서 혈액을 채취하여 일부는 혈액학적 분석에 나머지는 면역학적 분석에 사용하였다.

1.3 아토피 유발

전기제모기를 사용하여 마우스 배부(背部)의 털을 약 2×4cm 면적으로 제거한 후 1% DNCB 100㎕를 3일 간격으로 2회 등 부위에 도포하여 감작시켰다(sensitization). 다음 1주일 동안에는 0.2% DNCB 100㎕를 3일 간격으로 2회 등 부위에 도포하였다(challenge). Challenge가 끝난 직후부터 아토피가 유발된 배부에 저먼 카모마일 오일을 조조바 오일에 3%로 희석하여 1일 1회씩 주 6회 4주 동안 매회 70㎕를 도포하였다(도 1). 1% DNCB와 0.2% DNCB는 용매물질(acetone: olive oil = 4:1 혼합)에 녹여 제조하였다.

1.4 혈액학적 관찰

채취한 혈액을 혈액 응고 방지제인 K₂ EDTA가 들어 있는 CBC 채혈병에 취하여 coulter mixer기 위에서 5분 이상 혼합한 뒤 자동혈구분석기를 이용하여 백혈구 수(WBC, white blood cell count), 호중구수(NEUT, neutrophil count), 림프구수(LYMPH, lymphocyte count), 단핵구수(MONO, monocyte count), 호산구수(EOSIN, eosinophil count), 호염기구수(BASO, basophil count), 적혈구수(RBC, red blood cell count), 혈색소농도(HGB, hemoglobin concentration), 적혈구용적(HCT, hematocrit), 혈소판수(PLT, plate count)를 측정하였다.

1.5 면역학적 관찰

1.5.1 혈청내 IgE 측정

혈청내 존재하는 IgE 수준을 도포대조군 마우스와 비교분석하기 위해 Heo 등(1996)의 방법에 따라 sandwich ELISA 방법을 이용하여 정량하였다. Rat anti-mouse IgE capture antibody를 Immulon 2 plate에 2μg/ml(각 well당 100㎕) 첨가한 다음 냉장상태에서 24시간 정치시키고 이후 1% BSA-PBS로 non-specific binding을 차단한 다음 희석된 실험혈청 및 표준 IgE(purified mouse IgE mAb isotype standard, PharMingen)를 첨가하고 냉장상태에서 24시간 정치시켰다.

다음날 biotinylated rat anti-mouse IgE(1μg/ml 1% BSA-PBS, PharMingen)를 첨가하여 2시간 실온에서 정치시켜 detection antibody가 부착하게 한 다음 avidin peroxidase를 넣고 다시 1시간 실온에서 정치시켰다. 이후 ABTS(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)로 발색을 유도한 다음 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

1.5.2 혈청 내 IgG1 , IgG2a 측정

혈청 내 IgG의 isotype인 IgG1 및 IgG2a의 측정은 Heo 등(2001)의 방법에 따라 goat-anti mouse IgG1 및 IgG2a capture antibody와 peroxidase conjugated anti-mouse IgG detection antibody를 사용하는 sandwich ELISA 방법을 사용하여 정량하였다.

1.5.3 혈청 내 Histamine 측정

혈청 내 histamine 측정은 Duda(Duda, D., W. Lorenz, W. Dick, I. Celik, A. Black, and M. J. R. Heal. 1998. Can clinically relevant histamine release be accurately diagnosed in anaesthe-tised patients without plasma histamine measurements? Randomised study with nested sampling aimed to change paradigms. Inflamm . Res . 47, no. Suppl 1: S73-74)의 방법에 의해 IBL histamine ELISA kit를 사용하여 정량하였다. 20㎕의 실험혈청 및 표준혈청, positive control 혈청에 20㎕의 indicator buffer를 넣고 혼합한 다음, 4㎕의 acylation reagent를 넣고 다시 혼합을 한 뒤 실온에서 30분간 정치시켰다. 이후 150㎕의 diluted assay buffer를 넣고 혼합한 뒤, 이 혼합액 50㎕를 goat anti-rabbit antiserum against histamine 항체가 부착된 96 well plate에 넣었다. 다음에 peroxidase-conjugated histamine 50㎕를 부가하고 최종적으로 rabbit antiserum against histamine을 50㎕ 첨가한 다음 orbital shaker에서 3시간 혼합하였다. 이 후 plate를 세척하고 TMB(tetramethyl-benzidine) 발색단을 첨가한 후 20분이 지난 다음 450nm(reference wave length 610nm)에서 ELISA reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

