KR20090006108A

KR20090006108A - 아르테미아 나우플리이를 포함하는 사료의 제조방법

Info

Publication number: KR20090006108A
Application number: KR1020087025773A
Authority: KR
Inventors: 더크 그리몬프레; 루시안 반 니웬호브
Original assignee: 인베 테크놀로지즈 엔.브이.
Priority date: 2006-03-23
Filing date: 2007-03-21
Publication date: 2009-01-14
Also published as: EP1836901A1; CN101426380A; TW200806189A; WO2007107583A2; WO2007107583A3; US20070224318A1; ECSP088845A; EP2003984A2; BRPI0709112A2

Abstract

본 발명은 아르테미아 나우플리이를 포함하는 수생 유기체용 사료 및 이러한 사료의 제조방법에 관한 것이다. 사료를 장시간 저장할 수 있도록 하기 위해, 사료는 밀폐된 팩키징 내에 함유되고 나우플리이는 열 처리 및 조사 처리와 같은 방법으로 물리적으로 살균 처리한다. 살균 처리하기 전에, 나우플리이는 블랜칭하는 것이 바람직하다. 다량의 나우플리이는 물리적으로 손상되지 않은 상태로 유지되고 양호한 부양성을 나타낸다.

아르테미아 나우플리이, 살균 처리, 열 처리, 조사 처리, 팩키징, 수생 유기체, 사료, 부패 미생물, 평판 배양, 블랜칭, 해수 아가, 엄브렐라 기, 자유 유영, 유생, 세균, 낭포.

Description

아르테미아 나우플리이를 포함하는 사료의 제조방법 {Method for producing a feed comprising Artemia nauplii}

본 발명은 팩키징 내에 함유된 치사 아르테미아 나우플리이(dead Artemia nauplii)를 포함하는, 수생 유기체용 사료(feed)를 제조하는 방법에 관한 것이다. 수생 유기체는 담수 유기체 또는 염수 유기체이며, 특히 어류, 새우 및, 관상어와 같은, 수생 애완 동물, 보다 특히 이들의 유생(larvae)을 포함한다.

양식용으로 적합한 생 사료(live food) 유기체의 유용성은 수산 양식 또는 관상어 산업에서 주요 문제를 남긴다. 통상적으로, 가장 바람직한 생 사료는 브라인 쉬림프(brine shrimp) 아르테미아 나우플리이이다. 이는 인공 사료에 비해 자치어의 성장 및 생존 면에서 가장 우수한 결과를 제공한다.

아르테미아 및 이의 상이한 물리적 형태[엄브렐라 기(umbrella stage), 자유 유영 나우플리이 인스타 I, 풍부한 나우플리이 인스타 II 및 애덜트(adult)]의 크기 범위는 이를 수산 양식에서 광범위하게 다용도로 사용할 수 있게 한다.

생 사료의 유용성은 수 많은 어류 및 갑각류 종의 유생 배양(larviculture)시 제한 요소가 되는 것으로 사료된다. 수 많은 종의 유생은 생 아르테미아 나우플리이를 사용하여 성공적으로 배양되어왔다. 그러나, 생 사료를 사용하는 것과 관련 된 심각한 주요 단점, 이를 테면 배양 시스템에 병균이 도입될 가능성 및 생 사료의 제조시 필요한 노동량과 같은 단점이 존재한다.

아르테미아 나우플리이는 실제로 세균, 주로 중요한 어류 또는 새우 병균인 비브리오 종(Vibrio species)으로 심하게 오염될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 아르테미아 나우플리이는 해산 어류 또는 새우의 유생 양식시, 특히 유생이 스트레스를 받을 경우, 질병 또는 치사를 증폭시킬 수 있는 병원성 세균의 가능한 담체로 간주될 수 있다.

이에 따라, 상이한 화학요법제를 사용하여 상기한 세균 감염을 감소시키기 위한 많은 노력이 이루어졌다(예: 국제공개공보 제WO96/12407호). 이러한 세균 감소는, 아르테미아 나우플리이가, 종종 수산 양식업에서의 경우로서, 포획 후 포식자에 즉시 공급되는 경우에만 유효하다. 아르테미아 나우플리이의 세균수를 감소시키는 또 다른 방법은 일본 특허원 제2006　006211호에 기술되어 있다. 당해 특허원에 따르면, 아르테미아 나우플리이가 유용한 사료이기 위해서는 아르테미아 나우플리이를 살아있는 상태로 유지하는 것이 중요하다. 따라서, 아르테미아 나우플리이를 살아있는 상태로 유지하면서 세균수를 감소시키는 양의 자외선을 아르테미아 나우플리이에 조사한다. 보다 특히, 세균수를 10 내지 1000배 감소시킬 수 있었다. 이러한 방법의 단점은, 아르테미아 나우플리이를 살아 있는 상태로 유지하기 위해 조심스럽게 조절해야 한다는 점이다. 더구나, 처치된 아르테미아 나우플리이는 또한 수시간 내에 사용되어야만 한다. 그러나, 몇몇 수산 양식업 및 대부분의 관상어업에 있어서, 생 아르테미아 나우플리이를 직접 사용하는 것은 실행 가능하지 않 고, 준비, 저장 및 이송하는 동안, 아르테미아 나우플리이 내의 병원성 세균수가 다시 증가할 수 있다.

