JP2009108086A - 生物学的製品 - Google Patents
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Abstract
【課題】ヒトKDRに対する特異性を有するマウスモノクローナル抗体から得られる少なくとも1つのCDRを含有する抗体分子を提供する。
【解決手段】少なくとも1つのCDRはハイブリッドCDRである、CDR移植抗体。および、抗体分子の鎖をコードするDNA配列、ベクター、形質転換宿主細胞、およびVEGFおよび/またはKDRが関与している疾患の治療における抗体分子の使用。
【選択図】なし
【解決手段】少なくとも1つのCDRはハイブリッドCDRである、CDR移植抗体。および、抗体分子の鎖をコードするDNA配列、ベクター、形質転換宿主細胞、およびVEGFおよび/またはKDRが関与している疾患の治療における抗体分子の使用。
【選択図】なし
Description
(発明の分野)
本発明は、ヒトキナーゼ挿入ドメイン含有受容体(KDR)の抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子に関する。この抗体分子は、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)より大きな親和力でKDRに結合し、VEGFとKDRとの相互作用を妨害する。本発明はまた、抗体分子の治療的使用と抗体分子の産生方法に関する。
本発明は、ヒトキナーゼ挿入ドメイン含有受容体(KDR)の抗原決定基に対する特異性を有する抗体分子に関する。この抗体分子は、ヒト血管内皮増殖因子(VEGF)より大きな親和力でKDRに結合し、VEGFとKDRとの相互作用を妨害する。本発明はまた、抗体分子の治療的使用と抗体分子の産生方法に関する。
本発明は、抗体分子に関する。抗体分子には、2つの重鎖と2つの軽鎖がある。各重鎖と各軽鎖はそのN末端に可変ドメインを有する。各可変ドメインは、3つの相補性決定領域(CDR)と、これと交互に位置する4つのフレームワーク領域(FR)とからなる。CDRは、抗体の抗原結合特異性を決定し、可変ドメインのフレームワーク領域上に存在する比較的短いペプチド配列である。可変ドメイン中の残基は従来、カバト(Kabat)らが考案したシステムに従って番号付けがされている。このシステムは、カバト(Kabat)ら、1987、「免疫学的興味のあるタンパク質の配列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)」、米国健康福祉省(Department of Health and Human Services)、NIH、アメリカ合衆国(以後、「カバト(Kabat)ら(前述)」)に記載されている。特に明記しない場合は、本明細書においてこの番号付けシステムが使用される。
カバト(Kabat)による残基の指定は、必ずしもアミノ酸残基の線状の番号付けと直接的に一致しない。実際の線状のアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造であるフレームワーク又はCDR何れかの、短縮、またはそれら構造要素への挿入に対応して、厳密なカバト(Kabat)番号付けより、少ないかまたは多いアミノ酸を含む。残基の正しいカバト(Kabat)による番号付けは、ある抗体について、その抗体の配列中の相同性を「標準」カバト(Kabat)番号配列と残基について照合することにより決定される。
重鎖可変ドメインのCDRは、カバト(Kabat)の番号付けによると、残基31〜35(CDRH1)、残基50〜65(CDRH2)および残基95〜102(CDRH3)に位置する。
軽鎖可変ドメインのCDRは、カバト(Kabat)の番号付けによると、残基24〜34(CDRL1)、残基50〜56(CDRL2)および残基89〜97(CDRL3)に位置する。
軽鎖可変ドメインのCDRは、カバト(Kabat)の番号付けによると、残基24〜34(CDRL1)、残基50〜56(CDRL2)および残基89〜97(CDRL3)に位置する。
CDR移植抗体の構築は、ヨーロッパ特許出願EP−A−0239400号に記載されており、これは、長いオリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異の誘発により、マウスモノクローナル抗体(Mab)のCDRを、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインのフレームワーク領域に移植する方法を開示している。
CDR移植によるヒト化Mabについての初期の研究は、合成抗原(例えばNP)を認識するMabについて行われた。しかし、リゾチームを認識するマウスMabとヒトT細胞上の抗原を認識するラットMabがCDR移植によりヒト化された例が、それぞれベルホーエン(Verhoeyen)ら(Science,239、1534−1536、1998)とリーチマン(Riechmann)ら(Nature,332,323−324)に記載されている。
リーチマン(Riechmann)らは、CDR単独の移転(カバト(Kabat)(カバト(Kabat)らについては前述した)とウー(Wu)ら、J.Exp.Med,132,211−250,1970)により記載されている)は、CDR移植産物に充分な抗原結合活性を与えるのに充分ではないことを見いだした。ドナーのフレームワーク領域の残基と一致するように、多くのフレームワーク残基を変更しなければならないことが見いだされた。改変する必要があるフレームワーク残基を選択するための提唱された基準は、国際特許出願WO90/07861号に記載されている。
ボーハン(Vaughan)ら(Nature Biotechnology,16,535−539,1998)を含む、CDR移植抗体を考察する多くの論評が公表されている。
ボーハン(Vaughan)ら(Nature Biotechnology,16,535−539,1998)を含む、CDR移植抗体を考察する多くの論評が公表されている。
VEGFは、PDGFとの構造類似性を有する2つの23kDサブユニットのホモダイマー糖タンパク質である。これは、脈管形成(新しい血管系の確立)において重要な発展的役割を有し、血管形成(既存の血管からの新しい血管の形成)に関与している。血管形成は、既存の血管からの毛細管内皮細胞の増殖、移行、および組織浸潤を伴なう。正常な生理学的プロセス、例えば胚成長、濾胞増殖(黄体形成を含む)および創傷治癒、において重要な役割を果たす以外に、血管形成は、炎症、乾癬、リウマチ様関節炎および腫瘍増殖と転移を含む多くの病状で生じる(フォークマン(Folkman,J)とクラグスブルン(Klagsbrun,M.)、Science,235:442−447,1987)。例えば、腫瘍は、血管形成を介してあてられる血液の供給がなければ、あるサイズ以上に増殖できないと広く考えられている。
VEGFは、内皮細胞に特異的な血管形成のインデューサーである点で、インビボの血管形成の可能なレギュレーターとされている他の因子とは異なる。
mRNAの選択的スプライシングから生じる、VEGFの5つの異なるモノマーアイソフォームが存在する。このアイソフォームには、2つの膜結合型(VEGF206 とVEGF189)および3つの可溶性型(VEGF165、VEGF121、およびVEGF145)がある。ヒト胎盤を除くすべての組織で、VEGF165 が最も豊富に存在するアイソフォームである。
mRNAの選択的スプライシングから生じる、VEGFの5つの異なるモノマーアイソフォームが存在する。このアイソフォームには、2つの膜結合型(VEGF206 とVEGF189)および3つの可溶性型(VEGF165、VEGF121、およびVEGF145)がある。ヒト胎盤を除くすべての組織で、VEGF165 が最も豊富に存在するアイソフォームである。
VEGFの作用は、2つの高親和性チミジンキナーゼ受容体である、fms様チミジンキナーゼ受容体(FLT−1またはVEGFR−1、シブヤ(Shibuya M.)ら、Oncogene,5,519−524,1990)とKDR(またはVEGFR−2、ターモン(Terman)ら、Oncogene,6,1677−1683,1991)との相互作用により媒介される。KDRとFLT−1の両方は、膜の両側にまたがる受容体であり、それぞれ細胞外リガンド結合領域に7つの免疫グロブリン様ドメイン、細胞内チロシンキナーゼドメイン、および膜貫通ドメインを含有する。膜貫通ドメインは、受容体をそれが発現される細胞の細胞膜に受容体を固定する役割を担う。
RNAレベルとタンパク質レベルの両方で、腫瘍内のVEGFとその受容体が過剰発現されているという報告がいくつかある(ドボラク(Dvorak)ら、Curr.Top.Microbiol.Immunol,237,97,1999)。VEGFの発現は低酸素に応答してアップレギュレートされるが、これはしばしば腫瘍内で起き、リガンド濃度の上昇は、その受容体の発現を誘導する。ヒト腫瘍中のKDR発現の上昇を示す研究例として、乳癌(ブラウン(Brown)ら、Hum.Pathol.,26,86,1995);結腸癌(タカハシ(Takahashi)ら、Cancer Res.,55,3964,1995);腎癌(タカハシ(Takahashi)ら、BBRC 257,855,1999)および消化管の腺癌(ブラウン(Brown)ら、Cancer Res.,53,4727、1993)がある。KDRに結合したVEGFを特異的に認識する抗体を使用するより最近の研究では、非小細胞肺癌におけるVEGF/KDR血管形成経路のアップレギュレーションが観察された(コウコウラキス(Koukourakis)ら、Cancer Res.,60,3088,2000)。
多くの実験的証拠が、インビボでVEGF活性と腫瘍血管形成とが因果関係を有することを証明している。キム(Kim)らは、抗VEGF中和Mabを担癌ヌードマウスに注入することで、腫瘍増殖が抑制されることを証明した(Nature 362,841,1993)。優性陰性マウスKDR(FLK−1)のレトロウイルスでの発現もまた、マウスにおいて腫瘍増殖を阻害した(ミラウア(Millauer)ら、Nature 367,576,1993)。同様に、VEGFアンチセンス(チェング(Cheng)ら、PNAS,93,8502,1996)、抗FLT−1抗体(ウィッテ(Witte)ら、Cancer Metast.Rev.,17,155,1998)、および可溶性FLT−1の発現(ゴールドマン(Goldman)ら、PNAS,95,8795,1998)のすべてが、マウスモデルで腫瘍増殖を阻害した。
