KR20080065234A

KR20080065234A - 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 델타 리간드 티아졸 화합물및 이를 함유하는 의약, 화장품 및 건강식품 조성물

Info

Publication number: KR20080065234A
Application number: KR1020080001984A
Authority: KR
Inventors: 강헌중; 고재영; 황후상
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-01-08
Filing date: 2008-01-08
Publication date: 2008-07-11
Also published as: EP2104666A1; CN101605769A; BRPI0807023A2; EP2104666A4; JP5367584B2; JP2010515724A; US20100041723A1; WO2008084962A1; US8431715B2; RU2444518C2; US20120197024A1; KR100954237B1; RU2009130367A; US8236831B2

Abstract

본 발명은 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 δ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ, 이하 'PPARδ'로 표시함)에 활성을 갖는 하기 화학식 1로 표시되는 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 이를 포함하는 의약 조성물, 기능성 화장품 조성물, 건강식품, 건강음료, 식품첨가물 및 동물용 사료에 관한 것이다.

[화학식 1]

퍼록시솜 증식자, 활성화, 수용체, 동맥경화, 고지혈증, 비만, 당뇨, 근육강화제, 기억력 증진제, 치매 및 파킨슨 병 치료제, 화장품, 건강식품, 건강음료, 식품첨가물, 사료

Description

퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 델타 리간드 티아졸 화합물 및 이를 함유하는 의약, 화장품 및 건강식품 조성물{Thiazole compound as PPARδ ligand and pharmaceutical, cosmetic and health food comprised thereof}

본 발명은 비만, 고지혈증, 동맥경화, 당뇨병, 치매 및 파킨슨 병 치료 및 근육강화 또는 기억력 증진에 사용될 수 있는 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 δ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ: PPARδ) 활성화 리간드인 하기 화학식 1의 화합물로 표시되는 티아졸 화합물 및 이를 함유하는 의약 조성물, 기능성 화장품 조성물, 건강식품, 건강음료, 식품첨가물 및 동물용 사료에 관한 발명이다.

[화학식 1]

핵 수용체 중 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체(Peroxisome Proliferator Activated Receptor: PPAR)는 3종의 subtype인 PPARα, PPARγ, PPARδ가 알려져 있다(Nature, 1990, 347, p645-650., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, p7335-7359). PPARα, PPARγ 와 PPARδ는 생체 내 조직에 따른 구별된 기능을 가지며, 발현부위 또한 차이를 보인다. PPARα는 인간에서 심장, 신장, 골격근, 대장에서 주로 발현 되고(Mol. Pharmacol. 1998, 53, p14-22., Toxicol . Lett . 1999, 110, p119-127., J. Biol . Chem . 1998, 273, p16710-16714), 퍼록시솜(peroxisome)과 미토콘드리아의 β-산화와 관련이 있다(Biol . Cell . 1993, 77, p67-76., J. Biol. Chem . 1997, 272, p27307-27312). PPARγ는 골격근에서는 약하게 발현되나 지방조직에서는 다량으로 발현되어 지방세포의 분화와 에너지를 지방형태로 저장, 그리고, 인슐린과 당의 항상성 조절에 관여를 하는 것으로 알려져 있다(Moll . Cell . 1999, 4, p585-594., p597-609., p611-617). PPARδ는 인간을 포함한 포유류와 설치류, 멍게류 같은 척추동물 등에서 진화적으로 보존되어 있다. 지금까지 연구에 의하면 PPARδ는 생식세포의 발현과정 중 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며(Genes Dev . 1999, 13, p1561-1574.), 중추신경계(Central Nervous System: CNS)에서 신경세포의 분화(J. Chem . Neuroanat 2000, 19, p225-232), 소염효과를 통한 상처의 치유(Genes Dev . 2001, 15, p3263-3277., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2003, 100, p6295-6296) 등의 생리적 기능을 수행하는 것으로 보고되었다. 최근 연구에 의하면 PPARδ가 지방세포 분화 및 지방의 대사 작용에 관련 있다는 것이 증명되었는데(Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2002, 99, p303-308., Mol . Cell . Biol. 2000, 20, p5119-5128), PPARδ를 활성화 시키면 지방산 β-oxidation과 관련된 핵 심유전자와 에너지 대사와 관련된 유전자인 uncoupling proteins (UCPs)의 발현이 활성화되어 비만이 개선된다. (Nature 2000, 406, p415-418, Cell 2003, 113, p159-170). 또한 PPARδ는 고밀도 콜레스테롤(HDL, High Density Lipoprotein)을 높이고, 체중변화가 없는 상태에서 제2형 당뇨병을 개선시키며(Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2001, 98, p5306-5311, 2003, 100, p15924-15929, 2006, 103, p3444-3449), 염증관련 유전자를 조절하여 동맥경화를 억제한다(Science, 2003, 302, p453-457). 따라서 PPARδ 리간드는 비만, 당뇨, 고지혈증 및 동맥경화 등의 대사성 질환 치료를 위한 약물로의 개발이 가능하다.

PPARδ는 미토콘드리아의 생합성을 조절한다. 생쥐의 근육에 인위적으로 PPARδ를 과다발현 시킨 결과 미토콘드리아 생합성이 증가하였고, 또한 지방산 β 산화효소의 발현 및 TypeⅠ 근섬유가 증가하여 일반 쥐에 비해 지속적으로 달릴 수 있는 시간과 거리가 각각 67%, 92% 증가하였다(PLoS Biology, 2004, 2:e294). 이러한 미토콘드리아의 생합성 증가는 뇌기능 개선에도 효과적이다. 뇌세포의 미토콘드리아가 산화적 스트레스에 의해 파괴되면 기억력이 현저히 저하된다는 것이 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99, p2356-2361). 치매 및 파킨슨병은 대표적인 퇴행성 뇌질환으로 학습과 기억력이 현저하게 감퇴되는 공통된 증상을 보인다. 따라서 본 발명에서 개발한 미토콘드리아 증식 물질은 기억력 증진제 뿐만아니라 치매 및 파킨슨 병 치료제로의 개발이 가능하다.

PPARδ의 합성 리간드는 다른 PPARα,γ에 비하여 선택성이 탁월한 리간드 개발이 비교적 많이 이루어지지 않았으며, 초기에 개발된 선택적 리간드들은 머크 (Merk)사 연구진이 발표한 L-631033으로 (J. Steroid Biochem . Mol . Biol . 1997, 63, p1-8) 이것은 형태적으로 천연 지방산류의 형태를 기초로 측쇄를 고정시킬 수 있는 기능기를 도입하여 만들어졌다. 또한, 같은 연구진에서 보다 효과적인 L-165041 리간드 (J. Med . Chem . 1996, 39, p2629-2654)를 발표하였는데, 이것은 로이코트리엔 작동제(leukotriene agonist)로 이미 알려져 있던 화합물이 인간의 PPARδ에 활성물질로도 작용한 것이었다. 이 물질은 hPPARδ에 대하여 PPARα,γ보다 10배의 선택성을 보이며, EC₅₀ 값도530 nM로 작용하는 것으로 나타났다. 그러나 설치류에 대한 실험에서는 PPARγ에 대한 선택성이 거의 없었다. 또 다른 리간드인 L-796449와 L-783483은 친화또는 현저히 개선된 반면(EC₅₀=7.9 nM), 다른 hPPAR 아류(subtype)와의 선택성이 거의 없는 것으로 나타났다.