대부분의 유용한 수생 사료는 냉동 사료 또는 겔화 사료로서 존재한다. 이들 중의 대부분은 다수의 치사 아르테미아 나우플리이를 함유한다. 그러나, 냉동 및 겔화는, 사료를 제한된 기간동안 보존하는 데 유용할 뿐이며, 표적 종에 병원성 세균이 전달되는 것을 방지하지는 못한다.

냉동 사료는 또한 운송업자의 경우 뿐만 아니라 수족관 관리자의 경우에도 냉동 저장이 필요하다는 단점을 지니고 있다. 이송 또는 저장되는 동안 사료가 해동되는 경우, 당해 사료는 신속하게 불량해지며, 이를 재냉동시키는 경우에 조차도 더 이상 사용할 수 없게 된다. 사료가 수족관에 도입되고 수생 동물을 훼손시킬 때까지 병균 또는 기타 유해 미생물의 존재 또는 신선도에 대해 누구도 단언할 수 없다.

더구나, 치사 나우플리이 내부의 냉각수는 결정화되고 세포벽에 침투하여 침출 위험을 증가시킨다. 뿐만 아니라, 유생 어류의 경우에 특히 중요한 인자인 부양(buoyancy)은 최적 상태와는 거리가 멀다.

치사 아르테미아 나우플리이를 합성 또는 천연 겔화제와 함께 포함하는 겔화된 생 사료 유기체는 살균된 상태와는 거리가 멀고, 추가의 겔 물질을 수족관에 도입시켜야 하며, 여전히 사료를 실온에서 저장하기 위해 방부제를 필요로 한다.

치사 아르테미아 나우플리이를 함유하는 동결 건조된 사료가, 지금까지로는 방부제없이 장기간동안 저장할 수 있고 내부의 각각의 아르테미아 나우플리이가 여 전히 어류 및 새우 둘다의 입맛에 맞는 유일한 허용가능한 사료이다.

그러나, 고가의 동결 건조 공정이 종종 이러한 처리를 통상적인 작업용으로 사용하는 것을 방해한다. 더구나, 동결 건조된 나우플리이의 부양은 최적 상태와는 거리가 멀다. 대부분의 나우플리이는 수 표면에 부유하는 경향이 있고, 여기서 이는 대체로 소자치어에 도달하지 못한다. 최종적으로, 동결 건조 처리 또한 모든 병균을 처치하지 못한다.

따라서, 본 발명의 목적은, 방부제를 사용할 필요없이 실온에서 장기간 저장할 수 있도록 사료 부패 미생물의 수가 감소되고 또한 존재가능한 병균의 수가 감소된, 치사 아르테미아 나우플리이를 함유하는 사료의 신규한 제조방법을 제공하는 것이다.

이러한 목적을 위하여, 아르테미아 나우플리이를 물리적 살균 처리 공정에 적용시켜, 당해 공정이 진행되는 동안, 열 또는 γ선 조사에 의해 살균시키고 나우플리이를 함유하는 팩키징을 밀폐시킨다.

열 또는 γ선 조사에 의한 물리적 살균 처리 공정은 익히 공지되어 있고, 이미 사료 산업 분야에 적용되어왔다. 그러나, 당해 공정은 아르테미아 나우플리이를 살균하는데는 결코 적용되지 않는다. 살균 공정에 있어서의 통상의 문제점은, 이들 생성물의 다수가 걸쭉해지거나 응집되거나 이들의 구조적 외관이 엉성해진다는 점이다. 초고온, 초고압 및 가열 기간으로 인해, 미세한 조직상의 특성이 성취되기 어렵다. 무척추 소유기체를 오토클레이빙(autoclaving)하는 경우, 이는 오그라들거나 해체되어 포식자가 알아채지 못하고 흥미를 잃게 된다. 또한, γ선 조사 처리는 무척추 소유기체를 해체할 수 있다.

그러나, 본 발명에 의해, 이를 테면, 애덜트 아르테미아와는 대조적으로, 대부분의 아르테미아 나우플리이는 살균 공정에도 불구하고 원래의 외형을 유지하고 물리적으로 손상되지 않은 상태로 체류하는 반면, 기타 무척추 소유기체는 통상적으로 부분적으로 또는 완전히 해체되는 것으로 밝혀졌다. 애덜트 아르테미아는 부분적으로 또는 완전히 오그라들거나 해체되고 그 오렌지 색상이 바래서 포식자의 사료로서 더이상 매력적이지 못한 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따르는 방법의 바람직한 양태에 있어서는, 나우플리이를 우선 73℃ 이상, 바람직하게는 80℃ 이상의 온도의 고온수로 블랜칭(blanching)시켜서, 나우플리이를 물리적인 살균 처리 공정에 적용시키기 전에 나우플리이 내의 효소 작용을 정지시킨다.