いくつかの実験的証拠が、血管形成に関するVEGFの生物学的作用が主にKDR受容体により仲介されることを示唆している(総説については、ラリビー(Larrivee)とカーサン(Karsan)、Int.J.Mol.Med.,5,447,2000を参照)。
(1つのVEGFR型のみを発現する細胞株で)KDR単独のVEGF媒介活性化が、細胞増殖と移動を引き起こすのに充分であることが証明された(ワルテンバーガー(Waltenburger)ら、J.Biol.Chem.,269,26988,1994)。逆にFLT−1単独を活性化すると、細胞増殖は見られず、相反して細胞移動が観察された。
(1つのVEGFR型のみを発現する細胞株で)KDR単独のVEGF媒介活性化が、細胞増殖と移動を引き起こすのに充分であることが証明された(ワルテンバーガー(Waltenburger)ら、J.Biol.Chem.,269,26988,1994)。逆にFLT−1単独を活性化すると、細胞増殖は見られず、相反して細胞移動が観察された。
受容体選択的なVEGF変異体を利用する実験により、KDR連結反応が分裂促進因子活性化プロテインキナーゼ(MAPK)を活性化し、増殖、移動および血管透過性を引き起こすことが証明された(ケイト(Keyt)ら、J.Biol.Chem.,271,5638,1996)。FLT−1選択的な変異体は、これらの測定法で不活性化であった。
KDRとの相互作用をブロックするがFLT−1との相互作用はブロックしない抗VEGF Mabは、VEGF誘導性の血管透過性を阻害できたが、非ブロック性抗VEGF抗体は効果がなかった(ブレッケン(Brekken)ら、Cancer Res.,60,5117,2000)。
KDRとの相互作用をブロックするがFLT−1との相互作用はブロックしない抗VEGF Mabは、VEGF誘導性の血管透過性を阻害できたが、非ブロック性抗VEGF抗体は効果がなかった(ブレッケン(Brekken)ら、Cancer Res.,60,5117,2000)。
ハイブリドーマ技術によるマウスVEGF受容体であるFLK−1に対するMabの産生が記載されている(WO94/11499号)。これらは、VEGFと受容体との相互作用をブロックすることにより、FLK−1受容体活性化が阻害されることを証明した。受容体活性化のこの阻害は、いくつかのモデルでVEGF誘導性血管形成を阻害するのに有効であった。さらにこの抗FLK−1抗体は、いくつかのマウス異種移植片腫瘍を治療するのに有効であった。しかし、FLK−1に結合するすべての抗体が、治療的効果に充分な親和力でKDRに結合することはないであろう。
VEGF−KDR結合はまた、PI3−キナーゼ−Aktキナーゼシグナル伝達経路のKDRの媒介による活性化を介して新たに形成された血管のアポトーシスを阻害する(Aktキナーゼは、細胞の生存に関与するPI3−キナーゼ経路の公知の下流のキナーゼである、ガーバー(Gerber)ら、J.Biol.Chem.,273,30336,1998)。動物モデルもまた、VEGF−KDR相互作用をブロックすることが、この抗アポトーシス応答を阻止する上で有効であることを証明した。
現在、KDRはVEGFの作用を媒介する最も重要な受容体であると考えられており、血管形成の促進と新血管の生存におけるその役割が一般的に認識されているようである。
現在、KDRはVEGFの作用を媒介する最も重要な受容体であると考えられており、血管形成の促進と新血管の生存におけるその役割が一般的に認識されているようである。
従って、KDRに結合しVEGFによるその活性化をブロックすることができる抗体は、VEGFおよび/またはKDRが関与していると考えられている病態の治療において、治療的価値があるであろう。例えば、炎症、乾癬、リウマチ様関節炎、および腫瘍増殖の症例である。また、このような治療効果を達成するには、KDR受容体との相互作用をブロックすることが最善であるとの強い主張がなされている。繰り返し使用でき、容易かつ効率的に産生できるそのような抗体分子に対するニーズがある。また、KDRに対して高親和性を有し、ヒトにおける免疫原性が低い抗体分子に対するニーズがある。
第1の態様において本発明は、可変ドメインが、CDRH1として図1のH1に示す配列(配列番号1)、CDRH2として図1のH2に示す配列(配列番号2)、またはCDRH3として図1のH3に示す配列(配列番号3)を有するCDR(カバト(Kabat)ら(前述)により規定されたもの)を含有する重鎖を含む、KDRに特異性を有する抗体分子を提供する。
本発明の第1の態様の抗体分子は、重鎖可変ドメインにH1、H2およびH3(配列番号1〜配列番号3)から選択される少なくとも1つのCDRを含有する。好ましくはこの抗体分子は、重鎖可変ドメインに少なくとも2つの、さらに好ましくは3つすべてのCDRを含有する。
本発明の第1の態様の抗体分子は、重鎖可変ドメインにH1、H2およびH3(配列番号1〜配列番号3)から選択される少なくとも1つのCDRを含有する。好ましくはこの抗体分子は、重鎖可変ドメインに少なくとも2つの、さらに好ましくは3つすべてのCDRを含有する。
本発明の第2の態様において本発明は、可変ドメインが、CDRL1として図1のL1に示す配列(配列番号4)、CDRL2として図1のL2に示す配列(配列番号5)、またはCDRL3として図1のL3に示す配列(配列番号6)を有するCDR(カバト(Kabat)ら(前述)により規定されたもの)を含有する軽鎖を含む、ヒトKDRに特異性を有する抗体分子を提供する。
本発明の第2の態様の抗体分子は、軽鎖可変ドメインにL1、L2およびL3(配列番号4〜配列番号6)から選択される少なくとも1つのCDRを含有する。好ましくはこの抗体分子は、軽鎖可変ドメインに少なくとも2つの、さらに好ましくは3つすべてのCDRを含有する。
本発明の第2の態様の抗体分子は、軽鎖可変ドメインにL1、L2およびL3(配列番号4〜配列番号6)から選択される少なくとも1つのCDRを含有する。好ましくはこの抗体分子は、軽鎖可変ドメインに少なくとも2つの、さらに好ましくは3つすべてのCDRを含有する。
本発明の第1の態様と第2の態様の抗体分子は、好ましくはそれぞれ相補的軽鎖または相補的重鎖を有する。
好ましくは本発明の第1の態様と第2の態様の抗体分子は、可変ドメインが、CDRH1として図1のH1に示す配列(配列番号1)、CDRH2として図1のH2に示す配列(配列番号2)、またはCDRH3として図1のH3に示す配列(配列番号3)を有するCDR(カバト(Kabat)ら(前述)により規定されたもの)を含有する重鎖と、可変ドメインが、CDRL1として図1のL1に示す配列(配列番号4)、CDRL2として図1のL2に示す配列(配列番号5)、またはCDRL3として図1のL3に示す配列(配列番号6)を有するCDR(カバト(Kabat)ら(前述)により規定されたもの)を含有する軽鎖とを、含む。
好ましくは本発明の第1の態様と第2の態様の抗体分子は、可変ドメインが、CDRH1として図1のH1に示す配列(配列番号1)、CDRH2として図1のH2に示す配列(配列番号2)、またはCDRH3として図1のH3に示す配列(配列番号3)を有するCDR(カバト(Kabat)ら(前述)により規定されたもの)を含有する重鎖と、可変ドメインが、CDRL1として図1のL1に示す配列(配列番号4)、CDRL2として図1のL2に示す配列(配列番号5)、またはCDRL3として図1のL3に示す配列(配列番号6)を有するCDR(カバト(Kabat)ら(前述)により規定されたもの)を含有する軽鎖とを、含む。
上記の配列番号1〜6(図1)に示すCDRは、マウスモノクローナル抗体VR165から得られる。本発明はまた、マウスモノクローナル抗体VR165を提供する。VR165抗体の可変ドメインの配列を、図2に示す(配列番号7と8)。VR165の軽鎖定常領域はカッパであり、重鎖定常領域はIgG2aである。このマウス抗体を、以後「ドナー抗体」と呼ぶ。
第2の別の好適な実施態様において、本発明の第1および第2の態様の抗体は、キメラマウス/ヒト抗体分子であり、以後キメラVR165抗体分子と呼ぶ。キメラVR165抗体分子は、マウスMab VR165の可変ドメイン(配列番号7と8)およびヒト定常ドメインを含む。好ましくはキメラVR165抗体分子は、軽鎖中にヒトCカッパドメイン(ヒーター(Hieter)ら、Cell,22,197−207,1980;ジーンバンク(GeneBank)受け入れ番号J00241)、および重鎖中にヒトガンマ4ドメイン(フラナガン(Flanagan)ら、Nature,300,709−713,1982)を含む。
第3の別の好適な実施態様において、本発明の第1および第2の態様の抗体は、CDR移植抗体分子である。本明細書において「CDR移植抗体分子」という用語は、重鎖および/または軽鎖が、アクセプター抗体(例えば、ヒト抗体)の重鎖および/または軽鎖可変領域フレームワーク中に移植されたドナー抗体(例えば、マウスMab)からなる1つ以上のCDRを含有する抗体分子を意味する。
そのようなCDR移植抗体は、好ましくは上記のヒトアクセプターフレームワーク領域ならびに1つ以上のドナーCDRを有する可変ドメインを含有する。
そのようなCDR移植抗体は、好ましくは上記のヒトアクセプターフレームワーク領域ならびに1つ以上のドナーCDRを有する可変ドメインを含有する。
CDRを移植する際、CDRを得るドナー抗体のクラス/タイプを考慮して適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を使用すればよく、このようなフレームワーク配列としては、マウス、霊長類およびヒトのフレームワーク領域を含む。本発明で使用されるヒトフレームワークの例は、KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAYおよびPOMである(カバト(Kabat)ら(前述))。例えば、KOLとNEWMは重鎖のために使用することができ、REIは軽鎖のために、そしてEU、LAYおよびPOMは、重鎖と軽鎖の両方に使用することができる。
重鎖の好適なフレームワーク領域は、図3に示すヒト生殖細胞系の第3群フレームワーク領域である(VH3−7 GL、配列番号9)。軽鎖の好適なフレームワーク領域は、図3に示すヒト生殖細胞系配列第3群フレームワーク領域である(A30 GL、配列番号10)。
本発明のCDR移植抗体において、アクセプター抗体として、ドナー抗体鎖に相同的な鎖を有するものを使用することが好ましい。アクセプター重鎖および軽鎖は、必ずしも同じ抗体から得られる必要は無く、所望であれば、異なる鎖から得られるフレームワークを有する複合鎖を含むものでもよい。
本発明のCDR移植抗体において、アクセプター抗体として、ドナー抗体鎖に相同的な鎖を有するものを使用することが好ましい。アクセプター重鎖および軽鎖は、必ずしも同じ抗体から得られる必要は無く、所望であれば、異なる鎖から得られるフレームワークを有する複合鎖を含むものでもよい。
