JP2944694B2 - 検出可能な表現型のファージ形質導入による細菌の検出 - Google Patents
検出可能な表現型のファージ形質導入による細菌の検出Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 1. 発明の分野 本発明は、一般的には生物試料における細菌の検出と
同定に関する。更に詳細には、本発明は、目的とする細
胞に特異的に感染し且つ検出可能な表現型に感染細胞を
形質導入することができるバクテリオファージによる生
物試料のスクリーニングに関する。
同定に関する。更に詳細には、本発明は、目的とする細
胞に特異的に感染し且つ検出可能な表現型に感染細胞を
形質導入することができるバクテリオファージによる生
物試料のスクリーニングに関する。
細菌の種および株の検出および同定は、様々な場合に
興味がある。例えば、食料、水および他の食品を病原菌
による汚染について迅速にスクリーニングすることがで
きることが必要とされている。患者の検体での細菌の検
出も、多くの感染性の病気の治療に必要である。後者の
場合には、細菌を具体的に分類することができることが
望ましい場合がしばしばあり、各種の殺菌剤に対する感
受性について細菌をスクリーニングすることが更に望ま
しいことがある。
興味がある。例えば、食料、水および他の食品を病原菌
による汚染について迅速にスクリーニングすることがで
きることが必要とされている。患者の検体での細菌の検
出も、多くの感染性の病気の治療に必要である。後者の
場合には、細菌を具体的に分類することができることが
望ましい場合がしばしばあり、各種の殺菌剤に対する感
受性について細菌をスクリーニングすることが更に望ま
しいことがある。
これまで、細菌の同定には、血清分類、栄養学的スク
リーニングおよびファージ分類のような各種の手法が用
いられてきている。血清分類では、標的細菌上で異なる
細胞表面抗原に結合することができる抗体のパネルを用
いる。栄養学的スクリーニングは、様々な種類の細菌の
代謝の要件の変動によるものである。良好に定義された
培地上で細菌を生育させる（または生育させる試みを行
う）ことによって、生育に必要な物質および生育を阻害
する物質に基づいて細菌を分類することができる。
リーニングおよびファージ分類のような各種の手法が用
いられてきている。血清分類では、標的細菌上で異なる
細胞表面抗原に結合することができる抗体のパネルを用
いる。栄養学的スクリーニングは、様々な種類の細菌の
代謝の要件の変動によるものである。良好に定義された
培地上で細菌を生育させる（または生育させる試みを行
う）ことによって、生育に必要な物質および生育を阻害
する物質に基づいて細菌を分類することができる。
本発明にとって特に興味深いのは、バクテリオファー
ジが別種のファージの宿主範囲が限定されることに基づ
いて細菌培養物を分類するのに用いられてきたことであ
る。未知細菌の純粋培養物の一部を別種のファージのパ
ネルで感染させることを試みることによって、細菌細胞
の種類を決定することができる。
ジが別種のファージの宿主範囲が限定されることに基づ
いて細菌培養物を分類するのに用いられてきたことであ
る。未知細菌の純粋培養物の一部を別種のファージのパ
ネルで感染させることを試みることによって、細菌細胞
の種類を決定することができる。
このようなファージ分類法は細菌の種類を同定する上
で極めて精確であり且つ確定的な方法であるが、この方
法は時間が掛かり、手間も掛かる。試料中の細胞を、先
ず純粋な培養物を単離することができるように生育させ
ねばならない。次に、純粋培養物の個々のコロニーを生
育させた後、数個に分割してパネル中の種種のファージ
に暴露させねばならない。暴露の後に、通常のプラーク
分析を行って、各種のファージと感染性を決定する。全
体の処理には24〜48時間またはそれ以上掛かり、それを
行うには極めて熟練した者が必要とされる。処置が長た
らしく且つ細菌コロニー中のプラークを同定する必要が
あるため、この手続きは自動化がし難い。更に、時間を
必要とするため、この手続きは治療に先立つ患者の感染
の性質を決定するのには理想的ではない。
で極めて精確であり且つ確定的な方法であるが、この方
法は時間が掛かり、手間も掛かる。試料中の細胞を、先
ず純粋な培養物を単離することができるように生育させ
ねばならない。次に、純粋培養物の個々のコロニーを生
育させた後、数個に分割してパネル中の種種のファージ
に暴露させねばならない。暴露の後に、通常のプラーク
分析を行って、各種のファージと感染性を決定する。全
体の処理には24〜48時間またはそれ以上掛かり、それを
行うには極めて熟練した者が必要とされる。処置が長た
らしく且つ細菌コロニー中のプラークを同定する必要が
あるため、この手続きは自動化がし難い。更に、時間を
必要とするため、この手続きは治療に先立つ患者の感染
の性質を決定するのには理想的ではない。
加熱処理または部分加熱滅菌により弱体化された細菌
のような無力化した細菌は、多くの食品加工の局面にお
いて主要な検出の問題である。このような無力化した細
菌は生育能力を有して（おり、したがって潜在的に病原
性を有して）いることがあり、しかも十分に弱体化して
いるので、通常の分析法により検出には非選択的回収段
階（予備濃縮）と次に選択的濃縮段階で標的とする細菌
を生育させ、競合する生物の生育を抑制することができ
るようにすることが必要な場合がある。このような追加
段階は、分析を行うのに要する時間を著しく増加するこ
とがある。
のような無力化した細菌は、多くの食品加工の局面にお
いて主要な検出の問題である。このような無力化した細
菌は生育能力を有して（おり、したがって潜在的に病原
性を有して）いることがあり、しかも十分に弱体化して
いるので、通常の分析法により検出には非選択的回収段
階（予備濃縮）と次に選択的濃縮段階で標的とする細菌
を生育させ、競合する生物の生育を抑制することができ
るようにすることが必要な場合がある。このような追加
段階は、分析を行うのに要する時間を著しく増加するこ
とがある。
空気、水および土壌のような開放的環境での特定の細
菌の検出も問題があることがある。存在し得る細菌の種
類が多種多様であるため、関心のある特定の種類を識別
することが困難であることが多い。
菌の検出も問題があることがある。存在し得る細菌の種
類が多種多様であるため、関心のある特定の種類を識別
することが困難であることが多い。
上記の問題点に鑑み、生物学的試料において細菌細胞
を検出し、同定するための改良されたファージスクリー
ニング分析法を提供することが望ましい。特に、これら
の分析を比較的短時間に行うことができ且つこの分析法
が極めて単純で半熟練者でも行うことができることが望
ましい。これらの分析を混合培養物について最少限の段
階数で行い、且つ容易に観察され、自動読取りを行いや
すい検出可能な結果を生じるのが好ましい。この分析を
用いなければ検出には予備濃縮段階および選択的濃縮段
階を必要とするような無力化した細菌をこの分析で検出
することができるのが更に望ましい。また、空気、水お
よび土壌のような開放的環境中で特定の細菌細胞を迅速
且つ好都合に検出することができることが望ましい。
を検出し、同定するための改良されたファージスクリー
ニング分析法を提供することが望ましい。特に、これら
の分析を比較的短時間に行うことができ且つこの分析法
が極めて単純で半熟練者でも行うことができることが望
ましい。これらの分析を混合培養物について最少限の段
階数で行い、且つ容易に観察され、自動読取りを行いや
すい検出可能な結果を生じるのが好ましい。この分析を
用いなければ検出には予備濃縮段階および選択的濃縮段
階を必要とするような無力化した細菌をこの分析で検出
することができるのが更に望ましい。また、空気、水お
よび土壌のような開放的環境中で特定の細菌細胞を迅速
且つ好都合に検出することができることが望ましい。
2. 背景技術の説明 細菌細胞の表面を特性決定するのにバクテリオファー
ジを使用することは、Makela著、Enterobacterial Surf
ace−Antigens:Methods for Molecular Characterizati
on,Korhonenら監修、Elsevier Science Publishing、ア
ムステルダム155〜178頁（1985年）に述べられており、
従来のプラーク分析法を用いて特定のファージの感染性
を決定している。バクテリオファージP22の分析遺伝学
は、Susskind ＆ Botstein著（1978年）Microbiol.Re
v.,42,385−413に述べられている。P22が形質導入ベク
ターとして働く能力は、渡辺ら（1972年）Virol.,50,87
4−882およびOrbach ＆ Jackson著（1982年）J.Bacteri
ol.,149,985−994に記載されている。pac配列を組み込
んだ組換プラスミドを選択的に形質導入するのにP22を
使用することは、Schmidt ＆ Schmieger著（1984年）Mo
l.Gen.Genet.,196,123−128およびVogel ＆ Schmieger
著（1986年）Mol.Gen.Genet.,205,563−567に記載され
ている。外来遺伝子を、Spanova ＆ Karlovsky著（1986
年）Folia Microbiol.,31,353−363に記載されているよ
うに、トランスポゾン突然変異誘発によりバクテリオフ
ァージＬ（P22に関連）に挿入する。クローニングベク
ターとしてλファージを用いることは、Young ＆ Davis
著（1983年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,1194−1198に
記載されており、未知の遺伝子生成物を抗体プローブに
よって検出することができることが記載されている。ク
ローニングベクターとしてM13ファージを用いること
は、Vieira ＆ Messing著（1987年）Meths.Enz.,153,3
−11に記載されている。
ジを使用することは、Makela著、Enterobacterial Surf
ace−Antigens:Methods for Molecular Characterizati
on,Korhonenら監修、Elsevier Science Publishing、ア
ムステルダム155〜178頁（1985年）に述べられており、
従来のプラーク分析法を用いて特定のファージの感染性
を決定している。バクテリオファージP22の分析遺伝学
は、Susskind ＆ Botstein著（1978年）Microbiol.Re
v.,42,385−413に述べられている。P22が形質導入ベク
ターとして働く能力は、渡辺ら（1972年）Virol.,50,87
4−882およびOrbach ＆ Jackson著（1982年）J.Bacteri
ol.,149,985−994に記載されている。pac配列を組み込
んだ組換プラスミドを選択的に形質導入するのにP22を
使用することは、Schmidt ＆ Schmieger著（1984年）Mo
l.Gen.Genet.,196,123−128およびVogel ＆ Schmieger
著（1986年）Mol.Gen.Genet.,205,563−567に記載され
ている。外来遺伝子を、Spanova ＆ Karlovsky著（1986
年）Folia Microbiol.,31,353−363に記載されているよ
うに、トランスポゾン突然変異誘発によりバクテリオフ
ァージＬ（P22に関連）に挿入する。クローニングベク
ターとしてλファージを用いることは、Young ＆ Davis
著（1983年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,1194−1198に
記載されており、未知の遺伝子生成物を抗体プローブに
よって検出することができることが記載されている。ク
ローニングベクターとしてM13ファージを用いること
は、Vieira ＆ Messing著（1987年）Meths.Enz.,153,3
−11に記載されている。
細菌は、選択的培地、免疫同定法および核酸プローブ
のような多くの手法によって生物学的試料中で検出する
ことができる。サルモネラを検出するための特定の方法