이러한 블랜칭 단계는, 나우플리이의 살균 공정 후 및, 놀랍게도, 부양시에도 물리적으로 손상되지 않은 상태로 체류하는 나우플리이의 수에 포지티브한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 더구나, 본 발명에 의해, 블랜칭 단계 후에 수득한, 나우플리이의 바람직하지 못한 옅은 색상이 살균 공정이 진행되는 동안 바람직한 적오렌지색으로 변환된다는 사실이 밝혀졌다.

본 발명은 또한 본 발명에 따르는 방법으로 수득한 사료에 관한 것이기도 하다. 이러한 사료는, 밀폐된 팩키징 내에 함유되어 있는, 물리적으로 살균된 아르테미아 나우플리이를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명의 추가의 이점 및 특징은 본 발명에 따르는 방법 및 사료의 몇몇 특정 양태에 관해 후술되는 바로부터 명백해질 것이다.

본 발명에 따르는 사료를 제조하기 위해, 아르테미아 나우플리이가 제공되어야 한다. 본원 명세서 및 청구의 범위에 있어서, 아르테미아 나우플리이라는 용어는, 자유 유영 나우플리이 및, 소위, 프리-나우플리이(pre-nauplii), 즉 엄브렐라 기의 아르테미아를 둘다 포함하는 것을 의미한다. 이러한 아르테미아 나우플리이는, 아르테미아 나우플리이가 출현하거나 배양되는 천연 또는 인공 못(pond)으로부터 포획할 수 있다. 포획된 유기체는 나우플리이 및 애덜트 아르테미아를 포함하는 거의 모든 상이한 생물 단계를 포함한다. 애덜트 아르테미아로부터 나우플리이를 분리함으로써 나우플리이의 수를 증가시킬 수 있다. 그러나, 실제로, 아르테미아 나우플리이는 통상적으로 아르테미아 낭포(Artemia cysts)로부터 출발하여 생산한다. 부화는 온도에 따라 약 1 내지 2일에 걸쳐 발생한다. 처음 몇 시간동안, 나우플리이는 낭포 캡슐에 부착된 부화막 내에 체류한다. 이는 또한 나우플리이 단계의 진행이 종료된 "엄브렐라 기"로 칭명된다.

부화시, 나우플리이 유생(인스타 I)은 자유 유영 단계로서 출현한다. 당해 단계는, 난황 물질의 존재로 인해, 길이가 약 0.4 내지 0.5 mm이고 갈색톤 오렌지색을 나타낸다. 어느 정도까지는, 나우플리이 유생의 몸체는 주로 헤드(head)로 이루어져 있다. 이는 세쌍의 헤드 부속지--한쌍의 작은 제1 더듬이(촉각), 한쌍의 고도로 발달된 제2 더듬이 및 한쌍의 하악골--를 지닌다. 복면강을 덮고 있는 큰 입술형 구조물(상순)이 있다. 나우플리이 눈은 존재하나, 이는 당해 단계에서 용이하게 구별되지 않는다.

나우플리이의 후단부는 신개념 트렁크(future trunk)로 이루어져 있다. 초기에는, 이는 짧고 분화되지 않으며 분절되지 않는다. 나우플리이 유생은 완전 소화관을 지니지 않으며 즉시 공급되지 않는다. 이는 에너지원으로서 저장된 난황에 의존한다. 온도에 따라, 약 12 내지 20시간동안 약하게 유영한 후 메타나우플리이 유생(인스타 II)으로 탈피한다.

실제로, 나우플리이 인스타 I을 포획하여 그대로 공급한다. 그러나, 이러한 나우플리이는 통상적으로 포식자에게 바람직한 양질의 영양분을 함유하지 않으며, 따라서 이는 나우플리이가 활동적으로 공급될 수 있는 나우플리이 인스타 II로 추가로 발달할 수 있다. 이는 통상적으로 오일, 비타민 등과 같은 바람직한 사료 성분을 함유하는 풍부한 배지에서 수행된다.

나우플리이 인스타 I 및 인스타 II가 수생 유기체에 공급되기에 가장 적합한 나우플리이이며, 엄브렐라는 가장 작은 포식자에 공급하기에 유용할 수 있다.

나우플리이를 장기간동안 저장할 수 있도록 하기 위해, 나우플리이를 밀폐된 팩키징에 팩키지시키고, 물리적 살균 처리를 수행하고, 당해 단계가 진행되는 동안 나우플리이는 열 또는 γ선 조사에 의해 살균된다.

당해 처리는 무엇보다도 나우플리이상에 존재하거나 나우플리이 내에 존재하는 병원성 미생물의 수, 특히 비브리오균(Vibrio bacteria)의 수를 감소시키기 위한 것이다. 살균 처리는 바람직하게는 살균된 사료가 병원성 미생물을 실질적으로 함유하지 않는 방식으로 수행된다. 이는, TCBS 상에서 콜로니 형성 단위(CFU)의 수를 계수하는 경우, 당해 수가 살균된 사료 1g당 10CFU 미만이어야 함을 의미한다.