글락소 스미스 클라인 (Glaxo-Smith-Kline)사의 연구진은 PPARδ 리간드 포켓의 결정 구조와 유사한 Y-형 리간드로 PPARα의 활성물질인 GW2433 (Chem . Biol . 1997, 4, p909-918)을 발표하였다. 이 리간드는 지금까지 개발된 리간드와는 달리 벤젠고리를 포함한 Y-형의 구조를 찾고 있어 PPARδ의 리간드-결합 포켓에 공간적으로 잘 결합하는 리간드로 보고되었다. 그러나 이 리간드는 hPPARα에도 활성을 보이는 이중-활성화 리간드로, PPARδ에 대한 선택성이 떨어지는 것으로 나타났다. 최근 글락소 스미스 클라인 사에서 개발한 PPARδ의 선택적 리간드 GW501516 ([2-메틸-4-[[[4-메틸-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-1,3-티아졸-5-일]메틸]설파닐]펜옥시]아세트산)은 앞서 개발된 리간드 보다 탁월한 생리적 효능을 보였다 (Proc . Natl . Acad. Sci . USA 2001, 98, p5306-5311).

GW501516은 PPARδ에 매우 좋은 친화도 (1~10nM)를 보이고 있으며, PPARα나 γ에 대해서도 1000배 이상의 선택성을 보이는 것으로 나타났다.

그러나 지금까지 개발된 리간드로부터 얻어진 PPARδ의 활성또는 전체 리간드-결합 pocket의 30 내지 40% 부위와 결합하여 나타낸 결과들이다.

한편 글락소 그룹에 의하여 출원된 국제공개특허 2001-00603호에는 PPARδ의 선택적 활성화제로서 상기 GW501516를 포함하는 하기 화학식 A의 화합물이 공지되어 있으나, 상기 GW501516의 Rhesus 모델 실험 결과의 일부만 기재되어 있을 뿐이다.

[상기 화학식 A에서 R'는 CF₃, F 등이고, R''는 H, CH₃, Cl 등이며, R'''는 H, CH₃, CH₂CH₃이다.]

글락소 그룹에서 출원된 국제공개특허보 2002-62774호에는 또 다른 PPARδ의 선택적 활성화제로서 하기 구조의 화학식 B의 화합물을 포함한 티아졸 화합물이 공지되어 있다.

한편 일라이릴리에 의하여 출원된 국제공개특허 2003-072100호에는 하기 화학식 C 화합물을 포함하는 PPARδ를 선택적으로 조절하기위한 의약조성물이 공지되어 있다.

그러나 상기 화합물에 대하여 제조되었음을 기재하고 있을 뿐 2개로 존재하는 광학활성체를 제조한 것이 아닌 라세미체로 제조된 것이고, 제조된 라세미체에 대하여 질량분석스펙트럼의 M⁺+1 값만을 기재하고 있고, ¹H-NMR로 확인하였다는 기재와 PPARδ의 선택적 활성화제로 작용한다는 기재만 있을 뿐이며, PPARδ의 선택적 활성화제로서의 정량적인 약리효과의 기재가 전혀 없다.

본 발명자들은 상기의 국제공개특허 2003-072100호의 발명에 기재된 티아졸 유도체의 라세미 화합물 중 PPARδ의 선택적 활성화도가 높은 광학활성 화합물을 제조하기에 이르렀다. 따라서 본 발명은 PPARδ의 선택적 활성화도가 높은 티아졸 유도체의 광학활성 화합물을 제공하는 것이며, 또한 상기 티아졸 유도체의 광학활성 화합물을 포함하는 의약 조성물, 화장품 조성물, 건강식품 및 동물용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 비만, 고지혈증, 동맥경화, 당뇨병, 치매 및 파킨슨 병 치료 및 근육강화 또는 기억력 증진에 사용될 수 있는 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 δ (Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ: PPARδ) 활성화 리간드로서 하기 화학식 1의 화합물로 표시되는 티아졸 유도체 및 이를 포함하는 의약 조성물, 화장품 조성물, 건강식품 및 동물용 사료 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

국제공개특허 2003-072100호에서는 하기의 화합물 C의 티아졸 화합물이 공지되어 있으나, 제조된 라세미체에 대하여 질량분석스펙트럼의 M⁺+1 값 만을 기재하고 있고, ¹H-NMR로 확인하였다는 기재와 PPARδ의 선택적 활성화제로 작용한다는 기재만 있을 뿐이며, PPARδ의 선택적 활성화제로서의 약리효과의 정량적인 기재가 전혀 없다.

상기 화합물 C는 키랄 탄소를 갖고 있어서, 그의 입체이성체가 존재한다.

본 발명자들은 놀랍게도 상기 화합물 C의 라세미 화합물의 광학활성물질인 R-form 이성체인 화학식 1의 화합물이 PPARδ의 매우 높은 선택적 활성화도를 갖지만 S-form 이성체인 하기 화학식 2의 화합물은 상기 화학식 1의 화합물에 비하여 PPARδ에 대한 활성화도가 현저히 떨어짐을 확인하였다.

[화학식 2]

따라서 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물은 국제공개특허 2003-072100호에 대한 선택발명으로 간주된다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 하기의 반응식 1의 경로를 통하여 제조될 수 있다.

[반응식 1]

[상기 반응식 1 중, R¹은 페놀보호기로서 탄소수 1~4의 저급알킬기, 알릴기, 알킬실릴이나 알킬아릴실릴기 또는 테트라히드로피라닐기이며; R²는 탄소수 1~4의 알킬기를 같는 카르복실산 보호기 또는 알릴기이며; X¹은 브롬원자 또는 요오드원자 를 나타내며; X² 및 X³는 염소원자, 브롬원자, 요오드원자, 또는 친핵 치환반응에 반응성이 좋은 이탈기를 의미한다.]

이하 본 발명에 따른 화합물의 제조방법을 구체적으로 설명하나, 하기의 기재가 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[공정 A] 화학식 8의 화합물의 제조

화학식 8의 화합물을 얻기 위하여서는 화학식 3의 화합물인 4-할로-2-메틸페놀을 그리너드 시약으로 페놀기를 보호하고, 분리 과정 없이 순차적으로 유기금속 시약과 황을 반응 시킨 뒤, 화학식 7의 화합물을 반응시켜 얻는 것이 좋다. 본 공정은 세부적으로 4단계의 반응을 한번에 거치게 된다.

이하에, 세부공정을 설명한다.

(공정 A-1): 이 공정에 있어서 사용되는 무수 용매로서는 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 헥산, 헵탄 등의 단일 용매와 두 가지 이상의 용매를 배합한 혼합용매를 사용한다. 이중에서 바람직한 용매는 디에틸에테르, 테트라히드로푸란 또는 디에틸에테르와 테트라히드로푸란의 혼합용매다.

