KR20080036244A - 임파구계 혈구계 세포에 유전자 도입을 위한 프로모터 및그의 이용 방법 - Google Patents

임파구계 혈구계 세포에 유전자 도입을 위한 프로모터 및그의 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 임파구와 같은 면역적격 세포 및/또는 혈구계 세포 내에서 선택적이고 강한 발현을 유도하기 위한 프로모터를 제공한다. 본 발명의 목적은 HHV6 MIE 프로모터, HHV7 MIE 프로모터 및 HHV7 U95 프로모터가 T 임파구와 같은 면역적격 세포 및/또는 혈구계 세포 내에서 특이적 발현을 유도함을 발견함으로서 달성되었다. 상기 프로모터를 이용함으로서 DNA 백신 등의 선택적 전달이 실현될 수 있다.
Figure P1020087007967
임파구, 면역적격 세포, 혈구계 세포, 발현, 유도, 프로모터, DNA 백신

Description

임파구계 혈구계 세포에 유전자 도입을 위한 프로모터 및 그의 이용 방법 {Promoter for introducing a gene into a lymphocyte or blood cell and application thereof}
본 발명은 임파구계 혈구계 세포에 유전자 도입을 위한 프로모터 및 그의 이용 방법에 관한 것이다.
임파구 세포를 표적으로 하는 각종 질환 예를 들면 백혈병, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 감염의 치료를 위해서 임파구 세포에 대한 유전자 치료를 행하는 기술의 확립이 요망되고 있다. 그러나 임파구 세포에 원하는 유전자를 도입하기 위한 프로모터가 충분히 개발되어 있지 않다.
헤르페스바이러스(Herpesvirus)는 헤르페스비리대과에 속하는 바이러스를 총칭하는 것이다. 헤르페스바이러스 6 또는 7(HHV-6 또는 HHV-7)은 헤르페스비리대과 β 서브패밀리에 속하는 이중가닥 DNA를 지니는 바이러스이다. 또한 돌발성 발진(Exanthom subitum)의 원인 바이러스이다(비 특허문헌 1 및 비 특허문헌 2). HHV-6에는 HHV-6A 및 HHV-6B의 두 종류의 바이러스주가 존재한다. 유아기 환자의 있어서는 대부분 돌발적인 고열과 해열전 후의 발진을 특징으로 하는 바이러스 감염증이고 예후는 일반적으로 양호하다. HHV-7은 HHV-6보다 뒤늦게 감염되는 경향이 있다(비 특허문헌 3). 따라서 HHV-7에 의한 돌발성 발진은 임상적으로는 2단계의 돌발성 발진으로써 경험되는 것이 다수이다. HHV-6, HHV-7의 혈청 역학조사에 따르면 2∼3세 정도의 소아에 항체 양성반응을 통해 판명되고 불현성 감염도 20∼40% 정도로 보고되고 있다.
HHV-7은 1990년 Frenkel등이 건강한 사람의 말초 혈액의 CD4+ T임파구를 배양할 때 세포 변성효과가 야기됨을 통해 새로이 발견한 헤르페스바이러스이다(비 특허문헌 4). 인간말초혈액 단핵세포로부터 분리된 바이러스이고 HHV-6, HHV-7은 모두 CD4+ T임파구 성향의 바이러스이다. HHV-7이 감염될 때 세포내의 리셉터는 CD4이고 인간 T임파구에 있어서 그의 증식이 가능하다. 따라서 인간 T임파구의 유전자 변형에 사용할 수 있는 바이러스이다.
HHV-7의 게놈은 이중가닥 DNA이고 약 145kbp이다. 전체 염기 서열은 Nicholas에 의해 결정되었고 게놈상의 적어도 101개의 유전자가 존재하는 것으로 알려지고 있다(비 특허문헌 5).
그러나 HHV에 있어서는 그의 프로모터 활성에 관한 상세한 해석은 되어있지 않다. 또한 바이러스가 임파구 지향성은 세포 측의 리셉터와의 상호작용에 의한 것이고, 인간 T임파구에 있어서만 증식 가능한 것은 라이프 싸이클에 기인하는 것이다.
또한 이 바이러스 특히 HHV-7 바이러스는 정상인에게는 아무런 해를 끼치지 않고 따라서 바이러스 자체를 사용하여도 변이 등에 의한 유해성을 지니지 않는다. 이 특성을 이용하여 안전성을 증진시킨 발현계의 개발이 요망되고 있다. 또한 백신으로서 사용하는 경우 그 계대배양을 통해 유전자형을 변화시킬 수 있기 때문에 품질관리 및 품질보증 면에서 적합하지 않다. 따라서 백신으로서 재조합 바이러스를 사용하는 경우에는 단일 재조합 유전자 유래의 바이러스를 안정하게 공급할 필요가 있다. 또한 단일 유전자형을 지닌 시스템의 개발이 요망된다.
더욱이 T 임파구 세포주 Sup T1 세포에 있어서 HIV 감염과 T 임파구 지향 인간 헤르페스 바이러스(HHV-6A (U1102주), HHV-7 (MRK,MOS주))와의 상호관계를 검토하고 있다. CD4가 세포 측의 리셉터인 HHV-7주는 Sup T1 세포에 양호하게 증식하지만 감염에 의한 Sup T1/HIV 세포는 성립되지 않는다. 이에 반해 HHV-6A 바이러스주는 HIV 지속 감염 세포주 Sup T1(Sup-T1/HIV)를 감염시켜 명료한 CPE를 확인할 수 있다(비 특허문헌 6).
이상적인 HIV 백신은 모든 형태의 HIV에 대해 장기적인 보호를 나타낼 수 있는 것이다. 종래의 불활성화 HIV 백신의 이점 및 단점을 설명하면 다음과 같다. 재조합 백신의 제조 방법은 통상 면역원성을 유지하는 것이 곤란하기 때문에(낮은 면역원성 때문에) 높은 항원 접종, 빈번한 접종이 요구된다. 따라서 그 안전성이 최대의 관심사이다. 또한 야생의 또는 재조합 서브유니트 등을 포함하는 서브유니트 백신은 안전한 것으로 인정되지만 서브유니트 선택 및 면역원성이 낮아지는 문제가 있다. 이러한 HIV 백신 등의 면역담당 세포의 처치에 사용 가능한 백신을 개발하는 것이 요망된다.
비 특허문헌 1 : Yamanishi K 등 "Identification of human herpesvirus 6 as a casual agent for exanthem subitum." Lancet 1988;i: 1065∼1067
비 특허문헌 2 : Tanaka K 등 "Human herpesvirus 7: Another casual agent for roseola(exanthem subitum)" J pediatr. 1994;125:1∼5
비 특허문헌 3 : Tananaka-Taya K 등 "Seroepidemiological study of human herpesvirus-6 and -7 in children of different ages and detection of those two viruses in throat swabs by polymerase chain reaction" Journal of Medical Virology. 1996;48:88∼94
비 특허문헌 4 : Frankel N 등 " Isolation of a new herpesvirus from human CD4+T cells" ProNAS USA 87:749-752, ProNAS USA 87:749-752,1990
비 특허문헌 5 : John N. 등, Journal of Virology, Sep. 1996, 5975∼5989
비 특허문헌 6 : 야마다마사오 등 "HIV 지속감염 Sup-T1세포에의 HHV-6 및 HHV-7 중복 감염 시험" 연제번호 122, 제 7회 일본 에이즈학회 총회 연제 초록집 1993 동경
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 임파구 등의 면역 담당 세포, 혈구계 세포에 있어서 선택적으로 강력하게 발현을 유도하는 프로모터를 제공하는 것을 과제로 한다.
과제를 해결하고자 하는 수단
상기 과제는 본 발명에 있어서 HHV 6의 MIE 프로모터, HHV 7 MIE 프로모터 및 HHV 7 U95 프로모터가 예상외의 T 임파구 등의 면역 담당 세포, 혈구계 세포에 있어서 특이적인 발현을 유도하는 것을 발견함에 따라 해결한 것이다.
신규한 기술로서 인정된 DNA 백신의 개발에 있어서는 강력한 발현 프로모터를 필요로 한다. 현재까지 사례는 인간 싸이토메가로바이러스(HCMV)의 초기(IE) 프로모터가 DNA 백신에 사용되고 있다. 이 근거는 HCMVIE 프로모터가 일반적으로 각종 세포에 있어서 강력한 활성을 나타내는 것으로 여겨지기 때문이다. 그러나 임파구계 세포 내의 발현 효율이 낮아 메틸화에 의한 불활성화 등의 현상이 발견되고 있으며 또한 HHV IE 프로모터의 DNA 백신의 이용에 있어서는 각종의 제약이 있어 현실화에 문제가 있다.
HCMV는 감염 가능한 세포가 특수한 경우에 한해 섬유아세포 및 혈관 내피 세포등을 감염시키는 것으로 알려져 있다. 한편 HHV-6은 인간 유아기에 감염되어 돌발성 발진을 유발시키는 것으로 규명되어 있고 인간 임파구 세포 특히 세포에 우수한 증식을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 본 발명에 있어서 HCMV와 동일한 인간 헤르페스바이러스속 β바이러스에 속하는 HHV-6의 주요 전초기유전자(MIE)의 프로모터가 강한 활성을 지님을 발견하였다. 본 발명자들은 이 MIE 유전자 프로모터의 DNA 백신의 이용 가능성을 규명한 것이다. HHV-7은 CD4+ T임파구 지향성 바이러스이고 그 프로모터를 이용하여 예를 들면 DNA 백신을 개발한다면 CD4+ T임파구에 관한 질병을 예방하거나 치료에 응용가능 할 것이다. 본 발명자들은 HHV 7 MIE 프로모터 및 HHV 7 U95 프로모터의 유용성을 규명하였으며 이에 따라 DNA 백신에도 이용가능함을 규명하였다.
따라서 본 발명은 다음과 같은 사항을 제공한다.
(1) HHV 6B MIE 프로모터
(2) 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 1항목의 프로모터
(3) 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열 내에 적어도 R3 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 제 1항목의 프로모터
(4) 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열 내에 전사 개시점으로부터 -574 ∼ -427 (서열번호 13) 서열을 포함하는 제 1항목의 프로모터
(5) 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열 내에 전사 개시점으로부터 -1051 ∼ -427 (서열번호 14) 서열을 포함하는 제 1항목의 프로모터
(6) 상기 프로모터는 NF-κB 및 AP-1 모티프를 포함하는 제 1항목의 프로모터
(7) 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열을 포함하는 제 1항목의 프로모터
(8) 상기 프로모터는 (a)서열 번호 1로 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 1로 기재된 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드에 혼성화 되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; 또는 (d) (a)내지 (c)중 하나의 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에 70% 이상의 상동성을 지니는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 1항목의 프로모터
(9) 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 지닌 제 1항목의 프로모터
(10) 상기 생물학적 활성은 프로모터 활성인 제 8항목의 프로모터
(11) 제 1항목의 프로모터를 지닌 핵산 구축물(construct)
(12) 상기 프로모터와 다른 유래의 외래 유전자를 코드화하는 서열을 상기 프로모터 서열에 대해 작동 가능하게 연결시킨 것을 포함하는 제 11항목의 핵산 구축물
(13) 상기 외래 유전자는 RNAi 분자, 약제, 결손된 열성 유전자, 선택마커를 코드화하는 항목 12의 핵산 구축물
(14) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주의 배지에서 선택 가능한 항목 13의 핵산 구축물
(15) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에서 눈으로 선택 가능한 항목 13의 핵산 구축물
(16) 상기 선택 마커는 히포산틴 구아닌 포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt) 또는 녹색형광단백질(GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(dsRed)로 구성된 군에서 선택된 형광 단백질을 포함하는 항목 13의 핵산 구축물
(17) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에 대해 실질적으로 독성을 나타내지 않는 항목 13의 핵산 구축물
(18) 상기 결손된 열성 유전자는 ADA 유전자, PNP 유전자, γc체인유전자, TAP 유전자, MHC Ⅱ유전자, X연쇄WASP, CD40 리간드, PI3K 유사유전자 및 DNA 헬리카제로 이루어진 군에서 선택되는 항목 13의 핵산 구축물
(19) 상기 약제는 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 단백직호르몬, 펩티드호르몬(예를 들면 인터페론α, 인터페론γ, 인터루킨IL-2, IL-12, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF))으로 이루어진 군에서 선택되는 항목 13의 핵산 구축물
(20) 상기 프로모터는 상기 외래 유전자의 혈구계 세포 특히 T 임파구에 특이적 발현을 유도하는 항목 12의 핵산 구축물
(21) 항목 11의 핵산 구축물을 포함하는 발현 벡터
(22) 항목 11의 핵산 구축물을 포함하는 세포
(23) 상기 세포는 상기 프로모터 서열과는 다른 종인 항목 22의 세포
(24) 항목 11의 핵산 구축물을 포함하는 조직
(25) 항목 11의 핵산 구축물을 포함하는 장기
(26) 항목 11의 핵산 구축물을 포함하는 생물
(27) 항목 1의 프로모터 및 항원을 코드화하는 서열을 지닌 약학적 조성물
(28) DNA 백신인 항목 27의 약학적 조성물
(29) 임파구 특이적인 처리가 필요한 질환, 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 항목 1의 프로모터 및 상기 처치를 위한 핵산 서열을 포 함하는 약학적 조성물
(30) 상기 처치를 위한 핵산 서열은 사이토카인을 코드화하는 핵산 서열, 케모카인을 코드화하는 핵산 서열, 성장인자를 코드화하는 핵산 서열, 단백질 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 펩타이드 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 리보자임, RNAi(HIV-1 gp41: AATAAGACAGGGCTTGGAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(서열 번호 33)/HIV-1 tat: AAGCATCCAGGAAGTCAGCCTACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(서열 번호 34)/HTLV-1 tax: GAACATTGGTGAGGAAGGCACAGCCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT(서열 번호 35))를 포함하는 항목 29의 약학적 조성물
(31) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 방법에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(32) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(33) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(34) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또 는 상태를 처치 또는 예방하는 방법에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(35) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(36) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(37) 단백질을 생산하는 방법에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(38) 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키 는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(39) 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 항목 1의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(40) 임파구 특이적인 처치를 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 항목 1의 프로모터의 사용
(41) HHV 7 MIE 프로모터
(42) 상기 프로모터는 서열 번호 2로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 41항목의 프로모터
(43) 상기 프로모터는 서열 번호 2로 표시되는 서열 내에 적어도 R2 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 제 41항목의 프로모터
(44) 상기 프로모터는 서열 번호 2로 표시되는 서열 내에 +22 ∼ -233 서열을 포함하는 제 41항목의 프로모터
(45) 상기 프로모터는 서열 번호 2로 표시되는 서열 내에 +22 ∼ -388 서열을 포함하는 제 41항목의 프로모터
(46) 상기 프로모터는 R2 영역에 존재하는 NF-κB 결합 모티프를 포함하는 제 41항목의 프로모터
(47) 상기 프로모터는 서열 번호 15로 표시되는 서열을 포함하는 제 41항목의 프로모터
(48) 상기 프로모터는 (a)서열 번호 2로 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하 는 염기 서열 또는 그의 단편 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 2로 기재된 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드에 혼성화되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; 또는 (d) (a)내지 (c)중 하나의 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에 70% 이상의 상동성을 지니는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 41항목의 프로모터
(49) 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 지닌 제 41항목의 프로모터
(50) 상기 생물학적 활성은 프로모터 활성인 제 48항목의 프로모터
(51) 제 41항목의 프로모터를 지닌 핵산 구축물(construct)
(52) 상기 프로모터와 다른 유래의 외래 유전자를 코드화하는 서열을 상기 프로모터 서열에 대해 작동 가능하게 연결시킨 것을 포함하는 제 51항목의 핵산 구축물
(53) 상기 외래 유전자는 RNAi 분자, 약제, 결손된 열성 유전자, 선택마커를 코드화하는 항목 52의 핵산 구축물
(54) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주의 배지에서 선택 가능한 항목 53의 핵산 구축물
(55) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에서 눈으로 선택 가능한 항목 53의 핵산 구축물
(56) 상기 선택 마커는 히포산틴 구아닌 포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt) 또는 녹색형광단백질(GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(dsRed)로 구성된 군에서 선택된 형광 단백질을 포함하는 항목 53의 핵산 구축물
(57) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에 대해 실질적으로 독성을 나타내지 않는 항목 53의 핵산 구축물
(58) 상기 결손된 열성 유전자는 ADA 유전자, PNP 유전자, γc체인유전자, TAP 유전자, MHC Ⅱ유전자, X연쇄WASP, CD40 리간드, PI3K 유사유전자 및 DNA 헬리카제로 이루어진 군에서 선택되는 항목 53의 핵산 구축물
(59) 상기 약제는 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 단백직호르몬, 펩티드호르몬(인터페론α, 인터페론γ, 인터루킨IL-2, IL-12, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF))으로 이루어진 군에서 선택되는 항목 53의 핵산 구축물
(60) 상기 프로모터는 상기 외래 유전자의 혈구계 세포 특히 T 임파구에 특이적 발현을 유도하는 항목 52의 핵산 구축물
(61) 항목 51의 핵산 구축물을 포함하는 발현 벡터
(62) 항목 51의 핵산 구축물을 포함하는 세포
(63) 상기 세포는 상기 프로모터 서열과는 다른 종인 항목 62의 세포
(64) 항목 51의 핵산 구축물을 포함하는 조직
(65) 항목 51의 핵산 구축물을 포함하는 장기
(66) 항목 51의 핵산 구축물을 포함하는 생물
(67) 항목 41의 프로모터 및 항원을 코드화하는 서열을 지닌 약학적 조성물
(68) DNA 백신인 항목 67의 약학적 조성물
(69) 임파구 특이적인 처리가 필요한 질환, 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 항목 41의 프로모터 및 상기 처치를 위한 핵산 서열을 포함하는 약학적 조성물
(70) 상기 처치를 위한 핵산 서열은 사이토카인을 코드화하는 핵산 서열, 케모카인을 코드화하는 핵산 서열, 성장인자를 코드화하는 핵산 서열, 단백질 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 펩타이드 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 리보자임, RNAi(HIV-1 gp41: AATAAGACAGGGCTTGGAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(서열 번호 33)/HIV-1 tat: AAGCATCCAGGAAGTCAGCCTACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(서열 번호 34)/HTLV-1 tax: GAACATTGGTGAGGAAGGCACAGCCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT(서열 번호 35))를 포함하는 항목 69의 약학적 조성물
(71) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 방법에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(72) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서 열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(73) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(74) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 방법에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(75) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(76) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(77) 단백질을 생산하는 방법에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(78) 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(79) 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 항목 41의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(80) 임파구 특이적인 처치를 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 항목 41의 프로모터의 사용
(81) HHV 7 U 95 프로모터
(82) 상기 프로모터는 서열 번호 12로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 81항목의 프로모터
(83) 상기 프로모터는 서열 번호 12로 표시되는 서열 내에 적어도 R2 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 제 81항목의 프로모터
(84) 상기 프로모터는 서열 번호 12로 표시되는 서열 내에 +16 ∼ -304 서열을 포함하는 제 81항목의 프로모터
(85) 상기 프로모터는 서열 번호 12로 표시되는 서열 내에 +16 ∼ -379 서열을 포함하는 제 81항목의 프로모터
(86) 상기 프로모터는 R2 영역에 존재하는 NF-κB 결합 모티프를 포함하는 제 81항목의 프로모터
(87) 상기 프로모터는 서열 번호 16로 표시되는 서열을 포함하는 제 81항목의 프로모터
(88) 상기 프로모터는 (a)서열 번호 12로 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 12로 기재된 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드에 혼성화되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; 또는 (d) (a)내지 (c)중 하나의 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에 70% 이상의 상동성을 지니는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제 81항목의 프로모터
(89) 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 지닌 제 81항목의 프로모터
(90) 상기 생물학적 활성은 프로모터 활성인 제 88항목의 프로모터
(91) 제 81항목의 프로모터를 지닌 핵산 구축물(construct)
(92) 상기 프로모터와 다른 유래의 외래 유전자를 코드화하는 서열을 상기 프로모터 서열에 대해 작동 가능하게 연결시킨 것을 포함하는 제 91항목의 핵산 구축물
(93) 상기 외래 유전자는 RNAi 분자, 약제, 결손된 열성 유전자, 선택마커를 코드화하는 항목 92의 핵산 구축물
(94) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주의 배지에서 선택 가능한 항목 93의 핵산 구축물
(95) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에서 눈으로 선택 가능한 항목 93의 핵산 구축물
(96) 상기 선택 마커는 히포산틴 구아닌 포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt) 또는 녹색형광단백질(GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(dsRed)로 구성된 군에서 선택된 형광 단백질을 포함하는 항목 93의 핵산 구축물
(97) 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에 대해 실질적으로 독성을 나타내지 않는 항목 93의 핵산 구축물
(98) 상기 결손된 열성 유전자는 ADA 유전자, PNP 유전자, γc체인유전자, TAP 유전자, MHC Ⅱ유전자, X연쇄WASP, CD40 리간드, PI3K 유사유전자 및 DNA 헬리카제로 이루어진 군에서 선택되는 항목 93의 핵산 구축물
(99) 상기 약제는 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 단백질 호르몬, 펩티드호르몬(인터페론α, 인터페론γ, 인터루킨IL-2, IL-12, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF))으로 이루어진 군에서 선택되는 항목 93의 핵산 구축물
(100) 상기 프로모터는 상기 외래 유전자의 혈구계 세포 특히 T 임파구에 특이적 발현을 유도하는 항목 92의 핵산 구축물
(101) 항목 91의 핵산 구축물을 포함하는 발현 벡터
(102) 항목 91의 핵산 구축물을 포함하는 세포
(103) 상기 세포는 상기 프로모터 서열과는 다른 종인 항목 102의 세포
(104) 항목 91의 핵산 구축물을 포함하는 조직
(105) 항목 91의 핵산 구축물을 포함하는 장기
(106) 항목 91의 핵산 구축물을 포함하는 생물
(107) 항목 81의 프로모터 및 항원을 코드화하는 서열을 지닌 약학적 조성물
(108) DNA 백신인 항목 107의 약학적 조성물
(109) 임파구 특이적인 처리가 필요한 질환, 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 항목 81의 프로모터 및 상기 처치를 위한 핵산 서열을 포함하는 약학적 조성물
(110) 상기 처치를 위한 핵산 서열은 사이토카인을 코드화하는 핵산 서열, 케모카인을 코드화하는 핵산 서열, 성장인자를 코드화하는 핵산 서열, 단백질 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 펩타이드 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 리보자임, RNAi(HIV-1 gp41: AATAAGACAGGGCTTGGAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(서열 번호 33)/HIV-1 tat: AAGCATCCAGGAAGTCAGCCTACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(서열 번호 34)/HTLV-1 tax: GAACATTGGTGAGGAAGGCACAGCCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT(서열 번호 35))를 포함하는 항목 109의 약학적 조성물
(111) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 방법에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코 드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(112) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(113) 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(114) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 방법에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(115) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(116) 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또 는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(117) 단백질을 생산하는 방법에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
(118) 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
(119) 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 항목 81의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
(120) 임파구 특이적인 처치를 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 항목 81의 프로모터의 사용
이하 본 발명에 바람직한 실시태양을 설명한다. 당업자는 본 발명의 설명 및 당분야에 있어서 주지관용 기술로부터 실시태양 등을 편의에 따라 실시 할 수 있고 본 발명의 작용 및 효과를 용이하게 이해 할 수 있을 것으로 판단된다.
발명의 효과
본 발명에 있어서 임파구 등의 면역 담당 세포에 있어서 단백질의 발현을 선택적으로 유도하는 프로모터가 제공된다. 본 발명의 프로모터를 이용하여 선천성 면역 부전 증후군 등의 면역 질환을 효과적으로 예방하거나 치료할 수 있는 방법 및 의약이 제공된다. 본 발명은 또한 효율적으로 유전자 치료를 행할 수 있는 기술을 제공한다.
이하, 본 발명의 바람직한 형태를 설명한다. 본 명세서의 전체에 있어서 단수형 표현은 특히 언급하지 않으면 그 복수형 개념을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서 단수형의 관사는 특히 언급하지 않는 한 복수형의 개념을 포함한다. 한편 본 명세서에 있어서 사용하는 용어는 특히 언급하지 않는 한 해당 분야의 통상의 의미를 지닌 것으로 이해된다. 다른 정의가 없는 한 본 명세서 중에 사용되는 전반적인 전문 용어 및 과학기술 용어는 본 발명의 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 지닌다. 모순되는 경우 본 명세서(정의를 포함)가 우선된다.
(정의)
이하 본 명세서에 있어서 특별히 사용되는 용어를 정의한다.
본 명세서에 있어서 사용되는 'HHV'는 인간 헤르페스 바이러스이다. 그 타입에 따라 제 1형, 제 2형, 제 3형, 제 4형, 제 5형, 제 6형, 제 7형 및 제 8형이 존재한다.
본 명세서의 있어서 사용되는 경우, 용어 '헤르페스 바이러스'는 HHV-6A, HHV-6B 및 HHV-7 의 전부를 포함한다. 특히 언급하지 않는 한 이 바이러스의 야생형 재조합형을 모두 포함한다. 또한 본 명세서에 사용되는 경우, 용어 'HHV-6'은 HHV-6A 및 HHV-6B를 포함한다. 특히 언급하지 않는 한 이 바이러스는 야생형, 재조합형을 모두 포함한다. 사이토메갈로바이러스 HHV-5와 같은 β서브지니어스에 속하는 HHV-6은 돌발성 발진의 원인 바이러스이고 일본에서는 대부분 2세 이하의 유아에서 감염되고 있다. 본 명세서에 있어서 사용되는 경우, 용어 'HHV-7'은 이 헤르페스바이러스에 속하는 임의의 헤르페스바이러스를 의미한다. HHV-7도 돌발성 발진의 병원체이지만 HHV-6B에 비해 그 빈도가 적고 감염되는 연령도 높다. HHV-6과 동일한 β서브지니어스에 속한다. CD4+ T세포에 감염되어 장미색 비강진(pityriasis rosea)의 발병과 관련되어 있으며 일본인에서는 2세 미만에서 대부분 감염되고 있다.
본 명세서에 있어서 헤르페스 바이러스의 야생주는 인공적인 개변을 시키지 않은 천연으로부터 분리된 헤르페스 바이러스주이다. 야생주의 예로서는 JI주가 열거되고 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 HHV-6A의 야생주는 인공적인 개변을 시키지 않은 천연으로부터 분리된 HHV-6A주이다. 야생주의 예로서는 U1102주가 열거되고 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 변이주는 야생주의 바이러스주에 변이유도 다수의 계대배양 등에 의해 변이 유발시킨 헤르페스 바이어스주이다. 헤르페스 바이러스주에 변이 유발하는 경우 그 변이 유발은 랜덤한 변이 도입 또는 자리지정 변이 도입 등이 있다.
본 명세서에 있어서 HHV-6B 야생주는 인공적인 인공적인 개변을 시키지 않은 천연으로부터 분리된 HHV-6B주이다. 야생주의 예로서는 HST주가 열거되고 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 사용되는 용어, '단백질','폴리펩타이드','올리고펩타이드','펩타이드'는 본 명세서에 있어서 동일한 의미를 지닌 것으로 사용되고 임의의 길이를 지닌 아미노산의 폴리머이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '폴리뉴클레오티드','올리고뉴클레오티드','핵산'은 본 명세서에 있어서 동일한 의미를 지닌 것으로 사용되고 임의의 길이를 지닌 뉴클레오티드의 폴리머이다. 특별히 언급하지 않는 한 특정 핵산 서열은 명시적으로 나타난 서열과 동일하고 그의 보존적으로 개변시킨 개변체(예를 들면 축중코돈치환체) 및 상부서열을 포함하는 것으로 의미한다. 구체적으로는 축중코돈 치환체는 하나 또는 그 이상의 선택된 코돈의 3번째 위치가 혼합염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 작성하는 것에 의해 달성된다(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081(1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994)).