また、本発明のCDR移植抗体においてフレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと全く同じ配列を有する必要は無い。例えば、まれな配列を、そのアクセプター鎖のクラスまたはタイプでより頻繁に存在する残基に変えてもよい。あるいはアクセプターフレームワーク領域中の選択された残基を、ドナー抗体の同じ位置に見い出される残基に一致するように変えてもよい。そのような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するために必要最小限にすべきである。変化させる必要があるアクセプターフレームワーク領域中の残基を選択するためのプロトコールは、WO91/09967号に記載されている。
本発明のCDR移植抗体分子において、アクセプター重鎖がヒト生殖細胞系の第3群フレームワーク領域(図3に示す)(配列番号9)を有する場合には、好ましくは重鎖のアクセプターフレームワーク領域は、1つ以上のドナーCDR以外に、77および93位(カバト(Kabat)ら(前述)に従う)にドナー残基を有する。
本発明のCDR移植抗体分子において、アクセプター軽鎖がヒト第1群フレームワーク領域(図3に示す)(配列番号10)を有する場合には、好ましくは軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、36、44、60、66、69、70および71位(カバト(Kabat)ら(前述)に従う)にドナー残基を有する。
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち元々CDRを得た抗体に由来する残基である。
本発明のCDR移植抗体分子において、アクセプター軽鎖がヒト第1群フレームワーク領域(図3に示す)(配列番号10)を有する場合には、好ましくは軽鎖のアクセプターフレームワーク領域は、36、44、60、66、69、70および71位(カバト(Kabat)ら(前述)に従う)にドナー残基を有する。
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち元々CDRを得た抗体に由来する残基である。
本発明の抗体分子は、完全長重鎖と軽鎖とを有する完全な抗体分子;その断片、例えばFab、修飾Fab、ジFab、ジ(修飾Fab)、Fab’、F(ab')2、またはFv断片;軽鎖または重鎖モノマーまたはダイマー;1本鎖抗体、例えば重鎖と軽鎖の可変ドメインがペプチドリンカーにより連結された1本鎖Fvを含むことができる。同様に、重鎖と軽鎖の可変領域は、適宜他の抗体ドメインと組合せてもよい。
本発明の抗体分子は、好ましくはFab断片である。Fab断片は、好ましくは配列番号11(図4)に示す配列を有する軽鎖と、配列番号12(図5)に示す配列を有する重鎖とを含有する。配列番号11と配列番号12に示すアミノ酸配列は、好ましくは、それぞれ配列番号13と配列番号14(図4と図5)に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
また、本発明の抗体分子は、エフェクターまたはレポーター分子の結合を可能にするような1つ以上のアミノ酸の重鎖のC末端への付加により修飾された、修飾Fab断片であってもよい。追加のアミノ酸は、好ましくはエフェクターまたはレポーター分子が結合される1つまたは2つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する。そのような修飾Fab断片は、好ましくは配列番号11に示す配列を有する軽鎖と、配列番号12に示す配列を有する重鎖とを含有する。配列番号11と配列番号12に示すアミノ酸配列は、好ましくはそれぞれ配列番号13と配列番号14に示すヌクレオチド配列によりコードされる。
さらに、本発明の抗体分子は、Fab重鎖の他の重鎖およびエフェクター若しくはレポーター分子への結合を可能にするような1つ以上のアミノ酸の各Fab重鎖のC末端への付加により修飾された、ジ(修飾Fab)断片である。追加のアミノ酸は、好ましくは他のFab、エフェクターまたはレポーター分子への結合のための、1つ、2つまたは3つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する。
好適なエフェクター基はポリマー分子であり、これは、インビボでのその半減期を長くするために、修飾Fabまたはジ(修飾Fab)断片に結合される。
ポリマー分子は一般に、合成のまたは天然に存在するポリマー、例えば任意に置換された直鎖または分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐もしくは非分岐ポリサッカライド、例えばホモもしくはヘテロポリサッカライドである。
ポリマー分子は一般に、合成のまたは天然に存在するポリマー、例えば任意に置換された直鎖または分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、または分岐もしくは非分岐ポリサッカライド、例えばホモもしくはヘテロポリサッカライドである。
上記合成ポリマー上に存在し得る任意の置換基としては、1つ以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基がある。合成ポリマーの具体例には、任意に置換された直鎖または分岐鎖のポリ(エチレングリコール)、ポリ(プロピレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、またはこれらの誘導体、特に任意に置換されたポリ(エチレングリコール)例えばメトキシポリ(エチレングリコール)またはその誘導体がある。
具体的な天然に存在するポリマーには、乳糖、アミロース、デキストラン、グリコーゲンまたはこれらの誘導体がある。本明細書において「誘導体」とは、反応性誘導体、例えばチオール選択反応基、例えばマレイミドなどを含むものとする。反応基は、直接またはリンカーセグメントを介してポリマーに結合してもよい。そのような基の残基は、ある場合には、抗体断片とポリマーの間の結合基として生成物の一部を構成する。
ポリマーのサイズは、必要に応じて変更することができるが、一般に平均分子量が500Da〜50000Da、好ましくは5000〜40000Da、さらに好ましくは25000〜40000Daの範囲である。ポリマーサイズは特に、製品の使用目的に基づいて選択される。
特に好適なポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)、または特にメトキシポリ(エチレングリコール)またはこれらの誘導体、特に約25000Da〜約40000Daの範囲の分子量を有するものである。
特に好適なポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)、または特にメトキシポリ(エチレングリコール)またはこれらの誘導体、特に約25000Da〜約40000Daの範囲の分子量を有するものである。
修飾した抗体断片に結合している各ポリマー分子は、断片中に存在するシステイン残基のイオウ原子に共有結合することができる。共有結合は、一般にジスルフィド結合、または特にイオウ−炭素結合である。
必要に応じて、抗体断片は、それに1つ以上の他のエフェクターまたはレポーター分子が結合しているものでもよい。エフェクターまたはレポーター分子は、断片中に存在する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基(例えば、任意の遊離のアミノ、イミノ、ヒドロキシル、またはカルボキシル基)を介して、抗体断片に結合することができる。
必要に応じて、抗体断片は、それに1つ以上の他のエフェクターまたはレポーター分子が結合しているものでもよい。エフェクターまたはレポーター分子は、断片中に存在する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基(例えば、任意の遊離のアミノ、イミノ、ヒドロキシル、またはカルボキシル基)を介して、抗体断片に結合することができる。
活性化されたポリマーは、上記のポリマー修飾抗体断片の調製において出発物質として使用される。活性化ポリマーは、チオール反応性基を含有する任意のポリマー[例えばα−ハロカルボン酸またはエステル(例えば、ヨードアセトアミド)、イミド(例えば、マレイミド)、ビニルスルホンまたはジスルフィド]である。そのような出発物質は市販されている(例えば、シアウォーターポリマーズ社(Shearwater Polymers Inc.)、フンツビル(Huntsville)、アラバマ州、アメリカ合衆国)か、または市販の出発物質から従来の化学的方法を使用して調製される。
ポリ(エチレングリコール)(PEG)残基の結合については、「ポリ(エチレングリコール)化学、生物技術的および生物医学的応用(Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications)」、1992、ミルトン・ハリス(J.Milton Harris)(編)、プレヌムプレス(Prenum Press)、ニューヨーク、「ポリ(エチレングリコール)化学および生物医学的応用(Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biomedical Applications)」、1997、ミルトン・ハリス(J.Milton Harris)とザリプスキー(S.Zalipsky)(編)、米国化学会(American Chemical Society)、ワシントンディーシー、および「生物医科学のための生物結合タンパク質結合法(Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences)」、1998、アスラム(M.Aslam)とデント(A.Dent)、グローブパブリッシャーズ(Grove Publishers)、ニューヨークを参照されたい。
エフェクターまたはレポーター分子に結合した抗体断片を得たい場合、このような断片は、標準的な化学的方法または組換えDNA法により調製される。これらの方法において、抗体断片は、適宜、活性化ポリマーと反応させる前または後に、直接または結合剤を介して、エフェクターまたはレポーター分子に結合される。具体的な化学的方法としては、例えばWO93/06231号、WO92/22583号、WO90/09195号およびWO89/01476号に記載する方法がある。あるいは、エフェクターまたはレポーター分子がタンパク質またはポリペプチドである場合には、組換えDNA法、例えばWO86/01533号およびEP−A−0392745号に記載の方法を使用して結合される。