사용되는 그리너드 시약(Grignard reagent)은 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필, n-부틸, sec-부틸마그네슘클로라이드(R₂MgCl) 또는 알킬마그네슘브로마이드(R₂MgBr)이다. 이중에서도 가장 바람직한 것은 iso-프로필마그네슘클로라이드[(CH₃)₂CHMgCl]이다.

반응 온도는 사용되어지는 용매에 따라 달라질 수 있으나, 통상 -20～40 ℃이고, 바람직하게는 0 ℃부터 실온(25 ℃)에서 반응한다. 반응시간은 반응 온도와 사용하는 용매에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10분에서 60분, 바람직하기로는 10분에서 30분간 반응한다.

(공정A-2와 A-3): 할로겐-금속치환 반응에서 사용되는 유기금속시약으로는 n-부틸리튬, sec-부틸리튬, tert-부틸리튬 등을 들 수 있다. 이중에서도 바람직하기로는 tert-부틸리튬이 좋다.

황은 입자가 고운 분말형태의 것이 적당하고, 이를 용매에 직접 부가하여 반응시킨다.

반응 온도는 사용되어지는 용매에 따라 달라질 수 있으나 통상은 -78～25 ℃이고, 바람직하게는 할로겐-금속 치환반응은 -75 ℃에서 실시하고, 황 도입반응은 -75 ℃로부터 출발하여 실온(25 ℃)에서 반응한다. 반응시간은 반응 단계에 따라, 할로겐-금속 치환반응은 10～30분, 황 도입반응은 30～90분간 반응한다.

(공정A-4): 이 공정에서 사용되는 화학식 7의 5-할로겐메틸-4-메틸-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]티아졸 공지된 방법(WO 03/106442)에 따라 합성한다. 화학식 7의 할로겐은 염소, 브롬, 요오드 원소가 사용되며, 이중에서도 염소 원소의 화합물이 바람직하다.

반응 온도는 사용되어지는 용매에 따라 달라질 수 있으나 통상은 -78～25 ℃에서 실시하고, 바람직하게는 0～10 ℃에서 반응한다. 반응시간은 통상 10～120분으로 실시하고, 바람직하게는 10～60분 이하로 반응한다.

[공정 B] 화학식 9의 화합물의 제조

화학식 9의 화합물을 얻기 위하여서는 화학식 8의 화합물과 페놀 보호기로 통상 사용되고 있는 화합물을 염기 존재 하에서 반응시키면 좋다.

이 공정에 있어서 사용되는 비프로톤성 극성용매로서는 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 디메틸설폭시드, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 에테르류로서는, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄, 디에틸렌글리콜디메틸에테르, 트리에틸렌글리콜디메틸에테르 등을 들 수 있다. 방향족 탄화 수소로서는, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등을 들 수 있다. 이중에서도 사용되는 용매로서는, 비프로톤성 극성용매가 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 N,N-디메틸포름아미드, 클로로포름, 디클로로메탄이다.

사용되는 염기로는 피리딘, 트리에틸아민, 이미다졸, N,N-디메틸아미노피리딘 등의 아민류 염기를 사용하고, 알킬 또는 알릴에테르화 보호기의 반응은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨 등을 염기로 사용한다. 이중에서도 바람직한 염기로서는 이미다졸과 탄산칼륨이다.

실릴보호기는 알킬실릴할라이드나 알킬아릴실릴할라이드를 사용하며 테트라히드로피라닐 보호기는 3,4-디히드로-2H-피란을 사용한다.

반응 온도는 사용되어지는 용매에 따라 달라질 수 있으나, 통상은 -10～80℃이고, 바람직하게는 0℃부터 실온(25℃)에서 반응한다. 반응시간은 반응 온도와 사 용하는 용매에 따라 달라질 수 있으나, 통상 1시간에서 1일, 바람직하기로는 4시간 이내에서 반응하는 것이 좋다.

[공정 C] 화학식 10의 화합물의 제조

화학식 10의 화합물은 화학식 9의 화합물로부터 티오에테르의 알파-수소 (α-proton)를 강염기로 처리하여 친핵 반응물 (nucleophile)을 제조 후, 다양한 친전자 화합물을 반응시켜 얻는다.

이 공정에 있어서 사용되는 무수 용매로서는 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 헥산, 헵탄 등의 단일 용매와 두 가지 이상의 용매를 배합한 혼합용매를 사용한다. 이중에서도 가장 바람직한 용매는 디에틸에테르, 테트라히드로푸란, 디에틸에테르와 테트라히드로푸란의 혼합용매이다.

알파-수소 추출반응에 사용되어지는 강염기 시약으로는 포타슘 tert-부톡시드(t-BuOK), 리튬 디이소프로필 아미드(LDA), n-부틸리튬, sec-부틸리튬 및 tert-부틸리튬 등이 사용되며, 이중에서도 리.튬 디이소프로필 아미드(LDA)가 가장 바람직하다.

티오에테르 친핵 화합물과 반응하는 친전자 화합물 (electrophile)은 벤질할라이드를 사용한다.

반응 온도는 사용되어지는 용매에 따라 달라질 수 있으나 통상은 -78～25℃이고, 바람직하게는 강염기에 의한 알파-수소 추출반응은 -75℃에서 실시하고, 친전자 화합물은 -75℃에서 부가하여 실온(25℃)까지 서서히 온도를 올리면서 반응한 다. 반응시간은 반응 단계에 따라 다르나, 강염기에 의한 알파-수소 추출반응은 10～30분, 친전자 화합물과의 반응은 30～90분간 실시한다.

[공정 D] 화학식 11의 화합물의 제조

화학식 11의 화합물은 화학식 10의 화합물로부터 페놀 보호기의 제거반응으로서 얻어진다.

이 공정에 있어서 사용되는 극성용매로서는 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 디메틸설폭시드, 아세토니트릴, 아세톤, 에틸아세테이트, 사염화탄소, 클로로포름, 디클로로메탄 등을 들 수 있다. 에테르류로서는, 테트라히드로푸란, 디옥산, 디메톡시에탄, 디에틸렌글리콜디메틸에테르 등을 들 수 있다. 알코올류로서는 메탄올 에탄올 등을 들 수 있다. 방향족 탄화수소로서는, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등을 들 수 있다. 이중에서도 사용되는 용매로서는 극성용매가 좋으며, 가장 바람직한 것은 테트라히드로푸란이다.

