KR101617222B1

KR101617222B1 - 리그노셀룰로스의 전처리 방법에 따른 최적 당화효소 혼합물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101617222B1
Application number: KR1020140084739A
Authority: KR
Inventors: 김경헌; 김인정; 정주연; 박형석; 이희진
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2016-05-03
Also published as: KR20160005870A

Abstract

본 발명은 리그노셀룰로스의 전처리 방법에 따른 최적 당화효소 혼합물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 산 또는 알칼리 전처리된 셀룰로스계 바이오매스에 대하여 당화에 사용하는 효소 칵테일의 적절한 조성과 혼합비율을 제어하여 당화율을 개선하는 효과가 있다.

Description

리그노셀룰로스의 전처리 방법에 따른 최적 당화효소 혼합물 및 이의 제조방법{Cellulase mixtures optimized for differentially pretreated lignocellulose and method for preparing the same}

본 발명은 리그노셀룰로스의 전처리 방법에 따른 최적 당화효소 혼합물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

석유 기반 연료 그리고 화학소재 생산은 석유 고갈로 인한 유가 급등 및 지구 온난화 같은 경제적 및 환경적 문제를 야기한다. 석유는 전 세계적으로 현대 사회의 주된 에너지원으로 이용되고 있으나 매장량이 한정되어 있으므로 대체 자원의 개발이 시급한 실정이다. 특히, 우리나라의 경우에는 에너지 소비 증가율이 매년 약 10% 정도로 높을 뿐만 아니라 석유의 수입의존도가 높기 때문에 이를 해결하지 않으면 에너지 수급 불균형이 초래될 것으로 예상된다. 따라서 정부는 기후변화에 대응하고 자원위기를 극복하기 위한 전략으로 신재생 에너지 수급 목표를 현재 2%(2011년 기준)에서 2020년 6.1%, 2030년 11%, 2050년 20%로 설정한 상황이다.

석유대체자원으로서의 바이오매스는 주로 농산물 및 임산물 등의 소재 및 에너지 생산이 가능한 식물유기체를 의미하며, 광합성을 통해 이산화탄소를 재활용(CO₂ recycling)한다는 점에서 온실효과의 가속화를 방지할 수 있는 장점이 있다. 그 중에서도 2세대인 셀룰로스계의 바이오매스는 임산물(초본계·목질계)과 농부산물의 자원으로서 목재칩, 간벌재, 볏짚, 옥수수대·줄기, 왕겨, 밀짚, 사탕수수 찌꺼기 등이 이에 해당된다. 셀룰로스계의 바이오매스는 지구상에서 가장 풍부한 탄수화물원이라는 점에서 막대한 자원량의 확보가 가능하고, 비식용자원이기 때문에 1세대 전분계의 바이오매스(곡물, 감자류)와 달리 식량자원과의 경쟁이 없다는 장점이 있다.

셀룰로스 기반 바이오매스로부터 소재 및 연료를 생산하는 공정은 바이오매스의 전처리, 효소 당화, 발효 공정으로 나눌 수 있다. 전처리 공정에서는 다양한 물리화학적 방법을 리그노셀룰로스에 적용하여, 리그노셀룰로스의 구조를 파괴한 다음, 효소의 접근성을 높여 효소 당화율을 개선하는 것이 목표이다. 대표적으로 산 혹은 알칼리를 이용한 전처리법이 있는데, 각각의 방법에 따라 리그노셀룰로스 내의 구성물질이 다른 변화를 보인다. 즉, 산을 이용하면 주로 헤미셀룰로스가 제거되는 반면 알칼리를 이용하면 리그닌이 녹아 나온다. 결론적으로 바이오매스 종류와 전처리 방법에 따라 리그노셀룰로스의 조성과 물리적 특성이 다르다. 이에 따라, 효율적인 당화 공정을 위해서는 효소의 종류나 조성도 이에 맞게 설계가 되어야 할 필요가 있다.

본 발명은 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 2-40^T 유래의 EG(Cel5H)와 EX(Xyn10C) 그리고 써모바이피다 푸스카(Thermobifida fusca) 유래의 CBH (E3)를 포함한 세 종류의 재조합 효소와 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase)를 모델로 선정하여 묽은 산 또는 알칼리 전처리 볏짚에 테스트하여 각각의 전처리법에 적합한 효소 칵테일을 제조하고, 효소 칵테일 제조에 도움이 되는 통계적 방법을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

국내 공개특허 제2010-0047624호 국내 공개특허 제2008-0112329호 미국 공개특허 제2010-0151546호

본 발명의 목적은 셀룰로스계 바이오매스의 전처리법에 따라 리그노셀룰로스의 당화율을 개선할 수 있는 최적의 효소 칵테일과 이를 이용한 리그노셀룰로스의 당화율 개선 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로, 3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도글루카네이즈(Endoglucanase), 8 내지 22 mg/g의 총 고형분 함량의 써모바이피다 푸스카(Thermobifida fusca) 유래의 셀로바이오하이드롤레이즈(cellobiohydrolase), 및 3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도자일라네이즈(endoxylanase)가 혼합된 효소 칵테일을 포함하는 리그노셀룰로스 당화용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 산 또는 알칼리로 전처리된 셀룰로스계 바이오매스에 대하여 효소 칵테일로 당화시키는 단계를 포함하고, 상기 효소 칵테일은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로, 3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도글루카네이즈(Endoglucanase), 8 내지 22 mg/g의 총 고형분 함량의 써모바이피다 푸스카(Thermobifida fusca) 유래의 셀로바이오하이드롤레이즈(cellobiohydrolase), 및 3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도자일라네이즈(endoxylanase)가 혼합된 것인, 리그노셀룰로스의 당화율을 개선하는 방법을 제공한다.