본 명세서에 있어서 '유전자'는 유전형질을 규정하는 인자를 말한다. 통상 염색체위에 일정한 순서의 배열이다. 단백질의 일차구조를 규정하는 유전자를 구조유전자라고 한다. 이 발현을 좌우하는 영역을 조절 엘레멘트라 한다. 본 명세서에는 '유전자'는 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산 등으로 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 및 펩타이드를 생성하는 것이다. 본 명세서에 있어서 유전자의 '오픈리딩플레임' 또는 ORF는 유전자의 염기서열을 3부분의 염기 구획으로 나눌 때 그 중 하나이며 개시코돈을 지니고 그 사이에 종료코돈이 존재하지 않는 정도의 길이를 지닌 것이다. 실질적으로 단백질을 코드화하는 가능성이 있는 부분이다. 헤르페스 바이러스는 그 전체 염기배열이 결정되어 있으며 적어도 101개의 유전자가 발견되었고 그 유전자 각각은 오픈리딩플레임(ORF)를 지닌 것으로 알려져 있다.
본 명세서에 있어서 'RNAi'는 RNA 간섭(interference)의 약자이다. 이중가닥 RNA(dsRNA라 칭함)같은 RNAi를 유발시키는 인자를 세포에 도입하는 것에 의해 상동성을 지닌 mRNA가 특이적으로 분해되어 유전자 산물의 합성이 억제되는 현상 및 그에 관한 기술을 의미한다. 본 명세서에 있어서 RNAi는 경우에 따라 RNAi를 유발시키는 인자와 동일한 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서 'RNAi를 유발시키는 인자'는 RNAi를 유발시킬 수 있는 임의의 인자이다. 본 명세서에 있어서 유전자에 대해 RNAi를 유발시키는 인자는 그 유전자에 관한 RNAi를 유발시키고 RNAi에 따른 효과(예를 들면 그 유전자의 발현 억제 등)가 달성되는 것을 의미한다. 이와 같은 RNAi를 유발시키는 인자로서는 예를 들면 표적유전자의 핵산서열의 일부에 대해 적어도 약 70%의 상동성을 지닌 서열 또는 엄격한 조건하에서 하이브리다이즈될 수 있는 서열을 포함한다. 적어도 10 뉴클레오티드 길이의 이중가닥 부분을 포함하는 RNA 또는 그의 개변체가 열거되나 이것에 한정하는 것은 아니다. 여기에 그 인자는 바람직하게는 3'돌출 말단을 포함하는 것이 바람직하다. 3'돌출 말단은 2 뉴클레오티드 길이 이상의 DNA(예를 들면 2 내지 4 뉴클레오티드 길이)이다.
RNAi가 작동되는 기구를 살펴보면 다음과 같다. dsRNA와 같은 RNAi를 유발시키는 분자를 세포에 도입시키고 비교적인 (예를 들면 40염기 이상) RNA의 경우 헬리카제 도메인을 지닌 다이서(Dicer)를 칭하는 RAaseⅢ 등의 뉴클레아제가 ATP 존재 하에서 그 분자를 3'말단으로부터 약 20염기 인터벌로 절단시키고 짧은 사슬 dsRNA(siRNA라 칭함)을 생성시킨다. 본 명세서에 있어서 'siRNA'는 short interfering RNA의 약칭이다. 인공적으로 화학 합성되거나 생화학적으로 합성할 수 있으며 또는 생물체내에서 합성될 수 있다. 또는 약 40 염기 이상의 이중가닥 RNA가 체내에서 분해되어 10 염기 이상의 짧은 사슬 이중가닥 RNA로 된다. 통상 5'인산, 3'-OH의 구조를 지니고 3'말단은 약 2 염기로 돌출되어있다. 이 siRNA에 특이적인 단백질이 결합되어 RISC(RNA-induced-silencing-complex)가 형성된다. 이 복합체는 siRNA와 동일한 서열을 지닌 mRNA를 인식하여 결합시키고 RAaseⅢ 등의 효소 활성에 의해 siRNA의 중앙부에서 mRNA를 절단한다. siRNA의 서열과 표적으로서 절단하는 mRNA의 서열의 관계에 있어서는 100% 일치하는 것이 바람직하다. 그러나 siRNA 중앙부로부터 바깥 위치에 있는 염기의 변이에 있어서는 완전하게 RNAi에 의해 절단활성이 없어지지 않기 때문에 부분적인 활성이 잔존한다. 한편 siRNA 중앙부의 염기의 변이는 영향이 크기 때문에 RNAi에 의해 mRNA의 절단활성이 매우 저하된다. 이와 같은 성질을 이용하여 변이를 지닌 mRNA에 있어서는 그 변이를 중앙에 배치시킨 siRNA를 합성하고 세포내에 도입하는 것으로 특이적인 변이를 포함한 mRNA로 분해할 수 있다. 따라서 본 발명에서는 siRNA 및 RNAi를 유발시키는 인자로서 사용하는 것이 가능하다. siRNA를 생성하는 인자(예를 들면 대표적으로 약 40 염기 이상의 dsRNA)를 사용하는 것이 가능하다.
한편 siRNA는 상기 경로와는 별도로 siRNA의 안티센스 사슬이 mRNA에 결합하여 RNA 의존성 RNA 폴리머라제(RdRP)의 프라이머로써 작용한다. dsRNA가 합성되고 이 dsRNA가 다시 다이서 기질로 되어 새로운 siRNA가 생성되는 작용을 증폭하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명에서는 siRNA 자체 및 siRNA를 생성할 수 있는 인자가 유용하다. 실제로 곤충 등에 있어서는 예를 들면 35 분자의 dsRNA 분자가 1000 카피 이상인 세포내의 mRNA를 완전히 분해할 수 있기 때문에 siRNA 자체 및 siRNA를 생성할 수 있는 인자가 유용한 것으로 이해된다.
본 발명에 있어서 siRNA로 호칭되는 것은 약 20 염기 내외(예를 들면 대표적으로 약 21 내지 23 염기 길이) 또는 그 미만의 길이를 지닌 이중가닥 RNA를 사용할 수 있다. 이와 같은 siRNA는 세포에 발현하는 것에 의해 유전자 발현을 억제시키고 이 siRNA의 표적이 되는 병원유전자의 발현을 억제시키기 때문에 환자의 치료, 예방, 예후 등에 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 siRNA는 RNAi를 유발시키는 것이며 특별히 한정하는 것은 아니고 여러 가지 형태를 채택할 수 있다.
또 다른 실시태양에 있어서 본 발명의 RNAi를 유발시키는 인자는 3'말단에 돌출부를 지닌 짧은 헤어스핀 구조(shRNA; short hairspin RNA)이다. 본 명세서에 있어서 'shRNA'는 단일가닥 RNA에 부분적으로 회문상(palindromic) 염기 서열을 지닌 것이 바람직하나 분자 내에 이중가닥 구조일 수도 있고 헤어핀과 같은 구조로 된 약 20 염기 이상의 분자일 수 있다. 이와 같은 shRNA는 인공적으로 화학 합성된다. 또는 이와 같은 shRNA는 센스 스트랜드 및 안티 센스 스트랜드의 DNA 배열을 역방향으로 연결시킨 헤어핀 구조의 DNA를 T7 RNA 폴리머라제에 의해 인 비트로에서 RNA를 합성하는 것에 의해 생성될 수 있다. 이론적으로는 이와 같은 shRNA는 세포 내에 도입시킨 후 세포 내에서 약 20 염기(대표적인 예로는 21염기, 22염기, 23염기)의 길이로 분해된다. shRNA와 동일한 형태로 RNAi를 유발시킨다. 따라서 본 발명의 처치 효과가 이해되는 것이다. 이와 같은 효과는 곤충, 식물, 동물(포유동물을 포함함) 등의 광범위한 생물체에 있어서 발휘할 수 있는 것으로 이해된다. 이와 같이 shRNA는 siRNA와 동일한 RNAi를 유발시키기 때문에 본 발명의 유효성분으로 사용할 수 있다. shRNA는 또한 바람직하게는 3'돌출 말단을 지닌 것이다. 이중가닥 부분의 길이는 특별히 한정하는 것은 아니고 바람직하게는 약 10 뉴클레오티드 길이 이상 더욱 바람직하게는 약 20 뉴클레오티드 길이 이상이다. 여기에 3'돌출 말단은 바람직하게는 DNA이고 더욱 바람직하게는 적어도 2 뉴클레오티드 길이 이상을 지닌 DNA이며 가장 바람직하게는 2∼4 뉴클레오티드 길이를 지닌 DNA이다.
본 발명에 있어서 사용되는 RNAi를 유발시키는 인자는 인공적으로 합성하는 (예를 들면 화학적 또는 생화학적) 것이다. 천연에 존재하는 것을 사용할 수도 있고 양자간에는 본 발명의 효과에 본질적인 차이를 나타내지 않는다. 화학적으로 합성된 것은 액체 크로마토그래피 등에 의해 정제하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 사용되는 RNAi를 유발시키는 인자는 인 비트로에서 합성할 수 있다. 그 합성 방법에 있어서 T7 RNA 폴리머라제 및 T7 프로모터를 사용하여 주형 DNA로부터 안티센스 및 센스 RNA를 합성한다. 이것을 인 비트로에서 어닐링 시킨 후 세포에 도입하고 상술한 바와 같은 기구를 통해 RNAi가 유발되면 본 발명의 효과가 달성된다. 여기에는 예를 들면 인산칼슘법에 의해 이러한 RNA를 세포 내에 도입할 수 있다.
본 발명의 RNA를 유발시키는 인자로서는 mRNA와 혼성화되는 단일가닥 또는 그와 유사한 핵산 아날로그와 같은 인자를 들 수 있다. 이와 같은 인자는 한편 본 발명의 처치 방법 및 조성물에 있어서 유용하다.
본 명세서에 있어서 '상응하는 아미노산 및 핵산'은 이러한 폴리 뉴클레오티드 및 핵산 분자에 있어서 비교 기준인 폴리 뉴클레오티드 및 핵산 분자에 대해 소정의 아미노산 및 핵산과 동일한 형태의 작용을 지니거나 또는 지니는 것으로 예측되는 아미노산 및 핵산이다. 예를 들면 유비퀴틴(ubiquitin)에 있어서는 라이신과 결합을 담당하는 서열(예를 들면 c 말단의 글리신)과 동일한 위치에 존재하는 촉매 활성에 동일한 기여를 하는 아미노산 및 그것을 코드화하는 핵산이다. 예를 들면 핵산 서열에 있어서 이 핵산 서열 또는 그것을 코드화하는 특정 부분과 동일한 기능을 발휘하는 부분이다.
본 명세서에 있어서 '상응하는 유전자'(예를 들면 폴리펩타이드 또는 핵산 분자 등)는 어떤 종에 있어서 비교 기준이 되는 종에 있어서 소정의 유전자와 동일한 형태의 작용을 지니거나 또는 지니는 것으로 예측되는 유전자이다. 이러한 작용을 지니는 유전자가 복수 존재하는 경우 진화학적으로 동일한 기원을 지닌 것이다. 따라서 어느 유전자의 상응하는 유전자는 그 유전자의 오르소로그(ortholog)이다. 그러므로 헤르페스 바이러스 6B 형의 서열 암 기원 등의 유전자에 상응하는 유전자는 다른 생물(헤르페스 바이러스 7형 등)에 있어서 발견될 수 있다. 이와 같은 상응하는 유전자는 해당 분야에 있어서 주지된 기술로부터 동정할 수 있다. 따라서 예를 들면 어느 동물에 있어서 상응하는 유전자는 상응하는 유전자의 기준인 유전자(예를 들면 헤르페스 바이러스-6A MIE 프로모터 서열)의 서열을 퀘리(query) 서열로서 사용하는 그 동물(예를 들면 헤르페스 바이러스 6B)의 서열 데이터 베이스를 검색하는 것에 의해 또는 wet 실험으로 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 발견할 수 있다.
본 명세서에 있어서 '분리된 물질'(예를 들면 핵산 또는 단백질의 생화학적 인자)는 그 물질이 천연에 존재하는 환경(예를 들면 생물체의 세포 내)의 다른 물질(바람직하게는 생물학적 인자)(예를 들면 핵산인 경우 핵산 이외의 인자 및 목적하는 핵산 이외의 핵산 서열을 지니 핵산, 단백질인 경우 단백질 이외의 인자 및 목적하는 단백질 이외의 아미노산 서열을 지닌 단백질 등)로부터 실질적으로 분리 또는 정제된 것이다. '분리된 핵산' 및 단백질은 표준적인 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 따라서 분리된 핵산 및 단백질은 화학적으로 합성된 핵산 및 단백질을 포함한다.
본 명세서에 있어서 '정제된 물질'(예를 들면 핵산 또는 단백질과 같은 생화학적 인자)은 이 물질에 천연으로 수반되는 인자의 적어도 일부를 제거시킨 것이다. 따라서 통상 정제된 물질에 있어서 그 물질의 순도는 그 물질이 통상 존재하는 상태보다 높다(즉 농축된 것이다.).
본 명세서에 있어서 '정제된' 및 '분리된'은 바람직하게는 적어도 75 중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 85 중량%, 가장 바람직하게는 적어도 95 중량%, 최고로 바람직하게는 적어도 98 중량%의 동일한 형태의 물질이 존재하는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서 유전자의 '상동성'은 둘 이상의 유전자 서열 상호간에 동일성의 정도를 말한다. 따라서 어느 두 개의 유전자의 상동성이 높다는 것은 그 서열의 동일성 또는 유사성이 높은 것이다. 두 종류의 유전자가 상동성을 지니는지 여부는 서열을 직접 비교 또는 핵산의 경우 엄격한 조건하에서 하이브리다이제이션 방법에 의해 조사하여 얻을 수 있다. 두 개의 유전자 서열을 직접 비교하는 경우 그 유전자 서열간의 DNA 서열이 대표적으로는 적어도 50% 동일한 경우, 바람직하게는 적어도 70% 동일한 경우, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경우 이러한 유전자는 상동성을 지니는 것이다.
본 명세서에 있어서 엄격한 조건하에서 '하이브리다이즈 조건'은 해당분야에 주지 관용조건이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 폴리튜클레오티드를 프로브로서 콜로니 하이브리다이제이션법, 플래그 하이브리다이제이션법 또는 서던 브라트 하이브리다이제이션법에 의해 이와 같은 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다. 구체적으로는 엄격한 조건하에 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드는 콜로니 또는 플래그 유래의 DNA를 고정화 시킨 필터를 사용하여 0.7∼1.0 몰의 NaCl 존재하 65℃에서 하이브리다이제이션을 수행한 후 0.1∼2배의 농축의 SSC(살린-소디움 시트레이트) 용액(1배 농축도의 SSC 용액의 조성은 150mM 염화나트륨, 15mM 구연산나트륨 등이다)을 사용하여 65℃ 조건하에서 필터를 세척하는 것에 의해 동정된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 하이브리다이제이션은 Molecular Cloning 2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995) 등의 실험서에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 여기서 엄격한 조건 하에 하이브리다이즈하는 서열은 바람직하게는 A 서열만 또는 T 서열만을 포함하는 서열이 제외된다. '하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드'는 상기 하이브리다이즈 조건하에서 각각의 폴리뉴클레오티드에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 하이브리다이즈 가능한 폴리뉴클레오티드의 구체적으로는 본 발명에서 구체적으로 표시하는 아미노산 서열을 지닌 폴리뉴클레오티드를 코드화하는 DNA 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 지닌 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 지닌 폴리뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 열거할 수 있다.
본 명세서에 있어서 염기 서열의 동일성 비교 및 상동성의 산출은 서열 분석용 키트인 BLAST를 이용한 디폴트 파라미터를 사용하여 산출한다. 동일성의 검색은 예를 들면 NCBI BLAST 2.2.9(2004.5.12발행)를 사용하여 행할 수 있다. 본 명세서에 있엇 동일성의 수치는 통상 상기 BLAST를 사용하고 디폴트 조건으로 얼라이먼트 결과치이다. 또한 파라미터의 변경에 의해 보다 높은 수치가 산출되는 경우 가장 높은 수치를 상동성 수치로 한다. 복수의 영역에서 동일성이 평가되는 경우는 이러한 최고치를 동일성의 수치로 한다.
본 명세서에 있어서 '검색'은 전자적인 또는 생물학적 또는 기타의 방법으로 행하고 이 핵산 염기의 서열을 이용하여 특정 기능 및/또는 성질을 지닌 다른 핵산 염기 서열을 검출하는 것이다. 전자적인 검색으로는 BLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)), FASTA (Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:2444-2448 (1988)), Smith and Waterman method (Smith and Waterman, J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981)), 및 Needleman and Wunsch method (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970))을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 생물학적인 검색으로는 스트린전트 하이브리다이제이션(stringent hybridization), 게놈 DNA를 나이론 멤브레인 등에 점착 시킨 매크로어레이 또는 글라스 판에 점착 시킨 마이크로어레이(마이크로 에세이), PCR 및 in situ 하이브리다이제이션 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 본 명세서에 있어서 본 발명에 있어 사용되는 프로모터로서는 이와 같은 전자적 검색, 생물학적 검색에 의해 동정된 것에 대응하는 서열을 지닌 것으로 의도된다.
본 명세서에 있어서 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 등의 '발현'은 이 유전자 등이 인 비보에서 일정 작용을 받아 별개의 형태로 되는 것을 의미한다. 바람직하게는 유전자, 폴리뉴클레오티드 등이 전사 및 번역되어 폴리펩타이드 형태로 되는 것이다. 전사된 mRNA가 작동되는 것을 발현의 하나의 형태이다. 더욱 바람직하게는 이와 같은 폴리펩타이드 형태는 번역 후 프로세싱을 받는 것이다.
아미노산은 그의 일반적인 3 문자기호를 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 부여된 1 문자기호를 사용할 수 있다. 본 명세서 중에 언급되고 있으며 뉴클레오티드도 동일한 방식으로 일반적으로 1 문자코드를 사용한다.
이하 문자코드에 대해 설명한다.
아미노산:
3-문자 1-문자 아미노산 명
Ala A 알라닌
Cys C 시스테인
Asp D 아스파트산
Glu E 글루탐산
Phe F 페닐알라닌
Gly G 글리신
His H 히스티딘
Ile I 이소류신
Lys K 라이신
Leu L 류신
Met M 메티오닌
Asn N 아스파라긴
Pro P 프롤린
Gln Q 글루타민
Arg R 알기닌
Ser S 세린
Thr T 트레오닌
Val V 발린
Trp W 트리프토판
Tyr Y 타이로신
Asx 아스파트산 또는 아스파라긴
Glx 글루타민 또는 글루탐산
Xaa 알려지지 않은 또는 다른 아미노산
염기 (뉴클레오티드)
약어 염기 명
a 아데닌
g 구아닌
c 시토신
t 티민
u 우라실
r 구아닌 또는 아데닌 퓨린
y 티민/우라실 또는 시토신 피리미딘
m 아데닌 또는 시토신 아미노그룹
k 구아닌 또는 티민 우라실 케토그룹
s 구아닌 또는 시토신
w 아데닌 또는 티민/우라실
b 구아닌 또는 시토신 또는 티민/우라실
d 아데닌 또는 구아닌 또는 티민/우라실
h 아데닌 또는 시토신 또는 티민/우라실
v 아데닌 또는 구아닌 또는 시토신
n 아데닌 또는 구아닌 또는 시토신 또는 티민/우라실,
알려지지 않은 또는 다른 염기
본 명세서에 있어서 '프래그먼트'는 전체 길이의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드(길이가 n)에 대해 1 내지 n-1의 서열 길이를 지닌 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 프래그먼트의 길이는 그 목적에 따라 적절히 변경 가능하며 예를 들면 그 길이의 하한으로는 폴리펩타이드의 경우 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 및 그 이상의 아미노산을 들 수 있고 여기에 구체적으로 열거하지 않은 정수를 표시하는 길이(예를 들면 11 등)를 적절히 사용 할 수 있다. 한편 폴리뉴클레오티드의 경우 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 및 그 이상의 뉴클레오티드를 들 수 있으며 여기서 구체적으로 열거하지 않은 정수를 표시하는 길이(예를 들면 11 등)를 적절히 사용 할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 폴리펩타이드는 천연형 폴리펩타이드와 실질적으로 동일하게 작용하는 한 아미노산 서열 중의 1 이상(예를 들면 1 또는 수 개)의 아미노산이 치환, 부가 및/또는 결실될 수 있으며 당사슬이 치환, 부가 및/또는 결실된 것도 가능하다.
이 아미노산을 동일한 소수성 지수를 지닌 아미노산에 의해 치환하고 여기에 원래와 동일한 생물학적 기능을 지닌 단백질(예를 들면 효소활성에 있어서 등가인 단백질)을 생성하여 얻는 것은 해당 분야에 주지된 기술이다. 이와 같은 아미노산 치환에 있어서 소수성 지수가 ±2 이내인 것이 바람직하고 ±1 이내인 것은 더욱 바람직하며 ±0.5 이내인 것은 가장 바람직하다. 소수성기로의 아미노산의 치환은 효율적인 것으로 당분야에 있어서 이해된다. 소수성 지표는 개변체 제조에 있어서 고려된다. 미국 특허 제 4,554,101호에 기재된 것처럼 다음의 소수성 지표를 아미노산 잔기에 부여하고 있다. 알기닌 (+3.0); 리신 (+3.0); 아스파트산 (+3.01); 글루탐산 (+3.01); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.51); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 이소류신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 및 트리프토판 (-3.4)이다. 아미노산을 동일한 아미노산 지수를 지닌 생물학적 등가체를 부여하여 치환시켜 얻어지는 것이 이해된다. 이와 같은 아미노산 치환에 있어서 소수성 지수가 ±2 이내인 것이 바람직하고 ±1 이내인 것은 더욱 바람직하며 ±0.5 이내인 것은 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서 '보존적 치환'은 아미노산 치환에 있어서 원래의 아미노산과 치환된 아미노산과의 친수성 지수 및/또는 소수성 지수가 상기한 바와 같이 유사한 치환이다. 보존적 치환의 예는 당업자에 주지된 것이다. 예를 들면 다음과 같은 그룹 내에서 치환이 가능하다. 알기닌 대 라이신; 글루탐산 대 아스파트산; 세린 대 트레오닌; 글루타민 대 아스파라긴; 발린, 류신 대 이소류신 등이며 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 '개변체'는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오티드 등의 물질에 대해 일부가 변경된 것이다. 이와 같은 개변체로서는 치환개변체, 부가개변체, 결실개변체, 단축개변체, 대립유전자변이체 등을 들 수 있다. 대립유전자(allele)는 동일 유전자 자리에 속하고 상호 구별되는 유전적 개변체이다. 따라서 대립유전자 개변체는 이 유전자에 대해 대립유전자 관계에 있는 개변체이다. 종상동체 또는 호모로그는 이종 중에서 이 유전자와 아미노산 레벨 또는 뉴클레오티드의 레벨에 있어서 상동성을 바람직하게는 60%이상 더욱 바람직하게는 80% 이상, 85% 이상, 90%이상, 95% 이상의 상동성을 지닌 것이다. 이와 같은 종상동체 얻는 방법은 본 명세서에 기재되어 있다. 오르소로그(ortholog)는 오르소로고스 유전자이다. 두 번째의 유전자가 이 공통 조상인 종분화에 의해 유래하는 유전자이다. 예를 들면 다중유전자 구조를 지닌 헤모글로빈 유전자 패밀리를 예로 들 수 있다. 인간과 마우스의 알파 헤모글로빈 유전자는 오르소로그이며 인간의 알파 헤모글로빈 유전자와 베타 헤모글로빈 유전자는 파라로그(유전자 중복을 생성된 유전자)이다. 오르소로그는 분자 계통나무의 추정에 유용하기 때문에 본 발명의 오르소로그는 본 발명에 있어서 유용한 것이다.
본 명세서에 있어서 '기능적 개변체'는 기준이 되는 서열이 담당하는 생물학적 활성(특히 프로모터 활성)을 지니는 개변체이다.
본 명세서에 있어서 '보존적으로 개변되는 개변체'는 아미노산 배열 및 핵산 배열에 모두 적용될 수 있다. 특정 핵산 배열에 관해 보존적으로 개변되는 개변체는 동일 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코드화하는 핵산이다. 핵산이 아미노산 배열을 코드화하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 배열이다. 유전 코드의 축중을 위해 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정 단백질을 코드화한다. 예를 들면 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 아미노산 알라닌을 코드화한다. 그러므로 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서 이 코돈은 코드화된 폴리뉴클레오티드를 개변할 수 있으며 기재된 상응하는 코돈의 임의의 개변이 가능하다. 이와 같은 핵산의 변동은 보존적으로 개변된 변이의 1종(사일런트 개변)이다. 핵산에 있어서는 보존적 치환은 예를 들면 프로모터 활성을 측정하기 위해 확인 될 수 있다.
본 명세서에 있어서 기능적으로 등가인 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자를 제작하기 위해 아미노산의 치환이 가능하고 아미노산의 부가, 결실 또는 수식 등을 행할 수 있다. 아미노산의 치환은 펩타이드를 한번 이상 예를 들면 1∼10개 바람직하게는 1∼5개 더욱 바람직하게는 1∼3개의 아미노산을 치환하는 것이다. 아미노산의 결실은 펩타이드를 한번 이상 예를 들면 1∼10개 바람직하게는 1∼5개 더욱 바람직하게는 1∼3개의 아미노산을 결실시키는 것이다. 아미노산 수식은 아미드화, 카르복실화, 유산화, 할로겐화, 알킬화, 글리코실화, 인산화, 수산화, 아실화(예를 들면 아실레이션) 등을 포함하나 이에 한정하는 것은 아니다. 치환 또는 부가된 아미노산은 천연 아미노산인 것도 좋고 비천연 아미노산 또는 아미노산 아날로그도 좋다. 천연 아미노산이 바람직하다.
본 명세서에 있어서 발현되는 폴리펩타이드의 핵산 형태는 그 폴리펩타이드의 단백질 형태를 발현시켜 얻을 수 있는 핵산 분자이다. 그 핵산 분자는 발현된 폴리펩타이드가 천연형의 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 활성을 지닌 한 상술한 바와 같은 그 핵산의 서열의 일부가 결실 또는 다른 염기에 의해 치환될 수도 있다. 또한 다른 핵산 서열의 일부 삽입도 가능하다. 또한 5'말단 및/또는 3'말단에 다른 핵산이 결합되어도 좋다. 한편 폴리펩타이드를 코드화하는 유전자를 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈 시켜 그 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 기능을 지닌 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산 분자도 좋다. 이와 같은 유전자는 해당 분야에 있어서 공지된 것으로 본 발명에 있어서 이용할 수 있다.
이와 같은 핵산은 주지의 PCR법에 의해 얻을 수 있으며 화학적으로 합성할 수도 있다. 이 방법으로는 예를 들면 자리지정 돌연변이법 및 하이브리다이제이션법 등을 조합하여 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 치환, 부가 또는 결실은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드에 대해 그 아미노산에 대한 대체물 또는 뉴클레오타이드에 대한 대체물이 치환되거나 부가되거나 삭제되는 것이다. 이와 같은 치환, 부가 또는 결실 기술은 해당분야에 있어서 주지된 것이고 이와 같은 기술의 예로는 자리지정 돌연변이법 등을 들 수 있다. 치환, 부가 또는 결실은 하나 이상의 임의의 수일 수 있고 이와 같은 수는 그 치환, 부가 또는 결실을 지닌 개변체에 있어서 목적하는 기능을 유지하는 한 모두 가능한 것이다. 예를 들면 이와 같은 수는 1 또는 수 개 일 수 있으며 바람직하게는 전체 길이의 20% 이내, 10% 이내 또는 100개 이하, 50개 이하, 25개 이하 등이다.
