KR20070112796A - 바이러스를 이용하여 시료 중의 생 세포를 검출하는 방법 - Google Patents

바이러스를 이용하여 시료 중의 생 세포를 검출하는 방법 Download PDF

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KR20070112796A
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데이비드 제임스 스쿼럴
마틴 앨런 리
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이니그마 다이아그노스틱스 리미티드
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Abstract

본 발명은 (i) 바이러스가 임의의 생 세포를 감염시켜 그 안에서 복제할 수 있는 조건 하에서, 상기 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스와 함께 시료를 항온 처리하는 단계; 및 (ii) 상기 세포 내에서 바이러스 복제에 의해 얻어진 임의의 핵산을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중에 존재하는 생 세포 예를 들어, 박테리아 세포를 검출하는 방법을 제공한다.

Description

바이러스를 이용하여 시료 중의 생 세포를 검출하는 방법{METHOD FOR DETECTING VIABLE CELLS IN A SAMPLE BY USING A VIRUS}
본 발명은 시료 중에 생 세포가 존재하는지 여부를 검출하는 방법과, 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.
박테리아 및 기타 유기체를 신속하게 검출하는 것은 공중 위생 분야에서 매우 중요하다. 이는 식품 및 음료에 유해한 박테리아 및 기타 미생물 예를 들어, 이. 콜라이 0157(E. Coli 0157)에 의한 오염을 방지하는 것이 필수적인 식품 산업 분야에서 특히 중요하다.
뿐만 아니라, 이와 같이 신속하게 검출하는 것은 잠재적으로 유해한 박테리아 및 기타 유기체를 신속하게 동정하여, 감염을 억제할 수 있고 동물이나 환자를 올바로 처치할 수 있어야 하는 수의학적 진단 및 의료 진단 분야에서도 매우 중요하다. 또한, 의료용 제제, 화장용 제제 그리고 수의학적 제제에도 유해한 오염 물질 예를 들어, 박테리아가 존재하지 않아야 한다.
뿐만 아니라, 일부 박테리아 및 기타 유기체 예를 들어, 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis)는 세균전의 무기로서 사용될 가능성이 있다. 그러므로, 시료 중에 이러한 유기체가 존재하는지 여부는 신속하게 테스트될 수 있어야 한다. 예를 들어, 상기 바실러스 안트라시스 포자를 처음 흡입한 후 6시간 이내에 처치를 해야 처치 효과를 볼 수 있는 것으로 추정된다.
현재 박테리아 및 기타 유기체를 검출할 수 있는 방법이 몇 가지 존재한다.
시료 중 박테리아 존부를 검출할 수 있는 전통적인 방법의 일례로서는 배양에 기초한 방법이 있다. 그러나, 일반적으로 이러한 검정법에서는 시료 중 유기체 농도가 매우 낮다는 문제점이 있다. 그러므로, 시료 중 유기체를 검출 가능한 수준으로 배양하기 위해서는 검정법을 수행하기 이전에 상당한 기간 동안 시료를 항온 처리할 필요가 있다. 이 과정에서 시간이 지체되게 되는데, 이는 공중 위생이 위기에 처하게 되는 다수의 경우에 적합하지 않을 수 있다.
대안적으로, PCR 및 기타 핵산 증폭 기술이 박테리아 및 기타 유기체를 검출하는 데 있어서 신속하고 정밀한 DNA계 수단을 제공해 준다. 일반적으로 상기 기술은 증폭 반응 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 박테리아 DNA를 검출하는 것을 바탕으로 한다.
그러나, DNA는 매우 견고한 화학 종이어서 숙주 세포가 사멸되었을 때에도 계속 생존할 수 있는데, 이 점은 이러한 증폭 기술에 있어서 단점이 된다.
예를 들어, 만일 가금류의 생성물이 병원성 박테리아 예를 들어, 살모넬라(salmonella)로 오염된 후에 조리된다면, 이 생성물로 조리된 음식은 안전할 것이다. 통상의 배양에 기초한 검출 방법에 있어서, 음식은 안전한 것처럼 보이겠지만 그 방법 자체는 수행하는 데 오랜 시간이 걸릴 것인 반면에, 이보다 신속한 DNA 방법은, 살모넬라 DNA가 여전히 시료 중에 존재할 것이므로 잘못된 양성 결과를 나 타낼 것이다.
대안적으로, WO 2003/035889에는 마커 서열을 포함하는 변형된 파지를 생 세포를 검출하는 데 사용하는 기술에 관하여 개시되어 있다. 이 방법에서, 변형된 파지는 테스트될 시료에 도입된다. 만일 생 세포가 존재하면, 이 파지는 그 세포의 기구를 이용하여 복제할 수 있으며, 그 결과 마커 서열의 양은 검출 가능할 정도로 증가하게 된다.
그러나, 이 기술에도 단점은 있다.
첫째, 파지는 원하는 마커 서열을 함유하도록 특이적으로 조작되어야 하기 때문에, 마커 서열을 도입시켜야 하므로 인해 테스트를 복잡하게 만들 수 있다는 점이다. 그러므로, 이와 같이 변형된 파지는 테스트에 소모되는 비용을 증가시키고 또한 테스트 과정을 복잡하게 만들 것이다.
뿐만 아니라, 파지 내에 마커 소열이 존재함으로 인해, 테스트될 시료에 마커 서열이 첨가되므로, 시료 중 마커 서열의 양이 증가하였는지 여부를 정량적으로 측정할 필요가 있다. 이는 즉, 항온 처리 시간이, 잘못된 양성 결과가 나타나지 않음을 확신할 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다는 의미이다.
그러므로, 용이하게 실시할 수 있고, 잘못된 양성 또는 음성 결과가 나올 가능성이 낮은, 잠재적 생물 유해 물질을 테스트할 수 있는, 신뢰도 높은 방법이 필요하다.
그러므로, 본 발명은 시료 중에 존재하는 생 세포를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은
(i) 바이러스가 임의의 생 세포를 감염시켜 그 안에서 복제할 수 있는 조건 하에서, 상기 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스와 함께 상기 시료를 항온 처리하는 단계; 및
(ii) 상기 세포 내에서 바이러스 복제에 의해 얻어진 임의의 핵산을 검출하는 단계
를 포함한다.