페놀 보호기의 탈 보호방법으로는 메틸, 에틸, tert-부틸, 벤질, 알릴에테르 보호기의 경우, 트리메틸실릴요오드, 에탄티오알코올나트륨염, 리튬요오드, 알루미늄 할로겐화물, 붕소 할로겐화물, 트리플로로아세트산 등의 루이스산류가 사용되고, 트리메틸실릴, tert-부틸디페닐실릴, 트리이소프로필실릴, tert-부틸디메틸실릴 등의 실릴화보호기는 테트라부틸암모늄불소 (Bu₄N⁺F^-), 할로겐산(불소산, 염산, 브롬산 요오드산), 불소화칼륨 등의 불소화물 등을 사용한다. 이중에서도 실릴화기 의 탈보호기 반응의 방법으로는 불소화물이 바람직하고, 더욱 바람직하기로는 테트라부틸암모늄불소를 사용하는 것이 좋다.

반응온도는 사용하는 방법과 용매에 따라 달라질 수 있으나 통상은 0～120℃이고, 바람직하게는 10℃～25℃에서 반응을 한다. 반응시간은 반응온도에 따라서 달라지지만, 통상 30분에서 1일, 바람직하게는 2시간 이내에서 반응하는 것이 좋다.

[공정 E] 화학식 12의 화합물의 제조

화학식 11의 라세믹화합물로부터 화학식 12의 화합물인 R-이성질체와 또다른 이성체인 S-이성질체를 각각 분리함으로써 제조된다. 이 공정은 키랄 순상칼럼을 적용한 고성능 액체크로마토그래피를 이용할 수 있으며, 용매로는 헥산, 헵탄, 펜탄등의 비극성 용매와 에탄올, 이소프로필알콜등의 극성 용매의 혼합용매를 사용한다.

[공정 F] 화학식 13의 화합물의 제조

화학식 13의 화합물은 화학식 12의 화합물과 할로겐아세트산 알킬 또는 알릴에스테르를 염기 존재 하에서 반응시킴으로써 제조된다.

할로겐아세트산 알킬또는 알릴에스테르는 공지의 화합물로서 용이하게 입수 가능한 것이며, 할로겐은 염소원자, 브롬원자. 요오드원자 등이다. 사용되어진 할로겐아세트산 알킬에스테르 중에 가장 바람직한 것은 브로모아세트산 메틸에스테르 와 브로모아세트산 알릴에스테르 또는 브로모아세트산 에틸에스테르이다.

이 공정에 있어서 사용되는 용매로서는 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴, 아세톤, 에탄올, 메탄올 등의 수용성 단일용매를 사용하거나, 1～10%의 물을 혼합한 용매를 사용한다. 이중에서도 사용되는 용매로서 가장 바람직한 것은 1～5% 물을 혼합한 아세톤 또는 디메틸술폭시드이다.

사용되는 염기로서는, 반응에 악영향을 주지 않는 것이면 약염기어거나, 강염기어도 특별한 제한은 없고, 수소화나트륨, 수소화리튬 등의 알칼리금속 수소화물, 수소화칼륨 등의 알칼리토금속 수소화물, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속 수산화물 등의 강염기, 탄산리튬, 탄산칼륨, 탄산수소화칼륨, 탄산세슘 등의 알칼리금속 탄산염을 들 수 있다. 사용되어지는 염기로서는 알칼리금속 탄산염이 바람직하고, 더욱 바람직한 것은 탄산칼륨이다.

반응온도는 사용하는 용매의 끓는점까지면 특히 제한은 없으나, 부반응을 억제하기 위하여 비교적 고온의 반응은 바람직하지 않다. 통상은 0～60 ℃에서 반응한다. 반응시간은 반응온도에 따라서 달라지지만, 통상 30분에서 1일, 바람직하게는 30～90분간 반응한다.

[공정 G] 화학식 1의 화합물의 제조

화학식 1의 화합물은 화학식 13의 화합물로부터 수용성 무기염과 알코올 용액에서 카르복실산 에스테르의 가수분해를 통하여 제조하거나 알릴에스테르의 경우 팔라듐 촉매하에서 염을 제조한다.

이 공정에 있어서 사용되는 용매로는 메탄올, 에탄올 같은 알코올류로 물과 혼합되는 수용성 용매를 사용되며, 무기염으로서는 카르복실산 알칼리염의 형태에 따라 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 알칼리금속 수산화물을 0.1～3N 정도의 수용액을 만들어 사용한다. 화학식 13의 화합물을 카르복실산 형태로 얻기 위해 사용되는 산으로는 초산 또는 0.1～3N 염산 수용액을 사용하는 것이 좋다.

반응온도는 부반응을 억제하기 위하여 비교적 저온에서 반응하는 것이 바람직하고, 통상은 0 ℃ 내지 실온에서 반응한다. 반응시간은 반응온도에 따라서 달라지지만, 통상 10분에서 3시간, 바람직하게는 30분 내지 1시간 동안 반응한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용되는 염의 제조는 하기 반응식 2에 도시한 바와 같이, 상기 반응식 1의 화학식 13의 화합물은 유기용매 중에서 팔라듐테트라키스트리페닐포스핀 촉매와 금속염을 이용한 알릴 에스테르의 염 치환반응을 하여 용이하게 제조할 수 있다. 사용되어지는 용매로는 클로로포름, 사염화탄소, 디클로로메탄, 테트라하이드로퓨란, 아세트산에틸등을 사용하며 사용되어지는 촉매로는 팔라듐테트라키스트리페닐포스핀이 가능하며, 염교환반응을 위한 염으로는 칼륨 2-에틸헥사노에이트, 나트륨 2-에틸헥세노에이트이 바람직하다.

[반응식 2]

이렇게 하여 얻어진 본 발명에 따른 화학식 1의 황을 함유한 화합물은 PPARδ형 단백질의 리간드로서 중요한 물질이다.

본 발명의 범위는 화학식 1의 화합물, 그의 용매화물 및 그의 염을 포함하며, 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 δ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ: PPARδ)의 활성화제 조성물로서 유용하다. 또한 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 δ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ: PPARδ)를 활성화시킴으로써 동맥경화증 또는 고지혈증 치료 및 예방; 고밀도 콜레스테롤 증진; 당뇨병 치료 및 예방; 비만 치료 및 예방; 근육강화 또는 지구력 증진; 기억력 증진, 치매 또는 파킨슨병 치료 및 예방;을을 위한 의약 조성물과 건강식품 보조제, 건강음료, 식품 첨가물 및 동물용 사료 조성물로서 유용하다. 또한, 본 발명에 따른 화학식 1 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 비만 예방 및 비만 개선, 근육강화 및 지구력 증진을 위한 기능성 화장품 조성물로서 유용하고, 근육강화 및 지구력 증진을 위해서 상기 기능성 화장품 조성물은 연고제형이나, 로션, 유동성 크림, 크림 또는 겔로 제형화되어 운동전/후 원하는 신체부위에 도포할 수 있으며, 원하는 효과를 달성하기 위하여 장기간 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화학식 1 화합물 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 당뇨병 또는 diabetic ulcer라 불리는 당뇨로 인한 족부궤양증을 예방 또는 치료하기 위하여 연고제형으로 제형화되어 신체의 각 부위에 도포될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 δ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ: PPARδ)의 활성화제 조성물을 제공한다.

