KR20070116110A - 생물학적 생성물 - Google Patents

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KR20070116110A
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앤드류 조지 포플레웰
사이몬 피터 틱클
카렌 진케위치-페오티
로버트 켄달 모리슨
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셀테크 알앤디 리미티드
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Abstract

본 발명은 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 마우스 단일클론 항체 유래의 적어도 하나의 CDR을 포함하는 항체분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CDRs 중의 적어도 하나가 하이브리드 CDR인 것을 특징으로 하는 CDR 이식 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항체분자의 사슬을 인코딩하는 DNA 서열, 벡터, 형질전환된 숙주세포, 및 VEGF 및/또는 KDR이 관련된 질병의 치료에의 상기 항체분자의 사용에 관한 것이다.

Description

생물학적 생성물{BI0L0GICAL PRODUCTS}
본 발명은 인간의 키나아제 삽입 도메인을 포함하는 수용체(human kinase insert domain-containing receptor:KDR)의 항원 결정부위(antigenic determinants)에 대해 특이성을 갖는 항체분자에 관한 것이다. 항체분자는 인간의 혈관내피세포성장인자(VEGF) 보다 더 큰 친화력(affinity)으로 KDR과 결합하고, VEGF와 KDR사이의 상호작용을 막는다. 또한, 본 발명은 항체분자의 치료적 사용과 항체분자의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 항체분자들에 관한 것이다. 하나의 항체분자에는 두개의 중쇄(heavy chain)와 두개의 경쇄(light chain)가 있다. 각각의 중쇄와 각각의 경쇄는 그의 N-터미널 말단에 가변영역(variable region)을 갖고 있다. 각각의 가변영역은 3개의 상보성결정부위들(complementarity determining regions:CDRs)과 교번하는 4개의 구조형성부위들(framework regions:FRs)로 구성된다. 상보성결정부위들(CDRs)은 항체들의 항원결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다. 가변영역내의 잔기들(residue)은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 넘버링된다. 이 시스템 은 Kabat 등, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA(이하 "Kabat 등(상기 참조)")에 설명되어 있다. 상기의 넘버링 시스템은 다른 설명이 있는 경우를 제외하고는 본 명세서에서 사용된다.
Kabat 잔기 지정은 아미노산 잔기들의 직선형 넘버링과 항상 직접 일치하는 것은 아니다. 실제의 직선형 아미노산 서열은 엄격한 Kabat 넘버링에서 보다 더 적게 또는 부가적으로 아미노산들을 포함할 수 있고, 이는 기본적 가변영역 구조의 구조성분(구조형성부위 또는 CDR)의 단축 또는 구조성분내로의 삽입에 상응하는 것이다.
주어진 항체에 대한 잔기들의 정확한 Kabat 넘버링은 “표준”Kabat 넘버로된 서열과 항체의 서열상의 상동성 있는 잔기들을 배열, 대조하므로써 결정될 수 있다.
중쇄 가변영역의 CDRs은 Kabat 넘버링에 따라 잔기 31~35(CDRH1), 잔기 50~65(CDRH2)와 잔기 95~102(CDRH3)에 위치한다.
경쇄 가변영역의 CDRs은 Kabat 넘버링에 따라 잔기 24~34(CDRL1), 잔기 50~56(CDRL2)과 잔기 89~97(CDRL3)에 위치한다.
CDR-이식된 항체들의 구조는 유럽 특허출원 EP-A-0239400에 설명되어 있고, 이는 마우스의 단일클론 항체(Mab)가 긴 올리고뉴클레오티드를 사용하는 부위특이성 돌연변이 유발에 의해 인간 면역글로블린의 가변영역의 구조형성부위에 이식되는 방법을 개시하고 있다.
CDR-이식에 의한 마우스 단일클론 항체를 인간화시키기 위한 초기의 연구는 NP와 같은 합성 항원들을 인식하는 단일클론 항체로 수행되었다. 그러나, 라이소자임(lysozyme)을 인식하는 마우스 Mab와 인간 T-세포에 있는 항원을 인식하는 쥐 Mab가 CDR-이식에 의해 인간화되는 예들은 각각 Verhoeyen 등(Science, 239, 1534~1536, 1988)과 Riechmann 등(Nature, 332, 323~324, 1988)에 의해 설명되어 있다.
Riechmann 등은 CDRs 단독의 도입(Kabat 등(상기 참조)과 Wu 등, J. Exp. Med., 132, 211~250, 1970)에 의해 정의된 바와 같음)으로는 CDR-이식된 생성물 내에서 만족스런 항원결합 활성을 제공하기에 충분치 못함을 알게 되었다. 많은 구조형성 잔기들은 이들이 공여체의 구조형성부위의 잔기들과 상응되도록 하기 위하여 변경되어야 함을 발견하였다. 변경될 필요가 있는 구조형성 잔기들을 선택하기 위해 제안된 기준은 국제특허출원번호 WO 90/07861에 설명되어 있다.
CDR-이식된 항체들을 논의하는 다수의 리뷰(reviews)들이 간행되었고, 이들은 Vaughan 등(Nature Biotechnology, 16, 535~539, 1998)을 포함한다.
VEGF는 PDGF와 구조적인 유사성을 지니며, 두개의 23kD 소단위체(subunit)로 구성된 동종이량체 글리코단백질이다. 이는 혈관형성(Vasculogenesis), 즉 새로운 혈관 시스템의 확립에 있어서 중요한 발생학적 역할을 하며, 혈관신생(angiogenesis), 즉 이전에 존재하는 혈관들로부터 새로운 혈관의 생성에도 관여한다. 혈관신생은 이전에 존재하는 혈관들로부터 모세혈관 내피세포층 세포들의 증식, 이동 및 조직 침투를 포함한다. 배발생, 난포세포 생장(황체(corpus luteum)형 성을 포함) 및 상처치유와 같은 정상적인 생리학적 과정에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 혈관신생은 염증, 건선(psoriasis), 류마티스성 관절염, 종양증식 및 전이를 포함하는 다수의 병리 조건하에서 발생한다(Folkman, J and Klagsbrun, M., Science, 235:442~447, 1987). 예를 들면, 종양들은 이들이 혈관신생을 통해 전용의 혈액 공급을 제공받지 못하면 일정 크기 이상의 성장을 할 수가 없는 것으로 널리 알려져 있다.
VEGF는 내피세포층 세포-특이성 혈관신생 유도물질이라는 점에서, 생체내에서 혈관신생 의 가능한 조절인자로서 예상되는 다른 인자들과는 뚜렷한 차이가 있다.
mRNA의 선택 접합(alternative splicing)의 결과로 생성된 다섯개의 상이한 단량체형의 VEGF 이형(isoform)이 존재한다. 이들 이형들은 두개의 세포막 결합형 (VEGF206과 VEGF189)과 3개의 가용성형(VEGF165, VEGF121 및 VEGF145)을 포함한다. 인간의 태반을 제외한 모든 조직들에서, VEGF165는 가장 풍부한 이형이다.
VEGF의 효과는 두종의 고친화력의 티로신 키나아제 수용체들, fms-유사 티로신 키나아제 수용체(FLT-1 또는 VEGFR-1, Shibuya M. 등, Oncogene, 5, 519~524, 1990) 및 KDR(또는 VEGFR-2, Terman 등, Oncogene, 6, 1677~1683, 1991)과의 상호작용을 통해서 매개된다. KDR과 FLT-1 모두는 각각이 세포외 리간드-결합부위, 세포내 티로신 키나아제 영역 및 트랜스멤브레인(transmembrane) 영역내에 7개의 면역글로블린-유사 영역을 함유하는 세포막-관통(spanning) 수용체들이다. 트랜스 멤 브레인 영역은 이 영역내에서 발현되는 세포들의 세포막 내에 수용체를 고정시키는 역할을 한다.
종양내에서 VEGF와 이것의 수용체 모두가 RNA와 단백질 수준에서 모두 과발현된다는 몇몇 보고(Dvorak 등, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 237, 97, 1999)가 있다. VEGF 발현은 종양내에서 자주 발생하는 저산소증(hypoxia)에 반응하여 상향조절 되고, 증가된 농도의 리간드는 VEGF의 수용체의 발현을 유도한다. 인간의 종양내에서 증가된 KDR 발현을 보여주는 연구들의 예들은 다음을 포함한다: 유방암(Brown 등, Hum. Pathol., 26, 86, 1995); 대장암(Takahashi 등, Cancer Res., 55, 3964, 1995); 신장암(Takahashi 등, BBRC, 257, 855, 1999) 및 위-장관의 선암종(adenocarcinoma)(Brown 등, Cancer Res., 53, 4727, 1993). KDR에 결합된 VEGF를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하는 최근의 연구에서, 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer)에서 VEGF/KDR 혈관신생 경로의 상향조절이 관찰됐다(Koukourakis 등, Cancer Res., 60, 3088, 2000).
다수의 실험증거들이 생체내에서 VEGF 활성과 종양 혈관신생 사이의 일반적인 관련성을 보여준다. Kim 등은 종양을 갖고 있는 면역결핍 마우스(nude mouse)들에 항-VEGF 중화 Mab를 주사한 결과, 종양성장이 억제 되었음을 보여주었다(Nature, 362, 841, 1993). 우성의 음성 마우스 KDR(FLK-1)의 레트로바이러스 발현은 또한 마우스에서 종양성장을 억제시켰다(Millauer 등, Nature, 367 576, 1993). 이와 유사하게, VEGF 안티센스(Cheng 등, PNAS, 93, 8502, 1996), 항-FLK-1 항체(Witte 등, Cancer Metast. Rev., 17, 155, 1998)와 가용성 FLT-1의 발 현(Goldman 등, PNAS, 95, 8795, 1988) 모두는 마우스 모델들에서 종양성장을 억제 하였다.
몇가지의 실험증거들은 혈관신생에 관련된 VEGF의 생물학적 효과들은 주로 KDR 수용체를 통해 매개됨을 시사한다(Larrivee와 Karsan, Int. J. Mol., 5, 447, 2000).
VEGF-매개의 KDR 단독의 활성화(하나의 VEGFR-타입만 발현하는 세포주에서)는 세포증식과 세포이동을 야기하기에 충분함을 보여주었다(Waltenburger 등, J. Biol. chem., 269, 26988, 1994). 반대로, FLT-1 단독으로 활성화시에는, 세포증식은 보이지 않고, 세포이동은 일관성 없이 관찰되었다.
수용체 선택성 VEGF 돌연변이체를 사용하는 실험들은 KDR 연계가 증식, 이동 및 혈관 침투를 일으키는 분열촉진제 활성 단백질 키나아제(MAPK)를 활성화시킨다는 사실을 보여주었다(Keyt 등, J. Biol. Chem., 271, 5638, 1996). FLT-1 선택성 돌연변이체는 이들 분석에서는 비활성이었다.