바이러스를 복제하여 특별히 얻은 핵산을 검출함으로써, 시료 중에 사 세포가 아닌 생 세포가 존재하는지 여부를 측정할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 시료 중에 존재하는 생 세포를 검출하는 방법을 제공하는데, 이 방법은
(i) 바이러스가 임의의 생 세포를 감염시켜 그 안에서 복제할 수 있는 조건 하에서, 상기 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스와 함께 상기 시료를 항온 처리하는 단계; 및
(ii) 상기 세포 내에서 바이러스 복제에 의해 얻어진 임의의 핵산을 검출하는 단계
를 포함하는데, 단, 바이러스가 변형된 바이러스 즉, 마커 서열을 포함하도록 변형된 바이러스인 경우, 검출되는 핵산은 세포 내에서 바이러스가 복제할 때에만 생산되는 핵산인 것인 단계를 포함한다.
임의의 생 세포가 (i) 단계 수행 중에 감염되었음을 확인하기 위해서는, 상기 생 세포를 예를 들어, 상기 생 세포를 항온 처리 온도 예를 들어, 37∼42℃에, 적당한 시간 예를 들어, 2시간 반∼4시간 반 동안 처리한 후 바이러스를 첨가하는 것과 같이 예비 컨디셔닝 단계(pre-conditioning step)에 도입시킬 수 있다. 이러한 과정은 예를 들어, 시료가 면역 자기 분리(IMS) 방법과 같은 분리 또는 보관 방법의 실시 결과로 스트레스를 받은 박테리아를 함유하고 있을 때에 특히 필요할 수 있다. 이후, 생 세포는 감염 및 몇몇 복제 과정이 진행될 수 있는 시간 동안 항온 처리 온도에 방치될 수 있다.
사용된 바이러스는 단일 가닥(ss) 또는 이중 가닥(ds) RNA 또는 DNA 바이러스일 수 있다.
상기 (ii) 단계에서 검출된 핵산은 바이러스 자체 내에서도 생산될 수 있다. 그러한 경우, 이 시료 중에 존재하는 핵산의 양이 증가하였는지 여부를 정량할 필요가 있다. 이 방법은 마커 서열을 포함시키기 위해 바이러스를 변형시킬 필요가 없으므로, WO 03/035889에 개시된 방법에 비하여 유리하다.
그러나, (ii) 단계에서 검출되는 핵산은 바이러스 자체 내에 포함되지 않고, 세포 내 바이러스가 복제하는 경우에만 생산되는 것이 바람직하다. 이는 즉, 이러한 특정 서열을 가지는 임의의 핵산이 검출되면 곧, 생 세포가 바이러스 생산에 이용된 것이므로, 시료 중에 생 세포가 존재한다는 것에 대한 증거가 됨을 의미한다.
바이러스는 야생형 바이러스 또는 변형 바이러스일 수 있다. 바이러스가 마커 서열을 포함하도록 변형된 변형 바이러스인 경우, 검출된 핵산은 이 세포 내에서 바이러스가 복제하는 경우에만 생산되는 것이다.
특정 구체예에서, 바이러스는 임의의 마커 서열(들) 예를 들어, 표적 반복 서열(target repeat sequence)을 포함하도록 변형되지 않는다.
그러나, 상기 바이러스는 기타 목적 예를 들어, 바이러스의 감염성 또는 특이성을 증가시킬 목적으로 변형될 수 있다. 이러한 바이러스는 시판중에 있으므로, 방법을 복잡하게 만들지 않고, 이 방법에 소모되는 비용을 거의 증가시키지 않고서도 자연 발생 바이러스를 사용하는 경우에 비하여 유리할 수 있거나, 아니면 상기 바이러스는 통상의 형질 전환 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
검출 방법으로서 어떠한 방법을 사용할지에 대한 선택권은 사용되는 특정 바이러스에 따라 달라질 것이다.
특정 구체예에서, 바이러스는 RNA 바이러스 특히, 단일 가닥 RNA 바이러스이다.
특히 바람직한 단일 가닥 RNA 바이러스는 제 VI군 RNA 바이러스로서 즉, 단일 (+) RNA 가닥을 포함하는 바이러스이다. 이러한 바이러스는 역전사라고 불리는 과정을 통하여 자신의 RNA를 상보성 DNA(cDNA)로 전환시킨다. RNA를 cDNA로 전환시킴으로써 바이러스는 숙주 세포 내에서 복제할 수 있게 된다.
그러나, 상기 (ii) 단계에서 생산된 cDNA가 검출되면, 감염되었을 때 바이러스 감염을 지연시킬 수 있는 생 세포가 시료 중에 존재함을 나타내는 독특한 지표가 된다.
역전사를 수행함에 있어서 필요한 역전사 효소는 종종 비리온에 존재하는 효소이므로, 바이러스는 상기 필수 효소를 제공하는 숙주 세포에 의존할 필요가 없어진다. 그러나, 숙주는 바이러스가 숙주 세포를 감염시켜 이 숙주 세포 내에서 복제하는 데 필요한 다수의 기타 인자들을 제공하여야 한다.
예를 들어, 바이러스가 숙주 세포에 내재화하는 데에는 숙주의 인자들 예를 들어, 바이러스가 상호 작용해야 하는 표면 단백질과 세포막이 필요하다. 뿐만 아니라, 역전사에는 바이러스 DNA로부터 cDNA를 형성시키는 데 필요한 dNTP 기질을 함유하는 안정한 환경이 필요하다.
만일 숙주 세포가 살아있지 않아서, 전술한 바와 같은 부가의 인자들을 생산하지 않는 경우, 바이러스는 숙주 세포를 감염시켜 이 숙주 세포 내에서 복제할 수 없을 것이므로, 예를 들어, 증폭 반응의 표적을 형성할 수 있는 검출 가능한 DNA를 생성하게 될 것이다.
만일 숙주 세포가 살아있다면, RNA 바이러스는 검출 가능한 cDNA를 생산하는 숙주 세포 내에 침투하여 이 숙주 세포 내에서 복제할 수 있을 것이다. 만일 숙주 세포가 살아있지 않다면, 이 바이러스는 숙주 세포를 감염시킬 수 없을 것이며/것이거나, 이 세포 내에서 복제할 수도 없을 것이므로, cDNA는 검출되지 않을 것이다.
