KR20080094275A - 진세노사이드의 효소전환 - Google Patents

Abstract

본 발명은 진세노사이드(ginsenosides)에 시트로자임(Citrozym)을 처리하여 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1을 수득하는 단계를 포함하는 진세노사이드의 효소전환 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 인삼 또는 홍삼의 진세노사이드로부터 높은 생성율로 보다 간단하게 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1을 얻을 수 있다.

인삼, 홍삼, 전환, 효소, 시트로자임, 화합물 K, 진세노사이드 F1

Description

진세노사이드의 효소전환{Enzymatic Conversion of Ginsenosides}

도 1은 건삼 진세노사이드에 대한 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석 결과를 보여주는 크로마토그램이다.

도 2는 건삼 진세노사이드를 시트로자임으로 효소 전환한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.

도 3은 건삼 진세노사이드를 펙티넥스로 효소 전환한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.

도 4는 건삼 진세노사이드를 셀루클라스트로 효소 전환한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.

도 5는 건삼 진세노사이드를 비스코자임으로 효소 전환한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.

도 6은 건삼 진세노사이드를 노보펌으로 효소 전환한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.

도 7은 건삼 진세노사이드를 락토자임으로 효소 전환한 결과를 보여주는 HPLC 크로마토그램이다.

본 발명은 인삼 진세노사이드의 효소전환 방법에 관한 것이다.

인삼은 식물 분류학상 오가피과(Panax)의 인삼속에 속하는 다년생 숙근초로서 지구상에 약 11종이 알려져 있다. 인삼은 지금까지 많은 약리실험을 통해 콜레스테롤 저하, 지질과산화 억제, 혈압강하, 혈류증가, 뇌혈관확장, 심장기능항진, 항부정맥, 항혈전, 혈소판응집 억제, 만성신부전 치료 효과, 세포독성 및 암 억제, 면역조절 작용, 기억력 증가, 뇌대사 항진, 항스트레스, 항산화 작용, 항노화 작용, 항궤양 및 위액분비 억제, 작업 능력 항진, 방산선에 대한 보호작용, 항당뇨, 해독, 간세포 효소 증가, 천식 치료, 항염증, 진통작용, 빈혈치료, 생식능력 증진 및 성수행능력 증진, 알코올 혈중농도 저하, 항알러지, 항암제 등의 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

한편, 진세노사이드의 인체 내 주요 대사산물로 알려진 화합물 K 및 진세노사이드 F1은 장내 세균에 의해 생성되는 것으로 발표되었다(Hasegawa, H. et al., Planta Medica, 62:453(1996)). 화합물 K 및 진세노사이드 F1은 암세포 증식 억제, 항암제의 항암 활성 증대 작용, 알러지 억제 및 피부 보호 활성을 나타내는 것으로 알려져 있어, 이를 효율적으로 제조하려는 연구가 많이 이루어지고 있다.

화합물 K 및 진세노사이드 F1의 제조와 관련해서는 크게 두 가지 접근방식을 취하고 있다: (1) 유산균 또는 장내 세균을 이용한 생물전환; 및 (2) 효소를 이용한 전환.

대한민국 특허 제377546호는 인삼의 다이올계 사포닌을 수성용매 중에서 효소적으로 반응시켜 화합물 K의 효소적 방법에 의한 진세노사이드 화합물 K의 제조방법을 개시하고 있다. 이 특허 문헌에는 화합물 K를 제조하기 위한 효소로서, 셀룰라아제 및 베타-갈락토시다아제를 개시하고 있다.

대한민국 특허 제418604호는 인삼 정제 사포닌을 물이나 완충용액과 같은 수성용매 또는 물이나 완충용액과 같은 수성용매와 유기용매의 혼합액에 용해시킨 다음 나린지나제 및 펙티나제 중 적어도 하나 이상을 첨가하여 반응시킴으로써 화합물 K 및 진세노사이드 F1을 제조하는 방법을 개시하고 있다.