(프로모터)
본 명세서에 있어서 '프로모터'(또는 프로모터 서열)는 유전자의 전사개시부위를 결정하고 또는 그 빈도를 직접적으로 조절하는 DNA 위의 영역이다. 통상 RNA 폴리머라제가 결합되어 전사를 시작하는 염기 서열이다. 따라서 본 명세서에 있어서 유전자의 프로모터 작용을 지니는 부분을 '프로모터 부분'이라 칭한다. 프로모터 영역은 DNA 분석용 소프트웨어를 사용하여 게놈 염기 서열 중의 단백질 코드화 영역을 예측할 수 있으며 프로모터 영역을 추정할 수 있다. 추정 프로모터 영역은 구조 유전자에 따라 변화되지만 통상 구조 유전자의 상류(upstream)에 있으나 이에 한정하는 것은 아니고 구조 유전자의 하류(downstream)에서 얻을 수도 있다.
본 명세서에 있어서 'MIE 프로모터'는 주요 전초기 프로모터(major immediate early promoter)의 프로모터이다. 바이러스 감염 후 숙주 유래 또는 비리온 유래의 전자 인자에 의해 직접적으로 전사되는 유전자의 프로모터를 칭한다. MIE 유전자는 사이크로핵시미드(CHX) 처리 감염 세포로부터 추출된 RNA를 사용하여 RT-PCR에 의해 동정될 수 있다.
본 명세서에 있어서 'U95 프로모터'는 전초기 유전자 U95의 프로모터를 말한다. 이 U95 또는 전초기 유전자에서는 바이러스 감염 후 숙주 유래 또는 비리온 유래의 전사 인자에 의해 직접 전사된다.
본 명세서에 있어서 프로모터의 동정 방법은 다음과 같이 행한다. 즉 구조 유전자의 주변 배열을 스크리닝하고 (예를 들면 실시예에 기재된 바와 같은 발현 카세트를 사용함), 유전자 발현 촉진 활성을 지닌 서열을 매핑한다. 이에 따라 유의적인 촉진 활성을 지닌 서열을 동정할 수 있다. 통상은 상류에 배치되어 있는 것이나 이것에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 'HHV 6B MIE 프로모터'는 서열 번호 1에 있어서 프로모터 활성을 지니는 임의의 서열을 말한다. 바람직하게는 서열 번호 1에 있어서 전사 개시점으로부터 -814위치 ∼ 0위치를 지닌다. 이와 같은 서열은 서열 번호 1 또는 그에 대응하는 서열 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. HHV 6B 유전자의 발현 억제는 전사 개시점으로부터 상류 -574 ∼ -427 영역이고 바람직하게는 -1051 ∼ -427 영역이다. 이 염기 서열로서는 서열 번호 15, 16에 표시된 서열을 들 수 있다. 이 중에서도 NF-κB 및 AP-1의 모티프(전사 개시점을 기점으로 하면 -603 ∼ -594 가 NF-κB 모티프 서열이고 -488 ∼ -478 및 -249 ∼ -239 가 AP-1 모티프 서열임)가 된다. 염기 서열 치환의 실험은 이미 알려져 있으며 따라서 바람직하게는 본 발명의 HHV 6B MIE 프로모터는 (a)서열 번호 1에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그 프라그먼트 서열을 지니는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 1에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그의 프라그먼트인 폴리펩타이드; (c) (a) 또는 (b) 중 하나의 폴리뉴클레오타이드에 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈 되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; (d) (a) 내지 (c) 중 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 서열을 지닌 동일성이 적어도 70%인 염기 서열로서 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에 있어서 'HHV 7 MIE 프로모터'는 서열 번호 2에 있어서 프로모터 활성을 지니는 임의의 서열을 말한다. 바람직하게는 서열 번호 2에 있어서 전사 개시점으로부터 -493위치 ∼ +22 위치를 지닌다. 이와 같은 서열은 서열 번호 2 또는 그에 대응하는 서열 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. HHV 7 유전자의 발현 억제는 전사 개시점으로부터 상류 -388 영역이고 바람직하게는 -493 영역이다. 이 염기 서열로서는 서열 번호 2에 표시된 서열을 들 수 있다. 이 중에서도 NF-κB 및 AP-1의 모티프(전사 개시점을 기점으로 하면 -464 ∼ -455가 NF-κB 모티프 서열이고 -359 ∼ -350가 AP-1 모티프 서열임)가 된다. 염기 서열 치환의 실험은 이미 알려져 있으며 따라서 바람직하게는 본 발명의 HHV 7 MIE 프로모터는 (a)서열 번호 2에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그 프라그먼트 서열을 지니는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 2에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그의 프라그먼트인 폴리펩타이드; (c) (a) 또는 (b) 중 하나의 폴리뉴클레오타이드에 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈 되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; (d) (a) 내지 (c) 중 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 서열을 지닌 동일성이 적어도 70%인 염기 서열로서 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에 있어서 'HHV 7 U95 프로모터'는 서열 번호 12에 있어서 프로모터 활성을 지니는 임의의 서열을 말한다. 바람직하게는 서열 번호 12에 있어서 전사 개시점으로부터 -484위치 ∼ +16 위치를 지닌다. 이와 같은 서열은 서열 번호 2 또는 그에 대응하는 서열 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. HHV 7 유전자의 발현 억제는 전사 개시점으로부터 상류 -379 영역이고 바람직하게는 -484 영역이다. 이 염기 서열로서는 서열 번호 2에 표시된 서열을 들 수 있다. 이 중에서도 NF-κB 및 AP-1의 모티프(전사 개시점을 기점으로 하면 -478 ∼ -469가 NF-κB 모티프 서열이고 -373 ∼ -364가 AP-1 모티프 서열임)가 된다. 염기 서열 치환의 실험은 이미 알려져 있으며 따라서 바람직하게는 본 발명의 HHV 7 U95 프로모터는 (a)서열 번호 12에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그 프라그먼트 서열을 지니는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 12에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그의 프라그먼트인 폴리펩타이드; (c) (a) 또는 (b) 중 하나의 폴리뉴클레오타이드에 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈 되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; (d) (a) 내지 (c) 중 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 서열을 지닌 동일성이 적어도 70%인 염기 서열로서 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에 있어서 본 발명의 프로모터의 발현이 '구성적'(constitutive)인 것은 생물의 조직에 있어서 그 생물의 발생에 따른 단계에 있어서도 일정량으로 발현되는 성질을 말한다. 구체적으로는 본 명세서에 있어서 실시예와 동일한 조건 하에 노던브라트 분석의 경우 예를 들면 임의의 시점에서 (예를 들면 두 점이상 5일 및 15일에서) 동일 또는 대응하는 부위에 있어서도 동일한 정도의 발현량이 생성됨으로 본 발명의 정의상 발현이 구성적인 것이다. 구성적 프로모터는 통상 생육 환경인 생물의 항상성 유지에 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 이와 같은 성질은 생물의 임의의 부분으로부터 RNA를 추출하여 노던브라트 분석을 통한 발현량을 분석하는 것 또는 발현된 단백질을 웨스턴브라트에 의해 정량하는 것에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 있어서 '인핸서'는 목적 유전자의 발현 효율을 높이기 위해 사용하는 것이다. 동물세포에 있어서 사용되는 경우 인핸서로서는 SV40 프로모터 내의 상류측의 배열을 포함하는 인핸서 영역이 바람직하다. 인핸서는 복수로 사용할 수도 있고 하나로 사용하는 것도 좋다. 프로모터 중의 프로모터 활성을 강하게 하는 영역도 인핸서라 칭한다.
본 명세서에 있어서 사용되는 경우 '작동 가능하게 연결된(operatively linked)'는 원하는 서열의 발현이 작동하게 하는 전사 번역 조절 서열(예를 들면 프로모터 인핸서 등) 또는 번역 조절 서열의 제어 하에 배치된 것을 말한다. 프로모터 유전자에 작동 가능하게 연결되기 위해서는 통상 그 유전자의 상류에 프로모터가 배치되어 있으나 필요에 따라 인접하여 배치되지 않은 경우도 있다.
(핵산구축물)
본 명세서에 있어서 '핵산구축물' 또는 '유전자 카세트'는 서로 교환하여 사용하고 유전자를 코드화하는 핵산 분자 예를 들면 DNA, RNA와 이것에 필요에 따라 작동 가능하게 (즉 그 핵산의 발현의 제어 가능하게) 연결된 제어 서열(예를 들면 프로모터)를 포함하는 핵산 서열 또는 필요에 따라 제어 서열(예를 들면 프로모터)와 그것이 작동 가능하게 (즉 인 프레임) 결합된 이종 유전자를 포함하는 핵산 분자를 말한다. 이 카세트 또는 구축물은 필요에 따라 다른 조절 엘레멘트와 조합되어 사용할 수 있고 본 발명의 범위에 포함된다. 바람직하게는 발현 카세트는 특정의 제한효소로 절단되고 용이하게 회수할 수 있는 유전자 카세트 또는 핵산 구축물이다.
본 명세서에 있어서 유전자에 있어서 언급되는 경우 '벡터'는 목적의 폴리뉴클레오티드의 서열을 목적 세포에 삽입시킬 수 있는 것을 말한다. 이와 같은 벡터는 원핵생물세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포, 동물개체 및 식물개체 등의 숙주세포에 있어서 자율 복제가 가능한 것이다. 또는 염색체 중에 조립이 가능하고 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사에 따라 적절한 위치의 프로모터를 함유할 수도 있다. 본 명세서 내에는 예를 들면 BAC 벡터를 사용한다. BAC 벡터는 대장균 F 플라스미드를 제작하는 플라스미드이며 약 300kb이상의 거대한 사이즈를 지닌 DNA 단편을 대장균 등의 세포 내에서 안정적으로 증식 할 수 있게 한 벡터이다. BAC 벡터는 적어도 BAC 벡터의 복제에 필수적인 영역을 포함한다. 이 복제에 필수적인 영역으로는 예를 들면 F 플라스미드 복제 개시점인 oriS 또는 그의 개변체를 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 사용되는 경우 '선별 마커'는 핵산 구축물 벡터를 포함하는 숙주 세포를 선별하는 지표로서 기능을 지닌 유전자이다. 선별 마커로는 형광 마커, 발광 마커, 약제 선별 마커 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. '형광 마커'로서는 녹색 형광 프로테인(GFP), 청색 형광 프로테인(CFP), 황색 형광 프로테인(YFP) 및 적색 형광 프로테인(dsRed)에 의한 형광 단백질을 코드화하는 유전자를 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. '발광 마커'로서는 루시퍼라제 등의 발광 단백질을 코드화하는 유전자를 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. '약제 선별 마커'로서는 히포크산틴 구아닌포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt), 디하이드로폴레이트리덕타제 유전자, 글루타민 신타제 유전자, 아스파테이트 트랜스 아미나제, 메탈로티오네인, 아데노신 아미나제(ADA), AMP 디아미나제(AMPD1,2), 크산틴-구아닌-포스포릴보실 트랜스퍼라제, UMP 신타제, P-글리코프로테인, 아스파라긴 신타제 및 오르니틴 데카복실라제 등을 들 수 있다. 이러한 약제 선별 마커로 사용되는 약제는 조합하여 사용할 수 있으며 예를 들면 다음과 같다. 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자와 메토트레세이트(MTX)의 조합, 글루타민 신타제(GS) 유전자와 메티오닌 술폭시민(Msx)의 조합, 아스파테이트 트랜스아미나제(AST) 유전자와 N-포스폰 아세틸-L-아스파테이트(PALA)의 조합, MT 유전자와 카드늄(Cd2+)의 조합, 아데노신 디아미나제(ADA) 유전자와 아데노신, 알라노신, 2'-데옥시 코포르마이신의 조합, AMP 디아미나제(AMPD1.2) 유전자와 아데닌, 아자세린 및 코포르마이신의 조합, 크산틴-구아닌-포스포릴보실 트랜스퍼라제 유전자와 미코페놀산의 조합, UMP 신타제 유전자와 6-아자유리딘, 피라조퓨란의 조합, P-글리코프로테인(P-gp, MDR) 유전자와 다중 약제의 조합, 아스파테이트 신타제(AS) 유전자와 베타-아스파틸 하이드록사민산 또는 알비지인의 조합, 오르니틴 카르복실라제(ODC) 유전자와 알파-디플루오로메틸-오르니틴(DFMO)의 조합 등이나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 사용되는 '발현 벡터'는 구조 유전자 및 그의 발현을 조절하는 프로모터에 부과된 각종의 조절 엘레멘트가 숙주의 세포 중에서 작동할 수 있는 상태로 연결된 핵산 서열을 말한다. 조절 엘레멘트는 바람직하게는 터미네이터, 약제 내성 유전자(예를 들면 가나마이신 내성 유전자, 하이드로마이신 내성 유전자 등)의 선택 마커 및 인핸서를 포함한다. 생물(예를 들면 동물)의 발현 벡터의 형태 및 사용되는 조절 엘레멘터의 종류는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있으며 당업자에게 주지된 사항이다.
본 명세서에서 사용되는 경우 '재조합 벡터'는 목적 폴리뉴클레오타이드 서열을 목적 세포에 삽입하기 위해 된 벡터를 말한다. 이와 같은 벡터로서는 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포, 동물개체 및 식물개체 등의 숙주 세포 및 자가 복제가 가능한 또는 염색체 중의 일부를 조립 가능한 것이다. 본 발명의 폴리펩타이드의 전사에 적정한 위치의 프로모터를 함유하는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서 '터미네이터'는 유전자의 단백질을 코드화하는 영역의 하류에 위치하고 DNA가 mRNA에 전사되는 경우 전사의 종결, 폴리A 배열을 부가시킨 서열이다. 터미네이터는 mRNA의 안정성에 관여하는 유전자의 발현량의 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 터미네이터는 AATAAA를 함유하는 서열을 들 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 '외래유전자'는 어느 생물에 있어서 그 생물의 천연에는 존재하지 않는 유전자이다. 이러한 외래 유전자는 이 생물의 천연 상태로 존재하는 유전자를 개변하는 것도 좋고 천연에 있어서 다른 생물에 존재하는 유전자(예를 들면 ADA 유전자)인 것도 좋다. 인공적으로 합성된 유전자도 좋다. 이러한 복합체(예를 들면 융합체)도 좋다. 이와 같은 외래 유전자를 포함한 생물은 천연에서는 발현되지 않는 유전자 산물을 발현시킨다. 예를 들면 결실된 열성 유전자(예를 들면 ADA 유전자, PNP 유전자, γc 체인유전자, TAP 유전자, MHC II 유전자, X-연쇄 WASP, CD40 리간드, PI3K-유사유전자, DNA 헬리카제)를 외래유전자로서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 외래 유전자는 사이토카인이 바람직하다. 본 명세서에 있어서 사용되는 '사이토카인'은 당 분야에 있어서 사용되는 의미와 동일한 의미를 지닌다. 세포로부터 생성되는 동일 또는 상이한 세포에 작용하는 생리활성물질을 말한다. 사이토카인은 일반적으로 단백질 또는 폴리펩타이드이고 면역응답의 제어작용, 내분비계 조절, 신경계 조절, 항종양 작용, 항바이러스 작용, 세포증식의 조절 작용, 세포분화의 조절 작용 등을 지닌다. 본 명세서에 있어서는 사이토카인은 단백질 형태 또는 핵산 형태 또는 기타의 형태일 수 있다. 실제적으로 작용하는 시점에 있어서는 사이토카인은 통상 단백질 형태이다. 본 명세서에 있어서 사용되는 '증식인자'는 세포의 증식을 촉진 또는 제어하는 물질이다. 증식인자는 성장 인자 또는 발육 인자라고 한다. 증식 인자는 세포 배양 또는 조직 배양에 있어서 배지에 첨가되어 혈청 고분자 물질의 작용을 대체한다. 대부분의 증식 인자는 세포의 증식 이외에 분화 상태의 제어 인자로서도 기능한다. 사이토카인에는 대표적으로 인터류킨류, 케모카인류, 콜로니 자극 인자 등의 조혈인자, 항종양 괴사인자, 인터페론 등을 포함한다. 증식인자로서는 대표적으로 혈소판 유래 증식인자(PDGF), 상피 증식인자(EGF), 섬유아세포 증식인자(FGF), 간실질세포 증식인자(HGF), 혈관내피 증식인자(VEGF) 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 발현되는 외래 유전자는 상기 천연형의 외래 유전자와 상동성을 지닌 것을 사용한다. 이와 같은 상동성을 지닌 외래 유전자로서는 예를 들면 BLAST 파라미터를 사용하여 비교하는 경우 비교 대조 외래 유전자에 대해 적어도 약 30%, 35%, 40%, 30%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 동일성 또는 유사성을 지닌 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 적어도 약 30%, 35%, 40%, 30%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%의 동일성 또는 유사성을 지닌 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 분자 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티이드 등 유전자 산물의 '발현'은 이 유전자 등이 인 비보에서 일정 작용을 받아 별도의 형태를 나타내는 것이다. 바람직하게는 유전자 폴리뉴클레오티드 등이 전사 및 번역되어 폴리펩타이드 형태로 되는 것이며 전사된 mRNA가 제작되거나 발현의 하나의 형태로 얻어진다. 바람직하게는 이와 같은 폴리펩타이드 형태는 번역 후 프로세싱 주는 것이 바람직하다.
따라서 본 명세서에 있어서 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 등의 발현의 감소는 본 발명의 인자를 작용시킬 경우에 작용하지 않는 것 또는 발현량이 유의적으로 감소하는 것을 말한다. 바람직하게는 발현의 감소는 폴리펩타이드 발현량의 감소를 말한다. 본 명세서에 있어서 유전자 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 등의 발현의 증가는 본 발명의 인자의 작용에 따라 작용하는 것을 말한다. 발현의 양이 유의적으로 증가하는 것이다. 바람직하게는 발현의 증가는 폴리펩타이드 발현량의 증가를 포함한다. 본 명세서에 있어서 유전자 발현의 유도는 어느 세포에 있는 인자를 작용 가능케 하여 유전자의 발현량을 증가시키는 것이다. 따라서 발현의 유도는 이 유전자의 발현이 발견되는 경우에 유전자가 발현되는 것으로 알 수 있으며 이에 따라 유전자 발현량이 증가하는 경우 유전자 발현이 증대하는 것을 포함하는 것이다.
본 명세서에 있어서 유전자가 '특이적으로 발현하는'은 이 유전자가 식물의 특정 부위 또는 시기에 있어서 다른 부위 또는 시기와는 상이한 (바람직하게는 높은) 레벨로 발현하는 것을 말한다. 특이적으로 발현하는 것은 어느 부위(특이적 부위)의 발현에 의한 것으로 그 이외의 부위에 있어서도 발현하여도 좋다. 바람직하게는 특이적인 발현은 어느 부위에 있어서만 발현하는 것이다.
본 명세서에 있어서 사용되는 경우 재조합 벡터를 도입하는 방법으로는 DNA를 도입하는 방법이면 가능하다. 예를 들면 염화칼슘법, 엘렉트로포레이션법, 리포펙션법, 스페로프라스트법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929 (1978)], 초산리튬법 [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)], [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)] 등을 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 사용되는 게놈 또는 유전자 자리 등을 제거하는 방법에 사용되는 Cre 효소의 일시적 발현, 염색체상에서의 DNA 매핑 등은 세포 고합별 실험 프로토콜 시리즈 마스하라, 요시가와 등이 저술한 'FISH 실험 프로토콜', '인간 게놈 해석 등의 염색체 유전자 진단'에 기재된 통상의 방법에 따라 행한다.
본 명세서에 있어서 유전자 발현(예를 들면 mRNA 발현, 폴리펩타이드 발현)의 '검출' 또는 '정량'은 예를 들면 mRNA의 측정 및 염색학적 측정방법을 포함하는 적절한 방법에 의해 달성될 수 있다. 분자생물학적 측정 방법으로는 예를 들면 노던 블라팅법, 도트 블라팅법, 또는 PCR법 등을 들 수 있다. 면역학적 측정 방법으로는 예를 들면 마이크로타이터 플래이트를 이용한 ELISA법, RIA법, 형광항체법, 웨스턴 블라팅법, 면역조직염색법 등을 들 수 있다. 한편 정량 방법으로는 ELISA법 또는 RIA법 등을 들 수 있다. 어레이(예를 들면 DNA 어레이, 프로테인 어레이)를 사용한 유전자 해석 방법도 사용할 수 있다. DNA 어레이에 있어서는 사이보고각구에서 발간한 세포공학별책 'DNA 마이크로 어레이와 최신 PCR법'에 기재되어 있다. 프로테인 어레이에 있어서는 Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl:526-32 에 기재되어 있다. 유전자 발현 분석법으로는 상술한 방법 이외에 RT-PCR, RACE법, SSCP법, 면역침강법, two-hybrid 시스템, 인 비트로 번역 등에 기재되어 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 이와 같은 분석 방법은 예를 들면 게놈 해석 실험법, 나카무라의 랩 매뉴얼(2002) 등에 기재되어 있으며 본 명세서에 있어서 상기에 기재된 사항을 참고를 채용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 '발현량'은 목적 세포 등에 있어서 폴리펩타이드 또는 mRNA가 발현되는 양을 말한다. 이와 같은 발현량으로는 본 발명의 항체를 사용한 ELISA법, RIA법, 형광항체법, 웨스턴 블라팅법, 면역조직염색법 등의 면역학적 측정 방법을 임의 적절하게 사용하여 측정된 본 발명 폴리펩타이드 단백질 레벨 발현량 또는 노던 블라팅법, 도트 블라팅법, 또는 PCR법 등의 분자 생물학적 측정 방법을 임의 적절하게 사용하여 측정된 본 발명 mRNA 레벨 발현량을 들 수 있다. '발현량의 변화'는 상기 면역학적 측정방법 또는 분자 생물학적 측정방법을 사용하여 측정평가된 폴리펩타이드 단백질 레벨 또는 mRNA 레벨 발현량의 증가 또는 감소를 의미한다.
본 발명에 있어서 사용되는 '형질전환', '형질도입' 및 '트랜스팩션'은 특히 언급하지 않는 한 상호 교환 가능하게 사용한다. 숙주 세포 내의 핵산 도입을 의미한다. 형질전환 방법으로는 숙주 세포에 DNA를 도입할 수 있는 방법 예를 들면 엘렉트로포레이션법, 파티클 건(유전자 총) 등을 이용한 방법, 인산칼슘법 등이 알려져 있다.
'형질전환체'는 형질전환에 의해 제작되는 세포 등의 생명체 전부 또는 일부를 의미한다. 형질전환체로는 원핵세포, 효모, 동물세포, 식물세포, 곤충세포 등을 들 수 있다. 형질전환체는 그 대상에 의존하여 형질전환 세포, 형질전환 조직, 형질전환 숙주 등으로 나누며 본 명세서에 있어서는 모든 형태를 포함하고 특정 문맥에 있어서 특정 형태를 나타낼 수 있다.
원핵세포로는 에스체리카속, 세라티아속, 바실러스속, 브레비박테리움속, 코리네박테리움속, 마이크로박테리움속, 슈도모나스속 등을 들 수 있으며 더욱 구체적으로는 Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli BL21(DE3), Escherichia coli BL21(DE3)pLysS, Escherichia coli HMS174(DE3), Escherichia coli HMS174(DE3)pLysS, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacterium ammmoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14067, Corynebacterium glutamicum ATCC13869, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Pseudomonas sp.D-0110 등을 열거할 수 있다.
동물세포로는 제대혈단핵구, 말초혈단핵구 및 Sup-T1 세포 등을 열거할 수 있다.
본 명세서에 있어서 '동물'은 해당분야에 있어서 최고로 넓은 의미로 사용되며 척추동물 및 무척추동물을 포함한다. 동물로서는 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충류, 유충류 등을 포함하나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 생물의 '조직'은 생물의 집단에 있어서 그 집단의 일정한 동일작용을 지니는 것을 말한다. 따라서 조직은 장기(기관)의 일부이다. 장기 또는 기관 내에는 동일한 작용을 지니는 세포를 지니는 것이 많으며 미소한 차이를 지닌 것도 혼재하고 있기 때문에 본 명세서에 있어 조직은 일정의 특성을 공유하는 한 각종의 세포를 혼재하고 있는 것도 가능하다.
본 명세서에 있어서 '기관'(장기)는 하나의 독립적인 형태를 지닌 것으로 일종 이상의 조직의 조합으로 특정의 기능을 지닌 구조체를 의미한다. 동물에서는 위, 간, 장, 췌장, 폐, 기관, 비, 심장, 동맥, 정맥, 임파절, 흉선, 난소, 안, 이, 설, 피하 등을 열거할 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 '트랜스제닉'은 특정 유전자를 지닌 생물에 주입하거나 이러한 유전자를 조환시킨 생물(예를 들면 식물 또는 동물(마우스 포함)을 포함)을 말한다. 트랜스제닉 생물에서 어느 유전자가 결실 또는 억제되어 있는 것을 넉아웃 생물이라 칭한다.
본 발명의 생물은 동물의 경우 트랜스제닉 생물은 마이크로인젝션법(미량주입법), 바이러스벡터법, ES세포법(배아줄기세포법), 정자벡터법, 염색체 단편을 도입하는 방법(트랜스소믹법) 등을 이용하여 트랜스제닉 동물을 제조할 수 있다. 이와 같은 트랜스제닉 동물의 제조 기술은 당 분야에 주지된 기술이다.
본 명세서에 있어서 사용되는 '스크리닝'은 목적하는 특정의 성질을 지닌 물질 또는 숙주세포 또는 바이러스 등을 특정 조작 및/또는 평가 방법으로 다수의 후보에서 선별하는 것을 말한다. 본 발명에 있어서는 원하는 활성을 지닌 스크리닝에 의해 얻어진 바이러스는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해된다.
본 명세서에 있어서 '칩' 또는 '마이크로 칩'은 서로 호환 가능한 것이며 다양한 기능을 지닌 시스템의 일부로서 소형 집적회로이다. 칩으로는 예를 들면 DNA 칩, 프로테인 칩, 세포 칩 등을 들 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 헤르페스 바이러스는 임파계 또는 혈액계의 질환, 면역계의 질환, 감염증의 처치, 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물의 성분으로 사용하는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서 약제의 '유효량'은 그 약제가 목적하는 약효를 발휘하는 양을 말한다. 본 명세서에 있어서 이와 같은 유효량의 최소의 농도를 최소유효량이라 한다. 이와 같은 최소유효량은 당해 분야에 있어서 주지되어 있으며 통상 약제의 최소유효량은 당업자에 의해 결정되고 적정하게 결정될 수 있다. 이와 같은 유효량의 결정은 실제의 투여에 경우 동물, 모델 등을 이용하여 결정 가능하다. 본 발명은 이와 같은 유효량을 결정하는 것에 유용한 것이다.
본 명세서에 있어서 '약학적으로 수용 가능한 캐리어'는 의학 또는 동물약 등의 농약을 제조할 때 사용하는 물질이고 유효 성분에 유해한 영향을 미치지 않는 것이다. 이와 같은 약학적으로 수용 가능한 캐리어로서는 예를 들면 항산화제, 보존제, 착색제, 풍미제, 희석제, 유화제, 현탁화제, 용매, 필러, 증량제, 완충제, 송달비히클, 부형제 및/또는 농학적 또는 약학적 어주번트를 들 수 있다.
본 발명의 처치 방법에 있어서 사용되는 약제의 종류 및 양은 본 발명의 방법에 의해 얻어진 정보(예를 들면 질환에 관한 정보)를 사용 목적, 대상 질환, 환자의 연령, 체중, 성별, 거주력, 투여하는 피험체의 부위의 형태 또는 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 본 발명의 모니터링 방법을 피험체(또는 환자)에 대해 시행하는 빈도는 사용 목적, 대상 질환, 환자의 연령, 체중, 성별, 거주력 및 치료 경로 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 환자 상태를 모니터링하는 빈도는 (예를 들면 매일 내지 수개월에 1회, 1주일에 1회, 1개월에 1회) 일 수 있다. 1주일, 1개월에 1회의 모니터링을 관찰하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서 '지시서'는 본 발명의 치료방법 등을 의사, 환자 등 투여를 행하는 사람에 대해 기재하는 것이다. 이 지시서는 본 발명의 의학 등을 예를 들면 방사선 치료 직후 또는 전후(예를 들면 24시간내외 등)에 투여하는 것을 지시하는 문헌일 수 있다. 이 지시서는 본 발명이 실시하는 나라의 감독관청(예를 들면 일본의 후생노동성, 미국의 식품의약품국 등)의 규정에 따라 작성되고 이 감독관청에 승인을 받아 기재한다. 지시서는 첨부문서일 수 있다. 통상은 종이문서이지만 때에 따라서는 전자매체(예를 들면 인터넷에서 제공되는 웹사이트, 전자메일)의 형태를 지닐 수 있다.