KDR과의 상호작용을 차단하지만, FLT-1과의 상호작용은 차단하지 않는 항-VEGF Mab는 VEGF-유도의 혈관 침투를 저해할 수 있는 반면에, 비차단 항-VEGF 항체는 어떤 효과도 없었다(Brekken 등, Cancer Res., 60, 5117, 2000).
하이브리도마 기술에 의한 쥐(murine)의 VEGF 수용체인 FLK-1에 대한 Mab의 생산은 WO 97/11499에 설명되어 있다. 이들은 수용체와 VEGF의 상호작용을 차단시키므로써 FLK-1 수용체 활성화를 억제시킨다고 설명되어 있다. 이러한 수용체 활성화의 억제는 어떤 모델들에서 VEGF-유도 혈관신생을 억제시키는데 효과적이었다. 더구나, 상기 항-FLK-1 항체는 몇몇 마우스 이종이식(xenograft) 종양을 치료하는데 효과적임이 밝혀졌다. 그러나, FLK-1에 결합하는 모든 항체들이 치료효능에 충분한 친화력을 갖고 KDR과 결합하는 것은 아니다.
또한, VEGF-KDR 결합은 KDR-매개의 PI3-키나아제-Akt 키나아제 시그널 경로(Akt 키나아제는 세포생존에 관여하는 PI3-키나아제 경로의 잘 알려진 하류 키나아제이다, Gerber 등, J. Biol. Chem., 273, 30336, 1998)의 활성화를 통한 신규 형성 혈관의 세포사멸(apoptosis)을 억제한다. 동물 모델들 또한 VEGF-KDR 상호작용의 차단을 통해 상기의 항세포사멸반응의 차단의 효능을 보여주었다.
KDR은 VEGF의 효과를 매개하는데 있어서 가장 중요한 수용체로 여겨지고 있고, 혈관신생 촉진과 새로운 혈관 생존에 있어서의 이의 역할이 일반적으로 인정되고 있다.
따라서, KDR에 결합하여 VEGF에 의한 활성화를 차단할 수 있는 항체분자는 VEGF 및/또는 KDR이 관여하는 병리학상의 질병 치료시에 치료적 잇점이 있을 수 있다. 예를 들면, 염증, 건선, 류마티스성 관절염 및 종양생장의 경우들이다. 또한, 이는 KDR 수용체와의 상호작용을 차단시키므로써 최상으로 성취될 수 있다는 강력한 주장이 있다. 반복적으로 사용가능하고, 쉽게 그리고 효율적으로 제조될 수 있는 그러한 항체분자에 대한 필요성이 있다. 또한, KDR에 대한 고친화력 및 인간에서 낮은 면역원성을 갖는 항체분자에 대한 필요성이 있다.
첫째 관점에서, 본 발명은 중쇄를 포함하는, KDR에 대한 특이성을 갖는 항체분자를 제공하고, 상기 중쇄의 가변영역은 CDRH1에 대해 도1에서 H1(SEQ ID NO:1)로서, CDRH2에 대해 도1에서 H2(SEQ ID NO:2)로서, 또는 CDRH3에 대해 도1에서 H3(SEQ ID NO:3)으로서 나타낸 서열을 갖는 CDR(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)을 포함한다.
본 발명의 첫째 관점의 항체분자는 중쇄 가변영역에 대해 H1, H2 및 H3(SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:3)으로부터 선택된 최소한 하나의 CDR을 포함한다. 바람직하게는 항체분자는 중쇄 가변영역내에 최소한 두개의 CDRs을 포함하고, 더욱 바람직하게는 3개 모두의 CDRs을 포함한다.
본 발명의 둘째 관점에서, 경쇄를 포함하는, 인간 KDR에 대한 특이성을 갖는 항체분자가 제공되고, 상기 경쇄의 가변영역은 CDRL1에 대해 도1에서 L1(SEQ ID NO:4)로서, CDRL2에 대해 도1에서 L2(SEQ ID NO:5)로서, 또는 CDRL3에 대해 도1에서 L3(SEQ ID NO:6)으로서 나타낸 서열을 갖는 CDR(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)을 포함한다.
본 발명의 둘째 관점의 항체분자는 경쇄 가변영역에 대해 L1, L2 및 L3(SEQ ID NO:4~SEQ IN NO:6)으로부터 선택된 최소한 하나의 CDR을 포함한다. 바람직하게는 항체분자는 경쇄 가변영역내에서 최소한 두개의 CDRs을 포함하고, 더욱 바람직하게는 3개 모두의 CDRs을 포함한다.
본 발명의 첫째 및 둘째 관점의 항체분자들은 바람직하게는 상보성 경쇄 또 는 상보성 중쇄를 각각 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 첫째 또는 둘째 관점의 항체분자는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄의 가변영역은 CDRH1에 대해 도1에서 H1(SEQ ID NO:1)로서, CDRH2에 대해 도1에서 H2(SEQ ID NO:2)로서, 또는 CDRH3에 대해 도1에서 H3(SEQ ID NO:3)으로서 나타낸 서열을 갖는 CDR(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)을 포함하고, 그리고 상기 경쇄의 가변영역은 CDRL1에 대해 도1에서 L1(SEQ ID NO:4)로서, CDRL2에 대해 도1에서 L2(SEQ ID NO:5)로서, CDRL3에 대해 도1에서 L3 (SEQ ID NO:6)으로서 나타낸 서열을 갖는 CDR(Kabat 등(상기 참조)에 의해 정의된 바와 같음)을 포함한다.
상기 SEQ ID NO:1~NO:6(도1)으로 나타낸 CDR들은 마우스의 단일클론 항체 VR165로부터 유래된 것이다. 본 발명은 또한 마우스 단일클론 항체 VR165를 제공한다. VR165 항체의 가변영역의 서열은 도2(SEQ ID NOS:7 및 8)에 나타내었다. VR165의 경쇄 불변영역(constant region)은 카파(kappa)이고, 중쇄 불변영역은 IgG2a이다. 이러한 마우스 항체는 이하에서는 “공여체 항체”로 나타낸다.
두번째의 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 첫째와 둘재 관점들 중의 어느 것에 따르는 항체는 키메릭 마우스/인간 항체분자이고, 이는 여기에서 키메릭 VR165 항체분자로 표현된다. 키메릭 VR165 항체분자는 마우스 Mab VR165(SEQ ID NOS:7 및 8)의 가변영역과 인간 불변영역을 포함한다. 바람직하게는, 키메릭 VR165 항체분자는 경쇄내에 인간 C 카파영역(Hieter 등, Cell, 22, 197~207, 1980;Genebank accession NO. J00241)과 중쇄내에 인간 감마 4 영역(Flanagan 등, Nature, 300, 709~713, 1982)을 포함한다.
세번째의 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 첫째와 둘째 관점들 중의 어느 것에 따르는 항체는 CDR-이식 항체분자이다. 여기에서 사용된 용어 “CDR-이식 항체분자”는, 중쇄 및/또는 경쇄가 수용체 항체(예, 인간항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변영역 구조형성부위내로 이식된 공여체 항체(예, 쥐(murine) Mab)로부터 유래된 하나 이상의 CDRs을 포함하는 항체분자를 뜻한다.
바람직하게는, 이러한 CDR-이식 항체는 상기의 하나 이상의 공여체 CDRs 뿐만 아니라 인간 수용체 구조형성부위를 포함하는 가벽영역을 갖는다.
CDRs이 이식될 때, 어떤 적절한 수용체 가변영역 구조형성부위 서열은 마우스, 영장류 및 인간 구조형성부위를 포함하는, CDRs이 유도되는 공여체 항체의 류/형(class/type)을 고려하여 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 인간 구조형성부위의 예들은 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM(Kabat 등(상기 참조) )이다. 예를 들면, KOL과 NEWM은 중쇄를 위해 사용 가능하고, REI는 경쇄를 위해 사용 가능하며, EU, LAY 및 POM은 중쇄와 경쇄 모두를 위해 사용 가능하다.
중쇄를 위한 바람직한 구조형성부위는 도3에 도시된 인간 생식세포(germline)그룹 3 구조형성부위(VH3-7 GL, SEQ ID NO:9)이다. 경쇄를 위한 바람직한 구조형성부위는 도3에 도시된 인간 생식세포 서열그룹 1 구조형성부위(A30 GL, SEQ ID NO:10)이다.
본 발명의 CDR-이식 항체에 있어서, 수용체 항체로서는 공여체 항체의 사슬들과 상동성이 있는 사슬을 갖는 것을 사용함이 바람직하다. 수용체 중쇄와 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며, 원한다면 상이한 사슬들로부터 유래된 구조형성부위를 갖는 혼성 사슬을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 CDR-이식된 항체에 있어서, 구조형성부위는 수용체 항체의 구조형성부위와 완전히 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들면, 특수한 잔기들이 수용체 사슬 류 또는 형을 위해 더 자주 존재하는 잔기들로 전환될 수 있다. 또는, 수용체 구조형성부위내에서 선택된 잔기들은 공여체 항체내에서 동일한 위치에서 발견되는 잔기에 상응하도록 전환될 수 있다. 이러한 전환은 공여체 항체의 친화력을 회복하기에 필요한 최소한으로 유지되어야만 한다. 전환될 필요가 있는 수용체 구조형성부위내 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 WO 91/09967에 설명되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 CDR-이식 항체분자에서, 수용체 중쇄가 인간 생식세포그룹 3 구조형성부위(도3에 도시)(SEQ ID NO:9)를 가지고 있다면, 수용체 중쇄의 구조형성부위는 하나 이상의 공여체 CDRs 이외에, 위치 77과 93(Kabat 등(상기 참조)에 따름)에 공여체 잔기들을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 CDR-이식 항체분자에 있어서, 수용체 경쇄가 인간의 생식세포그룹 1 구조형성부위(도3에 도시)(SEQ ID NO:10)를 가지고 있다면, 수용체 경쇄의 구조형성부위는 위치 36, 44, 60, 66, 69, 70 및 71(Kabat 등(상기 참조)에 따름)에 공여체 잔기들을 포함한다.
공여체 잔기들은 공여체 항체 즉, CDR들이 최초로 유래된 항체, 유래의 잔기들이다.
