PL208848B1 - Cząsteczka przeciwciała o swoistości wobec ludzkiego KDR, zawierający ją związek, kodująca ją sekwencja DNA i sposób jej wytwarzania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, kompozycja oraz zastosowania medyczne - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka przeciwciała o swoistości wobec ludzkiego KDR, zawierający ją związek, kodująca ją sekwencja DNA i sposób jej wytwarzania, wektor ekspresyjny, komórka gospodarza, kompozycja oraz zastosowania medyczne. Cząsteczka przeciwciała według wynalazku jest swoista wobec determinant antygenowych receptora zawierającego domenę insercyjną ludzkiej kinazy (KDR, ang. kinase insert domain-containing receptor). Cząsteczka przeciwciała wiąże się z KDR z większym powinowactwem niż ludzki czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i uniemoż liwia oddział ywanie pomię dzy VEGF i KDR.

Wynalazek dotyczy cząsteczek przeciwciał. W cząsteczce przeciwciała znajdują się dwa ciężkie łańcuchy i dwa lekkie. Każdy łańcuch ciężki i każdy łańcuch lekki posiada na swoim końcu N domenę zmienną. Każda domena zmienna składa się z czterech regionów zrębowych (ang. framework region, FR) na przemian z trzema regionami determinującymi komplementarność (ang. complementarity determining region, CDR). CDR determinują swoistość wiązania antygenu przez przeciwciała i są względnie krótkimi sekwencjami peptydowymi występującymi w regionach zrębowych domen zmiennych. Reszty w domenach zmiennych są klasycznie numerowane zgodnie z systemem opracowanym przez Kabat i wsp. System ten jest przedstawiony przez Kabat i wsp., 1987, w Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (dalej „Kabat i wsp. (powyż ej)”). Taki system numerowania zastosowano w niniejszym opisie, o ile nie wskazano inaczej.

Oznaczenia reszt wg Kabat'a nie zawsze odpowiadają bezpośrednio liniowemu numerowaniu reszt aminokwasowych. Rzeczywista sekwencja aminokwasowa może zawierać mniej lub więcej aminokwasów niż dokładna numeracja wg Kabat'a, co odpowiada skróceniu lub insercji komponenty strukturalnej, zrębu lub CDR, do podstawowej struktury domeny zmiennej. Prawidłową numerację reszt wg Kabat'a można określić dla danego przeciwciała poprzez przyrównanie reszt homologicznych w sekwencji przeciwciała z sekwencją „standardową” numerowaną wg Kabat'a.

Regiony CDR domeny zmiennej łańcucha ciężkiego są położone pomiędzy resztami 31-35 (CDRH1), resztami 50-65 (CDRH2) i resztami 95-102 (CDRH3) wg numeracji Kabat'a.

Regiony CDR domeny zmiennej łańcucha lekkiego są położone pomiędzy resztami 24-34 (CDRL1), resztami 50-56 (CDRL2) i resztami 89-97 (CDRL3) wg numeracji Kabat'a.

Konstrukcję przeciwciał z przeszczepionym CDR opisano w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym EP-A-0239400, które ujawnia proces przeszczepienia regionów CDR z mysiego przeciwciała monoklonalnego (Mab) do regionów zrębowych domen zmiennych ludzkiej immunoglobuliny za pomocą ukierunkowanej mutagenezy wykorzystującej długie oligonukleotydy.

Wcześniejsza praca nad humanizowaniem Mab poprzez przeszczepienie CDR była prowadzona na Mab rozpoznających syntetyczne antygeny, takie jak NP. Jednakże przykłady, w których mysie Mab rozpoznające lizozym oraz szczurze Mab rozpoznające antygen na ludzkich komórkach T były humanizowane przez przeszczep CDR opisano, odpowiednio, przez Verhoeyen i wsp. (Science, 239, 1534-1536, 1988) i Riechmann i wsp. (Nature, 332, 323-324, 1988).

Riechmann i wsp. ujawnili, że przeniesienie samych regionów CDR (jak określono przez Kabat'a (Kabat i wsp. (powyżej) oraz Wu i wsp., J. Exp. Med., 132, 211-250, 1970)) nie wystarcza do dostarczenia produktowi z przeszczepionym CDR satysfakcjonującej aktywności wiązania antygenu. Ujawniono, że trzeba zmienić wiele reszt zrębowych, aby odpowiadały one tym z donorowego regionu zrębowego. Zaproponowane kryteria wyboru, które z reszt zrębowych powinny być zmienione opisano w Mię dzynarodowym Zgł oszeniu Patentowym nr WO 90/07861.

Opublikowano szereg prac przeglądowych omawiających przeciwciała z przeszczepionym CDR, w tym Vaughan i wsp. (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).

VEGF jest homodimerową glikoproteiną składającą się z dwóch 23kD podjednostek o strukturalnym podobieństwie do PDGF. Odgrywa rozwojowo ważną rolę w procesie powstawania naczyń, tworzenia systemu nowych naczyń krwionośnych i jest wymagany w angiogenezie, przy tworzeniu nowych naczyń z naczyń istniejących wcześniej. Angiogeneza wymaga proliferacji, migracji i infiltracji komórek śródbłonka kapilarnego z istniejących wcześniej naczyń krwionośnych. Poza istotną rolą w prawidłowych procesach fizjologicznych, takich jak rozwój embrionalny, rozwój pęcherzyków (łącznie z tworzeniem ciałka żółtego) oraz gojeniu ran, angiogeneza pojawia się w wielu stanach patologicznych włączając zapalenie, łuszczycę, reumatoidalne zapalenie stawów oraz wzrost nowotworu i przerzuty (Folkman, J i Klagsbrun, M., Science, 235:442-447, 1987). Przykładowo, uważ a się

PL 208 848 B1 powszechnie, że nowotwory nie są w stanie przekroczyć pewnego rozmiaru o ile nie będą miały dostarczonej odpowiedniej ilości krwi poprzez angiogenezę.

VEGF różni się od innych, będących przypuszczalnymi regulatorami angiogenezy in vivo, czynników tym, że jest specyficznym czynnikiem wywołującym angiogenezę komórek śródbłonkowych.

Istnieje pięć różnych monomerycznych form VEGF, powstających w wyniku alternatywnego składanie mRNA. Izoformy te obejmują dwie formy związane z błoną (VEGF206 i VEGF189) oraz trzy formy rozpuszczalne (VEGFi65, VEGF121 i VEGF145). We wszystkich tkankach, z wyjątkiem ludzkiego łożyska, w największej ilości występuje izoforma VEGF165.

Działanie VEGF odbywa się za pośrednictwem jego oddziaływania z dwoma receptorami wysokiego powinowactwa o aktywności kinazy tyrozynowej, receptorem kinazy tyrozynowej typu fms (FLT-1 lub VEGFR-1, Shibuya M. i wsp., Oncogene, 5, 519-524, 1990) oraz KDR (lub VEGFR-2, Terman i wsp., Oncogene, 6, 1677-1683, 1991). Zarówno KDR jak FLT-1 są receptorami bł onowymi, z których każdy zawiera siedem domen podobnych do immunoglobuliny w zewnątrzkomórkowym regionie wiążącym ligand, wewnątrzkomórkową domenę kinazy tyrozynowej i domenę transbłonową. Domena transbłonowa służy do kotwiczenia receptora w błonie komórkowej komórki, w której jest wyrażany.

Istnieje wiele doniesień dotyczących nadprodukcji zarówno VEGF jak i jego receptorów w nowotworach, zarówno na poziomie RNA jak białka (Dvorak i wsp., Curr. dop. Microbiol. Imunol., 237, 97, 1999). Wyrażanie VEGF jest podniesione w odpowiedzi na niedotlenienie, które często występuje w nowotworach i zwiększone stężenie Uganda indukuje ekspresję jego receptorów. Przykłady badań pokazujących zwiększoną ekspresję KDR w nowotworach ludzkich obejmują badania na: raku sutka (Brown i wsp., Hum. Pathol., 26, 86, 1995); raku okrężnicy (Takahashi i wsp., Cancer Res., 55, 3964, 1995); raku nerki (Takahashi i wsp., BBRC 257, 855, 1999) oraz gruczolakoraku przewodu żołądkowo-jelitowego (Brown i wsp., Cancer Res., 53, 4727, 1993). W nowszych badaniach wykorzystujących przeciwciała swoiście rozpoznające VEGF związane z KDR, obserwowano zwiększenie angiogenezy za pośrednictwem szlaku VEGF/KDR w olbrzymiokomórkowym raku płuc (Koukourakis i wsp., Cancer Res., 60, 3088, 2000).

Wiele dowodów doświadczalnych pokazuje przypadkowe powiązanie pomiędzy aktywnością VEGF i angigenezą nowotworową in vivo. Kim i wsp. wstrzykiwał neutralizujące przeciwciało Mab anty-VEGF do niosących raka nagich myszy i wykazał zahamowanie wzrostu nowotworu (Nature 362, 841, 1993). Ekspresja za pomocą retrowirusa dominującego negatywnego mysiego KDR (FLK-1) także hamowała wzrost nowotworu u myszy (Millauer i wsp., Nature, 367, 576, 1993). Podobnie, sekwencja antysensowna VEGF (Cheng i wsp., PNAS, 93, 8502, 1996), przeciwciała anty-FLK-1 (Witte i wsp., Cancer Metast. Rev., 17, 155, 1998) oraz wytwarzanie rozpuszczalnego FLT-1 (Goldman i wsp., PNAS, 95, 8795, 1998) hamowały wzrost nowotworu w modelach mysich.

Szereg dowodów doświadczalnych sugeruje, że biologiczny wpływ VEGF w odniesieniu do angiogenezy odbywa się za pośrednictwem receptora KDR (praca przeglądowa patrz Larrivee i Karsan, Int. J. Mol. Med., 5, 447, 2000).

Pokazano, że aktywacja samego KDR za pośrednictwem VEGF (w liniach komórkowych wytwarzających tylko jeden typ VEGFR) jest wystarczająca do wywołania proliferacji komórek i migracji (Waltenburger i wsp., J. Biol. Chem., 269, 26988, 1994). Przeciwnie, kiedy aktywowany jest sam FLT-1, proliferacja komórek nie jest widoczna, a obserwowana migracja komórek jest zmienna.

Doświadczenia wykorzystujące selektywne wobec receptora mutanty VEGF pokazały, że połączenie z KDR aktywuje kinazę białkową aktywowaną mitogenem (MAPK), co podnosi proliferację, migrację oraz przepuszczalność naczyń (Keyt i wsp., J. Biol. Chem., 271, 5638, 1996). Mutant selektywny dla FLT-1 był w tym teście nieaktywny.