본 발명의 이러한 구체예에서, (i) 단계 동안에 하나 이상의 cDNA가 숙주 세포에 의해 생산됨을 확신하는 데 충분히 긴 시간 동안, 단지 시료를 항온 처리할 필요가 있다. 이후, 상기 cDNA는 종래의 증폭 반응 예를 들어, PCR을 이용하여 검출될 수 있다. 그러나, 다수의 복사체를 생산하는 데 충분히 긴 시간 동안, 항온 처리를 할 수도 있다. 일반적으로, 검출 가능한 정도의 핵산을 생산하는 데 충분한 항온 처리 시간은 30분∼1시간이다.
대안적으로, 바이러스는 단일 (-) 가닥 RNA 분자 예를 들어, 제V군 바이러스를 포함할 수 있다. 생 세포가 감염될 때, 이 세포는 상보적인 (+) RNA 가닥, 구체적으로 mRNA 가닥을 생산할 것이다. 그러나, 전술한 바에 따르면, 이 과정은 감염 세포의 안정한 환경 내에서만 진행될 수 있다. 이와 같이 생산된 (+) RNA 가닥은 이후 예를 들어, 종래의 역전사 효소-PCR 반응(RT-PCR)을 이용하여 검출될 수 있다.
바람직하게, 검출 과정은 RT 단계에서 단일의 프라이머를 이용하여 수행되며, 그 결과 단일의 상보성 DNA 분자만이 생산된다.
특정 구체예에서, 이러한 cDNA는 이 cDNA 내에서 일정 부위를 증폭시키도록 디자인된 종래의 PCR 증폭 방법에 의해 검출된다. 이와 같은 증폭 방법은, 오염을 최소화하기 위해 RNA 가닥을 분해한 후 수행할 수 있는 것이 바람직하다.
대안적으로, 바이러스 핵산 자체의 양이 증가하였는지 여부는 생 세포의 존부를 나타내는 지표로서 사용될 수 있다. 즉, 바이러스는 생 세포 내에서만 복제될 수 있기 때문이다. 이와 같은 구체예에서, 검출되는 핵산은 리포터 서열 이외의 것이며, 바람직하게는 야생형 서열이다.
예를 들어, 바이러스가 DNA 바이러스 예를 들어, 단일 가닥 제II군 바이러스, 또는 이중 가닥 제I군 바이러스인 경우, 특히 생 세포가 시료 중에 존재하는지 여부를 측정하기 위하여, 감염 후 DNA의 총 증가량을 검출할 필요가 있을 것이다. 이는 다양한 방식으로 수행될 수 있지만, 정량적 PCR 검정법 예를 들어, TAQMAN™ 검정법 등을 사용하여 DNA를 증폭시키는 것이 가장 편리할 것이다.
바이러스가 RNA 바이러스인 경우, RNA의 증가 여부는 예를 들어, RT-PCR을 이용하여 검출할 필요가 있을 수 있다.
본 발명의 방법에서 테스트될 시료는 원핵 생물 세포 및/또는 하등 진핵 생물 세포 및/또는 고등 진핵 생물 세포를 함유하는 것으로 추측되거나 또는 이를 함유하는 것으로 알려진 임의의 시료일 수 있다.
본 발명의 범위에 포함되는 시료의 예로서는 식품 시료, 인간 또는 동물의 체액 또는 조직 시료를 포함하며, 구체적으로는 임상 시료, 의학용, 화장용 또는 수의학적 제제 또는 약품, 식물 시료, 흙 시료, 공기 시료, 물 시료 및 세포 배양액 시료를 포함한다. 상기 시료는 식품 시료인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 방법은 바이러스가 침투할 수 있는 임의의 세포와 같은 생 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 세포로서는 원핵 생물 세포 및 진핵 생물 세포를 포함한다. 상기 세포는 예를 들어, 미생물 예를 들어, 박테리아일 수 있다. 검출 가능한 박테리아의 구체예로서는 이. 콜라이(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 리스테리아(Listeria), 캄필로박터(Campylobacter), 레지오넬라(Legionella), 마이코박테리아(Mycobacterium), 스타필로코커스(Staphylococcus) 또는 스텝토코커스(Steptococcus)를 포함한다.
대안적으로, 상기 세포는 작은 유기체 예를 들어, 곤충, 식물 또는 곰팡이와 같은 유기체 내에 포함될 수 있다.
뿐만 아니라, 생 세포는 세포 또는 세포주 예를 들어, 포유동물 세포주, 식물 및 곰팡이 세포주 내에 존재할 수 있다. 세포 주 내에서 생 세포를 검출하는 방법은 종종 예를 들어, 약학적 시약 또는 기타 시약을 스크리닝하는 동안, 또는 생물학적 분석 과정 중에 수행되며, 본원에 기술된 방법은 본 발명에 유용할 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 특정 박테리아 감염에 대해 항생제 치료를 받은 환자로부터 유래하는 시료를 함유하는 세포를 분석함에 있어서 특히 유용할 수 있다. 이러한 환자들로부터 유래하는 적당한 시료는 본원에 기술된 방법을 통하여 테스트되어, 항생제 처리가 효과적인지 아닌지를 측정할 수 있다.
바이러스는 야생형 바이러스 또는 재조합 바이러스 중 어느 하나일 수 있다. 만일 세포가 살아있다면, 바이러스는 이 세포를 감염시켜 이 세포 내에서 복제할 수 있을 것이다[즉, (+) RNA의 경우에는 cDNA를 생산함으로써 복제하고, 그렇지 않은 경우에는 RNA, 구체적으로 mRNA를 생산함으로써 복제함]. 그러므로, 변형된 바이러스가 사용되는 경우, 예를 들어, 세포 내에서 바이러스가 복제할 때에만 생산되는 도입 마커 서열에 상보적인 서열을 검출함으로써 생 세포의 존재 여부를 명확히 나타내는 지표를 제공할 수 있다. 적당한 마커 서열은 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있다.