필요에 따라 본 발명의 치료로는 2종 이상의 의약이 사용 가능하다. 2종 이상의 약제를 사용하는 경우 유사성질 또는 유래성질을 사용하는 것이 좋고 다른 성질 또는 유래의 약제를 사용해도 된다. 이와 같은 2종 이상의 약제를 투여하는 방법은 환자 수준에 관한 정보에 따라 입수 가능하다.
본 발명에 사용되는 배양 방법은 예를 들면 동물배양세포 매뉴얼 등에 기재된 방법에 의해 채택될 수 있다.
(폴리펩타이드의 제조방법)
본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 DNA를 재조합시킨 벡터를 보유하는 미생물 동물세포 등에서 유래된 형질전환체를 통상의 배양방법에 따라 배양시켜 본 발명의 폴리펩타이드를 생성 축적시키고 배양물로부터 폴리펩타이드를 채택하는 것에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은 숙주의 배양방법에 따라 통상의 방법에 의해 행할 수 있다. 대장균 등의 원핵생물 또는 효모 등의 진핵생물을 숙주로서 사용하는 형질전환체를 배양하는 배지로서는 본 발명의 생물이 성장할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 포함한다. 형질전환체의 배양을 효율정그로 행하는 배지로서는 천연 배지, 합성배지 등을 사용할 수 있다.
탄소원으로는 각각의 미생물이 성장할 수 있는 것이면 좋고 글루코즈, 플락토즈, 슈크로즈 등의 단성분 및 전분 또는 전분의 가수분해물 등의 탄수화물, 초산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로탄올 등의 알코올을 사용할 수 있다.
질소원으로는 암모니아, 염화암모니움, 황산암모니움, 초산암모니움, 인산암모니움 등의 각종 무기물 또는 유기산의 암모니움염, 기타 질소화물, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 콘스팁리퀴드, 카제인 가수분해물, 대두 및 대두박 가수분해물, 각종 발효체 및 그의 소화물 등을 사용할 수 있다.
유기염으로는 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산동, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다. 배양은 진탕배양 또는 심부 통기 교반배양 등의 호기성 조건 하에 행할 수 있다.
배양온도는 15∼40℃가 좋고 배양시간은 통상 5시간 내지 7일간이다. 배양 중 pH는 3.0∼9.0이 유지된다. pH 조정은 무기 또는 유기산, 알칼리용액, 요소, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용한다. 또한 배지 중에 필요에 따라 암피실린 또는 테트라사이클린 등의 항생물질을 배지에 첨가시켜도 좋다.
프로모터로서 유도성 프로모터를 사용하여 발현벡터로 형질전환 시킨 미생물을 배양시킬 때 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가시켜도 좋다. 예를 들면 lac 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환 시킨 미생물을 배양할 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 등을 trp 프로모터를 사용한 발현 벡터로 형질전환 시킨 미생물을 배양할 경우에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가하여도 좋다. 유전자를 도입시킨 식물의 세포 또는 기관은 자 퍼멘터를 사용하여 대량배양 할 수 있다. 배양하는 배지로서는 일반적으로 사용하는 Murashige and Skoog (MS) 배지 White 배지 또는 이 배지에 옥신, 사이토카인, 식물 호르몬 등을 첨가시킨 배지를 사용 할 수 있다.
예를 들면 동물세포를 배양하는 경우 본 발명의 세포를 배양하는 배지는 일반적으로 사용할 수 있는 RMPI1640 배지 [The Journal of the American Medical Association,199,519(1967)], Eagles MEM 배지 [Science,122,501(1952)], DMEM 배지 [Virology,8,396(1959)], 199 배지 [Proceedings of the Society for the Biological Medicine,73,1(1950)] 또는 이 배지의 우태아혈청 등르 첨가시킨 배지를 사용할 수 있다.
배양은 통상 pH 6∼8, 25∼40℃, 5% CO2 존재 하에서 1∼7일간 배양한다. 또는 배지 중 필요에 따라 가나마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 배지에 첨가하여도 좋다. 본 발명의 폴리펩타이드를 코드화하는 핵산서열로 형질전환시킨 형질전환체의 배양물로부터 본 발명의 폴리펩타이드를 분리 또는 정제하기 위해서는 해당분야 주지된 통상의 효소 분리 또는 정제법을 사용할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 폴리펩타이드가 폴리펩타이드 제조용 형질전환체의 세포 밖으로 폴리펩타이드를 분비하는 경우에는 그 배양물을 원심분리 등의 방법에 따라 처리하고 가용성 획분을 취득한다. 이 가용성 획분으로부터 용매추출법, 유안 등에 따른 염석법탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디메틸아미노에틸(DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75(미스비시화학) 등 수지를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia) 등의 수지를 이용한 양이온 교환 크로마토그래법, 부틸세파로즈, 페닐세파로즈 등의 수지를 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동법 등의 전기영동법 등을 사용하여 정제 제품을 얻을 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드가 본 발명의 폴리펩타이드 제조용 형질전환체의 세포 내에서 용해된 상태로 축적되는 경우에는 배양물을 원심분리하거나 배양물 내의 세포를 모아 그 세포를 세정시킨 후에 초음파 파쇄기 등에 의해 세포를 파쇄한 후 세포추출액을 얻는다. 얻어진 세포추출액을 원심분리하는 것에 의해 얻어진 상등액으로부터 용매추출법, 유안 등에 따른 염석법탈염법, 유기용매에 의한 침전법, 디메틸아미노에틸(DEAE)-Sepharose, DIAION HPA-75(미스비시화학) 등 수지를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF(Pharmacia) 등의 수지를 이용한 양이온 교환 크로마토그래법, 부틸세파로즈, 페닐세파로즈 등의 수지를 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 등전점 전기영동법 등의 전기영동법 등을 사용하여 정제 제품을 얻을 수 있다.
한편 본 발명의 폴리펩타이드가 세포 내에서 불용체를 형성하여 발현되는 경우에는 세포를 회수 후 파쇄시키고 원심분리하여 얻어진 침전 획분으로부터 통상의 방법에 따라 본 발명의 폴리펩타이드를 회수한 후 그 폴리펩타이드의 불용체를 폴리펩타이드 변성제로 가용화시킨다. 그 가용화제를 폴리펩타이드 변성제를 포함하지 않거나 폴리펩타이드 변성제의 농도가 폴리펩타이드를 변성시키지 못할 정도로 희석된 용액을 사용할 수도 있다. 또는 투석 후 본 발명의 폴리펩타이드를 정상적인 입체구조로 구성하게 한 후 상기와 같은 분리정제법에 의해 정제 제품을 얻을 수 있다.
통상 단백질의 정제방법 [J. Evan. Sadler et al.: Methods in Enzymology, 83, 458]에 준하여 정제한다. 또한 단백질의 폴리펩타이드를 다른 단백질과 융합, 단백질을 생성하여 융합시킨 단백질에 친화성을 부여하는 물질을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수도 있다. [Akio Yamakawa, Experimental Medicine, 13, 469-474 (1995)]에 기재된 방법에 준한다. 예를 들면 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227-8231 (1989), Genes Develop., 4, 1288(1990)]에 방법에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 프로테인 A과 융합단백질을 생성하고 이뮤노글로불린 G를 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제하는 것도 가능하다.
한편 본 발명의 폴리펩타이드를 FLAG 펩타이드와 융합단백질로 생성하고 항 FLAG 항체를 이용하여 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제하는 것도 가능하다[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227(1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)].
또한 본 발명의 폴리펩타이드 자신에 대해 항체를 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제하는 것도 가능하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 공지의 방법 [J. Biomolecular NMR, 6, 129-134; Science, 242, 1162-1164; J. Biochem., 110, 166-168 (1991)]에 준해 인 비트로 전사 번역을 통해 생산할 수 있다.
상기에서 취득 된 폴리펩타이드의 아미노산 정제를 기초로 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카보닐법) 등의 화학합성법에 의해서도 본 발명의 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. Advanced ChemTech, Applied Biosystems, Pharmacia Biotech, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu 등에 폴리펩타이드의 합성기를 이용하여 화학합성이 가능하다.
정제시킨 본 발명의 폴리펩타이드의 구조해석은 단백질화학의 통상 사용되는 방법 예를 들면 유전자 크로닝 단백질 구조해석 방법에 의해 실시 가능하다.
(변이형 폴리펩타이드의 제조 방법)
본 발명의 폴리펩타이드의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가는 출원 전 주지된 기술에 따라 자리지정돌연변이법 등에 의해 실시 할 수 있다. 하나 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환, 부가될 수 있으며 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1∼38, JohnWiley & Sons(1987-1997), Nucleic Acids Research,10,6487(1982),Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79,6409(1982), Gene,34,315(1985), Nucleic Acids Research,13,4431(1985), Proc.Natl.Acad.Sci USA,82,488(1985),Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,5662(1984), Science,224,1431(1984), PCT WO85/00817(1985), Nature,316,601(1985)에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
(유전자 치료)
특정 실시태양에 있어서 항체 또는 그 기능적 유도체를 코드화하는 서열을 포함하는 핵산은 본 발명의 폴리펩타이드의 이상 발현 및/또는 활성에 관련된 질환 또는 잔해를 처치, 저해, 예방하기 위한 유전자 치료 목적으로 투여할 수 있다. 유전자 치료는 발현 또는 발현 가능한 핵산의 피검체 내의 투여에 의한 치료이다. 본 발명의 실시태양에 있어서 핵산은 이를 코드화하는 단백질을 생산하고 그 단백질은 치료 효과를 나타낸다.
해당 분야에 이용 가능한 유전자 치료의 방법은 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 다음과 같다.
유전자 치료 방법에 관한 일반적인 사항은 Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); and May, TIBTECH 11(5):155-215(1993)을 참조하고 유전자 치료에 있어서 사용되는 일반적인 재조합 DNA 기술은 Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)에 기재되어 있다.
(치료 활성 또는 예방 활성의 증명)
본 발명의 화합물 또는 약학적 조성물은 바람직하게는 인간의 사용 전에 인 비트로에서 그 후에 인 비보에서 원하는 치료 활성 또는 예방 활성에 관한 시험을 행한다. 예를 들면 화합물 또는 약학적 조성물의 치료 유용성 또는 예방 유용성을 증명하기 위해서 인 비트로 에세이로는 세포주 또는 환자 조직 샘플에 대해 화합물의 효과는 당업자에 공지된 기술(세포 용해 에세이 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아님)을 이용하여 결정할 수 있다. 본 발명에 따른 특정 화합물의 투여가 효과를 나타내는지 여부를 결정하기 위해 사용되는 방법은 인 비트로 에세이로는 인 비트로 세포배양 에세이를 들 수 있으며 이 에세이는 환자 조직 샘플 배양물을 증식시켜 여기서 화합물의 효과를 관찰하는 것이다. 또한 조직 샘플에 대해 화합물의 효과를 관찰 할 수 있다.
(치료/예방을 위한 투여 및 조성물)
본 발명은 피험체에 유효량의 본 발명 프로모터를 포함하는 성분 또는 약학적 조성물의 투여에 따른 처치, 저해 및 예방 방법을 제공한다. 바람직하게는 프로모터를 포함하는 성분은 실질적으로 정제된 것을 사용한다(예를 들면 그 효과를 제한하거나 원하지 않는 부작용의 생성물질이 실질적으로 존재하지 않는 상태). 피험체는 바람직하게는 소, 피그, 말, 치킨, 캣, 개 등의 동물을 들 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니고 바람직하게는 포유동물이며 가장 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 핵산분자 또는 폴리펩타이드가 의학으로서 사용하는 경우 이와 같은 조성물은 약학적으로 수용 가능한 캐리어 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 의학에 포함되는 약학적으로 수용 가능한 캐리어는 해당 분야에 있어서 공지된 임의의 물질을 들 수 있다.
이와 같은 적절한 처방 재료 또는 약학적으로 수용 가능한 캐리어로서는 항산화제, 보존제, 착색제, 풍미제 및 희석제, 유화제, 현탁화제, 용매, 필러, 증량제, 완충제, 전달비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 어주번트 등을 열거할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 대표적인 본 발명의 의학은 분리된 다기능성 줄기세포 또는 그의 개변된 유도체를 하나 이상의 생리적으로 수용 가능한 캐리어 부형제 또는 희석제를 포함하는 조성물의 형태로 투여한다. 예를 들면 적절한 비히클은 주사용수, 생리용액 또는 인공척수액 등이고 이와 같은 비경구 전달을 위한 조성물에 일반적인 다른 물질을 보충 할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 수용 가능한 캐리어 부형제로서는 안정화제는 리시피언트에 대해 비독성이고 바람직하게는 사용하는 투여량 및 농도에 있어서 불활성인 것이다. 예를 들면 인산염, 구연산염 또는 다른 유기산; 아스콜빈산, 알파-토코페롤; 저분자량 폴리펩타이드; 단백질(예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노 글로불린); 친수성 폴리머(예를 들면 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들면 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 알기닌 또는 라이신); 모노사카라이드, 비사카라이드 및 다른 탄수화물(예를 들면 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린); 킬레이트화제(예를 들면 EDTA); 당알코올(예를 들면 만니톨 또는 솔비톨); 염형성 카운터이온(예를 들면 소디움); 및/또는 비이온성 계면활성제(예를 들면 트윈, 플루로닉 또는 폴리에틸렌글리콜) 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
예시한 적절한 캐리어로서는 중성 완충화생리식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 생리식염수 등을 들 수 있다. 바람직하게는 이 생성물은 적절한 부형제(예를 들면 슈크로즈)를 사용하여 동결 건조제로서 처방한다. 다른 표준적인 캐리어는 캐리어, 희석제 및 부형제는 필요에 따라 포함할 수 있다. 다른 예시적인 조성물은 pH 7.0 내지 8.5의 트리스 완충액 또는 pH 4.0 내지 5.5의 초산 완충액을 포함하며 여기에 솔비톨 또는 그의 적절한 대체물을 포함할 수 있다.
본 발명의 의학은 경구적 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 또는 본 발명의 의학은 정맥 내 또는 피하에 투여할 수 있다. 전신투여의 경우 본 발명에 있어서 사용되는 의학은 발열물질을 포함하지 않는다. 약학적으로 수용 가능한 수용액의 형태를 지닌다. 이와 같은 약학적으로 수용 가능한 조성물 조제는 pH, 등장성, 안정성 등을 고려하여 당업자가 용이하게 행할 수 있다. 본 명세서에 있어서 투여방법은 경구투여, 비경구투여(예를 들면 정맥내투여, 근육내투여, 피하투여, 피내투여, 점막투여, 직장내투여, 질내투여, 환자의 국소투여, 피부투여 등)이다. 이와 같은 투여를 위한 처방물은 임의의 제형 형태를 제공한다. 이와 같은 제제 형태로서는 예를 들면 액제, 주사제, 서방제 등을 들 수 있다.
본 발명의 의학은 필요에 따라 생리학적으로 수용 가능한 캐리어, 부형제 또는 안정화제(일본 약국방 제 14판 및 이의 추보 최신판 Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990 등 참조)와 원하는 정도의 순도를 지닌 당사슬조성물을 혼합하는 것에 의해 동결건조시킨 겔 또는 수용액 형태로 조제하여 보존할 수 있다.
본 발명의 처치방법에 있어서 사용하는 당사슬 조성물량은 사용 목적, 대상 질환(종류, 중증도 등), 환자의 연령, 체중, 성별, 거주력, 세포의 형태 또는 종류 등을 고려하여 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 본 발명의 처치방법을 피험체( 또는 환자)에 대해 시행하는 빈도는 사용 목적, 대상 질환(종류, 중증도 등), 환자의 연령, 체중, 성별, 거주력 및 치료경로 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 빈도로서는 예를 들면 수일 내지 수개월에 1회(예를 들면 1주일에 1회 내지 1개월에 1회)의 투여를 들 수 있다. 일주간 내지 일개월간 투여 경과를 관찰하여 시행한다.
(면역치료)
본 명세서에 있어서 '백신'은 신체 중에 투여하여 활성 면역을 생성한다. 통상 감염성 인자 또는 감염인자의 부분 또는 그러한 인자 또는 부분을 생성하는 인자(예를 들면 유전자 서열 등)를 포함하는 조성물(예를 들면 현탁액 또는 용액)이다. 백신을 구성하는 항원성 부분은 미생물(예를 들면 바이러스 또는 세균 등) 또는 미생물로부터 정제된 천연 생성물, 합성 생성물 또는 유전자 조작된 단백질, 펩타이드, 다당 또는 동일한 형태의 생성물 또는 그와 같은 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 지닌 핵산분자 등이다. 백신은 중화항체를 생성하는 것에 의해 그 효과를 발현한다.
본 명세서에 있어서 '유전자 백신'은 백신 중 투여된 피험체에 있어서 발현하는 발현물이 백신의 작용을 지니는 인자(대표적으로는 핵산 분자)를 포함하는 조성물(예를 들면 현탁액 또는 용액 등)이다. 대표적인 유전자 백신은 항원성을 지닌 유전자 산물을 코드화하는 핵산 서열을 지닌 핵산 분자(예를 들면 백터, 플라스미드, 네이키드 DNA 등)이다.
본 명세서에 있어서 백신의 면역학적 효과는 해당 분야에 있어서 공지된 임의의 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 이와 같은 방법으로는 예를 들면 CTL 전구세포 빈도분석, ELISPOT법, 테트라머법, 실시간 PCR법 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 예시적인 설명으로는 CLT 전구세포빈도분석에는 말초혈 임파구 또는 항원 펩타이드 및 IL-2 존재 하에 배양시킨 임파구를 한계 희석시켜 IL-2와 피더 세포와의 공존 하에 배양시키고 증식된 웰을 백신 또는 그의 후보로서 자극시켜 인터페론-감마 생성유무를 ELISA법으로 측정한다. 여기에 양성 웰을 포아존 분석에 따라 CTL 전구세포의 빈도를 산출하고 백신의 효과를 평가하는 것이 가능하다. 여기에 양성 세포수가 항원 특이적 CTL수이고 이 수가 많은 것이 백신으로서 높은 효력을 지닌다.
본 발명은 암백신으로서 사용할 수 있다. 이와 같은 경우 암항원을 외래유전자로서 통합시키는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서 '암 항원'은 정상세포가 암화되는 것에 따라 수반되는 신규 발현에 의한 항원분자이다. 이와 같은 암 항원으로는 예를 들면 다음과 같은 것을 들 수 있으며 이에 한정하는 것은 아니다.
(1)암 바이러스 유래 항원(예를 들면 아데노바이러스, 폴리오마바이러스 또는 SV40 등의 DNA형 종양바이러스에 유래하는 T항원 등). 인간, 마우스 RNA형 종양바이러스로는 바이러스의 엔벨로프 단백질이 세포표면에 발현한다.
(2)암이종 이식항원(tumor specific transplantation antigen, TSTA). 이 항원은 동일한 암세포에 대해 특이적 면역응답이 성립되기 때문에 그 암세포가 거절되는 경우 그 표적항원이 되는 것에 해당한다. 유전자 변이에 의해 세포 내에 변이 단백질이 작용하여도 다른 세포 내에 정상 단백질과는 동일하게 펩타이드 단편으로서 세포 내에서 주요조직적합 항원 유전자 복합체(HMC) 분자와 결합하여 암세포 표면에 발현된다.
(3)암 연관항원(tumor associated antigen, TAA). 암세포에 반드시 특이적인 것은 아니나 암화에 수반하여 특징적인 발현을 나타내는 항원. 예를 들면 간암에 있어서 알파-페토프로테인, 장암 등에 있어서 태아성 암 항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 등이 해당된다. 이것은 원래 정상의 태아에 존재하는 단백질이고 성인의 조직에는 인식되지 않는다. 그러나 이러한 단백질은 암화에 수반되어 재발현을 나타내는 암 태아항원(oncofetal antigen)이라 칭한다.
본 명세서에 있어서 사용되는 암 항원으로는 어느 형태이건 사용할 수 있으며 특히 암 연관 항원으로 호칭되는 형태의 것이 바람직하다. MHC와의 회합에 의한 암세포의 표면에서 발현되는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서 '어쥬번트'는 투여하는 면역항원과 혼합하여 사용하는 경우 면역 반응을 증강시키거나 또는 이를 변경시키는 물질이다. 어쥬번트는 예를 들면 광물, 세균, 식물 합성 또는 숙주의 생성물로 경우에 따라 분류된다.
본 명세서에 있어서 '병원체'로는 숙주에 대해 질환 또는 장애를 발생시키는 생물체 또는 인자를 말한다.
본 명세서에 있어서 '예방'은 어느 질병 또는 장애에 있어서 이와 같은 상태를 유발시키기 전에 이와 같은 상태에 놓이지 않도록 하는 처치를 말한다.
본 명세서에 있어서 '치료'는 어느 질환 또는 장애에 있어서 이와 같은 상태의 경우 질환 또는 장애의 악화를 방지하고 바람직하게는 현상 유지 또는 경감 더욱 바람직하게는 해소하는 것을 말한다.
이와 같은 치료 활성 또는 예방 활성은 본 명세서의 백신에 있어서 판정하는 경우 바람직하게는 인간에 사용하기 전에 인 비트로에서 그 후에 인 비보로 시험한다. 예를 들면 본 발명의 유전자 백신의 치료 유용성 또는 예방 유용성을 증명하기 위한 인 비트로 에세이로는 세포주 또는 환자조직 시료에 대한 백신의 특이적인 결합의 효과를 들 수 있다. 이와 같은 시험은 당업자에 공지된 기술(예를 들면 ELISA 등의 면역학적 에세이)을 이용하여 결정할 수 있다. 인 비보 시험으로는 예를 들면 중화항체를 야기하는 능력 여부를 평가하는 시험 등을 열거할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
본 명세서에 있어서 '피험체'는 본 발명의 처치에 적용하는 생물이다. 즉 환자를 말한다. 환자 또는 피험체는 바람직하게는 인간이다.
본 발명은 피험체에의 유효량의 본 발명의 유전자 백신 투여에 의해 처치, 저해 및 예방 방지 방법을 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 유전자 백신은 실질적으로 정제된 것이다(예를 들면 그 결과를 제한하거나 원하지 않는 부작용을 생성하는 물질이 실질적으로 존재하지 않는 상태이다).
본 명세서 중 '투여한다'는 본 발명의 백신 또는 그것을 포함하는 의약조성물을 단독으로 또는 다른 치료제와 조합시켜 처치를 목적으로 숙주에 투여하는 것을 의미한다. 조합으로는 예를 들면 혼합물로서 동시에, 별개로서 동시에 병립하여 행한다. 또는 순차적으로 투여할 수도 있다. 이것은 조합된 약제가 치료혼합물로서 투여하는 것을 포함한다. 이와 같이 조합된 약제는 별개로서 동시에 (예를 들면 동시에 개체에 각각의 점막을 통하여 투여하는 경우) 투여하는 수순을 포함한다. '조합'투여는 첫 번째 투여 및 연속적인 두 번째 투여로 화합물 또는 약제를 각각으로 별개로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명에 있어서 백신의 투여는 이와 같은 수법에 의해 행하는 것이 바람직하다. 바람직하게는 주사를 통해 사용할 수 있다. 환자에 경우 부담을 주지 않도록 투여하는 것이 바람직하다.
여기에서 본 발명에 있어서 무침주사기는 주사침이 없이 가스압력 등의 탄성부재의 탄성에 의해 피스톤을 이송시켜 약액을 피하에 분사시켜 약제성분을 피하 바람직하게는 피하세포에 투여하는 의료기기를 말한다.
구체적인 예로는 시마젯(시마즈 제작사 제조), Medi-Jector VisionTM ( Elitemedica사 제조), PenJetTM (PenJet사 제조) 등이 시판되어 있다. 또한 유전자총(파티클건)은 DNA를 피복하여 금 또는 텅스텐 등의 고밀도 입자를 헬륨 등의 가스를 이용하여 가속시켜 인 비보 유전자 도입이 가능한 의료 시험기구이다. 유전자총의 이점은 소량의 유전자도 효율적으로 세포에 도입할 수 있고 상이한 조작자에게도 안정한 결과를 얻을 수 있는 것이다.
구체적으로는 예를 들면 미국 바이오레드사 Helios Gene Gunm 등이 시판되고 있으며 이용 가능하다.
본 명세서에 있어서 '지시서'는 본 발명의 의약 등을 투여하는 방법 또는 진단하는 방법을 의사, 환자 등에 투여하는 사람, 진단하는 사람에 대해 기재되어 있는 것이다. 이와 같은 지시서는 본 발명의 진단약, 예방약, 의약 등을 투여하는 수순을 지시하는 문헌이 기재되어 있다. 이 지시서는 본 발명이 실시하는 국가의 감독관청(예를 들면 일본의 후생노동성, 미국의 식품의약품국 등)의 규정에 따라 작성되고 이 감독관청에 승인을 받아 기재한다. 지시서는 첨부문서일 수 있다. 통상은 종이문서이지만 때에 따라서는 전자매체(예를 들면 인터넷에서 제공되는 웹사이트, 전자메일)의 형태를 지닐 수 있다.
본 발명에 있어서 예방 처치의 종료 판단은 시판 에세이 또는 기기사용에 의해 야기되는 항체를 확인하는 것에 의해 행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 의약을 포함하는 용기를 준비하는 약학적 패키지 또는 키트를 제공한다. 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용, 시판은 규제하는 정부 기관이 정한 형식의 통지가 이와 같은 용기의 임의의 부착되어 있고 이와 같은 통지는 인간의 투여에 대한 제조, 사용 또는 판매에 관한 정부기관에 의한 승인을 표시한다.
(본 명세서에 있어서 사용되는 일반적 기술)
본 명세서에 있어서 사용되는 기술은 구체적으로 한정하지 않는 한 당해 분야의 기술 범위 내에 있다. 당사슬과학, 마이크로풀루이딕스, 미세가공, 유기화학, 생화학, 유전자공학, 분자생물학, 미생물학, 유전학 및 관련 분야에 있어서 주지관용기술을 사용한다. 이와 같은 기술은 예를 들면 다음에 열거한 문헌 및 명세서에 있어서 다른 장소에 인용하지 않는 한 충분히 이해될 것이다.
미세가공에 있어서는 예를 들면 Campbell, S.A. (1996), The Science and Engineering of Microelectronic Fabrication, Oxford University Press; Zaut, P.V. (1996), Micromicroarray Fabrication: a Practical Guide to Semiconductor Processing, Semiconductor Services; Madou, M.J. (1997), Fundamentals of Microfabrication, CRC1 5 Press; Rai-Choudhury, P. (1997), Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication: Microlithography; 등에 기재된 것을 본 명세서에 관련하여 참조한다.
본 명세서에 있어서 분자생물학적 수법, 생화학적 수법, 미생물학적 수법, 당사슬과학적 수법은 해당분야에 있어서 주지관용된 기술로서 예를 들면 Maniatis, T. et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and its 3rd Ed. (2001); Ausubel, F.M. et al. eds, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc., NY, 10158 (2000); Innis, M.A. (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Innis, M.A. et al. (1995), PCR Strategies, Academic Press; Sninsky, J.J. et al. (1999), PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press; Gait, M.J. (1985), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J. (1990), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991), Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approac, IRL Press; Adams, R.L. et al. (1992), The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994), Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al. (1996), Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press; Method in Enzymology 230, 242, 247, Academic Press, 1994에 기재된 기술을 본 명세서와 관련하여 참조한다.
(바람직한 실시태양의 설명)
이하 바람직한 실시태양의 설명을 기재한다. 이 실시태양은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위는 이러한 실시태양으로 한정하는 것은 아니다. 당업자는 다음과 같은 바람직한 실시예를 참고하여 본 발명의 범위 내에서 개변, 변경을 용이하게 행할 수 있다.