본 발명은 산 또는 염기로 전처리한 셀룰로스계 바이오매스에 대하여 최적 조성과 비율의 효소 칵테일을 사용하여 리그노셀룰로스의 당화율을 개선하는 효과가 있다.

본 발명은 전처리물 종류에 따라 효소 혼합물의 조성을 최적화하는 것이 중요하다는 점을 시사하고, 최적화 과정에서 사용된 유용한 통계적 방법을 제시하였다. 이 통계적 방법은 셀룰로스계 바이오매스의 당화를 위한 효소 칵테일뿐만 아니라, 배지 조성이나 음료 배합 같은 다양한 혼합물 배합에도 응용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 효소 칵테일에 사용한 효소, Cel5H, E3 그리고 Xyn10C 활성에 대한 온도효과를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 효소 칵테일에 사용한 효소, Cel5H, E3 그리고 Xyn10C 활성에 대한 pH 효과를 도시한 것이다.
도 3은 산 또는 알칼리 전처리된 볏짚에 대해 본 발명의 효소 칵테일에 사용한 재조합 효소, Cel5H, E3 그리고 Xyn10C의 혼합 비율의 최적화를 위한 등고선도를 나타낸 것으로, A는 산 전처리물에 대한 등고선도, B는 알칼리 전처리물에 대한 등고선도이다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로, 3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도글루카네이즈(Endoglucanase), 8 내지 22 mg/g의 총 고형분 함량의 써모바이피다 푸스카(Thermobifida fusca) 유래의 셀로바이오하이드롤레이즈(cellobiohydrolase), 및 3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도자일라네이즈(endoxylanase)가 혼합된 효소 칵테일을 포함하는 리그노셀룰로스 당화용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 산 또는 알칼리로 전처리된 셀룰로스계 바이오매스에 대하여 상기 효소 칵테일로 당화시키는 단계를 포함하는 리그노셀룰로스의 당화율을 개선하는 방법을 제공한다.

본 발명은 산 또는 알칼리 전처리된 셀룰로스계 바이오매스를 효소적 가수분해 즉, 당화시킬 때 당화율을 개선할 수 있는 효소 칵테일의 최적 조성과 비율을 제공하는 특징으로 한다. 이는 산 또는 알칼리 전처리된 셀룰로스계 바이오매스가 성분분석 결과, 산 전처리물은 글루칸과 리그닌이 주를 이루고 있고, 자일란, 갈락탄, 아라비난, 만난 등의 헤미셀룰로스는 검출되지 않는 반면, 알칼리 전처리물은 자일란, 아라비난 등의 헤미셀룰로스가 함께 검출되어 효소 칵테일의 조성과 비율은 당화율에 영향을 미칠 수 있을 것으로 생각되어 산 전처리물과 알칼리 전처리물에 대한 효소 칵테일의 혼합 비율을 달리한 결과 당화율을 효과적으로 개선할 수 있었다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 산 전처리물은 셀로바이오하이드롤레이즈 비중이 높아질 경우 당화 효율이 높았고, 알칼리 전처리물은 4종의 효소들이 유사한 함량으로 혼합될 때 우수한 당화효율을 나타낸다.

따라서, 상기 효소 칵테일은 셀룰로스계 바이오매스의 당화율 개선을 위해 베타-글루코시데이즈 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로, 3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도글루카네이즈, 8 내지 22 mg/g의 총 고형분 함량의 셀로바이오하이드롤레이즈, 및 3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도자일라네이즈가 혼합된 것일 수 있다.

더 구체적으로, 산 전처리물에 대해서는 베타-글루코시데이즈 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로, 4 내지 6 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도글루카네이즈, 18 내지 21 mg/g의 총 고형분 함량의 셀로바이오하이드롤레이즈, 및 4 내지 6 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도자일라네이즈가 혼합된 효소 칵테일을 사용하는 것이 좋다. 보다 구체적으로는 베타-글루코시데이즈 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로, 약 5 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도글루카네이즈, 약 20 mg/g의 총 고형분 함량의 셀로바이오하이드롤레이즈, 및 약 5 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도자일라네이즈가 혼합된 효소 칵테일을 사용하는 것이 좋다.

알칼리 전처리물에 대해서는 베타-글루코시데이즈 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로, 각각 8 내지 11 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도글루카네이즈, 및 셀로바이오하이드롤레이즈, 및 엔도자일라네이즈가 혼합된 효소 칵테일을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 베타-글루코시데이즈 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로, 각각 약 10 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도글루카네이즈, 셀로바이오하이드롤레이즈, 및 엔도자일라네이즈가 혼합된 효소 칵테일을 사용하는 것이 좋다.