본 발명의 항체분자는 다음을 포함할 수 있다: 전장(full length) 중쇄와 경쇄를 갖는 완전한 항체분자; Fab, 변형된 Fab, 디-Fab, 디-(변형된 Fab), Fab', F(ab')2 또는 Fv 단편과 같은 그들의 단편; 경쇄 또는 중쇄 단량체 또는 이량체; 단일쇄 항체, 예로서 중쇄와 경쇄 가변영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 단일쇄 Fv. 유사하게, 중쇄와 경쇄 가변영역은 적절하게 다른 항체 영역들과 결합될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 항체분자는 Fab 단편이다. 바람직하게는, Fab 단편은 SEQ ID NO:11(도4)로서 나타낸 서열을 갖는 경쇄와, SEQ ID NO:12(도5)로서 나타낸 서열을 갖는 중쇄를 갖는다. SEQ ID NO:11과 SEQ ID NO:12로서 나타낸 아미노산 서열들은, 바람직하게는 각각 SEQ ID NO:13과 SEQ ID NO:14(도4와 도5)로서 나타낸 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다(encoded).
또는, 본 발명의 항체분자는 변형된 Fab 단편인 것이 바람직하며, 여기에서 변형이란 효과인자(effector) 또는 보고인자(reporter) 분자의 부착을 가능케 하도록 하나 이상의 아미노산이 중쇄의 C-터미널 말단에 추가된 것을 의미한다. 바람직하게는, 추가된 아미노산들은 효과인자 또는 보고인자 분자가 부착될 수 있는 하나 또는 두개의 시스테인(cysteine) 잔기들을 포함하는 변형된 힌지(hinge) 부위를 형성한다. 이러한 변형된 Fab 단편은, 바람직하게는 SEQ ID NO:11로서 나타낸 서열을 갖는 경쇄와 SEQ ID NO:12로서 나타낸 서열을 갖는 중쇄를 갖는다. SEQ ID NO:11과 SEQ ID NO:12로서 나타낸 아미노산 서열들은, 바람직하게는 SEQ ID NO:13과 SEQ ID NO:14로서 나타낸 뉴클레오티드 서열들에 의해 각각 인코딩된다.
또는, 본 발명의 항체분자는 디-(변형 Fab) 단편인 것이 특히 바람직하며, 여기에서 변형이란 각 Fab 중쇄의 다른 Fab 중쇄에의 부착을 위해, 그리고 효과인자 또는 보고인자 분자의 부착을 가능케 하도록, 하나 이상의 아미노산이 각 Fab 중쇄의 C-터미널 말단에 추가된 것을 의미한다. 바람직하게는, 추가된 아미노산들은 다른 Fab, 효과인자 또는 보고인자 분자들의 부착을 위하여, 1, 2 또는 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 변형된 힌지 부위를 형성한다.
바람직한 효과인자 그룹은 생체내에서 반감기를 증가시키기 위해, 변형된 Fab 또는 디-(변형 Fab) 단편에 부착될 수 있는 중합체 분자이다.
일반적으로, 중합체 분자는 합성될 수 있거나 또는 천연적으로 존재하는 중합체일 수 있으며, 예를 들면 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌, 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지형 또는 비분지형의 다당류(예를 들면, 호모- 또는 헤테로- 다당류)일 수 있다.
상기 합성 중합체들에 존재가능한 특정의 임의적 치환기들은 하나 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시기들을 포함한다. 합성 중합체들의 특정 예로는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜)과 같은 임의로 치환된 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 이들의 유도체를 포함한다.
특히 천연적으로 존재하는 중합체들은 락토즈, 아밀로즈, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다. 여기에서 사용된 “유도체”란, 예를 들면 말레이미드 등과 같은 티올-선택적 반응성기들과 같은 반응성 유도체들을 포함하는 의미이다. 반응성기는 중합체에 직접적으로 연결되거나 또는 링커단편(linker segment)을 통해서 연결된다. 이러한 그룹의 잔기는 몇가지의 예들에서, 항체 단편과 중합체 사이의 연결기로서 생성물의 일부를 형성할 수 있다는 사실을 알아야 할 것이다.
중합체의 크기는 원하는 바에 따라서 달라질 수 있지만, 대개 평균분자량 500~50000Da, 바람직하게는 5000~40000Da, 더욱 바람직하게는 25000~40000Da 범위내이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 원하는 용도에 기초하여 선택될 수 있다.
특히 바람직한 중합체들은 폴리(에틸렌글리콜)과 같은 폴리알킬렌 중합체, 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체를 포함하고, 특히 약 25000~약 40000Da 범위내의 분자량을 지닌 것을 포함한다.
변형된 항체 단편에 부착된 각 중합체 분자는 단편내에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유결합될 수 있다. 공유결합은 대개 디설파이드 결합이거나 또는 특히 황-탄소 결합이다.
원하는 경우에는, 항체 단편은 이에 부착된 하나 이상의 다른 효과인자 또는 보고인자 분자들을 가질 수 있다. 상기 효과인자 또는 보고인자 분자들은 단편내에 위치한 어떤 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 터미널 아미노산 기능기(예를 들면, 유리 아미노, 이미노, 히드록실 또는 카복실기)를 통해서 항체 단편에 부착될 수 있다.
활성화된 중합체는 상기의 중합체-변형 항체 단편들의 제조시에 출발물질로서 사용가능하다. 활성화된 중합체는 α-할로카복실산, 또는 요오드아세트아미드, 이미드(예로써, 말레이미드)와 같은 에스테르, 비닐설폰 또는 디설파이드와 같은 티올 반응기를 포함하는 어떠한 중합체일 수 있다. 이러한 출발물질들은 시판(예를 들면, Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA)되는 것을 구입할 수 있고,또는 통상적인 화학적 방법을 사용하여 시판되는 출발물질들로부터 제조할 수 있다.
폴리(에틸렌글리콜)(PEG)부분을 부착하는 것에 관한 참고 문헌은 “Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, “Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC 및 "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York이 있다.
효과인자 또는 보고인자 분자가 연결된 항체 단편을 얻고자 하는 경우에, 상기 단편은 표준 화학적 또는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있으며, 여기서 항체 단편은 활성화된 중합체와의 반응전 또는 반응후에, 효과인자 또는 보고인자 분자에 직접 또는 커플링제를 통해서 적절하게 연결된다. 특정 화학적 방법은, 예를 들면, WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 및 WO 89/01476에 설명된 내용들을 포함한다. 또는, 효과인자 또는 보고인자 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우에는, 상기 연결은 예를 들면 WO 86/01533 및 EP-A-0392745에 설명된 재조합 DNA 방법을 사용하여 얻을 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 변형된 Fab 단편 또는 디-Fab는 EP-A-0948544 및 EP-A-1090037에 개시된 방법들에 따라 PEG화(즉, PEG(폴리(에틸렌글리콜)), 또는 mPEG(메톡시폴리(에틸렌글리콜))가 공유결합되어 있는 것)된다. 바람직하게는, 본 발명의 항체분자는 도6에 도시된 PEG화된 변형 Fab 단편 또는 PEG화된 디-(변형 Fab) 단편이다. 도6에 나타낸 바와 같이, 변형 Fab 단편은 변형 힌지부위내의 단일 티올기에 말레이미드기가 공유결합되어 있다. 리신 잔기는 말레이미드기에 공유결합된다. 리신 잔기내 아민기 각각에는 약 20,000Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착된다. 따라서, 전체 효과인자 분자의 총 분자량은 약 40,000Da이다. 유사하게, 각각의 mPEG는 EP-A-1090037에 설명된 바와 같은 비스-말레이미드 링커에 공유결합된 리신 잔기에 연결되어, 본 발명에 따른 PEG화된 디-(변형 Fab)를 형성할 수 있다.
바람직하게는, 도6에 나타낸 화합물에 있어서, 항체 부분의 중쇄는 SEQ ID NO:12로 나타낸 서열을, 경쇄는 SEQ ID NO:11로 나타낸 서열을 갖는다.
본 발명의 항체분자의 불변영역 도메인은, 만일에 존재한다면, 항체분자의 원하는 기능을 고려하여 선택될 수 있으며, 특히 효과인자 기능이 필요할 수 있다. 예를 들면, 불변영역 도메인은 인간의 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 인간의 IgG, 특히 IgG1과 IgG3 이형(Isotype)의 불변영역 도메인은, 항체분자를 치료목적으로 사용하고, 항체 효과인자 기능이 필요할 때 사용될 수 있다. 또는, IgG2와 IgG4 이형은 항체분자를 치료목적으로 하나, 항체효과인자 기능이 필요치 않을 때, 예를 들면, VEGF에 의한 KDR 결합을 단순히 차단하기 위해 사 용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항체분자에는 효과인자 또는 보고인자 분자가 부착될 수 있다. 예를 들면, 중금속 원자 또는 리신(ricin)과 같은 톡신(toxin)을 킬레이트화 하기 위하여, 공유 브릿징 구조(covalent bridging structure)에 의해 거대고리(macrocycle)가 부착될 수 있다. 또는, 재조합 DNA 기술 방법은 항체분자를 제조하는 데 사용될 수 있으며, 여기에서 Fc 단편(CH2, CH3 및 힌지 도메인), CH2 및 CH3 도메인 또는 전체 면역글로블린 분자의 CH3 도메인은 효소 또는 톡신 분자와 같은 기능성 비면역글로블린 단백질에 의해서 치환되거나, 또는 펩티드 결합에 의해 여기에 부착된다.
본 발명의 항체분자는 결합 친화도 0.4×10-10M을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 항체분자는 중쇄 가변영역 gH3(SEQ ID NO:15)과 경쇄 가변영역 gL3(SEQ ID NO:16)을 포함한다. 이들 경쇄와 중쇄의 가변성 영역의 서열은 도7에 나타나 있다.
또한, 본 발명은 KDR에 대하여 증가된 친화력을 가지는 본 발명의 항체분자의 변종(variant)에 관한 것이다. 이러한 변종들은 CDRs을 돌연변이법(Yang 등, J. Mol. Biol., 254, 392~403, 1995), 사슬 셔플링법(chain shuffling)(Marks 등, Bio/Technology, 10, 779~783, 1992), E. coli의 돌연변이 유발(mutator) 종 사용법(Low 등, J. Mol. Biol., 250, 359~368, 1996), DNA 셔플링법(Patten 등, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724~733, 1997), 파아지 발현법(phage display)(Thompson 등, J. Mol. Biol., 256, 77~88, 1996) 및 유성 PCR법(sexual PCR)(Crameri 등, Nature, 391, 288~291, 1998)을 포함하는 다수의 친화도 증진법에 의해 얻어질 수 있다. Vaughan 등(상기 참조)은 친화도 증진을 위한 상기 방법들을 설명하고 있다.
또한, 본 발명은 예를 들면, 여기의 도면들에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체분자의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열을 제공한다.