상기한 물리적 살균 처리는 추가로 사료 부패 미생물의 수를 감소시켜, 사료가 밀폐된 팩키징 내에서 보다 장시간동안 저장할 수 있도록 하기 위한 것이다. 사료 부패 미생물의 수는, 바람직하게는, 물리적으로 살균되고 밀폐 팩키지된 사료를 사실상 어떠한 사료의 부패도 없이 20℃에서 6개월 이상동안, 바람직하게는 12개월 이상동안, 더욱 바람직하게는 18개월 이상동안 저장할 수 있는 정도로 감소시킨다. 이러한 방식으로, 나우플리이를 상온에서 충분히 장시간동안 저장된 상태로 유지할 수 있고, 심지어 나우플리이는 30℃ 이상의 온도에서 유지되며, 이는 종종 유생 새우 배양물을 대체하는 경우이다. 방부제를 가할 수도 있으나, 아르테미아 나우플리이가 밀폐된 팩키징 내에 체류하는 한 아르테미아 나우플리이에 이러한 방부제를 가할 필요가 없다. 일단 팩키징이 개봉되면, 이는 어떠한 화학적 방부제를 가하지 않고도(항상 방부제를 함유해야 하는 공지된 겔 사료와는 대조적으로) 0 내지 4℃의 온도에서 7일 이하 또는 심지어는 그 이상의 기간(위생적인 상태에서 저장되는 경우에는 심지어 21일까지의 기간)동안 저장할 수 있다.

물리적 살균 처리는 완전 살균 사료, 즉 어떠한 생육성 미생물도 함유하지 않는 사료를 수득하기 위한 것이 아니다. 실제로, 시판용 살균 제품, 즉 미생물에 의한 부패가 발생하지 않고 충분히 장시간동안 저장할 수 있는 제품을 수득하는 것만이 중요하다. 이러한 제품은 예를 들면 소정량의 사료 부패 미생물의 내열성 포자를 여전히 함유할 수 있으나, 그 양이 목적하는 최소의 저장 기간을 달성할 수 있도록 충분히 적어야 한다.

아르테미아 나우플리이의 살균성을 측정하기 위해, 아르테미아 나우플리이를 평판 배양시켜 새우의 외피상에 및 외피내에 존재하는 미생물의 수를 계수한다. 따라서, 살균 제품 1g을 샘플링하고, 오토클레이빙된 인공 해수 9ml에 용해시킨다. 샘플을 스토마커 블렌더[stomacher blender(400SN; Seward Medical, London, UK)]로 5분동안 균일화시킨다. 10배로 희석시킨 일련의 현탁액을 제조하고, 적당한 희석액 100-㎕ 용적을 아가 평판에 산포시킨다. 원 현탁액으로부터 1-ml 용적을 또한 평판 배양한다. 아가 평판을 28℃에서 배양시키고 2일 후에 계수한다. 해수 세균 수를 측정하기 위해, 해수 아가[Marine Agar(MA)], 특히 Difco Laboratories(Detroit, Mich)의 MA　2216을 사용한다. 사료 부패 유기체의 수를 측정하기 위해, 로즈-벵갈 클로르암페니콜 아가[Rose-Bengal Chloramphenicol Agar](효모 및 사상균용)로 제조한 것을 사용할 수 있다. 상기한 바와 같이, 비브리오균의 수는, TCBS를 이용하여 측정할 수 있다. 일반적으로, 나우플리이 또는 사료는, 총수가 나우플리이 또는 사료 1g당 10 cfu 미만을 의미하는 한계수 미만인 경우, 살균된 것으로 간주할 수 있다.

본 발명에 따르는 방법에서 사용할 수 있는 최초의 물리적 살균 처리는 나우플리이를 100℃를 초과하는 온도로 가열하는 열처리이다. 나우플리이의 체구조 또는 체조직을 가능한 한 많이 유지하려는 측면에서, 이를 바람직하게는 110℃를 초과하는 온도, 더욱 바람직하게는 120℃를 초과하는 온도로 가열한다. 열처리는 바람직하게는 1 bar를 초과하는 압력, 더욱 바람직하게는 1.5 bar를 초과하는 압력, 가장 바람직하게는 2 bar를 초과하는 압력에서 수행한다. 이어서, 나우플리이를 오토클레이빙 또는 레토르팅시키는 것이 바람직하다. 압력이 높을수록, 고온을 적용할 수 있고 처리 시간을 단축시킬 수 있다. 이러한 처리 시간은 바람직하게는 5분을 초과하고, 더욱 바람직하게는 10분을 초과하는 시간이다.

제2의 가능한 살균 처리는 γ선 조사에 의한 처리이다. 살균도는 나우플리이가 수여한 조사량에 의존한다. 바람직한 양태에 있어서, 이러한 조사량은 5　kGy 이상, 바람직하게는 15　kGy 이상, 더욱 바람직하게는 25　kGy 이상, 가장 바람직하게는 35　kGy 이상을 포함한다. 즉시 조사할 수 없을 경우, 조사 단계 전에, 나우플리이를 냉각시키거나, 바람직하게는 냉동시킨다. 조사 단계는 냉각되거나 냉동된 나우플리이상으로 직접 수행할 수 있다.