상기 약학적으로 허용하는 염은 상기 화학식 1의 화합물의 카복실산과 염을 이룰 수 있으며, 약학적으로 허용되는 염을 모두 포함하며, 알칼리금속이온 또는 알칼리토금속으로서 Li⁺, Na⁺, K⁺,Ca⁺ 등이 바람직하다.

본 발명에 따른 치료학적 효과를 달성하는데 사용되는 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 양은 물론 특정 화합물, 투여 방법, 치료할 대상, 및 치료할 질환에 따라 달라지나, 통상적인 의약의 투여량에 의존하나, 보다 바람직하게는 상기 화학식 1의 화합물의 유효투입량은 1 내지 100 ㎎/㎏(몸무게)/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다. 또한, 제형에 따라 경구투여 또는 국소 투여용 모두 가능하다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 경구투여 경우 기존의 모든 다양한 형태로 제조가능하며 예를 들어 정제, 분말제, 건조시럽, 씹을 수 있는 정제, 과립제, 츄잉정, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제, 드링크제, 설하정 등의 여러 가지 형 태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 정제는 유효량으로 생체이용성이 있는 임의의 형태 또는 방식, 즉, 경구경로로 환자에게 투여될 수 있으며, 치료 또는 예방하려는 질병 상태의 특성, 질병의 단계, 및 그 밖의 관련 사정에 따라 적합한 투여 형태 또는 방식을 용이하게 선택할 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물이 정제인 경우 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함 할 수 있으며, 이러한 부형제의 비율 및 성질은 선택된 정제의 용해도 및 화학적 특성, 선택된 투여경로 및 표준 약제 실무에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 고지혈증 개선 및 예방; 고밀도 콜레스테롤 증진; 당뇨병 개선 및 예방; 비만 개선 및 예방; 근육강화 또는 지구력 증진; 기억력 증진, 치매 또는 파킨슨병 개선 및 예방;을 위한 목적으로 건강식품 보조제 또는 건강음료에 첨가할 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 첨가량은 용도 및 목적에 따라 조절할 수 있으며, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명에 따른 티아졸 유도체 화합물은 선행발명으로부터 선택적 의의를 갖는 PPARδ 활성화 리간드의 특성이 있는 것으로서 동맥경화증 또는 고지혈증 치료 및 예방; 고밀도 콜레스테롤 증진; 당뇨병 치료 및 예방; 비만 치료 및 예방; 근육강화 또는 지구력 증진; 기억력 증진, 치매 또는 파킨슨병 치료 및 예방;을 위한 의약 조성물과 건강식품 보조제, 건강음료, 식품 첨가물, 기능성 화장품 및 동물용 사료 조성물로 이용될 가능성이 매우 높은 화합물이다.

[실시예]

[실시예 1] 화학식 8의 화합물의 제조(공정 A)

질소 조건하에서 4-요오드-2-메틸페놀 500 mg (2.14 mmol)를 무수 테트라히드로푸란 20 ㎖에 녹이고, 온도를 0 ℃로 유지시킨다. 이소프로필마그네슘클로라이드 1.1 ㎖(2 M-에테르용액, 2.16 mmol)를 서서히 부가하고, 10분간 반응시킨다. 반응 용액을 -78℃로 충분히 냉각 후, tert-부틸리튬 2.77 ㎖(1.7 M-헵탄용액, 4.70 mmol)을 천천히 적가하고, 20분간 더 반응시킨다. 황 69 ㎎(2.14 mmol)을 천천히 부가하고, 이 반응물의 온도가 15 ℃가 될 때까지 반응을 시킨다. 40분 후, 같은 온도에서 화학식 7 화합물인 5-클로로메틸-4-메틸-2-[(4-트리플루오로메틸)페닐]-티아졸 624 mg (2.14 mmol)을 무수 THF 2 ㎖에 녹여 천천히 부가한다. 한시간 가량 반응을 더 시키고, 염화암모늄 수용액 20 ㎖를 가하여 반응을 종결시킨다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 수분을 제거하고, 여과 후, 용매를 감압 증류하여 제거한다. 잔사를 헥산/에틸아세테이트(v/v = 3/1)에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 728 mg (수율 : 86 %)을 얻었다.

¹H NMR(300 MHz, CDCl₃) δ 7.96 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.65(d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 1.5 Hz), 7.01 (dd, 1H, J = 8.2, 2.0 Hz), 6.62 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 5.86 (brs, 1H), 4.07 (s, 2H), 2.19 (s, 3H), 2.12(s, 3H)

¹³C NMR(75.5 MHz, CDCl₃) δ 163.9, 155.5, 151.7, 137.4, 136.9, 133.5. 131.9 (q, J = 32.6 Hz), 131.7, 126.8, 126.3, (q, J = 3.9 Hz), 125.8, 123.8, 115.7, 33.2, 16.2, 14.8

[실시예 2] 화학식 9의 화합물(R¹=t-Bu(CH₃)₂Si-, 공정 B)

화학식 8의 화합물 500 mg (1.26 mmol)과 이미다졸 171 ㎎(2.52 mmol)을 디메틸포름아미드 (5 ml)에 완전히 녹인다. tert-부틸디메틸실릴클로라이드 209 ㎎(1.38 mmol)을 천천히 가하고 실온에서 4시간 교반 시킨다. 반응 완결 후 염화암모늄 수용액과 에틸아세테이트를 이용하여 추출하고, 유기층에서 황산마그네슘으로 수분을 제거하고 여과 후, 용매를 감압 증류하여 제거한다. 잔사를 헥산/에틸아세테이트(v/v = 10/1)에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 610 mg (수율 : 95 %)을 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): 7.97 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.65 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.19 (d, 1H, J = 1.9 Hz) 7.07 (m, 1H), 6.69 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 4.11 (s, 2H), 2.21 (s, 3H), 2.11 (s, 3H), 1.01 (s, 9H), 0.21 (s, 6H) ¹³C NMR (75.5 MHz, CDCl₃): δ 163.2, 154.7, 151.5, 137.1, 136.6, 133.3, 132.4, 131.7, 131.2, 131.0, 130.2, 129.2, 126.6, 126.1, 126.06, 126.01, 125.9, 124.9, 119.4, 32.8, 25.9, 18.5, 16.9, 15.0, -4.0

[실시예 3] 화학식 10의 화합물의 제조(R¹=t-Bu(CH₃)₂Si-, 공정 C)