상기 방법이 바이러스에 의해 감염될 수 있는 임의의 유형의 세포의 생존능을 확인하는 데 사용될 수 있다는 점에서, 전술한 방법은 일반적으로 무리 없이 받아들여진다. 예를 들어, 만일 시료가 살아있는 이. 콜라이 0157 세포에 대해 테스트되어야 하면, 이. 콜라이 0157 세포에 감염할 수 있는 임의의 바이러스를 사용할 수 있다.
일부 시료 예를 들어, 우유 또는 흙과 같은 시료에 있어서, 이 시료에 존재하는 여러 가지 종류의 박테리아 또는 기타 세포의 수는 매우 많을 수 있다. 이러한 시료 중에 존재하는 특정 유형의 세포의 생존능을 테스트하는 것은 당연히 어렵다. 하지만, 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 바이러스로서 세포 유형에 특이적인 것을 사용하고, 또한 그것(생 세포)이 존재하는지 여부를 관찰한다. 다시 말하면, 본 구체예에서, 사용된 바이러스는 관찰 중인 세포 유형 내에 침투하여 이 세포 내에서 복제할 수 있어야 한다.
예를 들어, 공지의 콜라이 파지(coliphage)는 국립 산업 및 해양 박테리아 보관소(National Collection of Industrial and Marine Bacteria; 영국 애버딘 소재; NCIMB 10359)로부터 입수 가능하다. 다이아그노스틱스 파스퇴르(Diagnostics Pasteur)(영국 왓포드 소재)로부터 입수할 수 있는 펠릭스(Felix) 01 파지는 살모넬라 균종 특히, 살모넬라 뉴포트(Salmonella Newport)를 감염시킬 수 있는 것이다.
이와 같이 바람직한 구체예에서, 사용된 특정 바이러스는, 다른 유형의 박테리아 또는 기타 세포가 존재하는 방식이 어떻든지 간에 테스트될 세포가 존재하고 또한 살아있다면, 검출 가능한 핵산을 생산할 것이다. 이는 곧, 테스트될 세포가 살아있는 상태로 존재하는지 여부를 확인할 수 있기 전에 이 세포는 분리되어서는 안 된다는 것을 의미하는 것이다.
하나 이상의 세포의 생존능에 대해 관찰할 경우, 바이러스는 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 다수개의 특이성을 가지는 혼합물로 사용될 수 있다. 후자의 경우, 각각 개개의 바이러스에 대한 특징을 나타내는 것인 다수의 핵산 서열 예를 들어, cDNA 서열을 검출하는 방법은 연속적으로 수행된다.
바이러스의 감염 및 복제 주기는 종종 감염된 세포를 파열시켜 이 세포의 내용물을 방출시키게 만들 것이다. 이러한 경우, 전술한 방법의 (ii) 단계에서 검출된 핵산은 이 세포를 능동적으로 분해하거나 또는 균질화시키지 않고서도 검출될 수 있다. 그러나, 시료 중에 존재하는 임의의 세포를 분해 또는 균질화하는 방법은 원하는 경우 또는 필요한 경우, (ii) 단계를 수행하기 전에 수행될 수 있다.
분해 또는 균질화는 임의의 통상적인 방법 예를 들어, 94℃까지 가열시키거나, 초음파 처리하거나, 또는 분해 제제 예를 들어, 세제를 첨가함으로써 수행될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 예를 들어, 바이러스에 의해 생산된 cDNA 또는 복제된 RNA로부터 유래하는 DNA가 (ii) 단계에서 검출되는 경우, 이러한 DNA 검출 과정은 증폭 반응 예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 수행되는 것이 바람직하다. 이러한 경우, 시약 예를 들어, 프라이머, 중합 효소, 뉴클레오티드 및 완충액에 관하여는 널리 공지되어 있으며, 필요에 따라서는 세포를 분해한 후에 (i) 단계의 마지막에 첨가할 수 있으며, 이후 존재하는 임의의 표적 DNA를 증폭시키기 위해 종래의 방법에서와 같은 열 순환 단계에 도입할 수 있다.
이후, 증폭 생성물은 종래의 방법 예를 들어, 겔 전기 영동법을 수행한 후 염료를 사용하여 가시화함으로써 확인될 수 있다.
증폭 반응은, 이 증폭 반응이 진행됨에 따라서 증폭 생성물이 검출 가능한 신호, 특히 가시 신호 예를 들어, 형광 신호를 발생시키는 방식으로 수행된다. 이와 같은 신호를 발생시키는 다수의 검정 방법에 관하여는 당 업계에 공지되어 있다. 이러한 검정 방법에서는 시약 예를 들어, DNA 결합제 예를 들어, DNA에 개입될 때 더욱 강한 세기의 방사선, 특히 형광 방사선을 방출하는 개입 염료와, 형광 표지가 형광 에너지 전이(FET), 특히 형광 공명 에너지 전이(FRET)를 수행할 수 있도록 결합되어 있는 프로브 및 프라이머를 이용할 수 있다.
일반적으로 사용되는 FET 또는 FRET 프로브로서는 2가지 종류가 있는데, 그 중 하나는 핵산 프로브를 가수 분해하여 수용체로부터 공여체를 분리시키는 것이고, 다른 하나는 혼성화를 통하여 공여체 및 수용체 분자간 공간적 관계를 변형시키는 것이다.
가수 분해 프로브는 TaqMan™으로서 시판되고 있다. 이 프로브는 공여체 및 수용체 분자로 표지화된 DNA 올리고뉴클레오티드로 이루어져 있다. 이 프로브는 PCR 산물의 한쪽 가닥에 존재하는 특정 부위에 결합하도록 디자인된다. PCR 프라이머를 이 가닥에 어닐링시킨 다음, 5'→3' 중합 효소 활성을 가지는 Taq 효소를 사용하여 DNA를 증폭시킨다. Taq 효소는 또한 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성도 나타낸다. TaqMan™ 프로브가 Taq 증폭 반응을 프라이밍시키는 것을 막기 위해, 이 프로브의 3' 말단을 인산화시켜 보호한다. 만일 TaqMan™ 프로브가 생산 가닥에 혼성화되면, 증폭하는 Taq 분자는 이 프로브에 혼성화되어, 수용체로부터 공여체를 분리시킬 수 있는데, 이것은 검출 방법의 토대가 된다. 이 예에서 신호는 누적적인 것으로서, 유리 공여체 분자 및 수용체 분자는 증폭 반응의 각 주기가 진행됨에 따라서 그 양이 증가하게 된다.