本発明の修飾Fab断片またはジFabは、好ましくはEP−A−0948544号およびEP−A−1090037号に記載の方法に従って、PEG化される(すなわち、PEG(ポリ(エチレングリコール))またはmPEG(メトキシポリエチレングリコール))がそれらに共有結合される)。本発明の抗体分子は、好ましくは図6に示すようなPEG化された修飾Fab断片、またはPEG化されたジ(修飾Fab)断片である。図6に示すように修飾Fab断片は、修飾ヒンジ領域で単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合されている。リジン残基上の各アミン基に、約20,000Daの分子量を有するメトキシポリ(エチレングリコール)ポリマーが結合される。従って全エフェクター分子の総分子量は約40,000Daである。同様に各mPEGを、EP−A−10900037号に記載のようにビスマレイミドリンカーに共有結合されたリジン残基に結合すると、本発明のPEG化ジ(修飾Fab)が形成される。
図6に記載の化合物において抗体部分の重鎖は、好ましくは配列番号12の配列を有し、軽鎖は配列番号11の配列を有する。
本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、もし存在するなら、抗体分子の提唱された機能、特に必要とされることがあるエフェクター機能を考慮して選択される。例えば、定常領域ドメインは、ヒトIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgMドメインでもよい。特にヒトIgG定常領域ドメインが使用され、特に抗体分子が治療用途で使用され、かつ抗体エフェクター機能が必要な時には、IgG1とIgG3イソタイプが使用される。また、抗体分子が治療目的で使用されかつ抗体エフェクター機能が必要無い時には(例えば、単にVEGFによるKDR結合をブロックするため)、IgG2とIgG4イソタイプが使用される。
また本発明の抗体分子は、それに結合したエフェクターまたはレポーター分子を有するものでもよい。例えば本発明の抗体分子は、重金属原子をキレート結合するための巨大環、又は共有結合による架橋構造でそれに結合させた毒素(例えば、リシン)を有するものでもよい。あるいは組換えDNA技術を使用して、完全な免疫グロブリン分子のFc断片(CH2、CH3およびヒンジドメイン)、CH2とCH3ドメイン、またはCH3ドメインが、ペプチド結合、機能性非免疫グロブリンタンパク質(例えば、酵素または毒素分子)で置換されているか、またはそれら断片又はドメインにそれら結合又はタンパク質が結合している、抗体分子を産生してもよい。
本発明の抗体分子の結合親和性は0.4×10-10 Mである。好ましくは本発明の抗体分子は、重鎖可変ドメインgH3(配列番号15)と軽鎖可変ドメインgL3(配列番号16)を含む。これらの軽鎖と重鎖の可変ドメインの配列を図7に示す。
本発明はまた、KDRに対する親和性が改良されている本発明の抗体分子の異形体に関する。そのような異形体は、CDRの変異(ヤング(Yang)ら、J.Mol.Biol.,254,392−403,1995)、鎖シャフリング(マークス(Marks)ら、Bio/Technology,10,779−783,1992)、大腸菌(E.coli)の変異株の使用(ロウ(Low)ら、J.Mol.Biol.,250,359−368,1996)、DNAシャフリング(パッテン(Patten)ら、Curr.Opin.Biotchnol.,8,724−733,1997)、ファージディスプレー(トンプソン(Thompson)ら、J.Mol.Biol.,256,77−88,1996)および有性PCR(クラメリ(Crameri)ら、Nature,391,288−291,1998)を含む多くの親和性成熟プロトコールにより得ることができる。ボーハン(Vaughan)ら(前述)は、親和性成熟のこれらの方法を考察している。
本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖および/または軽鎖をコードするDNA配列、例えば本明細書の図に記載のものを提供する。
本発明のDNA配列は、合成DNA(例えば化学工程により産生される)、cDNA、ゲノムDNA、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
本発明はまた、本発明の1つ以上のDNA配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクターに関する。好ましくはクローニングベクターまたは発現ベクターは、それぞれ本発明の抗体分子の軽鎖と重鎖とをコードする2つのDNA配列を含む。
好適な実施態様において本発明は、本発明のDNA配列を含む大腸菌(E.coli)発現ベクターを提供する。好ましくはこの発現ベクターは、図8に概略的に図示したpTTOD(CDP791)である。
本発明のDNA配列は、合成DNA(例えば化学工程により産生される)、cDNA、ゲノムDNA、またはこれらの任意の組合せを含んでよい。
本発明はまた、本発明の1つ以上のDNA配列を含むクローニングベクターまたは発現ベクターに関する。好ましくはクローニングベクターまたは発現ベクターは、それぞれ本発明の抗体分子の軽鎖と重鎖とをコードする2つのDNA配列を含む。
好適な実施態様において本発明は、本発明のDNA配列を含む大腸菌(E.coli)発現ベクターを提供する。好ましくはこの発現ベクターは、図8に概略的に図示したpTTOD(CDP791)である。
ベクターを構築する一般的な方法、トランスフェクション法、および培養法は、当業者に公知である。この点については、「分子生物学の現代のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」、1999,アウスベル(Ausubel)ら(編)、ウィレイインターサイエンス(Wiley Interscience)、ニューヨーク、およびコールドスプリングハーバーパブリッシング(Cold Spring Harbor Publishing)製のマニアティス(Maniatis)マニュアルを参照されたい。
本発明の抗体分子をコードするDNA配列は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば抗体重鎖と軽鎖の一部またはすべてをコードするDNA配列は、決定されたDNA配列からまたはその対応するアミノ酸配列に基づき、必要に応じて合成することができる。
アクセプターフレームワーク配列をコードするDNAは、当業者が広く利用することができ、その公知のアミノ酸配列に基づき容易に合成することができる。
アクセプターフレームワーク配列をコードするDNAは、当業者が広く利用することができ、その公知のアミノ酸配列に基づき容易に合成することができる。
分子生物学の標準的方法を使用して、本発明の抗体分子をコードするDNA配列が調製される。所望のDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成法を使用して完全にまたは部分的に合成される。部位特異的突然変異誘発技術およびポリメラーゼチェイン反応(PCR)法が、適宜使用される。
任意の適当な宿主細胞/ベクター系が、本発明の抗体分子をコードするDNA配列を発現するために使用される。細菌、例えば大腸菌(E.coli)および他の微生物系は、抗体断片、例えばFab、ジ(修飾Fab)およびF(ab')2 断片、および特にFv断片と1本鎖抗体断片(例えば、1本鎖Fv)の発現のために一部使用される。真核生物(例えば、哺乳動物)宿主細胞発現系は、完全な抗体分子を含むより大きな抗体分子の産生のために使用される。適当な哺乳動物宿主細胞としては、CHO、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞がある。
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするDNAからタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養し、抗体分子を単離することを含む、本発明の抗体分子の産生法を提供する。
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするDNAからタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養し、抗体分子を単離することを含む、本発明の抗体分子の産生法を提供する。
好ましくは本発明の抗体分子の産生方法は、DNA配列からタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のDNA配列を有する大腸菌(E.coli)発現ベクターを含有する大腸菌(E.coli)を培養し、抗体分子を単離することを含む。抗体分子は細胞から分泌されるか、または適当なシグナル配列によりペリプラスムに対して標的化される。あるいは、抗体分子は細胞の細胞質内で蓄積される。抗体分子は、好ましくはペリプラスムに対して標的化されたものである。産生される抗体分子および使用される方法に依存して、抗体分子を再び折り畳み、機能的なコンフォメーションをとらせることが好ましい。抗体分子を再折り畳みさせる方法は、当業者に公知である。
抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含有してもよく、この場合、宿主細胞をトランスフェクトするのに重鎖または軽鎖ポリペプチドのコード配列のみを使用する必要がある。重鎖と軽鎖の両方を含む生成物の産生においては、細胞株は、2つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第1のベクターと、重鎖ポリペプチドをコードする第2のベクターとでトランスフェクトされる。あるいは、軽鎖と重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む単一のベクターを使用してもよい。
本発明はまた、本発明の抗体分子を薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに含む、治療用または診断用組成物を提供する。
本発明はまた、本発明の抗体分子を、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに含む、治療用または診断用組成物の調製法を提供する。