질소 조건하에서 실시예 2에서 얻은 화학식 9의 화합물(R¹=t-Bu(CH₃)₂-) 300 mg (0.59 mmol)을 무수 테트라히드로퓨란 5 ml에 녹이고 온도를 -78 ℃로 유지시킨다. 이용액에 리튬디이소프로필아미드 619 μl (2.0M 에테르용액, 1.24 mmol) 서서히 부가하고 10분간 반응시킨다. 반응 용액을 -78℃로 유지하면서 벤질브로마이드 77 μl (0.65 mmol)을 서서히 부가하고 같은 온도에서 30분간 교반한다. 염화암모늄 수용액 5 ㎖를 가하여 반응을 종결시킨다. 유기층을 분리하여 황산마그네슘으로 수분을 제거하고, 여과 후, 용매를 감압 증류하여 제거한다. 잔사를 헥산/에틸아세테이트(v/v = 10/1)에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 265 mg (수율 : 75 %)을 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7.97 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.65 (d, 2H, J = 8.2Hz), 7.03-7.26 (m, 7H) 6.63 (d, 1H, J = 8.3 Hz), 4.51 (dd, 1H, J = 9.8, 5.3 Hz), 3.37 (dd, 1H, J = 9.8, 5.3 Hz), 3.05 (dd, 1H, J = 13.6, 9.9 Hz), 2.10 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 0.98 (s, 9H), 0.18 (s, 6H) ¹³C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 163.5, 155.1, 151.8, 138.4, 137.7, 136.5, 133.5, 130.3, 129.3, 128.9, 127.2, 126.8, 126.7, 126.2, 126.1, 124.5, 119.4, 49.2, 44.4, 26.1, 18.7, 17.1, 15.1, -3.81, -3.84

[실시예 4] 화학식 11의 화합물의 제조(공정 D)

질소 조건하에서 실시예 3에서 얻은 화학식 10의 화합물(R¹=t-Bu(CH₃)₂Si-) 200 mg (0.33 mmol)을 무수 테트라히드로퓨란 5 ml에 녹이고 상온을 유지하면서 테트라부틸암모늄풀루오라이드 1M 테트라히드로퓨란 용액 660 μl (0.66 mmol)을 가하고 한시간 동안 교반한다. 반응 종료후에 에틸아세테이트, 물을 부가하여 유기층을 추출하고 황산마그네슘으로 수분을 제거한다. 여과 후, 용매를 감압 증류하여 제거한다고 잔사를 헥산/에틸아세테이트(v/v = 5/1)에서 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제화합물 146 mg (수율 : 91 %)을 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 7.92 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.50 (s, 1H), 7.59 (d, 2H, J = 8.2Hz), 7.07-7.22 (m, 6H), 6.85(m, 1H), 6.44 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 4.47 (dd, 1H, J = 9.7, 5.4 Hz), 3.39 (dd, 1H, J = 13.8, 5.4 Hz), 3.06 (dd, 1H, J = 13.8, 9.8 Hz), 2.12 (s, 3H), 1.73 (s, 3H) ¹³C NMR (125 MHz, CDCl3): δ 164.1, 155.7, 151.2, 138.0, 137.9, 137.0, 136.4, 133.8, 131.8, 131.5, 129.0, 128.6, 127.2, 127.0, 126.6, 126.14, 126.11, 125.7, 125.0, 122.9, 122.7, 115.2, 60.8, 49.1, 43.7, 21.2, 15.9, 14.3, 14.2

[실시예 5] 화힉식 12의 화합물의 제조(공정 E)

실시예 4에서 얻은 화학식 11의 화합물 90 mg을 semiprep 키랄 HPLC 컬럼 (chiralpack AD-H) 을 통해서 표제 화합물인 R-form 인 화힉식 12 화합물과 상응하는 또 다른 이성체인 S-form인 화합물을 각각 45 mg씩 얻었다.

이동상 : 헥산/이소프로필 알콜 : 90/10

flow rate : 3 ml/min

[실시예 6] 화학식 13의 화합물의 제조(공정 F)

실시예 5에서 얻은 화학식 12의 화합물 20 mg (0.04 mmol)을 5% 물을 포함한 아세톤 10 ㎖, 탄산칼륨 127 ㎎(0.9 mmol, 2.3 당량)을 실온에서 잘 섞는다. 브로모아세트산에틸에스테르 67 ㎕(0.6 mmol, 1.5 당량)를 부가하고, 4시간 강렬히 교반하여 준다. 반응 종결 후, 소금 수용액과 에틸아세테이트를 사용하여 추출하고, 황산마그네슘으로 수분을 제거한다. 여과 후, 용매를 감압 증류하고, 잔사를 헥산/에틸아세테이트(v/v = 5:1) 용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 정제를 하여 표제화합물 화학식 13의 화합물을 22 mg(수율 : 95 %)으로 얻었다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl3) : 7.98 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.65 (d, 2H, J = 8.3 Hz), 7.06-7.27 (m, 7H), 6.55 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.59 (s, 2H), 4.53 (dd, 1H, J = 9.7, 5.3 Hz), 4.22 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 3.37 (dd, 1H, J = 13.7, 5.3 Hz), 3.17 (m, 1H) 2.20 (s, 3H), 1.83 (s, 3H), 1.26 (t, 3H, J = 7.2 Hz) ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) : 169.1, 163.6, 156.9, 151.8, 138.3, 137.4, 137.3, 136.4, 133.4, 129.3, 128.9, 128.6, 127.2, 126.8, 126.3, 126.2, 126.1, 125.1, 111.8, 65.9, 61.7, 49.1, 44.4, 16.5, 15.1, 14.5

[실시예 7] 화학식 1의 화합물의 제조(공정 G)

실시예 6에서 얻은 화학식 13의 화합물 20 mg (0.03 mmol)을 에탄올 15 ㎖를 잘 섞은 후, 3 N-수산화나트륨 수용액 15 ㎕를 부가한다. 실온에서 20분 교반 후, 반응이 종결되면 2 N-HCl로 pH를 2.0으로 맞춘다. 에탄올을 감압 증류하여 80%정도 제거하고, 소금 수용액과 에틸아세테이트를 이용하여 추출한 뒤 여과 후, 용매를 감압 증류하고, LH-20 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물을 16 ㎎ (수율 : 98%) 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 7.92 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.50 (s, 1H), 7.59 (d, 2H, J = 8.2Hz), 7.07-7.22 (m, 6H), 6.85(m, 1H), 6.44 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 4.47 (dd, 1H, J = 9.7, 5.4 Hz), 3.39 (dd, 1H, J = 13.8, 5.4 Hz), 3.06 (dd, 1H, J = 13.8, 9.8 Hz), 2.12 (s, 3H), 1.73 (s, 3H) ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃): δ 164.1, 155.7, 151.2, 138.0, 137.9, 137.0, 136.4, 133.8, 131.8, 131.5, 129.0, 128.6, 127.2, 127.0, 126.6, 126.14, 126.11, 125.7, 125.0, 122.9, 122.7, 115.2, 60.8, 49.1, 43.7, 21.2, 15.9, 14.3, 14.2

[시험예 1] (활성 및 독성 시험)

트랜스팩션 어세이(Transfection assay)를 통하여 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물인 R-Form 화합물과 비교예로서 화학식 2의 화합물인 S-Form 화합물의 PPARδ 활성을 측정하였으며, 추가적으로 PPARs의 subtype인 PPARα와 PPARγ에 대한 선택성 실험과, MTT assay를 통한 독성실험, mouse를 이용한 in vivo 활성 및 독성실험을 수행하였다.