혼성화 프로브는 다수의 형태로 시판되고 있다. 분자 비콘(molecular beacon)은 상보적인 5' 및 3' 서열을 가져 헤어핀 루프(hairpin loop)를 형성하는 올리고뉴클레오티드이다. 말단의 형광 표지는 헤어핀 구조가 형성될 때 발생하는 FRET이 일어나기 쉬운 곳에 위치한다. 분자 비콘이 상보적 서열에 혼성화된 후, 형광 표지는 분리되고, 그 결과 FRET은 발생하지 않게 되는데, 이것도 검출 방법의 토대가 된다.
표지화된 올리고뉴클레오티드 쌍도 사용될 수 있다. 이 올리고뉴클레오티드는 공여체 및 수용체 분자를 모두 보유하는 PCR 생산 가닥에 매우 근접하여 혼성화되므로 FRET이 발생할 수 있다. 강화된 FRET은 검출 방법의 토대가 된다. 이러한 종류의 변형예로서는, 표지화된 증폭 프라이머를 단일의 인접 프로브와 함께 사용하는 것을 포함한다.
증폭 반응이 진행되는지 여부를 확인하는 기타 방법들도 공지되어 있지만, 그러한 방법 중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법의 구체예에 관하여는 예를 들어, WO 99/28500, 영국 특허 제2,338,301호, WO 99/28501 및 WO 99/42611에 개시되어 있다.
WO 99/28500에는, 시료 중 표적 핵산 서열의 존부를 검출하기 위한, 매우 성공적인 검정법에 관하여 개시되어 있다. 이 방법에 있어서, 상기 표적 서열에 특이적인 프로브 및 DNA 이중체 결합제가 시료에 첨가된다. 이 프로브는 상기 DNA 이중체 결합제로부터 형광을 흡수할 수 있는 반응성 분자, 또는 이 DNA 이중체 결합제에 형광 에너지를 부여할 수 있는 반응성 분자를 포함한다. 이후, 상기 혼합물은 표적 핵산이 증폭되는 증폭 반응에 도입되고, 반응 조건은 프로브가 표적 서열에 혼성화되는 증폭 반응 진행 중 또는 진행 후에 유도된다. 이 시료로부터 유래하는 형광도를 관찰한다.
이러한 검정법의 대안적 형태 즉, 프로브상에 존재하는 형광 표지로부터 형광 에너지를 흡수할 수는 있으나 가시 광선을 방출하지 않는 DNA 이중체 결합제를 이용하는 방법에 관하여는 공동 계류중인 영국 특허 출원 제223563.8호에 개시되어 있다. 이러한 검정법 중 임의의 방법은 표적 cDNA 서열을 검출하기 위한 본 발명의 방법 중에 사용될 수 있다.
이러한 검정법의 대다수는 당 업계에 널리 공지된 정량적 방식 예를 들어, 증폭 반응의 각 주기가 진행되는 동안에 1회 이상 증폭 혼합물로부터 발생하는 신호를 관찰함으로써 수행될 수 있다.
이러한 방식으로 반응을 진행시킴으로써, 시료 중에 존재하는 핵산의 양을 측정할 수 있다. 이러한 방법은 원래 시료 중에 존재하는 생 세포의 양과 관련이 있을 수 있거나, 또는 생 세포 내에서 바이러스가 복제함에 따라서 핵산의 양이 증가하는지 여부를 측정하는 데 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 검출된 특정 핵산은 임의의 특징을 갖는 서열 즉, 생 세포가 바이러스에 감염됨에 따라서 생산 또는 복제되는 서열일 수 있다. 단일의 특이성을 가지는 바이러스가 이 검정법에 사용되는 경우, 그 서열은 바이러스로부터 유래하는 임의의 서열이거나, 또는 재조합 바이러스 제조시 이 바이러스에 도입된 임의의 기타 서열일 수 있다. 바이러스가 마커 서열을 포함하도록 변형된 변형 바이러스일 때, 핵산은 세포 내에서 바이러스가 복제될 때에 특이적으로 생산되는 것이다.
바이러스의 다중 특이성을 가지는 혼합물이 본 방법에 사용되는 경우, 시료 중 특정 유형의 세포가 살아있는지 여부를 확인하기 위해 사용되는 바이러스 각각으로부터 전사되는 특징적 서열인 핵산을 검출할 필요가 있다. 그러므로, 이와 같은 경우, 세포 내에서 바이러스가 복제될 때에만 생산되며, 사용된 각 바이러스 내에 존재하는, 특이적으로 도입한 마커 서열에 상응하는 서열을 검출하는 것이 바람직할 수 있다.
이 경우, 검출된 서열이 DNA 서열인 경우, 상이한 신호 전달 시약 또는 시스템을 사용하는 다중체 PCR 반응은, 생산되는 다양한 서열을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이 반응은 예를 들어, 상이한 표지 예를 들어, 상이한 파장에서 형광을 방출하는 표지를 이용하여, 증폭 반응에 사용되는 프로브 또는 프라이머를 표지화함으로써 이루어질 수 있다. 이후, 필요에 따라서는, 파장이 중첩되는 경우 적당한 신호 해상도를 가지는 각 표지에서 발생하는 신호 예를 들어, 파장이 각각 상이한 신호를 관찰한다.
본 발명의 방법에 있어서, 검출되는 핵산이 바이러스 자체 내에 존재하는 경우, 생 세포가 존재함을 나타내는 데 사용될 수 있는 핵산의 양은 증가하게 된다. 그러므로, (ii) 단계에서, 시료는 핵산 서열의 농도가 어느 정도 증가하였는지 확인하기 위해 테스트된다. 표적 핵산 서열의 양이 증가함은 시료 중에 살아있는 숙주 세포가 존재함을 말해주는 것이다. 반면에, 표적 핵산의 양이 증가하지 않음은 테스트될 시료 중에 살아있는 숙주 세포가 존재하지 않음을 말해주는 것이다.
이와 같은 구체예에서, 항온 처리 전, 시료에 바이러스를 첨가함으로써 생성되는 혼합물로부터 시료를 추출하고, 이와 같이 추출된 테스트 시료 중에 존재하는 핵산의 양을 비교 기준으로 삼는 것이 바람직할 수 있다. 부가의 추출 시료는 항온 처리 과정 중 임의의 시기에 대안적으로 또는 부가적으로 취하여질 수 있다.