Mab anty-VEGF blokujące oddziaływanie z KDR, lecz nie z FLT-1 było zdolne do hamowania przepuszczalności naczyń indukowanej przez VEGF, podczas gdy nieblokujące przeciwciało antyVEGF nie miało wpływu (Brekken i wsp., Cancer Res., 60, 5117, 2000).

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych Mab skierowanych przeciw mysiemu receptorowi VEGF, FLK-1, za pomocą techniki tworzenia hybrydoma opisano w WO 94/11499. Wykazywały one hamowanie aktywacji receptora FLK-1 poprzez blokowanie oddziaływania VEGF z receptorem. Hamowanie aktywacji receptora było skuteczne w hamowaniu angiogenezy indukowanej przez VEGF w okreś lonych modelach. Dodatkowo, udowodniono skuteczność przeciwciał anty-FLK-1 w leczeniu szeregu mysich nowotworów heteroprzeszczepowych. Jednakże, nie wszystkie przeciwciała, które wiążą się z FLK-1 będą wiązały KDR z powinowactwem wytaczającym wobec skuteczności terapeutycznej.

PL 208 848 B1

Wiązanie VEGF-KDR hamuje także apoptozę nowo powstałych naczyń krwionośnych poprzez aktywację szlaków przekazywania sygnału kinaza PI3 - kinaza Akt za pośrednictwem KDR (kinaza Akt jest dobrze znaną kinazą działającą w dalszych etapach szlaku kinazy PI3 wymaganego do przeżycia komórki, Gerber i wsp., J. Biol. Chem., 273, 30336, 1998). Modele zwierzęce także pokazywały skuteczność blokady odpowiedzi anty-apoptotycznej poprzez blokowanie oddziaływania VEGF-KDR.

Obecnie uważa się, że KDR jest najważniejszym receptorem za pośrednictwem, którego działa VEGF i jego rola w pobudzaniu angiogenezy i przeżywaniu nowych naczyń wydaje się powszechnie uznana.

Zatem, cząsteczka przeciwciała zdolna do wiązania KDR i blokowania jego aktywacji przez VEGF może być korzystna terapeutycznie w leczeniu patologii gdzie zaangażowany jest VEGF i/lub KDR. Przykładowo w przypadkach zapalenia, łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów oraz rozwoju nowotworu. Istnieją również silne argumenty przemawiające za tym, że najlepiej można to osiągnąć poprzez zablokowanie oddziaływania z receptorem KDR. Istnieje zapotrzebowanie na taką cząsteczkę przeciwciała, którą można stosować wielokrotnie oraz łatwo i wydajnie wytwarzać. Istnieje także zapotrzebowanie na cząsteczkę przeciwciała o wysokim powinowactwie do KDR i niskiej immunogenności u ludzi.

Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka przeciwciała o swoistości wobec ludzkiego KDR obejmująca region zmienny łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 15 i region zmienny łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 16. Korzystnie, czą steczka przeciwciał a wedł ug wynalazku zawiera ł a ń cuch lekki obejmujący sekwencję przedstawioną, jako aminokwasy 22 do 235 SEK. NR ID. 11. Również korzystnie, cząsteczka przeciwciała według wynalazku zawiera łańcuch ciężki obejmujący sekwencję przedstawioną, jako SEK. NR ID. 57. Korzystniej, cząsteczka przeciwciała według wynalazku zawiera łańcuch lekki obejmujący sekwencję przedstawioną, jako aminokwasy 22 do 235 SEK. NR ID. 11 i łańcuch ciężki obejmujący sekwencję przedstawioną, jako SEK. NR ID. 57.

Cząsteczka przeciwciała swoista wobec KDR obejmuje łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR (jak zdefiniowano przez Kabat i wsp., (powyżej)) o sekwencji podanej, jako H1 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 1) dla CDRH1, jako H2 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 2) dla CDRH2 lub jako H3 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 3) dla CDRH3.

Cząsteczka przeciwciała obejmuje co najmniej jeden CDR wybrany spośród H1, H2 i H3 (SEK. NR ID.: 1 do SEK. NR ID.: 3) dla domeny zmiennej łańcucha ciężkiego. Cząsteczka przeciwciała obejmuje co najmniej dwa lub wszystkie trzy CDR w domenie zmiennej łańcucha ciężkiego.

Ponadto cząsteczka przeciwciała swoista wobec ludzkiego KDR obejmuje łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR (jak zdefiniowano przez Kabat i wsp., (powyżej)) o sekwencji podanej jako L1 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 4) dla CDRL1, jako L2 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 5) dla CDRL2 lub jako L3 na Fig. 1 (SEK. NR ID.: 6) dla CDRL3.

Cząsteczka przeciwciała obejmuje co najmniej jeden CDR wybrany spośród L1, L2 i L3 (SEK. NR ID.: 4 do SEK. NR ID.: 6) dla domeny zmiennej łańcucha lekkiego. Cząsteczka przeciwciała obejmuje, co najmniej dwa lub wszystkie trzy CDR w domenie zmiennej łańcucha lekkiego.

Takie cząsteczki przeciwciała mogą posiadać, odpowiednio, komplementarny łańcuch lekki lub komplementarny łańcuch ciężki.

Cząsteczka przeciwciała obejmuje łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR (jak zdefiniowano przez Kabat i wsp., (powyżej)) o sekwencji podanej jako H1 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 1) dla CDRH1, jako H2 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 2) dla CDRH2 lub jako H3 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 3) dla CDRH3 oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR (jak zdefiniowano przez Kabat i wsp., (powyż ej)) o sekwencji podanej jako L1 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 4) dla CDRL1, jako L2 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 5) dla CDRL2 lub jako L3 na fig. 1 (SEK. NR ID.: 6) dla CDRL3.

Określone powyżej CDR, podane w SEK. NR ID.: 1 do 6 (fig. 1), pochodzą z mysiego przeciwciała monoklonalnego VR165, które zostało niniejszym opisane. Sekwencję domen zmiennych przeciwciała VR165 przedstawiono na Fig. 2 (SEK. NR ID.: 7 i 8). Regionem stałym łańcucha lekkiego VR165 jest kappa, a regionem stałym łańcucha ciężkiego jest IgG2a. To mysie przeciwciało jest poniżej określane jako „przeciwciało donorowe”.

Ponadto przeciwciało może być cząsteczką chimerowego przeciwciała mysz/człowiek, określanego, jako cząsteczka przeciwciała chimerowego VR165. Cząsteczka przeciwciała chimerowego VR165 obejmuje domeny zmienne mysiego Mab VR165 (SEK. NR ID.: 7 i 8) oraz ludzkie domeny stałe. Cząsteczka przeciwciała chimerowego VR165 obejmuje ludzką domenę C kappa (Hieter i wsp.,

PL 208 848 B1

Cell, 22, 197-207, 1980; numer dostępu w Genebank J00241) w łańcuchu lekkim oraz ludzkie domeny gamma 4 (Flanagan i wsp., Nature, 300, 709-713, 1982) w łańcuchu ciężkim.

Dodatkowo przeciwciało może być cząsteczką przeciwciała z przeszczepionym CDR. W użytym tu znaczeniu termin „cząsteczka przeciwciała z przeszczepionym CDR” określa cząsteczkę przeciwciała, w której łańcuch ciężki i/lub lekki obejmuje jeden lub więcej CDR z przeciwciała donorowego (np. mysiego Mab) przeszczepiony do regionu zrębowego zmiennego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała akceptorowego (np. przeciwciała ludzkiego).

Takie przeciwciało z przeszczepionym CDR posiada domenę zmienną obejmującą ludzkie akceptorowe regiony zrębowe, jak również jeden lub większą liczbę określonych powyżej donorowych CDR.

Kiedy CDR są przeszczepiane, można zastosować odpowiednią sekwencję akceptorowego regionu zrębowego zmiennego biorąc pod uwagę klasę/typ przeciwciała donorowego, z którego pochodzą CDR, włączając regiony zrębowe myszy, naczelnych i człowieka. Przykładami ludzkich regionów zrębowych, które można użyć według niniejszego wynalazku są KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat i wsp. (powyżej)). Przykładowo, KOL i NEWM można zastosować w łańcuchu ciężkim, REI można zastosować w łańcuchu lekkim oraz EU, LAY i POM można zastosować zarówno w ł a ń cuchu ciężkim jak i lekkim.

Korzystnymi regionami zrębowymi dla łańcucha ciężkiego są regiony zrębowe grupy 3 ludzkiej linii zarodkowej przedstawione na Fig. 3 (VH3-7 GL, SEK. NR ID.: 9). Korzystnymi regionami zrębowymi dla łańcucha lekkiego są regiony zrębowe sekwencji grupy 1 ludzkiej linii zarodkowej przedstawione na fig. 3 (A30 GL, SEK. NR ID.: 10).

Do przeciwciała z przeszczepionym CDR możliwe jest zastosowanie, jako przeciwciała akceptorowego takiego, które posiada łańcuchy homologiczne z łańcuchami przeciwciała donorowego. Nie jest koniecznie wymagane, aby ciężkie i lekkie łańcuchy akceptorowe pochodziły z tego samego przeciwciała i mogą one, o ile jest do pożądane, obejmować złożone łańcuchy posiadające regiony zrębowe pochodzące z różnych łańcuchów.

Także, nie jest konieczne, aby regiony zrębowe w przeciwciałach z przeszczepionym CDR posiadały dokładnie taką samą sekwencję jak ta w przeciwciele akceptorowym. Przykładowo, reszty rzadko występujące można zmienić na reszty częściej występujące w klasie lub typie łańcuchów akceptorowych. Alternatywnie, wybrane reszty w akceptorowych regionach zrębowych można zmienić tak, aby odpowiadały reszcie w tej samej pozycji w przeciwciele donorowym. Takie zmiany powinny być ograniczone do minimum koniecznego do odzyskania powinowactwa przeciwciała donorowego. Protokół do selekcji reszt w akceptorowych regionach zrębowych, które mogą wymagać zmiany przedstawiono w WO 91/09967.

W czą steczce przeciwciał a z przeszczepionym CDR, kiedy akceptorowy ł a ń cuch ciężki posiada regiony zrębowe grupy 3 ludzkiej linii zarodkowej (przedstawione na Fig. 3) (SEK. NR ID.: 9), to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha ciężkiego obejmują, dodatkowo do jednego lub kilku donorowych CDR, reszty donorowe w pozycjach 77 i 93 (według Kabat'a i wsp. (powyżej)).

