KR20080091257A - 생물연료 및 관련 물질을 생산하는 시스템 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 의해, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(Clostridium phytofermentans) 세포(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection ) 700394T) 및 상기 종들 중 모든 다른 균주는 바이오매스 등의 물질을 유용한 산물 및 에탄올, 수소 및 유기산 등의 부산물로 발효시킬 수 있다. 본 발명에는 클로스트리늄 파이토퍼멘탄스를 포함한 조성물도 개시된다.
클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포, 바이오매스, 생물연료

Description

생물연료 및 관련 물질을 생산하는 시스템 및 방법{SYSTEMS AND METHODS FOR PRODUCING BIOFUELS AND RELATED MATERIALS}
[미국 연방정부에 의해 지원된 연구에 대한 진술]
본 발명은 미국 에너지성(DOE)에 의해 부여된, 승인번호 DE-FG02-02ER15330 하에, 미국 정부 지원에 의해 이루어졌다. 따라서 미국 정부가 본 발명에 대한 일정한 권리를 갖는다.
본 발명은 에탄올 등의 생물연료(biofuel), 및 관련 물질을 생산하는 조성물, 및 시스템 및 방법에 관한 것이다.
재생가능하고 지속적으로 이용할 수 있는 바이오매스(biomass) 자원으로부터 사용가능한 에너지를 생산하는 방법 개발이 관심을 끌고 있다. 탄수화물 형태의 에너지는 폐기물 바이오매스, 및 곡물(예, 옥수수 또는 밀) 또는 목초(grasses)(예, 스위치그래스(switchgrass)) 등의 에너지 전용 농작물에서 발견될 수 있다. 셀룰로스계 및 리그노셀룰로스계 물질(cellulosic and lignocellulosic material)은 다수의 응용예에서 대량으로 생산, 처리, 및 사용된다.
현재 도전은 탄수화물을 유용한 에너지 형태로 전환하기 위한 실용적이고 경제적인 전략을 개발하는 것이다. 탄수화물로부터 유용한 에너지를 유도하기 위한 전략으로는 에탄올("셀룰로스계 에탄올") 및 기타 알코올류(예, 부탄올)의 생산, 탄수화물의 수소로의 전환, 및 연료 전지를 통한 탄수화물의 전기에너지로의 직접 전환을 들 수 있다. 예를 들면, 바이오매스 에탄올 전략은 DiPardo, Journal of Outlook for Biomass Ethanol Production and Demand ( EIA Forecasts ), 2002; Sheehan, Biotechnology Progress, 15:8179, 1999; Martin, Enzyme Microbes Technology, 31;274, 2002; Greer, BioCycle, 61-65, April 2005; Lynd, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 66:3, 506-577, 2002; 및 Lynd et al. "셀룰로스계 바이오매스의 통합 생물학적 처리(Consolidated Bioprocessing of Cellulosic Biomass); 개정판", Current Opinion in Biotechnology, 16:577-583, 2005 에 기재되어 있다.
[발명의 개요]
본 발명은 혐기성 박테리아, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(Clostridium phytofermentans)의 새로운 특징의 발견에 일부 근거한 것이다. 예를 들면, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 단리된 균주(ISDg T , 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) 700394T)는, 37 C.F.R 1.14 및 35 U.S.C. 122. 하에 미국 특허상표청장에 의해 권원이 있다고 인정되는 자는 특허출원의 계 속 중에 그 배양물을 입수할 수 있음이 보장된다고 하는 조건 하에 기탁되었다. 상기 기탁물은 그 출원 또는 그 자손출원의 대응 특허출원이 제출되어 있는 국가의 외국 특허법에 의해 청구될 때 입수 가능하다. 하지만, 기탁물의 입수 가능성(availability)이, 정부의 행정처분에 의해 부여된 특허권을 침해하여 본 발명을 실시할 수 있는 자격(license)을 부여하는 것은 아니다. 또한, 본 배양 기탁물은 미생물 기탁에 대한 부다페스트 조약의 규정에 따라 보관되어 일반 대중이 입수 가능하게 될 것이다. 즉, 미생물 시료 제공에 대한 가장 최근의 청구 후 적어도 5년간, 그리고 어떠한 경우라도 기탁일로부터 적어도 30년간, 또는 그 배양물을 개시하여 발행되는 특허를 권리 행사 가능한 기간에 최후의 시료 청구 후 5년을 합한 기간 동안, 미생물을 오염시키지 않고 생존시키기 위하여 필요한 모든 주의를 기울여 보관될 것이다. 기탁자는, 기탁물의 상태를 이유로, 기탁기관이 청구된 시료를 분양할 수 없을 경우, 기탁물을 재기탁(replace)할 의무에 동의한다. 당해 배양 기탁물의 일반 대중의 입수 가능성에 대한 모든 제한규정은 그것을 개시하고 있는 특허가 허여되었을 때 취소불가능하게 제거될 것이다.
본 발명자들은, ISDg T 균주 등의 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 단독으로 또는 하나 이상의 미생물과 조합하여, 탄수화물 또는 탄수화물의 혼합물을 포함하는 물질을 가연성 연료(예, 에탄올, 프로판올 및/또는 수소)로 대규모로 발효시킬 수 있음을 알아내었다. 예를 들면, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 톱밥, 나무 가루(wood flour), 나무 펄프, 종이 펄프 폐기물 스팀, 목초(예, 스위치그래스), 바 이오매스 식물 및 곡물(예, 크람베(Crambe)), 조류(algae), 쌀겨, 사탕수수 찌꺼기, 황마, 잎, 목초 베어낸 것, 옥수수 마초, 옥수수 속, 옥수수 알갱이(옥수수 가루), 증류기 곡물(distillers grain), 및 증류기 용질(distillers solute) 등의 폐기물 바이오매스를, 에탄올, 프로판올 및 수소로 발효시킬 수 있다. 게다가, 유기산(예, 포름산, 락트산 및 아세트산) 또는 그들의 짝염기(예, 포르메이트, 락테이트, 아세테이트) 등의 다른 유용한 유기물도 생산할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은, 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 제공하는 단계; 가수분해된 바이오매스 물질을 제공하기 위해 상기 바이오매스 물질을 가수분해하는 단계; 배지 중에서 상기 가수분해된 바이오매스 물질과 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 결합(combining)시키는 단계; 및 연료 또는 연료 혼합물(예, 에탄올, 프로판올, 및/또는 수소)을 생산하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안 상기 가수분해된 바이오배스 물질을 발효시키는 단계를 포함하는, 하나 이상의 바이오매스 물질로부터 연료 또는 연료들을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 연료 외에도, 기타 생산물 및/또는 부산물을 생산할 수 있다(예, 유기산 및/또는 그들의 짝염기). 일부 실시형태에서, 배지 중의 탄수화물의 농도는 약 20mM 보다 크다. 기타 실시형태에서, 상기 농도는 약 1mM 보다 크고, 예를 들면, 2mM, 3mM, 4mM, 5mM, 6mM, 7mM, 8mM, 9mM, 10mM, 12mM, 14mM, 16mM, 또는 18mM 보다 크다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 고분자량의 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 가수분해하도록 구성된(configured) 가수분해 유닛(hydrolysis unit)과, 그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포가 분산되어 있는 배지를 보유하도록 구성된 발효기(fermentor)를 포함하는 연료 플랜트(fuel plant)를 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 배지 중에서 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포와 리그노셀룰로스계 물질(lignocellulosic material)(및/또는 다른 바이오매스 물질)을 결합시키는 단계, 및 연료 또는 연료들(예, 에탄올, 프로판올 및/또는 수소)를 생산하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안 상기 리그노셀룰로스계 물질을 발효시키는 단계를 포함하는, 연료 또는 연료들을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 배지 중에서 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포와 탄수화물을 포함하는 물질을 결합시키는 단계, 및 연료를 제조하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안 상기 탄수화물을 발효시키는 단계를 포함하는, 연료 또는 연료들을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 상기 배지 중의 탄수화물의 농도는 20mM 보다 크고, 예를 들면, 30mM, 40mM, 50mM, 75mM 보다 크거나, 또는 100mM 이상보다 더 크다.
본 명세서에 기재된 방법 중의 어느 것에서는, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포를 단독으로 또는 하나 이상의 다른 미생물(예, 효모 또는 다른 박테리아)과 조합하여 이용하여, 연료 또는 또 다른 유용한 생산물(유기산, 또는 염(예, 나트륨염 또는 칼륨염)으로서 단리될 수 있는 그들의 짝 염기 등)을 생산할 수 있다. 다른 박테리아의 예로는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 중의 어느 균주이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 단독으로 또는 효모 균주 또는 자이모모나스 모빌리스 균주 등의 하나 이상의 다른 미생물과 공배 양(coculture)하여 하나 이상의 바이오매스 물질로부터 연료 또는 연료들을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 연료 생산 외에도, 상기 공배양(coculture)은 본 명세서에 기재된 어떠한 부산물(유기산, 또는 그들의 짝염기 또는 염 등)을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 채용하여 하나 이상의 바이오매스 물질(본 명세서에 기재된 물질들 중의 어느 것 등)로부터 유기산 또는 그들의 짝염기 또는 염을 생산하는 방법을 특징으로 한다. 예를 들면, 상기 다른 유용한 생산물 또는 부산물은 화학 또는 약제 산업의 공급 원료로서 사용될 수 있다. 생산할 수 있는 산(짝 염기)의 예로는 락트산(락테이트) 및 아세트산(아세테이트)을 들 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와 하나 이상의 다른 미생물(예, 효모 또는 기타 박테리아(예, 자이모모나스 모빌리스))을 포함하는 공배양을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와 하나 이상의 다른 미생물(예, 효모 또는 기타 박테리아(예, 자이모모나스 모빌리스))을 포함하는 조성물을 특징으로 한다. 상기 조성물은, 예를 들면, 고체 혼합물(예, 냉동-건조된 혼합물), 또는 상기 미생물들의 액체 분산액, 예를 들면, 공배양액 형태일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 바이오매스 또는 바이오매스 물질의 혼합물을 선별하는 단계; 배지 중에서 상기 바이오매스와 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 배 지와 결합시키는 단계; 제2 바이오매스 물질을 제공하기 위해 제1 기간 동안 상기 바이오매스를 발효시키는 단계; 상기 제2 바이오매스 물질을 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와는 다른 또 다른 미생물 또는 미생물 혼합물과 결합시키는 단계; 및 연료 또는 유기산 등의 유용한 물질을 생산하기 위해 상기 제2 바이오매스 물질을 제2 기간 동안 발효시키는 단계를 포함하는, 생물연료 등의 유용한 산물을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스가 분산되어 포함된 배지를 포함하는 발효기를 특징으로 한다. 상기 배지는, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와 함께, 본 명세서에 기재된 다른 미생물 중의 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 다른 미생물 중의 어느 하나 이상과 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 공배양하여 포함하는 발효기를 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스가 분산되어 포함된 배지를 포함하는 발효기를 특징으로 한다. 상기 발효기는 에탄올 등의 발효 생산물을 지속적으로 제거하도록 구성되어 있다. 일부 실시형태에서, 상기 생산물의 농도는 실질적으로 일정하게 유지되거나, 또는 평균 농도의 약 25퍼센트내로 유지된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 어떠한 바이오매스는 발효기에 연속적으로 공급된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 공정(process) 중의 어느 것에 의해 생산된 산물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 키트, 예를 들면, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 포함하는, 발효기를 도입(seeding)하기 위한 키트를 특징으로 한다. 상기 키트는 본 명세서에 기재된 다른 미생물 중의 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트 중의 미생물은 단일 용기 또는 다중 용기에 결합시킬 수 있다. 상기 키트 중의 미생물은 배지 중에 분산시키거나, 또는 동결 건조시킬 수 있다. 상기 키트는 영양분(nutrient) 등의 출발 물질(starter material)을 더 포함할 수 있다.
