KR20080094911A

KR20080094911A - 하이브리드화 프로브 분석 및 어레이

Info

Publication number: KR20080094911A
Application number: KR1020087019857A
Authority: KR
Inventors: 브리지테 데시리 알버트 콜라우; 기지스버투스 에버라두스 마리아 크레터; 디르크 코넬리스 제레파아스 젤드 판 알레위지크; 린더트 얀 판 도오른
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.; 델프트 디아그노스틱 라보레토리 비브이
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-16
Publication date: 2008-10-27
Also published as: US20100184022A1; WO2007082881A3; CA2636872A1; RU2008129127A; JP2009523416A; JP2013240342A; CN101541974B; GB0600927D0; CN101541974A; RU2461626C2; WO2007082881A8; BRPI0707155A2; EP1977012A2; WO2007082881A2

Abstract

본 발명은 a) 프로브가 미립자 지지체의 표면에 커플링될 수 있게 하는 커플링 기; b) 스페이서; 및 c) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열을 포함하는, 미립자 지지체, 예를들어 마이크로비드와의 커플링에 적합한 프로브에 관한 것으로, 상기 스페이서는 ⅰ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서; 및 임의로 ⅱ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 3 내지 50개의 탄소 단위의 탄소 스페이서를 포함한다.

Description

하이브리드화 프로브 분석 및 어레이 {HYBRIDIZATION PROBE ASSAY AND ARRAY}

본 발명은 분자 사이의 상호작용의 분석에 관한 것이다.

배경기술

단일 누클레오티드 다형성 (SNP)는 생물학적 기능 다양성의 주요 원인으로 인식되고 있다. SNP는 중요한 영향을 미칠 수 있으나, 대부분의 유전적 변화는 비-코딩 (non-coding) DNA 서열에서 관찰된다. 인간 유전학에서의 SNP의 중요성 외에, SNP 검출은 또한 감염성 질병의 분야에서도 중요하다. 인간 파필로마 바이러스 (HPV) 감염에서, 유전형은 중요한 지표이다. 오늘날, HPV족은 중요한 인간 병원체를 포함하는 다양한 군으로 분류될 수 있는 100개 이상의 유전형을 포함한다 (de Villiers et al, 2004). 특히, 고위험 HPV 유형은 자궁경부암을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 이러한 고위험 유형의 인지는 대부분 적절한 치료를 가능케 하는 진단을 위한 강력한 도구를 필요로 한다.

핵산 분석은 특정 DNA 또는 RNA 서열의 검출을 기초로 한다. 표적 핵산, 예를들어 임상 샘플로부터 유래된 핵산은 표지된 검출 프로브에 의해 인지될 수 있다. 상기 분석의 특이성은 표적과 프로브 사이의 하이브리드화 과정의 특이성에 의해 결정된다. 그러나, SNP의 검출은 가장 높은 수준의 특이성을 필요로 한다. 또한, 현재 SNP를 검출하기 위해 다수의 기술 (예를들어, 하이브리드화, 서열분석, 및 질량 분광 분석)이 이용가능하나, 이들중 어느 것도 효과적으로 높은 처리량과 SNP의 고밀도 스크리닝을 겸비하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이러한 수단에 필요성이 증가하고 있다.

복합 분석에서 미세구로서 본원에도 언급된 비드 (또는 마이크로비드), 예를들어 구상 비드의 사용이 예를들어 문헌[Dunbar SA. (Applications of Luminex™(R) xMAPtrade mark technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection. Clin Chim Acta. 2005 Aug 15)]; [Epub ahead of print], Clin Chim Acta. 2006 Jan; 363(1-2):71-82., 참조 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=16102740&query_hl=1), 및 루미넥스 (Luminex™) 제품 정보 및 웹사이트 (www.Luminex™corp.com)를 통해 기존에 기술되어 있었다. 루미넥스™ 시스템은 하나의 샘플 내의 다수의 파라미터 또는 분석대상물을 분석하는데 있어서 매우 강력한 것으로 증명된 비드-기재 복합 (어레이) 기술이다 (Dunbar et al, 2005). 이는 핵산 분석, 수용체-리간드 분석, 면역분석 및 효소 분석을 포함하는 다수의 생체 분석 포맷에 대한 결과를 생성한다.

HPV 검출을 위한 액체 비드 마이크로어레이의 이용은 문헌[Wallace J et al, (Facile, comprehensive, high-throughput genotyping of human genital papillomaviruses using spectrally addressable liquid bead microarrays." J Mol Diagn. 2005 Feb; 7(1):72-80)]에 논의되어 있다.

프로토콜 및 재료가 공지되어 있고, 루미넥스 (Luminex™) 타입 시스텝에 대해 공개되어 있으며, 루미넥스 웹사이트에 제공되어 있으나, 이러한 기술 및 재료에 대해 여전히 개선의 여지가 남아있다. 예를들어, 본 발명자들은 액체 비드 마이크로어레이이 사용을 위한 몇몇 표준 프로토콜이 작은 표적에서의 여러 SNP, 또는 언제나 프로브의 중앙에 존재하지는 않는 다중 점 돌연변이가 존재하는 시스템에 대해 효과적이지 않음을 발견하였다. 루미넥스에 의해 일반적으로 사용되는 TMAC 시스템은 제공된 복합 반응에서 일정한 프로브 길이를 권고한다. 더욱이, TMAC은 독성이 있으며, 보다 높은 온도에서 안정적이지 않다.

본 발명은 비드 기재 분석 시스템, 예를들어 루미넥스와 함께 사용하기에 적합한 프로브 및 프로토콜 고안에서의 개선의 필요를 다루고 있다.

발명의 진술

본 발명은 프로브와 표적 핵산 사이의 임의의 상호작용의 검출을 위한 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은,

ⅰ) 샘플에 존재하는 임의의 이중 가닥 표적 폴리핵산의 변성 단계;

ⅱ) 프로브와 표적 사이에 특이적 하이브리드화가 발생하도록 하는 조건하에서의 상기 변성된 표적과 프로브의 하이브리드화 단계;

ⅲ) 임의로, 엄격한 세척 단계;

ⅳ) 프로브-표적 결합의 검출을 가능케 하는 리포터 분자의 첨가 및 이와의 인큐베이션 단계;

ⅴ) 임의로, 세척 단계; 및

ⅵ) 프로브-표적 결합의 검출 단계를 포함하고,

여기서, 상기 방법은 하기의 추가 단계중 하나 이상을 포함한다:

a) 단계 (ⅱ) 후의 프로브와 표적 사이의 하이브리드화 단계 후의 하이브리드화 온도의 유지 단계;

b) 하이브리드화 단계 (ⅱ) 직후의 희석-세척 단계의 이용 단계;

c) 단계 (ⅲ)에서의 임의의 엄격한 세척 동안의 하이브리드와 온도의 유지 단계;

d) 예를들어, 단계 (ⅱ)에서의 써모-믹서 (thermo-mixer)를 이용한, 단계 (ⅱ)에서의 가열과 함께 교반 또는 혼합 단계;

e) 단계 (ⅳ)에서의 리포터 분자와의 인큐베이션 동안의 하이브리드화 온도의 유지 단계.

한 양태에서, 하이브리드화 온도는 단계 (ⅱ)로부터, 단계 (ⅳ)에서 리포터 분자와의 반응이 종료될 때까지 유지된다.

한 양태에서, 하이브리드화 온도가 프로브와 표적 사이의 하이브리드화 단계 후 및 단계 (ⅲ)에서의 엄격한 세척 단계 동안 유지되는 단계 a 및 c가 수행된다.

한 추가 양태에서, 프로브는 미립자 지지체, 예를들어 비드에 커플링된다.

본 발명은 또한 미립자 지지체, 예를들어 비드와의 커플링에 적합한 프로브에 관한 것으로, 이러한 프로브는,

a) 프로브가 미립자 지지체의 표면에 커플링 (예를들어, 공유적 커플링)될 수 있게 하는 커플링 기 (예를들어, NH₂ 기);

b) 스페이서; 및

c) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열을 포함하고,

여기서, 스페이서는,

ⅰ) 표적 특이적 프로브 서열과 커플링 기 사이의 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서, 예를들어 티민 반복 스페이서 또는 TTG 반복 단위를 포함하는 스페이서; 및 임의로

ⅱ) 표적 특이적 프로브 서열과 커플링 기 사이의 3 내지 50개 또는 13 내지 50개의 탄소 단위의 탄소 스페이서, 적절하게는 C₁₈ 스페이서를 포함한다.

한 양태에서, 스페이서는 표적 특이적 프로브 서열의 3' 말단에 존재한다.

또 다른 양태에서, 스페이서는 표적 특이적 프로브 서열의 5'말단에 존재한다.

본 발명은 또한 예를들어 상이한 표지, 예를들어 형광 표지 또는 바코드에 의해 서로 구별가능한 상이한 미립자 지지체에 커플링된, 적어도 2개의 상이한 표적 특이적 프로브 서열을 포함하는 본원에 기술된 프로브 세트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 2 내지 1000개, 예를들어 2 내지 50개의 상이한 표적 특이적 프로브의 세트에 관한 것으로, 각각의 프로브는,

a) 고체 지지체로의 프로브의 커플링을 가능케 하는 커플링 기;

b) 스페이서; 및

여기서, 스페이서는,

ⅰ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 13 내지 50개의 탄소 단위의 탄소 스페이서; 및

ⅱ) 표적 또는 표적의 플랭킹 (flanking) 영역으로 하이브리드되지 않는, 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 임의의 양태에 정의된 바와 같은 스페이서 서열 그 자체에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 스페이서 분자 및 미립자 지지체, 예를들어 비드를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 스페이서 분자 및 미립자 지지체, 예를들어 비드로의 커플링을 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본원에 정의된 바와 같은 프로브에 커플링된 미립자 지지체, 예를들어 비드에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 스페이서 분자에 커플링된 미립자 지지체, 예를들어 비드 및 표적 분자의 검출에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명의 프로브에 커플링된 미립자 지지체, 예를들어 비드 및 표적 분자의 검출에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한,

a) 프로브가 미립자 지지체의 표면에 커플링될 수 있게 하는 커플링 기;

b) 스페이서; 및

c) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열을 포함하는 프로브 및 미립자 지지체, 예를들어 폴리스티렌 비드를 포함하는 키트에 관한 것으로,

여기서, 상기 스페이서는,

ⅱ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.

본 발명은 또한,

b) 스페이서; 및

c) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열을 포함하는 프로브 및 미립자 지지체, 예를들어 폴리스티렌 비드로의 커플링을 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것으로,

여기서, 상기 스페이서는,

도면의 간단한 설명

도 1a 및 1b는 프로브 & 스페이서 고안의 일반적인 개략적인 개관을 도시한다. 도 1c는 이를 추가로 전개시킨 것이다.

도 2는 비드 기재 검출 시스템을 위한 분석 프로토콜의 개관을 도시한다.

발명의 상세한 설명

본 발명에서, 핵산의 표준 현탁 비드 분석 검출, 예를들어 루미넥스™ 기재 분석에서 사용되는 프로토콜 및 시약에 대한 개선이 있었다.

본 발명에 사용하기 위한 미립자 지지체는 특히 비드를 포함하며, 이는 예를들어 구상 비드 또는 원통형 비드를 포함한다. 비드는 또한 마이크로비드, 또는 마이크로어레이에 사용하기 위한 비드로 언급될 수 있다. 비드에 관한 본 발명의 기재는 또한 본 발명에 사용하기 위한 기타 미립자 지지체에도 적용된다.

본원에 기술된 미세구를 포함하는, 본 발명에 사용하기 위한 비드는 적절하게는 유세포분석에 사용하기에 적합한 비드이다. 비드는 적절하게는 프로브에 커플링되어 프로브와 표적 사이의 상호작용을 검출할 수 있다. 한 양태에서, 비드는 독특한 형광 분자 또는 이러한 분자의 조합물로 표지된다. 적절하게는, 비드 상 또는 비드 내의 표지는 비드 내의 하나 이상의 플루오로크롬의 레이저 여기에 의해 확인될 수 있다. 한 양태에서, 비드는 폴리스티렌 비드이다. 또 다른 양태에서, 비드는 유리 비드이다.

예를들어, 루미넥스 xMAP 시스템은 두개의 스펙트럼적으로 별개의 플루오로크롬으로 내부적으로 염색된 5.6 ㎛의 폴리스티렌 미세구를 포함한다 (상기 문헌[Dunbar et al] 참조). 이러한 비드가 본 발명에 사용하기에 적합하다.