그러나 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1을 얻기 위하여 현재까지 개발된 효소전환 방법은 수율(즉, 생성율)이 낮은 문제점이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은, 인삼 또는 홍삼에 포함되어 있는 사포닌, 즉 진세노사이드를 인체에 보다 유용한 형태, 즉 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1로 전환(conversion)시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 인삼 또는 홍삼, 또는 이들로부터 얻은 추출물에 시트로자임을 처리하면 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드가 인체에 유용한 형태의 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1로 전환됨을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 진세노사이드의 효소전환 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 진세노사이드(ginsenosides)에 시트로자임(Citrozym)을 처리하여 화합물 K를 수득하는 단계를 포함하는 진세노사이드의 효소전환 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 진세노사이드(ginsenosides)에 시트로자임(Citrozym)을 처리하여 화합물 K 및 진세노사이드 F1을 수득하는 단계를 포함하는 진세노사이드의 효소전환 방법을 제공한다.

본 발명자들은, 인삼 또는 홍삼에 포함되어 있는 사포닌, 즉 진세노사이드를 인체에 보다 유용한 형태, 즉 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1로 전환(conversion)시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 인삼 또는 홍삼, 또는 이들로부터 얻은 추출물에 시트로자임을 처리하면 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드가 인체에 유용한 형태의 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1로 전환됨을 확인하였다.

본 발명은 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드(즉, 사포닌)을 전환하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 인삼 또는 홍삼 내의 진세노사이드의 주요한 인체 내 대사물인 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 명세서에서 용어 “사포닌”은 특별하게 다른 언급이 없는 한, 진세노사이드, 즉 인삼 사포닌과 동일한 의미로 사용된다.

기재의 편의상, 본 발명의 방법은 진세노사이드에 적용되는 것으로 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명에 의해 제조되는 화합물 K는 프로토파낙사디올(protopanaxadiol)에 하나의 글루코오스가 결합된 것이다. 즉, 화합물 K는 여러 개의 당이 결합된 프로토파낙사디올계의 진세노사이드에서 하나의 글루코오스를 제외한 나머지 당들이 떨어져 나간 것이다. 또한, 본 발명에 의해 제조되는 진세노사이드 F1은 프로토파낙사트리올(protopanaxatriol)에 하나의 글루코오스가 결합된 것이다. 즉, 진세노사이드 F1은 여러 개의 당이 결합된 프로토파낙사트리올계의 진세노사이드에서 하나의 글루코오스를 제외한 나머지 당들이 떨어져 나간 것이다.

본 발명에서 출발물질로 이용되는 “진세노사이드”는 바람직하게는, 인삼 또는 홍삼 고유의 진세노사이드를 의미한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 출발물질로 이용되는 진세노사이드는 (a) 프로토파낙사디올계의 진세노사이드, 즉 진세노사이드 Ra1-3, Rb1-3, Rc, Rd, Rg3, Rh2, Ri, Rs1 및 Rs2, 말로닐-진세노사이드 Rb1-2, Rc 및 Rd; 그리고 (b) 프로토파낙사트리올계의 진세노사이드, 즉 진세노사이드 Re, Rf, Rg1-2 및 Rh1이다.

본 발명에서 출발물질로 이용되는 진세노사이드로는, 분리 및 정제된 형태의 진세노사이드를 이용할 수 있지만, 바람직하게는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 진세노사이드이다. 즉, 진세노사이드를 포함하는 인삼 또는 홍삼의 분말 또는 추출물을 직접 출발물질로 이용하여 본 발명의 방법을 실시한다. 본 발명은 다양한 형태로 가공된 모든 인삼, 예컨대, 수삼, 미삼, 백삼 및 홍삼에 적용될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 인삼으로는, 공지된 다양한 인삼을 사용할 수 있으며, 고려삼(Panax ginseng), 회기삼(P. quiquefolius), 전칠삼(P. notoginseng), 죽절삼(P. japonicus), 삼엽삼(P. trifolium), 히말라야삼(P. pseudoginseng) 및 베트남삼(P. vietnamensis)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 이용되는 홍삼은 상기 인삼을 가공처리 하여 제조된 것이다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 인삼은 고려삼(Panax ginseng) 또는 전칠삼(P. notoginseng)이다.

본 발명의 가장 큰 특징은 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1을 제조하는 있어서, 시트로자임을 이용한다는 것이다. 본 발명에서 이용되는 시트로자임은 다른 효소들보다 매우 우수한 진세노사이드 생성율을 나타낸다.