항온 처리 이전 및 이후에 존재하는 핵산의 양은 적당한 방법에 의해 측정되는 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, DNA 농도 측정에는 증폭 반응을 포함하지 않는 기타 DNA 검출 방법이 사용될 수도 있지만, 정량적 증폭 반응 예를 들어, 정량적 PCR을 사용할 수도 있다. RNA 농도는 RT-PCR 방법 즉, 생산된 DNA를 적당한 때에 PCR 반응과 병행하여 검출하는 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
항온 전처리 시료(pre-incubation sample) 및 항온 후처리 시료(post-incubation sample)는 동일한 방식으로 처리되어야 하므로, 그 결과는 직접 비교될 수 있다. 가장 바람직하게는 물 대조군을 사용하기도 한다.
본 발명의 추가의 측면은 전술한 방법들을 수행하는 키트를 제공하는 것이다. 이 키트는 바이러스와, 핵산 검출에 필요한 1종 이상의 시약을 포함하는 것이 적당하다.
바람직한 구체예에서, 상기 키트는 바이러스와, 상기 세포 내에서 바이러스를 복제시킴으로써 얻어지는 핵산을 검출하는 데 필요한 1종 이상의 시약을 포함하는데, 단, 바이러스가 마커 서열을 포함하도록 변형된 변형 바이러스인 경우, 1종 이상의 시약은 이 세포 내에서 바이러스 복제시에만 생산되는 핵산을 검출하는 데 필요한 것이다.
가장 바람직하게, 상기 바이러스는 박테리오파지이지만, 하등 및/또는 고등 진핵 생물 세포를 감염시킬 수 있는 기타 DNA 또는 RNA 바이러스는 테스트되는 세포의 특성에 따라서 달리 사용될 수 있다.
사용된 바이러스가 RNA 바이러스인 경우, 이 바이러스는 (i) 단계의 수행 전에 오염 DNA(contaminating DNA)가 최소한 부분적으로, 또는 완전히 제거된 것이 바람직하다. 이러한 바이러스는 본 발명의 추가의 측면을 이룬다.
상기 키트는 RNA 바이러스와, 이 RNA 바이러스 내 서열을 역전사시킴으로써 얻을 수 있는 cDNA를 검출하기 위한 1종 이상의 시약을 포함할 수 있는 것이 적당하다. 가장 바람직하게, 상기 1종 이상의 시약은 상기 RNA 바이러스 내에 존재하는 서열을 역전사시킴으로써 얻을 수 있는 임의의 cDNA에 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다.
대안적으로, 상기 키트는 DNA를 정량적으로 검출하는 데 적당한 1종 이상의 시약과 DNA 바이러스를 포함할 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 1종 이상의 시약은 바이러스 내에 존재하는 DNA 서열에 특이적인 한 쌍의 프라이머를 포함한다.
대안적으로, 키트는 RNA를 검출하기 위한 RT-PCR 반응을 수행하는 데 필요한 시약 예를 들어, 프라이머를 포함할 수 있다.
키트에 부가할 수 있는 성분(element)으로서는 핵산 서열의 검출에 사용하기에 적당한 기타 시약을 포함한다. 특히, 상기 키트는 개입 염료 또는 전술한 방법을 이용하여 생산되는 임의의 핵산을 검출하는 데 사용되는 프로브를 포함할 수 있다.
프라이머는 증폭 반응 산물을 직접 검출하는 방식으로 적당히 표지화될 수 있다. 예를 들어, 이 프라이머는 전술한 바와 같이 형광 표지 또는 기타 표지를 포함할 수 있다.
부가적으로 또는 대안적으로, 상기 키트는 증폭 반응 산물에 특이적이고 이 증폭 반응 산물의 검출을 도와주도록 표지화되는 프로브를 포함할 수 있다. 상기 키트는 단일 표지화 또는 이중 표지화 가수 분해 프로브 또는 혼성화 프로브를 포함할 수 있다. 적당한 경우, 이 키트는 검출 시스템의 일부를 이루는 개입 염료 또는 기타 DNA 이중체 결합제를 포함할 수 있다.
이하, 본 발명은 첨부된 도면을 참고로 하여 실시예를 통해 구체적으로 기술될 것이다.
도 1은 본 발명에 의한 검출 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 이하 실시예 2에 기술된 모든 테스트 시료에 대한 증폭 곡선을 나타내는 것이다.
도 3은 정방향 프라이머를 사용하여 임의의 cDNA를 증폭시킨 결과를 나타내는 것으로서, 이를 통하여 테스트 시료 중 어느 것에서도 cDNA가 증폭되지 않았음을 알 수 있다.
도 4는 역방향 프라이머를 사용하여 임의의 cDNA를 증폭시킨 결과를 나타내는 것으로서, 이를 통하여 1:10, 1:100 및 1:1000 농축 테스트 시료 각각에 대해 약 25번째, 29번째, 32번째 및 34번째 주기에 증폭이 일어났음을 알 수 있다.
도 5는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 둘 다를 사용하여 cDNA를 증폭시킨 결과를 나타내는 것으로서, 이를 통하여 1:10 및 1:100 농축 테스트 시료 각각에 대해 약 20번째, 23번째 및 27번째 주기에 증폭이 일어났음을 알 수 있다.
실시예 1
도 1에 나타낸 구체예에 있어서, 단일 가닥 (-) 게놈을 가지는 제V군 바이러스 제제를 시료에 가하였다.
이 시료는 임의의 적당한 시료로서, 발효액 또는 인산염-완충 염수(PBS) 중 박테리아 추출물을 포함할 수 있는데, 여기서 상기 박테리아는 스트레스를 받지 않은 것이므로 바이러스에 감염될 수 있는 것이다. 예를 들어, 필요에 따라서 시료는 희석되어, 발효액 또는 인산염-완충 염수(PBS) 중 박테리아 추출물 1 ㎖당 6×106∼2×103개의 세포를 함유할 수 있다.