하나의 국면에 있어서 본 발명은 HHV 6(HHV 6A 및 HHV 6B 특히 HHV 6B) HHV 7 MIE 프로모터 및/또는 HHV 7 U95 프로모터를 제공한다. 특히 HHV 6B MIE 프로모터 HHV 7 MIE 프로모터 및 HHV 7 U95 프로모터는 예상 밖으로 HCMV IE 프로모터보다도 임파구에 선택성이 매우 높은 것으로 발견되었다. 특히 부착성 세포(293세포, Vero 세포 등)에는 HCMV IE 프로모터의 1/100정도의 활성으로 MIE 프로모터가 나타내는데 반해 Sup T1, U937 등의 임파구P 세포에 대해서는 수배의 높은 발현효율이 얻어진다. 이와 같은 선택성, 특이성의 증가는 DNA 백신, 유전자 치료로서 특히 임파구를 타겟으로 하는 의약품의 개발에 응용될 수 있다. 인 비보에 있어서 발현계에는 메틸라제 작용에 의해 CMV 프로모터 등의 강력한 활성을 유지하여도 활성이 감소되지 않기 때문에 혈구계, 임파구계 세포의 인 비보 발현량의 확보를 위해 본 발명의 프로모터를 사용할 수 있는 것이 이해된다. 유전병 또는 유전자 치료 등에 있어서 레트로바이러스 벡터가 일반적으로 사용되지만 프로모터로서 LTR의 활성은 강력하지 않기 때문에 발현하려는 유전자의 업스트림에 본 발명의 프로모터를 도입하는 것에 의해 혈구계 세포에 있어서 강력한 발현을 얻을 수 있다. 백혈병 등의 혈액세포질환을 타겟으로 한 유전자 치료에 있어서 본 발명은 유용하다. 더욱이 유전자 발현을 넉아웃시키는 방법으로 RNAi를 사용할 때 헤어핀형 RNA 발현 벡터의 프로모터로서 본 발명의 프로모터를 사용하는 것이 좋고 혈구계 발현 억제효과를 더욱 효율적으로 이룰 수 있다. 생체의 말초혈에 의한 마이크로 에세이 또는 수상세포 등을 플로우 사이토메트리에 의해 분리 정제시키고 그것의 세포에 본 발명의 프로모터 억제 하에서 암특이적 항원 및 종양괴사인자(TNF) 유전자 등을 발현되도록 구축시킨 플라스미드를 트랜스펙트시키고 항원의 발현을 확인한 후에 원래의 생체에 재도입하여 글라스Ⅰ-HLA를 매개하는 암 항원특이적 CTL을 효율적으로 활성화시킨 암 유전자치료를 실현할 수 있다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 프로모터 서열은 서열번호 1로 나타난 서열 내에 적어도 R3영역 또는 그의 기능적 개변체를 포함한다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 서열 내에 전사 개시점의 기점으로서 적어도 -574 ∼ -427 의 서열, 더욱 바람직하게는 전사 개시점을 기점으로서 적어도 -1051 ∼ -427 의 서열을 포함한다. 이와 같은 서열에 인핸서 활성을 지닌 영역이 있을 것으로 예측된다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 NF-κB AP-1의 프로모터를 포함한다.
바람직한 실시태양에서는 본 발명의 프로모터는 서열번호 1로 표시되는 서열을 포함하고 더욱 바람직하게는 서열번호 1로 표시된 서열로부터 실질적으로 구성된다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 (a)서열 번호 1에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그 프라그먼트 서열을 지니는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 1에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그의 프라그먼트인 폴리펩타이드; (c) (a) 또는 (b) 중 하나의 폴리뉴클레오타이드에 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈 되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; (d) (a) 내지 (c) 중 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 서열을 지닌 동일성이 적어도 70%인 염기 서열로서 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 여기서 이 생물학적 활성은 프로모터 활성 및/또는 인핸서 활성을 지닌 것으로 이에 한정하는 것은 아니다. 프로모터 활성 및 인핸서 활성은 해당분야에 있어서 주지된 기술로 측정할 수 있으며 이와 같은 기법은 본 명세서에 있어서 기재되어 있고 실시예에 있어서 예시되어 있다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 상기 (a)∼(d)에 있어서 치환, 부가 또는 결실을 포함하여도 좋다. 이와 같은 치환, 부가 및 결실의 수는 예를 들면 50이하, 40이하, 30이하, 20이하, 15이하, 10이하, 9이하, 8이하, 7이하, 6이하, 5이하, 4이하, 3이하, 2이하인 것이 바람직하다. 보다 적은 수의 치환, 부가 또는 결실이 바람직하지만 생물학적 활성을 유지하는(바람직하게는 HHV 6B MIE 프로모터와 유사하거나 실질적으로 동일한 활성) 한 그 수는 많아도 좋다.
바람직한 실시태양에 있어서 상기 (a)∼(d) 중의 하나의 폴리펩타이드 또는 그의 상보서열에 대한 동일성은 적어도 약 80%이상이고 바람직하게는 90%이상 더욱 바람직하게는 약 98%이상 가장 바람직하게는 적어도 약 99%이상이다.
바람직한 실시태양에 있어서 본 발명의 핵산 분자는 적어도 8개의 연속하는 뉴클레오티드를 지닌다. 본 발명의 핵산분자는 본 발명의 사용목적에 의해 그 적절한 뉴클레오티드 길이를 변동할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 핵산 분자를 적어도 10 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 더욱 바람직하게는 적어도 15 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 더욱 바람직하게는 적어도 20 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 이 뉴클레오티드의 하한은 구체적으로 예시하는 숫자로는 이와 같은 숫자간의 수(예를 들면 9, 11, 12, 13, 14, 16 등)이거나 이 이상의 수(예를 들면 21, 22, ... 30 등)이다. 본 발명의 핵산 분자는 목적하는 용도(예를 들면 프로모터)로서 사용하는 것에 한해 이 상한의 길이는 제한하는 것은 아니다. 스트린전시는 높아도 중간 정도이어도 낮아도 좋고 정도는 당업자가 적절한 상황에 결정할 수 있다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 서열번호 2로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 프로모터 서열은 서열번호 2로 나타난 서열 내에 적어도 R2영역 또는 그의 기능적 개변체를 포함한다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 서열번호 2로 표시되는 서열 내에 전사 개시점의 기점으로서 적어도 -388 ∼ +22 의 서열, 더욱 바람직하게는 전사 개시점을 기점으로서 적어도 -493 ∼ +22 의 서열을 포함한다. 이와 같은 서열에 인핸서 활성을 지닌 영역이 있을 것으로 예측된다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 NF-κB(서열번호 2에 있어서 -464 ∼ -455 및 -359 ∼ -350의 서열영역)의 프로모터를 포함한다.
바람직한 실시태양에서는 본 발명의 프로모터는 서열번호 2로 표시되는 서열을 포함하고 더욱 바람직하게는 서열번호 2로 표시된 서열로부터 실질적으로 구성된다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 (a)서열 번호 2에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그 프라그먼트 서열을 지니는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 2에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그의 프라그먼트인 폴리펩타이드; (c) (a) 또는 (b) 중 하나의 폴리뉴클레오타이드에 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈 되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; (d) (a) 내지 (c) 중 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 서열을 지닌 동일성이 적어도 70%인 염기 서열로서 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 여기서 이 생물학적 활성은 프로모터 활성 및/또는 인핸서 활성을 지닌 것으로 이에 한정하는 것은 아니다. 프로모터 활성 및 인핸서 활성은 해당분야에 있어서 주지된 기술로 측정할 수 있으며 이와 같은 기법은 본 명세서에 있어서 기재되어 있고 실시예에 있어서 예시되어 있다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 상기 (a)∼(d)에 있어서 치환, 부가 또는 결실을 포함하여도 좋다. 이와 같은 치환, 부가 및 결실의 수는 예를 들면 50이하, 40이하, 30이하, 20이하, 15이하, 10이하, 9이하, 8이하, 7이하, 6이하, 5이하, 4이하, 3이하, 2이하인 것이 바람직하다. 보다 적은 수의 치환, 부가 또는 결실이 바람직하지만 생물학적 활성을 유지하는(바람직하게는 HHV 7 MIE 프로모터와 유사하거나 실질적으로 동일한 활성) 한 그 수는 많아도 좋다.
바람직한 실시태양에 있어서 상기 (a)∼(d) 중의 하나의 폴리펩타이드 또는 그의 상보서열에 대한 동일성은 적어도 약 80%이상이고 바람직하게는 90%이상 더욱 바람직하게는 약 98%이상 가장 바람직하게는 적어도 약 99%이상이다.
바람직한 실시태양에 있어서 본 발명의 핵산 분자는 적어도 8개의 연속하는 뉴클레오티드를 지닌다. 본 발명의 핵산분자는 본 발명의 사용목적에 의해 그 적절한 뉴클레오티드 길이를 변동할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 핵산 분자를 적어도 10 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 더욱 바람직하게는 적어도 15 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 더욱 바람직하게는 적어도 20 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 이 뉴클레오티드의 하한은 구체적으로 예시하는 숫자로는 이와 같은 숫자간의 수(예를 들면 9, 11, 12, 13, 14, 16 등)이거나 이 이상의 수(예를 들면 21, 22, ... 30 등)이다. 본 발명의 핵산 분자는 목적하는 용도(예를 들면 프로모터)로서 사용하는 것에 한해 이 상한의 길이는 제한하는 것은 아니다. 스트린전시는 높아도 중간 정도이어도 낮아도 좋고 정도는 당업자가 적절한 상황에 결정할 수 있다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 서열번호 12로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 프로모터 서열은 서열번호 12로 나타난 서열 내에 적어도 R2영역 또는 그의 기능적 개변체를 포함한다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 프로모터는 서열번호 12로 표시되는 서열 내에 전사 개시점의 기점으로서 적어도 -379 ∼ +16 의 서열, 더욱 바람직하게는 전사 개시점을 기점으로서 적어도 -484 ∼ +16 의 서열을 포함한다. 이와 같은 서열에 인핸서 활성을 지닌 영역이 있을 것으로 예측된다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 NF-κB(서열번호 12에 있어서 -478 ∼ -469 및 -373 ∼ -364의 서열영역)의 프로모터를 포함한다.
바람직한 실시태양에서는 본 발명의 프로모터는 서열번호 12로 표시되는 서열을 포함하고 더욱 바람직하게는 서열번호 12로 표시된 서열로부터 실질적으로 구성된다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 (a)서열 번호 12에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그 프라그먼트 서열을 지니는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 12에 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그의 프라그먼트인 폴리펩타이드; (c) (a) 또는 (b) 중 하나의 폴리뉴클레오타이드에 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈 되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; (d) (a) 내지 (c) 중 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보 서열을 지닌 동일성이 적어도 70%인 염기 서열로서 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 여기서 이 생물학적 활성은 프로모터 활성 및/또는 인핸서 활성을 지닌 것으로 이에 한정하는 것은 아니다. 프로모터 활성 및 인핸서 활성은 해당분야에 있어서 주지된 기술로 측정할 수 있으며 이와 같은 기법은 본 명세서에 있어서 기재되어 있고 실시예에 있어서 예시되어 있다.
하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 프로모터는 상기 (a)∼(d)에 있어서 치환, 부가 또는 결실을 포함하여도 좋다. 이와 같은 치환, 부가 및 결실의 수는 예를 들면 50이하, 40이하, 30이하, 20이하, 15이하, 10이하, 9이하, 8이하, 7이하, 6이하, 5이하, 4이하, 3이하, 2이하인 것이 바람직하다. 보다 적은 수의 치환, 부가 또는 결실이 바람직하지만 생물학적 활성을 유지하는(바람직하게는 HHV 7 U95 프로모터와 유사하거나 실질적으로 동일한 활성) 한 그 수는 많아도 좋다.
바람직한 실시태양에 있어서 상기 (a)∼(d) 중의 하나의 폴리펩타이드 또는 그의 상보서열에 대한 동일성은 적어도 약 80%이상이고 바람직하게는 90%이상 더욱 바람직하게는 약 98%이상 가장 바람직하게는 적어도 약 99%이상이다.
바람직한 실시태양에 있어서 본 발명의 핵산 분자는 적어도 8개의 연속하는 뉴클레오티드를 지닌다. 본 발명의 핵산분자는 본 발명의 사용목적에 의해 그 적절한 뉴클레오티드 길이를 변동할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 핵산 분자를 적어도 10 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 더욱 바람직하게는 적어도 15 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 더욱 바람직하게는 적어도 20 연속하는 뉴클레오티드 길이를 지닌다. 이 뉴클레오티드의 하한은 구체적으로 예시하는 숫자로는 이와 같은 숫자간의 수(예를 들면 9, 11, 12, 13, 14, 16 등)이거나 이 이상의 수(예를 들면 21, 22, ... 30 등)이다. 본 발명의 핵산 분자는 목적하는 용도(예를 들면 프로모터)로서 사용하는 것에 한해 이 상한의 길이는 제한하는 것은 아니다. 스트린전시는 높아도 중간 정도이어도 낮아도 좋고 정도는 당업자가 적절한 상황에 결정할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에 있어서 본 발명은 본 발명의 프로모터(HHV-6 MIE 프로모터, HHV-7 MIE 프로모터, HHV-7 U95 프로모터 등)를 포함하는 핵산 구축물을 제공한다. 여기서 이와 같은 핵산 구축물은 임파구 특이적인 발현유도 성질을 지니고 이의 유용성은 높으며 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV) IE 프로모터에 비해 예상 밖으로 높은 선택성을 나타낸다.
따라서 하나의 실시태양에 있어서 본 발명의 핵산 구축물은 본 발명의 프로모터와 다른 외래 유전자를 코드화하는 서열을 본 발명의 프로모터 서열에 대해 작동 가능케 연결된 것을 포함한다.
이와 같은 외래 유전자로서는 예를 들면 RNAi 분자, 약제, 결손된 열성 유전자, 선택마커를 코드화하는 것을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
바람직하게는 본 발명에 사용되는 선택마커는 본 발명의 핵산 구축물이 도입되는 숙주의 배지에서 선별 가능한 것이며 예를 들면 이 선택마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에서 눈으로 선별 가능한 것이 더욱 바람직하다. 예를 들면 포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt) 또는 녹색형광단백질(GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(dsRed)을 들 수 있다.
본 발명의 핵산 구축물에 있어서 포함하는 선택마커는 바람직하게는 본 발명의 핵산 구축물이 도입되는 숙주에 대해 실질적으로 독성을 지니지 않은 것이 바람직하다. 치료 예방 목적으로 발명을 사용할 경우 유해작용은 없는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 구축물에 있어서 포함되는 것은 예를 들면 결손된 열성 유전자이다. 이와 같은 결손된 열성 유전자는 결손된 질환의 상태를 나타내는 임의의 열성 유전자를 말한다. 예를 들면 ADA 유전자(중증 복합 면역 부전증에 관련함), PNP 유전자(중증 복합 면역 부전증에 관련함), γc체인유전자(중증 복합 면역 부전증에 관련함), TAP 유전자(MHC I 결손증에 관련함), MHC Ⅱ유전자(MHC Ⅱ 결손증에 관련함), X연쇄WASP(Wiskott-Aldrich 증후군에 관련함), CD40 리간드(X연쇄성 고 IgM 증후군에 관련함), PI3K 유사유전자(모세혈관 확장성 실조증에 관련함) 및 DNA 헬리카제(Bloom's 증후군에 관련함)를 들 수 있다.
바람직하게는 실시태양에서 본 발명의 핵산 구축물에 있어서 포함되는 약제는 사이토카인, 캐모카인, 증식인자, 단백질, 호르몬, 펩타이드 호르몬(IFN-알파,IFN-감마, IL-2, IL-12, G-CSF, GM-CSF) 등의 단백질성 약제이다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 핵산 구축물에는 본 발명의 프로모터와 외래 유전자와의 혈구계세포 특히 T 임파구에 특이적으로 발현을 유도하기 위해 사용한다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 이와 같은 발현벡터는 본 발명의 핵산 구축물에는 존재하지 않으나 발현에 필수적인 엘레멘트(예를 들면 터미네이터, 인핸서 서열 등을 작동 가능하게 연결시킨 상태를 포함한다) 숙주에서의 발현을 가능케 한다.
또 다른 바람직한 실시태양에서 선택마커는 불사멸 유전자(예를 들면 bcl-2)이다. 또는 선택마커는 히포산틴 구아닌 포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt), 독성산물을 코드화하는 유전자, 자살 기질과 조합된 조건에 의해 활성인 독성 유전자 산물(예를 들면 아실클로비르(acyclovir)와 조합된 단순 헤르페스바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK))이다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서 본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 세포를 제공한다. 이와 같은 세포는 임파구의 경우 외래 유전자로 코드화된 단백질을 발현시켜 항진된 것이다.
바람직하게는 본 발명의 세포는 본 발명의 프로모터 서열과 다른 종류의 세포인 것이 바람직하다. 다른 종이어도 프로모터 활성을 나타내는 것은 더욱 효과적이다. 본 발명의 핵산 분자를 세포에 도입하는 방법은 해당 분야에 있어서 주지된 것이고 본 명세서에 있어서 상술한 바 있다. 또는 이와 같은 세포는 세포를 포함하는 샘플 중에 있어서 이 핵산 분자를 포함하는 세포를 스크리닝하는 것에 의해 동정할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 세포는 바람직하게는 미분화 상태인 것이다. 본 발명의 핵산 분자가 발현되고 있는 세포는 통상 미분화 상태이다. 그러므로 이와 같은 핵산 분자가 제어 가능하게 발현될 수 있도록 도입된 세포는 이 미분화 상태를 제어할 수 있다. 이와 같은 세포를 사용하여 본 발명의 핵산 분자를 대량으로 생산 할 수 있다. 이와 같은 생산 방법은 해당분야에 있어서 주지된 것이고 본 명세서에 있어서 기재된 문헌에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 조직을 제공한다. 이와 같은 핵산 서열은 제어 서열로 작동 가능하게 연결된 것이 바람직하다. 이와 같은 조직은 동물 조직인 것도 좋고 다른 생물 예를 들면 식물인 것도 좋다. 또는 이와 같은 조직을 사용하여 본 발명의 핵산 분자를 대량으로 생산할 수 있다. 이와 같은 생산 방법은 해당분야에 있어서 주지된 것이고 본 명세서에 있어서 기재된 문헌에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 장기를 제공한다. 이와 같은 핵산 서열은 제어 서열로 작동 가능하게 연결된 것이 바람직하다. 이와 같은 장기는 동물 장기 또는 기관이어도 좋고 다른 생물 예를 들면 식물의 장기 또는 기관이어도 좋다. 또는 이와 같은 장기 또는 기관을 사용하여 본 발명의 핵산 분자를 대량으로 생산할 수 있다. 이와 같은 생산 방법은 해당분야에 있어서 주지된 것이고 본 명세서에 있어서 기재된 문헌에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 핵산 구축물을 포함하는 생물을 제공한다. 이와 같은 핵산 서열은 제어 서열로 작동 가능하게 연결된 것이 바람직하다. 이와 같은 생물은 동물이어도 좋고 다른 생물 예를 들면 식물이어도 좋다. 또는 이와 같은 생물을 사용하여 본 발명의 핵산 분자를 대량으로 생산할 수 있다. 이와 같은 생산 방법은 해당분야에 있어서 주지된 것이고 본 명세서에 있어서 기재된 문헌에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서 본 발명의 프로모터 및 항원을 코드화하는 서열을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 여기서 항원으로는 숙주의 면역반응을 야기하는 원하는 임의의 단백질을 사용할 수 있다. 이와 같은 항원으로는 예를 들면 암 항원 들을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 DNA 백신이다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 임파구 특이적인 처치를 원하는 질환 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물에 있어서 본 발명의 프로모터 및 상기 처치를 위한 핵산 서열을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 여기서 약학적 조성물의 타겟으로는 임파구 특이적인 처치를 요하는 임의의 질환 장애 상태 등이 적절하다. 예를 들면 선천성 면역부전 증후군을 들 수 있다. 선천성 면역부전 증후군으로는 예를 들면 중증 복합 면역 증후군(SCID), MHCⅠ결손증, MHC Ⅱ 결손증, Wiskott-Aldrich 증후군, X연쇄성 고IgM 증후군, 모세혈관 확장성 실조증, Bloom's 증후군 등을 들 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다. 이론적으로는 선천성 면역부전 증후군은 어떠한 열성 유전자의 결손에 의한다(여기서 결손된 열성 유전자를 말한다). 환자로부터 채취된 골수세포에 그 결손 유전자를 도입하여 다시 환자에 주입함으로서 체세포 유전자치료(somatic gene theraphy)를 실시할 수 있다. 이 때 본 발명의 HHV 6B MIE 프로모터를 이용하여 T 세포 마크로파지 등 분화된 세포에 유전자 발현 효율을 상승시킬 수 있다. 이러한 유전자 구축물의 도입은 예를 들면 레트로바이러스에 의한 방법으로 행할 수 있다.
바람직한 실시태양에서 본 발명에 있어서 사용되는 처치를 위한 핵산 서열은 사이토카인을 코드화하는 핵산 서열, 캐모카인을 코드화하는 핵산 서열, 증식인자를 코드화하는 핵산 서열, 단백질 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 펩타이드 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 리보자임, RNAi(HIV-1 gp41: AATAAGACAGGGCTTGGAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(서열번호:33)/HIV-1 tat: AAGCATCCAGGAAGTCAGCCTACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(서열번호:34)/HTLV-1 tax: GAACATTGGTGAGGAAGGCACAGCCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT(서열번호:35))를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 임파구 특이적으로 단백질을 발현하는 방법에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 공정; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도하는 조건 하에 배치하는 공정을 포함한다.
본 발명은 또한 임파구 특이적으로 단백질을 발현하는 키트에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도하는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 임파구 특이적으로 단백질을 발현하는 키트에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터; (B) 상기 프로모터에 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 임파구 특이적으로 단백질을 발현하는 것을 필요로 하는 질환, 장애, 상태를 처치하거나 예방하는 방법에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 공정; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도하는 조건 하에 배치하는 공정을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 임파구 특이적으로 단백질을 발현하는 것을 필요로 하는 질환, 장애, 상태를 처치하거나 예방하기 위한 키트에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도하는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 임파구 특이적으로 단백질을 발현하는 것을 필요로 하는 질환, 장애, 상태를 처치하거나 예방하기 위한 키트에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터; (B) 상기 프로모터에 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 단백질을 생산하는 방법에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 공정; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도하는 조건 하에 배치하는 공정을 포함한다.
본 발명은 또한 단백질을 생산하기 위한 키트에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도하는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 단백질을 생산하기 위한 키트에 있어서 (A) 본 발명의 프로모터; (B) 상기 프로모터에 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서 본 발명은 본 발명의 프로모터 임파구 특이적인 처치가 요망되는 질환, 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물을 제조에 있어서 사용을 제공한다.
본 발명에 있어서 인용된 과학문헌, 특허출원 등의 참조문헌은 그 전체가 각각 구체적으로 규제되어 있는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 있어서 참고 원용 할 수 있다.
이하 본 발명의 더욱 바람직한 실시태양을 나타내기 위해 설명한다. 다음의 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하지만 상술의 설명 및 이하의 실시예는 예시적인 목적으로만 제공되는 것이고 본 발명을 한정하는 목적으로 제공되는 것은 아니다. 따라서 본 발명의 범위는 명세서에 구체적으로 기재된 실시태양에 있어서 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니고 청구범위에 의해서만 한정된다.
도 1은 접착세포에서의 프로모터 활성의 비교를 나타낸 것이다. 가로축은 각종의 프로모터를 나타내는 것이며 각각의 프로모터에 있어서 Vero세포, HEL세포, L929세포, 293세포, U373세포에의 프로모터 활성을 Log(RLU)/β-gal 대수표시로 나타낸 것이다.
도 2는 임파구 세포에서의 프로모터 활성의 비교를 나타낸 것이다. 가로축은 각종의 프로모터를 나타내는 것이며 각각의 프로모터에 있어서 Vero세포, THP-1세포, SupT1세포, U937세포에의 프로모터 활성을 Log(RLU)/β-gal 대수표시로 나타낸 것이다.
도 3은 TPA로 세포를 자극시킨 경우 HHV-6 MIE 영역의 프로모터 활성을 나타낸 것이다(Vero 세포). 가로축은 각종의 프로모터를 나타내는 것이며 각각의 프로모터에 있어서 TPA 유무에 따른 프로모터 활성을 Log(RLU)/β-gal 대수표시로 나타낸 것이다.
도 4는 TPA로 세포를 자극시킨 경우 HHV-6 MIE 영역의 프로모터 활성을 나타낸 것이다(L929 세포). 가로축은 각종의 프로모터를 나타내는 것이며 각각의 프로모터에 있어서 TPA 유무에 따른 프로모터 활성을 Log(RLU)/β-gal 대수표시로 나타낸 것이다.
도 5는 HHV 6B의 프로모터 영역의 각각의 결실 개변체의 모식도이다. 상단에는 프로모터 영역을 나타내고 그 프로모터 영역 중의 각각의 모티프를 나타낸다.
도 6은 프로모터 활성의 측정 방법의 모식도이다.
도 7은 HHV 6B의 프로모터 영역의 각각의 결실 개변체의 모식도와 그 프로모터 활성(상대 루시퍼라제 활성)을 나타낸 것이다.
도 8은 HHV 7의 프로모터 영역에 관한 전초기(IE) 유전자 및 프로모터의 영역의 모식도이다. 왼편은 위로부터 순서대로 7MIE 프로모터(-493), 7MIE 프로모터(-388), 7MIE 프로모터(-233)를 나타낸다. 오른편은 위로부터 순서대로 7 U95 프로모터(-484), 7 U95 프로모터(-379), 7 U95 프로모터(-304)를 나타낸다.
도 9는 HHV 7 IE 프로모터의 임파구 세포주에 있어서 활성을 나타낸다. 왼편상부는 Jurkat세포, 오른편 상부는 Molt-3세포, 왼편 하부는 Sup T1세포, 오른편 하부는 SAS-413세포를 나타낸다. 각 그래프 중 각각 좌측으로부터 CMVP, 6MIEP, 6U95P, 7MIE(-493), 7U95P(-484)를 나타낸다.
도 10은 프로모터 활성에 대한 R2 결실 효과를 나타낸다. 왼편상부는 Jurkat세포, 오른편 상부는 Molt-3세포, 왼편 하부는 Sup T1세포, 오른편 하부는 SAS-413 세포를 나타낸다. 각 그래프 중 각각 위로부터 7MEI 프로모터(-493), 7MEI 프로모터(-388), 7MEI 프로모터(-233), 7U95 프로모터(-484), 7U95 프로모터(-379), 7 95 프로모터(-304)를 나타낸다.
도 11은 말초 혈에 단핵구(PBMC)에 있어서 프로모터 활성을 나타낸다. 왼쪽 상부, 오른쪽 상부 및 하부는 순서대로 계통 1, 계통 2 및 계통 3을 나타낸다.
(서열표의 설명)
서열번호 1은 HHV 6B MIE 프로모터 서열을 나타낸다.
서열번호 2는 HHV 7 MIE 프로모터 서열을 나타낸다.
서열번호 3은 HHV 6A MIE 프로모터 서열을 나타낸다.
서열번호 4는 HHV 6B R3영역 서열을 나타낸다.
서열번호 5는 실시예 1에서 사용된 20u의 서열을 나타낸다.
서열번호 6은 실시예 1에서 사용된 9u의 서열을 나타낸다.
서열번호 7은 실시예 1에서 사용된 MIE의 서열을 나타낸다.
서열번호 8은 실시예 1에서 사용된 U95의 서열을 나타낸다.
서열번호 9는 실시예 1에서 사용된 CMV의 서열을 나타낸다.
서열번호 10은 실시예 1에서 사용된 MIE/3K의 서열을 나타낸다.
서열번호 11은 실시예 1에서 사용된 U95/3K의 서열을 나타낸다.
서열번호 12는 HHV 7의 U95 프로모터 서열을 나타낸다.
서열번호 13은 HHV-6B의 MIE, 전사개시점으로부터 -574 내지 -427 서열을 나타낸다.