본 발명에 사용하기 위한 기타 비드 표지 시스템은 바코드 또는 디지털 홀로그래픽 소자, 예를들어 일루미나 인크 (Illumina Inc.)사의 바코드 표지된 원통형 비드를 포함한다. 비드 또는 디지털 홀로그래픽 소자는 형광 표지의 대안으로 사용될 수 있다.

예를들어, 일루미나 베라코드 (VeraCode) 시스템은 디지털 홀로그래픽 소자가 엠베딩 (embedding)되어 독특한 비드 유형을 생성시키는, 28 ㎛ 직경의 240 ㎛의 길이 측정용의 원통형 유리 마이크로비드를 포함한다. 레이저에 의해 여기되는 경우, 각각의 베라코드 비드는 특이적으로 검출될 수 있는 독특한 코드 영상을 방출한다.

본 발명의 한 양태에서, 비드는 또한 자성 또는 상자성을 지닐 수 있다.

일반적으로, 비드는 가능한 다중 표적과 다중 프로브 사이의 임의의 상호작용을 동시에 검출하기 위한 복합 시스템에 사용하기에 적합하다.

본원의 실시예는 인간 파필로마바이러스 (HPV) 표적 및 프로브를 이용하나, 개발된 원리는 원칙적으로 임의의 공급원으로부터의 폴리핵산의 검출에 적용될 수 있다.

표준 분자 생물학 기술은 문헌[Sambrook et al, (Molecular cloning a laboratory manual, Cold Spring Harbour Press, third edition)]에 기술되어 있다. 예를들어, 프로브와 표적 사이의 하이브리드 및 표적 핵산의 증폭과 관련된 원리 및 파라미터의 상세사항은 본원에 참조로서 포함되는 EP1012348에 기술되어 있다.

프로브

프로브는 일반적으로 (1) 프로브가 비드 표면에 커플링 (적절하게는, 공유 커플링)될 수 있게 하는 커플링 기 (예를들어, NH₂ 기), (2) 비드 표면과 특이적 프로브 서열 사이의 거리를 생성시키는 스페이서, 및 (3) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열 (본원에서 표적 특이적 프로브 서열로 언급될 수도 있음)을 포함한다.

한 양태에서, 프로브는 비드 또는 기타 지지체 상의 카르복실기로의 커플링에 적합한 일차 아미노기를 지닌다.

한 양태에서, 본 발명은, 예를들어 HPV에 대한 공개된 SPFlO 프로브 세트 (본원에 참조로서 포함되는 EP1012348 참조)와 같은 표적 특이적 HPV 프로브 서열을 함유하는 프로브, 또는 본원에 기술된 임의의 프로브 또는 프로브의 조합물, 특히 폴리카본 반복부와 연결되거나 연결되지 않은 실시예 13에 기술된 프로브 또는 프로브의 조합물에 관한 것이다.

한 양태에서, 본 발명은 표적 핵산의 짧은 단편, 일반적으로 샘플로부터 증폭된 DNA의 단편, 예를들어 20 내지 50개의 염기, 예를들어 20 내지 30개의 염기, 예를들어 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 염기 길이의 단편 내에서 발생하는 SNP의 확인에 적합하다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 프로브의 중앙이 아닌 곳에 위치한 미스매치 사이를 구별할 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 프로브의 중앙으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6 ,7 ,8, 9, 10개 또는 이 이상의 염기의 미스매치 사이를 구별하기 위해 이용될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명은 프로브의 양 말단중 어느 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5 ,6 ,7 ,8, 9, 10개 또는 이 이상의 염기, 적절하게는 3 내지 10개의 염기의 미스매치 사이를 구별하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 프로브는 짧은 표적 단편이 상이한 다중 SNP의 존재에 대해 프로빙되는 것을 가능케 하는 프로브의 말단에 근접한 위치에서 표적이 아닌 것으로부터 표적을 구별하는 것을 가능케 한다.

탄소 기재 스페이서 및 올리고 스페이서와의 조합물

본 발명의 한 양태에서, 프로브는 3 내지 50개 또는 13 내지 50개의 탄소 단위의 탄소 스페이서를 포함하고, 한 양태에서 표적 특이적 프로브 서열과 커플링 기 사이의 C20 내지 C50 스페이서, 예를들어 C20 내지 C40 스페이서, 또는 C20 내지 C30 스페이서를 포함한다. 임의의 적절한 스페이서, 예를들어 C13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 C50 스페이서가 사용될 수 있다. 최적의 결과를 수득하기 위해 표준 기술을 이용하여 결합의 특이성 및 신호 강도에 효과적인 적절한 스페이서가 선택될 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 프로브는 탄소 스페이서의 올리고누클레오티드와 함께 올리고누클레오티드 스페이서를 포함하여, 이러한 올리고누클레오티드 스페이서는 적어도 15개의 누클레오티드 또는 적어도 20개의 누클레오티드, 예를들어 15 내지 150개 또는 20 내지 150개의 누클레오티드, 예를들어 25 내지 100개의 누클레오티드, 30 내지 75개의 누클레오티드, 예를들어 15 내지 20, 20 내지 25, 25 내지 30, 30 내지 35, 35 내지 40, 40 내지 45 및 45 내지 50개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서이다. 예를들어, 올리고누클레오티드 스페이서는 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있다. 한 양태에서, 올리고누클레오티드 스페이서는 폴리 티민 (폴리 T) 스페이서, 또는 기타 적절한 반복 누클레오티드 단위를 포함하는 스페이서, 예를들어 (TTG) 반복 스페이서, 또는 폴리 A (아데닌) 스페이서, 또는 폴리 G 스페이서, 또는 폴리 C 스페이서이다. 적절할 수 있는 기타 이종중합체 스페이서는 TTTG, AAG, AAC, AAAG 또는 AAAC의 반복부를 포함한다. 당 분야에 널리 공지된 통상적인 방법을 이용하여 프로브-표적 상호작용을 최적화시키기 위해 다양한 스페이서가 시험될 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 일반적으로 탄소 스페이서 및 올리고누클레오티드 스페이서 둘 모두를 포함하는 프로브를 제공한다.

한 양태에서, 올리고누클레오티드 스페이서는 탄소 스페이서와 특정 프로브 서열 사이에 위치한다. 이러한 경우, 탄소 스페이서는 C12와 같이 13탄소 단위의 길이보다 짧을 수 있거나, 이보다 더 짧을 수 있다.

한 양태에서, 올리고누클레오티드 스페이서는 표적 서열 또는 표적 서열의 플랭킹 영역에 하이브리드되지 않도록 선택된다. 한 양태에서, 올리고누클레오티드 스페이서는 본 발명에 기술된 방법에 사용시 표적 서열 또는 표적 서열의 플랭킹 영역에 하이브리드되지 않도록 선택된다.

한 양태에서, 올리고누클레오티드 스페이서는 표적 특이적 프로브에 플랭킹되어 있는 스페이서의 영역이 표적 서열 또는 표적 서열의 플랭킹 영역에 하이브리드되지 않도록 선택된다. 이는 도 1c에 도시되어 있다.

폴리카본 스페이서는 문헌[Cowan et al (Transfer of a Mycobacterium tuberculosis genotyping method, Spoligotyping, from a reverse line-blot hybridization, membrane-based assay to the Luminex multianalyte profiling system. J Clin Microbiol. 2004 Jan;42(l):474-7)] 및 문헌[Taylor et al (Taylor JD, Briley D, Nguyen Q, Long K, Iannone MA, Li MS, Ye F, Afshari A, Lai E, Wagner M, Chen J, Weiner MP. Flow cytometric platform for high-throughput single nucleotide polymorphism analysis. Biotechniques. 2001 Mar;30(3):661-6, 668-9)]에 기술되어 있다.

탄소 스페이서는 적절하게는 (CH2)n 스페이서이다.

올리고 스페이서

따라서, 한 양태에서 본 발명은 비드 커플링 기와 표적-특이적 프로브 서열 사이에 올리고누클레오티드 스페이서만을 포함(즉, 탄소 스페이서 부재)하는 프로브를 제공한다.

한 양태에서, 이러한 스페이서는 적어도 15개의 누클레오티드 또는 적어도 20개의 누클레오티드를 지닌다. 한 양태에서, 이러한 스페이서는 15 내지 150개 또는 20 내지 150개의 누클레오티드, 예를들어 25 내지 100개의 누클레오티드, 30 내지 75개의 누클레오티드, 예를들어 15 내지 20, 20 내지 25, 25 내지 30, 30 내지 35, 35 내지 40, 40 내지 45 및 45 내지 50개의 누클레오티드를 지닌다.

예를들어, 올리고누클레오티드 스페이서는 동종중합체 또는 이종중합체일 수 있다. 한 양태에서, 올리고누클레오티드 스페이서는 폴리 티민 (폴리 T) 스페이서, 또는 기타 적절한 반복 누클레오티드 단위를 포함하는 스페이서, 예를들어 (TTG) 반복 스페이서, 또는 폴리 A (아데닌) 스페이서, 또는 폴리 G 스페이서, 또는 폴리 C 스페이서이다. 적절할 수 있는 기타 이종중합체 스페이서는 TTTG, AAG, AAC, AAAG 또는 AAAC의 반복부를 포함한다. 당 분야에 널리 공지된 통상적인 방법을 이용하여 프로브-표적 상호작용을 최적화시키기 위해 여러 스페이서가 시험될 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 비드 커플링 기와 표적-특이적 프로브 서열 사이에 올리고누클레오티드 스페이서를 포함하는 프로브를 제공하고, 이러한 올리고누클레오티드 스페이서는 폴리티민 (폴리 T) 스페이서이다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 비드 커플링 기와 표적-특이적 프로브 서열 사이에 올리고누클레오티드 스페이서를 포함하는 프로브를 제공하고, 이러한 올리고누클레오티드 스페이서는 TTG 반복 스페이서 또는 폴리 A 스페이서이다.

한 양태에서, 스페이서 (탄소 + 올리고누클레오티드 스페이서, 또는 올리고누클레오티드 스페이서 단독)은 표적 특이적 프로브 서열의 3' 말단에 위치한다. 또 다른 양태에서, 스페이서는 표적 특이적 프로브 서열의 5' 말단에 위치한다.

한 양태에서, 올리고누클레오티드 스페이서는 표적 서열 또는 표적 서열의 플랭킹 영역에 하이브리드되지 않도록 선택된다. 한 양태에서, 올리고누클레오티드 스페이서는 본원에 기술된 방법에 사용되는 경우 표적 서열 또는 표적 서열의 플랭킹 영역에 하이브리드되지 않도록 선택된다.

한 추가 양태에서, 본 발명은 적절하게는 본 발명의 임의의 프로브 또는 프로브들을 포함하는, 적어도 2개의 프로브를 포함하는 프로브 세트에 관한 것으로, 여기서 하나 이상의 프로브는 프로브의 5' 말단을 통해 비드 또는 스페이서에 연결되고, 하나 이상의 프로브는 프로브의 3' 말단을 통해 비드 또는 스페이서에 연결된다.

스페이서 서열

본 발명은 또한 액체 비드 기재 검출 시스템과 함께 사용하기에 적합한 스페이서 서열에 관한 것이다. 본 발명에 따른 스페이서는 본원에 기술된 임의의 스페이서일 수 있다. 스페이서는 예를들어 함께 커플링되고, 표적 특이적 프로브 서열로의 부착에 적합한 폴리카본 반복부 (예를들어, C₁₂ - C₃₀) 및 올리고누클레오티드 반복부 (예를들어, 15 내지 150개 또는 20 내지 150개 누클레오티드 길이의 폴리 T 또는 폴리 (TTG) 또는 폴리 A)를 포함하거나, 이로 구성될 수 있다.

본 발명의 스페이서는 또한 15 내지 150개 또는 20 내지 150개 또는 25 내지 150개의 전체 누클레오티드 길이의 올리고누클레오티드 반복부를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.

스페이서는 적절하게는 비드로의 부착에 적합한 커플링 기, 예를들어 일차 아미노기를 포함한다.

본 발명은 또한 비드로 커플링된 본 발명의 스페이서 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 표적 특이적 서열에 커플링되고, 임의로 비드로도 커플링된 본 발명의 스페이서 분자에 관한 것이다.

키트

본 발명은 또한 표적 특이적 프로브 서열로의 커플링을 위한 설명서와 함께 미립자 지지체, 예를들어 비드로 커플링된 본 발명의 스페이서 분자를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 또한 미립자 지지체, 예를들어 비드로 커플링된 본 발명의 프로브 및 표적의 검출에 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트에 관한 것이다.