본 발명의 DNA 서열은 예를 들면, 화학 공정에 의해 제조된 합성 DNA, cDNA, 게놈 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열들을 포함하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터는 본 발명의 항체분자의 경쇄와 중쇄를 각각 인코딩하는 두개의 DNA 서열을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 E. coli 발현 벡터를 제공한다. 바람직하게는 발현벡터는 도8에서 개략적으로 도시된 pTTOD(CDP791)이다.
벡터 제조를 위한 일반적인 방법, 트랜스팩션법(transfection) 및 배양방법들은 당업자 들에게는 잘 알려져 있다. 이점에 관하여, 참고문헌은 "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York 및 the Maniatis Manual produced by Cold Sping Harbor Publishing이 있다.
본 발명의 항체분자를 인코딩하는 DNA 서열들은 당업자들에 잘 알려진 방법들에 의해 얻을 수 있다. 예를 들면, 항체의 중쇄와 경쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열들은 결정된 DNA 서열들로부터 또는 상응하는 아미노산 서열들을 기 초로 하여 원하는 대로 합성 가능하다. 수용체 구조형성 서열을 코딩하는 DNA는 당업자들에게 널리 이용가능하고, 이들의 공지된 아미노산 서열들을 기초로 하여 쉽게 합성할 수 있다.
분자생물학의 표준기술들은 본 발명의 항체분자를 코딩하는 DNA서열을 제조하는 데 사용될 수 있다. 원하는 DNA 서열들은 올리고뉴클레오티드 합성기술을 사용하여 전체 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 위치특이적 돌연변이유발법과 PCR(polymerase chain reaction) 기술은 적절히 사용될 수 있다.
어떠한 적합한 숙주 세포/벡터 시스템은 본 발명의 항체분자를 인코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 사용될 수 있다. E. coli와 같은 박테리아 및 다른 미생물 시스템이 Fab, 디-(변형 Fab) 및 F(ab')2 단편, 특히 Fv 단편, 및 단일쇄 Fvs과 같은 단일쇄 항체 단편과 같은 항체 단편의 발현을 위해 부분적으로 사용될 수 있다. 포유류와 같은 진핵 숙주세포 발현시스템이 완전한 항체분자를 포함하는 더 큰 항체분자들의 제조를 위하여 사용될 수 있다. 적당한 포유류 숙주세포들은 CHO, 골수종(myeloma) 또는 융합세포주(hybridoma)를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 항체분자를 인코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건하에서, 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하고, 그리고 항체분자의 분리를 포함하는 본 발명에 따르는 항체분자의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 항체분자의 제조방법은 DNA 서열로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건하에서 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 E. coli 발현 벡터를 함유하는 E. coli 배양과 항체분자의 분리를 포함한다. 항체분자는 세포로부터 분비되거나, 적당한 시그널 서열에 의해 주변세포질(periplasm)로 이동될 수 있다. 또는, 항체분자들은 세포의 세포질내에 축적될 수 있다. 바람직하게는, 항체분자는 주변세포질로 이동된다. 제조되는 항체분자 및 사용되는 방법에 따라, 항체분자를 리폴딩(refolding)시키고, 기능성 구조를 채택하는 것이 바람직하다. 항체분자의 리폴딩을 위한 방법들은 당업자들에게 잘 알려져 있다.
항체분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있으며, 이 경우 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 숙주세포를 트랜스펙션하는데 사용될 필요가 있다. 중쇄와 경쇄 양쪽 모두를 포함하는 생성물의 제조를 위하여, 세포주는 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 첫번째 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 두번째 벡터로 된 두개의 벡터로 트랜스펙션될 수 있다. 또는, 단일 벡터가 사용될 수 있는데, 이 벡터는 경쇄와 중쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 서열들을 포함한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 수용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 조합하여, 본 발명의 항체분자를 포함하는 치료 조성물 또는 진단 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약제학적으로 수용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체분자를 혼합하는 것을 포함하는 치료 또는 진단용 조성물의 제조방법을 제공한다.
항체분자는 치료 또는 진단용 조성물 내에서 유일한 활성성분이거나, 또는 예를 들면, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체와 같은 다른 항체성분들, 또는 크산틴과 같은 비항체 성분들을 포함하는 다른 활성성분들과 함께 사용 가능하다.
약제 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 것이 바람직하다. 여기에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 목표 질병 또는 질환을 치료, 개선 또는 예방하는 데 필요한 치료제의 양을 의미하고, 또는 감지할 수 있는 정도의 치료 또는 예방효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 뜻한다. 어떤 항체에 대하여, 치료적 유효 투여량은 세포배양 분석법 또는 보통 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류와 같은 동물 모델로 최초로 결정될 수 있다. 동물 모델은 또한 적절한 농도범위와 투여루트를 결정하는 데 사용될 수 있다. 이러한 정보는 인간의 투약을 위해 유용한 투여량 및 루트를 결정하는 데 사용될 수 있다.
인간환자를 위한 정밀한 유효량은 질병상태의 심각도, 환자의 일반적 건강 상태, 환자의 나이, 체중 및 성별, 식이요법, 투여시간, 투여빈도, 약제조성, 반응감도 및 치료에 대한 내성/반응에 따라 달라질 수 있다. 상기 양은 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있고, 임상의사의 판단의 범위 내에 있다. 일반적으로, 유효 투여량은 0.01~50mg/kg, 바람직하게는 0.1~20mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 15mg/kg이다.
조성물은 환자에게 개별적으로 투여되거나, 또는 다른 제제, 약제 또는 호르몬과 조합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항체분자가 투여되는 투여량은 치료될 질환의 성질, 중화될 VEGF의 수준의 정도가 원하는 수준 이상으로 올라갈 것인가에 따라, 그리고 항체분자가 질병 예방 차원에서 사용되는지 또는 현존하는 질환을 치료하기 위해 사용되는지에 따라 달라진다. 투여량은 또한 환자의 나이와 상태에 따 라 선택될 수 있다.
따라서, 예를 들면 류마티스성 관절염과 같은 만성 염증질환의 치료 또는 예방을 위해, 본 발명의 항체분자의 적당한 투여량은 0.5~50mg/kg, 더욱 바람직하게는 1~20mg/kg, 가장 바람직하게는 약 15mg/kg이다. 투여빈도는 항체분자의 반감기, 약 효과의 지속성에 따라 달라진다.
만약 항체분자가 짧은 반감기(예, 2~10시간)를 가지면, 하루당 1회 또는 그 이상의 투여량을 제공할 필요가 있다. 또는, 항체분자가 긴 반감기(예, 2~15일)를 가지면, 하루에 한번, 일주일에 한차례, 또는 매 1개월 또는 2개월당 한차례의 복용량을 제공할 필요가 있다.
또한, 약제 조성물은 항체의 투여를 위하여 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 담체는 그 자신이 조성물을 투여받는 개체에 유해한 항체의 생성을 유발해서는 않되고, 독성이 없어야만 한다. 적당한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포오좀, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 아미노산 중합체, 아미노산 공중합체 및 비활성 바이러스 입자들과 같은, 서서히 물질대사되는 거대분자 일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염들은, 예를 들면, 염화물, 브롬화물, 인산염 및 황산염과 같은 미네랄 산염들, 또는 아세트산, 프로피온산. 말론산 및 벤조산 같은 유기산의 염들이 사용될 수 있다.
치료 조성물내의 약제학적으로 허용가능한 담체는 부가적으로, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체들을 포함할 수 있다. 부가적으로, 습윤제, 유화제 또는 pH 완충물질과 같은 보조 물질들이 이런한 조성물 내에 존재할 수 있다. 상기 담체는 환자에 의한 약제 조성물 섭취를 위해, 정제, 환약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁제로서 제제화될 수 있다.
투여를 위한 바람직한 형태는, 예로써 주사(injection) 또는 주입(infusion)(예를 들면, 환괴(bolus) 주사 또는 연속적 주입)에 의한 비경구적 투약에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주입 또는 주사용일 경우에는, 오일 또는 수용성 부형제내의 현탁제, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 이는 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 처방제들을 포함할 수 있다. 또는, 항체분자는 무수형태일 수 있고, 사용전에 적절한 멸균액으로 재구성될 수 있다.
일단 제제화된 경우, 본 발명의 조성물은 환자에게 직접 투여될 수 있다. 치료받을 환자들은 동물일 수 있다. 그러나, 조성물은 인간 환자 투여를 위해 맞추는 것이 바람직하다.
본 발명의 약제 조성물은 제한은 없지만, 경구, 정맥, 근육내, 동맥내, 골수내, 척추강내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous)(예, WO 98/20734 참조), 피하, 복강내, 비강내, 장내, 국소, 혀밑, 질내 또는 직장 경로를 포함하는 어떤 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약제 조성물을 투여하는 데 하이포스프레이(hypospray)가 사용될 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 물질로서 제조될 수 있다. 또한, 주입전에 액체 부형제내용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태가 제조될 수 있다.
조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하주사, 복강내주사, 정맥내 주사, 근육내주사에 의해 이루어질 수 있거나, 또는 조직의 간질(interstitial) 공간으로 전달될 수도 있다. 또한, 조성물은 상처부위로 투여될 수 있다. 투여량 처리는 단일 복용 스케쥴 또는 다중 복용 스케쥴일 수 있다.
조성물내의 활성성분은 항체분자일 수 있다. 그 자체로, 위장관내에서 분해에 민감할 수 있다. 따라서, 조성물이 위장관을 사용하는 경로에 의해 투여되면, 조성물은, 분해로부터 항체를 보호하지만 일단 위장관으로부터 흡수된 항체를 방출시키는 제제를 함유할 필요가 있을 것이다.
약제학적으로 허용가능한 담체의 완벽한 논의는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, N.J, 1991)를 이용할 수 있다.
본 발명의 항체는 유전자 치료법의 사용에 의해 투여될 수 있다는 사실 또한 예견된다. 이를 위하여, 적절한 DNA 성분의 조절하에서 항체분자의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열들이 환자에게 도입되고, 그 결과 항체 사슬은 DNA 서열로부터 발현되고, 현장(in situ) 조립된다.
또한, 본 발명은 VEGF 및/또는 KDR이 관련된 질병을 치료하는데 사용하기 위하여 본 발명의 항체분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 VEGF 및/또는 KDR이 관련된 치료를 위한 약제의 제조에 본 발명에 따른 항체분자의 사용을 제공한다.
본 발명의 항체분자는 인간 또는 동물내 생물학적 활성이 있는 KDR의 수준을 감소시키기 위한 어떤 치료법에 사용될 수 있다. VEGF는 체내에서 순환할 수 있고, 또는 체내의 특정 부위에서 바람직하지 못한 고수준으로 존재할 수도 있다.
예를 들면. VEGF(및, 따라서 KDR)는 염증, 건선, 류마티스성 관절염, 및 종양생장 및 전이를 포함하는 다수의 병리학적 질환과 관련이 되어 있다.