상기 효소 칵테일에 사용되는 효소들은 베타-글루코시데이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 엔도글루카네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 셀로바이오하이드롤레이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 엔도자일라네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에서 분리 정제한 것을 사용할 수 있다.

또는, 상기 효소 칵테일은 베타-글루코시데이즈 코딩 유전자, 엔도글루카네이즈 코딩 유전자, 셀로바이오하이드롤레이즈 및 엔도자일라네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에서 분리 정제한 효소를 사용할 수 있다.

상기 베타-글루코시데이즈 코딩 유전자는 공지의 서열을 사용할 수 있다.

상기 엔도글루카네이즈 코딩 유전자는 SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열로 표시될 수 있다.

상기 셀로바이오하이드롤레이즈 코딩 유전자는 SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열로 표시될 수 있다.

상기 엔도자일라네이즈 코딩 유전자는 SEQ ID NO: 3에 기재된 염기서열로 표시될 수 있다.

상술한 유전자들은 효소의 물리 화학적 활성을 갖고 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예컨대, SEQ ID NOS: 1 내지 3에 기재된 어느 하나의 뉴클레오티드를 포함하고, 효소의 물리 화학적 특성을 갖는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드도 포함한다. '엄격한 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드' 라 함은, 예컨대 설명서에 기술된 조건하(0.5×SSC를 포함하는 일차 세척 완충액으로 42℃에서 세척)에서 ECL 직접 핵산 표지화 및 검출 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 이용하여, 효소 단백질로부터 임의적으로 선택된 적어도 20, 바람직하게는 적어도 30의 연속적 잔기(예를 들어, 40, 60 또는 100 연속 잔기)의 서열을 포함하는 하나 이상의 프로브 DNAs에 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. '분리된 뉴클레오티드'라 함은 천연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드에 비해 상이한 형태로 존재하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들어, 다른 생물체의 게놈에 통합된 벡터 및 폴리뉴클레오티드는 상기 분리된 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 또한, 상기 분리된 폴리뉴클레오티드는 cDNA, PCR 산물, 또는 제한 단편으로서 얻어진 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 부분으로서 사용되는 폴리뉴클레오티드는 '분리된 폴리뉴클레오티드'에 또한 포함된다.

상술한 본 발명의 효소들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 하기 방법에 의해 분리할 수 있다: SEQ ID NOS: 1 내지 3의 뉴클레오티드 서열에 기초한 각각의 PCR 프라이머를 설계하고, 주형(template)으로서 효소-생산 균주 유래의 염색체 DNA나 cDNA 라이브러리를 이용한 PCR을 수행하여 본 발명의 DNA를 얻는다.

또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 프로브로서 얻어진 DNA 단편을 이용하여, 콜로니 혼성화, 플라크 혼성화 등으로, (a) 효소-생산 균주에서 유래된 염색체 DNA의 제한효소 단편을 파지나 플라스미드에 도입하고 상기 파지나 벡터로 대장균 세포를 형질전환하여 얻어진 라이브러리, 또는 (b) cDNA라이브러리에 대한 스크리닝을 수행함으로써 제조할 수 있다.

택일적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR로 얻어진 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열을 분석; 알려진 DNA 서열의 외부에 가닥(strand)을 신장하기 위해 분석된 서열에 기초한 PCR 프라이머의 설계; 및 적절한 제한효소로 효소-생산 균주의 염색체 DNA의 소화 및 주형으로서 상기 DNA를 이용하는 자가환화 반응(self-cyclizing reaction)에 의한 역-PCR을 수행함으로써 얻어질 수 있다(Genetics, 120, 621-623 (1988)). 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RACE 방법으로 얻어질 수 있다(Rapid Amplification of cDNA End, 'PCR Jikken Manual (Manual for PCR experiments)', 25-33, HBJ Publishing Bureau).

상기 방법으로 클로닝된 게놈 DNA 및 cDNA에 더하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 합성된 DNAs를 포함한다.

본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 또는 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 일반적인 대장균 균주 발현용 벡터에 상술한 효소 코딩 핵산을 각각 또는 함께 삽입함으로써 제조될 수 있다. 상기 대장균 균주 발현용 벡터는 일반적으로 사용할 수 있는 모든 대장균주 발현용 벡터가 제한 없이 사용될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 형질전환을 통해 숙주세포에 도입되어 본 발명의 효소들을 생산할 수 있도록 한다.

상기 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

또한, 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.

숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵생물이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등의 진핵생물이 사용될 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다. 상기 형질전환체는 상기 유전자들을 포함하는 재조합 벡터를 임의의 숙주세포에 도입시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다.

구체적으로, 베타-글루코시데이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 엔도글루카네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 셀로바이오하이드롤레이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 엔도자일라네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환될 수 있다.

또는, 베타-글루코시데이즈 코딩 유전자, 엔도글루카네이즈 코딩 유전자, 셀로바이오하이드롤레이즈 및 엔도자일라네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환될 수 있다.

본 발명의 리그노셀룰로스의 당화율을 개선하기 위해서는 셀룰로스계 바이오매스를 산 또는 알칼리로 전처리하는 것이 좋다.