1.5.4 비장세포 배양액 내 IL -4 측정

IgE 및 IgG1의 isotype switching을 유도하는 type-2 cytokine인 interleukin-4 (IL-4) 측정은 Heo 등(1996)의 방법에 의한 sandwich ELISA 방법을 사용하여 비장세포 배양액내 IL-4 수준을 정량하였다. 각 마우스에서 비장을 채취한 뒤 비장세포를 분리한 후 분리한 비장세포들을 24 well-culture plate에 분주한 뒤 CO₂ 배양기에서 48시간 배양하였다. 이 때 in vitro 활성화를 위해 polyclonal stimulator로 phytohemagglutinin(PHA, 5μg/1×10⁶cells)을 첨가하였다.

1.6 피부조직의 형태학적 관찰

1.6.1 육안적 관찰

아토피성 피부염을 유발한 직 후와 오일도포 4주에 각 군의 배부 피부의 상태를 육안적으로 관찰하고 디지털 카메라로 촬영하였다.

1.6.2 H&E 염색 후 광학현미경적 관찰

절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린 용액(neutral buffered formalin, NBF)에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과 정을 거친 다음 paraffin에 포매하고 4㎛ 두께로 절편을 만들어 hematoxyline and eosin(H&E)으로 염색 후 광학현미경으로 피부조직의 변화양상을 관찰하였다.

2.6.3 Oil Red O 염색 후 광학현미경적 관찰

절취한 피부조직을 실온에서 10% NBF에 24시간 고정한 후 10% formol-calcium에 1주일 동안 oxidation 처리하였다. 다음 30% sucrose 용액에 cryo-protection한 후 냉동절편기로 10㎛ 두께의 냉동절편을 제작하여 Oil Red O 염색 후 표피 각질층 내 지방과 lipid lamella 분포양상을 광학현미경으로 관찰하였다.

1.6.4 Toluidine Blue 염색 후 광학현미경적 관찰

절취한 피부조직을 실온에서 10% NBF에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 paraffin으로 포매하고 4?m 두께로 절편을 만들어 Toluidine Blue 염색 후 진피 및 피하층 내 mast cell의 분포양상 및 탈과립 정도를 광학현미경으로 관찰하였다.

1.7 행동학적 관찰

Kobayashi (Kobayashi, Y., R. Takahashi, and F. Ogino. 2005. Antipruritic effect of the single oral administration of German chamomile flower extract and its combined effect with antiallergic agents in ddY mice. Ethnopharmacology 101, no. 1-3: 308-312)의 방법을 사용하였다. DNCB로 challenge가 끝난 다음날과 오일 도포 21일, 총 2회에 걸쳐 안면 또는 등 부위 피부의 scratching 회수를 30분간 육안적으로 관찰하여 측정하였다.

1.8 자료 분석

SPSS WIN(v12.0) 통계프로그램을 이용하여 무처치군, 도포대조군, 용매대조군, 실험군 간의 결과자료 비교를 위하여 t-test로 분석을 하였고 유의수준은 0.05이하로 하였다.

2. 시험 결과

2.1 체중, 식이 및 음수량 변동

아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 실험에서 체중, 식이량 및 음수량을 관찰한 결과는 표 3, 도 2와 같다. 일일 체중 증가량은 아토피 유발군 모두 무처치군에 비해 약 27% 유의하게 낮았다(p<0.05). 식이효율은 무처치군에 비해 도포대조군이 약 32%, 용매대조군은 약 36%, 실험군은 약 32% 유의하게 낮았다(p<0.05). 그러나 실험기간 동안 각 군 간의 체중은 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 2).

표 3. Water intake , food intake , body weight gain , and food efficiency ratio of BALB /c mice in 6 weeks -rearing atopic dermatitis model experiment

2.2 혈액학적 변동

아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 후 혈액학적 분석을 한 결과는 표 4와 같다. 도포대조군의 경우 무처치군에 비해 백혈구수는 약 41% 높았으며 백혈구 중 단핵구수는 약 83% 유의하게 높았고(p<0.05) 호산구수는 약 150% 높았다. 실험군의 경우 도포대조군에 비해 백혈구수는 약 38% 유의하게 낮았고(p<0.05) 호산구수는 약 50% 낮았으며, 백혈구 중 호중구수(약 42%)와 단핵구수(약 51%)는 유의하게 낮았다(p<0.05). 적혈구, 혈색소 농도 및 적혈구 용적은 각 군 간에 유의한 차이를 관찰할 수 없었다.