抗体分子は、治療用または診断用組成物の唯一の活性成分であってもよく、他の抗体成分(例えば抗T細胞、抗IFNγ、または抗LPS抗体)、または非抗体成分(例えば、キサンチン)を含む他の活性成分と共に加えられるものでもよい。
本発明はまた、本発明の抗体分子を、薬剤学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体とともに含む、治療用または診断用組成物の調製法を提供する。
抗体分子は、治療用または診断用組成物の唯一の活性成分であってもよく、他の抗体成分(例えば抗T細胞、抗IFNγ、または抗LPS抗体)、または非抗体成分(例えば、キサンチン)を含む他の活性成分と共に加えられるものでもよい。
医薬組成物は好ましくは、治療的に有効量の本発明の抗体を含む。本明細書において「治療的に有効量」とは、標的の疾患または症状を治療、緩和または予防するか、または検出可能な治療効果または予防効果を示すのに必要な治療薬の量を意味する。任意の抗体について、治療的に有効用量は、まず細胞培養物アッセイまたは動物モデル(通常、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類)で推定することができる。この動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するのにも使用される。そのような情報は次に、ヒトでの投与のための有用な用量および経路を決定するのに使用することができる。
ヒト被験体の正確な有効量は、疾患の重症度、被験体の全身の健康状態、被験体の年齢、体重および性、食事、投与時間および頻度、薬剤組合せ、反応感受性および治療に対する耐性/応答に依存する。この量は、ルーチンの実験により決定することができ、臨床医により判定される。一般に有効量は、0.01mg/kg〜50mg/kg、好ましくは0.1mg/kg〜20mg/kg、さらに好ましくは約15mg/kgである。
組成物は、個々に患者に投与されるか、または他の物質、薬剤またはホルモンと組合せて投与される。
本発明の抗体分子が投与される用量は、治療すべき症状の性質、中和すべきVEGFのレベル、または所望のレベルより高くなる事が予測される程度に、および抗体分子が予防的に使用されるのか、または既存の症状を治療するために使用されるのかに依存する。用量はまた、患者の年齢と症状に従って選択される。
本発明の抗体分子が投与される用量は、治療すべき症状の性質、中和すべきVEGFのレベル、または所望のレベルより高くなる事が予測される程度に、および抗体分子が予防的に使用されるのか、または既存の症状を治療するために使用されるのかに依存する。用量はまた、患者の年齢と症状に従って選択される。
すなわち例えば、生成物が、慢性炎症性疾患(例えばリウマチ様関節炎)の治療用または予防用である場合、本発明の抗体分子の適当な用量は、0.5〜50mg/kgの範囲、好ましくは1〜20mg/kg、最も好ましくは約15mg/kgである。投与頻度は、抗体分子の半減期とその効果の持続時間に依存する。
抗体分子の半減期が短い(例えば、2〜10時間)時、1日に1回以上投与することが必要かも知れない。あるいは抗体分子の半減期が長い(例えば2〜15日)なら、1日、1週間、または1もしくは2ヶ月に1回の投与でいいかも知れない。
抗体分子の半減期が短い(例えば、2〜10時間)時、1日に1回以上投与することが必要かも知れない。あるいは抗体分子の半減期が長い(例えば2〜15日)なら、1日、1週間、または1もしくは2ヶ月に1回の投与でいいかも知れない。
医薬組成物はまた、抗体の投与のための薬剤学的に許容される担体を含有してもよい。担体は、組成物を投与されている個体に有害な抗体の産生を誘導してはならず、毒性を有するものであってもならない。適当な担体は、大きく、ゆっくり代謝される巨大分子であり、例えばタンパク質、ポリペプチド、リポソーム、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、および不活性化ウイルス粒子などである。
薬剤学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩のような鉱酸の塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩のような有機酸の塩が使用できる。
薬剤学的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩のような鉱酸の塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩のような有機酸の塩が使用できる。
治療用組成物中の薬剤学的に許容される担体は、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体をさらに含有してもよい。さらに湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝物質のような補助物質が、そのような組成物中に存在してもよい。そのような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤として製剤化することを可能にする。
好適な投与のための形態としては、例えば注射または注入(例えば、ボーラス注入または連続的注入)による非経口投与に適した形態がある。生成物が注射または注入用である場合、生成物は、油状または水性ビヒクル中の懸濁物、溶液またはエマルジョンの形態でもよく、調剤化物質、例えば懸濁剤、保存剤、安定剤および/または分散剤を含有してもよい。あるいは抗体分子は、適切な無菌液体と共に使用して溶解するための乾燥形態でもよい。
いったん調製されると、本発明の組成物は直接被験体に投与される。治療される被験体は動物でもよい。しかし、組成物はヒト被験体への投与に適合することが好ましい。
いったん調製されると、本発明の組成物は直接被験体に投与される。治療される被験体は動物でもよい。しかし、組成物はヒト被験体への投与に適合することが好ましい。
本発明の医薬組成物は、任意の経路、特に限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下、脳室内、経皮(transdermal)、経皮(trnscutaneous)(例えばWO98/20734号を参照)、皮下、腹腔内、鼻内、腸内、局所的、舌下、膣内、または直腸経路で投与してもよい。本発明の医薬組成物を投与するのにハイポスプレーを使用してもよい。典型的には治療用組成物は、注射剤として、液剤または懸濁剤として調製される。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するのに適した固体型も調製される。
組成物の直接送達は一般に、注入、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内で、または組織の間質スペースに投与されるであろう。組成物はまた病変中に投与することができる。投与処理は単回投与または複数回投与スケジュールでもよい。
組成物の直接送達は一般に、注入、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内で、または組織の間質スペースに投与されるであろう。組成物はまた病変中に投与することができる。投与処理は単回投与または複数回投与スケジュールでもよい。
組成物中の活性成分は、抗体分子であることは理解されるであろう。従ってこれは、消化管中で分解を受けやすい。すなわち消化管を使用する経路で組成物を投与するなら、組成物は、分解から抗体を防御するが、消化管から吸収されたら抗体を放出する物質を含有する必要がある。
薬剤学的に許容される担体の詳細な考察は、レミントンの薬剤科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(マックパブリッシング社(Mack Publishing Company)、ニュージャージー州、1991)に記載されている。
薬剤学的に許容される担体の詳細な考察は、レミントンの薬剤科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(マックパブリッシング社(Mack Publishing Company)、ニュージャージー州、1991)に記載されている。
また本発明の抗体は、遺伝子治療を利用して投与されるであろう。このために、適切なDNA成分の制御下で抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするDNA配列が、DNA配列から抗体鎖が発現され、in situで組み立てられるように患者に投与される。
本発明はまた、VEGFおよび/またはKDRが関与している疾患の治療に使用される本発明の抗体分子を提供する。
本発明はさらに、VEGFおよび/またはKDRが関与している治療のための薬剤を製造するための、本発明の抗体分子の使用を提供する。
本発明の抗体分子は、ヒトまたは動物の体に存在する生物学的に活性なKDRのレベルを低下させることが望まれる治療法で使用される。VEGFは、体内を循環していたり体の特定の部位で望ましくない高いレベルで存在することがある。
本発明はさらに、VEGFおよび/またはKDRが関与している治療のための薬剤を製造するための、本発明の抗体分子の使用を提供する。
本発明の抗体分子は、ヒトまたは動物の体に存在する生物学的に活性なKDRのレベルを低下させることが望まれる治療法で使用される。VEGFは、体内を循環していたり体の特定の部位で望ましくない高いレベルで存在することがある。
例えば、VEGF(および従ってKDR)は、多くの病状(炎症、乾癬、リウマチ様関節炎、および腫瘍増殖と転移を含む)に関与している。
本発明はまた、本発明の抗体分子の有効量を被験体に投与することを含む、VEGFおよび/またはKDRが関与している疾患にかかっているかまたはそのリスクのあるヒトまたは動物被験体の治療法を提供する。
本発明の抗体分子はまた、診断、例えば高レベルのKDRを伴なう病状のインビボ診断およびイメージングのために使用することができる。
本発明はさらに、添付の図面を参照する以下の実施例で例示のためにのみ記載される。
本発明はまた、本発明の抗体分子の有効量を被験体に投与することを含む、VEGFおよび/またはKDRが関与している疾患にかかっているかまたはそのリスクのあるヒトまたは動物被験体の治療法を提供する。
本発明の抗体分子はまた、診断、例えば高レベルのKDRを伴なう病状のインビボ診断およびイメージングのために使用することができる。
本発明はさらに、添付の図面を参照する以下の実施例で例示のためにのみ記載される。
(モノクローナル抗体産生と選択)