서열번호 14는 HHV-6B의 MIE, 전사개시점으로부터 -1051 내지 -427 서열을 나타낸다.
서열번호 15는 HHV-7의 MIE, 전사개시점으로부터 +22 내지 -493 서열을 나타낸다.
서열번호 16은 HHV-7 U95의 전사개시점으로부터 +16 내지 -484 서열을 나타 낸다.
서열번호 17은 실시예 1에서 사용된 9u-d2-7의 서열을 나타낸다.
서열번호 18은 실시예 1에서 사용된 9u-d1-4의 서열을 나타낸다.
서열번호 19는 실시예 1에서 사용된 9u-d1-5의 서열을 나타낸다.
서열번호 20은 실시예 1에서 사용된 9u-d1-7의 서열을 나타낸다.
서열번호 21은 실시예 1에서 사용된 9u-d3-7의 서열을 나타낸다.
서열번호 22는 실시예 1에서 사용된 9u-d5의 서열을 나타낸다.
서열번호 23은 실시예 1에서 사용된 9u-d6의 서열을 나타낸다.
서열번호 24는 실시예 1에서 사용된 9u-d7의 서열을 나타낸다.
서열번호 25는 실시예 1에서 사용된 9u-d8의 서열을 나타낸다.
서열번호 26은 실시예 1에서 사용된 7MIEP(-493)의 서열을 나타낸다.
서열번호 27은 실시예 1에서 사용된 7MIEP(-388)의 서열을 나타낸다.
서열번호 28은 실시예 1에서 사용된 7MIEP(-233)의 서열을 나타낸다.
서열번호 29는 실시예 1에서 사용된 7U95P(-484)의 서열을 나타낸다.
서열번호 30은 실시예 1에서 사용된 7U95P(-379)의 서열을 나타낸다.
서열번호 31은 실시예 1에서 사용된 7U95P(-304)의 서열을 나타낸다.
서열번호 32는 실시예 1에서 사용된 pGL3 Basic의 서열을 나타낸다.
서열번호 33은 HIV-1 gp41의 RNAi의 예이다.
서열번호 34는 HIV-1 tat의 RNAi의 예이다.
서열번호 35는 HTLV-1 tax의 RNAi의 예이다.
이하 실시예에 사용된 동물의 취급은 오사카대학에 있어서 규정된 기준을 준수하였다.
(실시예 1) HHV 6B 프로모터의 검색과 DNA 백신의 개발
HHV6B 전초기 단백질 (immediate early protein)의 프로모터 (서로 상이한9U, 20U, MIE, U95, MIE/3K, U95/3K)에 있어서 그 활성을 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터와 비교하였다. 방법은 pGL3-Basic Vector (Promega)의 루시퍼라제 유전자의 업스트림에 각각의 프로모터 영역을 삽입하고 각종 세포에 트랜스펙션 시킨 루시퍼라제 활성을 지표로 활성을 비교하였다. 이하 재료 및 방법에 대해 상세히 설명한다.
(재료 및 방법)
(개요)
HHV-6B MIE 프로모터 영역(약1.2kbp)를 크로닝하고 여기에 그 다운스트림에 일본 뇌염 바이러스 베이징-1 주의 외피당 단백질 유전자 cDNA를 연결시킨 프라스미드 p9u/JEVenv를 구축하였다. 녹색 형광 단백질 발현 플라스미드 pEGFP-N1은 시판하는 것을 사용하였다(Clontech사로부터 입수).
pcDNA3.1Zeo+ 벡터의 HCMV-IE 프로모터 다운스트림에 JEVenv를 연결시킨 플라스미드(pcDNA3.1/JEVenv)를 대조로 구축하였다. 녹색형광발현 플라스미드 pEGFP-N1은 시판된 것(BD Biosciences사로부터 입수)를 사용하였다. 또한 루시퍼라제 발현 플라스미드는 이미 구축된 것을 사용하였다(pGL3-Basic; Promega사로부터 입수).
이 플라스미드를 293세포(인간 신장 유래), Vero세포(시미안 신장 유래), SupT1세포(인간 T임파구 유래), U937(인간 단핵구 유래)(이 세포는 미국 ATCC에 기탁된 것으로 일본 이화학연구소 세포 뱅크 유전자 뱅크에서도 입수 가능)에 리포펙션법으로 도입시켰다. 세포 내의 외피당 단백질의 발현은 항JEV 폴리크로날 항체를 사용하여 간접 형광 항체법, 세포추출액의 웨스턴블라트법으로 검토하였다.
HHV-6MIE 프로모터 영역을 루시퍼라제 벡터 pGL3-Basic(프로메가)의 반딧불 루시퍼라제 유전자 업스트림에 삽입시킨 플라스미드 p9u를 제작한 후 MIE 프로모터 영역의 업스트림으로부터 Mung Bean Exonuclease에의 염기를 제거시켜 단축 뮤턴트를 제작하였다.
이와 같은 단축 뮤턴트와 트랜스펙션 효율 보정용 네릴라 루시퍼라제 발현 플라스미드(phRL-SV40)를 Vero세포에 리포펙션법으로 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션으로부터 24시간 후에 세포를 회수하고 세포용해액을 가한다. 이어서 이 라이세이트 중의 반딧불 루시퍼라제 및 네릴라 루시퍼라제의 형광량을 측정한다. 또한 트랜스펙션의 효율을 보정하기 위해 반딧불 루시퍼라제에 의한 형광량을 네릴라 루시퍼라제에 의한 형광량으로 나눈다.
1)세포
프로모터 활성 측정에는 다음 8종류의 세포주를 사용한다.
(1)Vero 세포(유인원 신장 유래)
(2)HEL 세포(인간 태아 섬유아세포 유래)
(3)L929 세포(마우스 섬유아세포 유래)
(4)293 세포(인간 신장 유래)
(5)U373 세포(인간 글리오마 유래)
(6)THP-1 세포(인간 단핵구 유래)
(7)SupT1 세포(인간 T세포 유래)
(8)U937 세포(인간 단핵구 유래)
(이와 같은 세포는 각각 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATTC)에서 입수 가능하다.)
2)프로모터 활성 측정용 플라스미드
프로모터 활성 측정에는 반딧불 루시퍼라제 유전자를 지닌 pGL3-Basic (Promega)를 사용한다. 이 플라스미드는 진핵세포의 플라스미드 서열과 인핸서 서열을 모두 지니지 않기 때문에 각각의 염기 배열을 루시퍼라제 유전자의 업스트림에 삽입하여 발현된 루시퍼라제량을 측정하는 것에 삽입 서열의 프로모터 활성을 측정할 수 있다.
3)pGL3-Basic에 통합된 프로모터 서열
측정에는 다음에 나타난 바와 같이 HHV-6MIE 프로모터 영역, HHV-6 전초기 유전자인 U95 유전자의 프로모터 영역 및 시판 발현 벡터에 사용하고 있는 HCMV MIE 프로모터 영역을 사용한다.
HHV-6 프로모터 영역은 PCR로 증폭하여 pGL3-Basic에 삽입시킨다.
(1) 20u [HHV-6MIE 프로모터 영역(139381←140624:1243bp)을 삽입시킨 것] (서열번호 5)
(2) 9u [HHV-6MIE 프로모터 영역(139381←140427:1046bp)을 삽입시킨 것] (서열번호 6)
(3) MIE [HHV-6MIE 프로모터 영역(139457←140211:754bp)을 삽입시킨 것] (서열번호 7)
(4) U95 [HHV-6 U95 프로모터 영역(141823→142578:756bp)을 삽입시킨 것] (서열번호 8)
(5) CMV [시판 발현 벡터(pcDNA3.1)로부터 절출된 HCMV MIE 프로모터를 삽입시킨 것:750bp] (서열번호 9)
(6) MIE/3K [HHV-6MIE 프로모터 영역(139443←142578:3136bp)을 삽입시킨 것] (서열번호 10)
(7) U95/3K [HHV-6MIE 프로모터 영역(139443→142578:3136bp)을 삽입시킨 것](서열번호 11) 또한 컨트롤로서 염기배열을 삽입시키지 않은 인택트 pGL3-Basic을 사용한다.
또한 각종의 결실 개변체를 제작하였다. 이와 같은 모식도는 도5에 나타낸다. 개변체로서는 도5에 나타난 바와 같은 다음의 물건을 제조하였다.
(1)9u: -1051 내지 +1 (서열번호 5)
(2)9u-d2-7: -814 내지 +1 (서열번호 17)
(3)9u-d1-4: -574 내지 +1 (서열번호 18)
(4)9u-d1-5: -427 내지 +1 (서열번호 19)
(5)9u-d1-7: -350 내지 +1 (서열번호 20)
(6)9u-d3-7: -276 내지 +1 (서열번호 21)
(7)9u-d5: -240 내지 +1 (서열번호 22)
(8)9u-d6: -212 내지 +1 (서열번호 23)
(9)9u-d7: -116 내지 +1 (서열번호 24)
(10)9u-d8: -77 내지 +1 (서열번호 25)
4)세포에의 플라스미드 트랜스펙션
트랜스펙션은 SuperFect (QIAGEN)을 사용하여 리포펙션법으로 행하였다.
트랜스펙션 효율의 보정을 위해 β-갈락토시다제(pCH110, Pharmacia)를 동시에 세포에 도입하고 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. pCH110은 SV40 초기 프로모터 제어 하에서 β-갈락토시다제를 발현시킨다.
pGL3construct(8μl)와 pCH110 (0.2μl)를 혼합하고 Superfect 시약(8μl)을 첨가하여 트랜스펙션을 행한다.
5)루시퍼라제 활성 측정
루시퍼라제 활성 측정에는 Luciferase Assay System (Promega)을 사용하였다.
pGL3construct 및 pCH110을 동시에 트랜스펙션 시킨 후 48시간 후에 세포를 회수하였다. PBS로 2회 세정 시킨 후 세포용해액 150μl에 용해시킨다. 세포용해액의 상청 20μl에 루시퍼라제 기질액 100μl를 첨가하고 30초 후에 루미노미터로 발광량을 측정하였다.
6)β-갈락토시다제 활성 측정
β-갈락토시다제 활성 측정은 β-gal reporter system (Clontech)을 사용하였다. 루시퍼라제 활성 측정과 동일하게 제조된 세포용해액의 상청 20μl에 발광 기질액 100μl를 첨가하고 1시간 후에 루미노미터로 발광량을 측정하였다.
7)TPA로 세포를 활성화시킨 조건 하에서 프로모터 활성의 측정
Vero 세포와 L929 세포에 플라스미드를 트랜스펙션 시킨 후 24시간 후에 TPA (25ng/ml) 존재하 또는 비존재 하에서 더욱이 24시간 배양시킨다. 그 후 세포를 회 수하고 루시퍼라제 및 β-갈락토시다제의 활성을 측정하였다.
(결과)
1) HHV-6 MIE 영역 프로모터 활성
HHV-6 MIE 영역 프로모터 활성 및 HCMV MIE 프로모터 활성은 상피모양의 접착세포와 임파구 세포에서 서로 다르게 나타났다.
(1)접착세포에서의 프로모터 활성 비교 (도 1)
HHV-6 MIE 프로모터 서열은 접착세포에 있어서 HCMV와 비교하면 약한 정도의 프로모터 활성을 나타낸다. HHV-6의 전초기 유전자인 U95 프로모터는 거의 활성이 나타나지 않았다. HCMV, MIE 프로모터는 접착세포에 있어서 HHV-6 MIE 프로모터의 약 10배 내지 50배의 활성을 나타내었다. 특히 HCMV 증식허용세포인 HEL세포 및 U373세포에서는 강한 활성을 나타내었다.
HHV-6 MIE 영역의 프로모터 활성은 프로모터 영역의 길이가 0.7kb 내지 1.2 kb까지 실질적으로 동일한 활성을 나타내었으나 3kb에서는 활성이 감소함을 인식할 수 있었다.
(2) 임파구계 세포에서의 프로모터 활성 비교 (도 2)
HHV-6의 증식 허용세포인 임파구계 세포에서 HHV-6 MIE 영역은 HCMV 보다 약 10배의 프로모터 활성을 나타낸다. 특히 단핵구(monocytic)의 마크로파지계의 세포주인 THP-1 및 U937에 강한 활성을 나타낸다. HCMV MIE 프로모터는 임파구계 세포에서는 그다지 강한 활성을 나타내지는 않았다.
HHV-6 MIE 영역의 프로모터 활성은 프로모터 영역이 0.7kb에서 1.2kb로 길어짐에 따라 활성이 증강되었지만, 3kb의 길이에서는 프로모터 활성이 저하되었다.
2) TPA에서 세포를 자극한 경우의 HHV-6 MIE 영역의 프로모터 활성(도 3∼4)
Vero 세포를 12-O-테트라데카노일 포르볼 13-아세테이트(TPA)로 자극하여, HHV-6 MIE 프로모터 활성을 측정하였다. 이 때 모든 프로모터의 활성은 상승하고, HCMV MIE 프로모터와 거의 동일한 정도의 활성을 나타내었다(도 3).
그러나 L929 세포에서 TPA 자극에 의한 세포활성화로 프로모터 활성의 상승은 관찰되지 않았다(도 4). 이것은 세포종에 따른 TPA의 반응성이 다르기 때문인 것으로 여겨진다.
Vero 세포에서 TPA에 의해 종종 전사 활성화 인자가 다량으로 유도됨으로써 HHV-6 MIE 프로모터 활성이 상승한 것으로 판단된다. 즉 HHV-6 MIE 프로모터의 최대 활성은 HCMV MIE 프로모터와 거의 동일한 정도인 것으로 판단된다. 따라서 본 발명의 프로모터의 특이성, 선택성이 증명되었다.
이와 같이 본 발명에 있어서 Vero 세포, HEL 세포, L929 세포, 293 세포, U373세포 등의 부착성 세포에서 CMV 프로모터가 HHV-6의 프로모터 보다 10배 이상 강한 활성을 나타낸다(도 1). 그러나 THP-1 세포, SupT1 세포, U937세포의 인간-유래 임파구계의 세포에서는 HHV-6 프로모터 활성이 수배 강하고, 프로모터 길이가 단축된 쪽이 더욱 강한 활성이 확인되었다(도 2).
HHV-6가 유망한 프로모터로 확인되었고, 이러한 결과로부터 이 프로모터는 DNA 백신(mumps vaccines)에 응용하는 것이 가능하고, 매우 유망한 것으로 이해된다.
HCMV의 IE 프로모터를 콘트롤로서 사용하고 본 발명자들에 의해 클론닝된 HHV-6B의 MIE 프로모터의 활성을 루시페라제 발현계로 비교 검사하였다. 그 결과 293 세포, Vero 세포 등 부착성 세포에서 HHV-6 MIE 프로모터는 HCMHE 프로모터의 1/10 정도의 활성밖에 나타나지 않았다. 그러나 SupT1 및 U937 등의 임파구계 세포에 있어서는 수배 높은 발현 효과가 얻어졌다. 여기서 이 프로모터 다운스트림 에 JEVcDNA를 연결한 p9u/JEVenv로 JEV의 외피당 단백질의 발현을 측정하였으나 트랜스펙션 48시간 후, 부착성 세포, 부유 임파구계 세포의 어느 쪽에 있어서도 JEV 단백질의 발현이 검출되지 않았다.
한편 HCMV의 IE 프로모터를 사용한 pCDNA 3.1/JEVenv에서 JEV 단백질의 발현이 확인되었다.
더욱이 양성대조군으로 사용된 JEV 감염 Vero 세포에서 외피당 단백질이 용이하게 검출되었다. 원인해명을 위해 GEP 단백질 발현 플라스미드를 사용하여 트랜스펙션 효율 확인을 실시하였다. 그 결과, SupT1 세포에서의 도입 효율은 0.1% 이하로 낮은 값이었지만, 부착성 293 세포와 Vero 세포에서는 각각 45%, 20%로 높은 도입 효율을 나타냈다. 클로닝된 HHV-6 MIE 프로모터가 임파구계 세포에서 HCMV MIE 프로모터보다 수배 발현 활성을 나타냈다. 하지만 발현 유전자를 JEV의 외피당 단백질 유전자로 변환하면 그 활성이 검출되지 않았다.
클로닝된 HHV-6 MIE 프로머터가 임파구계 세포에서 HCMV-IE 프로모터보다 수배의 발현 활성을 나타낸 것은 흥미 깊다. 하지만 발현 유전자를 리포터 유전자로부터 JEV의 외피당 단백질 유전자로 변환시 그 활성이 검출되지 않은 점은 이해할 수 없는 결과였다. 여기서 발현 JEV 단백질이 피드백되어 역으로 프로모터 활성이 억제되었는지, 발현 항원이 이러한 세포에서는 불안정해지는지 원인의 해명에 노력하였다.
본 실시예를 요약하면 이하와 같다.
1) HHV-6 MIE 프로모터는 임파구계 세포 특히, 단핵구/마크로파지계 세포에서 HCMV MIE 프로모터 보다 10배 정도의 활성을 나타냈다.
2) 상피계의 접착 세포에서는 HHV-6 MIE 프로모터 활성은 HCMV MIE 프로모터 활성의 약 1/10이었다.
3) HHV-6 MIE 프로모터는 종종 전사 활성화 인자가 다량으로 유도된 조건하에 있어서는 HCMV, MIE 프로모터와 동일한 정도의 활성을 나타내는 것으로 시사되었다.
이상과 같이 본 실시예에서는 리포터 플라스미드로서 HHV-6B의 주요 전초기(MIE) 유전자의 업스트림 약 12kbp(6MIEP)와 U95 유전자의 업스트림 약 700bp(6U95)를 pGL3Basic 벡터(Promega)의 루시퍼라제 유전자 업스트림에 삽입한 것을 사용하였다. 종래의 프로모터와 비교하여 이러한 IE 프로모터의 DNA 백신의 이용 가능성을 검사하기 위해, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV)의 IE 인핸서-프로모터(CMVP)와의 활성의 비교를 혈구계 세포를 이용하여 실시하였다. 본 실시예에서는 인간 헤르페스바이러스 6B(HHV-6B)에 의해 인코드된 전초기(IE) 프로모터는 혈구계 세포에 있어서 매우 높은 활성을 지니는 것을 증명하였다.
4) 더욱이 도 7에 나타난 바와 같이 각각의 플라그먼트에서의 활성을 조사하고 이때 적어도 전사개시점으로부터 업스트림 -574∼-427, 특히 -1051∼-427이 강력한 프로모터 활성에 바람직한 인핸서 활성이 있는 것으로 밝혀졌다. -427∼+1의 부위는 프로모터 활성에 필요하고 특이성을 확보하기 위해서는 이 인핸서 활성이 필요하다. 상기 인핸서 활성 부분에는 NF-κB 및 AP-1의 모티프가 있는 것이 명확해졌다. 따라서 이러한 모티프를 지니는 것이 임파구계에서의 특이성을 강하게 하는 역할을 하는 것 같다.
(실시예 2) HHV-7의 MIE 및 U95 프로모터
이어서 HHV-7의 포로모터에 관한 실험을 실시하였다.
HHV-7의 2 종류의 전초기 프로모터(7MIEP, 7U95P)의 활성을 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터와 HHV-6의 IE 프로모터(9U, U95)의 활성과 비교하였다. 비교의 방법은 pGL3 Basic 벡터(Promega)의 루시퍼라제 유전자의 업스트림에 IE 프로모터 영역을 삽입하고 각종 세포로 트랜스펙션시켜 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 수행되었다. 또한 각 프로모터 업스트림에 존재하는 R2 영역의 영향을 검사하기 위해 각 종 결실 변이체를 제조하고 프로모터 활성을 측정하였다.
(개요)
리포터 플라스미드로서 HHV-7의 MIE와 u95 유전자 각각의 업스트림 약 500bp(7MIEP와 7U95P)를 pGL3Basic 벡터(Promega)의 루시퍼라제 유전자 업스트림에 삽입한 것을 이용하였다.
T세포주인 Jurkat, Molt-3, SupT-1과 골수계 세포주인 SAS-413에 리포펙션법에 의해 또는 말초 혈액 단핵구(PBMC)에 엘렉트로포레이션법에 의해 리포터 플라스미드를 도입하고 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 그 결과 HCMV MIE 프로모터와 비교하면 T 세포주에서는 HHV-7 MIE 프로모터와 HHV-7 U95 프로모터가 수배 높은 활성을 나타내었다. SAS-413 세포에서는 HHV-7 MIE 프로모터 활성보다 약 10배 이상의 높은 활성이 나타났다. 3로트의 PBMC로 도입한 실험에서는 HHV-7 MIE 프로모터 및 HHV-7 U95 프로모터의 활성이 저하되었다. HHV-6 IE 프로모터(9U 및 U95)와 비교하면 모든 세포종에 있어서도 HHV-7의 모든 프로모터가 낮은 활성을 나타내었다. 한편 HHV-7 MIE 프로모터 및 HHV-7 U95 프로모터 각각을 결실 시킨 변이체를 사용한 실험에 의하면 변이종에 있어서 정도의 차이는 있어도 R2 영역이 모든 프로모터에 대해 주요한 인핸서 활성을 담당하는 것이 명확해졌다. 본 실시예에서는 인간 헤르페스바이러스 7(HHV-7)이 코드하는 전초기(IE) 프로모터는 혈액계 세포에 있어서 매우 높은 활성을 지님을 실증하는 것이다.
이하 재료 및 방법을 상세히 기재한다.
1)세포
프로모터 활성 측정에는 이하 5종의 세포를 사용하였다.
(1) Jurkat 세포 (인간 T세포 유래)
(2) Molt-3 세포 (인간 T세포 유래)
(3) SupT1 세포 (인간 T세포 유래)
(4) SAS-413 세포 (인간 골수세포 유래)
(5) 말초혈액 단핵구(PBMC)
2)프로모터 활성 측정용 플라스미드
프로모터 활성의 측정에는 반딧불 루시퍼라제 유전자를 지닌 pGL3 Basic (Promega)를 사용하였다.
3)pGL3 Basic에 도입된 프로모터 서열
HHV-7 MIE 유전자 프로모터 영역(7MIEP) 및 HHV-7 U95 유전자 프로모터 영역 (7U95P)의 각각의 약 500bp를 PCR에 의해 증폭시키고 각각에 있어서 결실 변이체를 제조하였다. 이의 모식도는 도8에 나타낸다.
(1) 7MIEP(-493) [HHV-7 MIE 유전자의 전사개시점으로부터 업스트림 493pb로부터 다운스트림 22bp까지 삽입시킨 것] (서열번호 26)
(2) 7MIEP(-388) [HHV-7 MIE 유전자의 전사개시점으로부터 업스트림 388pb 로부터 다운스트림 22bp까지 삽입시킨 것] (서열번호 27)
(3) 7MIEP(-233) [HHV-7 MIE 유전자의 전사개시점으로부터 업스트림 233pb로부터 다운스트림 22bp까지 삽입시킨 것] (서열번호 28)
(4) 7U95P(-484) [HHV-7 U95 유전자의 전사개시점으로부터 업스트림 484pb로부터 다운스트림 16bp까지 삽입시킨 것] (서열번호 29)
(5) 7U95P(-379) [HHV-7 U95 유전자의 전사개시점으로부터 업스트림 379pb로부터 다운스트림 16bp까지 삽입시킨 것] (서열번호 30)
(6) 7U95P(-304) [HHV-7 U95 유전자의 전사개시점으로부터 업스트림 304pb로부터 다운스트림 16bp까지 삽입시킨 것] (서열번호 31)
또한 대조군으로 프로모터 서열을 삽입시키지 않은 pGL3 Basic을 사용하였다.
4) 세포내로의 플라스미드의 트랜스펙션
트랜스펙션은 Jurkat 세포, Molt-3 세포, SupT1 세포 및 SAS-413 세포에 대해서는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 리포펙션법에 의해 행하고 PBMC에 대해서는 Nucleofector (amaxa)를 사용한 엘렉트로포레이션법에 의해 행한다.
트랜스펙션 효율의 보정을 위해서 레닐라 루시퍼라제의 발현 플라스미 드(pRL-TK, Promega)를 동시에 세포에 도입시키고 레닐라 루시퍼라제 활성을 측정하였다. pRL-TK는 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제(TK) 프로모터의 제어 하에서 레닐라 루시퍼라제를 발현한다.
1.2μg의 pGL3의 리포터와 50ng의 pRL-TK를 혼합시키고 2μl의 Lipofectamine 2000을 가하여 트랜스펙션을 행한다.
5)루시퍼라제 활성의 측정
루시퍼라제 활성의 측정은 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)를 사용한다. 트랜스펙션 후 16시간 후에 세포를 회수하고 세포용해액 100μl에 용해시킨다. 세포용해액의 상청 5μl에 반딧불 루시퍼라제 기질액 25μl를 첨가시키고 직후에 루미노메타로 발광량을 측정하였다. 이어서 측정 후의 샘플액 레닐라 루시퍼라제 기질액 25μl를 첨가시키고 직후 루미노메타로 발광량을 측정한다.
(결과)
1) HHV-7 MIE 프로모터 영역의 활성
4종류의 세포주를 사용한 실험 결과 CMV 프로모터 활성과 비교한 경우 7MIEP(-493)는 Molt-3 세포 및 SuptT1 세포에는 약 6∼7배 높고 Jurkat 세포에는 거의 동등하며 SAS-413 세포에는 약 1/11의 활성을 나타낸다. 또한 HHV-6 IE 프로모터(9U, U95)와 비교한 경우 어느 세포종에 있어서도 7MIEP(-493)의 활성이 낮았다(도 9).
3로트의 PBMC를 사용한 실험의 결과 7MIEP (-493)의 활성은 CMV 프로모터 및 9U와 거의 동등하거나 낮았으며 한편 HHV-6 U95와는 동등하거나 높은 활성을 나타내었다(도 10).
2) HHV-7 U95 프로모터 영역의 활성
4종류의 세포주를 사용한 실험 결과 CMV 프로모터 활성과 비교한 경우 7U95P(-484)는 Jurkat 세포에서는 2.5배, Molt-3 세포에서는 4배, SupT 세포에서는 20배 높은 활성을 나타내었으나 SAS-413 세포에서는 약 1/8의 활성을 나타낸다. 또한 HHV-6 IE 프로모터(9U, U95)와 비교한 경우 SupT1 세포에서는 U95 보다 약간 높은 활성을 나타내었으나 9U의 활성의 약 1/2을 지니고 그 밖의 세포에서도 7U95P(-484)의 활성이 낮게 나타났다(도 9).
3로트의 PBMC를 사용한 실험의 결과 7U95P(-494)의 활성은 다른 프로모터의 약 1/2 내지 1/4 활성을 나타내었다(도 10).
3) R2 영역의 프로모터 활성의 영향
7MIEP 및 7U95P의 각각을 결실 시킨 변이체를 4종류 세포에 도입시킨 실험을 행한 결과 R2의 결실에 의한 프로모터 활성이 저하되는지 여부는 세포주에 의존하는 것이 명백해졌다. 구체적으로는 7MIEP는 Jurkat 세포에서는 R2 결실에 의한 영향이 나타나지 않았으나 다른 세포주에서는 활성이 약 1/5 내지 1/2로 감소하였다. 한편 7U95P는 SAS-413 세포에서는 R2 결실에 의한 영향이 타나나지 않았으나 그 밖의 세포에서는 활성이 약 1/7 내지 1/2로 감소하였다(도 11).
(총괄)
본 실험을 다음과 같이 요약한다.
1) 7MIEP(-493)와 7U95P(-494)에서는 T 세포주에 있어서는 CMV 프로모터보다도 높은 활성을 나타내었으나 골수계 세포주인 SAS-413 세포에서는 반대로 활성이 저하되었다. PBMC에서는 7MIEPO(-493)는 CMV 프로모터와 거의 동등한 활성을 나타내었으나 7U95P(-494)는 CMV 프로모터보다 활성이 낮았다.
2) HHV-6 IE 프로모터와 비교하면 어느 세포종에 있어서도 HHV-6의 두 종류 IE 프로모터(9U, U95)가 7MIEP(-493) 및 7U95(-494)보다도 높은 활성을 나타내었다.