나우플리이는 팩키징 내에 충전시키기 전 또는 팩키징 내에 도입시킨 후에, 그러나 팩키징을 밀폐시키기 전에, 물리적으로 살균시킬 수 있다. 이어서, 나우플리이의 팩키징 또는 팩키징의 밀폐는 실질적으로 살균 조건하에서 수행되어야 한다. 살균 조건하에서 작업해야 하는 것을 피하기 위해, 나우플리이를 바람직하게는 팩키징 내에 도입하고 이러한 팩키징을 물리적으로 살균 처리하기 전에 밀폐시켜, 나우플리이를 이의 팩키징과 함께 살균시킨다. 나우플리이의 팩키징은 병, 단지, 캔, 파우치, 백 등을 함유할 수 있다.

나우플리이를 물리적으로 살균 처리하기 전에, 이를 고온수로 블랜칭시켜 나우플리이 내에서의 효소 작용을 정지시키는 것이 바람직하다. 고온수는 73℃ 이상의 온도, 바람직하게는 80℃ 이상의 온도를 지니는 것이 바람직하다. 통상적으로, 효소 작용을 정지시키는 데 약 1분 내지 약 2분이 걸린다. 나우플리이는 고온수에 침지시키는 것이 바람직하다.

블랜칭 단계의 중요한 이점은, 특히 살균 처리가 γ선 조사 단계를 포함하는 경우, 다수의 나우플리이가 상기한 살균 처리 후에 손상되지 않은 상태로 체류한다는 점이다. 추가의 이점은, 나우플리이의 부양이 개선된다는 점이다. 그러나, 블랜칭 단계는 나우플리이의 색상이 다소 옅어진다는 단점을 지니기도 한다. 그러나, 이러한 단점은 상기한 바와 같은 열 살균 처리에 블랜칭된 나우플리이를 적용시킴으로써 미연에 방지할 수 있다. 참으로, 본 발명에 의해, 상기한 열처리 후에, 양식업자 또는 수족관 소유주에게 이점으로서 감지되는 진한 오렌지색(적오렌지색)이 수득된 것으로 밝혀졌다.

상기한 방법으로부터 명백한 바와 같이, 당해 방법으로 수득한 사료는, 밀폐된 팩키징 내에 함유되어 있는, 물리적으로 살균된 아르테미아 나우플리이를 포함한다. 당해 사료에 포함되어 있는 나우플리이는 물리적으로 손상되지 않은 나우플리이를 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 가장 바람직하게는 85% 이상 포함한다. 사료는 바람직하게는 나우플리이를 결합되지 않은 상태로 포함함으로써, 물에 도입시키는 경우, 이들 중의 대부분은 서로 점착되지 않으며 개별적인 나우플리이로서 섭취될 수 있다. 사료 내의 나우플리이는 수성 배지 내에 개별적으로 현탁시킬 수 있다. 당해 수성 배지는 특히 블랜칭 단계 후 또는 헹굼 단계 후 나우플리이에 부착되는 물로 형성된다. 나우플리이를 팩키징 내에 도입시키기 전에, 체질 또는 누수에 의해 탈수시키는 것이 바람직하다. 그렇다해도, 상당량의 물이 나우플리이에 부착되어, 사료는 여전히 경사분리 가능한 유동액 또는 농축 유동액(나우플리이들 사이의 물의 양에 따라)의 형태로 존재한다.

나우플리이 이외에, 사료는 기타 사료 성분들을 함유할 수 있다. 그러나, 바람직하게는 사료 내에 함유되어 있는 무수물의 50중량% 이상, 더욱 바람직하게는 75중량% 이상이 아르테미아 나우플리이(손상되거나 손상되지 않은)의 무수물이다. 사료는 습식 중량 1g당 10　000 이상, 더욱 바람직하게는 20　000 이상, 가장 바람직하게는 40　000 이상의 아르테미아 나우플리이(손상되거나 손상되지 않은)를 함유한다.

다음 실시예는 살균 공정과 냉동 아르테미아와 대비하여 처리된 아르테미아의 외양에 대한 효과를 예시한다.

실시예 1: 살균성 아르테미아 나우플리이 인스타 I(블랜칭 및 오토클레이브에 의한 열 살균화)

6g 아르테미아 낭포 GSL-균주를 3ℓ인공 해수(염도: 25ppt)에서 28℃의 온도하에 배양시킨다. 물을 완전 통기시키고 발광시킨다. 24시간 후, 나우플리이를 부화시키고(나우플리이 인스타 I), 쉘 및 기타 쇄설물(debris)과 분리한다.

나우플리이는, 이를 85℃의 물에서 1 내지 2분동안 블랜칭시킴으로써 치사시킨다. 열 쇼크 후에, 나우플리이를 유출시킨다.