インハウス免疫プログラムを開始して、そのリガンドVEGFとの相互作用をブロックするのに有効なヒトKDRに対する抗体を選択した。完全長ヒトKDR、精製ヒトKDR−ヒトFc融合タンパク質、およびこれらの融合タンパク質をコードするDNAでトランスフェクトしたCHO細胞を含む種々の免疫原を用いて、マウスを免疫した。細胞/タンパク質免疫原で免疫した動物からの全部で19の融合体と、DNAで免疫した動物からの4つの融合体から、約23、000個のウェルを、ヒト7−ドメインKDR−Fcへの結合について1次ELISAフォーマットでスクリーニングした。次に約800の抗体を、ヒト7−ドメインKDR−Fcへの125−I VEGF結合のブロッキングを測定する放射免疫定量法の2次スクリーニングにかけた。3次スクリーニングにより、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)からのVEGF刺激組織因子放出のブロッキングを測定した。このスクリーニングカスケードから、抗体VR165が選択された(データは示していない)。
インハウス免疫プログラムを開始して、そのリガンドVEGFとの相互作用をブロックするのに有効なヒトKDRに対する抗体を選択した。完全長ヒトKDR、精製ヒトKDR−ヒトFc融合タンパク質、およびこれらの融合タンパク質をコードするDNAでトランスフェクトしたCHO細胞を含む種々の免疫原を用いて、マウスを免疫した。細胞/タンパク質免疫原で免疫した動物からの全部で19の融合体と、DNAで免疫した動物からの4つの融合体から、約23、000個のウェルを、ヒト7−ドメインKDR−Fcへの結合について1次ELISAフォーマットでスクリーニングした。次に約800の抗体を、ヒト7−ドメインKDR−Fcへの125−I VEGF結合のブロッキングを測定する放射免疫定量法の2次スクリーニングにかけた。3次スクリーニングにより、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)からのVEGF刺激組織因子放出のブロッキングを測定した。このスクリーニングカスケードから、抗体VR165が選択された(データは示していない)。
(VR165の遺伝子クローニング)
VR165を発現するハイブリドーマ細胞からRNAを調製し、DNAに逆転写した。次にこれを一連のPCR反応の鋳型として使用して、V領域配列を増幅した。保存された重鎖および軽鎖シグナル配列内でアニーリングするように設計された縮重プライマープールをフォーワードプライマーとして使用し、フレームワーク4/C領域ジャンクションをコードするプライマーをリバースプライマーとした。こうして、重鎖と軽鎖の両方のV領域遺伝子を増幅し、次にクローン化し配列決定した。DNA配列を翻訳してVR165 V領域アミノ酸配列を得て、これは、N末端配列決定により決定されたタンパク質配列と比較して確認した。次にマウスV領域遺伝子を、発現ベクターpMR10.1とpGamma−4中にサブクローン化した。これらは、ヒトカッパ軽鎖とgamma−4重鎖の定常領域遺伝子をコードするゲノムDNAを含有するそれぞれ軽鎖と重鎖の発現のための別々のベクターである。CHO細胞への同時トランスフェクションにより、キメラVR165抗体が得られる。
VR165を発現するハイブリドーマ細胞からRNAを調製し、DNAに逆転写した。次にこれを一連のPCR反応の鋳型として使用して、V領域配列を増幅した。保存された重鎖および軽鎖シグナル配列内でアニーリングするように設計された縮重プライマープールをフォーワードプライマーとして使用し、フレームワーク4/C領域ジャンクションをコードするプライマーをリバースプライマーとした。こうして、重鎖と軽鎖の両方のV領域遺伝子を増幅し、次にクローン化し配列決定した。DNA配列を翻訳してVR165 V領域アミノ酸配列を得て、これは、N末端配列決定により決定されたタンパク質配列と比較して確認した。次にマウスV領域遺伝子を、発現ベクターpMR10.1とpGamma−4中にサブクローン化した。これらは、ヒトカッパ軽鎖とgamma−4重鎖の定常領域遺伝子をコードするゲノムDNAを含有するそれぞれ軽鎖と重鎖の発現のための別々のベクターである。CHO細胞への同時トランスフェクションにより、キメラVR165抗体が得られる。
(CDR移植配列の設計)
免疫原性を低下させ大腸菌(E.coli)発現を促進するために、VR165をヒトフレームワークにCDR移植した。サブグループVHIIIとVLIから、ヒト生殖細胞系アクセプターフレームワークを選択した。重鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列VH3−7であり、ヒトJH領域生殖細胞系JH4のこの部分から来るフレームワーク4を有する。軽鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列A30であり、ヒトJK領域生殖細胞系JK1のこの部分から来るフレームワーク4を有する。整列すると、ドナーとアクセプター重鎖の間に15のフレームワークの差があることを示す。これらの位置のそれぞれで、抗原結合に寄与する残基の可能性について分析した;重要であると考えられたら、マウスドナー残基を保持した。軽鎖整列は、ドナーとアクセプター重鎖の間に24のフレームワークの差があることを示す。マウス残基が抗原結合に寄与する可能性を、再度分析した。こうして、VH移植片を設計し、3つのVL移植片を得た(図9、配列番号17〜22)。各場合に、移植片1は、マウスフレームワーク残基の無い移植片である。移植片gH3はまた、CDR−H2のC末端に追加のヒト残基を含有する。CDRのこの部分は、抗原結合表面ではない。大腸菌(E.coli)で頻繁に使用されるコドンを使用し、「まれ」な大腸菌(E.coli)コドンを避けて、移植配列をコードするように遺伝子を設計した(ワダ(Wada)ら、Nucleic Acids Res.19、1981−86、1991)。さらなる遺伝子操作を促進するために、間隔を置いてDNA配列中に制限部位を導入した。図10は、gH1とgL1の遺伝子の設計を示す(配列番号23と配列番号24)。遺伝子を構築するのに使用したオリゴヌクレオチドを図11に示す(配列番号25〜40)。
免疫原性を低下させ大腸菌(E.coli)発現を促進するために、VR165をヒトフレームワークにCDR移植した。サブグループVHIIIとVLIから、ヒト生殖細胞系アクセプターフレームワークを選択した。重鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列VH3−7であり、ヒトJH領域生殖細胞系JH4のこの部分から来るフレームワーク4を有する。軽鎖アクセプターフレームワークは、ヒト生殖細胞系配列A30であり、ヒトJK領域生殖細胞系JK1のこの部分から来るフレームワーク4を有する。整列すると、ドナーとアクセプター重鎖の間に15のフレームワークの差があることを示す。これらの位置のそれぞれで、抗原結合に寄与する残基の可能性について分析した;重要であると考えられたら、マウスドナー残基を保持した。軽鎖整列は、ドナーとアクセプター重鎖の間に24のフレームワークの差があることを示す。マウス残基が抗原結合に寄与する可能性を、再度分析した。こうして、VH移植片を設計し、3つのVL移植片を得た(図9、配列番号17〜22)。各場合に、移植片1は、マウスフレームワーク残基の無い移植片である。移植片gH3はまた、CDR−H2のC末端に追加のヒト残基を含有する。CDRのこの部分は、抗原結合表面ではない。大腸菌(E.coli)で頻繁に使用されるコドンを使用し、「まれ」な大腸菌(E.coli)コドンを避けて、移植配列をコードするように遺伝子を設計した(ワダ(Wada)ら、Nucleic Acids Res.19、1981−86、1991)。さらなる遺伝子操作を促進するために、間隔を置いてDNA配列中に制限部位を導入した。図10は、gH1とgL1の遺伝子の設計を示す(配列番号23と配列番号24)。遺伝子を構築するのに使用したオリゴヌクレオチドを図11に示す(配列番号25〜40)。
(移植配列の遺伝子の構築)
PCR組み立て法を使用して、CDR移植gH1とgL1 V領域遺伝子を構築した。10mMトリス塩酸(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.001%ゼラチン、0.25mMの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、1pmolの各「内部」プライマー(F2、F3、F4、R2、R3、R4)、10pmolの各「外部」プライマー(F1、R1)、および1単位のTaqポリメラーゼ(アンプリタク(AmpliTaq)、アプライド・バイオシステムズ(Applied BioSystems)、カタログ番号N808−0171)を含有する100μlの反応容量を準備した。PCRサイクルパラメータは、94℃で1分、55℃で1分、および72℃で1分を30サイクルであった。次に反応生成物を1.5%のアガロースゲルで流し、切り出し、キアゲン(Quiagen)スピンカラム(キアクイック(QIAquick)ゲル抽出キット、カタログ番号28706)を使用して回収した。30μlの容量でDNAを溶出した。次にアリコート(1μl)のgH1とgL1 DNAを、インビトロゲン(InVitrogen)トポタ(TOPO TA)クローニングベクターpCR2.1 TOPO(カタログ番号K4500−01)中に製造業者の説明書に従ってクローン化した。この非発現ベクターは、多量のクローンの配列決定を促進するためのクローニング中間体とした。ベクター特異的プライマーを使用するDNA配列決定を使用して、gH1とgL1を含有する正しいクローンを同定して、プラスミドpCR2.1(gH1)、およびpCR2.1(gL1)を作成した(図12を参照)。
PCR組み立て法を使用して、CDR移植gH1とgL1 V領域遺伝子を構築した。10mMトリス塩酸(pH8.3)、1.5mM MgCl2、50mM KCl、0.001%ゼラチン、0.25mMの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、1pmolの各「内部」プライマー(F2、F3、F4、R2、R3、R4)、10pmolの各「外部」プライマー(F1、R1)、および1単位のTaqポリメラーゼ(アンプリタク(AmpliTaq)、アプライド・バイオシステムズ(Applied BioSystems)、カタログ番号N808−0171)を含有する100μlの反応容量を準備した。PCRサイクルパラメータは、94℃で1分、55℃で1分、および72℃で1分を30サイクルであった。次に反応生成物を1.5%のアガロースゲルで流し、切り出し、キアゲン(Quiagen)スピンカラム(キアクイック(QIAquick)ゲル抽出キット、カタログ番号28706)を使用して回収した。30μlの容量でDNAを溶出した。次にアリコート(1μl)のgH1とgL1 DNAを、インビトロゲン(InVitrogen)トポタ(TOPO TA)クローニングベクターpCR2.1 TOPO(カタログ番号K4500−01)中に製造業者の説明書に従ってクローン化した。この非発現ベクターは、多量のクローンの配列決定を促進するためのクローニング中間体とした。ベクター特異的プライマーを使用するDNA配列決定を使用して、gH1とgL1を含有する正しいクローンを同定して、プラスミドpCR2.1(gH1)、およびpCR2.1(gL1)を作成した(図12を参照)。