방법

본 발명은 또한 비드 기재 기술을 이용하여 핵산 수준에서 프로브-표적 상호작용을 검출하기 위한 현존하는 프로토콜을 개선시킨 특정 방법에 관한 것이다.

비드 기재 기술, 예를들어 루미넥스 기술은 당 분야와 해당 문헌에 널리 기재되어 있다. 미세구로도 언급되는 비드는 적합하게는 모든 내용이 참조로서 본원에 포함되는 본원의 참고문헌 [Dunbar et al]에 기술된 바와 같은 폴리스티렌 비드이다.

본 발명의 일반적인 방법은 프로브, 적절하게는 본원에 정의된 프로브와 표적 핵산 사이의 임의의 상호작용의 검출을 위한 표준 반응이다. 이러한 방법은 적절하게는 하기 단계를 포함한다:

(ⅰ) 샘플 내에 존재하는 임의의 표적 폴리핵산의 변성 단계; (ⅱ) 프로브와 표적 사이에 특이적 하이브리드화가 발생하도록 하는 조건하에서 표적과 프로브의 하이브리드화 단계; (ⅲ) 임의로, 모든 실질적으로 결합하지 않은 물질을 제거하는 엄격한 세척 단계; (ⅳ) 프로브-표적 결합의 검출을 가능케 하는 리포터 분자의 첨가, 및 이와의 인큐베이션 단계; (ⅴ) 임의로, 세척 단계; 및 (ⅵ) 프로브-표적 결합의 검출 단계.

이러한 프로토콜의 상세한 예는 본원에 포함된 실시예에 제공된다.

일반적인 단계는 적절하게는 연속적이나, 한 양태에서, 특정 단계는 함께 수행될 수 있으며, 예를들어 프로브는 표적 및 리포터 분자와 동시에 반응된다.

표적 핵산으로의 프로브의 특이적 하이브리드화는 상기 프로브가 사용된 실험 조건하에서 상기 표적 영역의 일부 또는 전체 표적 영역과 함께 듀플렉스 (duplex)를 형성하고, 상기 조건하에서 상기 프로브는 분석되는 샘플 내에 존재하는 폴리핵산의 기타 영역과는 듀플렉스를 형성하지 않는다.

엄격한 세척 조건은 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를들어 50℃에서의 3X SSC, 0.1% 사르코실을 포함하며, 이러한 조건은 본원의 실시예에 기술되어 있다.

단계 (ⅴ)에서의 세척은 예를들어 과량의 리포터 분자를 제거하는 당 분야에 널리 공지된 임의의 적절한 조건하에서 수행된다. 본 발명의 한 양태에서, 세척은 세척 단계에서 사용되는 것보다 낮은 농도의 SSC, 예를들어 실질적으로 2 x SSC, 1.5 x SSC, 또는 실질적으로 1x SSC의 존재하에서 수행한다.

검출은 임의의 적절한 방법에 의해 수행될 수 있으며, 본 발명의 한 양태에서는 비드, 예를들어 문헌[Dunbar(상기)]에 기술된 루미넥스 비드 시스템의 형광 특성에 기초한 표적 프로브 상호작용을 검출하기 위한 유세포분석을 이용한다. 특히, 상기 문헌은 예를들어 루미넥스 xMAP 시스템이 두개의 스펙트럼적으로 별개의 플루오로크롬으로 내부적으로 염색된 5.6 ㎛의 폴리스티렌 미세구를 포함하는 것으로 기재되어 있다. 정확한 양의 상기 플루오로크롬의 각각을 이용하여, 특이적 스펙트럼 어드레스를 지니는 상이한 미세구 세트로 구성되는 어레이가 생성된다. 각각의 미세구 세트는 이의 표면 상에 상이한 반응물질을 지닐 수 있다. 미세구 세트는 이들의 스펙트럼 어드레스에 의해 구별될 수 있으므로, 이들은 예를들어 100개 이상의 상이한 분석대상물이 단일한 반응 용기에서 동시에 측정되는 것을 가능케 하도록 조합될 수 있다. 리포터 분자에 커플링된 세번째 플루오로크롬은 미세구 표면에서 발생된 생체분자 상호작용을 정량한다. 미세구는 루미넥스® 100™ 분석기 내에서 두개의 별개의 레이저에 의해 통과하므로 신속하게 흐르는 유체 스트림에서 개별적으로 인테로게이팅 (interrogating)된다. 635-nm 10-mW 적색 다이오드 레이저는 미세구 내에 함유된 두개의 플루오로크롬을 여기시키고, 532-nm, 13-mW 이트륨 알루미늄 가넷 (YAG) 레이저는 미세구 표면에 결합된 리포터 플루오로크롬 (R-피코에리트린, 알렉사 (Alexa) 532, 또는 Cy3)을 여기시킨다. 고속 디지털 신호 처리는 미세구의 스펙트럼 어드레스에 기초하여 미세구를 분류하고, 표면 상의 반응을 정량한다. 수천개의 미세구가 초당 인테로게이팅되어, 샘플당 단지 수초로 단일한 반응 용기 내의 예를들어 100개 이상의 상이한 반응을 분석하고 보고할 수 있는 분석 시스템을 생성시킨다.

본 발명의 한 양태에서, 비드는 상자성 비드일 수 있다. 한 양태에서, 비드는 비드의 자성에 기초한 기계적 혼합을 이용하여 표적 및/또는 리포터와 혼합될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (ⅱ) 후의 프로브와 표적 사이의 하이브리드화 단계 후에 하이브리드화 온도의 유지를 포함한다. 한 양태에서, 하이브리드화 온도는 적어도 단계 (ⅲ)의 엄격한 세척까지 유지된다. 한 양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (ⅳ)에서 리포터 분자와의 인큐베이션 동안의 하이브리드화 온도의 유지를 포함한다.

이와 같이, 본 발명은 프로브와 표적 핵산 사이의 임의의 상호작용의 검출을 위한 상기 기술된 방법에 관한 것으로, 표적과 프로브 사이의 하이브리드화 반응의 온도는 리포터 분자와의 반응이 실질적으로 완료될때까지 유지된다.

한 양태에서, 본 발명의 방법은 또한 단계 (ⅱ)의 하이브리드화 직후의 희석-세척 단계의 이용을 포함한다. 이러한 단계는 표적과 프로브 사이의 반응물의 부피를 증가시키고, 비특이적 하이브리드화의 가능성을 감소시키는 것으로 보인다. 희석은 상기 방법의 단계 (ⅱ)에서 결합되지 않은 임의의 물질을 제거하는데 사용된 세척 완충용액을 이용하여 수행될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명의 방법은 예를들어 단계 (ⅱ)에서 열-혼합기 (thermo-mixer)의 사용에 의해 가열하면서 진탕하거나 혼합하는 것을 포함한다. 열-혼합기는 일반적으로 사전결정될 수 있는 온도에서 샘플을 혼합을 제공하는 임의의 장치이다. 여기서, 혼합은 적절하게는 하이브리드화 온도에서 수행되며, 일반적으로 50℃ 이상, 예를들어 50 내지 55℃, 예를들어 50℃, 52℃, 54℃ 및 55℃이다.

한 양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (ⅵ) 후의 신호의 검출 전에 1X SSC 내의 최종 프로브-표적 복합체의 세척을 포함한다. 이러한 세척은 실온에서 수행될 수 있다.

한 양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (ⅵ) 후의 신호의 검출 전에 최종 프로브-표적 복합체의 진탕을 포함한다.

한 추가 양태에서, 본 발명의 방법은 단계 (ⅰ) 전에 비드와 프로브의 커플링의 추가 단계를 포함한다. 이러한 방식에서, 표적과 프로브 사이의 반응은 고체 지지체의 환경에서 발생한다.

한 추가 양태에서, 본 발명은 프로브가 비드, 적절하게는 플루오로크롬을 지니는 폴리스티렌 비드에 연결되는 상기 기술된 바와 같은 방법에 관한 것이다.

한 추가 양태에서, 본 발명은 상이한 표적을 검출하기 위해 적어도 2개의 프로브가 동시에 사용되는 상기 기술된 바와 같은 방법에 관한 것이다. 이러한 반응은 일반적으로 복합 반응으로 언급된다. 한 양태에서, 상이한 표적 특이성을 지니는 본 발명의 프로브가 비드에 부착되고, 이러한 비드 각각은 각각의 유형의 특이적 프로브에 대해 특이적이다.

한 추가 양태에서, 본 발명은 적어도 2개 유형의 특이적 프로브를 포함하는 복합 반응에 관한 것으로, 상기 프로브는 비드, 적절하게는 별개의 플루오로크롬으로 표지된 비드에 부착되고, 복합 반응에서의 상이한 프로브의 프로브 길이는 동일하지 않다. 예를들어, 소정의 폴리누클레오티드 (예를들어, DNA) 단편은 상이한 다중 타입의 특이적 프로브로 동시에 프로빙되며, 한 양태에서 본 발명은 동등한 길이의 모든 프로브를 필요로 하지 않고, 한 양태에서 프로브는 길이가 다양하다.

한 추가 양태에서, 프로브와 표적 사이의 하이브리드화는 적절하게는 프로브-표적 상호작용이 발생하는 이온 환경을 제공하는 시트르산 나트륨 (SSC) 또는 이의 동등체, 예를들어 2x 내지 4x SSC 또는 3x SSC의 존재하에서 수행된다.

본 발명은 하기의 실시예로 예시되며, 이는 본 발명을 제한하고자 하는 바는 아니다.

재료 & 방법:

상기의 문헌[Wallace et al (2005)]에 따른 표준 하이브리드화 방법 (순차)은 하기와 같다:

1. 적절한 올리고누클레오티드가 커플링된 미세구 세트를 선택한다.

2. 볼텍스 (vortex)에 의해 미세구를 재현탁시키고, 약 20초 동안 음파처리한다.

3. 커플링된 미세구 스톡을 1.5x TMAC (1x TMAC = 2mol/l TMAC / 0.15% 사르코실 (Sarkosyl) / 75mmol/l Tris, 6mmol/l EDTA) 하이브리드화 완충용액에 μl당 150개의 미세구의 각각의 세트로 희석시켜 작용 미세구 혼합물 (Working Microsphere Mixture)을 제조한다 (주의: 각각의 반응에 33 μl의 작용 미세구 혼합물이 필요함).

4. 볼텍스에 의해 작용 미세구 혼합물을 혼합시키고, 약 20초 동안 음파처리한다.

5. 각각의 샘플 또는 백그라운드 웰에 33 μl의 작용 미세구 혼합물을 첨가한다.

6. 각각의 백그라운드 웰에 17 μl의 dH₂O를 첨가한다.

7. 각각의 샘플 웰에 증폭된 비오티닐화된 DNA 및 dH₂O를 첨가하여 전체 부피를 17 μl로 만든다 (주의: 검출에 7 μl의 PCR 반응물이 사용됨).

8. 수차례의 피페팅 업 & 다운으로 반응 웰을 천천히 혼합시킨다.

9. 써모사이클러 (thermocycler)에서 증폭된 비오티닐화된 DNA를 변성시키기 위해 5분 동안 99℃에서 인큐베이션시킨다.

10. 15분 동안 하이브리드화 온도 (55℃)에서 반응 플레이트를 인큐베이션시킨다.

11. 인큐베이션 동안, 빙냉의 1x TMAC으로 2회 세척하여 필터 플레이트를 제조한 후, 필터 플레이트의 각각의 웰을 빙냉 1x TMAC으로 채운다.

12. 인큐베이션 동안, 스트렙타비딘-R-피코에리트린을 1x TMAC 하이브리드화 완충용액 중에 2μg/ml로 희석시켜 새로운 리포터 혼합물을 제조하고 (주의: 각각의 반응에 75 μl의 리포터 혼합물이 필요함), 이를 하이브리드화 온도의 오븐 또는 수조에 둔다.

13. 전체 반응물을 빙냉 세척 완충용액을 함유하는 필터 플레이트로 옮김으로써 하이브리드화 반응을 중지시킨다.

14. 옮긴 후, 진공 여과를 개재시킴으로써 빙냉 1x TMAC 세척 완충용액으로 필터 플레이트를 엄격하게 2회 세척한다.

15. 각각의 웰에 75 μl의 리포터 혼합물을 첨가하고, 수차례 피펫팅 없 & 다운으로 천천히 혼합한다.