이어서, 나우플리이를 소형 유리병(±50 ml)에 넣고, 당해 유리병에서 진공 상태가 사라지자마자 펑하고 소리나는 안전 버튼을 함유하는 뚜껑으로 닫는다. 나우플리이는 상층부가 공기용으로 충분한 공간을 남길 때까지(이를 테면, 총 용적의 약 20%) 충전시키지 않는다. 이어서, 충전된 나우플리이를 오토클레이브 내에서 121℃하에 15분동안 가열시킨다.

당해 유리병은 각각에 대해 1.5백만에 해당하는 25g 내외의 아르테미아 나우플리이(습식 중량)를 함유한다. 나우플리이는 손상되지 않은 상태로 존재하고 적오렌지색을 나타낸다. 물 탱크 내에서, 통상적으로 시판되는 나우플리이 또는 동결 나우플리이의 크기와 동일한 크기를 지니는 대부분의 인공 사료보다 더욱 부양이 잘된다. 나우플리이는 상온에서 18개월 이상동안 팩키징 내에서 보존될 수 있다. 방부제 또는 착색제는 전혀 필요하지 않다. 일단 개봉되면, ±4℃에서 21일 이하동안 냉동기에서 유지시킬 수 있고, 위생적인 환경하에서 유지되는 경우, 병균 또는 부패 유기체를 여전히 허용가능하게 낮은 수로 유지할 수 있다.

이를 시험하기 위해, 사료를 제조하고 MA상에서 18개월동안 저장한 후에 평판 배양시켰다. 총수는 매번 사료 1g당 10 CFU 미만이었다. 18개월동안 저장한 후, 소비자가 사용하는 것과 같이 유리병을 매일 잠시동안 개봉하고 냉동기에 저장하였다. 8일, 21일, 36일 및 43일 후, MA, TCBS 및 Rose-Bengal Chloramphenicol Agar상에서의 모든 오염도를 측정하였다. MA상에서의 수는 각각 <10; <10; 27 및 3600 CFU/g이었으며, TCBS 및 Rose-Bengal Chloramphenicol Agar상에서의 수는 10　CFU/g의 검측 한계하에서 유지되었다. 사료는 심지어 개봉 후 3주 내외동안 살균 품질을 유지하였다. 뿐만 아니라, 사료는 주요한 문제를 일으키지 않고 개봉 후 5 또는 6주가 될 때까지도 사용할 수 있었다.

실시예 2: 살균 아르테미아 나우플리이 인스타 II (블랜칭 및 오토클레이브 에 의한 열 살균)

6g 아르테미아 낭포 GSL-균주를 3ℓ인공 해수(염도: 25ppt)에서 28℃의 온도하에 배양시킨다. 물을 완전 통기시키고 발광시킨다. 24시간 후, 나우플리이를 부화시키고(나우플리이 인스타 I), 쉘 및 기타 쇄설물과 분리한다.

나우플리이 인스타 I을 인공 해수 25 ppt 속에서 28℃의 온도하에 추가의 24시간동안 오일 에멀젼을 사용하여 배양시킨 후, 이를 체질하고 유출시킨다.

나우플리이 인스타 I에 대해 동일한 살균 공정을 실시한다(참조: 실시예 1). 유리병은 각각에 대해 1.5백만에 해당하는 25g 내외의 아르테미아 나우플리이(습식 중량)를 함유한다. 나우플리이는 손상되지 않은 상태로 존재하고 적오렌지색을 나타낸다. 물 탱크 내에서, 동일한 크기를 지니는 나우플리이 또는 동결 나우플리이로 이루어진 대부분의 인공 사료보다 더욱 부양이 잘된다. 나우플리이는 상온에서 18개월 이상동안 팩키징 내에서 보존될 수 있다. 방부제 또는 착색제는 전혀 필요하지 않다. 일단 개봉되면, ±4℃에서 21일 이하동안 냉동기에서 유지시킬 수 있고, 위생적인 환경하에서 유지되는 경우, 병균 또는 부패 유기체를 여전히 허용가능하게 낮은 수로 유지할 수 있다.

실시예 3: 살균 아르테미아 나우플리이 인스타 I (블랜칭 및 조사에 의해)

나우플리이 인스타 I을 85℃의 물에서 1 내지 2분동안 블랜칭시킨다. 열 쇼 크 후에, 나우플리이를 유출시킨다.

이어서, 나우플리이를 소형 유리병(±50 ml)에 넣고, 당해 유리병에서 진공 상태가 사라지자마자 펑하고 소리나는 안전 버튼을 함유하는 뚜껑으로 닫는다. 당해 용기를 진공 챔버 속에서 진공시킨다.

조사에 의한 처리가 가능해질 때까지 당해 용기를 냉동시킨다.