바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 시트로자임은 펙티나아제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제의 혼합물이다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 시트로자임은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 미생물에서 세포외 분비되는 효소인 펙티나아제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제의 혼합물이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 시트로자임은 Novozyme 회사에서 구입 가능한 “Citrozym Cloudy 100L”이다.

본 발명에서의 효소전환 반응은, 바람직하게는 완충액에서 실시한다. 본 발명의 효소전환 반응에 이용될 수 있는 완충액은 효소 반응에 이용되는 어떠한 완충액도 포함하며, 바람직하게는 아세테이트 완충액, 시트레이트 완충액, 인산 완충액 또는 시트레이트-인산 완충액이다.

본 발명의 효소전환 반응에서 pH는 바람직하게는 3.0-7.5, 보다 바람직하게는 4.0-6.0, 가장 바람직하게는 약 5.0이다. 효소전환 반응에서 온도는 바람직하게는 30-65℃, 보다 바람직하게는 40-60℃, 보다 더 바람직하게는 48-52℃, 가장 바람직하게는 약 50℃이다.

본 발명의 방법에 따르면, 높은 생성율로 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1를 얻을 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물 K에 대한 생성율은 20-30%, 보다 바람직하게는 22-30%, 가장 바람직하게는 25-27%이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “생성율”은 인삼 또는 홍삼의 분말 용해액 또는 추출액을 출발물질로 하여 전환반응을 실시하는 경우, 반응 결과물에 포함된 전체 진세노사이드에서 생성된 특정 진세노사이드(예컨대, 화합물 K)의 중량%를 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 진세노사이드 F1에 대한 생성율은 2.5-6%, 보다 바람직하게는 3-5%, 가장 바람직하게는 3.8-4%이다. 본 발명의 진세노사이드 F1에 대한 생성율은 화합물 K보다 낮지만, 출발물질 자체에 프로토파낙사트리올계의 진세노사이드의 함량이 낮은 것을 고려하면, 상기 생성율도 매우 우수한 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 인삼 또는 홍삼의 진세노사이드로부터 높은 생성율로 보다 간단하게 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1을 얻을 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 진세노사이드의 효소 전환 1

분말 건삼((주)홍삼닷컴) 5%(w/v)을 50 mM Na-아세테이트 완충액(pH 5.0)에 용해한 다음, Citrozym Cloudy 100L(Novozyme; 효소 종류, 펙티나아제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제의 복합물; 효소 생산 미생물, 아스퍼질러스 나이거) 효소 5%(v/v)를 첨가하고, 50℃에서 72시간 동안 반응시켰다. 반응 후 수포화부탄올을 첨가하여 반응을 정지시킨 다음, 상층액을 얻어 진공 건조시켰다. 진공 건조물에 메탄올을 첨가하고 필터링한 다음, HPLC 분석을 하였다. HPLC 분석은, Waters HPLC(600 controller, 717 plus Autosampler, 2487 dual absorbance detector)를 사용하여 실시하였고, 컬럼은 ZORBAX Edipse XDB-C18 (4.6 x 250 mm, 5 micron), 컬럼의 오븐 온도는 30℃, 샘플의 로딩양은 10 ㎕로 하였다. 이동상으로는 100% 물과 100% 아세트니트릴로 75분간 농도구배 하여 얻었다. 유속은 분당 2.5 ml로 하였으며, 203 nm에서 검출하였다. 실험 결과는 도 2에 나타나 있다.

도 1은 효소 처리를 하지 않은 분말 건삼(대조군)에 대한 HPLC 분석 데이터이다. 보류시간(retention time), 17분, 24.5분, 26.5분, 28.3분 및 31분은 각각 진세노사이드 Rg1(Re), Rb1, Rc, Rb2 및 Rd에 해당하는 것이다.

도 2의 HPLC 크로마토그램에서, 보류시간 29분, 55.8분 및 68.7분은 각각 진세노사이드 F1, 화합물 K 및 PPD(protopanaxadiol)에 해당하는 것이다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, 화합물 K에 해당하는 보류시간 55.8분의 피크가 Citrozym Cloudy 100L의 처리에 의해 크게 증가하였음을 확인할 수 있다(검출된 진세노사이드들 중에서 화합물 K의 비율이 26.3%). 결국 인삼에 있는 진세노사이드의 화합물 K로의 효소전환이 Citrozym에 의해 매우 우수하게 이루어진다는 것을 알 수 있다. 또한, 진세노사이드 F1에 해당하는 보류시간 29분의 피크가 Citrozym Cloudy 100L의 처리에 의해 크게 증가하였음을 확인할 수 있다(검출된 진세노사이드들 중에서 진세노사이드 F1의 비율이 3.88%). 따라서, 인삼에 있는 진세노사이드가 Citrozym에 의해 진세노사이드 F1로 효율적으로 전환되었음을 알 수 있다.