オリゴヌクレオチドカセット置換法を使用して、ヒト化移植片gH2とgL2を作成した。図13は、オリゴヌクレオチドカセットの設計を示す(配列番号41と配列番号43)。各変種を構築するために、ベクター(pCR2.1(gH1)またはpCR2.1(gL1))を、記載の制限酵素で切断(図13、制限部位に下線)し、大きいベクター断片をアガロースからゲル精製し、オリゴヌクレオチドカセットとの結合に使用した。図14は、カセットに使用したオリゴヌクレオチドの配列を示す(配列番号45〜46および配列番号49〜50)。対を、12.5mMトリス塩酸(pH7.5)、2.5mM MgCl2、25mM NaCl、0.25mMジチオエリトリトールを含有する200μlの容量中0.5pmol/μlの濃度で混合し、水浴(容量500ml)中で95℃で3分加熱して、次に室温までゆっくり冷却することにより、アニーリングした。次にアニーリングしたオリゴヌクレオチドカセットを水で10倍希釈した後、適切な切断したベクター中に結合した。DNA配列決定を使用して、正しい配列を確認し、プラスミドpCR2.1(gH2)とpCR2.1(gL2)を作成した。
変種gH3とgL3を、同様にgH2とgL2から構築した。カセットとオリゴヌクレオチドを図13と14に示す(配列番号42と配列番号44、配列番号47〜48、および配列番号51〜52)。pCR2.1ベクター骨格中のPvuI部位の存在のために、gL3の構築には修飾法が必要であった。pCR2.1(gL2)をAatIIとSfuIで切断すると、PvuI−AatIIアニーリングしたカセットが結合したベクター分子と、これもpCR2.1(gL2)から調製された225塩基対のSfuI−PvuI断片が作成された。DNA配列決定を使用して、正しい配列を確認して、プラスミドPCR(gH3)とpCR2.1(gL3)を作成した。
次に3つの重鎖移植片のそれぞれを、発現ベクターpGamma−4中にHindIII−ApaI断片としてサブクローニングした。3つの軽鎖移植片のそれぞれを、発現ベクターpMR10.1中にSfuI−BsiWI断片としてサブクローニングした。図15は、これらの発現ベクターの地図を示す。CHO細胞への同時トランスフェクションにより、抗体を一過性に発現させた。移植した鎖とキメラ鎖のすべての組合せを発現させ、2重キメラ抗体に対して比較した。
結合を、KDR結合ELISA、KDRへの標識VEGF結合の阻害の放射免疫定量法、およびKDR結合のビアコア(BIAcore)アッセイにより測定した。移植したすべての型は、ELISAと放射免疫定量法で良好に機能し、キメラに似た活性を示した。ビアコア(BIAcore)分析から、移植片gL3gH3を最適として選択(データは示していない)し、これを以後g165と呼ぶ。
結合を、KDR結合ELISA、KDRへの標識VEGF結合の阻害の放射免疫定量法、およびKDR結合のビアコア(BIAcore)アッセイにより測定した。移植したすべての型は、ELISAと放射免疫定量法で良好に機能し、キメラに似た活性を示した。ビアコア(BIAcore)分析から、移植片gL3gH3を最適として選択(データは示していない)し、これを以後g165と呼ぶ。
(プラスミドpTTODの構築)
プラスミドpTTO−1を以下のように構築した。
プラスミドpTTO−1を以下のように構築した。
(a)pTTQ9ポリリンカーの置換
プラスミドpTTQ9をアマシャム(Amersham)から得た。アリコート(2μg)を制限酵素SalIとEcoRIで消化し、消化物を1%アガロースゲルに流し、大きいDNA断片(4520bp)を精製した。2つのオリゴヌクレオチドを合成し、これらはアニーリングすると、OmpAポリリンカー領域をコードする。この配列は、pTTQ9の制限切断により作成されたSalIとEcoRI末端に適合する粘着末端を有する。このオリゴヌクレオチド「カセット」をpTTQ9ベクター中にクローニングすると、SalI部位は再生されないが、EcoRI部位は維持される。このカセットは、大腸菌(E.coli)外膜タンパク質Omp−Aのシグナル配列の最初の13アミノ酸をコードし、これは、OmpA遺伝子のシャインダルガルノ(Shine Dalgarno)リボゾーム結合部位が先行する。さらに、酵素XbaI、MunI、StyIおよびSplIの制限部位が存在する。MunIとStyI部位は、OmpAシグナル配列のコード領域内に有り、遺伝子の挿入のための5’クローニング部位となる。このカセットを構成する2つのオリゴヌクレオチドを、5pmol/μlの濃度で混合し、水浴中で95℃で3分加熱して、次に室温までゆっくり冷却することにより、アニーリングした。次にアニーリングした配列を、SalI/EcoRI切断したpTTQ9に連結した。得られたプラスミド中間体(pTQOmpと呼ぶ)をDNA配列決定により証明した。
プラスミドpTTQ9をアマシャム(Amersham)から得た。アリコート(2μg)を制限酵素SalIとEcoRIで消化し、消化物を1%アガロースゲルに流し、大きいDNA断片(4520bp)を精製した。2つのオリゴヌクレオチドを合成し、これらはアニーリングすると、OmpAポリリンカー領域をコードする。この配列は、pTTQ9の制限切断により作成されたSalIとEcoRI末端に適合する粘着末端を有する。このオリゴヌクレオチド「カセット」をpTTQ9ベクター中にクローニングすると、SalI部位は再生されないが、EcoRI部位は維持される。このカセットは、大腸菌(E.coli)外膜タンパク質Omp−Aのシグナル配列の最初の13アミノ酸をコードし、これは、OmpA遺伝子のシャインダルガルノ(Shine Dalgarno)リボゾーム結合部位が先行する。さらに、酵素XbaI、MunI、StyIおよびSplIの制限部位が存在する。MunIとStyI部位は、OmpAシグナル配列のコード領域内に有り、遺伝子の挿入のための5’クローニング部位となる。このカセットを構成する2つのオリゴヌクレオチドを、5pmol/μlの濃度で混合し、水浴中で95℃で3分加熱して、次に室温までゆっくり冷却することにより、アニーリングした。次にアニーリングした配列を、SalI/EcoRI切断したpTTQ9に連結した。得られたプラスミド中間体(pTQOmpと呼ぶ)をDNA配列決定により証明した。
(b)断片調製と連結
プラスミドpACYC184からの1つのDNA断片を、pTQOmpから作成した2つの断片に連結して、プラスミドpTTO−1を構築した。プラスミドpACYC184はニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)から得られた。アリコート(2μg)を制限酵素StyIで完全に消化し、次に大豆ヌクレアーゼ(Mung Bean Nuclease)を用いて処理した;この処理により、5’塩基オーバーハングを切断して、平滑末端を作成する。フェノール抽出とエタノール沈殿後、DNAを酵素PvuIIで切断し、2348、1081、412および403bpの断片を生成した。アガロースゲル電気泳動後に2348bp断片を精製した。この断片は、テトラサイクリン耐性マーカーとp15A複製開始点をコードする。次に断片を子ウシ小腸アルカリホスファターゼで処理して、5’末端リン酸を除去し、こうしてこの分子の自己連結を防止した。
プラスミドpACYC184からの1つのDNA断片を、pTQOmpから作成した2つの断片に連結して、プラスミドpTTO−1を構築した。プラスミドpACYC184はニューイングランドバイオラボズ(New England Biolabs)から得られた。アリコート(2μg)を制限酵素StyIで完全に消化し、次に大豆ヌクレアーゼ(Mung Bean Nuclease)を用いて処理した;この処理により、5’塩基オーバーハングを切断して、平滑末端を作成する。フェノール抽出とエタノール沈殿後、DNAを酵素PvuIIで切断し、2348、1081、412および403bpの断片を生成した。アガロースゲル電気泳動後に2348bp断片を精製した。この断片は、テトラサイクリン耐性マーカーとp15A複製開始点をコードする。次に断片を子ウシ小腸アルカリホスファターゼで処理して、5’末端リン酸を除去し、こうしてこの分子の自己連結を防止した。
アリコート(2μg)のプラスミドpTQOmpを酵素SspIとEcoRIで消化し、アガロースゲル電気泳動後に2040bpと170bpの不要な断片から2350bp断片を精製した;この断片は、転写停止領域とlacIq 遺伝子とをコードする。別のアリコート(2μg)のpTQOmpをEcoRIとXmnIで消化して、2289、1670、350および250bpの断片を作成した。tacプロモーター、OmpAシグナル配列、および複クローニング部位をコードする350bp断片をゲル精製した。
次に、ほぼ等モル量の各断片を使用して3つの断片を連結して、プラスミドpTTO−1を作成した。すべてのクローニングジャンクションをDNA配列決定により証明した。
次に、ほぼ等モル量の各断片を使用して3つの断片を連結して、プラスミドpTTO−1を作成した。すべてのクローニングジャンクションをDNA配列決定により証明した。
(c)プラスミドpTTODの産生
pTTO−1から、PvuII(3部位)、EcoRV(2部位)およびApaI(1部位)の骨格制限部位を除去して、プラスミドpTTODを得た。Fab’コード法を単純化するために、これらの変化を加えた。これらの変化を加える時に、lacIq遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子のコードタンパク質配列は変化させなかったが、DNAレベルの「サイレント」変化を行った。PCR法を行い、ここでこれらの制限部位を除去した「サイレント」変化を有するプライマーを設計し、これを使用して親プラスミド(pTTO−1)のセクションを増幅した。次にフランキング制限部位(無変化)を使用して、親プラスミド中の配列をこれらの修飾配列で置換した。この多工程プロセスにより、プラスミドpTTODが作成された。遺伝子にフランクするユニークなPstIとEcoRI部位を使用して、ベクターpTTO内の既存のFab’遺伝子のpTTODへの移行を行い、pTTOD(Fab’)を作成した。