이어서, 냉동된 나우플리이를 포함하는 용기를 40-45 kGy가 흡수될 때까지 γ-조사선으로 조사한다. 나우플리이는 개별적이고, 손상되지 않은 상태로 존재하며, 오렌지색이 다소 유지된다. 물 탱크 내에서, 동일한 크기를 지니는 나우플리이 또는 동결 나우플리이로 이루어진 대부분의 인공 사료보다 더욱 부양이 잘된다. 나우플리이는 상온에서 18개월 이상동안 밀폐된 용기 내에서 보존될 수 있다. 방부제 또는 착색제는 전혀 필요하지 않다. 일단 개봉되면, ±4℃에서 21일 이하동안 냉동기에서 유지시킬 수 있고, 위생적인 환경하에서 유지되는 경우, 병균 또는 부패 유기체를 여전히 허용가능하게 낮은 수로 유지할 수 있다.

실시예 4: 살균 아르테미아 나우플리이 인스타 II (블랜칭 및 조사에 의한)

나우플리이 인스타 II를 85℃의 물에서 1 내지 2분동안 블랜칭시킨다. 열 쇼 크 후에, 나우플리이를 유출시킨다.

조사 처리가 가능해질 때까지 당해 용기를 냉각 저장한다. 이어서, 나우플리이를 포함하는 용기를 20-25 kGy가 흡수될 때까지 γ-조사선으로 조사한다. 나우플리이는 개별적이고, 손상되지 않은 상태로 존재하며, 오렌지색이 양호하게 유지된다. 물 탱크 내에서, 동일한 크기를 지니는 나우플리이 또는 동결 나우플리이로 이루어진 인공 사료보다 더욱 부양이 잘된다. 나우플리이는 상온에서 18개월 이상동안 밀폐된 용기 내에서 보존될 수 있다. 방부제 또는 착색제는 전혀 필요하지 않다. 일단 개봉되면, ±4℃에서 21일 이하동안 냉동기에서 유지시킬 수 있고, 위생적인 환경하에서 유지되는 경우, 병균 또는 부패 유기체를 여전히 허용가능하게 낮은 수로 유지할 수 있다.

살균(브랜칭+오토클레이빙) 아르테미아의 외관 상태: 상이한 단계. 엄브렐라기 및 애덜트 아르테미아를 사용하여 동일한 살균 공정을 실시하고, 그 물리적 특성을 나우플리이 인스타 I 및 인스타 II와 비교하였음.

	성체 동물	착색	부양
엄브렐라기	< 60%	적오렌지색	±부양
나우플리이 인스타 I	> 90%	적오렌지색	양호하게 부양
나우플리이 인스타 II	> 90%	적오렌지색	양호하게 부양
애덜트 아르테미아	< 50%	백색	침지

살균(브랜칭+조사: 25kGy) 아르테미아의 외관 상태: 상이한 단계. 엄브렐라기 및 애덜트 아르테미아를 사용하여 동일한 살균 공정을 실시하고, 그 물리적 특성을 나우플리이 인스타 I 및 인스타 II와 비교하였음

	성체 동물	착색	부양
엄브렐라기	> 90%	적오렌지색	±부양
나우플리이 인스타 I	> 90%	적오렌지색	양호하게 부양
나우플리이 인스타 II	> 90%	적오렌지색	양호하게 부양
애덜트 아르테미아	< 80%	백색	±침지

냉동(비살균) 아르테미아의 외관 상태: 상이한 단계

	성체 동물	착색	부양
엄브렐라기	> 90%	옅은 오렌지색	침지
나우플리이 인스타 I	> 90%	옅은 오렌지색	침지
나우플리이 인스타 II	> 90%	옅은 오렌지색	침지
애덜트 아르테미아	< 90%	갈색	침지

사료 실험

블랜칭되고 오토클레이빙된 아르테미아 나우플리이와 블랜칭되고 조사된 아르테미아 나우플리이를 새우 유생을 포함하는 실험실 준비물에 공급하고, 생 아르테미아 나우플리이와 비교하였다. 당해 시험에서, 100 마리의 화이트 슈림프 L. vannamei PL3-단계 후유생을 1L 처리된 해수를 포함하는 2 L Duran 병에 저장하였다. 각각의 처리를 4회 반복하였다. 당해 병을 벤-마리(Bain-Marie) 시스템 속에 정치시킴으로써 수온을 29℃로 조절하였다. 파스퇴르(Pasteur) 피펫을 사용하여 통기시켰다. 물을 매일 40 내지 60% 교환하였다. 사료를 1일에 6회 투여하였다.

생 나우플리이로 처리하기 위해, 아르테미아 부화 및 포획을 1일 2회 수행하였고, 생 나우플리이를 최대 12시간동안 지속적으로 냉각-저장하였다. 단계 PL9에서, 생존 새우의 수를 계수하였다.

아르테미아 나우플리이에 공급된 새우 유생의 생존률(시험 1)

처리된 아르테미아 나우플리이	생존	표준편차
생 나우플리이 인스타 I	83	7
치사 나우플리이: 오토클레이빙됨: 121℃에서 15분	68	16
치사 나우플리이: 조사됨: 18 kGY	80	8
단식 대조용	19	1

오토클레이빙되거나 조사된 치사 나우플리이 둘다에 새우 유생을 제공하였다. 당해 새우 유생의 생존률은 거의 생 나우플리이에 공급된 새우 유생의 생존률 정도로 양호한 경향이 있고, 단식 대조용에서보다 훨씬 높았다. 이러한 시험은, 생 나우플리이를 살균 나우플리이로 부분적으로 또는 심지어 완전히 대체할 수 있음을 입증한다.