상기 전처리에 사용되는 산의 종류로, 황산, 말산, 염산, 질산, 인산, 탄산, 포름산, 아세트산, 플루오르화 수소산, 옥살산, 또는 시트르산 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 알칼리의 종류로 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화바륨, 수산화암모늄, 탄산칼슘, 탄산칼륨, 또는 암모니아 등을 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

전처리를 위한 셀룰로스계 바이오매스로, 볏짚, 거대억새, 사탕수수부산물, 옥수수부산물, 스위치그라스, 포플라, 오일팜부산물, 참나무, 에너지작물 등의 초본계, 목질계 바이오매스를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 셀룰로스계 바이오매스로 볏짚을 사용할 수 있고, 볏짚은 건조된 것으로, 회전식 밀을 이용하여 수 mm 이하의 크기로 분쇄한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

상기 전처리 반응은 100 내지 200℃의 온도에서 60초 내지 2시간 동안 수행할 수 있으나, 셀룰로스계 바이오매스의 종류에 따라 적절히 채택하여 사용하면 되므로 특별히 제한하지는 않는다.

전처리된 슬러리에 대한 통상의 중화과정을 거친 후 본 발명의 효소 칵테일을 사용하여 당화시킨다.

당화는 산 또는 알칼리 전처리된 셀룰로스계 바이오매스와 효소 칵테일을 35 내지 45 ℃에서 pH 5.5 내지 7.5의 조건에서 수행할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 유전자 클로닝

본 발명에 사용한 세 가지의 재조합 효소 Cel5H (S. degradans 2-40^T유래; Accession no. Q21FN5), E3 (T. fusca 유래; Q60029), Xyn10C (S. degradans 2-40^T유래; Q21HD6)의 유전자 클로닝 전략은 다음과 같다.

1) 각 유래 균의 게놈 DNA를 추출한 다음 중합연쇄반응을 통해 목적하는 유전자를 증폭하였다.

2) 증폭된 타겟 유전자를 Ligation independent cloning 방법을 통하여 발현 벡터인 pET21a에 접합하여 클로닝을 완성하였다.

상기 타겟 유전자의 서열은 SEQ ID NOS: 1 내지 3에 나타내었다.

아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 베타-글루코시데이즈는 상용 효소(Novozyme 188)를 사용하였다.

<실시예 2> 재조합 Cel5H, E3, Xyn10C의 대장균 발현 및 정제

재조합 효소 단백질의 발현 숙주로는 E. coli BL21(DE3)가 이용되었다. 재조합 유전자를 대장균 세포에 형질전환시킨 후, 대장균 세포를 액체 배지(LB broth) 20mL에서 16시간 가량 종균 배양(seed culture) 하였다. 이를 1L의 LB에 재접종하여 37℃에서 3-4시간 정도 더 배양하여 OD₆₀₀의 수치가 0.6-0.9 정도 되었을 때, 온도를 16℃로 낮추고 최종 농도가 1mM이 되도록 isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside(IPTG)를 첨가하여 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 16시간 정도 대장균을 더 배양한 다음 원심분리를 통하여 세포를 회수하였다. 단, E3의 경우에는 37℃에서 발현을 유도하여 IPTG 첨가 후 4시간 정도 배양하였다. 전 과정에서 100㎍/mL의 앰피실린을 선별마커로 사용하였다.

회수한 세포는 초음파 분쇄기를 통하여 파쇄 시킨 후, 세포 내의 조 단백질을 추출하여 정제를 시행하였다. 정제 과정은 His-trap column을 이용한 친화 크로마토그래피법으로 수행하였고, 100-300mM의 이미다졸에서 대부분의 목적 단백질이 회수되었다.

<실시예 3> 산 전처리물(ACID)와 알칼리 전처리물(ALKALI)의 생산 및 성분분석

ACID의 경우, 볏짚에 1%의 묽은 황산용액을 190℃에서 90초 동안 (ramping 시간 3분) 마이크로웨이브 다이제스트 시스템(microwave digestion system)에서 처리하여 준비하였다. ALKALI의 경우, 볏짚에 14%의 액체 암모니아를 69℃에서 10시간 동안 침지하여 준비하였다. 전처리가 끝난 볏짚들은 물로 깨끗이 세척하면서 pH를 6-7 정도로 중화시켰다. 그 다음 45℃의 진공 건조 오븐(vacuum drying oven)에서 말려주었다.

ACID와 ALKALI의 생성 후 성분 분석(탄수화물 및 산 불용성 리그닌)은 National Renewable Laboratory의 LAP-002와 LAP-003 프로토콜을 참고하여 시행하였다. 각 전처리물의 성분분석을 표 1에 나타내었다.

성분		조성 (%, w/w)
성분	미처리	산 처리^b	알칼리 처리^c
글루칸	36.4 ± 2.3	56.9 ± 2.2	47.6 ± 1.4
자일란	11.3 ± 0.4	N.D^c ^.	13.1 ± 0.5
갈락탄	3.3 ± 0.3	N.D^c ^.	N.D^c ^.
아라비난	3.4 ± 0.2	N.D^c ^.	3.0 ± 1.2
만난	N.D^c ^.	N.D^c ^.	N.D^c ^.
리그닌	18.1 ± 1.3	24.8 ± 2.0	15.1 ± 0.4
b: 190℃에서 90초 동안 1%(w/v) 황산 전처리하고 물로 세척한 처리 결과 c: 69℃에서 10시간 동안 14%(w/w) 액체 암모니아에서 볏짚을 소킹한 후 물로 세척한 처리 결과

<실시예 4> 온도와 pH의 효소당화율 영향

1) 온도 최적화: 1%의 기질 carboxymethyl cellulose(CMC) (Cel5H와 E3의 경우)과 birchwood xylan(Xyn10C의 경우)을 다양한 온도 (20, 30, 40, 50, 60℃)에서 Cel5H(5.7 ㎍), E3(6.6 ㎍), Xyn10C(5.9 ㎍)를 처리하여 효소당화반응을 시행하였다. 반응 완충용액은 50mM 소듐 시트레이트(pH 6.0)를 사용하였다. 세 효소가 전반적으로 40℃에서 높은 당화율을 보였다(도 1).