は、米国特許第4,689,295号公報に記載されている。食
品中でサルモネラを検出するファージに基づいて試験
は、ASM News（1987年）53,542に記載されている。この
試験では、ファージを用いて標的にサルモネラの表面へ
の吸着を媒介する。
のような多くの手法によって生物学的試料中で検出する
ことができる。サルモネラを検出するための特定の方法
は、米国特許第4,689,295号公報に記載されている。食
品中でサルモネラを検出するファージに基づいて試験
は、ASM News（1987年）53,542に記載されている。この
試験では、ファージを用いて標的にサルモネラの表面へ
の吸着を媒介する。
氷形成を成核する能力は、数種類の氷成核陽性（In
a+）細菌中の単一の遺伝子によってコードされることが
報告されており、この能力は氷成核遺伝子を有するプラ
スミドでの形質転換によりE.コリに形質転換することが
できる。米国特許第4,464,473号明細書;Orserら著、Mol
ecular Genetics of the Bacterial−Plant Interactio
n（A.Puhler監修）Elsevier/North Holland Biochemica
l,353−361頁（1983年）;Greenら著（1985年）、Natur
e,317,645−648;およびCorottoら著（1986年）EMBO J.,
5,231−236を参照されたい。P.シリンガエ（P.syringa
e）中の氷成核遺伝子（遺伝子inaZ）の配列情報は報告
されている（Greenら著（1985年）同上）。対応するタ
ン白質は、分子量が約1.2×105のものである。このタン
白質の同定および精製に関する情報は、Wolberら著（19
86年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,7256−7260に報告さ
れている。P.フルオレスセンス（P.fluorescens）の氷
成核遺伝子（遺伝子inaW）についての配列情報も報告さ
れている。Warrenら著（1986年）Nuc.Acids Res.,14,80
47−8060を参照されたい。
a+）細菌中の単一の遺伝子によってコードされることが
報告されており、この能力は氷成核遺伝子を有するプラ
スミドでの形質転換によりE.コリに形質転換することが
できる。米国特許第4,464,473号明細書;Orserら著、Mol
ecular Genetics of the Bacterial−Plant Interactio
n（A.Puhler監修）Elsevier/North Holland Biochemica
l,353−361頁（1983年）;Greenら著（1985年）、Natur
e,317,645−648;およびCorottoら著（1986年）EMBO J.,
5,231−236を参照されたい。P.シリンガエ（P.syringa
e）中の氷成核遺伝子（遺伝子inaZ）の配列情報は報告
されている（Greenら著（1985年）同上）。対応するタ
ン白質は、分子量が約1.2×105のものである。このタン
白質の同定および精製に関する情報は、Wolberら著（19
86年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,7256−7260に報告さ
れている。P.フルオレスセンス（P.fluorescens）の氷
成核遺伝子（遺伝子inaW）についての配列情報も報告さ
れている。Warrenら著（1986年）Nuc.Acids Res.,14,80
47−8060を参照されたい。
液滴凍結分析法は、全細胞氷成核細菌および無細胞核
の存在についての既知の試験法である。無核表面上で容
積Ｖ（通常は0.01ml）のＮ個の液滴を配列させ、温度Ｔ
（０℃未満）に冷却し、凍結した液滴の数Nfを数えるこ
とから成っている。次に、1ml当たりの核の数を下記の
式：核/ml＝（1/V）loge〔N/（Ｎ−Nf）〕によって算出
する。G.Vali著（1971年）J.Atoms.Sci.,28,402−409。
の存在についての既知の試験法である。無核表面上で容
積Ｖ（通常は0.01ml）のＮ個の液滴を配列させ、温度Ｔ
（０℃未満）に冷却し、凍結した液滴の数Nfを数えるこ
とから成っている。次に、1ml当たりの核の数を下記の
式：核/ml＝（1/V）loge〔N/（Ｎ−Nf）〕によって算出
する。G.Vali著（1971年）J.Atoms.Sci.,28,402−409。
発明の概要 本発明によれば、生物学的試料中の生育可能な細菌を
検出して同定するための方法および組成物が提供され
る。これらの目的のため、生育可能な細菌という用語は
遺伝子を（一時的にまたはその他の方法で）発現させる
ことができる総ての細菌を包含する。組成物とは、既知
の宿主範囲の細菌に感染し、これらの細菌に形質導入し
て容易に検出し得る表現型、好ましくは氷成核表現型と
することができるバクテリオファージ粒子である。本発
明の方法はほとんどの種類の細菌を検出するのに好適で
あるが、標的細菌はバクテリオファージの感染を受け易
いものでなければならず且つ野生型細菌はそれ自体検出
可能な表現型を産生することができないという制限を有
する。目的の生物学的試料は、生育可能な条件において
細菌を支持し且つ保存することができる実質的に任意の
源から得ることができ、患者標本、水、酪農製品、食肉
製品等がある。かかる試料は、混合したまたは不純な個
体群の細菌を含むことがあり、目的の標的細菌を含むこ
とがあるが必ずしも含むとは限らない。本発明の好まし
い方法は、特に食品中のサルモネラの検出である。
検出して同定するための方法および組成物が提供され
る。これらの目的のため、生育可能な細菌という用語は
遺伝子を（一時的にまたはその他の方法で）発現させる
ことができる総ての細菌を包含する。組成物とは、既知
の宿主範囲の細菌に感染し、これらの細菌に形質導入し
て容易に検出し得る表現型、好ましくは氷成核表現型と
することができるバクテリオファージ粒子である。本発
明の方法はほとんどの種類の細菌を検出するのに好適で
あるが、標的細菌はバクテリオファージの感染を受け易
いものでなければならず且つ野生型細菌はそれ自体検出
可能な表現型を産生することができないという制限を有
する。目的の生物学的試料は、生育可能な条件において
細菌を支持し且つ保存することができる実質的に任意の
源から得ることができ、患者標本、水、酪農製品、食肉
製品等がある。かかる試料は、混合したまたは不純な個
体群の細菌を含むことがあり、目的の標的細菌を含むこ
とがあるが必ずしも含むとは限らない。本発明の好まし
い方法は、特に食品中のサルモネラの検出である。
本発明の方法は、細菌の存在について試料をスクリー
ニングしまたは未知の株または種の細菌を分類するのに
用いることができる。スクリーニングには、比較的広い
宿主範囲を有する単一バクテリオファージのみが必要と
なる。生物学的試料を細菌の生育を促進するのに好適な
条件下にてインキュベーションするのであり、純粋培養
物を提供する必要はない。このようなスクリーニング手
続きは極めて速やか且つ簡単であり、食品または水試料
のような汚染された試料を同定するのに特に有用であ
る。細菌分類法は、対照的に、独特なまたは重複した宿
主範囲を有するバクテリオファージのパネルを用いる。
バクテリオファージのそれぞれを、典型的にはファージ
パネルの各種の部分を試験を行う細菌の（純粋または他
の）培養物の部分に加えることによって、培養物に対し
て試験する。次に、細菌の種類を、個々のバクテリオフ
ァージの反応性のパターンに基づいて決定する。分類に
は細菌の純粋培養物を用いることがあるが、本発明の方
法はファージの感染性の検出が極めて速やかであり、分
析に要する全時間を著しく短縮するという利点を有す
る。更に、氷成核のような検出可能な表現型は自動化し
た装置で容易に検出することができるので、分析に要す
る労力が軽減される。
ニングしまたは未知の株または種の細菌を分類するのに
用いることができる。スクリーニングには、比較的広い
宿主範囲を有する単一バクテリオファージのみが必要と
なる。生物学的試料を細菌の生育を促進するのに好適な
条件下にてインキュベーションするのであり、純粋培養
物を提供する必要はない。このようなスクリーニング手
続きは極めて速やか且つ簡単であり、食品または水試料
のような汚染された試料を同定するのに特に有用であ
る。細菌分類法は、対照的に、独特なまたは重複した宿
主範囲を有するバクテリオファージのパネルを用いる。
バクテリオファージのそれぞれを、典型的にはファージ
パネルの各種の部分を試験を行う細菌の（純粋または他
の）培養物の部分に加えることによって、培養物に対し
て試験する。次に、細菌の種類を、個々のバクテリオフ
ァージの反応性のパターンに基づいて決定する。分類に
は細菌の純粋培養物を用いることがあるが、本発明の方
法はファージの感染性の検出が極めて速やかであり、分
析に要する全時間を著しく短縮するという利点を有す
る。更に、氷成核のような検出可能な表現型は自動化し
た装置で容易に検出することができるので、分析に要す
る労力が軽減される。
本発明の方法は、特定の細菌に対するバクテリオファ
ージの特異性を利用するものである。この特異性は、バ
クテリオファージを改質してマーカー遺伝子を含ませる
ときに保持される（実施例５参照）。その結果、本発明
の分析法による検出は、他の（標的でない細菌の）存在
とは無関係に特異的に行うことができる。勿論、本発明
の改質したバクテリオファージは、これが由来する野生
型ファージに比較するとその宿主範囲特異性が幾分変化
することがあることも（好ましくはないが）可能であ
る。かかる変動は、バクテリオファージが目的の細菌に
対する特異性を保持し且つ特定の試料に存在する可能性
がある他の細菌に対する特異性を持たない限り問題とは
ならない。
ージの特異性を利用するものである。この特異性は、バ
クテリオファージを改質してマーカー遺伝子を含ませる
ときに保持される（実施例５参照）。その結果、本発明
の分析法による検出は、他の（標的でない細菌の）存在
とは無関係に特異的に行うことができる。勿論、本発明
の改質したバクテリオファージは、これが由来する野生
型ファージに比較するとその宿主範囲特異性が幾分変化
することがあることも（好ましくはないが）可能であ
る。かかる変動は、バクテリオファージが目的の細菌に
対する特異性を保持し且つ特定の試料に存在する可能性
がある他の細菌に対する特異性を持たない限り問題とは
ならない。
本発明の方法は重要な利点は、生育可能であるが、例
えば、熱、低温または脱水のような有害なまたは弱体化
させる処理に暴露することによる何らかの方式で無力化
（生理学的に妥協）する細菌細胞を含む分析法に用いる
ことができることである。かかる無力化は、通常は工業
的処理、例えば食品に由来する細菌性汚染物の処理中に
生じる。本発明の分析法は、健康な細菌および無力化し
た細胞の混合物中の無力化した細胞のような無力化した
細胞を検出することができる（実施例４、熱による無力
化したサルモネラ細胞を含む）。この方法では著しく時
間を節約することになり、この方法は予備濃縮段階およ
び選択的濃縮段階の必要性が最少限度になりまたはなく
なる。これらの段階は、通常は他の生物の個体数を抑制
しながら標的細菌を検出可能な水準にまで増殖させる手
段として他の細菌分析法に用いられる。Andrews著、Inj
ured Index and Pathogenic Bacteria,Boca Raton、フ
ロリダ、56−113頁（1989年）を参照されたい。弱体化
した細胞は選択的濃縮の苛酷さに耐えることができない
ので、先行する非選択的な「予備濃縮」段階を用いて弱
体化した細胞を安定化させることが多い。食品医薬品局
のSalmonella単離プロトコールでは、この２つの段階
（予備濃縮および選択的濃縮）のそれぞれについて最低
22時間としている。Andrewsら著Bacteriological Analy
tical Manual、第５版、食品医薬品局、コロンビア特別
区、第VI章、１−29（1979年）。したがって、本発明の
方法は、無力化した細胞を有する系に適用するときには
かなりの時間の節約になる。
えば、熱、低温または脱水のような有害なまたは弱体化