표 4. Hematological values of BALB /c mice after 6 weeks - rearing atopic dermatitis model experiment

2.3 면역학적 변동

2.3.1 혈청 내 IgE 함량 변동

혈청 혹은 혈장내 IgE 수준의 상승은 아토피성 피부염의 대표적인 면역학적 지표로 DNCB를 이용한 아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 실험에서 혈청 내 IgE 함량 변동을 분석한 결과는 표 5, 도 3과 같다. 혈청 내 IgE의 함량은 아토피성 피부염 유발 직 후(실험 2주) 무처치군에 비해 평균 약 4.4배 유의하게 높게 나타났다(p<0.001). 오일도포 2주와 4주에 도포대조군의 경우 무처치군에 비해 각각 약 3.2배와 3.6배 유의하게 높았다(p<0.001). 오일도포 2주와 4주에 용매대조군의 경우 무처치군에 비해 각각 약 2.4배(p<0.01)와 3.6배(p<0.001) 유의하게 높았다.

실험군은 무처치군에 비해 오일도포 2주에는 약 1.9배 유의하게 높았고(p<0.05) 오일도포 4주에는 약 1.5배 높았으나 유의한 차이는 보이지 않았다. 도포대조군과의 비교에서는 오일도포 2주와 4주에 각각 약 42%(p<0.05)와 57%(p<0.01) 유의하게 낮게 나타났다.

표 5. Changes in serum IgE level of BALB /c mice induced atopic dermatitis by DNCB and followed by 4 weeks - dermal application with test compounds

2.3.2 혈청 내 IgG1 함량 변동

마우스의 IgG isotype 중에서 IgG1은 IgE와 같이 IL-4에 의해서 isotype switching이 유도되고 IgG2a는 IFN-γ에 의해서 유도되는 것으로 밝혀진 바 있으므로(Snapper, C. M., and W. E. Paul. 1987. Interferon-g and B cell stimulatory factor-1 reciprocally regulate Ig isotype production. Science 236: 944-947, Kepron, M. R., Y. W. Chen, J. W. Uhr, and E. S. Vitetta. 1989. IL-4 induced the specific rearrangement of gamma 1 genes on the expressed and unexpressed chromosoms of lipopolysaccharide- activated normal murine B cells. J. lmmunol . 143: 334-339), 혈청 내 IgG1과 IgG2a 수준의 상대적 변화에 대한 분석은 in vivo에서 type-1 response와 type-2 response간 항상성에 변화가 발생되었는지를 평가하는 지표치로 사용될 수 있다. 이를 위해 아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 실험에서 혈청 내 IgG1 함량 변동을 분석한 결과는 표 6, 도 4와 같다.

혈청 내 IgG1 함량은 아토피성 피부염 유발 직 후(오일도포 0주) 무처치군에 비해 평균 약 3.3배 유의하게 높게 나타났다(p<0.001). 오일도포 2주에 도포대조군의 경우 약 1.8배 증가하였으며 오일도포 4주에도 2주와 비슷한 수준(plateau level)을 유지한 반면, 실험군은 오일도포 2주에 약 2.1배 증가한 후 오일도포 4주에는 오일도포 2주에 비해 약 31% 낮아졌다.

표 6. Changes in serum IgG1 level of BALB /c mice induced atopic dermatitis by DNCB and followed by 4 weeks - dermal application with test compounds

2.3.3 혈청 내 IgG2a 함량 변동

아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 실험에서 혈청 내 IgG2a 함량 변동을 분석한 결과는 표 7, 도 5와 같다. 혈청 내 IgG2a 함량은 아토피성 피부염 유발 직 후(오일도포 0주) 무처치군에 비해 평균 약 2.4배 높게 나타났다. 오일도포 2주에 아토피 유발군 모두 급격히 증가한 후 오일도포 4주에도 비슷한 수준을 유지하여 각 군 간에 유의한 차이를 발 견할 수 없었다.