클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 700394T)는 배양된 균주, ISDg T 의 표현형 특성 및 유전자형 특성에 근거하여 규정된다(Warnick et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52:1155-60, 2002). 본 발명은, 일반적으로, ISDg T 균주 및/또는 ISDg T 로부터 유래되거나 또는 별개로 단리된 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 종의 어느 다른 균주를 포함하는, 연료 및/또는 다른 유용한 유기 생산물을 생산하는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 종들은 표준 분류학적 고려사항을 이용하여 규정된다(Stackebrandt and Goebel, International Journal of Systematic Bacteriology, 44:846-9, 1994): 상기 타입 균주(ISDg T )와 비교하여 97% 이상의 16S rRNA 서열 상동성 값을 가진 균주는, 그들이 70% 미만의 DNA 재결합(re-assocation) 값을 가진 것으로 나타나지 않는 한, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 균주로 간주된다. 또한, 70% 이상의 DNA 재결합 값을 가진 미생물이 적어도 96%의 DNA 서열 동일성(identity)을 가지며 종을 규정하는 표현형 형질을 공유함을 나타내는 중요한 증거가 존재한다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 균주 ISDg T 의 게놈 서열의 분석은, 식물 다당류 발표 메카니즘 및 경로에 관여하여, 이들 미생물의 특별한 발효 특성을 일으킬 가능성이 있는 다수의 유전자 및 유전자좌의 존재를 나타낸다. 상기한 분류학적 고려사항에 근거하여, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 종의 모든 균주는 이들의 발효 특성 중의 모든, 또는 거의 모든 특성을 갖는다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 균주는 자연 분리주, 또는 유전적으로 변형된 균주일 수 있다.
새로운 시스템 및 방법의 이점은 하기 중 어느 하나, 또는 조합을 포함한다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 고효율로 넓은 스펙트럼의 물질을 연료로 발효시킬 수 있다. 유용하게도, 폐기물, 예를 들면, 락토스, 폐휴지, 잎, 목초 베어낸 것, 및/또는 톱밥을 이용하여 연료를 제조할 수 있다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 고농도의 탄수화물에서조차도 활성을 유지한다. 종종, 탄수화물을 포함하는 물질들은 천연 그대로, 전처리 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 예에서, 셀룰로스계 물질의 일부를 형성하는 저분자량 셀룰로스계 물질을 방출하기 위해 발효하기 전에 상기 셀룰로스계 산, 염기, 효소로 전처리할 필요가 없다. 대신에, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 천연 그대로의 셀룰로스계 물질을 연료로 직접 발효시킬 수 있다. 일부 예에서, 리그노셀룰로스계 물질, 예를 들면, 톱밥 또는 스위치그래스 는 리그닌, 및/또는 헤미셀룰로스의 제거 없이 사용할 수 있다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포는 넓은 범위의 온도 및 pH 범위 하에 성장 및 발효한다. 상기 발효 배지의 pH는 발효하는 동안 조정할 필요가 없다. 일부 예에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포는, 원하는 생산물(예, 에탄올)의 수율을 증가시키기 위해서, 하나 이상의 다른 미생물과 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 고농도의 5탄당(5-carbon sugar), 또는 5탄당 반복 단위를 포함하는 중합체를 가연성 연료로 발효시킬 수 있다. 크실로스 등의 5탄당, 또는 크실란 등의 5탄당 반복 단위를 포함하는 중합체, 및 식물 세포벽의 "헤미셀룰로스(hemicellulose)" 부분(fraction)의 기타 성분은, 에탄올 및 수소 등의 생산물을 산출(yielding)하는 리그노셀룰로스계 물질의 다른 고분자 성분과 동시에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스에 의해 가수분해 및 발효된다. 상기 5탄당, 또는 5탄당 반복 단위를 포함하는 중합체는 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 대사 공급원(metabolic resource)을 전환하는 것(divert)으로 보이지는 않는다. 게다가, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 더 높은 셀룰로스 농도, 예를 들면, 40mM 보다 큰 농도를, 에탄올 수율을 증가시키면서, 발효시킨다. 다른 셀룰로스-발효 미생물은 일반적으로 약 20mM이 넘는 농도(글루코스 당량)의 셀룰로스를 발효시키지 않고, 에탄올 생산은 더 높은 셀룰로스 농도에서 감소된다(Desvaux et al., Appl . Environ , Microbiology, 66, 2461-2470, 2000).
탄수화물은 중합체, 올리고머, 이량체, 삼량체, 또는 단량체일 수 있다. 상기 탄수화물이 단일 반복 단위보다 더 많은 것으로부터 생성되는 경우, 각 반복 단 위는 동일하거나 다를 수 있다. 중합체 탄수화물의 예로는 셀룰로스, 크실란, 펙틴, 및 전분을 들 수 있는 한편, 셀로비오스(cellobiose) 및 락토스는 이량체 탄수화물의 예이다. 단량체 탄수화물의 예로는 글르코스 및 크실로스를 들 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 "저분자량 탄수화물" 이라 함은, 만능 교정 곡선(universal calibration curve)을 사용하여 결정 했을 때, 약 1,000 미만의 화학식량, 또는 수평균 분자량을 가진 어떠한 탄수화물을 말한다. 일반적으로, "고분자량 탄수화물" 이라 함은 1,000보다 큰 분자량, 예를 들면, 5,000 보다 크거나, 10,000보다 크거나, 25,000보다 크거나, 50,000보다 크거나, 100,000보다 크거나, 150,000보다 크거나, 또는 250,000보다 큰 분자량을 가진 어떠한 탄수화물을 말한다.
한정되고 컴퓨터판독가능한 화학식량을 가진 한정된 단일 구조의 탄수화물, 예를 들면, 단량체 또는 이량체 탄수화물(예, 아라비노스 및 셀로비오스, 각각)에 대해서, 농도는 상기 탄수화물의 화학식량을 이용하여 계산한다. 한정된 단일 구조를 갖지 않는 탄수화물, 예를 들면, 중합체 탄수화물(예, 셀룰로스)에 대해서, 농도는 중합체 탄수화물의 전량(entire mass)이 그 중합체 탄수화물을 형성하는 단량체 탄수화물 단위로 가수분해될 수 있는 것으로 보고 계산한다. 그 다음, 상기 단량체 탄수화물 단위의 화학식량을 적용하여, 단량체 등가 단위(monomer equivalent unit)의 농도를 계산한다. 예를 들면, 순수 셀룰로스는 전체적으로 글루코스 반복 단위로 구성된다. 상기 셀룰로스 전량이 글로코스로 가수분해된다고 볼 때, 셀룰로스 10그램은 글루코스 10그램이 될 것이다. 글루코스(C6H12O6)의 화학식량은 180.16 amu이다. 글루코스 10그램은 0.056몰의 글루코스이다. 이러한 양의 글루코스 양이 1L의 용액 중에 있을 경우, 그 농도는 0.056 M 또는 56mM이 될 것이다. 상기 중합체가 하나 이상의 반복 단위를 가질 경우, 그 농도는 중합체 탄수화물의 전량이 그 중합체 탄수화물을 형성하는 단량체 탄수화물로 가수분해될 수 있다고 보고 전체 평균 농도로서 계산한다. 예를 들면, 상기 중합체 탄수화물이 전체적으로 2개의 반복 단위로 구성될 경우, X 그램의 중합체 탄수화물의 가수분해에 의해 X 그램의 단량체 탄수화물을 얻는다. 합성 화학식량(composite formula weight)은 제1 단량체 탄수화물의 몰 분율과 그의 화학식량의 곱과 제2 단량체 탄수화물의 몰 분율과 그의 화학식량의 곱의 합이다. 그 다음, 탄수화물의 평균 몰수는 X 그램을 상기 합성 화학식량으로 나눈 값이다. 평균 탄수화물 농도는 상기 평균 몰수를 그들이 포함되어 있는 용액의 양으로 나누어 알아낸다.
"발효가능한 물질(fermentable material)"은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(예, ISDg T )가, 적어도 일부분, 연료(예, 에탄올, 프로판올 또는 수소) 및/또는 또 다른 유용한 생산물(예, 유기산)로 전환시킬 수 있는 물질이다.