W czą steczce przeciwciała z przeszczepionym CDR, kiedy akceptorowy ł a ń cuch lekki posiada regiony zrębowe ludzkiej grupy 1 (przedstawione na Fig. 3) (SEK. NR ID.: 10), to akceptorowe regiony zrębowe łańcucha lekkiego obejmują reszty donorowe w pozycjach 36, 44, 60, 66, 69, 70 i 71 (według Kabat'a i wsp. (powyżej)).

Reszty donorowe są resztami z przeciwciała donorowego, tzn. z przeciwciała, z którego pochodzą CDR.

Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku może obejmować: całą cząsteczkę przeciwciała, posiadającą pełnej długości łańcuch ciężki i lekki; ich fragment, taki jak Fab, zmodyfikowany Fab, di-Fab, di-(zmodyfikowany Fab), Fab', F(ab')2 lub fragment Fv; monomer lub dimer łańcucha lekkiego lub łańcucha ciężkiego; przeciwciało o pojedynczym łańcuchu, np. Fv o pojedynczym łańcuchu, w którym domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego są połączone peptydowym łącznikiem. Podobnie, domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego można odpowiednio połączyć z innymi domenami przeciwciała.

Korzystnie cząsteczką przeciwciała według wynalazku jest fragment Fab, który posiada łańcuch lekki o sekwencji podanej, jako SEK. NR ID.: 11 (Fig. 4) i łańcuch ciężki o sekwencji podanej jako SEK. NR ID.: 12 (fig. 5). Sekwencje aminokwasowe podane w SEK. NR ID.: 11 i SEK. NR ID.: 12 są kodowane odpowiednio przez sekwencje nukleotydowe podane w SEK. NR ID.: 13 i SEK. NR ID.: 14 (fig. 4 i fig. 5).

PL 208 848 B1

Cząsteczka przeciwciała według wynalazku jest korzystnie zmodyfikowanym fragmentem Fab posiadającym na końcu C łańcucha ciężkiego jeden lub więcej aminokwasów, które tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną lub dwie reszty cysteinowe, do których może być przyłączona cząsteczka efektorowa lub reporterowa. Korzystniej cząsteczka przeciwciała według wynalazku jest zmodyfikowanym fragmentem Fab obejmującym łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej jako aminokwasy 22 do 235 SEK. NR ID.: 11 i łańcuch ciężki o sekwencji przedstawionej, jako aminokwasy 22 do 249 SEK. NR ID.: 12.

Sekwencje aminokwasowe podane w SEK. NR ID.: 11 i SEK. NR ID.: 12 są kodowane odpowiednio przez sekwencje nukleotydowe podane w SEK. NR ID.: 13 i SEK. NR ID.: 14.

Cząsteczką przeciwciała według wynalazku może być fragment di-(zmodyfikowany Fab), w którym modyfikacją jest dodanie do końca C każdego z łańcuchów ciężkich Fab jednego lub większej liczby aminokwasów pozwalających na przyłączenie jednego łańcucha do innego takiego łańcucha i czą steczki efektorowej lub reporterowej. Dodatkowe aminokwasy mogą tworzyć zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną, dwie lub trzy reszty cysteinowe, do których może być przyłączony inny Fab, cząsteczki efektorowe lub reporterowe.

Przedmiotem wynalazku jest związek obejmujący cząsteczkę przeciwciała według wynalazku posiadający cząsteczkę efektorowa lub reporterowa kowalencyjnie przyłączoną do reszty cysteinowej w zmodyfikowanym regionie zawiasowym. Korzystnie czą steczka efektorowa obejmuje jeden lub więcej polimerów.

Korzystną grupą efektorowa jest cząsteczka polimeru, którą można przyłączyć do zmodyfikowanego fragmentu Fab lub di-(zmodyfikowanego Fab) w celu podniesienia jego okresu półtrwania in vivo.

Korzystnie cząsteczka polimeru może być polimerem syntetycznym lub występującym w naturze, przykładowo ewentualnie podstawionym prostym lub rozgałęzionym polimerem polialkilenowym, polialkenylenowym lub polioksyalkilenowym albo rozgałęzionym lub nierozgałęzionym polisacharydem, np. homo- lub hetero- polisacharydem.

Na wspomnianych powyżej syntetycznych polimerach mogą być obecne ewentualnie szczególne podstawniki obejmujące jedną lub większą liczbę grup hydroksylowych, metylowych lub metoksylowych. Szczególne przykłady polimerów syntetycznych obejmują ewentualnie podstawione prosty lub rozgałęziony glikol poli(oksy)etylenowy, glikol polipropylenowy, poli(alkohol winylowy) lub ich pochodne, w szczególności ewentualnie podstawiony glikol poli(oksy)etylenowego, taki jak glikol metfoksypoli(oksy)etylenowy lub jego pochodne.

W korzystnej postaci wykonania zwią zek wedł ug wynalazku zawiera glikole metoksypoli(oksy)etylenowe.

Szczególne, naturalnie występujące polimery obejmują laktozę, amylozę, dekstran, glikogen lub ich pochodne. W użytym tu znaczeniu „pochodne” obejmują pochodne reaktywne, przykładowo reaktywne grupy tiolo-selektywne, takie jak maleimidy i tym podobne. Grupa reaktywna może być podłączona do polimeru bezpośrednio lub poprzez segment łącznikowy. Powinno być rozumiane, że reszta takiej grupy będzie w pewnych przypadkach tworzyła część produktu w postaci grupy łącznikowej pomiędzy fragmentem przeciwciała a polimerem.

Wielkość polimeru może być różna w zależności od potrzeb, lecz zazwyczaj mieści się średnio w zakresie masy cząsteczkowej od 500Da do 50000Da, korzystnie od 5000 do 40000Da i korzystniej od 25000 do 40000Da. Wielkość polimeru można w szczególności wybrać na podstawie przeznaczenia produktu.

Szczególnie korzystne polimery obejmują polimer polialkilenowy, taki jak glikol poli(oksy)etylenowy lub, w szczególności, glikol metoksypoli(oksy)etylenowy lub ich pochodne, a w szczególności o masie czą steczkowej w zakresie od okoł o 25000Da do okoł o 40000Da.

Każda cząsteczka polimeru połączona ze zmodyfikowanym fragmentem przeciwciała może być kowalencyjnie połączona z atomem siarki zlokalizowanym we fragmencie reszty cysteinowej. Połączenie kowalencyjne będzie zazwyczaj wiązaniem disiarczkowym lub, w szczególności, wiązaniem siarka-węgiel.

Tam gdzie jest to pożądane, fragment przeciwciała może mieć przyłączoną jedną lub większą liczbę cząsteczek efektorowych lub reporterowych. Cząsteczki efektorowe lub reporterowe mogą być przyłączone do fragmentu przeciwciała poprzez dostępną aminokwasową grupę funkcyjną łańcucha bocznego lub aminokwasową grupę funkcyjną terminalną położoną we fragmencie, przykładowo przez wolną grupę aminową, iminową, hydroksylową lub karboksylową.

PL 208 848 B1

Aktywowany polimer można zastosować jako materiał wyjściowy do wytwarzania opisanych powyżej fragmentów przeciwciała zmodyfikowanych polimerem. Aktywowany polimer może być dowolnym polimerem zawierającym tiolową grupę reaktywną, taką jak kwas α-halogenokarboksylowy lub ester, np. jodoacetamid, imid, np. maleimid, winylosulfon lub disulfid. Taki materiał wyjściowy można otrzymać handlowo (przykładowo z Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) lub można wytworzyć z dostępnych na rynku materiałów wyjściowych stosując klasyczne procedury chemiczne.

Odpowiednią literaturą w odniesieniu do przyłączania cząstek glikolu poli(oksy)etylenowego (PEG) jest „Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (wyd.), Plenum Press, New York, „Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris i S. Zalipsky (wyd.), American Chemical Society, Washington DC i „Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam i A. Dent, Grove Publishers, New York.

Kiedy jest pożądane uzyskanie fragmentu przeciwciała połączonego z cząsteczką efektorowa lub reporterowa, może on być wytworzony przy pomocy standardowych procedur chemicznych lub rekombinacji DNA, w których fragment przeciwciała jest odpowiednio połączony, bezpośrednio bądź poprzez czynnik sprzęgający, z cząsteczką efektorowa lub reporterowa przed lub po reakcji z aktywowanym polimerem. Określone procedury chemiczne obejmują, przykładowo, te opisane w WO 93/06231, WO 92/22583, WO 90/09195 i WO 89/01476. Alternatywnie, kiedy cząsteczka efektorowa lub reporterowa jest białkiem lub polipeptydem łącznik można uzyskać stosując procedury rekombinacji DNA, przykładowo jak opisano w WO 86/01533 i EP-A-0392745.

Korzystnie, zmodyfikowany fragment Fab lub di-Fab według niniejszego wynalazku jest modyfikowany PEG (tzn. posiada kowalencyjnie przyłączony PEG (glikol poli(oksy)etylenowy) lub mPEG (glikol metoksypoli(oksy)etylenowy)) zgodnie z metodami ujawnionymi w EP-A-0948544 i EP-A-1090037. Korzystnie cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku jest zmodyfikowanym PEG fragmentem Fab jak pokazano na fig. 6 lub fragmentem di-(zmodyfikowanym Fab). Jak pokazano na fig. 6, zmodyfikowany fragment Fab posiada grupę maleimidu kowalencyjnie połączoną z pojedynczą grupą tiolową w zmodyfikowanym regionie zawiasowym. Reszta lizyny jest kowalencyjnie połączona z grupą maleimidową. Do wszystkich grup aminowych w reszcie lizyny jest przyłączony polimer glikolu metoksypoli(oksy)etylenowego o masie cząsteczkowej około 20000 Da. Całkowita masa cząsteczkowa całej cząsteczki efektorowej wynosi, zatem średnio 40000 Da. Podobnie każdy mPEG może być połączony z resztą lizyny kowalencyjnie przyłączonej do linkera bis-maleimidowego jak opisano w EP-A-1090037 tworząc PEG di-(zmodyfikowany Fab) według wynalazku.