16. 전체 플레이트를 약 30분 동안 실온에 도달하도록 둔다.

17. 30분 동안 하이브리드화 온도에서 반응 플레이트를 인큐베이션시킨다.

18. 진공 여과에 의해 인큐베이션을 중지시킨다.

19. 진공 여과를 개재시킴으로써 1x TMAC 세척 완충용액으로 2회 세척한다.

20. 진공 여과를 개재시킴으로써 1x TMAC 세척 완충용액에 반응물을 용해시킨다.

21. 시스템 매뉴얼에 따라 루미넥스™ 100 분석기에서 실온에서 분석한다.

[도 2 참조. 문헌[Wallace et al (2005)]에 기술된 바와 같은 작업 흐름도의 일반적인 도식적 개략도]

시험의 민감성 및 특이성은 프로브와 표적 핵산 서열 사이의 특이적 하이브리드화를 기초로 한다. 따라서, 하이브리드화 및 세척 뿐만 아니라 PE와의 인큐베이션이 상기 방법에서 중요한 단계로 여겨진다. 다양한 파라미터, 예를들어 온도 및 확산 동력학을 최적화시킴으로써 반응의 특이성 및 민감성을 최대화시키기 위해 프로토콜을 적합화시켰다. 이러한 적합화는 최적화된 하이브리드화 프로토콜로 여겨진다 (하기 참조).

재료:

A. 완충용액

0.1 M MES pH 4.5 (커플링 완충용액)

시약	카탈로그 번호	최종 농도	양/250 ml
MES (2[N-모르폴리노]에탄설폰산)	시그마 (Sigma) M-2933	0.1 M	4.88 g
dH₂O	-	-	250 ml까지
5N NaOH	피셔 (Fisher) SS256-500	-----	~ 5 점적

필터 (45μm) 멸균하고 4℃에 보관

0.02% TWEEN (세척 완충용액 Ⅰ)

시약	카탈로그 번호	최종 농도	양/250 ml
TWEEN 20 (폴리옥시에틸렌소르비탄 모노라우레이트)	시그마 P-9416	0.02%	50 μl
dH₂O	----	----	250 ml

필터 (45μm) 멸균하고 실온에 보관

20% 사르코실

시약	카탈로그 번호	최종 농도	양/250 ml
사르코실 (N-라우로일사르코신)	시그마 L-9150	20%	50 g
dH₂O	----	----	250 ml로 조정

필터 (45μm) 멸균하고 실온에 보관

TE pH 8.0 (샘플 희석제)

시약	카탈로그 번호	최종 농도	양/250 ml
Tris EDTA 완충용액 pH 8.0 100X	시그마 T-9285	1X	2.5 ml
dH₂O	----	----	247.5 ml

필터 (45μm) 멸균하고 실온에 보관

4.5x SSC / 0.15% 사르코실 하이브리드화 완충용액 (미세구 희석제)

시약	카탈로그 번호	최종 농도	양/50 ml
20x SSC (3M 염화나트륨, 0.3M 시트르산 나트륨 데히드레이트, pH 7.0)	캄브렉스 (Cambrex) US51232	4.5x	11.25 ml
20% 사르코실	----	0.15%	0.375 ml
dH₂O	----	----	38.375 ml

필터 (45μm) 멸균하고 실온에 보관

3x SSC / 0.1% 사르코실 / 1 mg/ml 카세인 엄격 세척 완충용액

시약	카탈로그 번호	최종 농도	양/50 ml
20x SSC	캄브렉스 US51232	3x	7.5 ml
20% 사르코실	----	0.1%	0.250 ml
50 mg/ml 카세인 (pH 7.2)	VWR BDHA440203H	----	1 ml
dH₂O	----	----	41.25 ml

필터 (45μm) 멸균하고 4℃에 보관

1x SSC / 0.1% 사르코실 / 1 mg/ml 카세인 세척 완충용액

시약	카탈로그 번호	최종 농도	양/50 ml
20x SSC	캄브렉스 US51232	1x	2.5 ml
20% 사르코실	----	0.1%	0.250 ml
50 mg/ml 카세인 (pH 7.2)	VWR BDHA440203H	----	1 ml
dH₂O	----	----	46.25 ml

필터 (45μm) 멸균하고 4℃에 보관

B. 비드

1. 사용된 비드 유형은 L100-C123-01 내지 L100-C172-01 (Luminex™ Corp., Austin, TX)이었다.

C. 프로브 (실시예 참조)

1. 유로젠텍 (Eurogentec, Seraing, Belgium)에서 프로브를 공급하였다.

D. 장비

장비	유형
써모사이클러	ABI GeneAmp PCR 시스템 9700
열 혼합기	에펜도르프 (Eppendorf) 열혼합기 콤포트 (comfort)
수조	GFL 1001
인큐베이션 오븐	메머트 (Memmert) U25U
루미넥스™	루미넥스™ X100

방법 & 프로토콜:

I. 프로브 커플링

1. -20℃의 새로운 분취량의 건조된 피어스 (Pierce) EDC [1-에틸-3-[디메틸아미노프로필]카르보디이미드 히드로클로라이드] 분말을 실온이 되도록 한다.

2. 아민 치환된 올리고누클레오티드 ("프로브" 또는 "포획" 올리고)를 dH₂O 중에 0.2mM (0.2nmol/μl)로 재현탁시킨다.

3. 볼텍스에 의해 스톡 미세구를 재현탁시키고, 약 20초 동안 음파처리한다.

4. 5.0 x 10⁶개의 스톡 미세구를 USA 사이언티픽 마이크로퓨즈 (Scientific microfuge) 튜브에 옮긴다.

5. 1-2분 동안 8000 x g 이상에서 미세원심분리시켜 스톡 미세구를 펠레트화시킨다.

6. 상층액을 제거하고, 펠레트화된 미세구를 50 μl의 0.1M MES (pH 4.5) 중에서 볼텍스에 의해 재현탁시키고, 약 20초 동안 음파처리한다.

7. dH₂O 중 0.2 mM 포획 올리고의 1:10 희석액 (0.02nmol/μl)을 제조한다.

8. 2 μl (0.04 nmol)의 1:10 희석된 포획 올리고를 재현탁된 미세구에 첨가하고, 볼텍스에 의해 혼합시킨다.

9. dH₂O 중에 20 mg/ml EDC의 새로운 용액을 제조한다. 사용전 1분 이내에 500μl의 dH₂O 중에 10 mg의 EDC를 용해시킨다. 1O mg EDC (분말)의 분취량을 실리카 겔과 함께 패킹하여 -80℃에서 건조 보관시킨다.

10. 각각의 반응을 위해 하나씩, 2.5 μl의 새로이 제조된 20 mg/ml EDC를 미세구에 첨가하고, 볼텍스에 의해 혼합시킨다 (주의: EDC 분말의 분취량은 여기서 폐기되어야 한다).

11. 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다.

12. dH₂O 중 20 mg/ml EDC의 제 2의 새로운 용액을 제조한다.

13. 각각의 반응을 위해 하나씩, 2.5 μl의 새로운 20 mg/ml EDC를 미세구에 첨가하고, 볼텍스에 의해 혼합시킨다 (주의: EDC 분말의 분취량은 여기서 폐기되어야 한다).

14. 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션시킨다.

15. 커플링된 미세구에 1.0 ml의 0.02% Tween-20을 첨가한다.

16. 1-2분 동안 8000 x g 이상에서 미세원심분리시켜 커플링된 미세구를 펠레트화시킨다.

17. 상층액을 제거하고, 볼텍스에 의해 커플링된 미세구를 1.0 ml의 0.1% SDS에 재현탁시킨다.

18. 1-2분 동안 8000 x g 이상에서 미세원심분리시켜 커플링된 미세구를 펠레트화시킨다.

19. 상층액을 제거하고, 볼텍스에 의해 커플링된 미세구를 100 μl의 TE (pH 8.0)에 재현탁시키고, 약 20초 동안 음파처리한다.

20. 1-2분 동안 8000 x g 이상에서 미세원심분리시켜 커플링된 미세구를 펠레트화시킨다.

21. 상층액을 제거하고, 볼텍스에 의해 커플링된 미세구를 100 μl의 TE (pH 8.0)에 재현탁시키고, 약 20초 동안 음파처리한다.

22. 혈색소계로 커플링된 미세구를 계산한다:

a. 재현탁된 커플링된 미세구를 dH₂0 중에 1:100으로 희석시킨다.

b. 볼텍스에 의해 충분히 혼합시킨다.

c. 10 μl를 혈색소계로 옮긴다.

d. 혈색소계 격자의 4개의 큰 사각형 내의 미세구를 계산한다.

e. 미세구/μl = (4개의 큰 사각형 내의 미세구의 합계) x 2.5 x 100 (희석 인자). (주의: 최대는 50,000 미세구/μl이다).

23. 커플링된 미세구를 어두운 곳에서 2-10℃에서 냉동 보관시킨다.

Ⅱ. 최적화된 하이브리드화 & 세척 프로토콜

1. 적절한 올리고누클레오티드 커플링된 미세구 세트를 선택한다.

2. 볼텍스에 의해 미세구를 재현탁시키고, 약 20초 동안 음파처리한다.

3. 커플링된 미세구 스톡을 4.5xSSC/0.15% 사르코실 하이브리드화 완충용액 중에 μl당 각각 150개의 미세구의 각각의 세트로 희석시킴으로써 작용 미세구 혼합물을 제조한다 (주의: 각각의 반응에 대해 33 μl의 작용 미세구 혼합물이 필요함).

6. 각각의 백그라운드 웰에 17 μl의 TE (pH 8)를 첨가한다.

7. 각각의 샘플 웰에 증폭된 비오티닐화된 DNA 및 TE (pH 8.0)를 첨가하여 전체 부피를 17 μl로 만든다 (주의: 4 μl의 로버스트 (robust) 50 μl PCR 반응물이 보통 검출에 충분하다).

8. 수차례 피펫팅 업 & 다운으로 반응 웰을 천천히 혼합시킨다.

9. 써모사이클러에서 증폭된 비오티닐화된 DNA를 변성시키기 위해 5분 동안 95-100℃에서 인큐베이션시킨다.

10. 써모사이클러에서 3분 동안 60℃에서 반응 플레이트를 인큐베이션시킨다.

11. 반응 플레이트를 하이브리드화 온도에서 미리 가열된 열혼합기로 옮긴다 (주의: 8개의 웰의 반응물을 동시에 옮기기 위해 8-채널 피펫터가 사용될 수 있다).

12. 15분 동안 하이브리드화 온도에서 500rpm으로 반응 플레이트를 인큐베이션시킨다.

13. 인큐베이션 동안, 증류수로 세척함으로써 밀리포어 (Millipore) 필터 플레이트를 제조한다. 다음으로, 필터 플레이트의 각각의 웰을 하이브리드화 온도의 200μl의 3xSSC/0.1% 사르코실/1 mg/ml 카세인 세척 완충용액으로 채우고, 이를 하이브리드화 온도의 오븐에 둔다.

14. 인큐베이션 동안, 스트렙타비딘-R-피코에리트린을 3xSSC/0.1% 사르코실/1 mg/ml 카세인 엄격 세척 완충용액 중에 2μg/ml로 희석시킴으로써 새로운 리포터 혼합물을 제조하고 (주의: 각각의 반응에 75 μl의 리포터 혼합물이 필요함), 이를 하이브리드화 온도의 오븐 또는 수조에 둔다.

15. 전체 반응물을 하이브리드화 온도의 세척 완충용액을 함유하는 필터 플레이트로 옮김으로써 하이브리드화 반응을 중지시킨다.

16. 옮긴 후, 진공 여과를 개재시킴으로써 필터 플레이트를 하이브리드화 온도의 1OOμl의 3xSSC/0.1% 사르코실/1 mg/ml 카세인 엄격 세척 완충용액으로 2회 세척한다.

17. 각각의 웰에 75 μl의 리포터 혼합물을 첨가하고, 수차례 피페팅 업 & 다운으로 천천히 혼합시킨다.

18. 15분 동안 하이브리드화 온도에서 반응 플레이트를 인큐베이션시킨다.

19. 진공 여과에 의해 인큐베이션을 중지시킨다.

20. 진공 여과를 개재시킴으로써 실온의 1OOμl의 1xSSC/0.1% 사르코실/1 mg/ml 카세인 세척 완충용액으로 2회 세척한다.

21. 실온의 1OOμl의 1xSSC/0.1% 사르코실/1 mg/ml 카세인 세척 완충용액에 반응물을 용해시킨다.