바이오매스는 생물 유기체(예, 식물 또는 동물), 사체(dead) 또는 생체이거나 또는 이들로부터 유래하는 비화석 유기물이다. 바이오매스는 지질학적 과정(geological process)에 의해 석탄 또는 석유 등의 물질로 변환된 덩어리(mass)는 배제하지만, 예를 들면, 상기 유기체 또는 상기 유기체의 잔여물(remnant)을 화 학적으로 처리함으로써 얻은, 생유기체 또는 죽은 유기체 유래의 물질들을 포함한다. 바이오매스의 예로는 나무, 나무 관련 물질(예, 파티클 보드), 종이, 목초(예, 스위치그래스, 미스칸투스(Miscanthus)), 쌀겨, 사탕수수 찌꺼기, 목화, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘삼, 마닐라삼, 짚, 잎, 목초 베어낸 것, 옥수수 마초, 옥수수 속, 증류기 곡물, 콩과 식물, 사탕수수 및 바이오매스 농작물(예, 크람베)를 들 수 있다.
달리 규정하지 않더라도, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 기술을 가잔 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 등가의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있으나, 적합한 방법 및 물질을 하기에 기재한다. 본 명세서에 기술된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 기타 참조문은 그 전체가 참고로 편입된다. 충돌(conflict)의 경우에는, 본 발명의 명세서(정의를 포함함)에 따를 것이다. 또한, 상기 물질, 방법 및 예는 단지 설명을 위한 것이며, 이들에 한정하고자 하는 것은 아니다.
본 발명의 특징 및 이점은 하기 상세한 설명, 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
[도면의 간단한 설명]
도 1은 그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포가 분산되어 있는 배지를 보유하는 발효 용기의 단면 도식도이다.
도 2는 소섬유 바이오매스(fibrillate biomass)에 사용되는 회전 칼 절단기(rotary knife cutter)의 단면 도식도이다.
도 3a는 도 2의 회전 칼 절단기로 전단된 셀룰로스계 물질의 사진이다.
도 3b는 도 3a에 나타낸 물질을 고도로 확대한 현미경 사진이다.
도 4는 산 가수분해 전처리를 이용하여 바이오매스로부터 에탄올 및 수소를 생산하는 공정을 나타내는 블럭선도(block diagram)이다.
도 5a는 효소 가수분해 전처리를 이용하여 바이오매스로부터 에탄올 및 수소를 생산하는 공정을 나타내는 블럭선도이다.
도 5b는 효소로 전처리 하지 않은 바이오매스를 이용하여 바이오매스로부터 에탄올 및 수소를 생산하는 공정을 나타내는 블럭선도이다.
도 5c는 화학적 또는 효소적 전처리를 하지 않았으나, 필요에 따라, 스팀처리되는 바이오매스를 이용하여 바이오매스로부터 에탄올 및 수소를 생산하는 공정을 나타내는 블럭선도이다.
도 6은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와 함께 다양한 초기 셀룰로스 농도(글루코스 당량으로)를 발효시켜 얻은 주생산물 및 그 생산물의 농도를 나타내는 막대 그래프이다.
도 1은 그 내부에 발효가능 물질이 용해 또는 분산되어 있는 배지(12)를 수용하는 발효 용기(10)를 나타낸다. 상기 발효가능 물질은 탄수화물(예, 글루코스, 셀로비오스, 또는 셀룰로스)이거나 또는 이들을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배지(12) 내에는 ISDg T 등의 복수의 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포(14)가 분산되어 있다. 상기 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포(14)는 상기 발효가능 물질을 발효시켜 가연성 연료, 예를 들면, 에탄올 및/또는 수소를 생산한다. 다른 유용한 생산물 및 부산물도 생산할 수 있다. 다른 생산물로는 유기산(예, 포름산, 락트산 및/또는 아세트산), 또는 그들의 짝염기(예, 포르메이트, 락테이트 또는 아세테이트 이온)를 들 수 있다.
클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포(14)(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 700394T)는 메사추세츠주(USA)에 있는 콰빈 저수지 근처 수목 지구의 간헐하천 바닥의 젖은 침니(slit)로부터 단리하였다. 일반적으로, ISDg T 세포(14)는 둥근 말단포자(직경이 0.9~1.5㎛)를 형성하는 길고, 얇고, 곧은 운동성 막대세포(3.0~15.0㎛로 0.5~0.8)이다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포의 부가적인 특징은 Warnick et al., Int . J. Systematic and Evol . Microbiology , 52, 1155-1160(2002)에 기재되어 있다.
클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포(14)는 혐기적인 환경에서 배양되며, 그 혐기적인 환경은 배지(12)의 표면 아래에 잠기는 가스 출구(18)를 포함하고 있는 기포발생기(bubbler)(16)를 통해서 실질적으로 산소가 없는 가스를 버블링시킴으로서 획득 및/또는 유지된다. 배지(12)중에서의 반응으로부터의 과잉의 유출물 및 가스는 상부공간(headspace)(22)을 채우고 결국에는 용기 벽(30)에 형성된 가스 출구 구멍(21)을 통과하여 빠져나온다. 혐기적인 상태를 유지하기 위해서 사용될 수 있는 가스로는 N2, N2/CO2(80:20), N2/CO2/H2(83:10:7), 및 노벨(Nobel) 가스(예, 헬륨 및 아르곤)을 들 수 있다. 일부 실시형태에서는, 균질성(homogeneity)을 획득 및/또는 유지하기 위해서, 배지(12)를 교반한다(화살표(40)으로 표시한 바와 같이). 또한, 균질성은 스케이팅 또는 진동 용기(10)에 의해 유지할 수 있다.
일부 예에서, 배지(12) 중에 현탁되어 있는 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포(14)의 농도는 약 106 ~ 약 109 세포/mL, 예를 들면, 약 107 ~ 약 108 세포/mL이다. 일부 실시형태에서, 발효 개시 시의 농도가 약 107 세포/mL이다.
본 발명자들은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포(14)가 낮은 농도의 탄수화물(예, 0.01mM ~ 약 5mM)과, 높은 농도의 탄수화물 둘다를 발효시킬 수 있으며, 일반적으로 다른 유기체에서 부작용을 나타내는 비교적 높은 농도의 탄수화물에서도 그들의 작용이 저해되지 않음을 알아내었다. 예를 들면, 배지에서의 탄수화물의 농도는 20mM보다 클 수 있고, 예를 들면, 25mM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM, 75mM, 100mM, 150mM, 200mM, 250mM, 300mM 또는 500mM 이상보다 더 클 수 있다. 이들 실시형태 중의 어느 것에서, 상기 탄수화물의 농도는 일반적으로 2000mM보다 작다.
상기 발효가능 물질은 하나 이상의 저분자량 탄수화물이거나 또는 이들을 포함할 수 있다. 상기 저분자량 탄수화물은, 예를 들면, 단당류, 이당류, 올리고당류, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 단당류는 예를 들면, 트리오스, 테트로스, 펜토스, 헥소스, 헵토스, 노노스, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 단당류는 아라비노스, 글리세르알데히드, 디히드록시아세톤, 에리트로스, 리보스, 리불로스, 크실로오스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, 프락토스, 세도헵툴로스, 뉴라믹산, 또는 이들의 혼합물 일 수 있다. 상기 이당류는, 예를 들면, 슈크로스, 락토스, 말토스, 젠티오비오스, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 저분자량 탄수화물은 고분자량 다당류(예, 셀룰로스, 크실란, 또는 헤미셀룰로스, 펙틴, 및/또는 전분의 기타 성분)를 절단(breaking down)하여 얻어진다. 이 기술은 폐기물 흐름(waste stream), 예를 들면, 폐휴지(예, 폐신문 및 폐상자)에 편리하게 직접 적용할 수 있다. 일부 예에서, 상기 절단은 개별 과정으로서 행해진 다음, 저분자량 탄수화물이 이용된다. 다른 예에서, 상기 고분자량 탄수화물은 직접 배지에 첨가되어, 저분자량 탄수화물로 그 자리에서(in situ) 절단된다. 일부 실시형태에서, 이것은, 예를 들면, 산화, 염기 가수분해, 및/또는 산 가수분해에 의해 화학적으로 행해진다. 화학 가수분해는 Bjerre, Biotechnol . Bioeng., 49:568, 1996, 및 Kim et al., Biotechnol . Prog ., 18:489, 2002에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 상기 저분자량 탄수화물은 효소 또는 효소들(예, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제 또는 셀로비오하이드롤라제(CBH))을 이용하여 다당류를 절단하여 생성된다. 이들 효소는 효소 제제로서 다당류원에 첨가될 수 있거나, 또는 유기체(예, 아스페르질러스 나이거(Aspergillus niger) BKMF 1305 및 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei RUT C30)에 의해 제자리에서(in situ) 생산될 수 있다. 효소적 절단은 T. Juhasz, Food Tech . Biotechnol.(2003), 41, 49에서 논의되어 있다.
특정한 실시형태에서는, 락토스가 탄수화물로서 사용된다. 락토스는 는 치즈 산업에 의해 대량으로 생산된다. 예를 들면, Elliott, Proceedings of the 38th Annual Marschall Cheese Seminar(2001)에 의해, 년간 약 4억7천만 파운드가 미국 치즈 산업에 의해 생산되며, 또 다른 7억2천6백만 파운드가 유럽에서 생산되는 것으로 추정되었다. 락토스는, 예를 들면, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포 단독에 대한 증식 기질로서, 또는 다른 증식 기질과 함께, 발효기, 예를 들면, 주 발효기에 공급되는 종균 발효기에서 사용된다. 저분자량 탄수화물의 발효를 증대시키고 및/또는 셀룰로스 또는 기타 고분자량 탄수화물의 분해 및 발효를 촉진시키기 위해, 발효 용기에 락토스를 첨가할 수 있다.
또한, 상기 발효가능 물질은 하나 이상의 고분자량 탄수화물이거나, 또는 이들을 포함할 수 있다. 고분자량 탄수화물로는, 예를 들면, 폴리갈락투론산, 셀룰로스, 마이크로크리스탈린 셀룰로스, 펙틴, 전분, 크실란, 기타 헤미셀룰로스 중합체, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다. 마이크로크리스탈린 셀룰로스 및 변형된 마이크로크리스탈린 셀룰로스는 상표명이 아비셀(AVICEL)인 FMC 생체중합체로부터 상업적으로 입수가능하다.