또한, 본 발명은 VEGF 및/또는 KDR이 관련된 질환의 위험으로부터 고통받는 또는 위험에 있는 인간 또는 동물 환자들의 치료방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 항체분자의 유효량을 환자들에게 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 항체분자는 진단, 예를 들면, KDR의 증가된 수준과 관련된 질병상태의 생체내 진단 및 예견에 사용될 수 있다.
단일클론 항체 제조 및 선택
KDR의 리간드 VEGF와의 상호작용을 강력하게 차단하는 인간 KDR에 대한 항체를 선택하기 위한 인-하우스(in-house) 면역화 프로그램이 개시되었다. 마우스를 전장 인간 KDR로 트랜스팩션된 CHO 세포, 정제된 인간 KDR-인간 FC 융합 단백질 및 이 융합 단백질을 인코딩하는 DNA를 포함하는 다양한 면역원으로 면역화시켰다. 세포/단백질 면역원으로 면역화된 동물로부터의 총 19개의 융합체, 및 DNA로 면역화된 동물로부터의 4개의 융합체로부터, 인간 7-도메인 KDR-Fc에 대한 결합을 위해, 약 23,000 웰(wells)을 1차 ELISA법으로 스크리닝하였다. 그 다음, 약 800개의 항체들이 2차 스크리닝되었는데, 즉 방사면역분석법(radioimmunoassay)으로 인간 7-도메인 KDR-Fc에 대한 I125 표지 VEGF 결합의 차단을 측정하였다. 3차 스크리닝은 인간 제대정맥내피세포(HUVECs)로부터 방출되는 VEGF 유도의 조직인자(Tissue Factor)의 차단을 측정하였다. 이 스크리닝 캐스케이드(cascade)로부터, 항체 VR165가 선별되었다(데이타 미도시).
VR165 의 유전자 클로닝
VR165를 발현하는 하이브리도마 세포로부터 RNA를 추출하여, DNA로 역전사시켰다. 그 다음, 이 DNA를 일련의 PCR 반응을 위한 주형(template)으로 사용하여, V-영역 서열들을 증폭시켰다. 보존된 중쇄와 경쇄 시그널 서열내에 어닐링(annealing)하도록 디자인된 디제너레이트 프라이머(degenerate primer) 풀(pool)이 전방프라이머(forward primer)로 사용된 반면, 구조형성부위 4/C-영역 연결부위(junction)를 인코딩하는 프라이머는 역프라이머(reverse primer)로서 사용하였다. 이와 같이 하여, 중쇄와 경쇄 모두의 V-영역 유전자들이 증폭되었고, 이어서, 상기 유전자를 클로닝 및 서열분석하였다. 상기 DNA 서열들을 번역하여 VR165 V-영역 아미노산 서열을 얻고, 이는 N-터미널 서열분석에 의해 결정된 단백질 서열을 참조로 하여 확인되었다. 그 다음, 쥐 V-영역 유전자를 발현벡터 pMR10.1과 pGamma-4에 서브-클로닝(sub-cloning)시켰다. 이들 벡터는 인간 카파 경쇄와 감마-4 중쇄에 대한 불변영역 유전자를 인코딩하는 게놈 DNA를 포함하는, 각각 경쇄와 중쇄의 발현을 위한 별개의 벡터들이다. 상기 각 벡터들을 CHO 세포에 함께 트랜스펙션시켜, 키메릭(chimeric) VR165 항체를 생산하였다.
CDR -이식 서열의 디자인
VR165는 잠재성 있는 면역원성을 줄이고, E. coli 발현을 촉진시키기 위하여, 인간 구조형성부위로 CDR-이식되었다. 인간의 생식세포계 수용체 구조형성부위는 서브그룹 VHⅢ 및 VLI으로부터 선택되었다. 중쇄 수용체 구조형성부위는 인간의 생식세포계 서열 VH3-7이며, 이는 인간 JH-영역 생식세포계 JH4 유래의 구조형성부위 4를 갖는다. 경쇄 수용체 구조형성부위는 인간의 생식세포계 서열 A30이며, 이는 인간 JK-영역 생식세포계 JK1 유래의 구조형성부위 4를 갖는다. 서열대조 결과, 공여체와 수용체 중쇄들 사이에는 15개 구조형성부위 차이가 있음이 밝혀졌다. 이들 각각의 위치에서, 항원결합에 기여하는 잔기의 잠재성 분석을 수행하였다;만약 중요하다고 여겨지면, 쥐의 공여체 잔기가 보유된다. 경쇄 서열대조 결과, 공여체와 수용체 중쇄들 사이에는 24개 구조형성부위 차이가 있음이 밝혀졌다. 항원결합에 기여하는 쥐 잔기의 잠재성 분석을 다시 수행하였다. 이와 같이 하여, 3개의 VH이식형 및 3개의 VL 이식형(도9, SEQ ID NOS:17~22)이 디자인되었다. 각각의 경우에서, 이식형 1은 쥐 구조형성부위 잔기가 없는 이식형을 나타낸다. 또한, 이식형 2와 3은 도시된 위치에 쥐 구조형성부위 잔기를 포함한다. 또한, 이식형 gH3은 CDR-H2의 C-터미널 말단에 추가의 인간 잔기를 포함한다. CDR의 이 부분은 항원결합 표면에는 존재하지 않는다. 유전자들은 E. coli 유전자에 자주 사용되는 코돈을 사용하고, '드문(rare)' E. coli 코돈(Wada 등, Nucl. Acids Res., 19, 1981~86, 1991)을 피하여, 이식된 서열들을 인코딩하도록 디자인되었다. 유전자조작을 더 용이하게 하도록, 제한효소부위(restriction site)가 일정한 간격을 두고 DNA 서열내로 도입되었다. 도10은 gHl과 gLl에 대한 유전자(SEQ ID NO:23과 SEQ ID NO:24)의 디자인을 나타낸다. 유전자 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NOS:25~40)가 도11에 도시되어 있다.
이식 서열을 위한 유전자의 제조
CDR-이식 gHl과 gLl V-영역 유전자를 제조하기 위하여, PCR 어셈블리(assembly) 기술이 사용되었다. 100㎕의 반응액에는 10mM Tris-HCl pH 8.3, 1.5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.001% 젤라틴, 0.25mM 각각의 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, "내부(internal)" 프라이머(F2, F3, F4, R2, R3, R4) 각각 1pmole, "외부(external)" 프라이머(F1, R1) 각각 10pmole 및 1 유니트(unit)의 Taq 폴리머라제(AmpliTaq, Applied BioSystems, catalogue no, N808-0171)가 함유되어 있다. PCR 사이클 조건은 94℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30사이클 수행하였다. 그 다음, 반응 생성물을 1.5% 아가로즈겔(agarose gel) 상에서 전기영동, 절개 및 QIAGEN 스핀 컬럼(QIAquick gel 추출키트, cat no. 28706)을 사용하여 회수하였다. DNA를 30㎕의 부피로 용출하였다. 그 다음, gHl과 gLl DNA의 분액(aliquot)(1㎕)을 프로토콜에 따라 InVitrogen TOPO TA 클로닝 벡터 pCR2.1 TOPO(cat. no. K4500-01)에 클로닝하였다. 이 비발현벡터는 다수의 클론들의 서열분석을 용이하게 하기 위한 클로닝 중간체로서의 역할을 하는 것이다. 벡터 특이성 프라이머를 사용한 DNA 서열분석은 gH1과 gLl을 포함하는 플라즈미드 pCR2.1(gH1)과 pCR2.1(gL1)(도12 참조)을 갖는 원하는 클론을 동정하는데 사용되었다.
올리고뉴클레오티드 카세트 치환법(cassette replacement method)이 인간화된 이식 gH2와 gL2를 제조하는데 사용되었다. 도13은 올리고뉴클레오티드 카세트 (SEQ ID NO:41과 SEQ ID NO:43)의 디자인을 나타낸다. 각 변종을 제조하기 위하여, 벡터(pCR2.1(gH1) 또는 pCR2.1(gL1))를 도시(도13, 제한효소부위들은 언더라인함)된 제한효소로 절단하고, 큰 벡터 단편은 아가로즈로부터 겔정제하여, 올리고뉴클레오티드 카세트에 연결하는 데에 사용하였다. 도14는 카세트내에 사용된 올리고뉴클레오티드의 서열(SEQ ID NOS:45~46 및 SEQ ID NOS:49~50)을 나타낸다. 상기 올리고뉴클레오티드 쌍들은 12.5mM Tris-HCl pH7.5, 2.5mM MgCl2, 25mM NaCl, 0.25mM 디티오에리스리톨을 포함하는 200㎕의 부피내에서, 0.5pmoles/㎕의 농도로 함께 혼합하여 어닐링시키고, 95℃ 수조(waterbath)(500ml)에서 3분간 가열한 다음에, 실온까지 서서히 식혔다. 어닐링된 올리고뉴클레오티드 카세트는 물로 10배 희석한 후, 적절하게 절단된 벡터에 연결하였다. 그 결과 생기는 플라즈미드 pCR2.1(gH2)와 pCR 2.1(gL2)에 대한 올바른 서열을 확인하기 위하여, DNA 서열분석을 하였다.
변종 gH3와 gL3은 gH2와 gL2로부터 유사한 방식으로 제조하였다. 카세트와 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NO:42와 SEQ ID NO:44, SEQ ID NOS:47~48 및 SEQ ID NOS:51~52)는 도13과 14에 나타내었다. gL3의 제조는 pCR2.1 벡터의 골격(backbone)내 PvuI 부위의 존재 때문에 변형된 방법이 필요하였다. AatⅡ와 SfuI로 pCR2.1(gL2)을 절단하여, PvuI-AatⅡ 어닐링된 카세트 및 pCR2.1(gL2)로부터 제조된 225 염기쌍 SfuI-PvuI 단편이 연결되어 있는 벡터 분자를 제조하였다. 그 결과 생기는 플라즈미드 pCR2.1(gH3)과 pCR 2.1(gL3)에 대한 올바른 서열을 확인하기 위하여, DNA 서열분석을 하였다.
3개의 중쇄 이식형 각각을 HindⅢ-ApaⅠ 단편으로서 발현벡터 pGamma-4에 서브클로닝하였다. 3개의 경쇄 이식형 각각을 SfuⅠ-BsiWI 단편으로서 경쇄 발현벡터 pMR10.1에 서브클로닝하였다. 도15는 상기 발현벡터의 지도를 나타낸다. CHO 세포에 상기 벡터를 함께 트랜스펙션시키므로써 항체를 일시적으로 발현시켰다. 이식사슬과 키메릭 사슬 조합 모두를 발현시키고, 2중 키메릭 항체에 대해 비교하였다.