22. 시스템 매뉴얼에 따라 루미넥스™ 100 분석기 상에서 실온에서 50 μl를 분석한다.

Ⅲ. 판독

1. 루미넥스™ 100 IS 버젼 2.3 소프트웨어를 이용하여 데이터를 판독한다.

2. 측정 동안, 하기의 파라미터를 사용한다:

a. 샘플 부피: 50μl

b. 샘플 타임아웃: 60 초

c. XY 가열기 온도 (℃): 35

d. 이중선 판별기 게이트 (Doublet Discriminator Gate):

i. 최저 한도: 8000

ii. 최고 한도: 18500

e. 통계치: 중앙값

Ⅳ. 데이터 관리

1. 데이터는 루미넥스™ 100 IS2.3 소프트웨어에 의해 제공되는 모든 표준 산출물을 함유하는 가공되지 않은 CSV 파일 (콤마로 분리된 *.csv)로 저장된다.

2. 수득된 중앙 시그널을 표적 대 프로브 비 및 신호 대 노이즈 비를 계산하기 위해 엑셀 파일로 옮겼다 (배치 및 계산 참조).

본 발명은 프로브 고안의 최적화 및 시험 프로토콜의 최적화를 포함하는 루미넥스™ 방법의 다양한 항목을 다룬다. 하기의 본문에서, 데이터는 도 2에 나타낸 바와 같은 작업 흐름도의 순서로 제시될 것이다.

도 2. 적합화된 작업 흐름도의 일반적인 도식적 개략도

실시예에서의 결과의 표시 (배치 및 계산):

포함된 실시예 및 청구의 범위는 하기와 같이 특정되고 설명된다. 결과는 주로 가공되지 않은 데이터를 함유하는 표 (MFI = 중앙 형광 강도), 변수 (예를들어, 온도), 프로브, 및 분석되는 표적, 계산, 및 설명으로 제시된다. 계산은 표적 대 프로브 비 (% 표적/프로브) 및 신호 대 노이즈 비 (신호/노이즈)를 포함한다. 표적 대 프로브 비는 프로브 마다 계산되고, 각각의 신호를 100%로 세팅된 양성 대조군의 백분율로 나타낸다 (실시예의 표 12 참조). 신호 대 노이즈 비도 또한 프로브 마다 계산된다. 각각의 신호는 수득된 모든 신호의 중앙값에 의해 나누어진다 (실시예의 표 13 참조). 표적 대 프로브 비 및 신호 대 노이즈 비 둘 모두는 신호 강도 및 특이성에 대한 우수한 종합적인 표시를 제공한다.

특정 실시예는 본원에 완전히 포함된 EP1012348에 기술된 SPF1O 프라이머로부터의 프로브 및 프로브 세트를 이용한다. 상기 특허는 본 특허 출원에서 사용된 기술에 대한 기술적 배경을 제공한다.

SPF1O 프라이머 세트는 22개 누클레오티드의 프라이머간 영역을 지니는 단지 65 bp 길이의 작은 앰플리머 (amplimer)를 발생시킨다. 이는 모든 HPV 유전형 사이의 다양한 미스매치와 관련하여 프로브의 위치를 정할 가능성을 매우 제한한다.

실시예 1

목적:

하이브리드화 단계 후의 하이브리드화 온도의 유지가 신호 특이성에 유의한 긍정적인 효과를 지니는지의 여부를 시험하기 위한 것이다.

서문:

비드 상에 고정된 프로브와 용액 중의 변성된 표적 서열 사이의 하이브리드화 후, 리포터 시약인 스트렙타비딘-R-피코에리트린 (PE)과의 인큐베이션 전에 결합되지 않은 물질을 세척하여 제거할 필요가 있다. 이는 필터 플레이트 (MSBVN1 2, Millipore)를 이용하여 달성되고, 여기서 비드 및 모든 부착된 분자는 용액 중에 유리된 분자로부터 분리된다. 반응 부피는 작고, 따라서 이의 환경에서 신속한 온도 변화에 약하다. 본 발명자들은 하이브리드화 온도 후의 온도 변화의 효과를 검사하였다.

재료 및 방법:

루미넥스™ 신호에서의 하이브리드화 보다 낮은 온도에서의 인큐베이션의 효과를 SPF_1O 모델 시스템을 이용하여 연구하였다.

HPV 31에 대한 프로브 (프로브 31SLPr31, 표 1a 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 이러한 프로브는 SPF_1O 프라이머 세트로 증폭된 HPV 31 서열의 확인에 특이적이다. 임의의 교차 반응을 측정하기 위해 HPV44 및 HPV16의 앰플리머를 사용하였다. HPV 31 및 HPV 44의 표적 서열은 1개 위치가 상이하고, HPV 31 및 HPV 16의 서열의 표적 서열은 4개의 위치가 상이하였다 (표 1b).

50℃에서 하이브리드화를 수행하였고, 분석을 이중으로 수행하였다. 이후, 하나의 세트의 반응물을 표준 프로토콜에 따라 처리하고, 비드를 4℃에서 필터 플레이트에서 즉시 세척하였다. 반응물의 이중 세트를 4℃에서 동일한 표준 세척을 시작하기 전에 1분 동안 실온에서 먼저 인큐베이션시켰다. 문헌[Wallace et al (2005)]과는 대조적으로, 샘플을 필터 플레이트로 옮긴 후에 세척 완충용액을 첨가하였다 (실시예 2 참조).

결과:

결과를 표 1c에 나타내었다. 입증된 바와 같이, 하이브리드화 후 및 엄격한 세척 전의 단지 1분 동안의 실온에서의 인큐베이션은 신호를 증가시켰으나, 특이성을 감소시켰다 (HPV44에 대해 관찰된 보다 높은 신호에 의해 나타남). 이는 하이브리드화 후의 단시간의 온도 하락에 의해 야기된 엄격함의 감소에 의한 것으로 설명될 수 있다.

결론

반응 온도는 하이브리드화 단계 후에 유지되어야 한다. 하이브리드화 후, 비드는 임의의 온도 감소를 방지하기 위해 임의의 지연 없이 가능한 신속하게 세척되어야 한다.

실시예 2

목적:

하이브리드화 직후의 희석 세척이 신호의 특이성에 유의한 긍정적인 효과를 지니는지의 여부를 시험하기 위한 것이다.

서문:

표준 루미넥스™ 분석 방법은 하이브리드화 단계 후 세척이 즉시 이루어지지 않는 경우 비특이적 결합을 유도하는 위험을 포함한다 (실시예 1 참조). 이러한 위험을 최소화하기 위해, 하이브리드화 직후 샘플의 희석액을 시험하였다.

재료 및 방법:

이러한 효과를 연구하기 위해, HPV 31에 대한 프로브 (명칭: 31SLPr31, 표 2a 참조)를 지니는 하나의 비드 및 HPV 51에 대한 프로브 (명칭: 51SLPr2, 표 2a 참조)를 지니는 또 다른 비드인 두개의 루미넥스™ 비드의 혼합물을 사용하였다. 이들 프로브는 SPF₁₀ 프라이머 세트를 이용하여 각각 증폭된 HPV 31 및 HPV 51 서열의 확인에 특이적이다. 31SLPr31과의 교차 반응의 가능성을 관찰하기 위해, HPV 44 및 HPV 16의 앰플리머를 사용하였다. HPV 31과 HPV 44 및 16의 표적 서열은 각각 1개 및 4개의 위치가 상이하였다 (표 2b). 51SLPr2와의 교차 반응의 가능성을 관찰하기 위해, HPV 33 및 HPV 16의 앰플리머를 사용하였다. HPV 51과 HPV 44 및 16의 표적 서열은 4개의 위치가 각각 상이하였다 (표 2c).

표준 프로토콜을 이용하여 50℃에서 하이브리드화를 수행하였다.

이후, 첫번째 세트의 반응물을 임의의 추가 세척 없이 4℃에서 필터 플레이트에서 즉시 세척하였다. 문헌[Wallace et al (2005)]과는 대조적으로, 샘플을 필터 플레이트로 옮긴 후에 세척 완충용액을 첨가하였다.

하이브리드화 단계 직후의 추가의 직접적 및 간접적 희석 세척 방법의 효과를 하기와 같이 연구하였다. 직접적 및 간접적 방법을 위해, 세척 완충용액 (3x SSC/0.1% 사르코실/1 mg/ml 카세인. 이는 엄격한 세척 완충용액임)을 50℃에서 사용하였다.

두번째 세트의 비드를 직접적 방법으로 세척하였다. 직접적 방법은 써모사이클러에서 하이브리드화 온도의 200μl의 세척 완충용액을 이용한 하이브리드화 혼합물 (50μl)의 희석 후에, 필터 플레이트로의 전체 희석된 샘플의 이동을 포함한다.

세번째 하이브리드화 반응물을 간접적 방법으로 세척하였다. 간접적 방법은 하이브리드화 온도의 200μl의 세척 완충용액으로 미리 충전된 필터 플레이트로의 50μl의 하이브리드화 혼합물의 신속한 이동에 의한 희석을 포함한다 (참조: 문헌[Wallace et al, 2005)]).

결과:

결과를 표 2d에 나타내었다. 둘 모두의 추가 세척 방법은 표준 방법에 비해 절대 신호를 감소시켰으나, 동시에 신호의 특이성은 현저하게 증가시켰다. 직접 및 간접 세척 방법 사이에는 유의한 차이가 없었다. 실제로, 써모사이클러에서의 직접 희석 세척은 덜 실용적이므로, 간접 희석 방법이 바람직하다.

결론:

하이브리드화 후의 추가 희석-세척 단계의 이용은 신호 특이성에 대해 유의한 긍정적인 효과를 지닌다. 실용적인 이유로, 간접 희석 세척 방법이 바람직하다.

실시예 3

목적:

스트렙타비딘-R-피코에리트린과의 인큐베이션 전의 엄격한 세척 동안 하이브리드화 온도의 유지가 신호 특이성에 대한 유의한 긍정적 효과를 지니는 지의 여부를 시험하기 위한 것이다.

서문:

상기 기술된 바와 같이 엄격한 하이브리드화 후의 온도 하락의 부정적 효과는 엄격한 세척 자체의 온도가 또한 영향을 줄 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 50℃, 실온 또는 4℃에서의 엄격한 세척 온도의 효과를 연구하였다.

재료 및 방법:

스트렙타비딘-R-피코에리트린과의 인큐베이션 전의 하이브리드화 단계 후의 다양한 엄격한 세척 완충용액 온도의 효과를 하기와 같이 SPF₁₀ 모델 시스템을 이용하여 연구하였다.

이러한 효과를 연구하기 위해, HPV 31에 대한 프로브 (명칭: 31SLPr31, 표 3a 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 이러한 프로브는 SPF₁₀ 프라이머 세트로 증폭된 HPV 31 서열의 확인에 특이적이다. 31SLPr31과의 교차 반응의 가능성을 관찰하기 위해, HPV 44 및 HPV 16의 앰플리머를 사용하였다. HPV 31과 HPV 44 및 16의 표적 서열은 각각 1개 및 4개의 위치가 상이하였다 (표 3b).

하이브리드화를 50℃에서 수행하였다. 이후, 반응물 세트를 각각 50℃, 실온 또는 4℃의 세척 완충용액을 함유하는 필터 플레이트로 옮겼다.

결과:

결과를 표 3c에 나타내었다. 양성 대조군 신호의 절대 수준은 50℃와 실온 사이에서 상이하지 않았고, 4℃에서 세척후 약간 감소하였다. 그러나, 50℃에서의 세척은 신호 특이성을 현저하게 증가시킨 반면, 실온 또는 4℃에서의 세척은 신호 특이성을 감소시켰다. 따라서, 50℃의 하이브리드화 온도에서의 간접 희석 세척 방법이 바람직하다.

결론:

스트렙타비딘-R-피코에리트린과의 인큐베이션 전의 엄격한 세척 동안 하이브리드화 온도의 유지는 신호 특이성에 유의한 효과를 지닌다.

실시예 4

목적:

열혼합기의 사용이 신호 강도에 대해 유의한 긍정적 효과를 지니는 지의 여부를 시험하기 위한 것이다.

서문:

하이브리드화 반응의 동력학은 반응 동안 성분을 혼합시킴으로써 영향을 받을 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 하이브리드화 동안 열혼합기를 이용한 효과를 연구하였다.