상기 발효가능 물질은 또한 하나 이상의 바이오매스 물질, 예를 들면, 셀룰로스성 또는 리그노셀룰로스계 물질이거나, 또는 이들을 포함할 수 있다. 셀룰로스계 물질은 셀룰로스를 포함하는 물질이지만, 실질적으로 리그닌은 포함하지 않는(예, 0.5 중량% 미만으로 포함하는) 물질이다. 상기 셀룰로스계 물질은 천연, 반합성, 또는 완전히 합성한 것 일 수 있다. 예를 들면, 목화는 천연 셀룰로스계 물질이다. 반합성 셀룰로스계 물질로는, 예를 들면, 레이온(재생 셀룰로스), 및 목화 섬유(예를 들면, 미사용 폐기처분 직물(예, 잔여물)로부터 얻어진 것) 또는 사용된 폐기물(post customer waste)(예, 헝겊)을 포함하는 직물을 들 수 있다. 다른 반합성 셀룰로스계 물질로는 증류기 곡물(예, 옥수수 에탄올 산업으로부터), 종이, 및 다중 코팅된 종이 및 크라프트 종이(Kraft paper)등의 제품을 들 수 있다. 상기 종이 또는 종이 제품은 미사용 물질(virgin material)이거나, 또는 사용된 폐기물일 수 있다.
리그노셀룰로스계 물질은 셀룰로스와 수 퍼센트의 리그닌, 예를 들면, 적어도 약 0.5 중량% ~ 약 60중량% 이상의 리그닌을 포함한다. 리그닌은 폴리페놀 물질로서 생각될 수 있다. 일부 리그닌은 하기 구조(I):
Figure 112008060420879-PCT00001
로 나타낼 수 있다.
리그닌은 고도로 분기될 수 있으며, 또한 부분적으로 가교될 수 있다. 리그닌은 그 공급원에 따라, 예를 들면, 침엽수에서 유래하는지 활엽수에서 유래하는 지에 따라, 적어도 일부분, 상당한 구조적 변형을 가질 수 있다.
리그노셀룰로스계 물질로는, 예를 들면, 제지 슬러지; 나무, 및 나무 관련 재료, 예를 들면, 톱밥, 파티클 보드 또는 잎; 및 천연 섬유 공급원, 예를 들면, 포플러 나무 등의 나무, 스위치그래스 등의 목초, 잎, 목초 베어낸 것, 쌀겨, 사탕수수 찌꺼기, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘삼, 마닐라삼, 짚, 옥수수 마초, 옥수수 속, 밀짚, 및 코코넛 털을 들 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 리그노셀룰로스계 물질은 칩엽수, 예를 들면, 이스턴 햄록(Tsuga canadensis), 은행나무(Ginkgo bilboa), 연필 향나무(Juniperus virgineana), 산 소나무(Pinus mugo), 히말라야 삼나무(Cedrus deodara), 북미산 적송나무(Thuja plicata), 서양 주목(Taxus baccata), 콜로라도 가문비나무(Picea pungens); 또는 활엽수, 예를 들면, 마가목(Sorbus), 고무나무(Eucalyptus gunnii), 자작나무(Betula platyphylla), 또는 노르웨이 단풍나무(Acer platanoides)로부터 얻어져서, 이용될 수 있다. 포플러, 너도 밤나무, 사탕 단풍 나무 및 오크 나무도 이용될 수 있다.
일부 예에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포는 리그노셀룰로스계 물질을 리그닌을 제거할 필요 없이 직접 발효시킬 수 있다.
하지만, 어떠한 실시형태에서는, 발효 전에 리그노셀룰로스계 물질로부터 리그닌의 적어도 일부를 제거하는 것이 유용하다. 예를 들면, 상기 리그노셀룰로스계 물질로부터 리그닌을 제거함으로써, 그 나머지 셀룰로스계 물질을 표면적이 더 넓은 다공성으로 만들 수 있으며, 예를 들면, 발효 속도 및 에탄올 수율을 증가시킬 수 있다. 상기 리그닌은, 예를 들면, 아황산법(sulfite process), 알칼린법, 또는 크라프트법에 의해, 리그노셀룰로스계 물질로부터 제거할 수 있다. 상기 방법 및 기타 방법들은 Meister, 미국특허번호 5,138,007, 및 Knauf et al., International Sugar Journal, 106:1263, 147-150(2004)에 기재되어 있다. 스위치그래스의 리그닌 함량은 약 17.6%(% 건조중량)이며, 옥수수 마초와 거의 동일하다. 필기 용지의 리그닌 함량은 약 0% 리그닌 ~ 약 12% 리그닌의 범위이다. 일부 사무용지는 약 11-12% 범위의 리그닌 함량을 갖는다. Mosier et al., Bioresource Technology 96:673, 2005에서는 일부 물질의 리그닌 함량, 및 또한 그것을 제거하기 위한 몇몇 전처리 전략을 논의한다. 리그닌이 제거되는 경우, 예를 들면, 그 리그닌을 연소시킴으로써 보일러를 가열하는 공정에서, 리그닌은 에너지원으로서 사용될 수 있다.
셀룰로스계 물질은, 리그노셀룰로스계 물질을 화학적으로 처리하여 리그닌에 대하여 셀룰로스계 물질이 분리될 정도까지 리그닌을 가용화시킴으로써, 리그노셀룰로스계 물질로부터, 예를 들면, 섬유 형태로 얻을 수 있다. 상기 리그노셀룰로스계 물질은 나무로부터 얻어지며, 그 용해된 리그닌은 일반적으로 물질의 약 25%-45%를 구성하고 있다.
물질의 크기는, 예를 들면, 회전 칼 절단기 중에서 물질을 전단시키거나, 또는 볼밀 중에서 물질을 분쇄함으로써 줄일 수 있다. 회전 칼 절단기를 사용하여 물질(예를 들면, 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질)의 크기를 줄이는 경우, 통상적으로, 그 결과 얻어지는 물질은 사실상 섬유상이며, 실질적인 직경에 대한 길이의 비(예를 들면, 5/1 크거나, 10/1보다 크거나, 15/1보다 크거나, 20/1보다 크거나, 또는 25/1보다 더 큰 비)를 갖는다. 볼밀이 사용되는 경우, 통상적으로는, 그 결과 얻어지는 물질은 가루 형태이며, 통상적으로, 예를 들면, 5 마이크론 미만(예, 4 마이크론 미만, 2.5 마이크론 미만, 1 마이크론 미만)의 직경을 가진, 실질적으로 구형 입자를 갖는다.
도 2는, 예를 들면, 칩 형태의 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질(102)호퍼(101)를 포함하는 회전 칼 절단기(100)를 나타낸다. 상기 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질은 전단 구역(103)으로 빠져들어가서, 고정 블래이드(104)와 회전 블래이드(106) 사이에서 전단된다. 스크린(105)은, 상기 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질이 그 스크린에 획정되어 있는 구멍을 통과할 만큼 충분히 작은 크기로 될 때까지, 상기 물질이 전단 구역(103)에서 이탈하는 것을 방지한다. 상기 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질이 스크린에 있는 구멍을 통과했을 때, 상자(bin)(110)에 포획된다. 상기 전단된 섬유상 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질의 수집(collection)을 돕기 위해서, 상자(110)를 정상 대기압 이하의 압력으로 유지시킬 수 있다. 상기 상자에 수집된 섬유상 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질은 비교적 낮은 벌크 밀도(예를 들면, 입방 센티미터당 0.5 그램 미만, 예를 들면, 입방 센티미터당 0.3 그램 미만, 또는 입방 센티미터당 0.2 그램 보다 더 작은 벌크 밀도)를 가지며, 도 3a 및 3b에 나타내는 바와 같이, "솜털같은(fluffy)" 외형을 갖는다.
일부 실시형태에서, 비교적 고 표면적 및/또는 비교적 고 다공성을 갖는 섬유상 물질을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 다공성 물질은, BET(Brunauer Emmett Teller) 표면적 측정을 사용하여 측정했을 때, 0.5 ㎡/g 보다 큰 표면적, 예를 들면, 1.0 ㎡/g , 1.5 ㎡/g , 1.75 ㎡/g , 5 ㎡/g 보다 큰 표면적, 또는 10 ㎡/g 보다 더 큰 표면적을 가질 수 있고; 및/또는 수은 기공측정기(mercury porosimetry)로 결정했을 때, 70% 보다 큰 다공성, 예를 들면, 80%, 87.5%, 90%보다 크거나, 또는 95% 보다 더 큰 다공성을 가질 수 있다. 고 표면적 및/또는 고 다공성은 가수분해율 및/또는 발효율을 증가시킬 수 있다.
상기한 물질들 중의 어느 것의 혼합물(blend)로는, 예를 들면, 종이 공급원으로부터 얻어진 물질과 목화로부터 얻어진 물질의 혼합물을 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스가 분산되어 있는 배지를 포함하는 발효기는 에탄올 등의 발효 생산물이 지속적으로 제거되도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 상기 원하는 생산물의 농도는 실질적으로 일정하게 유지되거나, 또는, 예를 들면, 초기 농도를 약 10mM ~ 25 m로 하여 발효 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 또는 10시간 후에 측정했을 때, 평균 농도의 약 25 퍼센트내로 유지된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 어떠한 바이오매스 물질 또는 혼합물은 상기 발효기에 연속적으로 공급된다.
클로스트리듐 파이토퍼멘탄스용 배지는 완충액(예, NaHCO3, NH4Cl, NaH2PO4·H2O, K2HPO4 및 KH2PO4; 전해질(예, KCl 및 NaCl); 성장인자; 계면활성제; 및 킬레이트제 등의 부가적인 성분을 포함할 수 있다. 성장인자로는, 예를 들면, 비오틴, 폴산, 피리독신·HCl, 리보플라빈, 우레아, 효모 추출물, 티민, 트립톤, 아데닌, 시토신, 구아노신, 우라실, 니코틴산, 판토텐산, B12(시아노코발라민), p-아미노벤조산, 및 티옥트산을 들 수 있다. 미네랄로는, 예를 들면, MgSO4, MnSO4·H2O, FeSO4·7H2O, CaCl2·2H2O, CoCl2·6H2O, ZnCl2, CuSO4·5H2O, AlK(SO4)2·12H2O, H3BO3, Na2MoO4, NiCl2·6H2O, 및 NaWO4·2H2O를 들 수 있다. 킬레이트제로는, 예를 들면, 니트릴로트리아세트산을 들 수 있다. 계면활성제로는, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), PEG와 PPG의 공중합체 및 폴리비닐알콜을 들 수 있다.