결합성은 KDR 결합 ELISA법, KDR에 대한 표지된 VEGF의 결합 저해 측정을 위한 방사면역분석법 및 KDR 결합 측정을 위한 BIAcore 분석법으로 측정하였다. 모든 이식된 형태들은 ELISA법과 방사면역분석법으로 잘 분석하였고, 키메릭형과 유사한 활성도를 나타냈다. BIAcore 분석법으로부터, 이식형 gL3gH3은 최적의 것(미도시)으로 선택하였고, 이것을 이하 g165로 나타낸다.
플라즈미드 pTTOD 의 제조
플라즈미드 pTTO-1은 다음과 같이 제조하였다.
(a) pTTQ9 폴리링커의 치환
플라즈미드 pTTQ9는 Amersham으로부터 구입하였다. 분액(2㎍)을 제한효소 SalⅠ와 EcoRⅠ로 절단하였고, 상기 절단 산물을 1% 아가로즈겔 상에서 전기영동하고, 큰 DNA 단편(4520 bp)을 정제하였다. 함께 어닐링시, OmpA 폴리링커 부위를 인코딩하는 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 상기 서열은 pTTQ9의 절단시 생성되는 SalⅠ와 EcoRⅠ 말단과 연결가능한 접착말단(cohesive end)을 갖는다. 상기 올리고뉴클레오티드 "카세트"를 pTTQ9 벡터에 클로닝시키므로써, SalⅠ 부위는 재생되지 않지만, EcoRⅠ부위는 유지된다. 상기 카세트는 OmpA 유전자의 샤인달가 노(Shine Dalgarno) 리보좀 결합부위가 선행된, E. coli 외막단백질 Omp-A의 시그널 서열의 처음 13개 아미노산을 인코딩한다. 또한, XbaⅠ, MunⅠ, StyⅠ및 SplⅠ에 대한 제한효소 부위가 존재한다. MunⅠ과 StyⅠ 부위가 OmpA 시그널 서열을 코딩하는 부위내에 존재하고, 이는 유전자의 삽입을 위한 5' 클로닝 부위로서 기능한다. 상기 카세트를 제작하는 2개의 올리고뉴클레오티드는 5pmoles/㎕의 농도로 함께 혼합하여 어닐링시키고, 95℃ 수조에서 3분간 가열한 다음에, 실온까지 서서히 식혔다. 상기 어닐링된 서열은 SalⅠ/EcoRⅠ로 절단한 pTTQ9에 연결하였다. 그 결과 생기는 플라즈미드 중간체 pTQOmp는 DNA 서열분석을 하여 확인하였다.
(b) 단편 제조와 연결
플라즈미드 pTTO-1은 플라즈미드 pACYC184 유래의 1개의 DNA 단편과 pTQOmp 유래의 2개의 단편을 연결시키므로써 제조하였다. 플라즈미드 pACYC184는 뉴잉글랜드 바이오랩스로부터 구입하였다. 분액(2㎍)을 제한효소 StyⅠ로 완전히 절단한 다음, 핵산분해효소(Mung Bean Nuclease)로 처리하였다; 상기 처리는 5' 말단 염기를 제거하므로써 이중가닥말단(blunt end)을 만든다. 페놀추출과 에탄올침전을 수행한 다음에, 상기 DNA는 제한효소 PvuⅡ로 처리하여 2348bp, 1081bp, 412bp 및 403bp의 단편을 생성시켰다. 이를 아가로즈겔 전기영동한 후, 2348bp 단편을 정제하였다. 상기 단편은 테트라사이클린 내성 마커와 p15A 복제기점(replication origin)을 인코딩한다. 그 다음, 상기 단편을 송아지 소장 알칼리 인산분해효소(calf intestinal alkaline phosphatase:CIAP)로 처리하여 5' 터미널 인산을 제거하여, 상기 분자의 자가-연결(self-ligation)을 막았다.
플라즈미드 pTQOmp 분액(2㎍)을 제한효소 SspⅠ과 EcoRⅠ으로 처리하여, 아가로즈겔 전기영동을 실시한 다음, 필요없는 2040bp 단편과 170bp 단편들로부터 2350bp 단편을 정제하였다; 상기 단편은 전사 종결부위(transcription terminator region)와 lacⅠq 유전자를 인코딩한다. pTQOmp의 또 다른 분액(2㎍)을 EcoRⅠ과 XmnⅠ으로 처리하여, 2289bp, 1670bp, 350bp 및 250bp의 단편들을 생성시켰다. tac프로모터, OmpA 시그널 서열 및 멀티클로닝 부위를 인코딩하는 350bp 단편을 겔정제하였다.
그 다음, 대략 동일몰량의 각 단편을 사용하여, 상기 3개의 단편들을 연결하여 플라즈미드 pTTO-1을 생성시켰다. 모든 클로닝 연결체는 DNA 서열분석으로 확인하였다.
(c) 플라즈미드 pTTOD 의 제조
플라즈미드 pTTOD는 pTTO-1을 PvuⅡ(3부위), EcoRⅤ(2부위) 및 ApaⅠ(1부위)에 대한 골격 제한효소부위의 제거에 의해 제조하였다. Fab' 코딩 전략을 단순화하기 위해 상기 변환을 수행한 것이다. 상기 변환을 수행함에 있어서, 비록 DNA 수준에서 "사일런트(silent)" 변환이 있지만, lacⅠq 유전자와 테트라사이클린 내성 유전자의 코딩 단백질 서열은 변경되지 않는다. PCR 전략이 사용되었으며, 여기에서 상기 제한효소 부위들을 제거시킨 "사일런트" 변환을 지닌 프라이머가 디자인되어, 선조(parant) 플라즈미드(pTTO-1)의 단면을 증폭시키는데 사용되었다. 플랭 킹(flanking) 제한효소 부위들(미변경)은 선조 플라즈미드내 서열들을 이들 변환 서열들로 치환시키는 데에 사용되었다. 이와 같은 다단계 공정에 의해, 플라즈미드 pTTOD가 제조되었다. 벡터 pTTO내에 존재하는 Fab' 유전자를 pTTOD로 이동시키는 것은 유전자들을 플랭킹하는 유일한 PstⅠ과 EcoRⅠ 부위들을 사용하여 이루어졌으며, 그 결과 pTTOD(Fab')를 생성하였다.
g165 V-영역 유전자의 E. coli Fab' 발현 플라즈미드 pTTOD 로의 삽입
g165 서열의 삽입을 위한 출발점은 관련성 없는 Fab'의 발현을 위한 3개의 벡터, 즉 pTTOD(Fab'IGS-1), pTTOD(Fab'IGS-2) 및 pTTOD(Fab'IGS-3)(예, 도16 참고)이었다. 이들은 단지 중쇄 유전자로부터 경쇄 유전자를 분리하는 유전자내부 서열(intergenic sequence), 즉 IGS만 상이하다. 이들 IGS 영역(SEQ ID NOS:53~55)은 도17에 도시되어 있다. g165 서열의 이들 벡터로의 클로닝은 2단계 공정으로 실시되었다. 첫번째 단계로, 경쇄가 EcoRⅤ-BsiWⅠ 단편(395bp)으로서 pCR2.1(gL3)로부터 절단되어, pTTOD(Fab'IGS-1), pTTOD(Fab'IGS-2) 및 pTTOD(Fab'IGS-3)의 EcoRⅤ-BsiWⅠ 처리로 생긴 큰 벡터 단편내로 삽입되었다. 그 결과, 클로닝 중간체 pTTOD(g165L IGS-1), pTTOD(g165L IGS-2) 및 pTTOD(g165L IGS-3)이 생겼다. 그 다음, 상기 클로닝 중간체를 PvuⅡ와 ApaⅠ으로 절단하고, 큰 벡터 단편을 정제하고, 여기에 pCR2.1(gH3) 유래의 435bp PvuⅡ-ApaⅠ 단편을 삽입시켰다. 그 결과, 3개의 Fab' 발현 플라즈미드인 pTTOD(g165 IGS-1), pTTOD(g165 IGS-2)와 pTTOD(g165 IGS-3)가 생겼다.
상기 플라즈미드로 숙주균주 W3110을 형질전환(transformation)시키고, 상기 3개 플라즈미드에 의한 Fab'의 발현은 진탕 및 발효에 의해 비교되었다. 도18은 IGS-2 변종의 우수한 성능을 명확히 나타내는 발효 비교의 결과들을 보여준다.
플라즈미드 pTTOD(g165 IGS-2)는 pTTOD(CDP791)로 다시 명명되었다. 이 구조의 플라즈미드 지도는 도8에 나타내었다. 도19는 상기 벡터내 Fab'의 코딩부위 및 몇몇 5' 및 3' 플랭킹 서열로 구성된 완전한 DNA 및 단백질 서열(SEQ ID NO:56)을 나타낸다.
CDR -이식, VR165 -베이스의 변형된 Fab 의 PEG 화
정제된 변형 Fab는 mPEG의 분지된 분자와 위치-특이적으로 연결(conjugation)된다. 이는 변형 Fab의 절단말단 힌지부위내 하나의 시스테인 잔기를 활성화시키고, 이어서 상술한 바와 같이 (mPEG)-리실 말레이미드와 반응시키므로써 이루어진다(A.P.Chapman 등, Nature Biotechnology 17, 780~783, 1999).
PEG화된 분자는 도6에 나타내었다. 또는 EP-A-1090037호에 설명된 바와 같이, 활성화된 Fab와 (mPEG)-리실 비스-말레이미드의 반응 결과, PEG화된 디-(변형 Fab)가 생기고, 이를 이하 DFM으로 칭한다.
비 PEG화된 단편 및 PEG화된 단편의 BIAcore 활성도
인간 Fc에 융합된 7 Ig-도메인 인간 KDR은 항-Fc로 코팅된 칩(chip)상에 고정시키고, CDR 이식 항체 g165 및 쥐 선조 항체 VR165의 여러 가지 단편들을 반응시켜 친화도 측정을 하였다. 하기의 표는 얻어진 결과들을 요약한 것이다. 이 분석 방식에는, 이종(divalent species)의 더 낮은 해리 속도(Kd)에 의해 나타나는 바와 같이 2가성(divalency)의 잇점이 있다. 이식 DFM의 친화도는 쥐의 IgG와 매우 유사하고, 약간의 친화도 감소를 보이는 DFM-PEG와 매우 유사하다. g165 DFM-PEG 분자의 KD는 약 4×10-11M이다.