재료 및 방법:

하이브리드화 동안 열혼합기를 이용한 확산 동력학의 효과를 하기와 같이 MPF 모델 시스템을 이용하여 연구하였다.

HPV 18에 대한 프로브 (명칭: 18MLPr7, 표 4a 참조) 또는 HPV 51에 대한 프로브 (명칭: 51MLPr2, 표 4a 참조)를 지니는 두개의 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 이들 프로브는 MPF 프라이머 세트로 증폭된 HPV 18 및 HPV 51 서열의 확인에 특이적이다.

두개의 비드를 혼합시키고, HPV 18 및 HPV 51의 MPF 앰플리머와 함께 하이브리드화시켰다.

HPV 18 및 HPV 51의 표적 서열은 7개의 위치가 상이하였다 (표 4b 및 c 참조). 반응물을 이중으로 시험하였다.

하나의 반응물을 진탕시키지 않고 써모사이클러에서 변성시키고, 하이브리드화시켰다 (문헌[Wallace et al, 2005] 참조).

이중 반응물을 변성을 위해 써모사이클러에서 변성시키고, 하이브리드화를 위해 열혼합기로 즉시 옮겼다. 50℃에서 하이브리드화를 수행하였다. 이후, 비드를 최적화된 하이브리드화 및 세척 프로토콜을 이용하여 50℃에서 필터 플레이트에서 즉시 세척하였다.

결과: 결과를 표 4d에 나타내었다. 열혼합기의 사용은 양성 대조군의 절대 신호를 현저하게 증가시킨 반면, 백그라운드는 영향을 받지 않았다. 이는 신호 특이성을 전체적으로 증가시켰다.

이들 결과는 신호 강도가 열혼합기를 이용함으로써 증가 (개선)될 것이라는 것을 입증한다.

결론:

열혼합기의 사용은 신호 강도 및 특이성에 유의한 긍적적 영향을 지닌다.

실시예 5

목적:

하이브리드화 온도에서 스트렙타비딘-R-피코에리트린과의 인큐베이션이 신호 강도에 대해 유의한 긍정적 효과를 지니는 지의 여부를 시험하기 위한 것이다.

서문:

일반적으로, 온도는 리포터 PE와의 하이브리드의 검출을 포함하여, 임의의 반응의 동력학에 영향을 미친다. 따라서, PE 인큐베이션 및 이후의 세척에 대한 온도의 영향을 연구하였다.

재료 및 방법:

HPV 51에 대한 프로브 (명칭: 51SLPr2, 표 5a 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 이러한 프로브는 SPF₁₀ 프라이머 세트로 증폭된 HPV 51 서열의 확인에 특이적이다. 이러한 프로브와의 교차 반응의 가능성을 관찰하기 위해, HPV 33 및 HPV 16의 SPF10 앰플리머를 사용하였다. HPV 51과 HPV33 및 HPV 16의 표적 서열은 4개의 위치가 상이하였다 (표 5b).

본원에 기술된 최적화된 하이브리드화 및 세척 프로토콜을 이용하여 50℃에서 하이브리드화를 이중으로 수행하였다. 엄격한 세척 후, 하나의 세트의 반응물을 50℃에서 PE와 함께 인큐베이션시키고 (문헌[Wallace et al, 2005] 참조), 다른 세트를 실온에서 PE와 함께 인큐베이션시켰다. 이후, 비드를 50℃에서 필터 플레이트에서 세척하였다.

또 다른 실험에서, 최적화된 하이브리드화 및 세척 프로토콜을 이용하여 50℃에서 하이브리드화를 이중으로 수행하였다. 엄격한 세척 후, 모든 반응물을 50℃에서 PE와 함께 인큐베이션시켰다 (참조: 문헌[Wallace et al, 2005]). 50℃에서 PE 인큐베이션 후, 하나의 세트의 반응물을 50℃에서 세척하고 (참조: 문헌[Wallace et al, 2005]), 이중 세트를 실온에서 세척하였다.

결과:

여러 온도에서의 PE 인큐베이션은 표 5c에 나타낸 바와 같이 유의한 효과를 지녔다. 50℃의 하이브리드화 온도에서의 PE 인큐베이션은 실온에서의 PE 인큐베이션에 비해 보다 높은 절대 신호를 발생시켰다. 그러나, 신호의 특이성은 유의하게 상이하지 않았다.

따라서, 하이브리드화 온도에서의 스트렙타비딘-R-피코에리트린과의 인큐베이션이 바람직하다. 대조적으로, 인큐베이션 후의 실온 또는 하이브리드화 온도에서의 세척은 유의한 효과를 지니지 않지만, 몇몇 상황에서 이는 더욱 실용적일 수 있다.

PE 인큐베이션 후의 세척 단계에서의 온도의 영향은 유의하지 않았다. 절대 신호 뿐만 아니라 특이성 둘 모두는 세척의 온도에 의해 영향을 받지 않는 것으로 보인다.

결론:

스트렙타비딘-R-피코에리트린과의 인큐베이션 동안 하이브리드화 온도의 유지는 신호 강도에 유의한 효과를 지니지만, 신호 특이성에는 효과를 지니지 않는다. PE 인큐베이션 후의 세척의 온도는 유의한 효과를 지니지 않았다.

실시예 6

목적:

루미넥스™ 샘플링 프로브의 클로깅 (clogging)이 1x SSC를 이용한 최종 세척에 의해 방지될 수 있는지의 여부를 시험하는 것이다.

서문:

본 발명자들의 최적화된 하이브리드화 및 세척 프로토콜에서, 하이브리드화를 3x SSC에서 수행하였다. 이 농도에서, SSC는 샘플의 처리를 강하게 방해하는 루미넥스™ 샘플링 프로브를 클로깅시킨다. 따라서, 보다 낮은 SSC 농도의 영향을 최종 세척에 대해 연구하였다.

결과:

처음, 본 발명자들은 하이브리드화의 SSC 농도를 유지시키려 하였다. 그러나, 3xSSC를 이용한 최종 세척이 루미넥스™ 샘플링 프로브의 강한 클로깅을 유도함에 따라, 유의한 데이터가 생성되지 않았다. 단지 1xSSC를 이용한 이러한 세척 단계의 수행이 유의한 데이터를 생성시켰다. 따라서, 데이터가 부족하므로, 데이터에 의한 비교는 나타낼 수 없었다. 기타 SSC 농도는 연구하지 않았다.

결론:

1x SSC를 이용한 최종 세척은 루미넥스™ 샘플링 프로브의 클로깅을 방지한다.

실시예 7

목적:

측정을 위해 준비된 샘플의 최소 4일 동안의 4℃에서의 최종 세척 후의 보관이 신호에 대해 임의의 유의한 효과를 지니는 지의 여부를 확인하기 위한 것이다.

서문:

작업 플로어에서의 융통성을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 루미넥스™ 시스템을 이용하여 직접 하이브리드화 시험 프로토콜에 관한 여러 단계를 분석하였다. 특히 시험된 한 방법은 직접 하이브리드화 방법의 두 단계 사이에서의 보관이다. 따라서, 본 발명자들은 4℃에서의 보관의 영향을 연구하였다.

재료 및 방법:

최종 세척 과정 후의 4℃에서의 보관의 효과를 하기와 같이 SPF1O 모델 시스템을 이용하여 연구하였다.

이러한 효과를 연구하기 위해, HPV 51에 대한 프로브 (명칭: 51SLPr2, 표 7a 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 이러한 프로브는 SPF₁₀ 프라이머 세트로 증폭된 HPV 51 서열의 확인에 특이적이다. 51SLPr2와의 교차 반응의 가능성을 관찰하기 위해, HPV 31의 앰플리머를 사용하였다. HPV 51과 HPV 31의 표적 서열은 4개의 위치가 상이하였다 (표 7b).

최종 세척 과정 후, 반응물의 세트를 0, 4, 24 및 96시간 동안 각각 4℃에 보관하였다. 다음으로, 이러한 반응물 세트를 실온에서 측정하였다.

결과:

결과를 7c에 나타내었다. 입증되는 바와 같이, 최종 세척 단계 후의 보관은 신호 강도 또는 특이성에 영향을 미치지 않았다. 그럼에도 불구하고, 상기와 같은 보관은 시간에 걸쳐 가공되지 않은 신호 강도를 매우 약간 개선시키는 것으로 보였다. 따라서, 최종 세척 단계 후의 보관은 필요시 본래의 신호를 유지시키는 최대 4일 동안 도입될 수 있다.

결론:

최종 세척 단계 후의 보관은 신호 강도 및 신호 특이성에 유의한 영향을 지지니 않고, 작업 플로어에서의 융통성을 증가시킨다.

프로브 (스페이서) 고안 - 서문

루미넥스™ 시스템의 주요 원리는 개별적 비드 유형의 색 조성으로 인해 독특한 라벨로 작용하는, 마이크로비드의 표면 상의 특정 올리고누클레오티드 프로브의 고착이다.

분자 스케일에서, 비드는 특정 올리고누클레오티드 프로브보다 훨씬 크다. 결과적으로, 특정 프로브 서열은 루미넥스™ 비드의 표면에 매우 밀접하게 위치된다. 이러한 프로브 위치는 입체구조적 간섭 및 다양한 비드 표면 효과, 예를들어 표면 소수성으로 인해, 고정된 프로브와 용액 중의 표적 분자 사이의 하이브리드화 동력학에 대해 최적이 아닐 수 있다.

하기의 실시예는 프로브와 표적 사이의 하이브리드화 동력학을 최적화시키기 위해, 비드 표면 상으로의 프로브의 위치 결정을 변화시키는 다수의 방법을 기술한다.

프로브 고안에서 하기의 변형을 시험하였다:

1. 다양한 길이의 탄소 스페이서의 사용

2. 다양한 길이의 추가 올리고누클레오티드 스페이서의 사용

3. 다양한 조성의 올리고누클레오티드 스페이서의 사용

프로브는 상이한 기능을 지니는 세개의 별개의 영역을 지닌다:

1. 프로브가 미립자 지지체의 표면에 공유 커플링될 수 있게 하는 NH2기와 같은 커플링기;

2. (a) 비드 표면과 특정 프로브 서열 사이의 거리를 형성할 수 있고/있거나, (b) 특정 프로브를 보다 친수성 환경에 위치시킬 수 있는 스페이서 및

3. 실제 표적 특이적 프로브 서열. 프로브의 이러한 부분에 대해, 당 분야의 일반적인 파라미터, 예를들어 프로브 조성 및 길이가 이용된다.

실시예 8

목적:

다양한 길이의 탄소 스페이서의 사용의 효과를 결정하기 위한 것이다.

재료 및 방법:

C₁₂ 스페이서를 지니는 HPV 51에 대한 프로브 (명칭: 51SLPr2, 표 8a 참조) 또는 C₁₈ 스페이서를 지니는 HPV 51에 대한 프로브 (명칭: 51SLPr2C₁₈, 표 8a 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 이들 프로브는 SPF_1O 프라이머 세트로 증폭된 HPV 51 서열의 확인에 특이적이다. 이들 프로브와의 교차 반응의 가능성을 관찰하기 위해, HPV 33의 앰플리머를 사용하였다. HPV 51과 HPV 33의 표적 서열은 4개의 위치가 상이하였다 (표 8b).

결과: 결과를 표 8c에 나타내었다. C18 스페이서는 절대 신호를 감소시켰으나, C12 프로브에 비해 특이성은 보다 높았다. 이러한 현상은 51SLPr2C₁₈ 뿐만 아니라 C18 탄소 스페이서를 지닌 기타 프로브 (예를들어, 33SLPr21C₁₈: 표 8a, c 및 d)에 대해서도 관찰되었다.

결론:

다양한 탄소 스페이서 길이의 사용은 신호 특이성에 대해 유의한 효과를 지닌다. 예를들어, 51SLPr2와 관련하여, 최적의 프로브는 C18 탄소 스페이서를 함유한다.

실시예 9

목적:

다양한 길이의 올리고누클레오티드 스페이서의 효과를 결정하기 위한 것이다.

재료 및 방법:

0, 10, 20, 30 또는 40개의 티민의 스페이서를 지니는 HPV 51에 대한 프로브 (명칭: 51SLPr2, 51SLPr2T10, 51SLPr2T20, 51SLPr2T30, 51SLPr2T40, 표 9a 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 각각의 비드 유형은 별도의 프로브 변이체를 지녔다. 이들 프로브는 SPF_1O 프라이머 세트로 증폭된 HPV 51 서열의 확인에 특이적이다. 이들 프로브와의 교차 반응의 가능성을 관찰하기 위해, HPV 33의 앰플리머를 사용하였다. HPV 51과 HPV 33의 표적 서열은 4개의 위치가 상이하였다 (표 9c).