아르테미아 나우플리이에 공급된 새우 유생의 생존률(시험 2)

처리된 아르테미아 나우플리이	생존	표준편차
생 나우플리이 인스타 I	86	2
치사 나우플리이: 조사됨: 25 kGy	79	4
치사 나우플리이: 조사됨: 45 kGY	80	8
단식 대조용	16	3

조사된(25 및 45 kGy) 아르테미아 나우플리이 둘다에 새우 유생을 공급하였다. 고 조사(45 kGy)에도 불구하고, 이들 나우플리이에 공급된 새우의 생존률은 저 조사(25 kGy)된 나우플리이에 공급된 새우의 생존률과 대적할 만하다. 생존률은 거의 생 나우플리이에 공급된 새우 유생의 생존률 정도로 양호한 경향이 있고, 단식 대조용에서의 새우의 생존률보다 훨씬 높다. 이러한 시험은, 새우 유생 공급시 생 나우플리이를 조사된 나우플리이로 부분적으로 또는 완전히 대체할 수 있음을 입증한다.

Claims

팩키징에 함유되어 있는 치사 아르테미아 나우플리이(dead Artemia nauplii)를 포함하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법에 있어서, 당해 나우플리이가 열 또는 감마선 조사에 의해 살균됨으로써 물리적으로 살균 처리되고, 당해 나우플리이가 함유되어 있는 팩키징이 밀폐됨을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제1항에 있어서, 나우플리이를 물리적으로 살균 처리하기 전에, 나우플리이가 팩키지되고, 팩키징이 밀폐되며, 나우플리이가 팩키징과 함께 물리적으로 살균 처리됨을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 나우플리이가 살균됨으로써, 20℃에서 6개월 이상, 바람직하게는 12개월 이상, 더욱 바람직하게는 18개월 이상동안 밀폐된 팩키징 내에 저장될 수 있는 양의 사료 부패 미생물을 포함함을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 나우플리이가 살균됨으로써, 해수 아가상에서 평판 배양시키는 경우, 해수 아가 상에서의 세균수가 나우플리이 1g당 10 CFU 미만임을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 물리적으로 살균 처리하는 공정이, 나우플리이가 100℃를 초과하는 온도, 바람직하게는 110℃를 초과하는 온도, 더욱 바람직하게는 120℃를 초과하는 온도로 가열되는 열 처리 단계를 포함함을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제5항에 있어서, 열 처리 단계가, 1 bar를 초과하는 압력, 바람직하게는 1.5 bar를 초과하는 압력, 더욱 바람직하게는 2 bar를 초과하는 압력에서 수행됨을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 나우플리이가 해당하는 온도로 5분 이상, 바람직하게는 10분 이상 처리됨을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 물리적으로 살균 처리하는 공정이 나우플리이를 조사하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제8항에 있어서, 나우플리이가, 5　kGy 이상의 조사량, 바람직하게는 15　kGy 이상의 조사량, 더욱 바람직하게는 25　kGy 이상의 조사량, 가장 바람직하게는 35　kGy 이상의 조사량으로 조사됨을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방 법.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 나우플리이를 물리적으로 살균 처리하기 전에, 나우플리이가, 온도가 73℃ 이상, 바람직하게는 80℃ 이상인 고온수로 블랜칭됨으로써, 나우플리이에서의 효소작용이 정지됨을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제10항에 있어서, 팩키지하기 전에, 나우플리이가 고온수에 침지됨을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 나우플리이가 프리-나우플리이, 나우플리이 인스타 I 및/또는 나우플리이 인스타 II를 포함하며, 바람직하게는 나우플리이 인스타 I 및/또는 나우플리이 인스타 II를 포함함을 특징으로 하는, 수생 유기체용 사료의 제조방법.
밀폐된 팩키징 내에 함유된 물리적으로 살균 처리된 아르테미아 나우플리이를 포함함을 특징으로 하는, 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 방법으로 제조한 사료.
제13항에 있어서, 나우플리이를 결합되지 않은 상태로 포함함을 특징으로 하 는 사료.
제13항 또는 제14항에 있어서, 20℃에서 6개월 이상, 바람직하게는 12개월 이상, 더욱 바람직하게는 18개월 이상동안 저장될 수 있도록 감소된 양의 사료 부패 미생물을 포함함을 특징으로 하는 사료.
제13항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 해수 아가상에 평판 배양시키는 경우, 해수 아가 상에서의 세균수가 사료 1g당 10 CFU 미만임을 특징으로 하는 사료.
제13항 내지 제16항 중의 어느 한 항에 있어서, 나우플리이가, 물리적으로 손상되지 않은 나우플리이를 60% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상 포함함을 특징으로 하는 사료.
제13항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, 사료 1g당 10　000 이상, 바람직하게는 20　000 이상, 더욱 바람직하게는 40　000 이상의 나우플리이를 포함함을 특징으로 하는 사료.