표 1: 비PEG화된 단편 및 PEG화된 단편의 BIAcore 활성도
Figure 112007073885080-PAT00001
방사면역분석
KDR에 결합하는 VEGF를 차단하기 위한 단편들의 능력은 방사면역분석으로 측정되었다. 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate)에서 폴리클로날 항 Fc가 인간 Fc에 융합된 7 Ig-도메인 KDR을 고정시키는데 사용되었고, 항체 또는 단편을 첨가 후, I125에 의해 표지된 VEGF-165를 첨가시켰다. 상기 분석 결과는 도20에 나타내었다. 또한, 상기 분석에서도, Fab'에 대한 DFM의 우수한 차단 성능으로 나타나 는, 2가성의 잇점이 있다. DFM-PEG 구조체는 BIAcore 연구에서 알 수 있듯이, 비PEG화된 DFM과 비교했을 때, 약간의 활성도 감소를 보여준다.
세포를 기초로 한 분석
분자 g164 DFM-PEG는 또한 세포를 기초로 한 분석으로 활성도를 측정하였다. KDR에 의한 VEGF 자극을 차단하는 상기 분자의 능력은 인간 제대정맥내피세포에서 조직인자의 방출(Clauss 등, J. Biol. Chem., 271, 17629~17634, 1996 참조) 억제를 통해 알 수 있었다. 활성도는 또한 인간의 미소혈관내피세포에서 VEGF 매개의 Ca2+ 이동(Cunningham 등, Am. J. Physiol., 276, C176~181, 1999 참조)의 억제를 통해 알 수 있었다.
상술한 실시예들은 단지 예시를 위한 것이고, 다음의 청구항에 정의된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 다음의 실시예들에서 단지 예시를 위한 목적으로 더욱 설명된다:
도1은 VR165 마우스 단일클론 항체 유전자의 중쇄와 경쇄 V-영역의 CDR 서열(SEQ ID NOS 1~6)을 나타낸다.
도2는 마우스 단일클론 항체 VR165 VH와 VL 도메인의 단백질 서열(SEQ ID NO:7과 SEQ ID NO:8)을 나타낸다.
도3은 인간의 생식세포 수용체 구조형성부위로서 선택된 V-영역 단백질 서열을 나타낸다. VH3-7 GL은 인간의 생식세포계 VH 유전자(SEQ ID NO:9)이다. A30 GL은 인간의 VL 생식세포계 서열 A30 유전자(SEQ ID NO:10)를 의미한다. 각각의 경우에서, 구조형성부위 4의 생식세포계 서열은 각각 인간의 생식세포계 JH4와 JK1에 의하여 제공된다.
도4는 CDP791 Fab 경쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:11과 SEQ ID NO:13)을 나타낸다.
도5는 CDP791 Fab 중쇄의 아미노산 및 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:12와 SEQ ID NO:14)을 나타낸다.
도6은 시스테인 잔기를 통해 리실-말레이미드(lysyl-maleimide) 링커로 공유결합된 항체 VR165로부터 유래된 변형 Fab 단편의 구조를 보여주며, 여기에서 리실 잔기상의 각 아미노기는 n이 약 420인 메톡시 PEG 잔기에 공유부착된다.
도7은 최적화된 CDR-이식 VH와 VL 영역 유전자를 위한 단백질 서열(SEQ ID NO:15와 SEQ ID NO:16)을 나타낸다.
도8은 이식 gL3과 gH3간에 IGS-2 변종을 포함하는 최적화된 pTTOD(CDP791) 플라즈미드를 나타낸다.
도9는 디자인된 VH와 VL 이식의 단백질 서열(gHI-3과 gL1-3, SEQ ID NOS 17~22)을 나타낸다. 이식 gH1은 쥐(murine)의 구조형성부위 잔기들을 포함하지 않는다. 이식 gH2는 위치 77과 93(Kabat 넘버링)에 쥐의 잔기들을 포함한다. T와 S 모두는 인간의 생식세포계 서열의 위치 77에서 공통이며, 따라서 T의 함유는 인간의 잔기와도 여전히 일치하고 있다. Ⅴ의 위치 93은 VH/VL 간극에서 중요한 것으로 여겨진다. 위치 60과 62에서 인간유래 잔기의 함유는 CDR-H2의 C-터미널 부분으로의 변화를 의미한다. 이식 gL2는 위치 60, 66, 69, 70 및 71(Kabat 넘버링)에 쥐유래의 잔기를 함유한다. 이식 gL3은 위치 36과 44에 추가의 쥐유래의 잔기를 포함한다.
도10은 gH1과 gL1 이식형을 인코딩하는 유전자(SEQ ID NO:23과 SEQ ID NO:24)의 디자인을 나타낸다.
도11은 gL1과 gH1 이식형을 인코딩하는 유전자를 조립하기 위하여 사용되는 올리고뉴클레오티드(SEQ ID NOS:25~40)를 나타낸다.
도12는 각각 gH1과 gL1 이식형을 포함하는 플라즈미드 pCR2.1(gH1)과 pCR2.1(gL1)을 나타낸다.
도13은 이식형 gH2, gH3, gL2 및 gL3의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 카세트(SEQ ID NOS:41~44)를 나타낸다.
도14는 이식형 gH2, gH3, gL2 및 gL3의 제조에 사용되는 올리고뉴클레오티드 쌍(SEQ ID NOS:45~52)을 나타낸다.
도15는 플라즈미드 pGamma4와 pMR10.1을 나타내고, 여기에 VH와 VL 이식형이 각각 서브클론(subclone)되어, CHO 세포주내에서 발현될 수 있다.
도16은 E. coli Fab' 발현 플라즈미드 pTTOD를 나타내고, 이 경우에는 IGS-3 서열을 포함한다.
도17은 테스트된 3개의 IGS 부위의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NOS:53~55)을 나타낸다.
도18은 IGS 성능의 Fab' 발효 비교의 결과들을 나타낸다.
도19는 CDP791 Fab' 단편의 코딩 및 플랭킹(flanking) 서열(SEQ ID NO:56)을 나타낸다.
도20은 방사면역분석시험(radioimmunoassay) 결과들을 나타내고, 여기에서 항체 단편들은 KDR에 대한 VEGF 결합의 차단에 대해 테스트된다.
도21은 gH3-이식 VR165-유래의 단일클론 항체의 중쇄 전체의 아미노산 서열(SEQ ID NO:57)을 나타낸다.
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ccgccagcgt 60 aggcgatcgt gtgactatta cctgtc 86 <210> 27 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 27 caaaaaccgg gcaaagcccc caagcgcctc atctatgcga cgtccagcct ggatagcggt 60 gtgccatctc gtttcagtgg cagtggc 87 <210> 28 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 28 agatttcgcc acttactatt gtctgcaata tggcagcttc cctccgacct tcggtcaggg 60 cactaaagta gaaatcaaac gtacggcgtg c 91 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 29 gcacgccgta cgtttgattt c 21 <210> 30 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 30 gacaatagta agtggcgaaa tcttccggct ggagagacga aattgtgagg gtaaattcag 60 taccgctgcc actgccactg aaacgag 87 <210> 31 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 31 ggggctttgc ccggtttttg ctgataccag ttcaggctac ccgcgatgtc ctgactggca 60 cgacaggtaa tagtcacacg atc 83 <210> 32 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 32 gatatcacat ctggtacctg gaaacaagag caacaagaag ccaagaatct gagcaggggt 60 cctcatggtg gcggcttcga atcatcc 87 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 33 gaataaaagc ttgccgccac c 21 <210> 34 <211> 91 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 34 tccagtgtga ggtgcagctg gtcgagtctg gaggcgggct tgtccagcct ggagggagcc 60 tgcgtctctc ttgtgcagca agcggcttca c 91 <210> 35 <211> 90 <212> DNA <213> Oligonucleotide used for graft construction <400> 35 agtgggtggc aaccattacg tccggaggca gctatacata ctacccggac accgtcaagg 60 gccgtttcac catttcccgg gacaatgcaa 90 <210> 36 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for graft construction <400> 36 ctattactgt 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Oligonucleotide cassette for construction of gH2 <400> 41 tcccgggaca atgcaaagaa taccctttac ctccagatga actctctccg cgcagaggac 60 acagcagtct attactgtgt acggatcggc gaagacgcgt tg 102 <210> 42 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide cassette for construction of gH3 <400> 42 tccggaggca gctatacata ctacgtggac agcgtcaagg gccgtttcac catttcccgg 60 gac 63 <210> 43 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide cassette for construction of gL2 <400> 43 gcgacgtcca gcctggatag cggtgtgcca aaacgtttca gtggcagtcg cagcggttct 60 gactataccc tcacaatttc gtctctccag 90 <210> 44 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide cassette for construction of gL3 <400> 44 ggcgatcgtg tgactattac ctgtcgtgcc agtcaggaca tcgcgggtag cctgaactgg 60 ttgcagcaaa aaccgggcaa agccatcaag cgcctcatct atgcgacgtc c 111 <210> 45 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for cassette construction <400> 45 ccgggacaat gcaaagaata ccctttacct ccagatgaac tctctccgcg cagaggacac 60 agcagtctat tactgtgtac ggatcggcga aga 93 <210> 46 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for cassette construction <400> 46 cgcgtcttcg ccgatccgta cacagtaata gactgctgtg tcctctgcgc ggagagagtt 60 catctggagg taaagggtat tctttgcatt gtc 93 <210> 47 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for cassette construction <400> 47 ccggaggcag ctatacatac tacgtggaca gcgtcaaggg ccgtttcacc atttc 55 <210> 48 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for cassette construction <400> 48 ccgggaaatg gtgaaacggc ccttgacgct gtccacgtag tatgtatagc tgcct 55 <210> 49 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for cassette construction <400> 49 ccagcctgga tagcggtgtg ccaaaacgtt tcagtggcag tcgcagcggt tctgactata 60 ccctcacaat ttcgtctct 79 <210> 50 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for cassette construction <400> 50 ctggagagac gaaattgtga gggtatagtc agaaccgctg cgactgccac tgaaacgttt 60 tggcacaccg ctatccaggc tggacgt 87 <210> 51 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for cassette construction <400> 51 cgtgtgacta ttacctgtcg tgccagtcag gacatcgcgg gtagcctgaa ctggttgcag 60 caaaaaccgg gcaaagccat caagcgcctc atctatgcga cgt 103 <210> 52 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide used for cassette construction <400> 52 cgcatagatg aggcgcttga tggctttgcc cggtttttgc tgcaaccagt tcaggctacc 60 cgcgatgtcc tgactggcac gacaggtaat agtcacacga t 101 <210> 53 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS-1 sequence <400> 53 gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggagagtgt taatgaagaa gactgctata 60 gcaattg 67 <210> 54 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS-2 sequence <400> 54 gagctcacca gtaacaaaaa gttttaatag aggggagtgt taaaatgaag aagactgcta 60 tagcaattg 69 <210> 55 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IGS-3 sequence <400> 55 gagctcacca gtaacaaaaa gctttaatag aggagagtgt tgaggaggaa aaaaaaatga 60 agaaaactgc tatagcaatt g 81 <210> 56 <211> 2000 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Coding and flanking sequence of CDP791 Fab' <400> 56 aattctcatg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 60 gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 120 gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 180 caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatcggc tcgtataatg tgtggaattg 240 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gcgatgagct tggctgcagg tcgagttcta 300 gataacgagg cgtaaaaaat gaaaaagaca gctatcgcaa ttgcagtggc cttggctggt 360 ttcgctaccg tagcgcaagc tgatatccag atgacccaga gtccaagcag tctctccgcc 420 agcgtaggcg atcgtgtgac tattacctgt cgtgccagtc aggacatcgc gggtagcctg 480 aactggttgc agcaaaaacc gggcaaagcc atcaagcgcc tcatctatgc gacgtccagc 540 ctggatagcg gtgtgccaaa acgtttcagt ggcagtcgca gcggttctga ctataccctc 600 acaatttcgt ctctccagcc ggaagatttc gccacttact attgtctgca atatggcagc 660 ttccctccga ccttcggtca gggcactaaa gtagaaatca aacgtacggt agcggcccca 720 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 780 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 840 ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 900 agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 960 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctca ccagtaacaa aaagttttaa tagaggggag 1020 tgttaaaatg aagaagactg ctatagcaat tgcagtggcg ctagctggtt tcgccaccgt 1080 ggcgcaagct gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag 1140 cctgcgtctc tcttgtgcag caagcggctt caccttttcc tcttacggta tgtcctgggt 1200 gcggcaggca cctgggaagg gcctggagtg ggtggcaacc attacgtccg gaggcagcta 1260 tacatactac gtggacagcg tcaagggccg tttcaccatt tcccgggaca atgcaaagaa 1320 taccctttac ctccagatga actctctccg cgcagaggac acagcagtct attactgtgt 1380 acggatcggc gaagacgcgt tggactactg gggacagggg acccttgtga cagtctcctc 1440 