させる処理に暴露することによる何らかの方式で無力化
（生理学的に妥協）する細菌細胞を含む分析法に用いる
ことができることである。かかる無力化は、通常は工業
的処理、例えば食品に由来する細菌性汚染物の処理中に
生じる。本発明の分析法は、健康な細菌および無力化し
た細胞の混合物中の無力化した細胞のような無力化した
細胞を検出することができる（実施例４、熱による無力
化したサルモネラ細胞を含む）。この方法では著しく時
間を節約することになり、この方法は予備濃縮段階およ
び選択的濃縮段階の必要性が最少限度になりまたはなく
なる。これらの段階は、通常は他の生物の個体数を抑制
しながら標的細菌を検出可能な水準にまで増殖させる手
段として他の細菌分析法に用いられる。Andrews著、Inj
ured Index and Pathogenic Bacteria,Boca Raton、フ
ロリダ、56−113頁（1989年）を参照されたい。弱体化
した細胞は選択的濃縮の苛酷さに耐えることができない
ので、先行する非選択的な「予備濃縮」段階を用いて弱
体化した細胞を安定化させることが多い。食品医薬品局
のSalmonella単離プロトコールでは、この２つの段階
（予備濃縮および選択的濃縮）のそれぞれについて最低
22時間としている。Andrewsら著Bacteriological Analy
tical Manual、第５版、食品医薬品局、コロンビア特別
区、第VI章、１−29（1979年）。したがって、本発明の
方法は、無力化した細胞を有する系に適用するときには
かなりの時間の節約になる。
好ましい態様では、形質導入するファージは氷成核遺
伝子を有する。試料を、先ずファージの細胞への付着を
促進する条件下で、典型的には約35℃〜40℃の範囲の温
度で、攪拌せずに、約150〜120分の範囲の時間、ファー
ジと共にインキュベーションするのである。その後、試
料を、氷成核表現型の展開を促進する条件下にて、典型
的には約20℃〜25℃の範囲の温度で約30分〜２時間の範
囲の時間懸濁液中でインキュベーションする。氷成核表
現型に形質転換した細菌は、通常のクリオアッセイによ
って、典型的には試験を行う懸濁液を容積が約10μ未
満の液滴に分割し、この液滴を約−３℃〜−12℃の範
囲、更に一般的には約−８℃〜−10℃範囲の温度に暴露
することによって検出される。このような温度範囲で氷
核が形成されることは、細菌の細胞表面に氷の成核部位
が存在することを示している。
伝子を有する。試料を、先ずファージの細胞への付着を
促進する条件下で、典型的には約35℃〜40℃の範囲の温
度で、攪拌せずに、約150〜120分の範囲の時間、ファー
ジと共にインキュベーションするのである。その後、試
料を、氷成核表現型の展開を促進する条件下にて、典型
的には約20℃〜25℃の範囲の温度で約30分〜２時間の範
囲の時間懸濁液中でインキュベーションする。氷成核表
現型に形質転換した細菌は、通常のクリオアッセイによ
って、典型的には試験を行う懸濁液を容積が約10μ未
満の液滴に分割し、この液滴を約−３℃〜−12℃の範
囲、更に一般的には約−８℃〜−10℃範囲の温度に暴露
することによって検出される。このような温度範囲で氷
核が形成されることは、細菌の細胞表面に氷の成核部位
が存在することを示している。
具体的な態様の説明 本発明は、改質したバクテリオファージ、以後形質導
入粒子と表わす、を用いて、生物学的試料中の細菌細胞
を検出しまたは同定する。本明細書に用いられる形質導
入粒子という用語は、改質したバクテリオファージの成
分部分であってこれらの成分部分を適当な条件下で互い
に混合すると結合して改質したバクテリオファージを形
成するものをも包含するものとする。生物学的試料は、
細菌の生育を支持し或いは生育可能な状態で細菌細胞を
懸濁することができる実質的に任意の物質または媒体で
あることができる。本発明にとって特に興味深い生物学
的試料には、水、土壌、食品試料、例えば食肉製品およ
び酪農製品であって細菌による汚染を特に受けやすいも
の、患者の試料、例えば血液、血漿、血清、痰、精液、
唾液、洗浄液、糞便、細胞培養物等がある。
入粒子と表わす、を用いて、生物学的試料中の細菌細胞
を検出しまたは同定する。本明細書に用いられる形質導
入粒子という用語は、改質したバクテリオファージの成
分部分であってこれらの成分部分を適当な条件下で互い
に混合すると結合して改質したバクテリオファージを形
成するものをも包含するものとする。生物学的試料は、
細菌の生育を支持し或いは生育可能な状態で細菌細胞を
懸濁することができる実質的に任意の物質または媒体で
あることができる。本発明にとって特に興味深い生物学
的試料には、水、土壌、食品試料、例えば食肉製品およ
び酪農製品であって細菌による汚染を特に受けやすいも
の、患者の試料、例えば血液、血漿、血清、痰、精液、
唾液、洗浄液、糞便、細胞培養物等がある。
検出される細菌の細胞の範囲は、利用可能なバクテリ
オファージの宿主範囲によってのみ制限される。特に興
味あるのは、食品および水供給物を汚染することができ
且つ動物およびヒトの病気を引き起こす原因となる病原
性細菌である。これらの病原性細菌は通常はグラム陰性
であるが、グラム陽性菌の検出および同定も本発明の一
部である。特に興味深い細菌宿主、これらの宿主によっ
て引き起こされる病気およびこれらの宿主に感染するこ
とができるバクテリオファージの代表的リストを、第１
表に示す。
オファージの宿主範囲によってのみ制限される。特に興
味あるのは、食品および水供給物を汚染することができ
且つ動物およびヒトの病気を引き起こす原因となる病原
性細菌である。これらの病原性細菌は通常はグラム陰性
であるが、グラム陽性菌の検出および同定も本発明の一
部である。特に興味深い細菌宿主、これらの宿主によっ
て引き起こされる病気およびこれらの宿主に感染するこ
とができるバクテリオファージの代表的リストを、第１
表に示す。
本発明の形質導入粒子は、天然に存在するバクテリオ
ファージを改質して、標的細菌を容易に識別し得る表現
型に形質転換することができる遺伝子、以後一次マーカ
ー遺伝子と表わす、を有するようにすることによって得
られる。形質導入粒子は、細菌宿主が検出可能な方法で
遺伝子の機能を発現することができるように一次マーカ
ー遺伝子を標的細菌宿主に特異的に導入することができ
るものでなければならない。多くのバクテリオファージ
が存在し、所望な宿主範囲とバクテリオファージが目的
とする遺伝子を有し且つ形質導入する能力によって改質
されるように選択することができる。特に、バクテリオ
ファージは、一次マーカー遺伝子、関連したプロモータ
ー領域および包含される任意の他のDNA領域を収容し得
るほどに十分大きなものでなければならない。本発明の
改質バクテリオファージは、一般的には未改質バクテリ
オファージの正常な宿主範囲特異性を保持するが、選択
される標的細菌を同定する能力に悪影響を及ぼさない限
り特異性が変化してもよい。
ファージを改質して、標的細菌を容易に識別し得る表現
型に形質転換することができる遺伝子、以後一次マーカ
ー遺伝子と表わす、を有するようにすることによって得
られる。形質導入粒子は、細菌宿主が検出可能な方法で
遺伝子の機能を発現することができるように一次マーカ
ー遺伝子を標的細菌宿主に特異的に導入することができ
るものでなければならない。多くのバクテリオファージ
が存在し、所望な宿主範囲とバクテリオファージが目的
とする遺伝子を有し且つ形質導入する能力によって改質
されるように選択することができる。特に、バクテリオ
ファージは、一次マーカー遺伝子、関連したプロモータ
ー領域および包含される任意の他のDNA領域を収容し得
るほどに十分大きなものでなければならない。本発明の
改質バクテリオファージは、一般的には未改質バクテリ
オファージの正常な宿主範囲特異性を保持するが、選択
される標的細菌を同定する能力に悪影響を及ぼさない限
り特異性が変化してもよい。
改質されるバクテリオファージは溶菌性または毒性を
有するものであってもよく、好ましくは溶菌性であって
標的細菌において一次マーカー遺伝子を長時間に亙って
発現するものである。或いは、バクテリオファージの改
質によって、標的細菌宿主中にマーカー遺伝を導入する
ことができるが細胞溶解性または溶原性感染を行うこと
ができない欠陥のある形質導入粒子を生じることがあ
る。後者の場合には、一次マーカー遺伝子は、感染した
宿主中に支持され且つ発現されるプラスミドまたは他の
自己複製エピソーム単位の一部であってもよい。ファー
ジから誘導された正常な宿主範囲外の標的細菌に感染す
るときにも、同様な結果（感染なしのマーカー遺伝子の
導入）が起こることがある。
有するものであってもよく、好ましくは溶菌性であって
標的細菌において一次マーカー遺伝子を長時間に亙って
発現するものである。或いは、バクテリオファージの改
質によって、標的細菌宿主中にマーカー遺伝を導入する
ことができるが細胞溶解性または溶原性感染を行うこと
ができない欠陥のある形質導入粒子を生じることがあ
る。後者の場合には、一次マーカー遺伝子は、感染した
宿主中に支持され且つ発現されるプラスミドまたは他の
自己複製エピソーム単位の一部であってもよい。ファー
ジから誘導された正常な宿主範囲外の標的細菌に感染す
るときにも、同様な結果（感染なしのマーカー遺伝子の
導入）が起こることがある。
マーカー表現型の形質導入は、マーカー遺伝子の一次
的発現（すなわち、細胞によって安定に受け継がれてい
ない遺伝子からの発現）によって起こることがある。こ
のような場合には、バクテリオファージによって形質導
入されたDNAは、全試験期間中そのままの形でいること
は出来ない。しかしながら、ファージによって形質導入
されたマーカー遺伝子の転写は、DNAが分解して試験期
間の終わりまでに機能マーカーを集めてしまう前に十分
効率的である。したがって、細菌がファージDNAを分解
するとしても、細菌を本発明の分析法によって検出する
ことができる。
的発現（すなわち、細胞によって安定に受け継がれてい
ない遺伝子からの発現）によって起こることがある。こ
のような場合には、バクテリオファージによって形質導
入されたDNAは、全試験期間中そのままの形でいること
は出来ない。しかしながら、ファージによって形質導入
されたマーカー遺伝子の転写は、DNAが分解して試験期
間の終わりまでに機能マーカーを集めてしまう前に十分
効率的である。したがって、細菌がファージDNAを分解
するとしても、細菌を本発明の分析法によって検出する
ことができる。
本発明に有用なバクテリオファージは、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション、12301パークロー
ン・ドライブ、ロックビル、メリーランド20852のよう
な微生物貯蔵機関から得ることができる。毒性バクテリ
オファージは無細胞溶解物として利用可能であるが、溶
原性バクテリオファージは一般的には感染した宿主細胞
として利用可能である。
タイプ・カルチャー・コレクション、12301パークロー
ン・ドライブ、ロックビル、メリーランド20852のよう
な微生物貯蔵機関から得ることができる。毒性バクテリ
オファージは無細胞溶解物として利用可能であるが、溶
原性バクテリオファージは一般的には感染した宿主細胞
として利用可能である。
任意の源から得た野生型バクテリオファージを従来の
組換DNA技法によって改質して、目的とする検出可能な
表現型を産生することができる所望な一次マーカー遺伝
子を導入することができる。導入の前に、目的のするマ
ーカー遺伝子を、適当な遺伝子カセット上のプロモータ
ー領域と結合する。遺伝子カセットは、E.coliのような
適当な宿主中で通常の組換DNA技法によって構築するこ
とができる。マーカー遺伝子とプロモーター領域は両方
とも標的宿主中で機能するように選択すべきであり、カ
セットは所望ならば抗生物質耐性、重金属耐性等の二次
マーカー遺伝子を包含して、試験管内操作を容易にする
ことができる。
組換DNA技法によって改質して、目的とする検出可能な
表現型を産生することができる所望な一次マーカー遺伝
子を導入することができる。導入の前に、目的のするマ
ーカー遺伝子を、適当な遺伝子カセット上のプロモータ
ー領域と結合する。遺伝子カセットは、E.coliのような