2) pH 최적화: 1%의 기질 carboxymethyl cellulose(CMC)(Cel5H와 E3의 경우)과 birchwood xylan(Xyn10C의 경우)을 다양한 pH 조건(3.0, 4.0, 5.0, 6.0)에서 Cel5H(5.7 ㎍), E3(6.6 ㎍), Xyn10C(5.9 ㎍)를 처리하여 효소당화반응을 시행하였다. 효소 반응 온도는 50℃ 였다. 세 효소가 전반적으로 pH 6.0에서 높은 당화율을 보였다(도 2).

<실시예 5> 효소 칵테일 실험설계

전처리물에 대한 반응 조건은 위의 온도 및 pH 실험결과를 토대로 시행하였다. 기본적인 효소 반응 조건은 1%의 ACID와 ALKALI에 Cel5H, E3, Xyn10C를 포함하는 다양한 배합의 효소 혼합물을 40℃ 그리고 pH 6.0 (50 mM 소듐 시트레이트)에서 48 시간 동안 반응시켰다. 그리고 총 반응 부피는 100 ㎕로 하였다. 효소 반응의 종결을 위하여 열처리(95℃에서 5분)하였고, 당화율을 확인하기 위하여 DNS법을 이용한 환원당 정량을 수행하였다.

칵테일 실험설계의 첫 단계로 심플렉스 중심점 모델을 이용하여 10개의 실험군을 설정하였다. 독립변수는 각 효소의 농도(Cel5H-X₁, E3-X₂, Xyn10C-X₃)이고 종속변수는 환원당의 양(Y)이다. 총 단백질 투입량은 30 mg/g의 총 고형분이고, BG는 모든 실험군에 3 mg/g의 총 고형분으로 고정하였다. 표 2에 실험 설계 조건과 각각에 해당하는 실험적인 결과값을 제시하였다.

심플렉스 중심 설계법 (Simplex centroid design)을 이용한 Cel5H, E3, Xyn10C의 칵테일 실험설계

No. of experimental composite	β-글루코시데이즈 (mg/g의 총 고형분)	X 변수 (mg/ g의 총 고형분)			Y 변수(㎍)
No. of experimental composite	β-글루코시데이즈 (mg/g의 총 고형분)	Cel5H (X₁)	E3 (X₂)	Xyn10C (X₃)	산 처리물의 환원당 수율(Y₁)	알칼리 처리물의 환원당 수율(Y₂)
1	3	30	0	0	9.84 (±0.66)	7.86 (±0.37)
2		0	30	0	11.79 (±0.36)	18.54 (±0.98)
3		0	0	30	6.71 (±0.16)	6.88 (±0.27)
4		15	15	0	12.86 (±1.26)	11.62 (±1.99)
5		15	0	15	9.66 (±2.64)	14.95 (±0.28)
6		0	15	15	9.79 (±1.19)	6.64 (±0.39)
7		20	5	5	10.51 (±0.47)	11.41 (±0.24)
8		5	20	5	15.58 (±0.89)	19.01 (±0.98)
9		5	5	20	10.41 (±1.13)	18.93 (±1.26)
10		10	10	10	11.32 (±0.73)	21.08 (±1.70)

<실시예 6> 회귀분석

표 2의 실험결과값을 잘 반영할 수 있는, 즉 실험데이터에 가장 적합한 수학식을 선정하기 위해 회귀분석을 시행하였고, ACID와 ALKALI 모두 풀 큐빅 모델(full cubic model)로 R² 가 가장 높았으므로 가장 적합함을 알 수 있었다(표 3). 표 4의 풀 큐빅 모델의 회귀분석을 통해 도출해낸 수학식은 다음과 같다.

1) 산 처리물의 환원당 수율(㎍) = 9.96×Cel5H+11.91×E3 + 6.83×Xyn10C + 8.65×Cel5H×E3 + 6.01×Cel5H×Xyn10C + 2.63×E3×Xyn10C + 24.26×Cel5H×E3×Xyn10C - 40.72×Cel5H×E3×(-)

2) 알칼리 처리물의 환원당 수율(㎍) = 7.89×Cel5H + 18.57×E3 + 6.91×Xyn10C - 6.19×Cel5H×E3 + 30.45×Cel5H×Xyn10C - 24.15×E3×Xyn10C + 276.37×Cel5H×E3×Xyn10C - 24.68×Cel5H×E3×(-) - 73.22×Cel5H×Xyn10C×(-)