바이러스 제제는 예를 들어, DNAase 효소 처리와 같은 전 처리를 통하여 오염 DNA를 제거하는 것이 적당하다. 이 제제는 또한 예를 들어, 완충 펩톤 수(BPW) 중에 재현탁된 후 원심 분리되어, 예를 들어, 파지 역가 1010/㎖이 되도록 만들어질 수 있다.
이후, 이러한 제제 예를 들어, 약 20 ㎕의 파지를 첨가한 후, 30초 동안 천천히 혼합한다. 이후, 상기 혼합물을 5분 동안 적당히 방치하여 파지 부착을 촉진한다.
그 다음, 배양액을 천천히 교반하면서 예를 들어, 37℃의 수조 내에서 30분 동안 적당히 항온 처리한다.
이 기간 동안, 파지는 (도시한 바와 같이) 생 세포에 감염할 것이며, 그 결과 (+) RNA의 다수의 복사체가 이 세포 내에서 생산된다.
필요에 따라, 이 과정의 마지막 단계에서는 예를 들어, 세포를 94℃까지 가열시킴으로써 이 세포를 용해하고, 또한 결과로 생성된 혼합물을 RT-PCR 수행시켜, (+) RNA로부터 상보적 DNA 서열을 생성하게 된다. 이러한 과정은 (+) RNA에 특이적인 단일의 프라이머를 사용함으로써 적당히 진행된다.
쥣과 동물의 역전사 효소 또는 AMV 반응에 있어서 통상적인 조건의 예는 다음과 같다:
완충액(최종 완충액) :
1O mM Tris.CL pH8.3 (실온)
1∼6 mM MgCl2
0.1% 젤라틴(선택적), 10∼50 mM KCL,
BSA 분획 V 1∼100㎍/㎖
뉴클레오티드 50∼400μM
프라이머:
(PCR에) 특이적인 랜덤 헥사뉴클레오티드(Random Hexanucleotides), 또는 폴리 dt("tttttttt...") 0.1∼lμM
효소:
0.25∼5 유닛/㎕ (효소에 따라 다름)
선택 사항:
태반 RNA 분해 효소 억제제 1∼20 유닛
생성물을 RNA 분해 효소로 처리하면, cDNA 즉, 종래의 PCR 반응에 의해 증폭 및 검출 가능한 cDNA를 막 이탈한 RNA를 분해할 것이다.
모든 단계는 신속하게 진행되므로, 생 세포를 검출하기 위한 신속 검정법을 제공하게 된다.
실시예 2
가닥 선택적 MS2 RT-PCR 실험
본 실험은 cDNA가 가닥 지정(strand directed) RT-PCR을 이용하여 생산 및 검출될 수 있음을 입증하기 위해 수행되었다. 특히, 이 실험에서는 MS2 박테리오파지 내에서의 가닥 특이적인 2단계 RT-PCR에 대하여 관찰하였다. 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 개별적으로 사용하여 cDNA를 제조한 한편, 상기 프라이머 둘 다를 함께 사용해서도 cDNA를 제조하였다. MS2에는 한 가지 유형의 RNA만 존재하므로, 프라이머(예를 들어, 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머) 중 하나만이 PCR에서 증폭될 DNA를 생산하는 것으로 예측되었다.
방법
본 실험에서 사용된 프라이머 및 프로브 서열을 이하 표 1에 나타내었다. 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 모두를 농도 10μM이 될 때까지 DEPC 처리한 물로 희석하였다. 상기 프로브도 농도 2μM이 될 때까지 희석시켰다. 제1 프로브는 0.1× TE로 희석하고, 제2 프로브는 DEPC 처리한 물로 희석하였다.
MS2 프라이머 및 프로브
프라이머 명 서열(5'→3') 길이 변형 여부
정방향 프라이머 TCG TCG ACA ATG GCG GAA CTG 21 무
역방향 프라이머 CTT TAG GCA CCT CGA CTT TGA TGG 24 무
제1 프로브 AGC TCT AAC TCG CGT TCA CAG GCT TAC AAA GTA ACC TGT T 40 3' FAM
제2 프로브 GTT CGT CAG AGC TCT GCG CAG AAT CGC AAA TAT 33 5' Cy5 & 3'인산염
RT 단계에 있어서, 이하 표 2에 나열한 시약의 농축물을 사용하여 3개의 반응 혼합물을 제조하였다.
RT 단계에 사용된 시약
시약 번호 스톡 농도 첨가량(㎕) 최종 농도
F & R 프라이머 F 프라이머 R 프라이머
반응 완충액 1009 5× 16 16 16 1×
dUTP 24/11 2mM 20 20 20 0.5mM
정방향 프라이머 ---- 10μM 10 10 0 1.25μM*
역방향 프라이머 ---- 10μM 10 0 10 1.25μM*
* 첨가할 경우
RT 반응 혼합물은 DEPC 처리한 물과 합하여 총 71㎕였다. 그 다음, MS2 8㎕(농도 = 4×109/㎖)를 각 튜브에 첨가하였다. 상기 시료를 혼합한 다음, 각각 35㎕씩 2개의 튜브에 나누어 담고, 이를 10분 동안 90℃에서 변성시켰다. 이후, 상기 튜브를 얼음 상에 놓은 다음, RT 효소 MMuLV(60 유닛/㎕, #173) 0.5 ㎕를 상기 각 튜브에 첨가하였다. 이 시료를 천천히 혼합한 다음 48℃의 수조에 30분 동안 방치하여, cDNA를 전사시켰다.
다음과 같은 PCR용 테스트 시료들을 두 개씩 준비하였다:
DEPC 처리한 물, 네거티브 대조군(ntc)
정방향 프라이머를 이용하여 제조된 cDNA를 연속하여 4회 10배 희석한 희석물
역방향 프라이머를 이용하여 제조된 cDNA를 연속하여 4회 10배 희석한 희석물
상기 양 프라이머를 이용하여 제조된 cDNA를 연속하여 3회 10배 희석한 희석물
MS2 정제 DNA 산물의 1:1000 희석액, 포지티브 대조군.
PCR 반응 혼합물을 코벳 로봇(Corbett robot)을 사용하여 제조하였다. 각 반응물에 존재하는 시약의 농도를 이하 표 3에 나열하였다.