Szczególnie korzystną postacią wykonania jest związek obejmujący cząsteczkę przeciwciała według wynalazku, posiadający grupę lizylo-maleimidową lub lizylo bis-maleimidową przyłączoną do jednej z reszt cysteinowych na końcu C łańcucha ciężkiego, przy czym każda z grup aminowych reszty lizylowej jest kowalencyjnie połączona z resztą glikolu metoksypoli(oksy)etylenowego o masie cząsteczkowej wynoszącej około 20000 Da.

Inną szczególnie korzystną postacią wykonania jest związek obejmujący cząsteczkę przeciwciała według wynalazku, który jest PEGylowanym di-(modyfikowanym Fab), przy czym każdy ze zmodyfikowanych Fab obejmuje łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej, jako aminokwasy 22 do 235 SEK. NR ID.: 11 i łańcuch ciężki przedstawiony, jako aminokwasy 22 do 249 SEK. NR ID.: 12. Korzystnie PEGylowany di-(modyfikowany Fab) obejmuje co najmniej jedną cząsteczkę mPEG, która korzystniej jest przyłączona do reszty lizynowej kowalencyjnie związanej do linkera bis-maleimidowego. Najkorzystniej w PEGylowanym di-(modyfikowanym Fab) według wynalazku każda cząsteczka mPEG ma masę cząsteczkową wynoszącą około 20000 Da.

W związku pokazanym na Fig. 6, łańcuch ciężki części przeciwciała posiada sekwencję podaną, jako SEK. NR ID.: 12, a łańcuch lekki posiada sekwencję podaną w SEK. NR ID.: 11.

Domeny regionu stałego cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, jeśli obecne, można wybrać ze względu na proponowaną funkcję cząsteczki przeciwciała, a w szczególności na wymagane funkcje efektorowe. Przykładowo, domenami regionu stałego mogą być ludzkie domeny IgA, IgD, IgE, IgG lub IgM. W szczególności można zastosować domeny regionu stałego ludzkiego IgG, zwłaszcza z izotypów IgG1 i IgG3, kiedy cząsteczka przeciwciała ma być użyta w celach terapeutycznych i wymagane są funkcje efektorowe przeciwciała. Alternatywnie, można zastosować izotypy IgG2 i IgG4, wówczas gdy cząsteczka przeciwciała ma być użyta w celach terapeutycznych i nie są wymagane funkcje efektorowe przeciwciała, np. do prostego blokowania ligacji KDR przez VEGF.

PL 208 848 B1

Cząsteczka przeciwciała według wynalazku może posiadać przyłączoną do niej cząsteczkę efektorowa lub reporterowa. Na przykład, może posiadać makrocykl, do chelatowania atomów metali ciężkich, lub toksynę, taką jak rycyna, przyłączone do niego poprzez strukturę mostka kowalencyjnego. Alternatywnie, procedury technologii rekombinacji DNA można wykorzystać do wytwarzania cząsteczki przeciwciała, w której fragment Fc (CH2, CH3 oraz domeny zawiasowe), domeny CH2 i CH3 lub domena CH3 całej cząsteczki immunoglobuliny, jest (są) wymienione, lub do której jest przyłączony łącznik peptydowy, funkcjonalne białko niebędące immunoglobuliną, takie jak enzym lub cząsteczka toksyny.

Cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku posiada powinowactwo wiązania 0,4x10^-10 M. Cząsteczka przeciwciała według wynalazku obejmuje domenę zmienną łańcucha ciężkiego gH3 (SEK. NR ID.: 15) i domenę zmienną łańcucha lekkiego gL3 (SEK. NR ID.: 16). Sekwencje domen zmiennych tych lekkich i ciężkich łańcuchów przedstawiono na fig. 7.

Niniejszym opisano także warianty cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, które mają większe powinowactwo do KDR. Warianty takie można uzyskać za pomocą szeregu protokołów dojrzewania powinowactwa, łącznie z mutowaniem CDR (Yang i wsp., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), tasowanie łańcucha (Marks i wsp., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), zastosowanie mutatorowych szczepów E. coli (Low i wsp., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), tasowanie DNA (Patten i wsp., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), prezentację na fagu (Thompson i wsp., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) i płciowy PCR (Crameri i wsp., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan i wsp. (powyżej) omawia metody dojrzewania powinowactwa.

Niniejszy wynalazek także dostarcza sekwencję DNA kodującą ciężki i/lub lekki łańcuch(y) cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku, przykładowo jak opisano tu na figurach.

Sekwencja DNA według niniejszego wynalazku może obejmować syntetyczny DNA, przykładowo wytworzony procedurami chemicznymi, cDNA, genomowy DNA lub dowolną ich kombinację.

Niniejszy wynalazek także dotyczy wektora do klonowania lub do ekspresji obejmującego jedną lub więcej sekwencji DNA według wynalazku. Korzystnie, wektor do klonowania lub do ekspresji obejmuje dwie sekwencje DNA, kodujące odpowiednio łańcuch lekki i łańcuch ciężki cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku.

W korzystnym wykonaniu, niniejszy wynalazek dostarcza wektor ekspresyjny dla E. coli obejmujący sekwencję DNA według wynalazku. Korzystnie wektorem ekspresyjnym jest pTTOD(CDP791) jak przedstawiono schematycznie na fig. 8.

Ogólne sposoby za pomocą, których można skonstruować wektory, sposoby transfekcji i sposoby hodowania są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. W związku z nimi, niniejszym odniesiono się do „Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (wyd.), Wiley Interscience, New York oraz Maniatis Manual wydany przez Cold Spring Harbor Publishing.

Sekwencje DNA, które kodują cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można uzyskać sposobami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie. Przykładowo, sekwencje DNA kodujące część lub cały łańcuch ciężki i lekki przeciwciała można syntetyzować, jeśli jest to pożądane na podstawie ustalonych sekwencji DNA lub na podstawie odpowiadających sekwencji aminokwasowych.

DNA kodujący akceptorowe sekwencje zrębowe jest szeroko dostępny specjalistom w dziedzinie i może być z łatwością zsyntetyzowany na podstawie ich znanych sekwencji aminokwasowych.

Do wytworzenia sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można zastosować standardowe techniki biologii molekularnej. Pożądane sekwencje DNA można syntetyzować w całości lub częściowo przy użyciu technik syntezy oligonukleotydów. Jeśli jest to wskazane można zastosować technikę ukierunkowanej mutagenezy i reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).

Do ekspresji sekwencji DNA kodujących cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można zastosować dowolny stosowny system komórka gospodarza/wektor. Przedmiotem wynalazku jest, zatem komórka gospodarza stransformowana wektorem według wynalazku.

Systemy bakteryjne, przykładowo E. coli, i innych mikroorganizmów można, częściowo, zastosować do wytwarzania fragmentów przeciwciał takich jak fragmenty Fab, di-(zmodyfikowany Fab) i F(ab')2, a w szczególnoś ci dla fragmentów Fv oraz jedno ł a ń cuchowych fragmentów przeciwciał , przykładowo, pojedynczego łańcucha Fvs. Systemy ekspresyjne w eukariotycznych komórkach gospodarza, np. ssaczych, można zastosować do wytwarzania większych cząsteczek przeciwciał, włączając cząsteczki całych przeciwciał. Stosowne ssacze komórki gospodarzy obejmują komórki CHO, szpiczaka lub hybrydoma.

PL 208 848 B1

Niniejszy wynalazek także dostarcza procesu wytwarzania cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmującego: hodowlę komórki gospodarza zawierającej wektor według niniejszego wynalazku, w warunkach stosownych do wytwarzania białka dzięki ekspresji DNA kodującego cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku, oraz izolację cząsteczki przeciwciała.

Korzystnie proces wytwarzania cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku obejmuje hodowlę E. coli, obejmującej wektor ekspresyjny dla E. coli zawierający sekwencję DNA według niniejszego wynalazku, w warunkach stosownych do wytwarzania białka dzięki ekspresji sekwencji DNA, oraz izolację cząsteczki przeciwciała. Cząsteczka przeciwciała może być wydzielana z komórki lub wprowadzana do periplazmy dzięki stosownym sekwencjom sygnałowym. Alternatywnie, cząsteczki przeciwciała mogą gromadzić się w cytoplazmie komórkowej. Korzystnie w sposobie według wynalazku cząsteczka przeciwciała jest wprowadzana do periplazmy. W zależności od wytwarzanej cząsteczki przeciwciała i stosowanego procesu, pożądane jest, aby pozwolić cząsteczce przeciwciała na fałdowanie i przyjęcie funkcjonalnej konformacji. Specjalistom w dziedzinie dobrze są znane procedury pozwalające na fałdowanie cząsteczek przeciwciała.

Cząsteczka przeciwciała może obejmować tylko polipeptyd łańcucha ciężkiego lub lekkiego, w którym to przypadku do transfekcji komórek gospodarza potrzebna jest tylko sekwencja kodują ca polipeptyd łańcucha ciężkiego lub łańcucha lekkiego. Do wytwarzania produktów obejmujących oba łańcuchy, ciężki i lekki, linia komórkowa może być transfekowana dwoma wektorami, pierwszym wektorem kodującym polipeptyd łańcucha lekkiego i drugim wektorem kodującym polipeptyd łańcucha ciężkiego. Alternatywnie, można zastosować pojedynczy wektor, który zawiera sekwencje kodujące polipeptydy łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego.

Niniejszy wynalazek dostarcza także kompozycji terapeutycznej lub diagnostycznej obejmującej cząsteczkę przeciwciała lub związek według niniejszego wynalazku w kombinacji z farmaceutycznie dopuszczalną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.

Niniejszym opisano także proces wytwarzania kompozycji terapeutycznej lub diagnostycznej obejmujący zmieszanie cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku wraz z farmaceutycznie dopuszczoną zaróbką, rozcieńczalnikiem lub nośnikiem.

Cząsteczka przeciwciała może być jedynym aktywnym składnikiem w kompozycji terapeutycznej lub diagnostycznej lub mogą jej towarzyszyć inne aktywne składniki, łącznie z innymi składnikami będącymi przeciwciałami, przykładowo przeciwciałami przeciwko komórkom T, anty-IFNY lub antyLPS, albo składniki niebędące przeciwciałami, takie jak ksantyny.