일부 실시형태에서, 발효 조건은 배지의 온도를 약 45℃ 미만, 예를 들면, 42℃ 미만(예, 약 34℃ ~ 38℃, 또는 약 37℃)으로 유지하는 것을 포함한다. 이들 실시형태 중 어느 것에서는, 일반적으로, 상기 배지는 약 5℃ 보다 높은 온도, 예를 들면, 15℃보다 높은 온도로 유지된다.
일부 실시형태에서, 발효 조건은 배지의 pH를 약 9.5 미만, 예를 들면, 약 6.0 ~ 9.0, 또는 약 8 ~ 8.5로 유지하는 것을 포함한다. 일반적으로, 발효시키는 동안, 배지의 pH는 통상적으로 1.5 pH 단위 이상까지 많이 변화하지는 않는다. 예를 들면, 발효가 약 pH 7.5에서 시작되는 경우, 통상적으로, 발효의 종결점에서는 pH 6.0보다 낮아지지 않으며, 이것은 세포의 성장 범위내이다.
클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포는 비교적 고농도의 에탄올, 예를 들면, 7중량% 이상(예, 12.5 중량%)에 적응한다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포는, 보다 더 높은 농도의 에탄올(예, 20% 에탄올)에 적응시킬 수 있다. 발효시키기 전에 에탄올이 풍부한 환경(예, 7% 에탄올)에서 성장시켜서, 일부 실시형태에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 연속적으로 고농도의 에탄올(예를 들면, 2% 에탄올에서 시작하여, 다음은 5% 에탄올, 그 다음에는 10% 에탄올)에 적응시킨다.
에탄올 이외의 생산물이 생산될 수 있다. 보다 일반적으로, 발효 생산물로는 알코올(예, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 또는 이들의 혼합물) 및 수소 등의 연료를 들 수 있다. 기타 생산물로는 유기산(예, 포름산, 락트산, 아세트산, 또는 이들의 혼합물) 또는 그들의 짝 염기(예, 포르메이트, 락테이트 또는 아세테이트 이온) 또는 그들의 염을 들 수 있다
ISDg T 균주 등의 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 단독으로 또는 효모 또는 진균(fungi)(예, 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 트리코데르마 종(Trichoderma species), 아스페르질러스 종(Aspergillus species)) 또는 기타 박테리아(예, 자이모모모나스 모빌리스(Zymommonas moblis), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리듐 베이제린크키이(Clostridium beijerinckii), 클로스트리듐 파피로솔벤스(Clostridium papyrosolvens), 클로스트리듐 셀룰로라이티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리듐 조수이(Clostridium josui), 클로스트리듐 테르미티디스(Clostridium termitidis), 클로스트리듐 셀룰로시(Clostridium cellulosi), 클로스트리듐 셀레레크레센스(Clostridium celerecrescens), 클로스트리듐 포풀레티(Clostridium populeti), 클로스트리듐 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans)) 등의 하나 이상의 다른 미생물과 조합하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 셀룰로스분해 클로스트리듐(균주 C7)은 성장 기질로서 셀룰로스를 함유하는 배지 중에서 자이모모나스 모빌리스와 공배양하여 성장시켰을 때, 에탄올 수율이 상기 클로스트리듐 단독 배양보다 2.5배 높았다(Leschine and Canale-Parola, Current Microbiology, 11:129-136, 1984). 미생물 혼합물은 고체 혼합물(에, 동결건조 혼합물)로서, 또는 미생물의 액체 분산액으로서 제공할 수 있으며, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와 공배양하여 성장시키거나, 또는 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 첨가 전 또는 후에 또 다른 미생물을 첨가함으로써, 미생물들을 배양 배지에 순차적으로 첨가할 수도 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 바이오매스 물질 중의 어느 것 또는 본 명세서에 기재된 바이오매스 물질 중의 어느 것의 혼합물은 순차적인 또는 동시처리 방식으로 본 명세서에 기재된 하나 이상으로 미생물로 처리할 수 있다. 예를 들면, 상기 바이오매스(또는 바이오매스 혼합물)은 미생물 혼합물과 동시에 처리(공배양)할 수 있고, 또는 상기 바이오매스(또는 바이오매스 혼합물)을 초기에 제1 미생물 또는 미생물의 제1 혼합물(예, 하나 이상의 효모, 진균 또는 기타 박테리아)로 처리한 다음, 그 결과 얻어진 바이오매스를 하나 이상의 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 균주로 처리할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 바이오매스 물질(또는 바이오매스 혼합물)은 초기에 하나 이상의 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 균주로 처리한 다음, 그 결과 얻어진 바이오매스를 하나 이상의 다른 미생물(본 명세서에 기재된 미생물 중의 어느 하나 또는 그 혼합물)로 처리한다.
바이오매스로부터 대규모 에탄올 생산
일반적으로, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포를 이용하여, 대규모로, 바이오매스로부터 연료 등급의 에탄올을 생산하기 위한 2가지 기본적인 접근법이 있다. 그 첫번째 방법에서는, 먼저 고분자량 탄수화물을 포함하는 바이오매스를 저분자량 탄수화물로 가수분해한 다음, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포를 이용하여 저분자량 탄수화물을 발효시켜 에탄올을 생산한다. 두번째 방법에서는, 화학적 및/또는 효소적 처리 없이 바이오매스 물질 그 자체를 발효시킨다. 상기 첫번째 방법에서, 가수분해는 산, 예를 들면, 브렌스테드 산(Bronsted acid)(예, 황산 또는 염화수소산), 염기(예, 수산화나트륨), 열수 작용(hydrothermal process), 암모니아 섬유 폭쇄법(ammonia fiber explosion process: "EFEX"), 석회법(lime process), 효소, 또는 이들의 조합을 이용하여 수행할 수 있다. 수소, 및 기타 발효 생산물은 포획되어 필요에 따라 정제되거나, 또는, 예를 들면, 연소(burning)에 의해 처리될 수 있다. 예를 들면, 상기 수소 가스는, 예를 들면, 연소 등에 의해, 스팀 보일러를 가동시키기 위한 과정에서, 타오르거나 또는 에너지원으로서 사용될 수 있다. 바이오매스의 가수분해 및/또는 스팀 처리는, 예를 들면, 바이오매스의 다공성 및/또는 표면적을 증가시킬 수 있으며, 종종 셀룰로스계 물질이 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포에 더 많이 노출되게 함으로써, 발효율 및 수율을 증가시킬 수 있다. 리그닌을 제거함으로써, 예를 들면, 보일러를 가동시키기 위한 가연성 연료를 제공할 수 있으며, 또한, 바이오매스의 다공성 및/또는 표면적을 증가시켜, 종종 발효율 및 수율을 증가시킬 수 있다. 일반적으로 하기에 기재하는 실시형태 중의 어느 것에서는, 배지 중의 탄수화물의 초기 농도는 20mM보다 크고, 예를 들면, 30mM, 50mM, 75mM, 100mM, 150mM, 200mM보다 크거나, 또는 500mM 보다 더 크다.
산 가수분해 전처리를 이용한 바이오매스로부터의 에탄올 생산
도 4는 산성화 유닛(160)에서, 수 중에 현탁되어 있는 바이오매스(약, 약 10 ~ 60 중량%)를 우선 산으로 처리함으로써, 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는 공정(158)을 도시한다. 상기 바이오매스는, 예를 들면, 나무 조각, 톱밥, 분쇄된 농사 잔여물 또는 바이오매스 농작물(예, 옥수수 마초 또는 스위치그래스), 옥수수 분쇄 잔여물, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같은 종이 전단품, 또는 이들의 혼합물 및 기타 셀룰로스계 및/또는 리그노셀룰로스계 물질일 수 있다. 상기 바이오매스는 수 중에 현탁되어 있는 바이오매스를 통하여 기체 이산화황을 버블링(bubbling)시키거나, 또는 강산(예, 황산, 염화수소산, 또는 질산)을 첨가함으로써 산성화시킬 수 있다. 상기 산성화 동안, pH는 약 3 이하로 유지되며, 예를 들면, 약 2.5 이하 또는 약 1.5 이하로 유지된다. 상기 산성화 유닛내에는 이미 존재하는 산 외에도, 필요에 따라, 황산제1철, 황산제2철, 염화제2철, 황산알루미늄, 염화알루미늄, 황산마그네슘, 또는 이들의 혼합물을 상기 바이오매스의 가수분해 시에 도움이 되도록 첨가할 수 있다. 상기 바이오매스는 상기 산성화 유닛(160)에, 예를 들면, 약 1 ~ 6 시간 동안, 예를 들면, 약 40℃ ~ 80℃의 온도에서 보유된다.
상기 산성화 유닛(160)의 산성화 후에, 상기 바이오매스를 탈수 유닛(164)에서, 예를 들면, 압착하거나 또는 원심분리하여 탈수함으로써, 다량의 산성액(acidified water)를 제거한다. 필요에 따라, 상기 산성액은 산성화 유닛(160)에서 재사용될 수 있다.
상기 산-침윤 바이오매스를, 일부 예에서는, 상기 바이오매스를 실질적으로 치밀화시키지 않는 중력 공급기 또는 회전 밸브 공급기에 의해, 가수분해 유닛(166)에 공급한다. 스팀은 상기 가수분해 유닛(166)내로 주입되어 상기 바이오매스와 직접 접촉하여 원하는 온도까지 바이오매스를 가열시킨다. 상기 스팀의 온도는, 예를 들면, 약 130℃ ~ 220℃이며, 스팀 주입은, 예를 들면, 약 10분 ~ 120분 동안 지속된다. 그 다음, 가수분해물을, 예를 들면, 약 100℃ ~ 190℃의 온도로 가동되고 있는 플래쉬 탱크(170)로 배출시키고, 이 탱크(170)에서, 예를 들면, 약 1시간 ~ 6시간 동안 보유하여, 상기 바이오매스를, 예를 들면, 가용성 올리고당 및 단당류로 더 가수분해시킨다.