3) R2 영역은 대부분의 세포에서 7MIEP와 7U95P에 대해 인핸서로서 기능하고 있는 것이 명백하다. R2 영역에 결합시킨 전사인자는 동정되지 않았으나 HHV-6 R3 영역에 NF-κB를 결합시킨 U95 프로모터 인핸서로서 기능하고 있는 것으로 사료된다. R2 영역 내에는 반복적으로 존재하는 NF-κB 결합 모티브가 R2 영역의 인핸서 활성을 담당할 가능성이 높다(도 8).
(실시예 3) 특이적 결실 시스템 구축
혈구계 세포에 있어서 유전자 발현 넉아웃을 IE 프로모터 및 RNAi법을 사용하여 실시한다. IE 프로모터는 혈구계 세포에서 발현량이 매우 증가되기 때문에 해석에 유리하다.
1) 세포의 조제(마크로파지의 경우)
건강인 말초 혈액을 채취하고 Ficoll·Hypaque을 사용한 밀도구배법에 의해 PBMC를 분리 정제한다. AIM V serum medium (Life Technologies)에 100U/ml M-CSF (R&D Systems)을 가하여 상기 PBMC를 배양한다. 배지는 3일 후 교환하고 배양 6일 또는 7일 후에 마크로파지를 시험에 사용한다.
2) siRNA 발현 레트로바이러스의 제조
헤어핀형 RNA를 발현하기 위해 '센스 스트랜드 목적 서열', '루프서열','안티센스 스트랜드 목적 서열' 및 '터미네이터 서열'을 포함하는 합성 올리고 DNA를 제조한다. 이와 같은 센스 스트랜드 목적 서열, 루프서열, 안티센스 스트랜드 목적 서열, 테미네이터 서열은 해당 분야에 있어서 주지된 기술을 사용하여 실현 할 수 있다. 당업자는 실제로 사용하는 경우 이 상황에 대해 적절한 서열을 채택하는 것이 가능한 것으로 이해된다.
IE 서열 다운스트림에 상기 올리고 DNA를 연결시키고 레트로바이러스의 복제에 필요한 gag, pol 및 env를 결실시킨 NeoR 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터에 제한효소 서열 등을 이용하여 상기 DNA를 재조합한다. 제작된 플라스미드 벡터 10μl를 100μl의 컴페턴트 세포에 가하여 형질전환 시키고 LBAmp 플레이트에서 37℃로 16시간 배양한다. 형질전환에 의해 얻어진 콜로니를 LBAmp 액체 배지에서 37℃로 16시간 배양시킨 후 배양액으로부터 통상의 방법으로 플라스미드를 추출정제한다.
gag, pol 및 env를 발현하고 있는 레트로바이러스 패키징 세포를 직경 10cm의 디스크에 넣고 트랜스펙션 시약을 넣어 10μg의 상기 플라스미드를 트랜스펙션한다. 24∼48 시간 후 세포를 G418 함유 배지(500μg/ml)에 단계적으로 희석 후 계대시킨다.
3∼4일마다 G418 배지를 교환하고 약 2주간 배양한다. 콜로니를 회수하고 6 웰 플레이트에 생육시킨다. G418을 함유하지 않은 배지에 교환하여 24시간 후 상청을 회수한다. 또한 세포는 스토킹한다.
상청 중에 포함된 레트로바이러스를 단계적으로 희석하고 NIH/3T3 세포에 감염시켜 생육된 콜로니를 카운트하는 것에 의해 감염가를 산출한다.
3) 레트로바이러스를 이용한 유전자 도입 시험
1)에서 제조된 마크로파지 등 혈구계 세포에 레트로바이러스 벡터를 감염시킨다. 세정 후에 0.5-2.5 x 104 세포/cm2가 되도록 플레이트를 만든다. 감염 후 24시간에 G418 함유 배지를 교환시키고 3∼4일마다 배지를 교환한다. 약 2주간 후 유전자 도입 세포를 얻는다. 이 세포를 사용 목적 넉아웃 유전자의 발현량을 확인한다.
이 실험을 행하는 것에 의해 유전자 도입 후 실제로 본 발명의 프로모터로서 임파구 특이적 외래유전자 발현이 넉아웃된 것을 확인하였다.
(실시예 4) 특이적 발현
실시예 3에 있어서 RNAi에 대체하여 발현을 원하는 유전자 (예를 들면 TGF β 등의 사이토카인)을 코드화하는 핵산 분자를 도입한다.
그 결과 실시예 3과 동일한 실험을 행함으로써 유전자 도입 후 실제로 본 발명의 프로모터가 임파구 특이적 외래유전자 발현을 유도하는 것이 확인되었다.
이상은 본 발명의 바람직한 실시태양을 사용하여 본 발명을 예시한 것으로 본 발명은 특허청구 범위에 의해서만 범위를 해석하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 있어서 인용되는 특허, 특허출원 및 문헌은 그 내용자체가 구체적으로 본 명세서에 기재되어 있는 것과 동일한 내용이 본 명세서에 대해 참고로서 채택될 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명에 의한 T 임파구 등의 면역담당세포에 있어서 단백질 발현을 선택적으로 유도하는 프로모터를 제공하는 것이다. 본 발명의 프로모터는 선천성 면역부전 증후군 등의 변역질환을 효과적으로 예방 또는 치료하기 위한 방법 및 의약으로서 유용하다. 본 발명은 또한 효율적으로 유전자 치료를 행할 수 있기 위해 기술에 있어서도 유용한 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Research Institute of Microbial Diseeases, Osaka University <120> Promoters for introducing genes into cells of lymphocytic series and blood cell lineages, and use thereof <130> OBK008PCT <150> JP 2005-261366 <151> 2005-09-08 <160> 35 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1242 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HHV6B MIE promoter sequence <400> 1 agtgggtacc gcggttgggg tctttcctac ctaggctaac gagaacccta aaatctgcta 60 acggagcaac cgcagttcca gtttttctca taaaattaaa ggttagtggg taccgcggtt 120 gaaatctttc ctgctaataa ggatgagaac ttcaaaatct cgtaacgcgg caaccgcagt 180 tcctgttttt ctcataaagt taaagatcag cgggtaccgc ggttgaagta tttcctgccc 240 aggcgaatga gaactctaaa agctcgtaac gcggcaaccg agttcctgtt tttcccataa 300 agttaaagat cagcgggtac cgcggttgaa gtatttcctg tccaggcgaa tgagaactct 360 aaaagctcgt aacgcggcaa tcgcagttcc tgtttttctc ataaatttaa agatcagcgg 420 gtaccgcggt tgaagtattt cctgcccagg cgaatgagaa ctctaaaagc tcgtaacgcg 480 gcaaccgcag ttcctgtttt tcttataaag ttaaaaatta gcagatattg 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60 ctgcctaaac gggtgagaac ccgtaaaacc tgctgagaag gcaaccgcag ttcctgttgt 120 tttcacgggt ttaaatgtca gtgggttatg tggttggggt ctttcctgcc taaagcgagt 180 gggaatgtgt agaacttgct gagaagacaa ccgcaattcc tgttgtttca aagatttaaa 240 taccaattcg aaataaaata accgcaaaaa tcatgtttac gtaaaatata aatccattgt 300 ggtttttatt ggaaaaataa tattttaaaa aaatacatgt acaaataagg ttaaacccta 360 atttttttag tattataatt ttttggcttt ttttaattgg ttgatatatt aacgtcattt 420 tcctgtgcat cacatccgct tcaaaatgta tataataaga agacagatca actattttgc 480 cactttttct tcaagagctt gaagatacag ttctg 515 <210> 3 <211> 1243 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HHV6A MIE promoter sequence <400> 3 tgggtatcgc ggtttggggg tctttcctgc acaggcgaac gagaactcta aaagctgcta 60 acgcggcaac cgcagtttct gtttttctcg gaaaattaaa agtcagtggg taccgcggtt 120 tgggggtctt tcctgcacag gcgaacgaga actctaaaag ctgctaacgc ggcaaccgca 180 gtttctgttt ttctcggaaa attaaaagtc agtgggtacc gcggtttggg gtctttcctg 240 cacaggcgaa cgaaaactct aaaagctgct aacgcggcaa ccgcagtttc tgtttttctc 300 ggaaaactaa aagtcagtgg 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655 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of CMV in EXAMPLE 1 <400> 9 cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 60 aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 120 aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 180 tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 240 gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 300 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 360 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg 420 gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 480 cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 540 taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 600 aagcagagct ctctggctaa ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaatt 655 <210> 10 <211> 3136 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of MIE/3K region in EXAMPLE 1 <400> 10 tgtgtccaag ctagcagaag aacagctaat ggcgtatagc ggcaaattgc ctatcctata 60 aatactgaag ttaataggcg tggtaggaaa tgatgattaa tacatcatta aaatattcta 120 cttcacggct tttgattcgt tattcgtaag tgggtacaat gaaaaaaaat caacactgcc 180 ttaatgtatg caccctcaag agtgctgatt ggatagagat ataatgatat ataaaaaagt 240 gcatgatgaa caaaaaagtt tgtttttcca taaatttaaa tgtcagtggg tgccgcggtt 300 agggtctttc ctacccaagc gggtgagaac cttaaaaatt gctaacgggg caaccgcagc 360 ttctgttttt catcaaaaag ttaaaggtca gtgggtgccg cggttagggt ctttcctacc 420 caagcgggtg agaaccttaa aaattgctaa cggggcaacc gcagcttctg tttttcatca 480 aaaagttaaa ggtcagtggg tgccgcggtt agggtctttc ctacccaagc gggtgagaac 540 cttaaaaatt actaacgggg caaccgcagt ttctgtttct cctcataaag ttaaaggtca 600 gtgggtgccg cggttagggt ctttcctacc caagcgggtg agaaccttaa aaattgctaa 660 ctgggcaacc gcagtttctg tttctcttca tacagttaaa ggtcagtggg tgccgcggtt 720 agggtctttc ctactcaagt gggtgaggac cctaaaatcc gctaatgggg caaccgcagt 780 ttctgttttt tctgataaag ctaaagatca gtgggtaccg cggttgaaat tttttttgcc 840 catacggatg agaactctaa aagctgttaa caaagcaacc gcatttcctg tttttcctca 900 taaacttaaa ggtcagtggg aactgcggtt gaagtctttc ctgataatga ggatgagaac 960 tttaaaatct gctaacaaag caacaaagtt cctgtttttc ttcataaagt taaagatcag 1020 tgggtaccgc ggttgaagta tttcctgcca atacgaatga gaactctaaa agatgctaac 1080 aaagcaaccg cagttcctgt ttttcctcat aaacttaaag gttagtgggt actgcggttt 1140 aaatctttcc tgctaataag gatgagaact tcaaaagtct cgtaacgcgg caaccgcagt 1200 tcctgttttt ctcagaaagt taaagatcag cgggtaccgc ggttgaagtc tttcctgttc 1260 atgcgaatta aaactctaaa agctgctaac ggagcaaccg cagtttctgt ttttctcata 1320 aagttaaagg ttagtgggta ctgcggttgg ggtctttcct acccaggcta acgagaaccc 1380 taaaatctgc taacggagca accgcaattc ctgtttttct cataaagtta aaggttagtg 1440 ggtaccgcgg ttgaagtctt tcctgattat gcgaattaaa actctaaaac ctgctaacgg 1500 agcaaccgca gttcctgttt ttctcataaa gttaaaggtt agtgggtact gcggttgggg 1560 tctttcttac ccaggctaac gagaacccta aaacctgcta acggagcaac cgcagttcct 1620 gtttttctca taaagttaaa ggttagtggg tactgcggtt ggggtctttc ttacccaggc 1680 taacgagaac cctaaaacct gctaacggag caaccgagtt cctgtttttc tcataaagtt 1740 aaaggttagt gggtactgcg gttggggtct ttcctaccca ggctaacgag aaccctaaaa 1800 cctgctaacg gagcaaccgc agttcctgtt tttctcataa agttaaaggt tagtgggtac 1860 cgcggttgaa atctttcctg ctaataagga tgagaacttc aaaatctgct aatgggggaa 1920 accgcaattt ctgtttttct cataaagtta aagatcagtg ggtaccgcgg ttggggtctt 1980 tcctacctag gctaacgaga accctaaaat ctgctaacgg agcaaccgca gttccagttt 2040 ttctcataaa attaaaggtt agtgggtacc gcggttgaaa tctttcctgc taataaggat 2100 gagaacttca aaatctcgta acgcggcaac cgcagttcct gtttttctca taaagttaaa 2160 gatcagcggg taccgcggtt gaagtatttc ctgcccaggc gaatgagaac tctaaaagct 2220 cgtaacgcgg caaccgagtt cctgtttttc ccataaagtt aaagatcagc gggtaccgcg 2280 gttgaagtat ttcctgtcca ggcgaatgag aactctaaaa gctcgtaacg cggcaatcgc 2340 agttcctgtt tttctcataa atttaaagat cagcgggtac cgcggttgaa gtatttcctg 2400 cccaggcgaa tgagaactct aaaagctcgt aacgcggcaa ccgcagttcc tgtttttctt 2460 ataaagttaa aaattagcag atattgcggt tgaagtcttt cctgttcatg cgaattaaaa 2520 ctctaaaaac tgctaacgaa gcaaccgagt tcctgttttt ctcattaagt taaaggttag 2580 tgggtactgt ggttggggtc tttcctaccc aggctaacga gaaccctaaa atctgctaac 2640 agagcaaccg cagttcctgt ttttctcata aagttaaagg tcagtgtgta ccgcggttac 2700 aacattttcc cctgactaag tcatttattt cgtgagaagc gctaacacca aaaccacatt 2760 cctgtttcat gatgtgtagc agatgttttt aaaaaaaaaa catgacaatt tatcagtaaa 2820 gtgttcttta ttatcccgcc ttcaaccgca aactccgtct ttctcataaa aaaatacaag 2880 tcagccataa gaagaaaacc tcaaaaaatc cagaccacaa attcctgttt ttgagtaaga 2940 tatgacaaaa ccctaaattt ttgtaagcat cagctaattt ccattccata tttgtctaaa 3000 aggggtgtat ttctacactt gcggtttaac attatacagc gattggctcc ttcatcctcg 3060 tcattttcct gtacatcaca cccgctatag aattgtatat aagcagaagt tacagccagt 3120 tcagtgccac ttttct 3136 <210> 11 <211> 3136 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of U95/3K region in EXAMPLE 1 <400> 11 agaaaagtgg cactgaactg gctgtaactt ctgcttatat acaattctat agcgggtgtg 60 atgtacagga aaatgacgag gatgaaggag ccaatcgctg tataatgtta aaccgcaagt 120 gtagaaatac acccctttta gacaaatatg gaatggaaat tagctgatgc ttacaaaaat 180 ttagggtttt gtcatatctt actcaaaaac aggaatttgt ggtctggatt ttttgaggtt 240 ttcttcttat ggctgacttg tattttttta tgagaaagac ggagtttgcg gttgaaggcg 300 ggataataaa gaacacttta ctgataaatt gtcatgtttt ttttttaaaa acatctgcta 360 cacatcatga aacaggaatg tggttttggt gttagcgctt ctcacgaaat aaatgactta 420 gtcaggggaa aatgttgtaa ccgcggtaca cactgacctt taactttatg agaaaaacag 480 gaactgcggt tgctctgtta gcagatttta gggttctcgt tagcctgggt aggaaagacc 540 ccaaccacag tacccactaa cctttaactt aatgagaaaa acaggaactc ggttgcttcg 600 ttagcagttt ttagagtttt aattcgcatg aacaggaaag acttcaaccg caatatctgc 660 taatttttaa ctttataaga aaaacaggaa ctgcggttgc cgcgttacga gcttttagag 720 ttctcattcg cctgggcagg aaatacttca accgcggtac ccgctgatct ttaaatttat 780 gagaaaaaca ggaactgcga ttgccgcgtt acgagctttt agagttctca ttcgcctgga 840 caggaaatac ttcaaccgcg gtacccgctg atctttaact ttatgggaaa aacaggaact 900 cggttgccgc gttacgagct tttagagttc tcattcgcct gggcaggaaa tacttcaacc 960 gcggtacccg ctgatcttta actttatgag aaaaacagga actgcggttg ccgcgttacg 1020 agattttgaa gttctcatcc ttattagcag gaaagatttc aaccgcggta cccactaacc 1080 tttaatttta tgagaaaaac tggaactgcg gttgctccgt tagcagattt tagggttctc 1140 gttagcctag gtaggaaaga ccccaaccgc ggtacccact gatctttaac tttatgagaa 1200 aaacagaaat tgcggtttcc cccattagca gattttgaag ttctcatcct tattagcagg 1260 aaagatttca accgcggtac ccactaacct ttaactttat gagaaaaaca ggaactgcgg 1320 ttgctccgtt agcaggtttt agggttctcg ttagcctggg taggaaagac cccaaccgca 1380 gtacccacta acctttaact ttatgagaaa aacaggaact cggttgctcc gttagcaggt 1440 tttagggttc tcgttagcct gggtaagaaa gaccccaacc gcagtaccca ctaaccttta 1500 actttatgag aaaaacagga actgcggttg ctccgttagc aggttttagg gttctcgtta 1560 gcctgggtaa gaaagacccc aaccgcagta cccactaacc tttaacttta tgagaaaaac 1620 aggaactgcg gttgctccgt tagcaggttt tagagtttta attcgcataa tcaggaaaga 1680 cttcaaccgc ggtacccact aacctttaac tttatgagaa aaacaggaat tgcggttgct 1740 ccgttagcag attttagggt tctcgttagc ctgggtagga aagaccccaa ccgcagtacc 1800 cactaacctt taactttatg agaaaaacag aaactgcggt tgctccgtta gcagctttta 1860 gagttttaat tcgcatgaac aggaaagact tcaaccgcgg tacccgctga tctttaactt 1920 tctgagaaaa acaggaactg cggttgccgc gttacgagac ttttgaagtt ctcatcctta 1980 ttagcaggaa agatttaaac cgcagtaccc actaaccttt aagtttatga ggaaaaacag 2040 gaactgcggt tgctttgtta gcatctttta gagttctcat tcgtattggc aggaaatact 2100 tcaaccgcgg tacccactga tctttaactt tatgaagaaa aacaggaact ttgttgcttt 2160 gttagcagat tttaaagttc tcatcctcat tatcaggaaa gacttcaacc gcagttccca 2220 ctgaccttta agtttatgag gaaaaacagg aaatgcggtt gctttgttaa cagcttttag 2280 agttctcatc cgtatgggca aaaaaaattt caaccgcggt acccactgat ctttagcttt 2340 atcagaaaaa acagaaactg cggttgcccc attagcggat tttagggtcc tcacccactt 2400 gagtaggaaa gaccctaacc gcggcaccca ctgaccttta actgtatgaa gagaaacaga 2460 aactgcggtt gcccagttag caatttttaa ggttctcacc cgcttgggta ggaaagaccc 2520 taaccgcggc acccactgac ctttaacttt atgaggagaa acagaaactg cggttgcccc 2580 gttagtaatt tttaaggttc tcacccgctt gggtaggaaa gaccctaacc gcggcaccca 2640 ctgaccttta actttttgat gaaaaacaga agctgcggtt gccccgttag caatttttaa 2700 ggttctcacc cgcttgggta ggaaagaccc taaccgcggc acccactgac ctttaacttt 2760 ttgatgaaaa acagaagctg cggttgcccc gttagcaatt tttaaggttc tcacccgctt 2820 gggtaggaaa gaccctaacc gcggcaccca ctgacattta aatttatgga aaaacaaact 2880 tttttgttca tcatgcactt ttttatatat cattatatct ctatccaatc agcactcttg 2940 agggtgcata cattaaggca gtgttgattt tttttcattg tacccactta cgaataacga 3000 atcaaaagcc gtgaagtaga atattttaat gatgtattaa tcatcatttc ctaccacgcc 3060 tattaacttc agtatttata ggataggcaa tttgccgcta tacgccatta gctgttcttc 3120 tgctagcttg gacaca 3136 <210> 12 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> HHV7 U95 promoter sequence <400> 12 tgggttctca cccgtttagg caggaaacac ccagaccgca taacccactg acatttaaac 60 ccgtgaaaac aacaggaact gcggttgact tctcagcagg ttttatgggt tctcacccgt 120 ttaggtagga aagacccaga ccgcataacc cactaacatt ttaatatgtg aaaataaaca 180 ggaactgcgg ttatagtttc agtacattct agagattaca tcctgctaag gcgaaaaaca 240 ctttaaccgc aaaagccact gatttttaaa cttgtgaaaa taacaggaaa ccacagaaac 300 gtcaggaaaa aaacgttgtt ttataattat gtccataaaa catgcaacat aatccaaacc 360 ggccaatgat ttttctgctt aaatgtaatt taaataattt attcatacgt aagttgttat 420 agccacgcct acgcagcaat gtatataagc agacaccgtc atttcgcagt tagtctgctg 480 gaaagcttgt gaagactaca 500 <210> 13 <211> 148 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> -574 to -427 from transcription initiation point of HHV-6B MIE <400> 13 acccaggcta acgagaaccc taaaatctgc taacagagca accgcagttc ctgtttttct 60 cataaagtta aaggtcagtg tgtaccgcgg ttacaacatt ttcccctgac taagtcattt 120 atttcgtgag aagcgctaac accaaaac 148 <210> 14 <211> 625 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> -1051 to -427 from transcription initiation point of HHV-6B MIE <400> 14 ctagcccggg ctcgagatct tcagttaaag atcagcgggt accgcggttg aagtatttcc 60 tgcccaggcg aatgagaact ctaaaagctg ctaacgcggc aaccgcagtt cctgtttttc 120 ccataaagtt aaagatcagc gggtaccgcg gttgaagtat ttcctgtcca ggcgaatgag 180 aactctaaaa gctgctaacg cggcaatcgc agttcctgtt tttctcataa atttaaagat 240 cagcgggtac cgcggttgaa gtatttcctg cccaggcgaa tgagaactct aaaagctgct 300 aacgcggcaa ccgcagttcc tgtttttctt ataaagttaa aaattagcag atattgcggt 360 tgaagtcttt cctgttcatg cgaattaaaa ctctaaaaac tgctaacgaa gcaaccgcag 420 ttcctgtttt tctcattaag ttaaaggtta gtgggtactg tggttggggt ctttcctacc 480 caggctaacg agaaccctaa aatctgctaa cagagcaacc gcagttcctg tttttctcat 540 aaagttaaag gtcagtgtgt accgcggtta caacattttc ccctgactaa gtcatttatt 600 tcgtgagaag cgctaacacc aaaac 625 <210> 15 <211> 515 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> +22 to -493 from transcription initiation point of HHV-7 MIE <400> 15 cgcagttcct gttgttttca catattaaaa tgttagtggg ttatgtggtt ggggtctttc 60 ctgcctaaac gggtgagaac ccgtaaaacc tgctgagaag gcaaccgcag ttcctgttgt 120 tttcacgggt ttaaatgtca gtgggttatg tggttggggt ctttcctgcc taaagcgagt 180 gggaatgtgt agaacttgct gagaagacaa ccgcaattcc tgttgtttca aagatttaaa 240 taccaattcg aaataaaata accgcaaaaa tcatgtttac gtaaaatata aatccattgt 300 ggtttttatt ggaaaaataa tattttaaaa aaatacatgt acaaataagg ttaaacccta 360 atttttttag tattataatt ttttggcttt ttttaattgg ttgatatatt aacgtcattt 420 tcctgtgcat cacatccgct tcaaaatgta tataataaga agacagatca actattttgc 480 cactttttct tcaagagctt gaagatacag ttctg 515 <210> 16 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> +16 to -484 from transcription initiation point of HHV-7 U95 <400> 16 tgggttctca cccgtttagg caggaaacac ccagaccgca taacccactg acatttaaac 60 ccgtgaaaac aacaggaact gcggttgact tctcagcagg ttttatgggt tctcacccgt 120 ttaggtagga aagacccaga ccgcataacc cactaacatt ttaatatgtg aaaataaaca 180 ggaactgcgg ttatagtttc agtacattct agagattaca tcctgctaag gcgaaaaaca 240 ctttaaccgc aaaagccact gatttttaaa cttgtgaaaa taacaggaaa ccacagaaac 300 gtcaggaaaa aaacgttgtt ttataattat gtccataaaa catgcaacat aatccaaacc 360 ggccaatgat ttttctgctt aaatgtaatt taaataattt attcatacgt aagttgttat 420 agccacgcct acgcagcaat gtatataagc agacaccgtc atttcgcagt tagtctgctg 480 gaaagcttgt gaagactaca 500 <210> 17 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d2-7 in EXAMPLE 1 <400> 17 aaaatttagg gttttgtcat atcttactca aaaacaggaa tttgtggtct ggattttttg 60 aggttttctt cttatggctg acttgtattt ttttatgaga aagacggagt ttgcggttga 120 aggcgggata ataaagaaca ctttactgat aaattgtcat gttttttttt taaaaacatc 180 tgctacacat catgaaacag gaatgtggtt ttggtgttag cgcttctcac gaaataaatg 240 acttagtcag gggaaaatgt tgtaaccgcg gtacacactg acctttaact ttatgagaaa 300 aacaggaact gcggttgctc tgttagcaga ttttagggtt ctcgttagcc tgggtaggaa 360 agaccccaac cacagtaccc actaaccttt aacttaatga gaaaaacagg aactgcggtt 420 gcttcgttag cagtttttag agttttaatt cgcatgaaca ggaaagactt caaccgcaat 480 atctgctaat ttttaacttt ataagaaaaa caggaactgc ggttgccgcg ttagcagctt 540 ttagagttct cattcgcctg ggcaggaaat acttcaaccg cggtacccgc tgatctttaa 600 atttatgaga aaaacaggaa ctgcgattgc cgcgttagca gcttttagag ttctcattcg 660 cctggacagg aaatacttca accgcggtac ccgctgatct ttaactttat gggaaaaaca 720 ggaactgcgg ttgccgcgtt agcagctttt agagttctca ttcgcctggg caggaaatac 780 ttcaaccgcg gtacccgctg atctttaact ttatga 816 <210> 18 <211> 576 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d1-4 in EXAMPLE 1 <400> 18 acttagtcag gggaaaatgt tgtaaccgcg gtacacactg acctttaact ttatgagaaa 60 aacaggaact gcggttgctc tgttagcaga ttttagggtt ctcgttagcc tgggtaggaa 120 agaccccaac cacagtaccc actaaccttt aacttaatga gaaaaacagg aactgcggtt 180 gcttcgttag cagtttttag agttttaatt cgcatgaaca ggaaagactt caaccgcaat 240 atctgctaat ttttaacttt ataagaaaaa caggaactgc ggttgccgcg ttagcagctt 300 ttagagttct cattcgcctg ggcaggaaat acttcaaccg cggtacccgc tgatctttaa 360 atttatgaga aaaacaggaa ctgcgattgc cgcgttagca gcttttagag ttctcattcg 420 cctggacagg aaatacttca accgcggtac ccgctgatct ttaactttat gggaaaaaca 480 ggaactgcgg ttgccgcgtt agcagctttt agagttctca ttcgcctggg caggaaatac 540 ttcaaccgcg gtacccgctg atctttaact ttatga 576 <210> 19 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d1-5 in EXAMPLE 1 <400> 19 tttaacttaa tgagaaaaac aggaactgcg gttgcttcgt tagcagtttt tagagtttta 60 attcgcatga acaggaaaga cttcaaccgc aatatctgct aatttttaac tttataagaa 120 aaacaggaac tgcggttgcc gcgttagcag cttttagagt tctcattcgc ctgggcagga 180 aatacttcaa ccgcggtacc cgctgatctt taaatttatg agaaaaacag gaactgcgat 240 tgccgcgtta gcagctttta gagttctcat tcgcctggac aggaaatact tcaaccgcgg 300 tacccgctga tctttaactt tatgggaaaa acaggaactg cggttgccgc gttagcagct 360 tttagagttc tcattcgcct gggcaggaaa tacttcaacc gcggtacccg ctgatcttta 420 actttatga 429 <210> 20 <211> 352 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d1-7 in EXAMPLE 1 <400> 20 agacttcaac cgcaatatct gctaattttt aactttataa gaaaaacagg aactgcggtt 60 gccgcgttag cagcttttag agttctcatt cgcctgggca ggaaatactt caaccgcggt 120 acccgctgat ctttaaattt atgagaaaaa caggaactgc gattgccgcg ttagcagctt 180 ttagagttct cattcgcctg gacaggaaat acttcaaccg cggtacccgc tgatctttaa 240 ctttatggga aaaacaggaa ctgcggttgc cgcgttagca gcttttagag ttctcattcg 300 cctgggcagg aaatacttca accgcggtac ccgctgatct ttaactttat ga 352 <210> 21 <211> 278 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d3-7 in EXAMPLE 1 <400> 21 ttttagagtt ctcattcgcc tgggcaggaa atacttcaac cgcggtaccc gctgatcttt 60 aaatttatga gaaaaacagg aactgcgatt gccgcgttag cagcttttag agttctcatt 120 cgcctggaca ggaaatactt caaccgcggt acccgctgat ctttaacttt atgggaaaaa 180 caggaactgc ggttgccgcg ttagcagctt ttagagttct cattcgcctg ggcaggaaat 240 acttcaaccg cggtacccgc tgatctttaa ctttatga 278 <210> 22 <211> 242 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d5 in EXAMPLE 1 <400> 22 caaccgcggt acccgctgat ctttaaattt atgagaaaaa caggaactgc gattgccgcg 60 ttagcagctt ttagagttct cattcgcctg gacaggaaat acttcaaccg cggtacccgc 120 tgatctttaa ctttatggga aaaacaggaa ctgcggttgc cgcgttagca gcttttagag 180 ttctcattcg cctgggcagg aaatacttca accgcggtac ccgctgatct ttaactttat 240 ga 242 <210> 23 <211> 214 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d6 in EXAMPLE 1 <400> 23 ttatgagaaa aacaggaact gcgattgccg cgttagcagc ttttagagtt ctcattcgcc 60 tggacaggaa atacttcaac cgcggtaccc gctgatcttt aactttatgg gaaaaacagg 120 aactgcggtt gccgcgttag cagcttttag agttctcatt cgcctgggca ggaaatactt 180 caaccgcggt acccgctgat ctttaacttt atga 214 <210> 24 <211> 118 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d7 in EXAMPLE 1 <400> 24 ctttaacttt atgggaaaaa caggaactgc ggttgccgcg ttagcagctt ttagagttct 60 cattcgcctg ggcaggaaat acttcaaccg cggtacccgc tgatctttaa ctttatga 118 <210> 25 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 9u-d8 in EXAMPLE 1 <400> 25 gttagcagct tttagagttc tcattcgcct gggcaggaaa tacttcaacc gcggtacccg 60 ctgatcttta actttatga 79 <210> 26 <211> 515 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 7MIEP(-493) in EXAMPLE 2 <400> 26 cgcagttcct gttgttttca catattaaaa tgttagtggg ttatgtggtt ggggtctttc 60 ctgcctaaac gggtgagaac ccgtaaaacc tgctgagaag gcaaccgcag ttcctgttgt 120 tttcacgggt ttaaatgtca gtgggttatg tggttggggt ctttcctgcc taaagcgagt 180 gggaatgtgt agaacttgct gagaagacaa ccgcaattcc tgttgtttca aagatttaaa 240 taccaattcg aaataaaata accgcaaaaa tcatgtttac gtaaaatata aatccattgt 300 ggtttttatt ggaaaaataa tattttaaaa aaatacatgt acaaataagg ttaaacccta 360 atttttttag tattataatt ttttggcttt ttttaattgg ttgatatatt aacgtcattt 420 tcctgtgcat cacatccgct tcaaaatgta tataataaga agacagatca actattttgc 480 cactttttct tcaagagctt gaagatacag ttctg 515 <210> 27 <211> 410 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 7MIEP(-388) in EXAMPLE 2 <400> 27 cgcagttcct gttgttttca cgggtttaaa tgtcagtggg ttatgtggtt ggggtctttc 60 ctgcctaaag cgagtgggaa tgtgtagaac ttgctgagaa gacaaccgca attcctgttg 120 tttcaaagat ttaaatacca attcgaaata aaataaccgc aaaaatcatg tttacgtaaa 180 atataaatcc attgtggttt ttattggaaa aataatattt taaaaaaata catgtacaaa 240 taaggttaaa ccctaatttt tttagtatta taattttttg gcttttttta attggttgat 300 atattaacgt cattttcctg tgcatcacat ccgcttcaaa atgtatataa taagaagaca 360 gatcaactat tttgccactt tttcttcaag agcttgaaga tacagttctg 410 <210> 28 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 7MIEP(-233) in EXAMPLE 2 <400> 28 accgcaaaaa tcatgtttac gtaaaatata aatccattgt ggtttttatt ggaaaaataa 60 tattttaaaa aaatacatgt acaaataagg ttaaacccta atttttttag tattataatt 120 ttttggcttt ttttaattgg ttgatatatt aacgtcattt tcctgtgcat cacatccgct 180 tcaaaatgta tataataaga agacagatca actattttgc cactttttct tcaagagctt 240 gaagatacag ttctg 255 <210> 29 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 7U95P(-484) in EXAMPLE 2 <400> 29 tgggttctca cccgtttagg caggaaacac ccagaccgca taacccactg acatttaaac 60 ccgtgaaaac aacaggaact gcggttgact tctcagcagg ttttatgggt tctcacccgt 120 ttaggtagga aagacccaga ccgcataacc cactaacatt ttaatatgtg aaaataaaca 180 ggaactgcgg ttatagtttc agtacattct agagattaca tcctgctaag gcgaaaaaca 240 ctttaaccgc aaaagccact gatttttaaa cttgtgaaaa taacaggaaa ccacagaaac 300 gtcaggaaaa aaacgttgtt ttataattat gtccataaaa catgcaacat