실시예 2: 진세노사이드의 효소 전환 2

상기 실시예 1과 동일하게 효소 전환하되, Pectinex 5XL(Novozyme; 효소 종류, 폴리갈락투로나아제; 효소 생산 미생물, 아스퍼질러스 아쿨레아투스, 아스퍼질러스 나이거)를 이용하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, Pectinex 효소에 의해 0.8%(검출된 진세노사이드들 중에서 화합물 K의 비율)의 화합물 K를 얻을 수 있었다. 한편, 진세노사이드 F1에 해당하는 피크는 거의 형성되지 않았다.

실시예 3: 진세노사이드의 효소 전환 3

상기 실시예 1과 동일하게 효소 전환하되, Celluclast 1.5L(Novozyme; 효소 종류, 셀룰라아제; 효소 생산 미생물, 트리코더마 레에세이)를 이용하였다.

도 4에서 확인할 수 있듯이, Celluclast 1.5L 효소에 의해 2.6%(검출된 진세노사이드들 중에서 화합물 K의 비율)의 화합물 K를 얻을 수 있었다. 한편, 진세노사이드 F1에 해당하는 피크는 거의 형성되지 않았다.

실시예 4: 진세노사이드의 효소 전환 4

상기 실시예 1과 동일하게 효소 전환하되, Viscozyme L(Novozyme; 효소 종류, 카보하이드라타아제의 혼합물; 효소 생산 미생물, 아스퍼질러스)를 이용하였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, Viscozyme L 효소에 의해서는 화합물 K를 얻을 수 없음을 확인할 수 있었다. 한편, 진세노사이드 F1에 해당하는 피크는 거의 형 성되지 않았다.

실시예 5: 진세노사이드의 효소 전환 5

상기 실시예 1과 동일하게 효소 전환하되, Novoferm 61(Novozyme; 효소 종류, 폴리갈락투로나아제; 효소 생산 미생물, 아스퍼질러스 아쿨레아투스, 아스퍼질러스 나이거)를 이용하였다.

도 6에서 확인할 수 있듯이, Novoferm 61 효소에 의해서는 화합물 K를 얻을 수 없음을 확인할 수 있었다. 한편, 진세노사이드 F1에 해당하는 피크는 거의 형성되지 않았다.

실시예 6: 진세노사이드의 효소 전환 6

상기 실시예 1과 동일하게 효소 전환하되, Lactozym 3000L HP-G(Novozyme; 효소 종류, 베타-갈락토시다아제; 효소 생산 미생물, 클루이베로마이세스 락티스)를 이용하였다.

도 7에서 확인할 수 있듯이, Lactozym 3000L HP-G 효소에 의해서는 화합물 K를 얻을 수 없음을 확인할 수 있었다. 한편, 진세노사이드 F1에 해당하는 피크는 거의 형성되지 않았다.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 보다 개선된 생성율을 나타내는 진세노사이드의 효소전환 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 인삼 또는 홍삼의 진세노사이드로부터 높은 생성율로 보다 간단하게 화합물 K 및/또는 진세노사이드 F1을 얻을 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 진세노사이드(ginsenosides)에 시트로자임(Citrozym)을 처리하여 화합물 K를 수득하는 단계를 포함하는 진세노사이드의 효소전환 방법.
2. 진세노사이드(ginsenosides)에 시트로자임(Citrozym)을 처리하여 화합물 K 및 진세노사이드 F1을 수득하는 단계를 포함하는 진세노사이드의 효소전환 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 진세노사이드는 인삼의 분말 또는 추출물에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법은 pH 4.0-6.0에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법은 48-52℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법의 화합물 K에 대한 생성율은 20-30%인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 2 항에 있어서, 상기 방법의 진세노사이드 F1에 대한 생성율은 3-5%인 것을 특징으로 하는 방법.

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