適当な宿主中で通常の組換DNA技法によって構築するこ
とができる。マーカー遺伝子とプロモーター領域は両方
とも標的宿主中で機能するように選択すべきであり、カ
セットは所望ならば抗生物質耐性、重金属耐性等の二次
マーカー遺伝子を包含して、試験管内操作を容易にする
ことができる。
一次マーカー遺伝子（または、単独遺伝子系でない場
合には、複数の遺伝子）は、標的細菌宿主中で容易に検
出可能な表現型を発現することができるものとする。好
適な表現型には、生物発光、酵素によって触媒されるカ
ラーの産生（例えば、酵素β−グルクロニダーゼ（GU
S）を用いる）、氷成核活性などが挙げられる。通常の
氷成核分析法を用いて容易で且つ速やかに検出されるこ
とが本明細書で示されている氷成核活性を用いることが
好ましい。本開示の残りの部分は主として氷成核活性お
よび標的細菌細胞の導入および検出に向けられるが、開
示された原理は他の検出可能な表現型にも広く適用する
ことができる。
合には、複数の遺伝子）は、標的細菌宿主中で容易に検
出可能な表現型を発現することができるものとする。好
適な表現型には、生物発光、酵素によって触媒されるカ
ラーの産生（例えば、酵素β−グルクロニダーゼ（GU
S）を用いる）、氷成核活性などが挙げられる。通常の
氷成核分析法を用いて容易で且つ速やかに検出されるこ
とが本明細書で示されている氷成核活性を用いることが
好ましい。本開示の残りの部分は主として氷成核活性お
よび標的細菌細胞の導入および検出に向けられるが、開
示された原理は他の検出可能な表現型にも広く適用する
ことができる。
好適な氷成核遺伝子を、氷成核表現型を自然に表わす
微生物から単離することができる。氷成核遺伝子の例と
この遺伝子が単離される細胞には、プスードモナスシリ
ンガエS203（Pseudomonas syringae S203）から単離さ
れるinaZ、プスードモナスシリンガエPS31から単離され
るinaY、P.フルオレセンスMS1650（P.fluorescens MS16
50）から単離されるinaW、およびエルウィニアヘルビコ
ラ（Erwinia herbicola）から単離されるiceEが挙げら
れる。inaZの配列はGreen ＆ Warren（1985年）Nature,
317,645−648に記載されており、inaWの配列はWarrenら
（1986年）Nucl.Acid.Res.,14,8047−8060に記載されて
いるが、これらの文献の開始内容は参考として本明細書
に包含される。米国特許第4,464,473号公報も参照され
たい。また、この公報の記載内容は参考として本明細書
に包含される。これらの文献教示内容は、当業者が野生
型から氷成核生物を単離し、それから通常のクローニン
グおよびスクリーニング手法によってina遺伝子を得る
のに十分である。
微生物から単離することができる。氷成核遺伝子の例と
この遺伝子が単離される細胞には、プスードモナスシリ
ンガエS203（Pseudomonas syringae S203）から単離さ
れるinaZ、プスードモナスシリンガエPS31から単離され
るinaY、P.フルオレセンスMS1650（P.fluorescens MS16
50）から単離されるinaW、およびエルウィニアヘルビコ
ラ（Erwinia herbicola）から単離されるiceEが挙げら
れる。inaZの配列はGreen ＆ Warren（1985年）Nature,
317,645−648に記載されており、inaWの配列はWarrenら
（1986年）Nucl.Acid.Res.,14,8047−8060に記載されて
いるが、これらの文献の開始内容は参考として本明細書
に包含される。米国特許第4,464,473号公報も参照され
たい。また、この公報の記載内容は参考として本明細書
に包含される。これらの文献教示内容は、当業者が野生
型から氷成核生物を単離し、それから通常のクローニン
グおよびスクリーニング手法によってina遺伝子を得る
のに十分である。
本発明の形質導入粒子は多数の従来の遺伝学的操作
法、例えばマーカー遺伝子カセットのバクテリオファー
ジゲノム中への部位を指定した挿入、マーカー遺伝子ま
たはその一部を有するプラスミドのバクテリオファージ
コート中へのパッケージング、トランスポゾン突然変異
誘発および同種組換によって作成することができる。こ
れらの変法の選択は、細菌宿主の性状、バクテリオファ
ージの性状およびバクテリオファージが特性決定される
程度によって変わる。
法、例えばマーカー遺伝子カセットのバクテリオファー
ジゲノム中への部位を指定した挿入、マーカー遺伝子ま
たはその一部を有するプラスミドのバクテリオファージ
コート中へのパッケージング、トランスポゾン突然変異
誘発および同種組換によって作成することができる。こ
れらの変法の選択は、細菌宿主の性状、バクテリオファ
ージの性状およびバクテリオファージが特性決定される
程度によって変わる。
十分に特性決定されるバクテリオファージ、特に遺伝
学的に遺伝子の位置決定がされたものについては、プロ
モーター領域のような一次マーカー遺伝子カセットおよ
び所望ならば二次マーカーを標準的組換DNA手法によっ
てバクテリオファージゲノムに配置するのが望ましいこ
とがある。上記のような好適な宿主中でプラスミドを作
成した後、マーカー遺伝子カセットを摘出して、所望な
バクテリオファージ中に挿入する。他のバクテリオファ
ージにも一般化することができるλファージ中への挿入
法は、Young ＆ Davis（1983年）Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,80,1194−1198に記載されており、この文献の記載内
容は参考として本明細書に包含される。
学的に遺伝子の位置決定がされたものについては、プロ
モーター領域のような一次マーカー遺伝子カセットおよ
び所望ならば二次マーカーを標準的組換DNA手法によっ
てバクテリオファージゲノムに配置するのが望ましいこ
とがある。上記のような好適な宿主中でプラスミドを作
成した後、マーカー遺伝子カセットを摘出して、所望な
バクテリオファージ中に挿入する。他のバクテリオファ
ージにも一般化することができるλファージ中への挿入
法は、Young ＆ Davis（1983年）Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,80,1194−1198に記載されており、この文献の記載内
容は参考として本明細書に包含される。
溶解性または溶原性感染が可能な形質導入粒子は、バ
クテリオファージゲノムの本質的でない領域を欠失して
遺伝子カセットを置換することによって製造される。望
ましくは、欠失し、挿入される領域はほぼ同じ大きさで
あり、パッケージングが破壊を最少限に止どめて行うこ
とができるようにする。しかしながら、場合によって
は、特に比較的大きなマーカー遺伝子カセットを挿入す
ることが所望な時には、バクテリオファージゲノムのあ
る種の本質的領域を欠失する必要があることもある。こ
のような場合には、形質導入粒子はDNAを 所望の細菌宿主に送入する能力を保持するが、宿主内部
で再生を行うことができなくなる。しかしながら、野生
型バクテリオファージであって、本質的なパッケージン
グ機能を提供することができるもののようなヘルパーバ
クテリオファージを提供することによって再生を行うこ
とができる。
クテリオファージゲノムの本質的でない領域を欠失して
遺伝子カセットを置換することによって製造される。望
ましくは、欠失し、挿入される領域はほぼ同じ大きさで
あり、パッケージングが破壊を最少限に止どめて行うこ
とができるようにする。しかしながら、場合によって
は、特に比較的大きなマーカー遺伝子カセットを挿入す
ることが所望な時には、バクテリオファージゲノムのあ
る種の本質的領域を欠失する必要があることもある。こ
のような場合には、形質導入粒子はDNAを 所望の細菌宿主に送入する能力を保持するが、宿主内部
で再生を行うことができなくなる。しかしながら、野生
型バクテリオファージであって、本質的なパッケージン
グ機能を提供することができるもののようなヘルパーバ
クテリオファージを提供することによって再生を行うこ
とができる。
また、良好に特性決定されたバクテリオファージに就
いては、DNA構成体中のバクテリオファージpac部位にプ
ラスミドまたはカセットを付着させることによってプラ
スミドまたはマーカー遺伝子カセットをパッケージする
ことが可能である。pac部位はバクテリオファージゲノ
ムから得て、一次マーカー遺伝子、プロモーター領域お
よび所望ならば二次マーカーを有するプラスミド中にク
ローニングすることができる。次に、プラスミドを高貴
な細菌宿主に形質転換し、これに次に欠損pac部位を有
するバクテリオファージを感染させる。細菌宿主は、次
いでプラスミドおよび／またはプラスミドDNAをその宿
主範囲の細菌中に挿入することができるバクテリオファ
ージコート内部でパッケージされたマーカー遺伝子カセ
ットを有する形質導入粒子を産生する。pac部位をクロ
ーニングし、パッケージング欠損バクテリオファージを
産生する一般的方法は、Vogel ＆ Schmieger（1986年）
Mol.Gen.Genet.,205,563−567に記載されており、その
開示内容は参考として本明細書に包含される。
いては、DNA構成体中のバクテリオファージpac部位にプ
ラスミドまたはカセットを付着させることによってプラ
スミドまたはマーカー遺伝子カセットをパッケージする
ことが可能である。pac部位はバクテリオファージゲノ
ムから得て、一次マーカー遺伝子、プロモーター領域お
よび所望ならば二次マーカーを有するプラスミド中にク
ローニングすることができる。次に、プラスミドを高貴
な細菌宿主に形質転換し、これに次に欠損pac部位を有
するバクテリオファージを感染させる。細菌宿主は、次
いでプラスミドおよび／またはプラスミドDNAをその宿
主範囲の細菌中に挿入することができるバクテリオファ
ージコート内部でパッケージされたマーカー遺伝子カセ
ットを有する形質導入粒子を産生する。pac部位をクロ
ーニングし、パッケージング欠損バクテリオファージを
産生する一般的方法は、Vogel ＆ Schmieger（1986年）
Mol.Gen.Genet.,205,563−567に記載されており、その
開示内容は参考として本明細書に包含される。
余り特性決定されていないバクテリオファージについ
ては、トランスポゾン突然変異誘発を用いて本発明の形
質導入粒子を作成することができる。ファージＬ（Salm
onella typhimurium）の突然変異誘発についてのSpanov
a ＆ Karlovsky（1986年）Folia Microbiol.,31,353−3
63の方法（この開示内容は参考として本明細書に包含さ
れる）を一般化して他のトランスポゾン、バクテリオフ
ァージおよび細菌宿主に適用することができる。前記の
プラスミドからのマーカー遺伝子カセットを、先ず通常
の手法によって所望なトランスポゾンに挿入する。次い
で、改質したトランスポゾンを、好適な宿主に改質トラ
ンスポゾンとバクテリオファージの両者を同時感染させ
ることによって所望なバクテリオファージ中に転位させ
る。宿主細胞を次に溶菌が起きるまでインキュベーショ
ンし、放出されたファージを集める。放出されたファー
ジの一部はトランスポゾンインサートを有している。次
に、バクテリオファージのない宿主細胞に前記の方法で
得られたファージ混合物を感染させて、トランスポゾン
上に存在する検出可能なマーカーを有する細胞を選択す
る。次に、改質トランスポゾンを有するバクテリオファ
ージが溶原性になった溶菌されていない選択された細胞
を選択媒質にのせて、所望なフェノタイプについてスク
リーニングする。こうして選択された細胞は、適当なプ
ロモーターのコントロール下で所望な一次マーカー遺伝
子を有するプロファージを含む。次に、形質導入粒子
が、プロファージを誘発して溶菌状態にすることによっ
て得られ、これによって細胞溶解を生じ、多量の好適な
形質導入粒子を放出させることができる。
ては、トランスポゾン突然変異誘発を用いて本発明の形
質導入粒子を作成することができる。ファージＬ（Salm
onella typhimurium）の突然変異誘発についてのSpanov