Kompozycje farmaceutyczne powinny korzystnie obejmować terapeutycznie skuteczną ilość przeciwciała według wynalazku. W użytym tu znaczeniu termin „terapeutycznie skuteczna ilość” odnosi się do ilości czynnika terapeutycznego potrzebnego do leczenia, łagodzenia objawów lub zapobiegania konkretnej chorobie lub stanom chorobowym, lub do wykazania widocznego skutku terapeutycznego lub zapobiegawczego. Dla każdego przeciwciała, terapeutycznie skuteczną dawkę można oszacować początkowo albo w testach z hodowlami komórkowymi lub na modelach zwierzęcych, zazwyczaj na gryzoniach, królikach, psach, świniach lub naczelnych. Model zwierzęcy można także zastosować do określenia odpowiedniego zakresu stężenia i drogi podawania. Informacje takie można następnie zastosować do określenia przydatnych dawek i dróg podawania u ludzi.

Precyzyjna skuteczna ilość dla człowieka będzie zależała od ciężkości stanu chorobowego, ogólnego stanu zdrowia osobnika, wieku, wagi, płci osobnika, diety, czasu i częstości podawania, kombinacji leku(ów), czułości odpowiedzi i tolerancji/odpowiedzi na terapię. Ilość tę można określić poprzez rutynowe doświadczenia i jest to w gestii lekarza.

Ogólnie, skuteczna dawka będzie od 0,01 mg/kg do 50 mg/kg, korzystnie 0,1 mg/kg do 20 mg/kg, korzystniej około 15 mg/kg.

Kompozycję można podawać pacjentowi pojedynczo lub można podawać w kombinacji z innymi czynnikami, lekami lub hormonami.

Dawka, w jakiej jest podawana cząsteczka przeciwciała według niniejszego wynalazku zależy od natury leczonego stanu chorobowego stopnia, w jakim poziom przeznaczonego do neutralizowania VEGF jest, lub ma być podwyższony ponad pożądany poziom i od tego czy cząsteczka przeciwciała jest stosowana profilaktycznie czy w leczeniu istniejącego stanu chorobowego. Dawka będzie także wybrana na podstawie wieku i stanu pacjenta.

Zatem, przykładowo, kiedy produkt służy do leczenia lub do profilaktyki przewlekłej choroby zapalnej, takiej jak reumatoidalne zapalenie stawów, skuteczne dawki cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku leżą w zakresie pomiędzy 0,5 i 50 mg/kg, korzystniej pomiędzy 1 i 20 mg/kg

PL 208 848 B1 i najkorzystniej okoł o 15 mg/kg. Czę stość podawania dawki bę dzie zale ż a ła od okresu pół trwania czą steczki przeciwciała i czasu trwania jej efektu.

Jeśli cząsteczka przeciwciała posiada krótki okres półtrwania (np. 2 do 10 godz.) może być konieczne podanie jednej lub większej liczby dawek dziennie. Alternatywnie, jeśli cząsteczka przeciwciała posiada długi okres półtrwania (np. 2 do 15 dni) może być konieczne podanie tylko jednej dawki dziennie, tygodniowo lub nawet jednej, co 1 lub 2 miesiące.

Kompozycja farmaceutyczna może także zawierać farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do podawania przeciwciał. Nośnik nie powinien sam indukować wytwarzania przeciwciał szkodliwych dla osobnika otrzymującego kompozycję i nie powinien być toksyczny. Stosowne nośniki mogą być dużymi, powoli metabolizowanymi cząsteczkami takimi jak białka, polipeptydy, liposomy, polisacharydy, poli(kwasy mlekowe), poli(kwasy glikolowe), aminokwasy polimeryczne, kopolimery aminokwasów i cząstki nieaktywnych wirusów.

Można zastosować farmaceutyczne dopuszczone sole, przykładowo sole kwasów mineralnych, takie jak chlorowodorki, bromowodorki, fosforany i siarczany, lub sole kwasów organicznych, takie jak octany, propioniany, maloniany i benzoesany.

Farmaceutycznie dopuszczalne nośniki w kompozycjach terapeutycznych mogą dodatkowo zawierać ciecze takie jak woda roztwór soli fizjologicznej, glicerol lub etanol. Dodatkowo w kompozycjach takich mogą być obecne substancje pomocnicze, takie jak czynniki zwilżające lub emulgujące czy substancje buforujące pH. Takie nośniki umożliwiają preparowanie kompozycji w postaci tabletek, pigułek, drażetek, kapsułek, płynów, żeli, syropów, rzadkich zawiesin i zawiesin do spożywania przez pacjenta.

Korzystne formy podawania obejmują formy stosowne do podawania pozajelitowego, np. przez wstrzyknięcie lub infuzję, przykładowo przez wstrzyknięcie bolusa lub przez ciągłą infuzję. Produkt do wstrzyknięcia lub infuzji może mieć formę zawiesiny, roztworu lub emulsji w nośniku oleistym lub wodnym i może zawierać czynniki formujące, takie jak czynniki zawieszające, konserwujące, stabilizujące i/lub rozpraszające. Alternatywnie, cząsteczka przeciwciała może być w formie suchej, do odtworzenia przed użyciem przy użyciu odpowiedniego sterylnego płynu.

Raz przygotowane, kompozycje według niniejszego wynalazku można bezpośrednio podawać osobnikowi. Osobnikami mogą być zwierzęta. Jednakże, korzystne jest, jeśli kompozycje są przystosowane do podawania ludziom.

Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać za pomocą dowolnych dróg podawania w tym, lecz nie ograniczająco, doustnie, dożylnie, domięśniowo, dotętniczo, wewnątrzrdzeniowo, dooponowo, dokomorowo, śródskórnie, przezskórnie (przykładowo, patrz WO98/20734), podskórnie, dootrzewnowo, donosowo, dojelitowo, miejscowo, podjęzykowo, dopochwowo lub doodbytniczo. W podawaniu kompozycji farmaceutycznych według wynalazku można także zastosować hipospray. Zazwyczaj, kompozycje farmaceutyczne można przygotować, jako gotowe do wstrzyknięcia, w postaci płynnych roztworów lub zawiesin. Można także przygotować formy stałe stosowne do rozpuszczenia lub zawieszenia w płynnych nośnikach przed wstrzyknięciem.

Bezpośrednie dostarczenie kompozycji będzie zazwyczaj osiągnięte przez wstrzyknięcie podskórne, dootrzewnowe, dożylne lub domięśniowe lub przez dostarczenie do przestrzeni śródmiąższowej tkanki. Kompozycje można także podawać do zmiany chorobowej. Dawkowanie może być stosowane w schemacie pojedynczej dawki lub wielu dawek.

Należy podkreślić, że aktywnym składnikiem w kompozycji będzie cząsteczka przeciwciała. Jako taka, będzie ona podatna na degradację w przewodzie żołądkowo-jelitowym. Zatem, jeśli kompozycja ma być podawana drogą przewodu żołądkowo-jelitowego, kompozycja powinna zawierać czynniki, które chronią przeciwciało przed degradacją, lecz które po adsorbowaniu z przewodu żołądkowojelitowego uwalniają przeciwciała.

Dokładne omówienie farmaceutycznie dopuszczalnych nośników jest dostępne w Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

Przeciwciało według niniejszego wynalazku może być dostarczane na drodze terapii genowej. W celu osią gnię cia tego, sekwencje DNA kodujące ł a ń cuch ciężki i lekki czą steczki przeciwciał a pod kontrolą odpowiednich komponentów DNA są wprowadzone do pacjenta tak, że łańcuchy przeciwciał ulegają ekspresji z sekwencji DNA i powstające łańcuchy przeciwciał są składane in situ.

Ponadto niniejszy wynalazek dostarcza cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku do zastosowania w leczeniu choroby, w którą zaangażowane są VEGF i/lub KDR.

PL 208 848 B1

Niniejszy wynalazek dalej dostarcza zastosowanie cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku do wytwarzania leku do leczenia choroby, w którą zaangażowane są VEGF i/lub KDR.

Cząsteczkę przeciwciała lub związek według niniejszego wynalazku można wykorzystać w terapii, w której pożądane jest zredukowanie poziomu biologicznie aktywnego KDR obecnego w ciele człowieka lub zwierzęcia. VEGF może krążyć w ciele lub być obecne na niepożądanie wysokim poziomie w określonym miejscu ciała.

Przykładowo, VEGF (i zatem KDR) jest zaangażowany w szereg patologicznych stanów włączając zapalenie, łuszczycę, reumatoidalne zapalenie stawów oraz rozwój nowotworu i przerzuty.

Niniejszym opisano sposoby leczenia człowieka lub zwierzęcia cierpiącego na lub z ryzykiem zaburzenia, w które zaangażowane są VEGF i/lub KDR, przy czym sposób ten obejmuje podawanie osobnikowi skutecznej ilości cząsteczki przeciwciała według niniejszego wynalazku.

Cząsteczkę przeciwciała według niniejszego wynalazku można także stosować w diagnostyce, przykładowo do diagnozowania in vivo i uwidaczniania stanów chorobowych związanych z podniesionymi poziomami KDR.

Niniejszy wynalazek jest dalej opisany w celu zilustrowania poprzez następujące przykłady odnoszące się do towarzyszących figur:

Fig. 1 przedstawia sekwencje CDR regionów V łańcucha ciężkiego i lekkiego genu mysiego monoklonalnego przeciwciała VR165 (SEK. NR ID.: 1-6).

Fig. 2 przedstawia sekwencję białka domeny VH i VL mysiego monoklonalnego przeciwciała VR165 (SEK. NR ID.: 7 i SEK. NR ID.: 8).

Fig. 3 przedstawia sekwencje białka regionu V wybrane, jako akceptorowe sekwencje zrębowe ludzkiej linii pierwotnej. VH3-7 GL jest genem VH ludzkiej linii pierwotnej (SEK. NR ID.: 9). A30 GL odnosi się genu sekwencji A30 ludzkiej linii pierwotnej VL (SEK. NR ID.: 10). W każdym przypadku sekwencja linii pierwotnej zrębu 4 jest dostarczona odpowiednio przez ludzką linię pierwotną JH4 i JK1.

Fig. 4 przedstawia sekwencję aminokwasową i nukleotydową łańcucha lekkiego CDP791 Fab (SEK. NR ID.: 11 i SEK. NR ID.: 13).

Fig. 5 przedstawia sekwencję aminokwasową i nukleotydową łańcucha ciężkiego CDP791 Fab (SEK. NR ID.: 12 i SEK. NR ID.: 14).

Fig. 6 przedstawia strukturę zmodyfikowanego fragmentu Fab pochodzącego z przeciwciała VR165 kowalencyjnie podłączonego poprzez resztę cysteinową do łącznika lizylo-maleimidowego, w którym każ da grupa aminowa w reszcie lizylowej posiada kowalencyjnie przyłączoną resztę metoksyPEG, gdzie n wynosi około 420;

Fig. 7 przedstawia sekwencje białka dla genów optymalnych domen VH i VL z przeszczepionym CDR (SEK. NR ID.: 15 i SEK. NR ID.: 16).