[ Transfection assay ]

CV-1세포를 이용하여 assay를 수행하였으며, 세포배양은 5%의 이산화탄소가 포함된 37℃ 배양기에서 10% FBS, DBS(delipidated)와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 넣은 DMEM 배지를 이용하여 96 웰 플레이트에서 수행하였다. 실험은 세포 접종, 트랜스팩션, 개발 물질 처리, 결과 확인의 4단계 나누어 수행하였다. CV-1세포를 96웰 플레이트에 5,000 cell/well로 접종하고, 24시간 후에 트랜스팩션 하였다. full length의 PPARs 플라스미드 DNA와 루시퍼라제 활성(Luciferase activity)을 가지고 있어서 PPARs의 활성을 확인할 수 있는 Reporter DNA, Transfection 효율 정보를 제공해 줄 β-galactosidase DNA를 Transfection Reagent를 이용하여 수행하였다. 화학식 1 화합물과 화학식 2 화합물을 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹였으며, media를 이용하여 다양한 농도로 세포에 처리하였다. 24시간 동안 인큐베이터에서 배양한 후, lysis buffer를 이용하여 세포를 용해하였고, Luminometer와 microplate reader를 이용하여 luciferase와 β-galactosidase 활성을 측정하였다. 측정된 luciferase 값은 β-galactosidase 값을 이용하여 보정하였으며, 이 값을 이용하여 그래프를 그리고, EC₅₀값을 구하였다.

[표 1]

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명에 따른 화학식 1의 유기 황 화합물은 EC₅₀ PPARδ 에 매우 선택적이다. 본 발명에 따른 화학식 1의 티아졸 화합물 은 PPARα, PPARγ에 대하여 100,000배 이상의 선택성을 보였으며, EC₅₀은 PPARδ에 대하여 0.6 nM, 5.1nM의 활성을 나타냈으며, 특히 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물인 R-이성질체는 화학식 2의 S-이성질체에 비해 약 10배의 강한 활성을 나타냈으며, 이는 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물이 선택적 의의를 갖는 것임을 입증한다.

[MTT assay]

본 발명에 따른 물질에 대한 독성 Test는 MTT assay를 이용하였다. MTT는 물에 용해되는 노란색의 물질이나, 살아있는 세포에 유입될 경우 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 물에 용해되지 않는 보라색의 결정으로 변성된다. 이 물질을 디메틸설폭시드에 용해시킨 후, 550 nm에서 흡광도를 측정하면 세포 독성을 확인할 수 있다. 실험방법은 다음과 같다.

먼저 CV-1 세포를 96웰 플레이트에 5,000 cell/well로 접종하였다. 24시간 동안 5%의 이산화탄소가 함유된 가습된 37℃ 배양기에서 배양한 후, 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물과 화학식 2의 화합물을 다양한 농도로 처리하였다. 24시간 동안 배양을 하고, MTT 시약을 넣어주었다. 15분 정도 배양한 후, 생성된 보라색의 결정을 디메틸설폭시드에 용해시킨 다음, microplate reader를 사용하여 흡광도를 측정하였고, 이것으로부터 세포독성을 확인하였다. 실험결과 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물과 또 다른 광학이성체인 화학식 2의 화합물 모두 EC₅₀ 값의 100,000배에 해당하는 농도에서도 독성이 나타나지 않았다.

[독성실험]

본 발명에 따른 물질의 독성을 평가하기 위하여 쥐를 이용한 급성독성 및 생식독성 실험을 진행하였다. 6주령의 ICR 쥐에 화학식 1의 화합물을 50mg/kg, 300mg/kg, 2000mg/kg 용량으로 경구투여한 후 14일 동안 급성독성 여부를 관찰하였다. 그 결과 화학식 1의 화합물은 2000mg/kg 용량에서도 사망예를 전혀 관찰할 수 없었으며, 체중변화, 사료 섭취 및 부검결과에서도 전혀 유의한 이상을 발견할 수 없었다. 또한 C57BL/6 쥐를 이용한 생식독성 실험에서도 화학식 1의 화합물에 의한 독성을 관찰할 수 없었다. 플러그가 확인된 암컷 쥐에 개발물질을 경구투여한 후 태자의 체중 및 성장 속도를 비교한 결과 전혀 유의한 차이를 관찰할 수 없었고, 골 발생 및 질환 등의 문제 역시 나타나지 않았다.

[동물실험]

[비만억제효과 검증]

본 발명에 따른 물질의 비만억제효과를 검정하기 위하여 mouse를 이용한 In vivo 실험을 수행하였다. Mouse는 14주령의 C57BL/6 (SLC Co.)를 이용하였고, 비만을 유도하기 위하여 35%의 지방이 함유된 사료를 사용하였다. 35일 동안 고지방을 섭취시키면서 vehicle, GW501516(10mg/Kg/day), 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1 의 화합물(10mg/Kg/day)을 경구 투여하였다. 결과 vehicle을 투여한 쥐는 체중이 58.9% 증가하였으나, GW501516와 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물을 투여한 쥐의 경우에는 26.5%와 23.1%만이 증가하였다. 이는 vehicle을 투여한 mouse의 체중 증가의 1/2에 해당하는 것으로, 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물이 비만에 대한 강력한 억제 효과가 있음을 확인 할 수 있었으며, 그 효과는 GW501516에 비해 우수하였다.

[당뇨개선효과 검증]

본 발명에 따른 물질의 당뇨개선 효과를 검증하기 위하여 GTT(Glucose Tolerance Test)를 실시하였다. 78일 동안 약물을 경구투여한 쥐에 Glucose (1.5g/Kg)를 복강 투여 후 시간별로 혈당 농도 변화를 확인하였다. 그 결과 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물을 경구 투여한 그룹이 vehicle과 GW501516을 투여한 쥐의 그룹에 비해 공복혈당이 낮은 것을 확인하였다. 또한 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물을 투여한 그룹에서는 20～40분 사이에 혈당이 급속히 감소하였으며, 100분 후에는 glucose clearance가 완벽히 일어났다. 하지만 vehicle을 투여한 쥐의 그룹은 120분 후에도 정상혈당을 유지하지 못하였으며, GW501516을 투여한 쥐의 그룹도 vehicle에 비해 혈당은 낮았으나 정상으로 회복되지는 못하였다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 탁월한 당뇨개선 효과가 있음을 확인하였다.

[고지혈증개선효과 검증]

본 발명에 따른 물질의 고지혈증개선효과를 검증하기 위하여 6주령 C57BL/6 (SLC Co.)를 이용한 in vivo 동물실험을 수행하였다. 고지방 사료를 섭취시키면서 GW501516과 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물을 10mg/Kg/day의 농도로 경구 투여하였다. 6주후 안와채혈을 이용하여 혈액을 채취하였으며, 혈청만을 분리하여 혈중 HDL 농도를 생화학적 방법으로 측정하였다. 그 결과 GW501516을 투여한 그룹에서는 대조군에 비해 36.3%의 HDL이 증가하였으며, 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물을 투여한 그룹에서는 44.6%가 증가하였다. 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물은 GW501516보다 더 효과적으로 혈중 HDL을 증가시키는 것을 확인하였다.