a ＆ Karlovsky（1986年）Folia Microbiol.,31,353−3
63の方法（この開示内容は参考として本明細書に包含さ
れる）を一般化して他のトランスポゾン、バクテリオフ
ァージおよび細菌宿主に適用することができる。前記の
プラスミドからのマーカー遺伝子カセットを、先ず通常
の手法によって所望なトランスポゾンに挿入する。次い
で、改質したトランスポゾンを、好適な宿主に改質トラ
ンスポゾンとバクテリオファージの両者を同時感染させ
ることによって所望なバクテリオファージ中に転位させ
る。宿主細胞を次に溶菌が起きるまでインキュベーショ
ンし、放出されたファージを集める。放出されたファー
ジの一部はトランスポゾンインサートを有している。次
に、バクテリオファージのない宿主細胞に前記の方法で
得られたファージ混合物を感染させて、トランスポゾン
上に存在する検出可能なマーカーを有する細胞を選択す
る。次に、改質トランスポゾンを有するバクテリオファ
ージが溶原性になった溶菌されていない選択された細胞
を選択媒質にのせて、所望なフェノタイプについてスク
リーニングする。こうして選択された細胞は、適当なプ
ロモーターのコントロール下で所望な一次マーカー遺伝
子を有するプロファージを含む。次に、形質導入粒子
が、プロファージを誘発して溶菌状態にすることによっ
て得られ、これによって細胞溶解を生じ、多量の好適な
形質導入粒子を放出させることができる。
トランスポゾン突然変異誘発による形質導入粒子の作
成における二次選択マーカーの使用は有効であるが、必
要とされるものではない。突然変異誘発によって一次選
択マーカー、例えば氷成核遺伝子を有するようになった
ファージは、例えば氷成核遺伝子の場合の氷核に対する
レプリカ・プレーティング・アッセイのような適当な分
析法を行うことによって野生型ファージのバックグラウ
ンドに対して同定することができる。かかるスクリーニ
ング法はLindowら（1978年）App.Environ.Microbiol.,3
6,831−838に教示されており、この教示内容は参考とし
て本明細書に包含される。
成における二次選択マーカーの使用は有効であるが、必
要とされるものではない。突然変異誘発によって一次選
択マーカー、例えば氷成核遺伝子を有するようになった
ファージは、例えば氷成核遺伝子の場合の氷核に対する
レプリカ・プレーティング・アッセイのような適当な分
析法を行うことによって野生型ファージのバックグラウ
ンドに対して同定することができる。かかるスクリーニ
ング法はLindowら（1978年）App.Environ.Microbiol.,3
6,831−838に教示されており、この教示内容は参考とし
て本明細書に包含される。
前記の手法に加えて、形質導入粒子は、低頻度形質導
入粒子または高頻度形質導入粒子を同種組換によって作
成することもできる。低頻度形質導入粒子は、最初に目
的とするバクテリオファージゲノムの制限ライブラリー
を作成することによってマーカー遺伝子カセットを有す
るプラスミドから構成することができる。このライブラ
リーからの制限フラグメントを、次に好適な宿主中のプ
ラスミドにクローニングして、野生型バクテリオファー
ジと同種の比較的大きな領域を有するプラスミドを生じ
させる。この領域は、当該技術分野で十分に記載されて
いる方法で同種組換法におけるクロスオーバー点として
働く。次に、この組換プラスミドを適当な細菌宿主に導
入して、一次または二次マーカー遺伝子を発現するコロ
ニーを選択して、野生型バクテリオファージを感染させ
る。このバクテリオファージの感染によって産生される
形質導入粒子は比較的低い割合が挿入体としてマーカー
遺伝子カセットを有する前プラスミドを有する。次に、
新鮮な細菌培養物に混合形質導入粒子を感染させ、形質
転換コロニーをプラスミドによって担持される一次マー
カーまたは二次マーカーの発現によって選択する。
入粒子または高頻度形質導入粒子を同種組換によって作
成することもできる。低頻度形質導入粒子は、最初に目
的とするバクテリオファージゲノムの制限ライブラリー
を作成することによってマーカー遺伝子カセットを有す
るプラスミドから構成することができる。このライブラ
リーからの制限フラグメントを、次に好適な宿主中のプ
ラスミドにクローニングして、野生型バクテリオファー
ジと同種の比較的大きな領域を有するプラスミドを生じ
させる。この領域は、当該技術分野で十分に記載されて
いる方法で同種組換法におけるクロスオーバー点として
働く。次に、この組換プラスミドを適当な細菌宿主に導
入して、一次または二次マーカー遺伝子を発現するコロ
ニーを選択して、野生型バクテリオファージを感染させ
る。このバクテリオファージの感染によって産生される
形質導入粒子は比較的低い割合が挿入体としてマーカー
遺伝子カセットを有する前プラスミドを有する。次に、
新鮮な細菌培養物に混合形質導入粒子を感染させ、形質
転換コロニーをプラスミドによって担持される一次マー
カーまたは二次マーカーの発現によって選択する。
S.チピムリウム（S.typhimurium）を特異的に感染さ
せることができる低頻度形質導入粒子の作成の具体例
を、下記の実験の部に実施例２として示す。
せることができる低頻度形質導入粒子の作成の具体例
を、下記の実験の部に実施例２として示す。
通常は約５％を上回る比較的高い形質導入頻度を有す
る低頻度形質導入粒子を用いて、本発明の分析法を行う
ことができる。低率の形質導入を有する形質導入粒子に
ついては、通常は細菌宿主を更に改質して、高頻度形質
導入粒子を産生させるのが望ましい。
る低頻度形質導入粒子を用いて、本発明の分析法を行う
ことができる。低率の形質導入を有する形質導入粒子に
ついては、通常は細菌宿主を更に改質して、高頻度形質
導入粒子を産生させるのが望ましい。
高頻度形質導入粒子は、同種組換の標的として細菌ゲ
ノム中のプロファージを用いること以外は前記の方法に
よって作成される。このために、溶原性株（プロファー
ジとしてゲノム中に野生型バクテリオファージDNAを有
する株）を用い、宿主中で複製することができない遺伝
子マーカーカセットを有するプラスミドで形質転換す
る。このようにして、選択的マーカーをプロファージに
組み込んだ宿主のみが、適当な選択的条件下で生育可能
となる。或いは、プラスミドを変えて、プロファージで
の組換が容易に検出されるようにすることもできる。所
望な細菌宿主中で複製することができないプラスミド
を、数種類の手法で作成することができる。例えば、前
記の方法で作成した低頻度形質導入ファージを複製を妨
害するプロファージによって発現される免疫機能として
用いることができる。第二に、好適なクローニング宿主
において複製可能であるが目的の標的宿主では複製が不
可能なプラスミドを用いることができる。最後に、この
プラスミドを改質して、一次マーカー遺伝子をプロファ
ージに挿入し、二次マーカーをプロファージに組み込ま
れている領域外におくようにすることができる。次に、
一次選択表現型を発現するが二次選択表現型を喪失した
細胞に就いてのスクリーニングによって組換を検出する
ことができる。所望なマーカー遺伝子のプロファージへ
の組み込みは、Southern（1975）J.Molec.Biol.,98,503
−517に記載されているサザン・ブロット法のような標
準的手法によって確認することができる。
ノム中のプロファージを用いること以外は前記の方法に
よって作成される。このために、溶原性株（プロファー
ジとしてゲノム中に野生型バクテリオファージDNAを有
する株）を用い、宿主中で複製することができない遺伝
子マーカーカセットを有するプラスミドで形質転換す
る。このようにして、選択的マーカーをプロファージに
組み込んだ宿主のみが、適当な選択的条件下で生育可能
となる。或いは、プラスミドを変えて、プロファージで
の組換が容易に検出されるようにすることもできる。所
望な細菌宿主中で複製することができないプラスミド
を、数種類の手法で作成することができる。例えば、前
記の方法で作成した低頻度形質導入ファージを複製を妨
害するプロファージによって発現される免疫機能として
用いることができる。第二に、好適なクローニング宿主
において複製可能であるが目的の標的宿主では複製が不
可能なプラスミドを用いることができる。最後に、この
プラスミドを改質して、一次マーカー遺伝子をプロファ
ージに挿入し、二次マーカーをプロファージに組み込ま
れている領域外におくようにすることができる。次に、
一次選択表現型を発現するが二次選択表現型を喪失した
細胞に就いてのスクリーニングによって組換を検出する
ことができる。所望なマーカー遺伝子のプロファージへ
の組み込みは、Southern（1975）J.Molec.Biol.,98,503
−517に記載されているサザン・ブロット法のような標
準的手法によって確認することができる。
S.チピムリウムに特異的に感染することができる高頻
度形質導入粒子の具体例を、下記の実験の部の実施例３
に示す。
度形質導入粒子の具体例を、下記の実験の部の実施例３
に示す。
同種組換による高頻度形質導入粒子の好ましい作成法
には、挿入可能な要素がトランスポゾンの本質的な末端
配列に連結した目的とする検出可能な表現型に対する遺
伝子を含んで成るトランスポゾン・タッギングのしよう
が挙げられる。このような挿入可能な要素は、バクテリ
オファージゲノム中の位置を同定することが可能にな
り、このゲノム中で氷成核または他のリポーター遺伝子
を本質的なバクテリオファージの機能を妨害することな
く挿入することができる。一般的に、任意の細菌性トラ
ンスポゾンを用いて、挿入可能な要素を作成することが
できる。生成する挿入可能な要素の大きさは出切るだけ
小さくして成熟ウイルス粒子中に生成するファージゲノ
ム全体をパッケージ出切るようにするのが望ましい。
には、挿入可能な要素がトランスポゾンの本質的な末端
配列に連結した目的とする検出可能な表現型に対する遺
伝子を含んで成るトランスポゾン・タッギングのしよう
が挙げられる。このような挿入可能な要素は、バクテリ
オファージゲノム中の位置を同定することが可能にな
り、このゲノム中で氷成核または他のリポーター遺伝子
を本質的なバクテリオファージの機能を妨害することな
く挿入することができる。一般的に、任意の細菌性トラ
ンスポゾンを用いて、挿入可能な要素を作成することが
できる。生成する挿入可能な要素の大きさは出切るだけ
小さくして成熟ウイルス粒子中に生成するファージゲノ
ム全体をパッケージ出切るようにするのが望ましい。
トランスポゾン・タッギングにおける好適な部位の発
生の頻度は低いと考えられるので、用いられる細菌性ト
ランスポゾンは、転位結果を選択することができる機能
をコードするのが好ましい。このため、天然に存在する
トランスポゾンを改質して、小型の選択可能なトランス
ポゾンを提供することができる。トランスポザーゼ機能
を転位可能な要素の末端から分離することができる任意
のトランスポゾンが好適である。これには、IS（挿入配
列）要素、例えばIS50、および転位可能な医薬品耐性要
素、例えばTn3,Tn5およびTn7が挙げられるがこれらに限
定されないことは、当該技術分野で知られている通りで
ある。当該技術分野において極めて詳細に特性決定され
ているように改質するには、細菌性トランスポゾンTn5
が最も好都合である。Krebs ＆ Reznikoff（1986年）J.
Mol.Biol.,192,721−791;Dodson ＆ Berg（1989年）Gen
e,76,207−213。
生の頻度は低いと考えられるので、用いられる細菌性ト
ランスポゾンは、転位結果を選択することができる機能
をコードするのが好ましい。このため、天然に存在する
トランスポゾンを改質して、小型の選択可能なトランス
ポゾンを提供することができる。トランスポザーゼ機能
を転位可能な要素の末端から分離することができる任意
のトランスポゾンが好適である。これには、IS（挿入配
列）要素、例えばIS50、および転位可能な医薬品耐性要
素、例えばTn3,Tn5およびTn7が挙げられるがこれらに限
定されないことは、当該技術分野で知られている通りで
ある。当該技術分野において極めて詳細に特性決定され
ているように改質するには、細菌性トランスポゾンTn5
が最も好都合である。Krebs ＆ Reznikoff（1986年）J.