PCR 혼합물에 사용된 시약의 농도
시약 번호 스톡 농도 시료당 첨가량 (㎕) 최종 농도
Tris 완충액 (pH8.8) 0016 0.5M 2 50 mM
BSA B8667 20㎎/㎖ 0.25 0.25㎎/㎖
MgCl2 019 100mM 0.6 3mM
dUTP 24/11 2mM 2 0.2mM
제1 프로브 ---- 2μM 2 0.2μM
제2 프로브 ---- 2μM 2 0.2μM
정방향 프라이머 ---- 10μM 2 1μM
역방향 프라이머 ---- 10μM 2 1μM
Taq 항체 GC102TA/7 5유닛/㎕ 0.16 0.04유닛/㎕
Taq 중합 효소 14/4 5유닛/㎕ 0.16 0.04유닛/㎕
PCR 혼합물(18㎕)을 2㎕의 테스트 시료와 함께 라이트사이클러(LightCycler) 모세관에 첨가하였다. 상기 모세관에 마개를 씌우고 이를 간단히 3000 rpm에서 회전시켰다.
라이트사이클러 1.0(로쉐)에서 다음과 같은 프로그램을 실행하였다:
증폭(50회 수행)
변성 = 95℃에서 5초
어닐링 = 55℃에서 20초, 1회 형광도 판독
증폭 = 74℃에서 5초.
용융(1회 수행)
방치 = 50℃에서 15초
램프 온도 = 95℃(0.1초)/형광도 연속 판독
라이트사이클러 데이터 분석 프로그램을 사용하여 데이터를 분석하였다.
그 결과를 도 2∼5에 나타내었다.
도 2는 테스트 시료 전부에 대한 결과를 나타내는 것이다.
도 3은 정방향 프라이머를 함유하는 테스트 시료에 대한 결과를 나타내는 것이다.
도 4는 역방향 프라이머를 함유하는 테스트 시료에 대한 결과를 나타내는 것이다.
도 5는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 둘 다를 함유하는 테스트 시료에 대한 결과를 나타내는 것이다.
결과의 요약:
정방향 프라이머를 사용한 결과, PCR에서 검출용으로 사용될 cDNA가 불충분한 양만큼 생성되었다. 그러나, 역방향 프라이머를 사용한 결과 PCR에서 검출용으로 사용될 cDNA가 충분한 양만큼 생산되었다. 상기 양 프라이머를 모두 사용하였을 경우에는, cDNA가 고 효율로 증폭되어 PCR 증폭 과정 중 비교적 초기 단계에서 검출되었다.
그러므로, RNA를 역전사할 경우에만 생성되는 cDNA는 가닥 지정 RT-PCR을 사용하였을 때에 특이적으로 검출될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (20)

  1. 시료 중의 생 세포를 검출하는 방법으로서,
    (i) 바이러스가 임의의 생 세포를 감염시켜 그 안에서 복제할 수 있는 조건 하에서, 상기 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스와 함께 상기 시료를 항온 처리하는 단계; 및
    (ii) 상기 세포 내에서 바이러스 복제에 의해 얻어진 임의의 핵산을 검출하는 단계로서, 단, 상기 바이러스가 마커 서열을 포함하도록 변형된 변형 바이러스인 경우, 검출되는 핵산은 세포 내에서 바이러스가 복제할 때에만 생산되는 핵산인 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (ii) 단계에서 검출되는 핵산은 바이러스 자체 내에는 포함되어 있지 않으며, 이 바이러스가 세포 내에서 복제할 때에만 생산되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 바이러스가 RNA 바이러스인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (ii) 단계에서 검출되는 핵산은 상기 세포 내에서 상기 RNA 바이러스 내의 RNA 서열로부터 역전사되어 생산되는 cDNA인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 (ii) 단계 이전에, 시료를 RNA 분해 효소로 처리하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 자연 발생 DNA 또는 RNA 바이러스이고, 상기 (ii) 단계에서 검출되는 핵산은 바이러스 내에 존재하는 것이며, 상기 (ii) 단계에서 시료 중 상기 핵산량의 증가가 검출되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 바이러스는 상기 세포에 특이적인 자연 발생 바이러스인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 (ii) 단계에서 검출되는 핵산은 증폭 반응을 이용하여 검출하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 증폭 반응은 중합 효소 연쇄 반응(PCR)인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 (ii) 단계에서 검출을 실시하기 이전에, 이 시료 중의 임의의 온전한 세포를 분해하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 시료는 식품 또는 임 상 시료인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포이고, 상기 바이러스는 박테리오파지인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 세포는 이. 콜라이(E. coli), 살모넬라(Salmonella), 리스테리아(Listeria), 캄필로박터(Campylobacter), 레지오넬라(Legionella), 마이코박테리아(Mycobacterium), 스타필로코커스(Staphylococcus) 또는 스텝토코커스(Steptococcus)인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 특정 세포를 검출하는 방법을 수행하기 위한 키트로서, 바이러스와, 상기 세포 내에서 바이러스가 복제함으로써 얻어지는 핵산을 검출하는 데 필요한 1종 이상의 시약을 포함하며, 단, 바이러스가 마커 서열을 포함하도록 변형된 변형 바이러스인 경우, 상기 1종 이상의 시약은 세포 내에서 바이러스가 복제할 때에만 생산되는 핵산을 검출하는 데 필요한 것인 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 바이러스는 검출될 핵산을 포함하지 않으며, 상기 1종 이상의 시약은 세포 내에서 바이러스가 복제할 때에만 생산되는 핵산을 검출하는 데 필요한 것인 키트.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, RNA 바이러스와, 이 RNA 바이러스 내에서 서열이 역전사됨으로써 얻어질 수 있는 cDNA를 검출하기 위한 1종 이상의 시약을 포함하는 키트.
  17. 제14항에 있어서, 상기 바이러스는 검출될 핵산을 포함하는 자연 발생 DNA 또는 RNA 바이러스이고, 상기 1종 이상의 시약은 이 핵산량의 증가를 검출하는 데 필요한 것인 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 1종 이상의 시약은 한 쌍의 증폭 프라이머를 포함하는 것인 키트.
  19. 오염 DNA가 제거되도록 처리된 RNA 바이러스 제제.
  20. 제14항 내지 제16항 또는 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 바이러스는 제19항에 따른 바이러스 제제인 키트.
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