SPF1O 모델 시스템과는 별개로, 이러한 효과를 또한 하기와 같이 MPF 모델 시스템을 이용하여 연구하였다. 0, 20, 30, 또는 40개의 티민의 스페이서를 지니는 HPV 52에 대한 프로브 (명칭: 52MLPr2, 52MLPr2T20, 5MLPr2T30, 52MLPr2T40, 표 9b 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 각각의 비드 유형은 별도의 프로브 변이체를 지녔다. 이들 프로브는 MPF 프라이머 세트로 증폭된 HPV 52 서열의 확인에 특이적이다. 이들 프로브와의 교차 반응의 가능성을 관찰하기 위해, HPV 16의 앰플리머를 사용하였다. HPV 52 및 HPV 16의 표적 서열은 2개의 위치가 상이하였다 (표 9d).

결과:

결과를 표 9e 및 9f에 나타내었다. 티민 스트레치를 지닌 스페이서의 신장은 절대 신호 수준을 유의하게 증가시켰다. 또한, 추가 티민 스페이서를 지니지 않는 스페이서에 비해 특이성이 유의하게 증가하였다. 다양한 길이를 지닌 스페이서를 비교하여, 최적 신호를 생성시키기 위해 최소 20개의 티민 잔기가 필요하였다 (예를들어, 51SLPr2). 종합적으로, 프로브가 40개의 누클레오티드의 스페이서 (예를들어, 51SLPr2 및 52MLPr2)를 함유하는 경우에 최고로 작용하였다. 따라서, 이러한 스페이서 길이가 바람직하다.

결론:

다양한 스페이서의 사용은 신호 강도 뿐만 아니라 특이성에 유의한 효과를 지닌다. 51SLPr2T_n와 관련하여, 우수한 프로브는 신호 강도 및 특이성 둘 모두를 증가시키는 20개 이상의 티민 누클레오티드의 스페이서를 함유한다. 일반적으로, 40개 이상의 누클레오티드의 스페이서 길이가 최고로 작용한다.

실시예 10

목적:

변형된 폴리(T) 스페이서의 사용이 가양성(false-positive) 반응을 방지할 수 있는지의 여부를 결정하기 위한 것이다.

서문:

다수의 Taq DNA 중합효소가 합성된 가닥의 3' 말단에 추가의 A-누클레오티드를 추가하는 것이 널리 공지되어 있다. 다수의 A가 3' 말단에 첨가되어, 3' 말단에 올리고-A 테일을 지니는 분자의 부차집단을 생성할 수 있는지의 여부는 공지되어 있지 않다. 이러한 분자가 PCR 생성물의 전체량의 매우 소량의 비로 존재하더라도, 이들 분자는 검출 방법의 높은 민감성으로 인해 가음성(false-negative) 결과를 생성시킬 수 있다. 이는 PCR 생성물에서의 올리고-A 스트레치와 프로브의 폴리(T) 스페이서 사이의 하이브리드화에 기인한다.

이러한 PCR 인공물은 몇몇 샘플에서 발생하고, PCR 수준에서 재생하기는 어렵다. 이는 반응 조건에서 매우 작은 변동에 좌우되는 것으로 보인다. 백그라운드는 검출 수준에서 많이 발생될 수 있으며, 이는 백그라운드를 발생하는 PCR 생성물이 많이 발생될 수 있는 것을 말한다.

PCR 인공물은 또한 라인 프로브 분석 (LiPA) 시스템에서 가양성 결과를 야기할 수 있는데, 이는 이러한 시스템이 또한 T-테일링된 프로브를 포함하기 때문이다. LiPA 분석에서, 이는 이들의 특정 서열에 관계없이 모든 프로브와 함께 약한 동등한 (백그라운드) 신호를 발생시킨다. 또한, 루미넥스™ 시스템에서, 이러한 약한 백그라운드 신호 리드아웃(readout)이 관찰되었다. 따라서, 변형된 스페이서의 효과를 연구하였다.

재료 및 방법:

T40 스페이서, 또는 변형된 (TTG) 13 스페이서를 지닌 HPV 18에 대한 프로브 (명칭: 18MLPr7T40 및 18MLPr7(TTG)₁₃, 표 10a 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 이들 프로브는 MPF 프라이머 세트로 증폭된 HPV 18 서열의 확인에 특이적이다. (TTG) 트리플렛 (triplet)을 대안적 스페이서로 선택하였는데, 이는 이러한 (TTG) 트리플렛이 폴리 (A)와 함께 가장 나쁜 이론적 결합 효능중 하나를 나타내기 때문이다.

18MLPr7T40 및 18MLPr7(TTG)₁₃과의 교차 반응 가능성을 관찰하기 위해, 상기 가양성 백그라운드를 나타내는 샘플로부터 유래된 앰플리머를 사용하였다 (nc8로 명명).

결과:

결과를 표 10b에 나타내었다.

13개의 "TTG" 누클레오티드 트리플렛의 스페이서는 T40 스페이서에 대해 관찰된 백그라운드 신호를 명백하게 거의 완전히 제거할 수 있었다.

결론:

대안적 T-기재 스페이서, 예를들어 (TTG)₁₃의 사용은 신호 특이성에 대한 유의한 긍정적 효과를 지니고, A-풍부 PCR 인공물에 의해 유도된 가양성 신호를 제거하였다.

실시예 11

목적:

프로브의 5' 또는 3' 말단에서의 티민 기재 스페이서의 위치결정이 프로브-표적 결합 부위에 플랭킹된 A-풍부 표적 영역에 대한 결합을 억제하는지의 여부를 검사하기 위한 것이다.

서문:

프로브/표적의 중간에서의 미스매치는 이의 결합 에너지에 대해 가장 큰 영향을 지니는 것으로 공지되어 있다. 결합 영역의 측면에 밀접한 미스매치는 구별하기가 더욱 어렵다. 프로브/표적 결합 영역에 플랭킹된 A-풍부 스트레치의 위치와 함께, 이는 선택 프로브 길이에 악영향을 줄 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 프로브-표적 결합 부위에 플랭킹된 A-풍부 표적 영역에 대한 결합을 최소화하기 위해 스페이서 위치의 영향을 연구하였다.

재료 및 방법:

루미넥스™ 비드와 특정 프로브 서열 사이에 위치된, 프로브의 5' 또는 3' 말단에서의 스페이서 위치의 영향을 하기와 같이 MPF 모델 시스템을 이용하여 연구하였다.

이러한 영향을 연구하기 위해, 티민 기재 스페이서를 지니는 HPV 18 및 HPV 45에 대한 프로브 (명칭: 18MLPr7T40N5, 18MLPr7T40N3, 45MLPr8T40N5 및 45MLPr8T40N3, 표 11a 참조)를 지니는 루미넥스™ 비드를 사용하였다. 이들 프로브는 MPF 프라이머 세트로 증폭된 HPV 18 및 HPV 45 서열 각각의 확인에 특이적이다. 18MLPr7T40_n과의 교차 반응 가능성을 관찰하기 위해, HPV 39의 앰플리머를 사용하였다. HPV 18과 HPV 39의 표적 서열은 2개의 위치가 상이하였다 (표 11b). 45MLPr8T40_n과의 교차 반응 가능성을 관찰하기 위해, HPV 13, 39 및 40의 앰플리머를 사용하였다. HPV 45와 HPV13, 39 및 40의 표적 서열은 각각 3, 2 및 1개의 위치가 상이하였다 (표 11c).

결과:

결과를 표 11d에 나타내었다. 입증되는 바와 같이, 5' 말단 대신 프로브의 3' 말단에서의 스페이서는 프로브-표적 결합 부위에 플랭킹된 A-풍부 표적 영역에 대한 결합을 감소시켰고, 결합 에너지 (dG) 및 용융 온도 (Tm)에 영향을 주었다. 이러한 비특이적 신호의 제거는 스페이서 및 프로브에 대한 표적의 결합에 의해 설명될 수 있다. 이들 결과는 스페이서에 대한 표적의 결합이 프로브 특이성에 악영향을 줄 수 있다는 것을 암시하고, 이는 방지되어야 한다. 원칙적으로, 메커니즘이 또한 "TTG" 누클레오티드 트리플렛 스페이서를 이용하여 수반될 수 있다. 따라서, 티민 기재 스페이서를 이용하는 경우, 프로브:표적 하이브리드의 안정성은 스페이서와 특정 표적 영역에 인접한 서열 사이의 약한 교차-하이브리드화에 의해 증가될 수 있고, 이는 프로브 고안시 고려되어야 하는 가양성 신호를 발생시킨다.

결론:

프로브의 5' 또는 3' 말단에서의 티민 기재 스페이서의 위치는 프로브-표적 결합 부위에 플랭킹된 A-풍부 표적 영역의 결합과 관련하여 유의한 효과를 지닐 수 있다.

실시예 12

비드 기재 방법, 예를들어 루미넥스 기재 방법과의 사용에 적합한 HPV 프로브:

표 14

본 발명의 한 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개중 어느 하나 또는 22개 모두의 상기 프로브가 샘플 내에 존재하는 임의의 HPV 표적 DNA의 동시 검출을 위한 동일한 조건하에서 비드-기재 다중 반응에 사용될 수 있다. 이러한 비드 세트는 상기 기술된 반응식을 최적화시키는데 사용하기에 적절하다. 추가의 폴리카본 스페이서가 포함될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21개 또는 22개 모두의 상기 프로브를 포함하는 임의의 프로브 세트에 관한 것이다.

일반적인 결론

본 발명자들은 입체구조적 간섭 및 소수성 반발이 하이브리드의 말단에서 차선적인 미스매치 식별을 발생시키는 것으로 가정하였다. 또한, 표적이 프로브에 덜 최적으로 결합되므로, 상기 입체구조적 간섭이 민감성을 감소시키는 것으로 생각하였다. 따라서, 프로브 고안에서의 스페이서의 포함은 입체구조적 간섭을 방지하여, 교차-하이브리드화를 배제시키고 민감성을 증가시키는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 또한 스페이서의 포함이 보다 높은 특이성 및 민감성을 발생시키는 것을 관찰하였다.

상기 스페이서가 프로브 성능을 현저하게 상승시키지만, 몇몇 교차 반응이 여전히 관찰되었다. 대부분의 상기 교차 반응은 프로브의 말단 근처 (표적 결합 영역)에 단일한 미스매치를 지니는 것으로 밝혀졌다. 때때로, 이러한 교차 반응은 표적의 프로브 결합 영역에 플랭킹된 A-풍부 영역과 함께 관찰되었다. 따라서, 본 발명자들은 상기 A-풍부 영역이 스페이서의 T-스트레치의 일부에 결합하여 교차 반응성을 증가시킬 수 있는 것으로 가정하였다. 최초로, 본 발명자들은 다른 말단 (5' 대신 3')에 스페이서를 지니는 프로브를 고안하였다. 그러나, 프로브 결합 영역에 플랭킹된 서열을 고려한 상기 스페이서의 재고안이 대안이 될 수 있었다.

본 발명자들은 PCR에서 때때로 인공 생성물을 생성되고, 이러한 인공 생성물이 모든 프로브에 결합하는 경향이 있는 것을 발견하였다. 이러한 생성물은 3' 말단에 다수의 A-잔기 (이는 여러 Taq 중합효소의 공지된 활성임)를 포함함으로써, T-기재 스페이서에 대한 증가된 친화성을 지닐 수 있었다. A-T 하이브리드화는 가양성 하이브리드화 결과를 야기시키는 증가된 교차-반응성을 생성시킬 수 있었다.

상기 현상에 대한 보다 많은 정보를 얻기 위해, 본 발명자들은 TTG-트리플렛 (triplet) (예를들어, (TTG)₁₃)을 포함하는 스페이서를 지닌 여러 프로브를 고안하였다. 본 발명자들은 특히 이러한 트리플렛이 가장 반발적이며, 인공 PCR 생성물과 프로브 표적 영역에 플랭킹된 A-풍부 섹션의 결합을 감소시키는 것으로 계산하였다. 본 발명자들은 상기 인공 PCR의 전체적인 비특이적 결합이 TTG-기재 스페이서에 의해 감소되는 것을 관찰하였다. TTG-기재 스페이서는 또한 프로브 플랭킹 영역의 결합을 감소시키고, 이의 특이성을 증가시킬 수 있다.