그 다음, 상기 가수분해물을 추출기(extractor)(172), 예를 들면, 역류 추출기, 스크류-컨베이어 추출기, 또는 진공 벨트 추출기에 공급한다. 추출기(172)에서, 상기 가수분해물을, 예를 들면, 온도가 약 40℃ ~ 90℃인 열수로 세정한다. 예를 들면, 상기 가수분해물은 그 자신의 중량보다 더 많은 양, 예를 들면, 그 자신의 중량보다 2배 큰 중량, 예를 들면, 3배, 4배, 8배 큰 중량, 또는 그 자신의 중량의 10배 더 큰 중량으로 세정한다.
pH 조정 및 여과 유닛(180) 중의 추출물에, 알칼리(예를 들면, 석회 또는 암모니아의 형태)를 첨가하여 추출물의 pH를 약 7 ~ 8로 조정한다. 상기 알칼리를 첨가하는 동안 어떠한 침전물은 제거되며, 여과물(filtrate)은 그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포가 분산되어 있는 배지를 보유하고 있는 발효기(182)로 보내진다. 상기 배지 중의 탄수화물의 초기 농도는 20mM ~ 약 80mM이다. 상기 배지에 현탁되어 있는 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 농도는, 예를 들면, 약 107 ~ 약 109 세포/mL이다. 일 실시형태에서, 상기 배지(여기서는 GS-2라고 함)는 효모 추출물 6.0; 우레아 2.1; K2HPO4 2.9; KH2PO4 1.5; MOPS 10.0; 트리소디움 시트레이트 디하이드레이트 3.0; 시스테인 하이드로클로라이드 2.0(각각 g/L로 표시됨)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 트립톤 2.0; 아데닌 0.02; 시토신 0.05; 구아노신 0.02; 티민 0.05; 우라실 0.04; 및 Wolin et al., Bacteriology, 87:993, 1964에 기재된 바와 같이 제조된, 다량의(예를 들면 10 g/mL) 비타민 용액을 포함한 성분들이 GS-2 배지에 첨가되거나, 또는 GS-2 배지의 성분을 대신한다. 상기 pH 및 여과 유닛(180)으로부터의 추출물은 배지의 탄수화물의 초기 pH가, 예를 들면, 약 pH 7.0 ~ pH 7.5로 되도록 조정된다.
필요에 따라, 발효 초기에는, 상기 가수분해물 외에, 저분자량 탄수화물(예, 락토스)을, 예를 들면, 약 1.0 g/L ~ 5 g/L의 초기 농도로 첨가할 수 있다. 이것은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포의 수를 빠르게 증가시킬 수 있으며 발효기 내에 효소를 형성할 수 있다. 발효는, 예를 들면, 약 8시간 ~ 72시간 동안 배지를 통해 질소 가스를 버블링시키면서, 예를 들면, 약 15℃ ~ 40℃의 온도를 유지하면서, 진행된다. 상기 발효 동안 생산된 수소 가스는 질소 가스에 의해 발효기(182)로부터 일소되어, 수집되거나 또는 타오르게 된다(flare).
상기 추출기(172)로부터 추출된 고체를 탈수시킨 다음, 제2 산성화 유닛(190)으로 보낸다. 상기 추출기로부터의 고체를 산의 수성 용액, 필요에 따라 금속염의 수성 용액에 담근다(soak). 상기 산성화 동안, pH는 약 3 미만으로, 예를 들면 2.5 미만 또는 약 1.5 미만으로 유지시킨다. 상기 바이오매스는 제2 산성화 유닛(190)에, 예를 들면, 약 40℃ ~ 약 80℃의 온도에서, 예를 들면, 약 1 ~ 6 시간 동안, 보유된다.
상기 산성화 유닛(190)에서의 산성화 후에, 탈수 유닛(200)에서, 예를 들면, 압착 또는 원심분리에 의해 상기 바이오매스를 탈수시켜 산성액을 제거한다. 필요에 따라, 상기 산성액을 산성화 유닛(160) 및/또는 산성화 유닛(190)에서 재사용할 수 있다.
상기 산-침윤 바이오매스를 제2 가수분해 유닛(202)으로 공급한다. 상기 제2 가수분해 유닛(202)에 스팀을 주입하여 바이오매스와 직접 접촉시켜 바이오매스를 원하는 온도까지 가열시킨다. 상기 스팀의 온도 및 처리 시간은 일반적으로 상기 제1 가수분해 유닛(166)에서 사용된 바와 동일하다. 그 다음, 가수분해물을, 예를 들면, 약 140℃ ~ 190℃의 온도로 작동되고 있는 플래쉬 탱크(204)로 배출시키고, 이 탱크(204)에서, 예를 들면, 약 0.5시간 ~ 12시간 동안 보유시켜, 상기 바이오매스를 더 가수분해시킨다.
pH 조정 및 여과 유닛(210)의 추출물에 알칼리를 첨가하여 추출물의 pH를 약 7 ~ 8로 조정한다. 상기 알칼리를 첨가하는 동안 어떠한 침전물은 제거되며, 여과물(filtrate)은 발효기(182)의 내용물과 결합한 다음, 발효기(212)로 보내진다. 발효는, 예를 들면, 약 15시간 ~ 100시간 동안 배지를 통과하여 질소 가스를 버블링시키면서, 예를 들면, 약 25℃ ~ 35℃로 온도를 유지하면서, 진행시킨다. 상기 발효 동안 생산된 수소 가스는 질소 가스에 의해 발효기(212)로부터 일소되어, 수집되거나 또는 타오르게 된다(flare).
발효 후, 발효기(212)의 전체 내용물을 증류 유닛(220)으로 이송시키고, 97퍼센트 에탄올/4퍼센트 물(체적 기준)을 증류시켜서 수집한다. 96퍼센트 에탄올을 등비등 증류시키거나, 또는 96퍼센트 에탄올을 분자 체(molecular sieve)를 통과시켜 물을 제거함으로써, 연료 등급의 에탄올(99-100퍼센트 에탄올)을 얻는다.
효소 가수분해 전처리를 이용하여 바이오매스로부터 에탄올 생산
도 5a는 가수분해 유닛(230)에서, 예를 들면, 수 중에 현탁되어 있는 바이오매스(10 ~ 60 중량%)를, 예를 들면, 헤미셀룰로스, 펙틴 및 전분 성분에 대해 활성이 있는 효소 또는 효소 혼합물(예, 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오하이드롤라제(CBH), 베타-글루코시다제, 글리코시드 하이드롤라제, 글리코실트랜스퍼라제, 리아제, 및 에스테라제)로 처리하여, 에탄올을 생산하는 공정(228)을 도시한다. 상기 가수분해 동안, pH는 수산화나트륨을 첨가하여, 약 6.0 ~ 7.0으로 유지시킨다. 상기 바이오매스는 상기 가수분해 유닛(230) 중에, 예를 들면, 약 25℃ ~ 40℃의 온도에서, 예를 들면, 약 6 ~ 120시간 동안, 질소 하에 보유된다.
가수분해 후, 알칼리(예, 석회 또는 암모니아 형태) 및/또는 산(예, 황산의 수성 용액 형태)을, 내용물의 pH를 약 7~8로 조정하기 위해 pH 조정 유닛(234)을 거쳐서 가수분해 유닛(230)의 내용물에 첨가한다. pH를 조정한 후, 가수분해 유닛(230)의 전체 내용물을, 그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포가 분산되어 있는 배지를 보유(hold)하고 있는 발효기(240)로 이송한다. 배지 중의 탄수화물의 초기 농도는 20mM ~ 약 100mM이다. 상기 배지 중에 현탁되어 있는 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포의 농도는, 예를 들면, 약 107 ~ 109 세포/mL 이다. 일 실시형태에서, 상기 배지는 효모 추출물 6.0; 우레아 2.1; K2HPO4 2.9; KH2PO4 1.5; MOPS 10.0; 트리소디움 시트레이트 디하이드레이트 3.0; 시스테인 하이드로클로라이드 2.0(각각 g/L로 표시됨)를 포함한다. 가수분해 유닛(230)으로부터의 유출물은 배지 중의 탄수화물의 초기 농도가, 예를 들면, 약 50 ~ 200mM로 되도록 조정한다. 필요에 따라, 발효 개시시에, 셀로비오스를, 예를 들면, 약 1.0 g/L ~ 5 g/L의 초기 농도로 첨가하거나, 또는 락토스를 첨가하여 발효 또는 가수분해를 촉진시킬 수 있다. 발효는, 예를 들면, 약 8시간 ~ 72시간 동안 배지를 통과하여 질소 가스를 버블링시키면서, 예를 들면, 약 15℃ ~ 40℃로 온도를 유지하면서, 진행시킨다. 상기 발효 동안 생산된 수소 가스는 질소 가스에 의해 발효기(240)로부터 일소되어, 수집되거나 또는 타오르게 된다.
발효 후, 발효기(240)의 전체 내용물을 증류 유닛(242)으로 이송시켜, 상기한 바와 같이 연료 등급의 에탄올을 얻을 수 있다.
산 또는 효소 전처리를 하지 않고 바이오매스로부터 에탄올 생산
도 5b는 먼저, 수중에 현탁된, 예를 들면, 10 ~ 60 중량%의 바이오매스를 보유 용기(holding vessel)(252)에 충전함으로써, 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는 공정(250)을 도시한다. 상기 바이오매스는, 예를 들면, 정상 대기압 하에 있을 경우에는 약 25℃ ~ 90℃의 온도에서, 또는 정상 대기압보다 높은 압력(예, 약 1.5 대기압 ~ 약 10 대기압) 하에 있을 경우에는 약 100℃ ~ 175℃의 온도에서, 예를 들면, 1 ~ 36시간 동안, 담글 수 있다. 알칼리(예, 석회 또는 암모니아 형태) 및/또는 산(예, 황산의 수성 용액 형태)을, 그 내용물의 pH를 약 7 ~ 8로 조정하기 위해 pH 조정 유닛(260)을 거쳐서 상기 담금(soaking) 시간 후의 보유 용기(252)의 내용물에 첨가한다. pH 조정 후, 보유 용기(252)의 전체 내용물을, 그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포가 분산되어 있는 배지를 보유하고 있는 발효기(262)로 이송한다. 배지 중의 탄수화물의 초기 농도는 20mM ~ 약 100mM이다. 발효는 상기한 바와 같은 조건 하에서 발효 용기(262)에서 일어난다. 또한, 연료 등급 에탄올은, 상기한 바와 같이, 증류 유닛(270)에서 증류된다.