Fig. 8 przedstawia optymalny plazmid pTTOD(CDP7 91), który obejmuje wariant IGS-2 pomiędzy przeszczepami gL3 i gH3. Fig. 9 przedstawia sekwencję białka zaprojektowanych przeszczepów VH i VL (gH1-3 i gL1-3, SEK. NR ID.: 17-22). Przeszczep gH1 nie zawiera mysich reszt zrębowych. Przeszczep gH2 zawiera mysie reszty zrębowe w pozycjach 77 i 93 (numeracja wg Kabat'a). Zarówno T jak i S są wspólne w sekwencjach ludzkiej linii zarodkowej w pozycji 77, tak, ż e włączenie T jest nadal spójne z resztą ludzką. Wydaje się, że V w pozycji 93 jest ważne na styku VH/VL. Włączenie ludzkich reszt w 60 i 62 odpowiada zmianom w części CDR-H2 na końcu C. Przeszczep gL2 zawiera reszty mysie w pozycjach 60, 66, 69, 70 i 71 (numeracja wg Kabat'a) . Przeszczep gL3 zawiera dodatkowe reszty mysie w pozycjach 36 i 44).

Fig. 10 przedstawia projekt genów kodujących przeszczepy gH1 i gL1 (SEK. NR ID.: 23 i SEK. NR ID.: 24).

Fig. 11 przedstawia oligonukleotydy zastosowane do złożenia genów kodujących przeszczepy gL1 i gH1 (SEK. NR ID.: 25-40). Fig. 12 przedstawia plazmidy pCR2.1(gH1) i pCR2.1(gL1), które zawierają odpowiednio przeszczepy gH1 i gL1.

Fig. 13 przedstawia kasety oligonukleotydowe zastosowane do konstrukcji przeszczepów gH2, gH3, gL2 i gL3 (SEK. NR ID.: 41-44).

Fig. 14 przedstawia pary oligonukleotydów zastosowane do konstrukcji przeszczepów gH2, gH3, gL2 i gL3 (SEK. NR ID.: 45-52).

Fig. 15 przedstawia plazmidy pGamma4 i pMR10.1, do których subklonowano odpowiednio przeszczepy VH i VL w celu uzyskania ekspresji w linii komórkowej CHO.

PL 208 848 B1

Fig. 16 przedstawia plazmid pTTOD do ekspresji Fab' w E. coli, w tym przypadku zawierający sekwencję IGS-3.

Fig. 17 przedstawia sekwencję nukleotydową trzech badanych regionów IGS (SEK. NR ID.: 53-55).

Fig. 18 przedstawia porównanie wyników fermentacji Fab' dla wytwarzania IGS.

Fig. 19 przedstawia sekwencję kodującą i flankującą fragmentu Fab' CDP791 (SEK. NR ID.: 56).

Fig. 20 przedstawia wyniki testu radioimmunologicznego, w którym fragmenty przeciwciał są testowane pod kątem blokowania wiązania VEGF z KDR.

Fig. 21 przedstawia sekwencję aminokwasową całego ciężkiego łańcucha przeciwciała monoklonalnego pochodnego VR165 z przeszczepionym gH3 (SEK. NR ID.: 57).

P r z y k ł a d y

Wytwarzanie i selekcja przeciwciał monoklonalnych

Samodzielnie przeprowadzony program immunizacji został zapoczątkowany w celu wybrania przeciwciała wobec ludzkiego KDR, które potencjalnie blokuje oddziaływanie z jego ligandem VEGF. Myszy immunizowano różnymi immunogenami, łącznie z komórkami CHO transfekowanymi ludzkim KDR o pełnej długości, oczyszczonymi białkami fuzyjnymi ludzkim, KDR-ludzki Fc i DNA kodującymi takie białka fuzyjne. Spośród 19 fuzji ze zwierząt immunizowanych komórkowymi/białkowymi immunogenami oraz 4 fuzji ze zwierząt immunizowanych DNA, w przybliżeniu 23000 studzienek przeszukano w pierwszym teście ELISA pod kątem wiązania z ludzką domeną 7 KDR-Fc. Około 800 przeciwciał poddano drugiemu badaniu przesiewowemu, pomiarowi testem radioimmunologicznym blokowania wiązania 125-1 VEGF z ludzką 7 domenową KDR-Fc. Trzecie badanie przesiewowe sprawdzało blokowanie VEGF stymulujące uwalnianie czynnika tkankowego z ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC, ang. human umbilical vein endothelial cell). Na podstawie tej kaskady badań przesiewowych wybrano przeciwciało VR165 (wyników nie przedstawiono).

Klonowanie genu dla VR165

Z komórek hybrydoma wytwarzają cych VR165 izolowano RNA i przepisywano w reakcji odwrotnej transkrypcji na DNA. Używano je następnie, jako matrycę w serii reakcji PCR w celu zamplifikowania sekwencji regionu V. Pule zdegenerowanych starterów zaprojektowanych w celu hybrydyzacji z konserwatywnymi sekwencjami sygnałowymi ciężkiego i lekkiego łańcucha zastosowano, jako startery zgodne, podczas gdy startery kodujące łącznik region zrębowy 4/region C służyły, jako startery przeciwne. W ten sposób, zamplifikowano, a następnie sklonowano i zsekwencjonowano geny regionu V zarówno ciężkiego jak lekkiego łańcucha. Sekwencje DNA poddano translacj i w celu uzyskania sekwencji aminokwasowej regionu V VR165, która została zweryfikowana przez porównanie z sekwencją białka określoną na podstawie sekwencjonowania końca N. Geny mysiego regionu V przeklonowano następnie do wektorów ekspresyjnych pMR10.1 i pGamma-4. Są to oddzielne wektory do ekspresji lekkiego i ciężkiego łańcucha zawierające genomowy DNA kodujący geny regionu stałego odpowiednio ludzkiego łańcucha lekkiego kappa i ciężkiego łańcucha gamma-4. Kotransfekcja do komórek CHO wytwarza chimerowe przeciwciało VR165.

Projektowanie sekwencji przeszczepionych CDR

W zręby ludzkie przeszczepiono CDR VR165 w celu zredukowania potencjalnej immunogenności i ułatwienia ekspresji w E. coli. Akceptorowe sekwencje zrębowe ludzkiej linii zarodkowej wybrano z podgrupy VHIII i VLI. Akceptorowy łańcuch zrębowy łańcucha ciężkiego jest sekwencją VH3-7 ludzkiej linii zarodkowej, ze zrębem 4 pochodzącym z tej części ludzkiego regionu JH linii zarodkowej JH4. Akceptorowy zrąb łańcucha lekkiego jest sekwencją A30 linii zarodkowej, ze zrębem 4 pochodzącym z tej części ludzkiego regionu JH linii pierwotnej JK1. Przyrównanie pokazuje, że istnieje 15 różnic w zrębach pomiędzy donorowym i akceptorowym łańcuchem ciężkim. Dla każdej z tych pozycji przeprowadzono analizę możliwości udziału danej reszty w wiązaniu antygenu; jeśli uważano, że jest ona istotna pozostawiano resztę z mysiego donora. Przyrównanie łańcucha lekkiego pokazało, że istnieją 24 różnice w zrę bach pomiędzy sekwencją donorową i akceptorową . Ponownie przeprowadzono analizę moż liwości udziału mysiej reszty w wiązaniu antygenu. W ten sposób zaprojektowano trzy przeszczepy VH i trzy przeszczepy VL (fig. 9, SEK. NR ID.: 17-22). W każdym przypadku przeszczep 1 reprezentuje przeszczep bez reszt mysiego zrębu. Przeszczep 2 i 3 zawiera reszty mysiego zrębu w pokazanych pozycjach. Przeszczep gH3 zawiera także dodatkowe reszty ludzkie z końca C CDR-H2. Ta część CDR nie znajduje się na powierzchni wiążącej antygenu. Geny zaprojektowane do kodowania sekwencji przeszczepu wykorzystują kodony często wykorzystywane w genach E. coli i omijają kodony „rzadko” występujące u E. coli (Wada i wsp., Nucl. Acids Res., 19, 1981-86, 1991). Do DNA wprowadzono miejsca restrykcyjne w odstępach ułatwiających dalsze manipulacje genetyczne. Fig. 10 przedstawia projekt

PL 208 848 B1 genów dla gH1 i gL1 (SEK. NR ID.: 23 i SEK. NR ID.: 24). Oligonukleotydy zastosowane do konstrukcji genów przedstawiono na Fig. 11 (SEK. NR ID. : 25-40).

Konstrukcja genów dla przeszczepianych sekwencji

Do konstrukcji genów regionów V z przeszczepem CDR gH1 i gL1 wykorzystano technikę składania PCR. Przygotowano 100 μl objętości reakcyjne zawierające 10 mM Tris-HCl pH 8,3; 1,5 mM MgCl2; 50 mM KCl; 0,001% żelatynę; 0,25 mM każdego trifosforanu dezoksyrybonukleozydu; 1 pmol każdego z „wewnętrznych” starterów (F2, F3, F4, R2, R3, R4); 10 pmoli każdego z „zewnętrznych” starterów (FI, Rl) oraz 1 jedn. polimerazy Taq (AmpliTaq, Applied BioSystems, nr kat. N808-0171). Parametry cyklu PCR były następujące 94°C przez 1 min., 55°C przez 1 min. i 72°C przez 1 min., przez 30 cykli. Produkty reakcji rozdzielano następnie w 1,5% żelu agarozowym, wycinano i odzyskiwano przy użyciu wirujących kolumienek QIAGEN (QIAquick gel extraction kit, nr kat. 28706). DNA wypłukiwano w objętości 30 μΕ Porcje (1 μθ DNA gH1 i gL1 klonowano w wektorze InVitrogen TOPO TA cloning vector pCR2.1 TOPO (nr kat. K4500-01) zgodnie z zaleceniami producenta. Ten wektor, nie będący wektorem ekspresyjnym, służył jako pośredni, ułatwiający sekwencjonowanie dużej liczby klonów. Sekwencjonowanie DNA przy użyciu starterów specyficznych dla wektora przeprowadzono w celu zidentyfikowania prawidłowych klonów zawierających gH1 i gL1, tworząc plazmidy pCR2.1(gH1) i pCR2.1(gL1) (patrz fig. 12).