산 및 알칼리 전처리물에 대하여 네 가지 회귀식을 이용한 회귀분석

대응 함수	모델	R ²
산 전처리물의 환원당 수율 (Y₁)	선형	0.5753
	2차	0.7457
	스페셜 큐빅	0.7540
	풀 큐빅	0.9318
알칼리 전처리물의 환원당 수율 (Y₂)	선형	0.1384
	2차	0.5484
	스페셜 큐빅	0.8401
	풀 큐빅	0.9991

산 및 알칼리 전처리물의 효소당화를 위하여 풀 큐빅 모델을 이용한 회귀분석 결과

	팩터	계수	p-값	R ²
산 처리물	Cel5H	9.96	*	0.9318
	E3	11.91	*
	Xyn10C	6.83	*
	Cel5H*E3	8.65	0.000
	Cel5H*Xyn10C	6.01	0.000
	E3*Xyn10C	2.63	0.027
	Cel5HE3Xyn10C	24.26	0.002
	Cel5HE3()	-40.72	0.000
	Cel5HXyn10C(-)	2.66	0.493
알칼리 처리물	Cel5H	7.89	*	0.9991
	E3	18.57	*
	Xyn10C	6.91	*
	Cel5H*E3	-6.19	0.000
	Cel5H*Xyn10C	30.45	0.000
	E3*Xyn10C	-24.15	0.000
	Cel5HE3Xyn10C	276.37	0.000
	Cel5HE3(-)	-24.68	0.000
	Cel5HXyn10C(-)	-73.22	0.000

<실시예 7> 효소 칵테일의 최적 비율 예측

실시예 6의 수학식들을 바탕으로 각각의 전처리물의 당화를 최대치로 할 수 있는 효소 칵테일의 최적 비율을 예측하였다. 도출된 등고선도는 도 3에 제시하였다.

표 2와 도 3에서와 같이, 산 전처리물의 당화의 경우, Xyn10C의 비율이 낮을수록 그에 따라 Cel5H와 E3의 비중이 높아질수록 효율이 높아짐을 보였다. 이때, E3가 비중이 높아짐에 따라 당화효율이 높은 경향을 보였다. 반면, 알칼리 전처리물의 경우, 3가지의 효소가 골고루 분포되어 있을 때 가장 높은 당화효율을 보였다.