표 7. Changes in serum IgG2a level of BALB /c mice induced atopic dermatitis by DNCB and followed by 4 weeks - dermal application with test compounds

2.3.4 혈청 내 Histamine 함량 변동

Histamine(히스타민)은 아토피성 피부염 증상 발현 시 수 시간 만에 상승하는 대표적인 아토피성 피부염 증상 발현 지표물질이다. 이를 위해 아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 실험에 서 혈청 내 히스타민 함량 변동을 분석한 결과는 표 8, 도 6과 같다. 혈청 내 히스타민 함량은 아토피성 피부염 유발 직 후(오일도포 0주) 무처치군에 비해 평균 약 1.6배 유의하게 증가한 후(p<0.05), 오일도포 2주에 감소하였다가 오일도포 4주에는 무처치군 수준으로 환원되는 경향을 관찰할 수 있었다. 실험군의 경우 오일도포 2주에 도포대조군에 비해 약 51% 유의하게 감소하였다(p<0.01).

표 8. Changes in serum histamine level of BALB /c mice induced atopic dermatitis by DNCB and followed by 4 weeks - dermal application with test compounds

2.3.5 비장세포 배양액 내 IL -4 함량 변동

IgE 및 IgG1의 isotype switching을 유도하는 IL-4를 중심으로 한 type-2 cytokine(사이토카인)과 이 사이토카인들의 생산능력을 비교 분석하는 것은 세포면역능의 편향성을 평가하는 방법으로 고려되고 있다. 이를 위해 아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 후 각 마우스에서 비장을 채취한 뒤 비장세포를 분리 배양하여 세포 배양액내 IL-4 함량을 분석한 결과는 표 9, 도 7과 같다. 비장세포 배양액내 IL-4 함량은 아토피성 피부염 유발 후 오일도포 4주에 도포대조군의 경우 무처치군에 비해 약 28% 높았으며 실험군은 도포대조군에 비해 약 50% 낮게 나타났다.

표 9. IL-4 production from splenic T cells of normal and atopic BALB/c dermatitis mice induced by DNCB and followed by 4 weeks-dermal application with test compounds

2.4 피부조직의 형태학적 변화

2.4.1 육안적 관찰

아토피성 피부염 유발 직 후와 오일도포 4주에 배부의 육안적 상태를 디지털 카메라로 촬영한 사진은 도 8, 도 9와 같다. 오일도포 4주에 모든 아토피 유발군에서 아토피성 피부염 유발 직 후에 비해 염증상태가 많이 완화되었고 실험군의 경우 도포대조군에 비해 피부의 염증 상태가 경미함을 확인할 수 있었다.

2.4.2 H&E 염색 후 광학현미경적 관찰

아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 실험에서 적출한 피부를 H&E로 염색하여 표피의 두께 및 진피 내 백혈구 세포의 침윤정도를 광학현미경으로 관찰한 결과는 도 10, 11, 12와 같다. DNCB로 감작과 challenge를 마친 직 후 아토피 유발군의 경우 무처치군에 비해 표 피의 두께가 비후되어 있었고 진피 내 염증반응 관련 세포들이 많이 침윤되어 있음을 관찰하였다. 실험군의 경우 오일도포 4주에 표피의 두께는 무처치군 수준으로 회복되었으며 진피 내 염증반응 관련 세포들의 침윤정도가 도포대조군보다 훨씬 경미함을 관찰할 수 있었다.

2.4.3 Oil Red O 염색 후 광학현미경적 관찰

아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 다음 적출한 피부를 Oil Red O로 염색하여 표피 각질층의 lipid 양 및 lipid lamella의 분포정도를 광학현미경으로 관찰한 결과는 도 13과 같다. 도포대조군은 무처치군에 비해 lipid 양이 훨씬 적었으며 실험군은 도포대조군에 비해 lipid 양이 많았고 lipid lamella가 선상으로 고르게 배열되어 있음을 관찰할 수 있었다.