pTTO−1から、PvuII(3部位)、EcoRV(2部位)およびApaI(1部位)の骨格制限部位を除去して、プラスミドpTTODを得た。Fab’コード法を単純化するために、これらの変化を加えた。これらの変化を加える時に、lacIq遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子のコードタンパク質配列は変化させなかったが、DNAレベルの「サイレント」変化を行った。PCR法を行い、ここでこれらの制限部位を除去した「サイレント」変化を有するプライマーを設計し、これを使用して親プラスミド(pTTO−1)のセクションを増幅した。次にフランキング制限部位(無変化)を使用して、親プラスミド中の配列をこれらの修飾配列で置換した。この多工程プロセスにより、プラスミドpTTODが作成された。遺伝子にフランクするユニークなPstIとEcoRI部位を使用して、ベクターpTTO内の既存のFab’遺伝子のpTTODへの移行を行い、pTTOD(Fab’)を作成した。
(大腸菌(E.coli)Fab’発現プラスミドpTTODへのg165V領域遺伝子の挿入)
g165配列の挿入のための開始点は、無関係のFab’の発現のための3つのベクター(pTTOD(Fab’IGS−1)、pTTOD(Fab’IGS−2)およびpTTOD(Fab’IGS−3))である(例えば、図16を参照)。これらは、軽鎖遺伝子を重鎖遺伝子から分離する、いわゆるIGSすなわち遺伝子内配列でのみ異なる。これらのIGS領域を図17に示す(配列番号53〜55)。これらのベクターへのg165配列のクローニングは、2工程プロセスとして行った。まず、pCR2.1(gL3)から軽鎖をEcoRV−BsiWI断片(395bp)として制限切断し、pTTOD(Fab’IGS−1)、pTTOD(Fab’IGS−2)およびpTTOD(Fab’IGS−3)のEcoRV−BsiWI消化からの大きいベクター断片中に挿入した。これで、クローニング中間体pTTOD(g165L IGS−1)、pTTOD(g165L IGS−2)およびpTTOD(g165L IGS−3)が作成された。次にこれらのクローニング中間体をPvuIIとApaIで切断し、大きいベクター断片を精製し、pCR2.1(gH3)からの435bpのPvuII−ApaI断片を挿入した。これで、3つのFab’発現プラスミドpTTOD(g165 IGS−1)、pTTOD(g165 IGS−2)およびpTTOD(g165 IGS−3)が作成された。
g165配列の挿入のための開始点は、無関係のFab’の発現のための3つのベクター(pTTOD(Fab’IGS−1)、pTTOD(Fab’IGS−2)およびpTTOD(Fab’IGS−3))である(例えば、図16を参照)。これらは、軽鎖遺伝子を重鎖遺伝子から分離する、いわゆるIGSすなわち遺伝子内配列でのみ異なる。これらのIGS領域を図17に示す(配列番号53〜55)。これらのベクターへのg165配列のクローニングは、2工程プロセスとして行った。まず、pCR2.1(gL3)から軽鎖をEcoRV−BsiWI断片(395bp)として制限切断し、pTTOD(Fab’IGS−1)、pTTOD(Fab’IGS−2)およびpTTOD(Fab’IGS−3)のEcoRV−BsiWI消化からの大きいベクター断片中に挿入した。これで、クローニング中間体pTTOD(g165L IGS−1)、pTTOD(g165L IGS−2)およびpTTOD(g165L IGS−3)が作成された。次にこれらのクローニング中間体をPvuIIとApaIで切断し、大きいベクター断片を精製し、pCR2.1(gH3)からの435bpのPvuII−ApaI断片を挿入した。これで、3つのFab’発現プラスミドpTTOD(g165 IGS−1)、pTTOD(g165 IGS−2)およびpTTOD(g165 IGS−3)が作成された。
これらのプラスミドを宿主株W3110中に形質転換し、これらの3つのプラスミドによるFab’の発現を、振盪フラスコと発酵槽で比較した。図18は、発酵槽比較の結果であり、IGS−2変種の優れた性能を明瞭に証明している。
プラスミドpTTOD(g165 IGS−2)をpTTOD(CDP791)と再度名付けた。この構築体のプラスミド地図を図8に示す。図19は、このベクター中のFab’のコード領域の完全なDNAとタンパク質配列、および5’と3’フランキング配列の一部を示す(配列番号56)。
プラスミドpTTOD(g165 IGS−2)をpTTOD(CDP791)と再度名付けた。この構築体のプラスミド地図を図8に示す。図19は、このベクター中のFab’のコード領域の完全なDNAとタンパク質配列、および5’と3’フランキング配列の一部を示す(配列番号56)。
(CDR移植VR165ベースの修飾FabのPEG化)
精製し修飾Fabは、mPEGの分岐分子に部位特異的に結合した。これは、修飾Fabの端を切り取ったヒンジ領域中の単一のシステイン残基の活性化と、次に、既に記載されているように(チャップマン(A.P.Chapman)ら、Nature Biotechnology 17,780−783,1999)(mPEG)リジルマレイミドと反応させて行った。PEG化分子を図6に示す。あるいは、EP−A−1090037号に記載されているように、活性化Fabを(mPEG)リジルビスマレイミドと反応させると、PEG化ジ(修飾Fab)が得られる(以後DFMと呼ぶ)。
精製し修飾Fabは、mPEGの分岐分子に部位特異的に結合した。これは、修飾Fabの端を切り取ったヒンジ領域中の単一のシステイン残基の活性化と、次に、既に記載されているように(チャップマン(A.P.Chapman)ら、Nature Biotechnology 17,780−783,1999)(mPEG)リジルマレイミドと反応させて行った。PEG化分子を図6に示す。あるいは、EP−A−1090037号に記載されているように、活性化Fabを(mPEG)リジルビスマレイミドと反応させると、PEG化ジ(修飾Fab)が得られる(以後DFMと呼ぶ)。
(裸のおよびPEG化断片のビアコア(BIAcore)活性)
ヒトFcに融合した7つのIgドメインヒトKDRを、抗Fcで被覆したチップ上に捕捉し、CDR移植抗体g165の種々の断片とマウス親抗体VR165とを、親和性測定のために流した。以下の表は、得られた結果を要約する。このアッセイフォーマットで、2価の種の低いオフレート(Kd)で示される2価の利点がある。移植したDFMの親和性は、マウスIgGと非常によく似ており、DMF−PEGは親和性のわずかな低下を示す。g165 DFM−PEG分子のKDは、このアッセイでは約4×10-11Mである。
ヒトFcに融合した7つのIgドメインヒトKDRを、抗Fcで被覆したチップ上に捕捉し、CDR移植抗体g165の種々の断片とマウス親抗体VR165とを、親和性測定のために流した。以下の表は、得られた結果を要約する。このアッセイフォーマットで、2価の種の低いオフレート(Kd)で示される2価の利点がある。移植したDFMの親和性は、マウスIgGと非常によく似ており、DMF−PEGは親和性のわずかな低下を示す。g165 DFM−PEG分子のKDは、このアッセイでは約4×10-11Mである。
(放射免疫定量法)
KDRへのVEGF結合をブロックする断片の能力を、放射免疫定量法で測定した。ポリクローナル抗Fcを使用して、マイクロタイタープレート中のヒトFcに融合した7つのIgドメインKDRを補足し、抗体または断片を加え、次に125−I標識VEGFを加えた。このアッセイの結果を図20に示す。このアッセイの構成においてFab’に対するDFMの優れたブロッキング性能により証明される2価の利点がる。ビアコア(BIAcore)試験で見られたように、DFM−PEG構築体は裸のDFMと比較して活性のわずかな低下を示す。
KDRへのVEGF結合をブロックする断片の能力を、放射免疫定量法で測定した。ポリクローナル抗Fcを使用して、マイクロタイタープレート中のヒトFcに融合した7つのIgドメインKDRを補足し、抗体または断片を加え、次に125−I標識VEGFを加えた。このアッセイの結果を図20に示す。このアッセイの構成においてFab’に対するDFMの優れたブロッキング性能により証明される2価の利点がる。ビアコア(BIAcore)試験で見られたように、DFM−PEG構築体は裸のDFMと比較して活性のわずかな低下を示す。
(細胞ベースのアッセイ)
分子g165 DFM PEGはまた、細胞ベースのアッセイで活性を示した。KDRのVEGF刺激をブロックする能力は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(クラウス(Clauss)ら、J.Biol.Chem.,271,17629−17634,1996)による組織因子放出を介して証明された。活性はまた、ヒト微小血管内皮細胞(カニンガム(Cunningham)ら、Am.J.Physiol,276,C176−181,1999)におけるVEGF介在Ca2+動員の阻害により証明した。
分子g165 DFM PEGはまた、細胞ベースのアッセイで活性を示した。KDRのVEGF刺激をブロックする能力は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(クラウス(Clauss)ら、J.Biol.Chem.,271,17629−17634,1996)による組織因子放出を介して証明された。活性はまた、ヒト微小血管内皮細胞(カニンガム(Cunningham)ら、Am.J.Physiol,276,C176−181,1999)におけるVEGF介在Ca2+動員の阻害により証明した。
上記例は例示のためのみであって、請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
Claims (2)
- 可変ドメインが、CDRH1として図1のH1に示す配列(配列番号1)、CDRH2として図1のH2に示す配列(配列番号2)、またはCDRH3として図1のH3に示す配列(配列番号3)を有するCDRを含有する、重鎖を含む、ヒトKDRに特異性を有する抗体分子。
- 可変ドメインが、CDRL1として図1のL1に示す配列(配列番号4)、CDRL2として図1のL2に示す配列(配列番号5)、またはCDRL3として図1のL3に示す配列(配列番号6)を有するCDRを含有する、軽鎖を含む、KDRに特異性を有する抗体分子。
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