W celu otrzymania humanizowanych przeszczepów gH2 i gL2 zastosowano metodę wymiany kasety oligonukleotydowej. Fig. 13 przedstawia szkic kaset oligonukleotydowych (SEK. NR ID.: 41 i SEK. NR ID.: 43). Do skonstruowania każdego wariantu wektor (pCR2.1(gH1) lub pCR2.1(gL1)) przecięto pokazanymi enzymami restrykcyjnymi (Fig. 13, podkreślone miejsca restrykcyjne), duży fragment wektora oczyszczono z żelu agarozowego i użyto do ligacji z kasetą oligonukleotydową. Fig. 14 przedstawia oligonukleotydy zastosowane w kasetach (SEK. NR ID.: 45-46 i SEK. NR ID.: 49-50). Pary hybrydyzowano razem poprzez zmieszanie w stężeniu 0,5 pmoli^l w mieszaninie o objętości 200 μl zawierającej 12,5 mM Tris-HCl pH 7,5; 2,5 mM MgCl₂; 25 mM NaCl; 0,25 mM ditioerytrtolu i podgrzanie do 95°C przez 3 min. w łaźni wodnej (objętość 500 ml), a następnie powolne schłodzenie do temp. pokojowej. Następnie kasetę zhybrydyzowanych oligonukleotydów rozcieńczono 10-krotnie wodą przed reakcją ligacji z odpowiednio przeciętym wektorem. Przeprowadzono sekwencjonowanie DNA w celu potwierdzenia prawidłowej sekwencji, tworząc plazmidy pCR2.1(gH2) i pCR2.1(gL2).

Warianty gH3 i gL3 skonstruowano w podobny sposób z gH2 i gL2. Kasety i oligonukleotydy przedstawiono na Fig. 13 i 14 (SEK. NR ID.: 42 i SEK. NR ID.: 44, SEK. NR ID.: 47-48 i SEK. NR ID.: 51-52). Konstrukcja gL3 wymagała zmodyfikowanej strategii ze względu na obecność miejsc Pvul w wektorze pCR2.1. Trawienie pCR2.1(gL2) Aatll i Sful daje cząsteczkę wektora, z którą ligowana była zhybrydyzowana kaseta Pvul-Aatll plus Sful-Pvul fragment 225 bp także pochodzący z wektora pCR2.1(gL2). Przeprowadzono sekwencjonowanie DNA w celu potwierdzenia prawidłowej sekwencji, tworząc plazmidy pCR2.1(gH3) i pCR2.1(gL3).

Każdy z 3 przeszczepów łańcucha ciężkiego subklonowano do wektora ekspresyjnego pGamma-4 jako fragmenty Hindlll-Apal. Każdy z 3 przeszczepów łańcucha lekkiego subklonowano do wektora ekspresyjnego dla łańcucha lekkiego pMR10.1 jako fragmenty Sful-BsiWI. Fig. 15 przedstawia mapę tych wektorów ekspresyjnych. Przeciwciała wytwarzano przejściowo poprzez kotransfekcję komórek CHO. Wytworzono wszystkie kombinacje łańcucha z przeszczepem i łańcucha chimerowego i porównano z podwójnym przeciwciałem chimerowym.

Wiązanie oszacowano w teście ELISA z wiązaniem KDR, w teście radioimmunologicznym hamowania wiązania wyznakowanego VEGF z KDR i w teście typu BIAcore wiązania KDR. Wszystkie formy z przeszczepami zachowywały się dobrze w teście ELISA i w teście radioimmunologicznym, wykazując aktywność podobną do form chimerowych. Na podstawie analizy typu BIAcore, jako optymalne wybrano przeszczep gL3gH3 (wyników nie przedstawiono) i jest ono od tego czasu określane, jako gl65.

Konstrukcja plazmidu pTTOD

Plazmid pTTO-1 skonstruowano w następujący sposób:

(a) Zamiana polilinkera pTTQ9

Plazmid pTTQ9 otrzymano z firmy Amersham. Porcję (2 μg) trawiono enzymami restrykcyjnymi Sali i EcoRI, produkty trawienia rozdzielano w 1% żelu agarozowym i oczyszczano duży fragment DNA (4520 bp). Zsyntetyzowano dwa oligonukleotydy kodujące region polilinkera OmpA, które ze sobą hybrydyzowano. Sekwencja ta posiada lepkie końce odpowiadające końcom SalI i EcoRI wytworzonym po trawieniu restrykcyjnym pTTQ9. W wyniku sklonowania tej „kasety” oligonukleotydowej

PL 208 848 B1 w wektorze pTTQ9, miejsce SalI nie jest odtwarzane, lecz jest zachowane miejsce EcoRI. Kaseta koduje 13 pierwszych aminokwasów sekwencji sygnałowej białka błony zewnętrznej Omp-A E. coli, poprzedzonych miejscem wiązania rybosomów Shine Dalgarno genu OmpA. Dodatkowo obecne są miejsca restrykcyjne dla enzymów Xbal, MunI, Styl i SpII. Miejsca MunI i Styl znajdują się w regionie kodującym sekwencję sygnałową OmpA i służą, jako miejsca do klonowania po stronie 5' wprowadzanych genów. Oba nukleotydy, które tworzą tę kasetę hybrydyzowano razem poprzez zmieszanie w stężeniu 5 pmoli/μΐ i ogrzanie w łaźni wodnej do 95°C przez 3 min., a następnie powolne schłodzenie do temp. pokojowej. Zhybrydyzowaną sekwencję ligowano z pTTQ9 przeciętym Sall/EcoRI. Uzyskany plazmid pośredni, nazwany pTQ0mp, sprawdzono poprzez sekwencjonowanie DNA.

(b) Przygotowanie fragmentów i ligacja

Plasmid pTTO-1 skonstruowano poprzez ligację jednego fragmentu DNA z plazmidu pACYC184 z dwoma fragmentami uzyskanymi z pTQOmp. Plazmid pACYC184 pochodził z New England Biolabs. Porcję (2 μg) całkowicie strawiono enzymem restrykcyjnym Styl, a następnie poddano działaniu nukleazy fasoli Mung; działanie to wytworzyło tępe końce poprzez wycięcie wystających par na końcach 5'. Po ekstrakcji fenolowej i wytrąceniu etanolem, DNA trawiono enzymem PvuII, wytwarzając fragmenty 2348, 1081, 412 i 403 bp. Fragment 2348 bp oczyszczono po rozdziale elektroforetycznym w żelu agarozowym. Fragment ten koduje marker oporności na tetracyklinę oraz miejsce startu replikacji pl5A. Fragment następnie poddawano działaniu alkalicznej fosfatazy z jelita cielęcego w celu usunięcia fosforanu z końca 5', zapobiegając w ten sposób ligacji własnych końców ze sobą.

Porcję (2 μg) plazmidu pTQOmp trawiono enzymami Sspl i EcoRI, i fragment 2350 bp oczyszczono z niepożądanych fragmentów 2040 bp i 170 bp po rozdziale w żelu agarozowym; fragment ten koduje region terminatora transkrypcji i gen laclq. Inną porcję (2 μg) pTQOmp strawiono EcoRI i XmnI, wytwarzając fragmenty 2289, 1670, 350 i 250 bp. Fragment 350 bp, kodujący promotor tac, sekwencję sygnałową OmpA i zgrupowanie miejsc do klonowania oczyszczono w żelu.

Trzy fragmenty poddano ligacji, stosując w przybliżeniu równomolarne ilości każdego z fragmentów w celu wytworzenia plazmidu pTTO-1. Wszystkie miejsca klonowania sprawdzono poprzez sekwencjonowanie DNA.

(c) Wytworzenie plazmidu pTTOD

Plazmid pTTOD otrzymano z pTTO-1 poprzez usunięcie miejsc restrykcyjnych dla PvuII (3 miejsca), EcoRV (2 miejsca) i Apal (1 miejsce). Zmiany te przeprowadzono dla ułatwienia strategii klonowania Fab'. W czasie przeprowadzania tych zmian sekwencja genu kodującego białko laclq i genu oporności na tetracyklinę nie została zmieniona, chociaż wprowadzono „ciche” zmiany na poziomie DNA. Zastosowano strategię PCR, w której zaprojektowano startery niosące „ciche” zmiany usuwające te miejsca restrykcyjne i użyto je do amplifikacji sekcji plazmidu rodzicielskiego (pTTO-1). Następnie flankujące miejsca restrykcyjne (niezmienione) użyto do zamiany sekwencji w plazmidzie rodzicielskim tymi zmodyfikowanymi sekwencjami. W tym wieloetapowym procesie wytworzono plazmid pTTOD. Przeniesienie genów Fab' istniejących w wektorze pTTO do pTTOD osiągnięto poprzez wykorzystanie unikatowych miejsc Pstl i EcoRI flankujących te geny, tworząc pTTOD(Fab'). Wprowadzenie genów regionu V gl65 do plazmidu pTTOD umożliwiającego wytwarzanie Fab' w E. coli.

Punktem wyjściowym do wprowadzenia sekwencji gl65 były 3 wektory pozwalające na wytwarzanie nieistotnych Fab', pTTOD(Fab' IGS-1), pTTOD(Fab' IGS-2) i pTTOD(Fab' IGS-3) (przykładowo, patrz fig. 16). Różnią się one między sobą tak zwaną IGS (lub sekwencją międzygenową), która oddziela gen łańcucha lekkiego od genu łańcucha ciężkiego. Te regiony IGS przedstawiono na fig. 17 (SEK. NR ID.:53-55). Klonowanie sekwencji gl65 do wektorów przeprowadzono w dwóch etapach. Najpierw łańcuch lekki wycięto z pCR2.1(gL3) jako fragment EcoRV-BsiWI (395 bp) i wprowadzono do dużego fragmentu wektora uzyskanego po trawieniu EcoRV-BsiWI pTTOD(Fab' IGS-1), pTTOD(Fab' IGS-2) i pTTOD(Fab' IGS-3). Wytworzyło to pośrednie wektory klonowania pTTOD(gl65L IGS-1), pTTOD(gl65L IGS-2) i pTTOD(gl65L IGS-3). Te pośrednie wektory klonowania trawiono następnie PvuII i Apal, duży fragment wektora oczyszczono i wprowadzono 435 bp fragment PvuII-Apal z pCR2.1(gH3). Dzięki temu wytworzono 3 plazmidy ekspresyjne dla Fab' pTTOD(gl65 IGS-1), pTTOD(gl65 IGS-2) and pTTOD(gl65 IGS-3).