tgcttctaca aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg 1500 gggcacagcg gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc 1560 gtggaactca ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc 1620 aggactctac tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac 1680 ctacatctgc aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtcgacaaga aagttgagcc 1740 caaatcttgt gacaaaactc acacatgcgc cgcgtgatga ggatccaagc ttgcggccgc 1800 gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 1860 taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctcgcgt aatagcgaag aggcccgcac 1920 cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga tgcggtattt 1980 tctccttacg catctgtgcg 2000 <210> 57 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein sequence of gH3-grafted heavy chain <400> 57 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Arg Ile Gly Glu Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 58 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:23 <400> 58 Met Lys Met Trp Leu Asn Trp Val Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 85 90 95 Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Gly Glu Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 <210> 59 <211> 129 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:24 <400> 59 Met Arg Thr Pro Ala Gln Ile Leu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Phe Pro 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Ala Gly Ser Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60 Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly 100 105 110 Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr <210> 60 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:41 <400> 60 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 1 5 10 15 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ile Gly Glu Asp 20 25 30 Ala Leu <210> 61 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:42 <400> 61 Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 1 5 10 15 Thr Ile Ser Arg Asp 20 <210> 62 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:43 <400> 62 Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser 1 5 10 15 Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 20 25 30 <210> 63 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:44 <400> 63 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ala Gly 1 5 10 15 Ser Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Arg Leu 20 25 30 Ile Tyr Ala Thr Ser 35 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:53 <400> 64 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 10 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:53 <400> 65 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile 1 5 <210> 66 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:54 <400> 66 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 10 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:54 <400> 67 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile 1 5 <210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:55 <400> 68 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5 10 <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:55 <400> 69 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile 1 5 <210> 70 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:56 <400> 70 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 20 25 30 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 35 40 45 Asp Ile Ala Gly Ser Leu Asn Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 50 55 60 Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Asp Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr 100 105 110 Gly Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 71 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence encoded by SEQ ID NO:56 <400> 71 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 20 25 30 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 35 40 45 Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys 50 55 60 Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 85 90 95 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ile Gly Glu Asp Ala Leu Asp Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 245

Claims (41)

  1. 가변영역이 CDRH1에 대하여 SEQ ID NO:1의 서열, CDRH2에 대하여 SEQ ID NO:2의 서열 및 CDRH3에 대하여 SEQ ID NO:3의 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  2. 가변영역이 CDRL1에 대하여 SEQ ID NO:4의 서열, CDRL2에 대하여 SEQ ID NO:5의 서열 및 CDRL3에 대하여 SEQ ID NO:6의 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 항체분자는 가변영역이 CDRH1에 대하여 SEQ ID NO:1의 서열, CDRH2에 대하여 SEQ ID NO:2의 서열 및 CDRH3에 대하여 SEQ ID NO:3의 서열을 갖는 CDR을 포함하는 중쇄, 및 가변영역이 CDRL1에 대하여 SEQ ID NO:4의 서열, CDRL2에 대하여 SEQ ID NO:5의 서열 및 CDRL3에 대하여 SEQ ID NO:6의 서열을 갖는 CDR을 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 항체분자는 CDRH1에 대하여 SEQ ID NO:1의 서열, CDRH2에 대하여 SEQ ID NO:2의 서열 및 CDRH3에 대하여 SEQ ID NO:3의 서열, 및 CDRL1에 대하여 SEQ ID NO:4의 서열, CDRL2에 대하여 SEQ ID NO:5의 서열 및 CDRL3 에 대하여 SEQ ID NO:6의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체분자는 CDR 이식 항체분자인 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 가변영역은 인간 수용체 구조형성부위와 비인간 공여체 CDRs을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 중쇄의 가변영역의 인간 수용체 구조형성부위가 인간 생식세포 그룹 3 구조형성부위 서열에 기초하고, 위치 77과 93에 비인간 공여체 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 경쇄의 가변영역의 인간 수용체 구조형성부위가 인간 생식세포 그룹 1 구조형성부위 서열에 기초하고, 위치 36, 44, 60, 66, 69, 70 및 71에 비인간 공여체 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체분자는 SEQ ID NO:15의 중쇄 가변영역 gH3, 및 SEQ ID NO:16의 경쇄 가변영역 gL3을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체분자는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 항체분자는 SEQ ID NO:11의 서열을 갖는 경쇄, 및 SEQ ID NO:12의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  12. 제 1항 내지 제 9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체분자는 효과인자 또는 보고인자 분자의 결합을 가능케 하는 하나 이상의 아미노산을 중쇄의 C-터미널 말단에 갖는 변형 Fab 단편인 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 추가된 아미노산들이 효과인자 또는 보고인자 분자가 결합될 수 있는 하나 또는 두개의 시스테인 잔기를 포함하는 변형 힌지부위를 형성하는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 항체분자는 SEQ ID NO:11의 서열을 갖는 경쇄, 및 SEQ ID NO:12의 서열을 갖는 중쇄를 포함하는 변형 Fab 또는 디-Fab 단편인 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  15. SEQ ID NO:11의 서열을 포함하는 경쇄를 갖는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  16. SEQ ID NO:57의 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  17. SEQ ID NO:12의 서열을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO:57의 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  18. KDR에 대해 향상된 친화력을 갖는 것을 특징으로 하는, 제 1항 내지 제 17항 중의 어느 한 항에 따른 항체분자의 변종.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 항체분자의 변종은 친화도 증진 프로토콜에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 항체분자의 변종.
  20. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체분자는 쥐의 항-KDR 단일클론 항체 VR165인 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  21. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 항체분자는 제 20항의 단일클론 항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역들을 포함하는 키메릭 항체분자인 것을 특징으로 하는, 인간 KDR에 대해 특이성을 갖는 항체분자.
  22. 중쇄의 C-터미널 말단에 또는 이 말단쪽으로 존재하는 아미노산에 효과인자 또는 보고인자 분자가 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 제 10항 내지 제 14항 중의 어느 한 항에 따른 항체분자를 포함하는 화합물.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 화합물은 효과인자 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 효과인자 분자는 하나 이상의 중합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체는 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄의 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지형 또는 미분지형 다당류인 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 하나 이상의 중합체는 메톡시폴리(에틸렌글리콜)인 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 중쇄의 C-터미널 말단에 있는 시스테인 잔기들 중의 하나에 리실-말레이미드 또는 리실 비스-말레이미드기가 결합되어 있고, 상기 리실 잔기의 각 아미노기에는 약 20,000Da의 분자량을 갖는 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기가 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 제 12항에 따른 항체분자를 포함하는 화합물.
  28. 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 따른 항체분자의 중쇄 및/또는 경쇄를 인코딩하는 DNA 서열.
  29. 제 27항에 따른 DNA 서열을 포함하는 클로닝벡터 또는 발현벡터.
  30. 제 27항에 따른 DNA 서열을 포함하는 E. coli 발현벡터.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 벡터는 pTTOD(CDP791)인 것을 특징으로 하는 E. coli 발현벡터.
  32. 제 29항 내지 제 31항 중의 어느 한 항에 따른 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  33. 제 32항에 따른 숙주세포를 배양하고, 항체분자를 분리하는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 따른 항체분자의 제조방법.
  34. 제 29항 내지 제 31항 중의 어느 한 항에 따른 DNA 서열을 포함하는 E. coli 발현벡터를 포함하는 E. coli 를 배양하고, 항체분자를 분리하는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 따른 항체분자의 제조방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 항체분자를 주변세포질로 이동시키는 것을 특징으로 하는 항체분자의 제조방법.
  36. 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 따른 항체분자 또는 제 23항 내지 제 27항 중의 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 또는 진단 조성물.
  37. VEGF 및/또는 KDR이 관련된 질병의 치료에 사용하기 위한, 인간 KDR에 대하여 특이성을 갖는 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 따른 항체분자, 또는 제 23항 내지 제 27항 중의 어느 한 항에 따른 화합물.
  38. 제 37항에 있어서, 염증, 건선, 류마티스성 관절염, 및 종양생장 또는 전이 치료에 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는 항체분자 또는 화합물.
  39. VEGF 및/또는 KDR이 관련된 질병의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인간 KDR에 대하여 특이성을 갖는 제 1항 내지 제 21항 중의 어느 한 항에 따른 항체분자, 또는 제 23항 내지 제 27항 중의 어느 한 항에 따른 화합물의 사용.
  40. 제 39항에 있어서. 상기 질병은 염증, 건선, 류마티스성 관절염, 및 종양생장 또는 전이인 것을 특징으로 하는 항체분자 또는 화합물의 사용.
  41. 도8에 나타낸 바의 벡터 pTTOD(CDP791).
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