Mol.Biol.,192,721−791;Dodson ＆ Berg（1989年）Gen
e,76,207−213。
一つの方法として、トランスポゾンの本質的な末端DN
A配列を、当該技術分野に知られている方法によって化
学的に合成することができる。これらのDNA配列を合成
する場合に、多数の制限エンドヌクレアーゼに対する制
限部位を含むフランク配列（ポリリンカー）を含むこと
が有利である。これによりトランスポゾン要素の両端の
間への選択可能なマーカーの挿入が容易になり、こうし
て作成される要素をベクタープラスミド中へ容易にクロ
ーニングすることができ、ベクタープラスミドの選択は
特定のバクテリオファージに対する細菌性宿主の性質に
よって変わる。当該技術分野で周知のように、ColE1、P
15AまたはpMB9レプリコン（例えば、pAT273、pACYC18
4、pBR322またはpUC19）に由来する狭宿主領域プラスミ
ドがエンテロバクテリアエ（Enterbactriaceae）科から
の細菌に用いるのに好適であるが、通常は不和合性群In
cP、IncWまたはIncQ（例えば、pRK2、pS−ａまたはpPSF
1010に由来するもの）に由来する任意の広宿主領域プラ
スミドが他のグラム陰性菌に用いるのに好適でる。グラ
ム陽性菌に対しては、当該技術分野に知られている他の
好適なプラスミドベクターを用いることができる。
A配列を、当該技術分野に知られている方法によって化
学的に合成することができる。これらのDNA配列を合成
する場合に、多数の制限エンドヌクレアーゼに対する制
限部位を含むフランク配列（ポリリンカー）を含むこと
が有利である。これによりトランスポゾン要素の両端の
間への選択可能なマーカーの挿入が容易になり、こうし
て作成される要素をベクタープラスミド中へ容易にクロ
ーニングすることができ、ベクタープラスミドの選択は
特定のバクテリオファージに対する細菌性宿主の性質に
よって変わる。当該技術分野で周知のように、ColE1、P
15AまたはpMB9レプリコン（例えば、pAT273、pACYC18
4、pBR322またはpUC19）に由来する狭宿主領域プラスミ
ドがエンテロバクテリアエ（Enterbactriaceae）科から
の細菌に用いるのに好適であるが、通常は不和合性群In
cP、IncWまたはIncQ（例えば、pRK2、pS−ａまたはpPSF
1010に由来するもの）に由来する任意の広宿主領域プラ
スミドが他のグラム陰性菌に用いるのに好適でる。グラ
ム陽性菌に対しては、当該技術分野に知られている他の
好適なプラスミドベクターを用いることができる。
選択されたトランスポゾンに対するトランスポザーゼ
はトランスポゾンの両端の間に配置されないのが好まし
い。この方法では、転位可能な要素が一旦バクテリオフ
ァージゲノムに挿入されてしまえば第二の転位操作を行
うことが不可能になる。一般的には、この配置が輸送さ
れる要素と同じDNA分子上に（すなわち、シスに）なる
ことが望ましいが、トランスポゾンとトランスポザーゼ
はある種の系では、別個のプラスミドレプリコン上に
（すなわち、トランスに）配置することができる。
はトランスポゾンの両端の間に配置されないのが好まし
い。この方法では、転位可能な要素が一旦バクテリオフ
ァージゲノムに挿入されてしまえば第二の転位操作を行
うことが不可能になる。一般的には、この配置が輸送さ
れる要素と同じDNA分子上に（すなわち、シスに）なる
ことが望ましいが、トランスポゾンとトランスポザーゼ
はある種の系では、別個のプラスミドレプリコン上に
（すなわち、トランスに）配置することができる。
トランスポザーゼタン白質に対するコード配列を高発
現性細菌プロモーターの加硫に挿入することによって、
転位可能な要素のトランスポザーゼ遺伝子の発現を改質
することも望ましいことがある。かかるプロモーターは
当業者に知られており、E.coliのtac、trcおよびlacプ
ロモーターが挙げられる。細菌性トランスポザーゼの過
剰発現は宿主細胞にとって有害であることが知られてい
るので、選択されるプロモーターからの転写を調製する
ことができるようにすることも望ましい。tac、trcおよ
びlacプロモーターのようなプロモーターは、lac I遺伝
子の生成物であるlacリプレッサーによって抑制され
る。トランスポザーゼと同じ分子上にかかる遺伝子を包
含することにより、抑制が少ない条件（すなわち、誘起
条件）下でのみトランスポザーゼタン白質が確実に発現
するようになる。lac I遺伝子に対しては、化学的イソ
プロピルプロピルチオガラクトシド（IPTG）は、lacリ
プレッサーを制限しやすい。
現性細菌プロモーターの加硫に挿入することによって、
転位可能な要素のトランスポザーゼ遺伝子の発現を改質
することも望ましいことがある。かかるプロモーターは
当業者に知られており、E.coliのtac、trcおよびlacプ
ロモーターが挙げられる。細菌性トランスポザーゼの過
剰発現は宿主細胞にとって有害であることが知られてい
るので、選択されるプロモーターからの転写を調製する
ことができるようにすることも望ましい。tac、trcおよ
びlacプロモーターのようなプロモーターは、lac I遺伝
子の生成物であるlacリプレッサーによって抑制され
る。トランスポザーゼと同じ分子上にかかる遺伝子を包
含することにより、抑制が少ない条件（すなわち、誘起
条件）下でのみトランスポザーゼタン白質が確実に発現
するようになる。lac I遺伝子に対しては、化学的イソ
プロピルプロピルチオガラクトシド（IPTG）は、lacリ
プレッサーを制限しやすい。
一般的には、高発現性でありながら抑制可能なプロモ
ーターとその関連リプレッサー遺伝子との結合は、同じ
結果を与える働きをする。選択可能なマーカーを転位可
能な要素の両端の間にインサートとして用いるときに
は、マーカーはできるだけ小さくすべきである。転位可
能な要素の大きさは1kb未満とするのが好ましい。通常
は、抗生物質耐性遺伝子は所望なものよりも大きいが転
位されるDNAの絶対的大きさは個々のバクテリオファー
ジのパッケージ限度によって決定される。
ーターとその関連リプレッサー遺伝子との結合は、同じ
結果を与える働きをする。選択可能なマーカーを転位可
能な要素の両端の間にインサートとして用いるときに
は、マーカーはできるだけ小さくすべきである。転位可
能な要素の大きさは1kb未満とするのが好ましい。通常
は、抗生物質耐性遺伝子は所望なものよりも大きいが転
位されるDNAの絶対的大きさは個々のバクテリオファー
ジのパッケージ限度によって決定される。
選択の好ましい手段は、E.coliに記載されているよう
なラクトース利用に対するα−相補性の現象を用いる。
ここで、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の小さなフラグメ
ント（長さが約500bpであるlacZαフラグメント）は、
アミノ酸が欠失した（M15欠失）他の突然変異体ポリペ
プチドに対する機能を回復するポリペプチドをコードす
る。トランスポゾンの両端の間にlacZαフラグメントが
包含されることにより、プラスミド上にまたは染色体中
にlacZM15欠失を有する宿主細胞に対するラクトース利
用を回復する能力によって、挿入されたDNAを有するバ
クテリオファージを選択することができる。これらの２
種類の活性をコードするDNAフラグメントは詳細に特性
決定されており、当業者が容易に操作することができ
る。I.Zabinら、The Operon（J.H.Millerら監修）、Col
d Springer Harbor Laboratory（ニュー・ヨーク）、10
4−107（1978年）を参照されたい。
なラクトース利用に対するα−相補性の現象を用いる。
ここで、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の小さなフラグメ
ント（長さが約500bpであるlacZαフラグメント）は、
アミノ酸が欠失した（M15欠失）他の突然変異体ポリペ
プチドに対する機能を回復するポリペプチドをコードす
る。トランスポゾンの両端の間にlacZαフラグメントが
包含されることにより、プラスミド上にまたは染色体中
にlacZM15欠失を有する宿主細胞に対するラクトース利
用を回復する能力によって、挿入されたDNAを有するバ
クテリオファージを選択することができる。これらの２
種類の活性をコードするDNAフラグメントは詳細に特性
決定されており、当業者が容易に操作することができ
る。I.Zabinら、The Operon（J.H.Millerら監修）、Col
d Springer Harbor Laboratory（ニュー・ヨーク）、10
4−107（1978年）を参照されたい。
前記のように、トランスポザーゼ、末端片DNA、マー
カーDNAおよびリプレッサーを含むプラスミドが、細菌
性ゲノム内部にプロファージDNA（例えば、P22）を含む
細菌細胞（例えば、サルモネラ）中に導入される。トラ
ンスポザーゼは適当な化学的誘導物質（例えば、IPTG）
によって誘導され、細菌細胞を多数の世代に亙って生育
させる。次に、プロファージを適当な化学的誘導物質
（例えば、マイトマイシンＣ）によって誘導され、バク
テリオファージを産生する。トランスポゾン挿入を有す
るバクテリオファージは、適当な細菌宿主（例えば、M1
5欠失を有するもの）に誘導されたファージ溶菌生成物
を感染させることによって選択される。感染細胞は、マ
ーカーに対して選択的に媒質上で培養され、プロファー
ジゲノムであってこれも末端片とマーカーを含むトラン
スポゾンフラグメントを含むものを含む細胞が選択され
る。次いで、選択された細胞を誘導してファージ溶菌を
行い、純粋なファージ調製物を得る。トランスポゾン挿
入を有するバクテリオファージのDNAフラグメントは、
イン・ビトロ法を用いて単離される。このフラグメント
を適当なプラスミドベクター上でクローニングする。次
に氷遺伝子を、イン・ビトロ法を用いる選択可能なマー
カー（例えば、lacZα）の代わりに用いる。次いで同種
組換を、このようにして作成した氷遺伝子を含むプラス
ミドを用いて行うのであり、同種組換には細菌性ゲノム
のプロファージDNAとプラスミド上の氷遺伝子をフラン
クするプロファージDNAとの間の組換がある。ファージ
誘導によって生成する株は、プロファージDNA内部の部
位において氷遺伝子DNAを含む形質導入粒子を生成する
が、この部位に氷遺伝子が存在することは本質的なファ
ージの機能を破壊しない。
カーDNAおよびリプレッサーを含むプラスミドが、細菌
性ゲノム内部にプロファージDNA（例えば、P22）を含む
細菌細胞（例えば、サルモネラ）中に導入される。トラ
ンスポザーゼは適当な化学的誘導物質（例えば、IPTG）
によって誘導され、細菌細胞を多数の世代に亙って生育
させる。次に、プロファージを適当な化学的誘導物質
（例えば、マイトマイシンＣ）によって誘導され、バク
テリオファージを産生する。トランスポゾン挿入を有す
るバクテリオファージは、適当な細菌宿主（例えば、M1
5欠失を有するもの）に誘導されたファージ溶菌生成物
を感染させることによって選択される。感染細胞は、マ
ーカーに対して選択的に媒質上で培養され、プロファー
ジゲノムであってこれも末端片とマーカーを含むトラン
スポゾンフラグメントを含むものを含む細胞が選択され
る。次いで、選択された細胞を誘導してファージ溶菌を
行い、純粋なファージ調製物を得る。トランスポゾン挿
入を有するバクテリオファージのDNAフラグメントは、
イン・ビトロ法を用いて単離される。このフラグメント
を適当なプラスミドベクター上でクローニングする。次
に氷遺伝子を、イン・ビトロ法を用いる選択可能なマー
カー（例えば、lacZα）の代わりに用いる。次いで同種
組換を、このようにして作成した氷遺伝子を含むプラス
ミドを用いて行うのであり、同種組換には細菌性ゲノム
のプロファージDNAとプラスミド上の氷遺伝子をフラン
クするプロファージDNAとの間の組換がある。ファージ
誘導によって生成する株は、プロファージDNA内部の部
位において氷遺伝子DNAを含む形質導入粒子を生成する
が、この部位に氷遺伝子が存在することは本質的なファ
ージの機能を破壊しない。
前記のようにして作成される形質導入粒子を用いて、
下記の方法により生物学的試料中の標的細菌を検出す
る。幾つかの場合には、生物学的試料を感染させて、そ