aatccaaacc 360 ggccaatgat ttttctgctt aaatgtaatt taaataattt attcatacgt aagttgttat 420 agccacgcct acgcagcaat gtatataagc agacaccgtc atttcgcagt tagtctgctg 480 gaaagcttgt gaagactaca 500 <210> 30 <211> 395 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 7U95P(-379) in EXAMPLE 2 <400> 30 tgggttctca cccgtttagg taggaaagac ccagaccgca taacccacta acattttaat 60 atgtgaaaat aaacaggaac tgcggttata gtttcagtac attctagaga ttacatcctg 120 ctaaggcgaa aaacacttta accgcaaaag ccactgattt ttaaacttgt gaaaataaca 180 ggaaaccaca gaaacgtcag gaaaaaaacg ttgttttata attatgtcca taaaacatgc 240 aacataatcc aaaccggcca atgatttttc tgcttaaatg taatttaaat aatttattca 300 tacgtaagtt gttatagcca cgcctacgca gcaatgtata taagcagaca ccgtcatttc 360 gcagttagtc tgctggaaag cttgtgaaga ctaca 395 <210> 31 <211> 320 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of 7U95P(-304) in EXAMPLE 2 <400> 31 ggaactgcgg ttatagtttc agtacattct agagattaca tcctgctaag gcgaaaaaca 60 ctttaaccgc aaaagccact gatttttaaa cttgtgaaaa taacaggaaa ccacagaaac 120 gtcaggaaaa aaacgttgtt ttataattat gtccataaaa catgcaacat aatccaaacc 180 ggccaatgat ttttctgctt aaatgtaatt taaataattt attcatacgt aagttgttat 240 agccacgcct acgcagcaat gtatataagc agacaccgtc atttcgcagt tagtctgctg 300 gaaagcttgt gaagactaca 320 <210> 32 <211> 4818 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> sequence of pGL3 Basic in EXAMPLE 2 <400> 32 ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctaa gtaagcttgg 60 cattccggta ctgttggtaa agccaccatg gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg 120 gcgccattct atccgctgga agatggaacc gctggagagc aactgcataa ggctatgaag 180 agatacgccc tggttcctgg aacaattgct tttacagatg cacatatcga ggtggacatc 240 acttacgctg agtacttcga aatgtccgtt cggttggcag aagctatgaa acgatatggg 300 ctgaatacaa atcacagaat cgtcgtatgc agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg 360 gtgttgggcg cgttatttat cggagttgca gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa 420 cgtgaattgc tcaacagtat gggcatttcg cagcctaccg tggtgttcgt ttccaaaaag 480 gggttgcaaa aaattttgaa cgtgcaaaaa aagctcccaa tcatccaaaa aattattatc 540 atggattcta aaacggatta ccagggattt cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat 600 ctacctcccg gttttaatga atacgatttt gtgccagagt ccttcgatag ggacaagaca 660 attgcactga tcatgaactc ctctggatct actggtctgc ctaaaggtgt cgctctgcct 720 catagaactg cctgcgtgag attctcgcat gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc 780 attccggata ctgcgatttt aagtgttgtt ccattccatc acggttttgg aatgtttact 840 acactcggat atttgatatg tggatttcga gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag 900 ctgtttctga ggagccttca ggattacaag attcaaagtg cgctgctggt gccaacccta 960 ttctccttct tcgccaaaag cactctgatt gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa 1020 attgcttctg gtggcgctcc cctctctaag gaagtcgggg aagcggttgc caagaggttc 1080 catctgccag gtatcaggca aggatatggg ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt 1140 acacccgagg gggatgataa accgggcgcg gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg 1200 aaggttgtgg atctggatac cgggaaaacg ctgggcgtta atcaaagagg cgaactgtgt 1260 gtgagaggtc ctatgattat gtccggttat gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg 1320 attgacaagg atggatggct acattctgga gacatagctt actgggacga agacgaacac 1380 ttcttcatcg ttgaccgcct gaagtctctg attaagtaca aaggctatca ggtggctccc 1440 gctgaattgg aatccatctt gctccaacac cccaacatct tcgacgcagg tgtcgcaggt 1500 cttcccgacg atgacgccgg tgaacttccc gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag 1560 acgatgacgg aaaaagagat cgtggattac gtcgccagtc aagtaacaac cgcgaaaaag 1620 ttgcgcggag gagttgtgtt tgtggacgaa gtaccgaaag gtcttaccgg aaaactcgac 1680 gcaagaaaaa tcagagagat cctcataaag gccaagaagg gcggaaagat cgccgtgtaa 1740 ttctagagtc ggggcggccg gccgcttcga gcagacatga taagatacat tgatgagttt 1800 ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 1860 attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 1920 cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc 1980 tacaaatgtg gtaaaatcga taaggatccg tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc 2040 agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt 2100 ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc ggcagcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 2160 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 2220 tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 2280 aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 2340 ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 2400 aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 2460 cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 2520 cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 2580 aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 2640 cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga 2700 ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa 2760 gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta 2820 gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 2880 agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg 2940 acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 3000 tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 3060 agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 3120 gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg 3180 agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc 3240 cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa 3300 ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc 3360 cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt 3420 cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc 3480 ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt 3540 tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc 3600 catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt 3660 gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata 3720 gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga 3780 tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag 3840 catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 3900 aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 3960 attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 4020 aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgcgccct 4080 gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 4140 ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 4200 gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 4260 ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 4320 gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 4380 tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 4440 tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 4500 ttaacaaaat attaacgctt acaatttgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 4560 aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagcc caagctacca tgataagtaa 4620 gtaatattaa ggtacgggag gtacttggag cggccgcaat aaaatatctt tattttcatt 4680 acatctgtgt gttggttttt tgtgtgaatc gatagtacta acatacgctc tccatcaaaa 4740 caaaacgaaa caaaacaaac tagcaaaata ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag 4800 aacatttctc tatcgata 4818 <210> 33 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi of HIV-1 gp41 <400> 33 aataagacag ggcttggaaa gacactttcc aagccctgtc ttattttt 48 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi of HIV-1 tat <400> 34 aagcatccag gaagtcagcc tacaaggctg acttcctgga tgcttttt 48 <210> 35 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNAi of HTLV-1 tax <400> 35 gaacattggt gaggaaggca cagccttcct caccaatgtt cttttt 46

Claims (120)

  1. HHV 6B MIE 프로모터
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열 내에 적어도 R3 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  4. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열 내에 전사 개시점으로부터 -574 ∼ -427 (서열번호 13) 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  5. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열 내에 전사 개시점으로부터 -1051 ∼ -427 (서열번호 14) 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로 모터
  6. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 NF-κB 및 AP-1 모티프를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  7. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 1로 표시되는 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  8. 제 1항에 있어서, 상기 프로모터는 (a)서열 번호 1로 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 1로 기재된 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드에 혼성화되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; 또는 (d) (a)내지 (c)중 하나의 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에 70% 이상의 상동성을 지니는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  9. 제 1항에 있어서, 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 지님을 특징으로 하는 프로모터
  10. 제 8항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 프로모터 활성임을 특징으로 하는 프로모터
  11. 제 1항의 프로모터를 지닌 핵산 구축물(construct)
  12. 제 11항에 있어서, 상기 프로모터와 다른 유래의 외래 유전자를 코드화하는 서열을 상기 프로모터 서열에 대해 작동 가능하게 연결시킨 것을 포함함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  13. 제 12항에 있어서, 상기 외래 유전자는 RNAi 분자, 약제, 결손된 열성 유전자, 선택마커를 코드화함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  14. 제 13항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주의 배지에서 선택 가능함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  15. 제 13항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에서 눈으로 선택 가능함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  16. 제 13항에 있어서, 상기 선택 마커는 히포산틴 구아닌 포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt) 또는 녹색형광단백질(GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(dsRed)로 구성된 군에서 선택된 형광 단백질을 포함함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  17. 제 13항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에 대해 실질적으로 독성을 나타내지 않음을 특징으로 하는 핵산 구축물
  18. 제 13항에 있어서, 상기 결손된 열성 유전자는 ADA 유전자, PNP 유전자, γc체인유전자, TAP 유전자, MHC Ⅱ유전자, X연쇄WASP, CD40 리간드, PI3K 유사유전자 및 DNA 헬리카제로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 핵산 구축물
  19. 제 13항에 있어서, 상기 약제는 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 단백직호르몬, 펩티드호르몬(예를 들면 인터페론α, 인터페론γ, 인터루킨IL-2, IL-12, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF))으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 핵산 구축물
  20. 제 12항에 있어서, 상기 프로모터는 상기 외래 유전자의 혈구계 세포 특히 T 임파구에 특이적 발현을 유도함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  21. 제 11항의 핵산 구축물을 포함하는 발현 벡터
  22. 제 11항의 핵산 구축물을 포함하는 세포
  23. 제 22항에 있어서, 상기 세포는 상기 프로모터 서열과는 다른 종임을 특징으 로 하는 세포
  24. 제 11항의 핵산 구축물을 포함하는 조직
  25. 제 11항의 핵산 구축물을 포함하는 장기
  26. 제 11항의 핵산 구축물을 포함하는 생물
  27. 제 1항의 프로모터 및 항원을 코드화하는 서열을 지닌 약학적 조성물
  28. 제 27항에 있어서, DNA 백신임을 특징으로 하는 약학적 조성물
  29. 임파구 특이적인 처리가 필요한 질환, 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 제 1항의 프로모터 및 상기 처치를 위한 핵산 서열을 포함하 는 약학적 조성물
  30. 제 29항에 있어서, 상기 처치를 위한 핵산 서열은 사이토카인을 코드화하는 핵산 서열, 케모카인을 코드화하는 핵산 서열, 성장인자를 코드화하는 핵산 서열, 단백질 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 펩타이드 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 리보자임, RNAi(HIV-1 gp41: AATAAGACAGGGCTTGGAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(서열 번호 33)/HIV-1 tat: AAGCATCCAGGAAGTCAGCCTACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(서열 번호 34)/HTLV-1 tax: GAACATTGGTGAGGAAGGCACAGCCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT(서열 번호 35))를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물
  31. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 방법에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  32. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터 에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  33. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  34. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 방법에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  35. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축 물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  36. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  37. 단백질을 생산하는 방법에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  38. 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  39. 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 제 1항의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  40. 임파구 특이적인 처치를 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 제 1항의 프로모터의 사용
  41. HHV 7 MIE 프로모터
  42. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 2로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  43. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 2로 표시되는 서열 내에 적어도 R2 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  44. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 2로 표시되는 서열 내에 +22 ∼ -233 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  45. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 2로 표시되는 서열 내에 +22 ∼ -388 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  46. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터는 R2 영역에 존재하는 NF-κB 결합 모티프를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  47. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 15로 표시되는 서열을 포함하함을 특징으로 하는 프로모터
  48. 제 41항에 있어서, 상기 프로모터는 (a)서열 번호 2로 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 2로 기재된 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드에 혼성화되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; 또는 (d) (a)내지 (c)중 하나의 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에 70% 이상의 상동성을 지니는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  49. 제 41항에 있어서, 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 지님을 특징으로 하는 프로모터
  50. 제 48항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 프로모터 활성임을 특징으로 하는 프로모터
  51. 제 41항의 프로모터를 지닌 핵산 구축물(construct)
  52. 제 51항에 있어서, 상기 프로모터와 다른 유래의 외래 유전자를 코드화하는 서열을 상기 프로모터 서열에 대해 작동 가능하게 연결시킨 것을 포함함을 특징으 로 하는 핵산 구축물
  53. 제 52항에 있어서, 상기 외래 유전자는 RNAi 분자, 약제, 결손된 열성 유전자, 선택마커를 코드화함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  54. 제 53항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주의 배지에서 선택 가능함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  55. 제 53항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에서 눈으로 선택 가능함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  56. 제 53항에 있어서, 상기 선택 마커는 히포산틴 구아닌 포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt) 또는 녹색형광단백질(GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(dsRed)로 구성된 군에서 선택된 형광 단백질을 포함함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  57. 제 53항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에 대해 실질적으로 독성을 나타내지 않음을 특징으로 하는 핵산 구축물
  58. 제 53항에 있어서, 상기 결손된 열성 유전자는 ADA 유전자, PNP 유전자, γc체인유전자, TAP 유전자, MHC Ⅱ유전자, X연쇄WASP, CD40 리간드, PI3K 유사유전자 및 DNA 헬리카제로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 핵산 구축물
  59. 제 53항에 있어서, 상기 약제는 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 단백직호르몬, 펩티드호르몬(인터페론α, 인터페론γ, 인터루킨IL-2, IL-12, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF))으로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 핵산 구축물
  60. 제 52항에 있어서, 상기 프로모터는 상기 외래 유전자의 혈구계 세포 특히 T 임파구에 특이적 발현을 유도함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  61. 제 51항의 핵산 구축물을 포함하는 발현 벡터
  62. 제 51항의 핵산 구축물을 포함하는 세포
  63. 제 62항에 있어서, 상기 세포는 상기 프로모터 서열과는 다른 종임을 특징으로 하는 세포
  64. 제 51항의 핵산 구축물을 포함하는 조직
  65. 제 51항의 핵산 구축물을 포함하는 장기
  66. 제 51항의 핵산 구축물을 포함하는 생물
  67. 제 41항의 프로모터 및 항원을 코드화하는 서열을 지닌 약학적 조성물
  68. 제 67항에 있어서, DNA 백신임을 특징으로 하는 약학적 조성물
  69. 임파구 특이적인 처리가 필요한 질환, 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 제 41항의 프로모터 및 상기 처치를 위한 핵산 서열을 포함하는 약학적 조성물
  70. 제 69항에 있어서, 상기 처치를 위한 핵산 서열은 사이토카인을 코드화하는 핵산 서열, 케모카인을 코드화하는 핵산 서열, 성장인자를 코드화하는 핵산 서열, 단백질 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 펩타이드 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 리보자임, RNAi(HIV-1 gp41: AATAAGACAGGGCTTGGAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(서열 번호 33)/HIV-1 tat: AAGCATCCAGGAAGTCAGCCTACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(서열 번호 34)/HTLV-1 tax: GAACATTGGTGAGGAAGGCACAGCCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT(서열 번호 35))를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물
  71. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 방법에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  72. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  73. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  74. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 방법에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  75. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  76. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  77. 단백질을 생산하는 방법에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  78. 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  79. 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 제 41항의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  80. 임파구 특이적인 처치를 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 제 41항의 프로모터의 사용
  81. HHV 7 U 95 프로모터
  82. 제 81항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 12로 표시되는 서열 내에 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  83. 제 81항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 12로 표시되는 서열 내에 적어도 R2 영역 또는 그의 기능적 변이체를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  84. 제 81항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 12로 표시되는 서열 내에 +16 ∼ -304 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  85. 제 81항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 12로 표시되는 서열 내에 +16 ∼ -379 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  86. 제 81항에 있어서, 상기 프로모터는 R2 영역에 존재하는 NF-κB 결합 모티프를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  87. 제 81항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 16으로 표시되는 서열을 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  88. 제 81항에 있어서, 상기 프로모터는 (a)서열 번호 12로 기재된 염기 서열 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (b)서열 번호 12로 기재된 염기 서열의 대립 유전자 변이체 또는 그에 상응하는 염기 서열 또는 그의 단편을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (c) (a) 또는 (b)의 뉴클레오티드에 혼성화되는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드; 또는 (d) (a)내지 (c)중 하나의 염기 서열 또는 그의 상보적 서열에 70% 이상의 상동성을 지니는 생물학적 활성을 지닌 폴리뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 프로모터
  89. 제 81항에 있어서, 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드 길이를 지님을 특징으로 하는 프로모터
  90. 제 88항에 있어서, 상기 생물학적 활성은 프로모터 활성임을 특징으로 하는 프로모터
  91. 제 81항의 프로모터를 지닌 핵산 구축물(construct)
  92. 제 91항에 있어서, 상기 프로모터와 다른 유래의 외래 유전자를 코드화하는 서열을 상기 프로모터 서열에 대해 작동 가능하게 연결시킨 것을 포함함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  93. 제 92항에 있어서, 상기 외래 유전자는 RNAi 분자, 약제, 결손된 열성 유전자, 선택마커를 코드화함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  94. 제 93항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주의 배지에서 선택 가능함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  95. 제 93항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에서 눈으로 선택 가능함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  96. 제 93항에 있어서, 상기 선택 마커는 히포산틴 구아닌 포스포릴보실 트랜스퍼라제(hprt) 또는 녹색형광단백질(GFP), 청색형광단백질(CFP), 황색형광단백질(YFP) 및 적색형광단백질(dsRed)로 구성된 군에서 선택된 형광 단백질을 포함함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  97. 제 93항에 있어서, 상기 선택 마커는 상기 핵산 구축물이 도입된 숙주에 대해 실질적으로 독성을 나타내지 않음을 특징으로 하는 핵산 구축물
  98. 제 93항에 있어서, 상기 결손된 열성 유전자는 ADA 유전자, PNP 유전자, γc체인유전자, TAP 유전자, MHC Ⅱ유전자, X연쇄 WASP, CD40 리간드, PI3K 유사유전자 및 DNA 헬리카제로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 핵산 구축물
  99. 제 93항에 있어서, 상기 약제는 사이토카인, 케모카인, 성장인자, 단백질 호르몬, 펩티드호르몬(인터페론α, 인터페론γ, 인터루킨IL-2, IL-12, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(GM-CSF))로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 핵산 구축물
  100. 제 92항에 있어서, 상기 프로모터는 상기 외래 유전자의 혈구계 세포 특히 T 임파구에 특이적 발현을 유도함을 특징으로 하는 핵산 구축물
  101. 제 91항의 핵산 구축물을 포함하는 발현 벡터
  102. 제 91항의 핵산 구축물을 포함하는 세포
  103. 제 102항에 있어서, 상기 세포는 상기 프로모터 서열과는 다른 종임을 특징으로 하는 세포
  104. 제 91항의 핵산 구축물을 포함하는 조직
  105. 제 91항의 핵산 구축물을 포함하는 장기
  106. 제 91항의 핵산 구축물을 포함하는 생물
  107. 제 81항의 프로모터 및 항원을 코드화하는 서열을 지닌 약학적 조성물
  108. 제 107항에 있어서, DNA 백신임을 특징으로 하는 약학적 조성물
  109. 임파구 특이적인 처리가 필요한 질환, 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물에 있어서, 제 81항의 프로모터 및 상기 처치를 위한 핵산 서열을 포함하는 약학적 조성물
  110. 제 109항에 있어서, 상기 처치를 위한 핵산 서열은 사이토카인을 코드화하는 핵산 서열, 케모카인을 코드화하는 핵산 서열, 성장인자를 코드화하는 핵산 서열, 단백질 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 펩타이드 호르몬을 코드화하는 핵산 서열, 리보자임, RNAi(HIV-1 gp41: AATAAGACAGGGCTTGGAAAGACACTTTCCAAGCCCTGTCTTATTTTT(서열 번호 33)/HIV-1 tat: AAGCATCCAGGAAGTCAGCCTACAAGGCTGACTTCCTGGATGCTTTTT(서열 번호 34)/HTLV-1 tax: GAACATTGGTGAGGAAGGCACAGCCTTCCTCACCAATGTTCTTTTT(서열 번호 35))를 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물
  111. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 방법에 있어서, (A) 제 81항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  112. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 제 81항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  113. 임파구 특이적인 단백질을 발현하는 키트에 있어서, (A) 제 81항의 프로모 터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  114. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 방법에 있어서, (A) 제 81항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  115. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 제 81항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  116. 임파구 특이적인 단백질을 발현시키는 것을 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치 또는 예방하는 키트에 있어서, (A) 제 81항의 프로모터; 및 (B) 상기 프 로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  117. 단백질을 생산하는 방법에 있어서, (A) 제 81항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 단계; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 단계를 포함하는 방법
  118. 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 제 81항의 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물; (B) 상기 핵산 구축물을 상기 프로모터가 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열의 발현을 유도시키는 조건 하에 배치하는 수단을 포함하는 키트
  119. 단백질을 생산하는 키트에 있어서, (A) 제 81항의 프로모터; 및 (B) 상기 프로모터에 상기 단백질을 코드화하는 핵산 서열을 작동 가능하게 연결시킨 핵산 구축물을 제조하는 수단을 포함하는 키트
  120. 임파구 특이적인 처치를 필요로 하는 질환 장애 또는 상태를 처치하기 위한 약학적 조성물의 제조를 위한 제 81항의 프로모터의 사용
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011027575A1 (ja) * 2009-09-04 2011-03-10 独立行政法人医薬基盤研究所 プロモーターのエンハンサーおよびその利用方法
CN101869715A (zh) * 2010-05-26 2010-10-27 江苏命码生物科技有限公司 载有干扰核糖核酸的细胞微粒子、其制备方法及其应用
SG191246A1 (en) * 2010-12-24 2013-07-31 Agency Science Tech & Res Modified human cmv promoters that are resistant to gene silencing
US10365597B2 (en) * 2016-05-26 2019-07-30 Xerox Corporation Endless belt comprising boron nitride nanotubes
CN106086011B (zh) * 2016-06-18 2019-10-18 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性大豆植物dbn9004的核酸序列及其检测方法
WO2023147604A2 (en) * 2022-01-31 2023-08-03 Trames Bio, Inc. Expression cassettes for treating epilepsy and neuropathic pain
KR102509175B1 (ko) 2022-10-11 2023-03-15 주식회사 하이플랜 화재확산방지기능을 갖는 배전반

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
WO1985000817A1 (en) 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
US5879936A (en) * 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
GB9323404D0 (en) * 1993-11-12 1994-01-05 Smithkline Beecham Plc Pharmaceuticals
CN1111069C (zh) * 1999-07-13 2003-06-11 暨南大学 Hhv8的mip同源物在防治艾滋病的药物中的应用
GB0027088D0 (en) * 2000-11-06 2000-12-20 Glaxo Group Ltd DNA expression vectors
JP3923505B2 (ja) * 2003-08-29 2007-06-06 株式会社ウイルス医科学研究所 Ｈｈｖ−６由来の組換ウイルスベクター、その製造方法、それを用いた宿主細胞の形質転換方法、それにより形質転換された宿主細胞およびそれを用いた遺伝子治療方法
GB0400965D0 (en) * 2004-01-16 2004-02-18 Glaxo Group Ltd Promoter

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