요약:

· 입체구조적 간섭 및 소수성 반발은 하이브리드의 말단에서 차선의 미스매치 구별을 발생시킨다.

· 프로브 고안에서 스페이서의 포함은 입체구조적 간섭을 방지하여 교차-하이브리드화를 배제시킴으로써, 보다 높은 특이성 및 민감성을 발생시킨다.

· 표적의 프로브 결합 영역에 플랭킹된 A-풍부 영역은 스페이서의 T-스트레치에 결합하고, 교차 반응을 증가시킬 수 있다.

· 때때로, PCR에서 모든 프로브에 결합하는 경향이 있는, 3' 말단에 A-스트레치를 포함하는 인공 생성물이 생성된다.

· 이러한 생성물은 A-가 풍부하며, 따라서 T-기재 스페이서에 대해 증가된 친화성을 지닌다.

· 이러한 현상은 프로브 플랭킹 영역의 비특이적 결합을 감소시키는 TTG-기재 스페이서에 의해 감소되어, 특이성이 증가될 수 있다.

참고 문헌:

실시예 1의 표들 :

표 1a. 31SLPr31 = SPF₁₀ 프로브 31 버전 31, C₁₂= 12개의 탄소 원자의 스트레치

표 1b. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 1c.

실시예 2의 표들 :

표 2a. 31SLPr31 = SPF₁₀ 프로브 31 버전 31, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치

표 2b. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 2c. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 2d.

실시예 3의 표들 :

표 3a. 31SLPr31 = SPF₁₀ 프로브 31 버전 31, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치

표 3b. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 3c.

실시예 4의 표들 :

표 4a. 18MLPr7 = MPF 프로브 18 버전 7, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치

표 4b. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 4c. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 4d.

실시예 5의 표들 :

표 5a. 51SLPr2 = SPF₁₀ 프로브 51 버전 2, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치

표 5b. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 5c.

표 5d.

실시예 7의 표들 :

표 7a. 51SLPr2 = SPF₁₀ 프로브 51 버전 2, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치

표 7b. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 7c.

실시예 8의 표들 :

표 8a. 51SLPr2 = SPF₁₀ 프로브 51 버전 2, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치, C₁₈ = 18개의 탄소 원자의 스트레치

표 8b. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 8c. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 8d.

실시예 9의 표들 :

표 9a. 51SLPr2 = SPF₁₀ 프로브 51 버전 2, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치, (T)₄₀ = 40개의 티민 누클레오티드의 스트레치

표 9b. 52MLPr2 = MPF 프로브 52 버전 2, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치, (T)₄₀ = 40개의 티민 누클레오티드의 스트레치

표 9c. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 9d. 동일한 누클레오티드는 "-"로 나타내었다.

표 9e.

표 9f.

표 10의 표들 :

표 10a. 18MLPr7 = MPF 프로브 18 버전 7, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치, (T)₄₀ = 40개의 티민 누클레오티드의 스트레치, (TTG)₁₃ = 13개의 티민-티민-구아닌 누클레오티드 트리플렛의 스트레치 (전체 39개 누클레오티드)

표 10b. nc8 = LiPA 분석에서 모든 프로브와 함께 교차 반응을 나타내는 음성 대조군 8, DNA- = 음성 대조군

실시예 11의 표들 :

표 11a. 18MLPr7 = MPF 프로브 18 버전 7, C₁₂ = 12개의 탄소 원자의 스트레치, (T)₄₀ = 40개의 티민 누클레오티드의 스트레치, N5 = 5'-말단 아미노 링커, N3 = 3'-말단 아미노 링커

표 11b. 18MLPr7 = MPF 프로브 18 버전 7, N5 = 5'-말단 아미노 링커, N3 = 3'-말단 아미노 링커, 회색 박스 서열 = 티민 스페이서 (소문자) 및 프로브 서열 (대문자)에 결합할 수 있는 표적 누클레오티드, 진한 글씨 & 밑줄 = 프로브 서열과의 미스매치

표 11c. 45MLPr8 = MPF 프로브 45 버전 8, N5 = 5'-말단 아미노 링커, N3 = 3'-말단 아미노 링커, 회색 박스 서열 = 티민 스페이서 (소문자) 및 프로브 서열 (대문자)에 결합할 수 있는 표적 누클레오티드, 진한 글씨 & 밑줄 = 프로브 서열과의 미스매치

표 11d.

표 12a 및 b :

% 표적 / 프로브:

A1, a = 988 / 988 * 100 = 100%;

A1, c = 19 / 988 * 100 = 2%

표 13a 및 b :

신호 / 노이즈:

A1, a = 988 / 12 (= 중앙값 (988, 13, 19, 5, 3, 11, 14, 3)) = 82;

A1, c = 19 / 12 (중앙값 (988, 13, 19, 5, 3, 11, 14, 3)) = 2.

SEQUENCE LISTING <110> GlaxoSmithKline Biologicals sa Delft Diagnostic Laboratory b.v. Van Alewijk, Dirk Cornelius Jerrefaas Gelde Van Doorn, Leendert Jan Colau, Brigitte Desiree Alberte Kleter, Gijsbertus Everardus <120> Assay and Materials Therefor <130> VB61803 <140> PCT/EP2007/050380 <141> 2007-01-16 <150> GB0600927.8 <151> 2006-01-17 <160> 30 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 1 gagcacaggg ccac 14 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 2 ttacataagg cacagg 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 3 gttacaacgt gcacag 16 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 4 ggatgcaacg tgctc 15 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 5 catattggct acaacgt 17 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 6 gtgcacaagg ccata 15 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 7 gccttattgg ctacataa 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 8 ggtgttacat aaggcccag 19 <210> 9 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 9 ccagggccat aacaa 15 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 10 ttattggctc caccgt 16 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 11 ccgtactggt tacaacga 18 <210> 12 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 12 atattggctg caacgt 16 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 13 ggcccaaggc cataataa 18 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 14 cttattggct acagcgt 17 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 15 acagcgtgca caagg 15 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 16 caaggctcag ggtttaa 17 <210> 17 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 17 tgcacagggc cata 14 <210> 18 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 18 tgcaacgtgc acag 14 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 19 ctgcacaagg cacag 15 <210> 20 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 20 gcacaaggca cagg 14 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 21 cctattggtt gcataagg 18 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 22 attggttgca tcgcg 15 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 23 ggcaatcagt tatttg 16 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 24 ctatttgctg gaacaatc 18 <210> 25 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 25 gggcaatcag gtatt 15 <210> 26 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 26 gactcccagt tgtttaataa accatattgg ttacataagg cacagggtca taacaatggt 60 gtttgctggc ataatca 77 <210> 27 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 27 gattcccagt tatttaataa gccttattgg ctacataagg cccagggcca caacaatggt 60 atatgttggc ataatca 77 <210> 28 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 28 gaggcccagt tgtttaataa accttattgg ttacaaaagg cccagggaca caataatggt 60 atatgttggg gcaatca 77 <210> 29 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 29 gattctcaga tatttaacaa gccattgtgg atacaaaagg cccagggcca taacaatggc 60 atatgttttg gcaatca 77 <210> 30 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer/probe <400> 30 gattctcaat tatttaataa gccatattgg ttacataagg cccagggcca taacaatggt 60 atttgttggc ataatca 77

Claims

a) 프로브가 미립자 지지체의 표면에 커플링될 수 있게 하는 커플링 기; b) 스페이서, 및 c) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열을 포함하는, 미립자 지지체와의 커플링에 적합한 프로브로서, 상기 스페이서가 ⅰ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서; 및 임의로 ⅱ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 3 내지 50개의 탄소 단위의 탄소 스페이서를 포함하는, 미립자 지지체와의 커플링에 적합한 프로브.
제 1항에 있어서, 스페이서가 탄소 스페이서 및 올리고누클레오티드 스페이서 둘 모두를 포함하는 것인 프로브.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 스페이서가 탄소 스페이서를 지니지 않는, 25 내지 150개의 누클레오티드로 이루어진 올리고누클레오티드 스페이서인 프로브.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 표적 서열 또는 표적의 플랭킹 (flanking) 영역에 하이브리드되지 않도록 선택된 것인 프로브.
제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 올리고누클레오티드 스페이서가 동종중합체 또는 이종중합체를 포함하는 것인 프로브.
제 5항에 있어서, 올리고누클레오티드 스페이서가 폴리 T 올리고누클레오티드 또는 TTG 반복부를 포함하는 것인 프로브.
제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 표적 특이적 프로브 서열이 인간 파필로마바이러스 표적 서열에 특이적인 것인 프로브.
미립자 지지체에 커플링된 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 따른 프로브.
제 9항에 있어서, 지지체가 비드 (bead)인 프로브.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 지지체가 유리 또는 폴리스티렌으로부터 선택된 것인 프로브.
서로 구별가능한 상이한 미립자 지지체에 커플링된 적어도 2개의 상이한 표적 특이적 프로브 서열을 포함하는, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 프로브의 세트.
제 11항에 있어서, 상이한 미립자 지지체가 상이한 형광 분자로 표지된 것인 프로브의 세트.
2개 내지 1000개의 상이한 표적 특이적 프로브의 세트로서, 각각의 프로브가 a) 프로브가 미립자 지지체의 표면에 커플링될 수 있게 하는 커플링 기; b) 스페이서; 및 c) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열을 포함하고, 상기 스페이서가 ⅰ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 13 내지 50개의 탄소 단위의 탄소 스페이서; 및 ⅱ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하고, 올리고누클레오티드 스페이서가 표적 서열 또는 표적의 플랭킹 영역에 하이브리드되지 않는, 2 내지 1000개의 상이한 표적 특이적 프로브의 세트.
13 내지 50개 단위의 탄소 스페이서 및 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드를 포함하는, 표적 특이적 프로브 서열로의 부착에 적합한 스페이서.
a) 프로브가 미립자 지지체의 표면에 커플링될 수 있게 하는 커플링 기; b) 스페이서; 및 c) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열을 포함하는 프로브, 및 미립자 지지체, 예를들어 폴리스티렌 비드를 포함하는 키트로서, 상기 스페이서가 ⅰ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 13 내지 50개의 탄소 단위의 탄소 스페이서; 및 ⅱ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 키트.
a) 프로브가 미립자 지지체의 표면에 커플링될 수 있게 하는 커플링 기; b) 스페이서; 및 c) 표적-특이적 올리고누클레오티드 프로브 서열을 포함하는 프로브, 및 미립자 지지체, 예를들어 폴리스티렌 비드로의 커플링을 위한 설명서를 포함하는 키트로서, 상기 스페이서가 ⅰ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 13 내지 50개의 탄소 단위의 탄소 스페이서; 및 ⅱ) 표적 특이적 프로브 서열과 지지체 커플링 기 사이의 적어도 15개의 누클레오티드의 올리고누클레오티드 스페이서중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는 키트.
제 15항 또는 제 16항에 있어서, 서로 구별가능한 상이한 미립자 지지체로의 커플링을 위한 2개 이상의 상이한 표적 특이적 프로브 서열의 세트를 포함하는 키트.
ⅰ) 샘플 내에 존재하는 임의의 이중 가닥 표적 폴리핵산의 변성 단계; ⅱ) 프로브와 표적 사이에 특이적 하이브리드가 발생하도록 하는 조건하에서의 상기 변성된 표적과 프로브의 하이브리드화 단계; ⅲ) (임의로, 엄격한 세척 단계); ⅳ) 프로브-표적 결합의 검출을 가능케 하는 리포터 분자의 첨가 및 이와의 인큐베이션 단계; ⅴ) (임의로, 세척 단계), 및 ⅵ) 프로브-표적 결합의 검출 단계를 포함하며, 단계 ⅱ)로부터 단계 ⅳ)의 종료까지 하이브리드화 온도를 유지하는 것을 포함하는, 제 1항에 따른 프로브와 표적 핵산 사이의 임의의 상호작용을 검출하는 방법.
제 18항에 있어서, 프로브가 미립자 지지체, 예를들어 비드에 커플링되는 방법.
제 18항 또는 제 19항에 있어서, 2개 이상의 상이한 프로브가 동시에 사용되는 방법.
제 18항 내지 제 20항중 어느 한 항에 있어서, 상이한 표적-특이적 프로브의 표적-특이적 프로브 서열의 길이가 동일하지 않은 방법.
제 18항 내지 제 21항중 어느 한 항에 있어서, 프로브와 표적 사이의 하이브리드화가 이온 환경하에서 수행되는 방법.