して表現型を直接観察することが可能になるが、他の場
合には試料中に存在する細菌の集積培養物を最初に作成
するのが好ましい。試料を得て（必要であれば）集積培
養物を作成する方法は生物学的試料の性状によって変わ
り、各種の試料の型を作成するのに好適な手法は、標準
的微生物および細菌学の教本、Bergey's Manual of Det
erminative Bacteriology（８版）、Buchanan ＆ Gibbo
ns（監修）、Williams ＆ Wilkens Co.,バルチモア（19
74年）;Manual of Methods for General Bacteriology,
Gerhardtら（監修）、Am.Soc.Microbiology、ワシント
ン（1981年）；およびManual of Clinical Microbiolog
y（２版）、Lennetteら（監修）、Am.Soc.Microbiolog
y、ワシントン（1974年）に詳細に記載されている。
下記の方法により生物学的試料中の標的細菌を検出す
る。幾つかの場合には、生物学的試料を感染させて、そ
して表現型を直接観察することが可能になるが、他の場
合には試料中に存在する細菌の集積培養物を最初に作成
するのが好ましい。試料を得て（必要であれば）集積培
養物を作成する方法は生物学的試料の性状によって変わ
り、各種の試料の型を作成するのに好適な手法は、標準
的微生物および細菌学の教本、Bergey's Manual of Det
erminative Bacteriology（８版）、Buchanan ＆ Gibbo
ns（監修）、Williams ＆ Wilkens Co.,バルチモア（19
74年）;Manual of Methods for General Bacteriology,
Gerhardtら（監修）、Am.Soc.Microbiology、ワシント
ン（1981年）；およびManual of Clinical Microbiolog
y（２版）、Lennetteら（監修）、Am.Soc.Microbiolog
y、ワシントン（1974年）に詳細に記載されている。
生物学的試料が（集積培養物の増殖を伴って又は伴わ
ないで）作成されてしまったならば、これを典型的には
形質導入粒子の細菌への結合と遺伝子材料の注入を促進
する条件下で、典型的には細菌を迅速に増殖させる温度
（例えば、35℃〜40℃）で攪拌せずに十分に感染を行う
ことができる時間（例えば、15分〜120分間）の条件下
で形質導入粒子に暴露させる。ina遺伝子を有する形質
導入粒子については、試料を次に低温（例えば、20℃〜
25℃）でインキュベーションして氷成核部位を形成させ
る。短時間の後、典型的には30分から２時間後に、試料
を下記に更に記載されている方法で氷成核について分析
することができる。
ないで）作成されてしまったならば、これを典型的には
形質導入粒子の細菌への結合と遺伝子材料の注入を促進
する条件下で、典型的には細菌を迅速に増殖させる温度
（例えば、35℃〜40℃）で攪拌せずに十分に感染を行う
ことができる時間（例えば、15分〜120分間）の条件下
で形質導入粒子に暴露させる。ina遺伝子を有する形質
導入粒子については、試料を次に低温（例えば、20℃〜
25℃）でインキュベーションして氷成核部位を形成させ
る。短時間の後、典型的には30分から２時間後に、試料
を下記に更に記載されている方法で氷成核について分析
することができる。
氷成核遺伝子を有する形質導入粒子については、Vali
（1971年）上記、に記載した通常の液滴凍結分析法が氷
成核表現型への形質転換を検出するのに有用である。ま
た、氷成核表現型を検出するための特異的傾向凍結分析
法は米国特許第4,784,943号公報に教示されており、こ
の開示内容は参考として本明細書に包含される。簡単に
いえば、氷成核を検出する分析法は、水性状態において
は水性媒質の凍結または融解を行うときに螢光または可
視特性に変化を表わす螢光化合物を用いることから成
る。好適な螢光化合物は、フルオレセイン族、例えばカ
ルセイン、カルボキシフルオレセインおよび関連化合物
から選択することができる。
（1971年）上記、に記載した通常の液滴凍結分析法が氷
成核表現型への形質転換を検出するのに有用である。ま
た、氷成核表現型を検出するための特異的傾向凍結分析
法は米国特許第4,784,943号公報に教示されており、こ
の開示内容は参考として本明細書に包含される。簡単に
いえば、氷成核を検出する分析法は、水性状態において
は水性媒質の凍結または融解を行うときに螢光または可
視特性に変化を表わす螢光化合物を用いることから成
る。好適な螢光化合物は、フルオレセイン族、例えばカ
ルセイン、カルボキシフルオレセインおよび関連化合物
から選択することができる。
前記のように、本発明の分析法は生物学的試料をスク
リーニングして、形質導入粒子の宿主領域にある細菌が
存在するかどうかを決定するのに有用である。本発明
は、ファージの感染を決定するためのプラーク分析法に
よる通常のファージ分類と同様な方法で細菌の種および
株を分類するにも有用である。
リーニングして、形質導入粒子の宿主領域にある細菌が
存在するかどうかを決定するのに有用である。本発明
は、ファージの感染を決定するためのプラーク分析法に
よる通常のファージ分類と同様な方法で細菌の種および
株を分類するにも有用である。
本発明による分類には、異なる、通常は重複している
宿主領域を有する形質導入粒子のパネルが用いられる。
次に、標的細菌の種および株を、各種の形質導入粒子と
の反応性のパターンによって決定することができる。こ
のような試験は、単一キャリヤー上で行い、キャリヤー
表面上の固定形状またはマトリックスに異なる形質導入
粒子をスポットすることができる。次いで、反応性のパ
ターンを迅速に観察することができる。
宿主領域を有する形質導入粒子のパネルが用いられる。
次に、標的細菌の種および株を、各種の形質導入粒子と
の反応性のパターンによって決定することができる。こ
のような試験は、単一キャリヤー上で行い、キャリヤー
表面上の固定形状またはマトリックスに異なる形質導入
粒子をスポットすることができる。次いで、反応性のパ
ターンを迅速に観察することができる。
本発明は、栄養スクリーニングと組み合わせて、検討
を行う細菌を更に特性決定することができる。集積培養
またはコロニー形成培養中に選択的媒質を供給すること
によって、増殖し続けることができる細菌の領域を制限
することができる。本発明の表現型分析法は増殖可能な
細胞を検出することができるだけであるので、検出可能
な表現型がなければ存在し得る細菌の種類が制限され
る。形質導入粒子の宿種領域と選択的媒質の増殖可能領
域とを適当に組み合わせることによって、本発明の方法
を決定を行う細菌の種類に対して極めて特異的にするこ
とができる。
を行う細菌を更に特性決定することができる。集積培養
またはコロニー形成培養中に選択的媒質を供給すること
によって、増殖し続けることができる細菌の領域を制限
することができる。本発明の表現型分析法は増殖可能な
細胞を検出することができるだけであるので、検出可能
な表現型がなければ存在し得る細菌の種類が制限され
る。形質導入粒子の宿種領域と選択的媒質の増殖可能領
域とを適当に組み合わせることによって、本発明の方法
を決定を行う細菌の種類に対して極めて特異的にするこ
とができる。
細菌宿主を特異的に同定する本発明の能力を増加させ
る第二の方法は、免疫吸着の使用である。抗血清または
モノクローン性抗体のような固定化抗体を用いて、細胞
表面のエピトープの同一性により細菌細胞を特異的に補
足する。次に、この細菌を、前記のような本発明の形質
導入粒子を用いて更に検出することができる。固相表面
の特定の細菌の種および株の免疫吸着に好適な材料およ
び方法は、Enterobacterial surface antigens:Methods
for molecular characterization,Korhonenら（監修）
Elsevier Science Pubishers,Amsterdam（1985年）に記
載されている。
る第二の方法は、免疫吸着の使用である。抗血清または
モノクローン性抗体のような固定化抗体を用いて、細胞
表面のエピトープの同一性により細菌細胞を特異的に補
足する。次に、この細菌を、前記のような本発明の形質
導入粒子を用いて更に検出することができる。固相表面
の特定の細菌の種および株の免疫吸着に好適な材料およ
び方法は、Enterobacterial surface antigens:Methods
for molecular characterization,Korhonenら（監修）
Elsevier Science Pubishers,Amsterdam（1985年）に記
載されている。
本発明は、抗生物質および他の殺菌剤に対する細菌の
感受性を決定することができるので、本発明は患者の診
断薬に於いて特に有用である。細菌のスクリーニングを
行う抗生物質または殺菌剤と共に短時間インキュベーシ
ョンを行った後、本発明の形質導入粒子に暴露すること
によって、細胞の代謝活性が停止し、表現型の変化が防
止される。このような試験は、前記のような形質導入粒
子を用いて細菌の存在を最初に確認した後に用いられ
る。次に、細菌の感染にとって致命的であることを決定
する抗生物質および殺菌剤を用いて、患者を治療するこ
とができる。このような迅速且つ容易な抗生物質および
殺菌剤の検出は、重度の細菌感染症の治療に極めて重要
である。
感受性を決定することができるので、本発明は患者の診
断薬に於いて特に有用である。細菌のスクリーニングを
行う抗生物質または殺菌剤と共に短時間インキュベーシ
ョンを行った後、本発明の形質導入粒子に暴露すること
によって、細胞の代謝活性が停止し、表現型の変化が防
止される。このような試験は、前記のような形質導入粒
子を用いて細菌の存在を最初に確認した後に用いられ
る。次に、細菌の感染にとって致命的であることを決定
する抗生物質および殺菌剤を用いて、患者を治療するこ
とができる。このような迅速且つ容易な抗生物質および
殺菌剤の検出は、重度の細菌感染症の治療に極めて重要
である。
具体的な態様では、ファージ特異性により本発明のバ
クテリオファージに予め感受性を付与しておいた細菌を
分析する手段が提供される。すなわち、第一段階では、
標的細菌を例えば形質転換によって改質してこれらの細
菌がこのバクテリオファージに対する細胞特異性受容体
を含むまたは発現するようにする。第二段階では、改質
した（または標識した）細菌を置くことになる試料環境
に、これらの細菌を導入しまたは混合する。この試料環
境は、屋外（例えば、土壌、空気または水）、生活宿主
（例えば、植物、動物または昆虫）、装置（例えば、製
造、加工またはパッケージング装置）および臨床試料の
ような細菌が存在する任意の設定とすることができる。
次に、（前記のような）本発明のバクテリオファージ分
析法を、導入される受容体に特異的なバクテリオファー
ジを用いて行い、標識した細菌の存在を監視しまたは定
量することができる。
クテリオファージに予め感受性を付与しておいた細菌を
分析する手段が提供される。すなわち、第一段階では、
標的細菌を例えば形質転換によって改質してこれらの細
菌がこのバクテリオファージに対する細胞特異性受容体
を含むまたは発現するようにする。第二段階では、改質
した（または標識した）細菌を置くことになる試料環境
に、これらの細菌を導入しまたは混合する。この試料環
境は、屋外（例えば、土壌、空気または水）、生活宿主
（例えば、植物、動物または昆虫）、装置（例えば、製
造、加工またはパッケージング装置）および臨床試料の
ような細菌が存在する任意の設定とすることができる。
次に、（前記のような）本発明のバクテリオファージ分
析法を、導入される受容体に特異的なバクテリオファー
ジを用いて行い、標識した細菌の存在を監視しまたは定
量することができる。
この態様の利点は、これが放出される細菌と同じ種類
の細菌（または極似した細菌）を含むまたは同じ種類の
細菌（または極似した細菌）を別個の源から導入するこ
とができる試料環境に放出される細菌を追跡しまたは探
知する手段を提供することである。追跡される細菌は、
この追跡される細菌中に導入された細胞特異的受容体の
存在によって他の細菌（すなわち、本質的に同じである