도 5c는 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는 공정(300)을 도시한다. 바이오매스(리그닌이 제거되거나 되지 않은)와, 필요에 따라, 스팀을 발효기(302)에 충전시킨다. 리그닌이 제거된 경우, 바이오매스는 에너지 집약 공정(energy intensive process)에서 증류 유닛을 가동시키는 에너지 등으로서 사용될 수 있다. 스팀은 상기 바이오매스를 살균하고, 또한, 상기 바이오매스를 느슨하게 하여 보다 더 반응성으로 만드는데 유리할 수 있다. 상기 바이오매스를 발효기(302)에 충전하고, (필요에 따라) 바이오매스가 총 질량의 약 10~60중량%로 현탁되도록 물을 첨가한다. 상기 바이오매스는, 예를 들면, 정상 대기압 하에 있을 경우에는 약 25℃ ~ 90℃의 온도에서, 또는 정상 대기압보다 높은 압력(예, 약 1.5 대기압 ~ 약 10 대기압) 하에 있을 경우에는 약 100℃ ~ 175℃의 온도에서, 예를 들면, 1 ~ 36시간 동안, 담글 수 있다. 알칼리(예, 석회 또는 암모니아 형태) 및/또는 산(예, 황산의 수성 용액 형태)을, 그 내용물의 pH를 약 7 ~ 8로 조정하기 위해 pH 조정 유닛(260)을 거쳐서 상기 담금(soaking) 시간 후의 발효기(302)의 내용물에 첨가한다.
그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포가 분산되어 있는 배지를 보유하는 종균 발효기(304)를 사용하여, 상기 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포를 증식시킨다. 상기 배지 중에 현탁되어 있는 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포의 농도는, 예를 들면, 증식 개시시에 약 107세포/mL이며, 그 종균 혼합물이 탄수화물을 발효시킬 용도로 준비되는 경우에는 약 108 세포/mL이다. 상기 배지 중의 탄수화물의 초기 농도는 20mM ~ 약 100mM 이다. 일 실시형태에서, 상기 배지는 효모 추출물 6.0; 우레아 2.1; K2HPO4 2.9; KH2PO4 1.5; MOPS 10.0; 트리소디움 시트레이트 디하이드레이트 3.0; 및 시스테인 하이드로클로라이드(각각 g/L로 표시됨)를 포함한다. 상기 종균 발효기(304)의 전체 내용물을, 대략 실온으로 유지시킨 발효기(302)로 이송한 다음, 상기한 조건 하에서 발효시킨다. 또한, 상기한 바와 같이, 증류 유닛(270)에서 연료 등급 에탄올을 증류시킨다.
산 가수분해 전처리와 효소 가수분해 전처리의 조합을 이용한 바이오매스로 부터 에탄올 생산
바이오매스 유래의 에탄올은 산 가수분해 전처리와 효소 가수분해 전처리의 조합을 이용하여 생산할 수 있다. 예를 들면, 초기 가수분해는, 예를 들면, 산성화 유닛에서 바이오매스를 처리한 다음, 스팀을 주입함으로써 산을 사용하여 발생시킬 수 있으며(도 4에 나타낸 바와 같음), 그 다음에, 상기 초기 가수분해된 바이오매스에, 효소 가수분해를 이용하여 최종 가수분해를 적용할 수 있다(도 5a에 나타낸 바와 같음).
상기 에탄올 생산 방법들 및/또는 특징들의 어떠한 조합 및/또는 특징이 하이브리드 생산법을 구성하는 데 이용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 중의 어느 것에서, 리그닌은 발효 전에 제거될 수 있다. 더욱이, 본 명세서에 기재된 방법 중 어느 것에 의해, 에탄올 이외의 다른 생산물을 생산할 수 있다. 보다 일반적으로, 발효 생산물로는 알콜 및 수소 등의 연료, 및 유기산 등의 다른 생산물을 들 수 있다. ISDg T 균주 등의 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스는 단독으로 사용되거나, 또는 본 명세서에 기재된 다른 미생물(예, 효모 또는 다른 박테리아) 중의 하나 이상과 상승적으로 조합하여 사용할 수 있다.
상기 상세한 내용은 하기 실시예에서 더 기재되며, 이것이 청구항에 기재된 발명의 범위를 제한하지는 않는다.
하나의 실험에서는, N2 분위기 하에, 초기 pH가 7.5인 GS-2 셀루로스 배지를 포함하는 배양관에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 증식시켰다. 상기 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 초기 농도는 약 0.8 ~ 1.1×107 세포/mL였으며 배양 온도는 30℃였다.
도 6은 초기 셀룰로스 농도의 함수로서 셀룰로스 분해가 완성되었을 때의 에탄올(E), 아세테이트(A), 포르메이트(F), 및 락테이트의 농도를 나타낸다. 셀룰로스의 초기 농도가 37mM일 때, 락테이트(L), 아세테이트(A), 및 에탄올(E)의 농도는 각각 4mM, 20mM, 및 59mM이었다. 포르메이트(F)는 이러한 초기 농도에서 검출되지 않았다. 셀룰로스의 초기 농도가 74mM일 때, 락테이트(L), 포르메이트(F), 아세테이트(A), 및 에탄올(E)의 농도는 각각 7mM, 10mM, 20mM, 및 123mM였으며; 및 셀룰로스의 초기 농도가 148mM일 때, 락테이트(L), 포르메이트(F), 아세테이트(A), 및 에탄올(E)의 농도는 각각 10mM, 17mM, 20mM, 및 160mM이었다. 도 6은 고농도의 셀룰로스가 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 작용을 저해하지 않음을 나타내며, 이는 셀룰로스 초기 농도가 증가함에 따라 에탄올(E)의 농도가 증가하기 때문이다.
이러한 결과는, 더 높은 농도(예를 들면, 약 40mM 이상)의 셀룰로스를 발효시키지 않고 더 높은 셀룰로스 농도에서는 감소된 양의 에탄올을 생산하는 다른 셀룰로스 발효 미생물을 이용하여 얻은 결과와 대조를 이룬다(Desvaux et al., Appl . Environ, Microbiology, 66, 2461-2470, 2000 참조). 또한, 클로스트리듐 파이토 퍼멘탄스를 사용하는 경우 셀룰로스의 초기 농도를 증가시킴에 따라 아세테이트의 수준이 유의하게 증가하는 것은 아니며, 더 많은 셀룰로스에 의해 경제적으로 더 가치있는 에탄올을 생산할 수 있기 때문에 유용하다. 일반적으로, 다른 셀룰로스분해 박테리아는 아세테이트보다 에탄올을 더 적게 생산하며, 에탄올 대 아세테이트의 비(ethanol-to-acetate ratio)는 초기 셀룰로스 농도가 증가함에 따라 감소한다(예를 들면, 상기한 Dessvaux et al. 참고).
두번째 실험에서, 총 탄수화물 농도 50mM 또는 100mM(단당류 당량)에 대해, 25mM 또는 50mM의 셀룰로스(글루코스 당량), 또는 25mM 또는 50mM의 크실란(크실로스 당량), 또는 셀룰로스 플러스 크실란, 각각 25mM 또는 50mM을 함유하는 GS-2 배지를 포함하는 배양관에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 증식시켰다. 배지의 초기 pH는 7.5 였고, 초기 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 농도는 0.8 ~ 1.1×107 세포/mL였다. 배양물(culture)은 30℃, N2 분위기 하에서 배양되었다. 탄수화물 분해는 가시적으로 모니터링되었다.
두 탄수화물을 함유하는 배양물에서, 셀룰로스와 크실란은 동시에 분해되었다. 두 탄수화물을 함유하는 배양물 중의 셀룰로스 또는 크실란의 분해율은 단일 탄수화물을 함유하는 배양물에서의 분해속도와 동일하거나 더 컸다. 이러한 실험은 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 배양물에 의한 셀룰로스의 발효가 크실란, 5탄당 중합체, 및 헤미셀룰로스의 주요 성분에 의해 저해되지 않음을 입증한다. 게다가, 이 실험은, 셀룰로스 및 크실란이 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 배양물에 의 해 동시에 발효되고, 대부분의 바이오매스의 천연 공급원이 가장 풍부한 성분으로서의 셀룰로스와 셀룰로스에 대하여 단지 두번째로 풍부한 성분인 크실란 등의 헤미셀룰로스를 포함하는 탄수화물의 혼합물을 함유할 경우 유리할 수 있음을 보여준다. 이와 대조적으로, 다른 미생물은 5탄당, 또는 5탄당의 반복단위를 포함하는 중합체를 발효시킬 수 없다. 또한, 다른 미생물을 이용하면, 5탄당, 또는 그들의 중합체는 그 미생물의 대사 과정을 실질적으로 방해하여 발효율 및 에탄올 수율을 감소시킬 수 있다.
세번째 실험에서, 전분(Difco 가용성 전분) 10, 20, 또는 40 g/L을 함유하는 GS-2 배지에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 증식시켰다. 배지의 초기 pH는 7.5 였고 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 초기 농도는 0.8 ~ 1.1×107 세포/mL였다. 배양물(culture)은 30℃, N2 분위기 하에서 배양시켰다. 전분 발효는 가스 생산 및 배양물의 탁도 증가에 의해 표시되었다. 발효 완료 시, 발효 생산물의 농도를 결정하였다. 초기 전분 농도가 10 g/L일 때, 락테이트, 포르메이트, 아세테이트, 및 에탄올의 농도는 각각 1mM, 2mM, 4mM, 및 69mM 이었다. 초기 전분 농도가 20 g/L일 때, 락테이트, 포르메이트, 아세테이트, 및 에탄올의 농도는 각각 3mM, 4mM, 5mM, 및 127mM이었다. 초기 전분 농도가 40 g/L일 때, 락테이트, 아세테이트, 및 에탄올의 농도는 각각 11mM, 4mM, 및 132mM이었다. 이 나중 실험에서는 포르메이트가 검출되지 않았다. 이들 실험은, 전분의 초기 농도가 증가함에 따라 에탄올의 농도가 증가하기 때문에, 더 높은 농도의 전분이 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 작용을 저해하지 않음을 나타내며, 상기한 바와 같은 셀룰로스의 농도를 증가시키면서 세포를 배양한 것과 유사한 결과를 나타내었다.