Plazmidami tymi transformowano szczep gospodarza W3110 i ekspresję Fab' przez te 3 plazmidy porównywano w wytrząsanych kolbach i w fermentorze. Fig. 18 przedstawia porównane wyników dla fermentora, które jasno demonstrują przewagę wytwarzania z wariantem IGS-2.

PL 208 848 B1

Plazmid pTTOD(gl65IGS-2) przemianowano na pTTOD(CDP7 91). Mapę plazmidową tego konstruktu przedstawiono na fig. 8. fig. 19 przedstawia DNA pełnej długości oraz sekwencję białka regionu kodującego Fab' w tym wektorze, plus niektóre sekwencje flankujące 5' i 3' (SEK. NR ID.: 56).

Modyfikacja PEG Fab opartego na VR165 z przeszczepionym CDR

Oczyszczone zmodyfikowane Fab jest miejscowo specyficznie koniugowane z rozgałęzioną cząsteczką mPEG. Jest to osiągane przez aktywację pojedynczej reszty cysteinowej w skróconym regionie zawiasowym zmodyfikowanego Fab, a następnie reakcję z lizyno maleimidem (mPEG) - jak opisano wcześniej (A. P. Chapman i wsp., Nature Biotechnology 17, 780-783, 1999). Cząsteczkę modyfikowaną PEG przedstawiono na Fig. 6. Alternatywnie, reakcja aktywowanego Fab z lizylo bismaleimidem (mPEG), jak opisano w EP-A-1090037, daje di-(zmodyfikowany Fab) PEG, dalej określany, jako DFM.

Aktywności BIAcore nagich i PEGiowanych fragmentów

Ludzki KDR o 7 domenach Ig w fuzji z ludzkim Fc wychwytywano na chipie opłaszczonym antyFc i różne fragmenty przeciwciała gl65 z przeszczepionym CDR oraz mysie rodzicielskie przeciwciało VR165 przepuszczano pozwalając na określenie powinowactwa. Tabela poniżej sumuje uzyskane wyniki. W tej formie testu, istnieje przewaga diwalentości, co pokazano poprzez obniżenie szybkości dysocjacji (Kd) diwalentnych składników. Powinowactwo DFM z przeszczepem jest bardzo podobne do mysiego IgG, z DFM-PEG wykazującym niewielką redukcję powinowactwa. KD cząsteczki gl65 DFM-PEG wynosi w tym teście w przybliżeniu 4 x 10^-11M.

T a b e l a 1 : Aktywności BIAcore fragmentów nagich i modyfikowanych PEG

a-KDR	Ka e5	Kd e4	IZ Λ-10 Kd e
DFM	21,6	0,64	0,29
DFM-PEG4 0	15,5	0,64	0,41
mlgG	19,8	0,60	0,30
FAB	13,6	12,4	9,1
FAB-PEG4 0	11,0	11,8	10,7

Test radioimmunologiczny

Zdolność fragmentów do blokowania wiązania VEGF z KDR badano testem radioimmunologicznym. Poliklonalne anty-Fc wykorzystano do wychwytywania KDR z 7 domenami Ig w fuzji z ludzkim Fc na płytce mikrotitracyjnej, przeciwciało lub fragment dodawano po wyznakowaniu VEGF-165 za pomocą 125-I. Wyniki tego testu przedstawiono na fig. 20. Ponownie w badaniu tym została zademonstrowana przewaga diwalentności, wykazana większym blokowaniem DFM niż Fab'. Konstrukt DFM-PEG wykazał niewielką redukcję aktywności w porównaniu z nagim DFM, jak było to widoczne w badaniach BIAcore.

Testy oparte na komórkach

Cząsteczka gl64 DFM PEG wykazywała także aktywność w testach opartych na komórkach. Jej zdolność do blokowania stymulacji KDR przez VEGF zademonstrowano poprzez zahamowanie uwalniania czynnika tkankowego przez ludzkie komórki śródbłonkowe żyły pępowinowej (patrz Clauss i wsp., J. Biol. Chem., 271, 17629-17634, 1996). Aktywność zademonstrowano takż e poprzez zahamowanie ruchliwości Ca2+ za pośrednictwem VEGF w ludzkich komórkach śródbłonkowych mikronaczyń (patrz Cunningham i wsp., Am. J. Physiol., 276, C176-181, 1999).

Powinno być zrozumiałe, że opisane powyżej przykłady są jedynie przykładowymi i nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku, który jest zdefiniowany przez następujące zastrzeżenia.

Claims (28)

1. Cząsteczka przeciwciała o swoistości wobec ludzkiego KDR obejmująca region zmienny łańcucha ciężkiego z SEK. NR ID.: 15 i region zmienny łańcucha lekkiego z SEK. NR ID.: 16.

2. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 zawierająca łańcuch lekki obejmujący sekwencję przedstawioną, jako aminokwasy 22 do 235 SEK. NR ID. 11.

PL 208 848 B1

3. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 zawierająca łańcuch ciężki obejmujący sekwencję przedstawioną, jako SEK. NR ID. 57.

4. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1 zawierająca łańcuch lekki obejmujący sekwencję przedstawioną, jako aminokwasy 22 do 235 SEK. NR ID. 11 i łańcuch ciężki obejmujący sekwencję przedstawioną, jako SEK. NR ID. 57.

5. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 1, znamienna tym, że jest zmodyfikowanym fragmentem Fab posiadającym na końcu C łańcucha ciężkiego jeden lub więcej aminokwasów, które tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną lub dwie reszty cysteinowe, do których może być przyłączona cząsteczka efektorowa lub reporterowa.

6. Cząsteczka przeciwciała według zastrz. 5, znamienna tym, że jest zmodyfikowanym fragmentem Fab obejmującym łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej jako aminokwasy 22 do 235 SEK. NR ID.: 11 i łańcuch ciężki o sekwencji przedstawionej, jako aminokwasy 22 do 249 SEK. NR ID.: 12.

7. Związek obejmujący cząsteczkę przeciwciała określoną w zastrz. 5 posiadający cząsteczkę efektorowa lub reporterowa kowalencyjnie przyłączoną do reszty cysteinowej w zmodyfikowanym regionie zawiasowym.

8. Związek według zastrz. 7, znamienny tym, że cząsteczka efektorowa obejmuje jeden lub więcej polimerów.

9. Związek według zastrz. 8, znamienny tym, że jeden lub więcej polimerów stanowią ewentualnie podstawione proste lub o rozgałęzionym łańcuchu polimery polialkilenowe, polialkenylowe lub polioksyalkilenowe lub polisacharydy rozgałęzione lub nierozgałęzione.

10. Związek według zastrz. 9, znamienny tym, że jeden lub więcej polimerów stanowią glikole metoksypoli(oksy)etylenowe.

11. Związek według zastrz. 7 obejmujący cząsteczkę przeciwciała określoną w zastrz. 5, posiadający grupę lizylo-maleimidową lub lizylo bis-maleimidową przyłączoną do jednej z reszt cysternowych na końcu C łańcucha ciężkiego, przy czym każda z grup aminowych reszty lizylowej jest kowalencyjnie połączona z resztą glikolu metoksypoli(oksy)etylenowego o masie cząsteczkowej wynoszącej około 20000 Da.

12. Związek obejmujący cząsteczkę przeciwciała określoną w zastrz. 5, który jest PEGylowanym di-(modyfikowanym Fab), przy czym każdy ze zmodyfikowanych Fab obejmuje łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej, jako aminokwasy 22 do 235 SEK. NR ID.: 11 i łańcuch ciężki przedstawiony, jako aminokwasy 22 do 249 SEK. NR ED.: 12.

13. PEGylowany di-(modyfikowany Fab) według zastrz. 12, który obejmuje, co najmniej jedną cząsteczkę mPEG.

14. PEGylowany di-(modyfikowany Fab) według zastrz. 13, w którym mPEG jest przyłączony do reszty lizynowej kowalencyjnie związanej do linkera bis-maleimidowego.

15. PEGylowany di-(modyfikowany Fab) według zastrz. 13 lub 14, w którym każda cząsteczka mPEG ma masę cząsteczkową wynoszącą około 20000 Da.

16. Sekwencja DNA, która koduje łańcuch ciężki i/lub lekki cząsteczki przeciwciała określonej w dowolnym z zastrz. 1 do 6.

17. Wektor do klonowania lub ekspresyjny zawierający sekwencję DNA określoną w zastrz. 16.

18. Wektor ekspresyjny dla E. coli obejmujący sekwencję DNA określoną w zastrz. 16.

19. Wektor ekspresyjny dla E. coli według zastrz. 18, który stanowi pTTOD(CDP791).

20. Komórka gospodarza stransformowana wektorem określonym w dowolnym z zastrz. 17 do 19.

21. Sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała określonej w dowolnym z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że obejmuje hodowanie komórki gospodarza określonej w zastrz. 20 i izolowanie cząsteczki przeciwciała.

22. Sposób wytwarzania cząsteczki przeciwciała określonej w dowolnym z zastrz. 1 do 6, znamienny tym, że obejmuje hodowanie E. coli zawierającego wektor ekspresyjny określony w zastrz. 18 lub 19 i izolowanie cząsteczki przeciwciała.

23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że cząsteczka przeciwciała jest wprowadzana do periplazmy.

24. Kompozycja terapeutyczna lub diagnostyczna, znamienna tym, że obejmuje cząsteczkę przeciwciała określoną w dowolnym z zastrz. 1 do 6 lub związek określony w dowolnym z zastrz. 7 do 15.

PL 208 848 B1

25. Cząsteczka przeciwciała określona w dowolnym z zastrz. 1 do 6, wykazująca swoistość wobec ludzkiego KDR albo związek określony w dowolnym z zastrz. 7 do 15 do zastosowania w leczeniu stanów patologicznych, w które zaangażowane są VEGF i/lub KDR.

26. Cząsteczka przeciwciała lub związek jak określono w zastrz. 25 do zastosowania w leczeniu zapalenia, łuszczycy, reumatoidalnego zapalenia stawów oraz wzrostu nowotworu lub przerzutów.

27. Zastosowanie cząsteczki przeciwciała określonej w dowolnym z zastrz. 1 do 6, wykazującej swoistość wobec ludzkiego KDR, albo związku określonego w dowolnym z zastrz. 7 do 15 do wytwarzania leku do leczenia stanów patologicznych, w które zaangażowane są VEGF i/lub KDR.

28. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że stanem patologicznym jest zapalenie, łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów oraz wzrost nowotworu lub przerzuty.