[동맥경화억제효과 검증]

본 발명에 따른 물질의 동맥경화억제효과를 검증하기 위하여 동맥경화질환 동물 모델인 ApoE-/- mouse를 이용한 in vivo 동물실험을 수행하였다. 고지방콜레스테롤 먹이 (20% 지방, 1.25% 콜레스테롤 ; AIN-93G diet)를 섭취시키면서 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물을 2mg/Kg/day의 농도로 경구 투여하였다. 28일 후 Sudan IV를 이용한 동맥 전영역 plaque 염색을 수행하였고, 대조군과의 비교를 통하여 동맥경화 억제효과를 분석하였다. 그 결과 본 발명에 따른 화합물인 화학식 1의 화합물을 투여한 ApoE-/- mouse의 경우에는 대조군에 비해 30%의 동맥경화 억제효과가 확인되었다.

[근 지구력 강화 및 근 기능 증진효과 검증]

본 발명에 따른 물질의 근 지구력 강화 및 근 기능 증진효과를 검증하기 위하여 동물실험을 수행하였다. 근육의 생성은 대부분 발생단계에서 이루어지므로 임신된 쥐에 임신기간, 수유기간, 또는 임신기간 및 수유기간 동안 동시에 화학식 1의 화합물을 10mg/Kg/day 농도로 경구 투여하였다. 대조군과 처리군 태자의 체중이나 성장속도는 차이가 없었으며, 피부 제거 후 근육을 관찰한 결과 처리군이 대조군에 비해 더 붉은 것이 관찰 관찰되었다. ATPase 염색과 면역염색 결과에서도 처리군에서 TypeⅠ근 섬유가 증가한 것이 확인되었다. 이러한 근섬유의 변화가 근 지구력 및 근 기능 개선효과에 미치는 영향을 확인하기 위하여 Treadmill을 이용한 실험을 수행하였다. 그 결과 화학식 1의 화합물을 투여한 쥐의 근 지구력이 현저히 강화되었다.

[표 2] 근 지구력 테스트 결과

또한 본 발명에 따른 물질을 성체에 투여한 경우에도 근 지구력 강화 및 근 기능 증진효과가 입증되었다. 10주령의 C57BL/6 쥐에게 화학식 1의 화합물을 10mg/Kg의 농도로 경구 투여하면서 운동 시켰다. 운동은 30일 동안 하루에 한번, 30분씩 Treadmill을 이용하여 시켰다. 운동 조건은 2 meter/min 속도로 5분, 5 meter/min 속도로 5분, 8 meter/min 속도로 5분, 20 meter/min 속도로 5분 동안 운동시켰다. 실험 종료 시점에서 Treadmill을 이용하여 근 지구력 강화 및 근 기능 증진효과를 테스트 하였다. 그 결과 대조군에 비해 처리군의 운동시간(1.5배) 및 운동거리(1.6배)가 모두 증가하였다.

[기억력 증진 실험]

본 발명에 따른 물질에 대한 기억력 증진에 의한 치매 및 파킨슨병 치료 효과를 검증하기 위하여 동물실험을 수행하였다. 임신된 쥐에 임신기간 및 수유기간 동안 개발 물질을 10mg/Kg 농도로 경구 투여하였다. 대조군과 처리군 사이의 뇌기능 차이를 확인하기 위하여 모리스 물 미로 (Morris water maze) 테스트를 수행하였다. 실험결과 화학식 1의 화합물을 투여한 처리군의 경우 플랫폼을 찾는데 평균 6.8초가 소요되었으나 대조군의 경우에는 24.2초가 소요되었다. 따라서 화학식 1의 화합물은 기억력 증진에 탁월한 효과를 나타내었다.

또한 10 주령의 성체 C57BL/6 쥐를 이용하여 뇌 질환 모델에서 기억력 증진에 의한 치매 및 파킨슨병 치료 효과를 확인해 보았다. 실험 전 스테레오 탁식으로 LPS를 뇌에 주사하여 뇌 질환 동물 모델을 제작하였다. 실험은 본 발명에 따른 물질인 화학식 1의 화합물 투여 여부 및 운동 여부로 나누어 네 개의 그룹으로 수 행하였고, 운동 조건은 2 meter/min 속도로 5분, 5 meter/min 속도로 5분, 8 meter/min 속도로 5분, 20 meter/min 속도로 5분 동안 운동시켰다. 실험 종료 후 모리스 수미로 (Morris water maze) 테스트를 수행하였고, 그 결과는 하기 표 3에 정리하였으며, 화학식 1의 화합물과 운동에 의하여 뇌 질환 모델에서 기억력 증진을 통한 치매 및 파킨슨병 치료 효과가 입증되었다.

[표 3] 수미로 테스트 결과

Claims

하기 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.

[화학식 1]
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 동맥경화증 또는 고지혈증 치료 및 예방을 위한 의약 조성물.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 고밀도 콜레스테롤을 높이기 위한 의약 조성물.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 당뇨병 치료 및 예방을 위한 의약 조성물.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 비만 치료 및 예방을 위한 의약 조성물.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 근육강화 또는 지구력 증진을 위한 의약 조성물.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 기억력 증진, 치매 또는 파킨슨병 치료 및 예방을 위한 의약 조성물.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 건강식품 보조제 또는 건강음료.
제 8항에 있어서,

상기 건강식품 보조제 또는 건강음료는 동맥경화증 또는 고지혈증 개선 및 예방; 고밀도 콜레스테롤 증진; 당뇨병 개선 및 예방; 비만 개선 및 예방; 근육강화 또는 지구력 증진; 기억력 증진, 치매 또는 파킨슨병 개선 및 예방;을 위한 것을 특징으로 하는 건강식품 보조제 또는 건강음료.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 식품첨가물.
제 10항에 있어서,

상기 식품첨가물은 동맥경화증 또는 고지혈증 개선 및 예방; 고밀도 콜레스테롤 증진; 당뇨병 개선 및 예방; 비만 개선 및 예방; 근육강화 또는 지구력 증진; 기억력 증진, 치매 또는 파킨슨병 개선 및 예방;을 위한 것을 특징으로 하는 식품첨가물.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 동물용 사료 조성물.
제 12항에 있어서,

상기 동물용 사료 조성물은 동맥경화증 또는 고지혈증 개선 및 예방; 고밀도 콜레스테롤 증진; 당뇨병 개선 및 예방; 비만 개선 및 예방; 근육강화 또는 지구력 증진; 기억력 증진, 치매 또는 파킨슨병 개선 및 예방;을 위한 것을 특징으로 하는 동물용 사료 조성물.
제 1항의 화학식 1의 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 기능성 화장품 조성물.
제 14항에 있어서,

상기 기능성 화장품 조성물은 비만 예방 및 개선; 근육강화 또는 지구력 증진을 위한 것을 특징으로 하는 기능성 화장품 조성물.
제 1항의 화학식 1로 표시되는 티아졸 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하는 퍼록시솜 증식자 활성화 수용체 δ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor δ: PPARδ)의 활성화제 조성물.