2.4.4 Toluidine Blue 염색 후 광학현미경적 관찰

아토피성 피부염 유발 후 마우스의 제모한 배부에 3% 저먼 카모마일 오일을 4주 동안 도포한 실험에서 적출한 피부를 Toluidine Blue로 염색하여 진피 및 피하층 내 mast cell의 분포양상 및 탈과립 정도를 광학현미경으로 관찰한 결과는 도 14와 같다. DNCB로 감작과 challenge를 마친 직 후 아토피 유발군의 경우 무처치군에 비해 mast cell의 분포와 탈과립 정도가 훨씬 심한 것을 관찰할 수 있었다. 실험군의 경우 오일도포 4주에 도포대조군보다 mast cell의 분포와 탈과립 정도가 훨 씬 경미함을 관찰할 수 있었다.

2.5 행동학적 변화

아토피성 피부염 유발 후 오일 도포 1일과 21일에 총 2회에 걸쳐 scratching 횟수를 측정한 결과는 표 10, 도 15와 같다. 오일도포 1일에는 아토피유발 군 간에 유의한 차이가 관찰되지 않았으나 오일도포 21일에는 실험군과 용매도포군의 경우 도포대조군에 비해 각각 약 45%(p<0.001)와 19%(p<0.05) 유의하게 감소됨을 관찰하였다.

표 10. Scratching frequency for 30 minutes in atopic dermatitis mice after the second DNCB challenge

도 1. 아토피가 유발된 마우스의 배부(背部)에 조조바 오일에 3%로 희석한 저먼 카모마일 오일을 도포하는 사진.

도 2. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험에서 체중의 변화를 나타낸 그래프.

*Normal : Saline application group.

*Control : DNCB + saline application group.

*Vehicle : DNCB + jojoba oil application group.

*Experimental : DNCB + German chamomile oil application group.

*Values are mean±SE of 10 mice.

도 3. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험에서 혈청 내 IgE 함량의 변동을 나타낸 그래프.

도 4. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험에서 혈청 내 IgG1 함량 변동을 나타낸 그래프.

도 5. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험에서 혈청 내 IgG2a 함량 변동을 나타낸 그래프.

도 6. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험에서 혈청 내 히스타민 함량 변동을 나타낸 그래프.

도 7. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험 완료시 채취한 비장세포를 분리 배양하여 세포 배양액내 IL-4 함량을 분석한 결과 그래프.

도 8. 아토피성 피부염 유발 직후 배부의 육안적 상태를 디지털 카메라로 촬영한 사진.

도 9. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험 완료시 배부의 육안적 상태를 디지털 카메라로 촬영한 사진.

*a : Normal(Saline application group).

*b : Control(DNCB + saline application group).

*c : Vehicle(DNCB + jojoba oil application group).

*d : Experimental(DNCB + German chamomile oil application group).

도 10. 정상 피부와 아토피성 피부염 유발 후 적출한 피부를 H&E로 염색하여 표피의 두께 및 진피 내 백혈구 세포의 침윤정도를 광학현미경으로 관찰(×100, ×400)한 결과 사진.

도 11. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험 완료시 적출한 피부를 H&E로 염색하여 표피의 두께 및 진피 내 백혈구 세포의 침윤정도를 광학현미경으로 관찰(×100)한 결과 사진.

도 12. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험 완료시 적출한 피부를 H&E로 염색하여 표피의 두께 및 진피 내 백혈구 세포의 침윤정도를 광학현미경으로 관찰(×400)한 결과 사진.

도 13. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험 완료시 적출한 피부를 Oil Red O로 염색하여 표피 각질층의 lipid 양 및 lipid lamella의 분포정도를 광학현미경(×400)으로 관찰한 결과사진.

도 14. 아토피성 피부염 유발 후 4주 동안의 오일 도포 실험 완료시 적출한 피부를 Toluidine Blue로 염색하여 진피 및 피하층 내 mast cell의 분포양상 및 탈과립 정도를 광학현미경(×200)으로 관찰한 결과사진.

도 15. 아토피성 피부염 유발 후 오일 도포 1일과 21일에 총 2회에 걸쳐 scratching 횟수를 측정한 결과 그래프.

도 16. Th2 세포의 분화과정에 있어서 저먼 카모마일 오일의 작용기전. 저먼 카모마일 오일은 혈장 내 IL-4, IgE, IgG1, Histamine의 농도를 낮춘다.

Claims

저먼 카모마일 오일을 2~5중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 완화제.
저먼 카모마일 오일 2~5중량%와 조조바 오일 95~98중량%로 이루어진 것을 특징으로 하는 아토피성 피부염 완화제.