<110> KOREA UNIVERSITY RESEARCH AND BUSINESS FOUNDATION <120> Cellulase mixtures optimized for differentially pretreated lignocellulose and method for preparing the same <130> P14U13C0458 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1893 <212> DNA <213> Saccharophagus degradans 2-40T <400> 1 atgaaatcag caaccacaaa tcaatcgagg gcacgcagta gcgcctttaa aaatatgttg 60 gcggcatcgc tcgcaggttt agggctacta tcagcttctg catttgccga tgtagccccg 120 ctaaccgtag acggcaataa aattcttagc ggtggccagc aagccagttt tgccggtaat 180 agcttatttt ggtctaacaa tggctggggc ggtgagaagt attacacggc cggtaccgtt 240 gaatggctaa agcaagactg gggcagtaat ttagttcgcg ccgcaatggg tgtcgatgaa 300 aacggcggct acttagaaga cccagcagga aacaaagcga aagtaacaac cgttgtagat 360 gcagccatcg ctaacgatat gtatgtaatt atcgattggc acagccacca cgccgaagac 420 taccaaaacc aagccattag ctttttccaa gatatggctc gcacctacgg taacaacaac 480 aacgttatat acgaaattta taacgagcca ttacaggttt cttggagcgg caccatcaag 540 ccttacgcag aagcggtaat tggcgcaatt cgcgcaatcg acccagataa ccttattatt 600 gtgggcacgc ctacttggtc gcaggatgta gacgtagcct cgcgcgaccc catcacgcag 660 tacagcaaca ttgcctacac tattcacttt tatgcgggca cccacaaaca atccctacgc 720 gataaagcac aaaccgcatt aaataatggt attgctttgt ttgctaccga atggggtaca 780 gtaaatgcca acggtgacgg cggtgtagac gcagccgaaa ctgatcgttg gatgcagttt 840 tttaaagcga atcatataag ccatgccaac tgggccttaa acgataaagc cgaaggctct 900 tctgcattaa agcctggctc taacgcaaac ggcggctgga gcaattccga cttaaccgcc 960 tctggtacct atgttaaaaa cttaattaaa acatggaacg acggctcacc gagcagcagc 1020 tcatctagca gcaccagttc ttcttcaagc agctcctcgt ctagtagctc atcatctagc 1080 agctcttcat ctagtagttc tggcggtacc aatttacccg cgcgcattga agcagaaaac 1140 tacgatagcg caccggtaga aaccactgca ggtaatagcg gctcacccac caattgttcg 1200 tataaaggta tgggcgtaga tgtagaaaac tctactgaag gtgcttgtaa tattggctgg 1260 actgcggcag gcgaaaaagt aacttacaac attggcaatg ccgatggcac ttacgatatt 1320 gcattgcgcg tagcctctat ggatgcgggc aaacgtatct ctgtgcatgt aaacaacagc 1380 ctagcagata ccgtaaccac acaaggtggc ggctggcagg catggactac cgaaaccatt 1440 tctaacgtgt atatcccatc aaactcggta attaccgttg agttttacga tagtggctct 1500 aacctaaact ttttaaacat taccgaaagc tcgggtaccg aaccacctgt agaaccaccc 1560 gttgagccgc cagtagaacc acccgtagac aacggtaact tcccatgtaa cgacggtaac 1620 tctacgcttg ccaacaacgg cgcctccatt aaccttaacc aaggagcgtg tgttaaatac 1680 aatcacggct ggggcgatat tcgtttaggc acctggagcg gcaacggtac cattcgatac 1740 gacgtactag actgcaataa caacgtaatg agtgatattg cacaaaaact taatgacttt 1800 actgctgtag acaccgcaac aatgaactgc gcacactaca tttatgtaaa acaagcccct 1860 agcagctaca ccctgcaatt tggtagctgg tag 1893 <210> 2 <211> 1791 <212> DNA <213> Thermobifida fusca <400> 2 atgagtaaag ttcgtgccac gaacagacgt tcgtggatgc ggcgcggcct ggcagccgcc 60 tctggactgg cgcttggcgc ctccatggtg gcgttcgctg ctccggccaa cgccgccggc 120 tgctcggtgg actacacggt caactcctgg ggtaccgggt tcaccgccaa cgtcaccatc 180 accaacctcg gcagtgcgat caacggctgg accctggagt gggacttccc cggcaaccag 240 caggtgacca acctgtggaa cgggacctac acccagtccg ggcagcacgt gtcggtcagc 300 aacgccccgt acaacgcctc catcccggcc aacggaacgg ttgagttcgg gttcaacggc 360 tcctactcgg gcagcaacga catcccctcc tccttcaagc tgaacggggt tacctgcgac 420 ggctcggacg accccgaccc cgagcccagc ccctccccca gcccttcccc cagccccaca 480 gacccggatg agccgggcgg cccgaccaac ccgcccacca accccggcga gaaggtcgac 540 aacccgttcg agggcgccaa gctgtacgtg aacccggtct ggtcggccaa ggccgccgct 600 gagccgggcg gttccgcggt cgccaacgag tccaccgctg tctggctgga ccgtatcggc 660 gccatcgagg gcaacgacag cccgaccacc ggctccatgg gtctgcgcga ccacctggag 720 gaggccgtcc gccagtccgg tggcgacccg ctgaccatcc aggtcgtcat ctacaacctg 780 cccggccgcg actgcgccgc gctggcctcc aacggtgagc tgggtcccga tgaactcgac 840 cgctacaaga gcgagtacat cgacccgatc gccgacatca tgtgggactt cgcagactac 900 gagaacctgc ggatcgtcgc catcatcgag atcgactccc tgcccaacct cgtcaccaac 960 gtgggcggga acggcggcac cgagctctgc gcctacatga agcagaacgg cggctacgtc 1020 aacggtgtcg gctacgccct ccgcaagctg ggcgagatcc cgaacgtcta caactacatc 1080 gacgccgccc accacggctg gatcggctgg gactccaact tcggcccctc ggtggacatc 1140 ttctacgagg ccgccaacgc ctccggctcc accgtggact acgtgcacgg cttcatctcc 1200 aacacggcca actactcggc cactgtggag ccgtacctgg acgtcaacgg caccgttaac 1260 ggccagctca tccgccagtc caagtgggtt gactggaacc agtacgtcga cgagctctcc 1320 ttcgtccagg acctgcgtca ggccctgatc gccaagggct tccggtccga catcggtatg 1380 ctcatcgaca cctcccgcaa cggctggggt ggcccgaacc gtccgaccgg accgagctcc 1440 tccaccgacc tcaacaccta cgttgacgag agccgtatcg accgccgtat ccaccccggt 1500 aactggtgca accaggccgg tgcgggcctc ggcgagcggc ccacggtcaa cccggctccc 1560 ggtgttgacg cctacgtctg ggtgaagccc ccgggtgagt ccgacggcgc cagcgaggag 1620 atcccgaacg acgagggcaa gggcttcgac cgcatgtgcg acccgaccta ccagggcaac 1680 gcccgcaacg gcaacaaccc ctcgggtgcg ctgcccaacg cccccatctc cggccactgg 1740 ttctctgccc agttccgcga gctgctggcc aacgcctacc cgcctctgta a 1791 <210> 3 <211> 1125 <212> DNA <213> Saccharophagus degradans 2-40T <400> 3 gtgaattgta cgcgtaggaa tatagtaaaa gcaggccttc ttggctcggc attcgtcgcc 60 ctgcctgccg tggcgcgcgc gctgcctgga ttggccacga aatttcgcga tcagttttac 120 gtgggcactg cggttagtgc gcgctcactt aatacgccca gcggcgcgtt tgcagccact 180 gtcgcgcatc aattcaatgc actaaccgct gaaaacgcca tgaagcccgc cttacttcaa 240 ccacaaatgg gggagtggcg ctggcaggat gccgatgcca ttgtgagatt tgccgagcag 300 catcagatgc taatgcatgg tcacaccctt gtgtggcatt cgcaaacgcc agattggttc 360 ttccaaaaca agcagggcga accggcagac aaagcaaccc tataccgcag gcaagaggag 420 tatatcaatg ccgtagttgg gcgctataaa gggcgggtac actcgtggga tgtggtgaat 480 gaagcagaag atgagggtaa aggctggcgc aagagccact ggtataacat ttgtgggcca 540 gagtttatgg aacgagcctt tcgcttagct cacgcagcgg acccaaaagc acacttatgt 600 tacaacgatt acaatatgca cttgccgcaa aagcgcgaat ttttggttaa gttattcaaa 660 gactacatta agcgcggcgt gcctattcac ggcgtagggt tgcaggggca tgtgggctta 720 gactacccct cgctggacga gttggaaaaa accatcgtgg ccatggccga tttaggtcta 780 aaagtacaca ttacagaatt ggatgtagat gtattacccg cgccatggca actagctagc 840 gcagatataa gtactaaatt cgagtacgac aaaagcttaa acccgtacgt tgatggtttg 900 cctgacgcgg tgaaccagca gcttagtgcg cgttatgtag agctattcaa gctgttcatt 960 aagcatcagc aacatattgg acgtgttacg ttctggggcg tcggtgacgg tgactcgtgg 1020 aaaaataact ttccggtacc agggcgaacc aattaccctt tgttattcga tcgtaatttg 1080 aaaccaaagc ctgcttataa cgccttagtg gccctcaagt tgtaa 1125