네번째 실험에서, 옥수수 가루 27 g/L, 또는 습식 증류기 곡물 10.5 g/L, 또는 잘게자른 옥수수 마초 20 g/L, 또는 잘게자른 스위치그래스 20 g/L을 함유하는 GS-2 배지를 포함하는 배양관에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 증식시켰다. 배지의 초기 pH는 7.5 였고, 초기 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 농도는 0.8 ~ 1.1×107 세포/mL였다. 배양물(culture)은 30℃, N2 분위기 하에서 배양시켰다. 가스 생산에 의해 표시되는 바와 같이, 모든 기질은 발효되었으며, 모든 배양에서의 1차 발효 생산물은 에탄올이었다. 이 실험은, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스가, 셀룰로스계 공급원료의 화학적 전처리 및 셀룰라제 또는 다른 효소의 첨가 없이, 이들 셀룰로스 공급원료를 에탄올로 발효시킴을 나타낸다.
최종 실험에서, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 게놈 서열 분석에 의해, 이 미생물이 특별한 발효 특성을 보유하고, 식물 바이오매스의 다중 성분을 분해하여 이들 성분을 에탄올로 발효시키는데 매우 적합하다는 결론을 뒷받침하였다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 게놈은 미국 에너지성의 연합게놈연구소에 의해 서열분석되었다. 염기서열 초안 어셈블리(draft sequence assembly)가 2005년 11월 8일 처음으로 작성되었으며(available), 2006년 5월 20일 대중에게 발표되었다(http://genome.ornl.gov/micobial/cphy/). 이 초안 어셈블리는 169개의 접속 부위(contiguous region)로 구획되는 4.5MB의 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있었 으며, 이들로부터 3671개의 추정 단백질이 유도된다. 2006년 12월에, 상기 서열 중의 갭(gap)이 완료되었으며, 최종 서열은 2007년초로 기대된다.
클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 특별한 발효 특성 및 식물 바이오매스의 복수 성분 분해 능력의 지표로서, 본 발명자들은 탄수화물 흡수(uptake) 메카니즘의 증거가 되는 게놈 서열을 시험하였다. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스의 게놈은 100개가 넘는 ABC-type 수송 시스템을 포함하고 이들 중 52개는 탄수화물을 세포로 수송하는데 관여하는 것으로 여겨진다. 이들 수송 시스템 중의 일부는 글루코스, 푸코스, 또는 크실로스 등의 단당류에 특이적이지만, 나머지는 의심할 여지없이 이당류(예, 셀로비오스), 삼당류, 및 사당류의 이송에 관여한다. 이러한 탄수화물 수송 시스템의 특별히 넓은 다양성은, 미생물들 중에서 전례에 없는 것으로, 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스가 셀룰로스성 바이오매스를 분해하는 데 특히 적합함을 나타낸다.
기타 실시형태
본 발명을 그들의 상세한 설명과 함께 기재하였으나, 상기한 기재는 설명을 위한 것으로, 첨부된 청구항의 범위에 의해 규정된 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님은 당연할 것이다.
기타 관점, 이점, 및 변형은 하기 청구항의 범위내이다.

Claims (39)

  1. 고분자량 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 제공하는 단계;
    가수분해된 바이오매스 물질을 제공하기 위해 상기 바이오매스 물질을 가수분해하는 단계;
    배지 중에서 상기 가수분해된 바이오매스 물질과 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스(Clostridium phytofermentans) 세포를 결합시키는 단계로, 상기 배지 중의 탄수화물의 농도가 20mM 보다 큰 단계; 및
    상기 가수분해된 바이오매스 물질을 연료를 제조하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안 발효시키는 단계
    를 포함하는, 바이오매스 물질로부터 연료를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 연료는 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 및 그들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 알콜을 포함하는, 바이오매스 물질로부터 연료를 제조하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 바이오매스 물질을 산으로 처리하여 가수분해하는, 바이오매스 물질로부터 연료를 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 바이오매스 물질을 효소 또는 효소 혼합물로 처리하여 가수분해하는, 바이오매스 물질로부터 연료를 제조하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 바이오매스 물질을 산으로 처리한 다음, 효소로 처리하여 가수분해하는, 바이오매스 물질로부터 연료를 제조하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바이오매스 물질은 가수분해 전에 크기가 감소되는, 바이오매스 물질로부터 연료를 제조하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 가수분해 단계는 산성화 유닛(acidification unit)에서 산으로 전처리한 다음, 탈수하는 단계를 포함하는, 바이오매스 물질로부터 연료를 제조하는 방법.
  8. 고분자량 탄수화물을 포함하는 바이오매스 물질을 가수분해하도록 구성된 가수분해 유닛; 및
    그 내부에 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포가 분산되어 있는 배지를 보유하도록 구성된 발효기(fermentor)
    을 포함하는 연료 플랜트(fuel plant).
  9. 제8항에 있어서,
    상기 배지를 보유하도록 구성되고 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스를 포함하는 발효기는 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와는 다른 하나 이상의 다른 미생물을 더 포함하는, 연료 플랜트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다른 미생물이 하나 이상의 효모를 포함하는, 연료 플랜트.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 하나 이상의 다른 미생물이 하나 이상의 박테리아를 포함하는, 연료 플랜트.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 하나 이상의 박테리아가 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 중 어느 하나 이상의 균주를 포함하는, 연료 플랜트.
  13. 배지에서 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포와 리그노셀룰로스계 물질을 결합시키는 단계; 및
    연료를 제조하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안 상기 리그노셀룰로스계 물질을 발효시키는 단계
    를 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 리그노셀룰로스계 물질이 나무, 나무 펄프, 제지 슬러지, 종이 펄프 폐기물 흐름(paper pulp waste stream), 파티클 보드(particle board), 목초, 쌀겨, 사탕수수 찌꺼기(bagasse), 목화, 황마(jute), 대마(hemp), 아마(flax), 대나무, 사이잘삼, 마닐라삼, 짚, 옥수수 마초, 옥수수 속, 증류기 곡물(distillers grain), 잎, 밀 짚, 코코넛 털, 조류(algae), 스위치그래스(switch grass), 미스칸터스(Miscanthus), 콩과식물, 사탕수수(sorghum), 바이오매스 농작물(크람베(Crambe)), 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는, 연료를 제조하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 배지 중에는 성장인자, 미네랄, 계면활성제, 킬레이트제, 및 그들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 구성성분이 용해되어 있는, 연료를 제조하는 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    조건은 배지의 온도를 약 45℃ 미만으로 유지하는 것을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    조건은 배지의 pH를 약 9.5 미만으로 유지하는 것을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 연료는 에탄올이고, 조건은 에탄올의 농도를 약 1 M 미만으로 유지하는 것을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  19. 배지 중에서 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포와 탄수화물을 포함하는 물질을 결합시키는 단계로, 상기 배지 중의 탄수화물의 농도가 40mM 보다 큰 단계; 및
    연료를 제조하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안 상기 탄수화물을 포함하는 물질을 발효시키는 단계
    를 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 농도가 50mM 보다 큰, 연료를 제조하는 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 농도가 100mM 보다 큰, 연료를 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 농도가 2,000mM 보다 작은, 연료를 제조하는 방법.
  23. 제19항에 있어서,
    상기 물질이 분자량이 1,000 미만인 저분자량 탄수화물을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 저분자량 탄수화물이 아라비노스, 프락토스, 갈락토스, 글루코스, 락토스, 만노스, 리보스, 크실로스, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는, 연료를 제조하는 방법.
  25. 제19항에 있어서,
    상기 물질이 분자량이 1,000 보다 큰 고분자량 탄수화물을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 고분자량 탄수화물이 셀룰로스, 마이크로크리스탈린 셀룰로스, 폴리갈락투론산, 펙틴, 전분, 크실란, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는, 연료를 제조하는 방법.
  27. 제19항에 있어서,
    상기 물질이 약 5 마이크론 ~ 50 마이크론의 입자 크기를 갖도록 분쇄되는, 연료를 제조하는 방법.
  28. 제19항에 있어서,
    상기 물질이 둘 이상의 탄수화물의 혼합물(blend)을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  29. 제19항에 있어서,
    상기 물질이 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 셀룰로스계 또는 리그노셀룰로스계 물질이 다중코팅된 종이, 크라프트지(Kraft paper), 제지 슬러지, 나무, 나무 펄프, 증류기 곡물, 파티클 보드, 잎, 목초, 목초 베어낸 것, 쌀겨, 사탕수수 찌꺼기, 목화, 황마, 대마, 아마, 대나무, 사이잘삼, 마닐라삼, 짚, 옥수수 마초, 옥수수 속, 밀 짚, 코코넛 털, 조류(algae), 스위치그래스, 크람베, 바이오매스 농작물, 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는, 연료를 제조하는 방법.
  31. 제19항에 있어서,
    상기 물질이 고분자량 탄수화물을 절단하여 형성된 저분자량 탄수화물을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 절단은 효소를 이용하는 것을 포함하는, 연료를 제조하는 방법.
  33. 제32항에 있어서,
    상기 효소가 헤미셀룰로스, 펙틴 및 전분 성분에 대해 활성이 있는 엔도글루카나제, 엑소글루카나제, 셀로비오하이드롤라제(CBH), 베타-글루코시다제, 글리코시드 하이드롤라제, 글리코실트랜스퍼라제, 리아제, 및 에스테라제, 및 그들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는, 연료를 제조하는 방법.
  34. 제19항에 있어서,
    상기 물질이 실질적으로 리그닌을 포함하지 않는, 연료를 제조하는 방법.
  35. 배지 중에서 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스 세포 및 제2 미생물을, 탄수화물을 포함하는 물질과 결합시키는 단계; 및
    상기 탄수화물을 포함하는 물질을 발효시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    상기 발효가 연료를 제조하기에 충분한 조건 하 및 시간 동안 수행되는, 방법.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 제2 미생물이 효모를 포함하는, 방법.
  38. 제35항에 있어서,
    상기 제2 미생물이 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와는 다른 박테리아를 포함하는, 방법.
  39. 클로스트리듐 파이토퍼멘탄스와 제2 미생물을 포함하는 조성물.
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