Claims

아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로,
3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도글루카네이즈(Endoglucanase),
8 내지 22 mg/g의 총 고형분 함량의 써모바이피다 푸스카(Thermobifida fusca) 유래의 셀로바이오하이드롤레이즈(cellobiohydrolase), 및
3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도자일라네이즈(endoxylanase)가 혼합된 효소 칵테일을 포함하고,
상기의 엔도글루카네이즈를 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열로 표시되는, 셀룰로스계 바이오매스 당화용 조성물.
제1항에 있어서,
효소 칵테일은 베타-글루코시데이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 엔도글루카네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 셀로바이오하이드롤레이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 엔도자일라네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에서 분리 정제한 효소들을 혼합한 것인, 셀룰로스계 바이오매스 당화용 조성물.
제1항에 있어서,
효소 칵테일은 베타-글루코시데이즈 코딩 유전자, 엔도글루카네이즈 코딩 유전자, 셀로바이오하이드롤레이즈 및 엔도자일라네이즈 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포에서 분리 정제한 효소들을 혼합한 것인, 셀룰로스계 바이오매스 당화용 조성물.
삭제
제2항 또는 제3항에 있어서,
셀로바이오하이드롤레이즈 코딩 유전자는 SEQ ID NO: 2에 기재된 염기서열로 표시되는 셀룰로스계 바이오매스 당화용 조성물.
제2항 또는 제3항에 있어서,
엔도자일라네이즈 코딩 유전자는 SEQ ID NO: 3에 기재된 염기서열로 표시되는 셀룰로스계 바이오매스 당화용 조성물.
산 또는 알칼리로 전처리된 셀룰로스계 바이오매스에 대하여 효소 칵테일로 당화시키는 단계를 포함하고,
상기 효소 칵테일은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로,
3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도글루카네이즈(Endoglucanase),
8 내지 22 mg/g의 총 고형분 함량의 써모바이피다 푸스카(Thermobifida fusca) 유래의 셀로바이오하이드롤레이즈(cellobiohydrolase), 및
3 내지 12 mg/g의 총 고형분 함량의 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 유래의 엔도자일라네이즈(endoxylanase)가 혼합된 것이며,
상기의 엔도글루카네이즈를 코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열로 표시되는, 셀룰로스계 바이오매스의 당화율을 개선하는 방법.
제7항에 있어서,
산 전처리된 셀룰로스계 바이오매스는 베타-글루코시데이즈 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로,
4 내지 6 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도글루카네이즈,
18 내지 21 mg/g의 총 고형분 함량의 셀로바이오하이드롤레이즈, 및
4 내지 6 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도자일라네이즈가 혼합된 효소 칵테일로 당화시키는, 셀룰로스계 바이오매스의 당화율을 개선하는 방법.
제7항에 있어서,
알칼리 전처리된 셀룰로스계 바이오매스는 베타-글루코시데이즈 3 mg/g의 총 고형분을 기준으로,
각각 8 내지 11 mg/g의 총 고형분 함량의 엔도글루카네이즈, 셀로바이오하이드롤레이즈, 및 엔도자일라네이즈가 혼합된 효소 칵테일로 당화시키는, 셀룰로스계 바이오매스의 당화율을 개선하는 방법.
제7항에 있어서,
산은 황산, 말산, 염산, 질산, 인산, 탄산, 포름산, 아세트산, 플루오르화 수소산, 옥살산 및 시트르산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 셀룰로스계 바이오매스의 당화율을 개선하는 방법.
제7항에 있어서,
알칼리는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화바륨, 수산화암모늄, 탄산칼슘, 탄산칼륨 및 암모니아로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 셀룰로스계 바이오매스의 당화율을 개선하는 방법.
제7항에 있어서,
당화는 산 또는 알칼리 전처리된 셀룰로스계 바이오매스와 효소 칵테일을 35 내지 45 ℃에서 pH 5.5 내지 7.5의 조건에서 수행하는, 셀룰로스계 바이오매스의 당화율을 개선하는 방법.