細菌）と識別することができる。このようにして、交差
反応性（バックグラウンド）なしで（受容体成分以外
は）同様な細菌の存在において、放出された細菌の存在
について分析する機会が提供される。
の細菌（または極似した細菌）を含むまたは同じ種類の
細菌（または極似した細菌）を別個の源から導入するこ
とができる試料環境に放出される細菌を追跡しまたは探
知する手段を提供することである。追跡される細菌は、
この追跡される細菌中に導入された細胞特異的受容体の
存在によって他の細菌（すなわち、本質的に同じである
細菌）と識別することができる。このようにして、交差
反応性（バックグラウンド）なしで（受容体成分以外
は）同様な細菌の存在において、放出された細菌の存在
について分析する機会が提供される。
プスードモナスを監視する典型的な方法では、コーリ
ーファージλの受容体であることが知られているE.coli
のlamB遺伝子が用いられる。G.Vries o（1984年）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,81,6080−6084;およびR.Ludwig（19
87年）同上、84,3334−3338を参照されたい。また、こ
れらの文献の開示内容はいずれも参考として本明細書に
包含される。lamBの発現によって、Pseudomonas種のλ
ファージが付着し且つファージDNAを注入し易くなる。
受容体遺伝子、例えば氷成核遺伝子を有する組換λファ
ージは、通常は強プロモーターの制御下にて、広宿主領
域プラスミド中に構築される。lamB遺伝子を（例えば同
種組換によって）分析される細菌の染色体中に挿入され
る。次いで、本明細書の教示にしたがって分析を行う。
ーファージλの受容体であることが知られているE.coli
のlamB遺伝子が用いられる。G.Vries o（1984年）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,81,6080−6084;およびR.Ludwig（19
87年）同上、84,3334−3338を参照されたい。また、こ
れらの文献の開示内容はいずれも参考として本明細書に
包含される。lamBの発現によって、Pseudomonas種のλ
ファージが付着し且つファージDNAを注入し易くなる。
受容体遺伝子、例えば氷成核遺伝子を有する組換λファ
ージは、通常は強プロモーターの制御下にて、広宿主領
域プラスミド中に構築される。lamB遺伝子を（例えば同
種組換によって）分析される細菌の染色体中に挿入され
る。次いで、本明細書の教示にしたがって分析を行う。
この方法の一つの具体的使用はプスードモナス土壌細
菌およびプスードモナス着生細菌のようなプスードモナ
ス細菌であって、特定の環境または設定、例えば土壌、
温室または畑の設定中に放出されるものを監視すること
である。放出される細菌の少なくとも幾つかの種類は、
最初に形質転換されてバクテリオファージ特異性受容体
を発現する。次いで、後になって環境から細菌を集める
ことによって、環境中の細菌の存在を決定することがで
きる。この方法は、細菌の存在、移動および生存能力を
追跡する手段を提供する。
菌およびプスードモナス着生細菌のようなプスードモナ
ス細菌であって、特定の環境または設定、例えば土壌、
温室または畑の設定中に放出されるものを監視すること
である。放出される細菌の少なくとも幾つかの種類は、
最初に形質転換されてバクテリオファージ特異性受容体
を発現する。次いで、後になって環境から細菌を集める
ことによって、環境中の細菌の存在を決定することがで
きる。この方法は、細菌の存在、移動および生存能力を
追跡する手段を提供する。
下記の実施例は冷時のために提供するものであり、制
限のためのものではない。
限のためのものではない。
実 験 1. 雄（F+）E.コリの分析 INA形質導入粒子を、下記のようにして作成した。氷
成核遺伝子inaY（プスードモナスシリンガエ株PS31から
単離されたもの、この株はDeiningerら（1988）、J.Bac
teriol.,170,669−675に記載されている）をプラスミド
pLVC76に挿入することによって、pUC118プラスミド−M1
3バクテリオファージ系（Vieira ＆ Messing（1987）Me
ths.Enz、,153,3−11）を改質した。また、このプラス
ミドもM13バクテリオファージpac部位を有する。次に、
形質導入粒子を、パッケージング−欠損M13ヘルパーフ
ァージを用いて産生させた。inaY遺伝子はlacプロモー
ターの制御の下で元のpUC118プラスミドから誘導され、
生成する形質導入粒子はE.コリのメール（F+）株に対す
るM13ファージの特異性を保持した。
成核遺伝子inaY（プスードモナスシリンガエ株PS31から
単離されたもの、この株はDeiningerら（1988）、J.Bac
teriol.,170,669−675に記載されている）をプラスミド
pLVC76に挿入することによって、pUC118プラスミド−M1
3バクテリオファージ系（Vieira ＆ Messing（1987）Me
ths.Enz、,153,3−11）を改質した。また、このプラス
ミドもM13バクテリオファージpac部位を有する。次に、
形質導入粒子を、パッケージング−欠損M13ヘルパーフ
ァージを用いて産生させた。inaY遺伝子はlacプロモー
ターの制御の下で元のpUC118プラスミドから誘導され、
生成する形質導入粒子はE.コリのメール（F+）株に対す
るM13ファージの特異性を保持した。
この形質導入粒子を0.2μｍフィルターを通過させて
（調製物に残っている任意のINA+細胞を除去し）、−12
℃までは氷成核活性がないことを見出した。E.コリMV11
93（F+）の形質転換の効率を、pLVC76によって担持され
たアンピシリン耐性遺伝子の活性に基づいて氷成核活性
とは無関係に測定した。INA形質導入粒子（10μ）に
暴露した細胞（100μ;OD600＝0.001）のコロニー成形
分析は、37℃で30分間インキュベーションし、1mlに希
釈し、50μの分量を培養することによって行った。結
果を第２表に示す。
（調製物に残っている任意のINA+細胞を除去し）、−12
℃までは氷成核活性がないことを見出した。E.コリMV11
93（F+）の形質転換の効率を、pLVC76によって担持され
たアンピシリン耐性遺伝子の活性に基づいて氷成核活性
とは無関係に測定した。INA形質導入粒子（10μ）に
暴露した細胞（100μ;OD600＝0.001）のコロニー成形
分析は、37℃で30分間インキュベーションし、1mlに希
釈し、50μの分量を培養することによって行った。結
果を第２表に示す。
形質導入粒子は２つの効果を生じた。第一に、それら
は細胞生存能力を低下させた。このような生存能力の低
下は、ヘルパーファージ、すなわち粒子を構成するのに
用いられ且つ形質導入粒子を汚染するパッケージング欠
損ファージによって引起されるものと考えられる。第二
に、それらは幾つかの細胞を形質転換してアンピシリン
耐性にした。アンピシリン耐性コロニーの５個の氷成に
ついて調べたところ、試験した総てのコロニーは、INA+
であった。アンピシリンの不在で低ファージ濃度で回収
されたコロニーの数を用いて最初に存在した細菌の数を
算出すると、高ファージ濃度での形質転換効率は約５％
であった。
は細胞生存能力を低下させた。このような生存能力の低
下は、ヘルパーファージ、すなわち粒子を構成するのに
用いられ且つ形質導入粒子を汚染するパッケージング欠
損ファージによって引起されるものと考えられる。第二
に、それらは幾つかの細胞を形質転換してアンピシリン
耐性にした。アンピシリン耐性コロニーの５個の氷成に
ついて調べたところ、試験した総てのコロニーは、INA+
であった。アンピシリンの不在で低ファージ濃度で回収
されたコロニーの数を用いて最初に存在した細菌の数を
算出すると、高ファージ濃度での形質転換効率は約５％
であった。
E.コリMV1193の試料を、次のようにして試験した。細
胞（100μ、OD600＝0.01）をINA形質導入粒子の懸濁
液（100希釈）10μと共に37℃で２時間インキュベー
ションした後、室温で１時間インキュベーションした。
次に、試料を40×10μ滴／希釈液であって、希釈は最
初の試料濃度の10-1から10-5まで10倍ずつにしたものか
ら成る標準液滴凍結分析法で氷成核活性について試験し
た。凍結分析法の結果を、第３表に示す。
胞（100μ、OD600＝0.01）をINA形質導入粒子の懸濁
液（100希釈）10μと共に37℃で２時間インキュベー
ションした後、室温で１時間インキュベーションした。
次に、試料を40×10μ滴／希釈液であって、希釈は最
初の試料濃度の10-1から10-5まで10倍ずつにしたものか
ら成る標準液滴凍結分析法で氷成核活性について試験し
た。凍結分析法の結果を、第３表に示す。
３時間後に、試験では、希釈懸濁液中の細胞の数を測
定したところ、感度（約40％）のコロニー形成分析法の
感度（約90％）にほぼ等しかった。コロニー形成分析で
は、E.コリに対して約15時間を要した。バックグラウン
ドは、検出限界を下回った。それ故、信号：ノイズ比は
少なくとも105であった。データーは、氷成核分析に典
型的な温度依存性感度を示し、−11℃でのデーターは、
細胞の全数がINA+フェノタイプに形質転換されたことを
示していた。
定したところ、感度（約40％）のコロニー形成分析法の
感度（約90％）にほぼ等しかった。コロニー形成分析で
は、E.コリに対して約15時間を要した。バックグラウン
ドは、検出限界を下回った。それ故、信号：ノイズ比は
少なくとも105であった。データーは、氷成核分析に典
型的な温度依存性感度を示し、−11℃でのデーターは、
細胞の全数がINA+フェノタイプに形質転換されたことを
示していた。
INA形質導入ファージの生物学的特異性について試験
するため、E.コリのF-株（JE5505、K12誘導体）をE.コ
リMV1193について前記したのと同じ方法を用いて試験し
た。E.コリの形質導入を試みたところ、検出可能な核は
生じなかった。抗生物質感受性または耐性は、下記のよ
うにして試験した。実験は、細菌を最初にテトラサイク
リン（10μg/ml）クロラムフェニコール（50μg/ml）ま
たは抗生物質なし（対照）と共に37℃で30分間インキュ
ベーションしたこと以外は、第３表に関連して記載した
のと本質的に同じてあった。この実験の結果を、第４表
に示す。
するため、E.コリのF-株（JE5505、K12誘導体）をE.コ
リMV1193について前記したのと同じ方法を用いて試験し
た。E.コリの形質導入を試みたところ、検出可能な核は
生じなかった。抗生物質感受性または耐性は、下記のよ
うにして試験した。実験は、細菌を最初にテトラサイク
リン（10μg/ml）クロラムフェニコール（50μg/ml）ま
たは抗生物質なし（対照）と共に37℃で30分間インキュ
ベーションしたこと以外は、第３表に関連して記載した
のと本質的に同じてあった。この実験の結果を、第４表
に示す。
この分析では、試料中のテトラサイクリン耐性菌の数
を正確に測定し、これらの細菌の総てがクロラムフェニ
コール感受性であることを正確に決定した。したがっ
て、本発明の分析法は、抗生物質耐性および感受性につ
いてのスクリーニングに好適である。
を正確に測定し、これらの細菌の総てがクロラムフェニ
コール感受性であることを正確に決定した。したがっ
て、本発明の分析法は、抗生物質耐性および感受性につ
いてのスクリーニングに好適である。
2. サルモネラチピムリウムの分析 氷成核活性を付与することができる低頻度形質導入粒
子をプラスミドpRLG61のバクテリオファージP22による
同種組換によって得た。プラスミドpRLG61は、tacプロ
モーター（Bagdasarianら（1983年）Gene,26,273−28
2）の転写制御下で氷成核遺伝子inaW（Corottoら（1986
年）EMBO J.,5,231−236に記載の方法でプスードモナス
フルオレセンスMS1650から単離）を含む。複製の源とア
ンピシリン耐性遺伝子はpBR322（Bolivarら（1977年）G
ene,2,95−113）から誘導され、pRLG61はP22染色体のHi
nd III消化物からクローニングされたP22 DNAの4.3kb挿
入体を含む。pRLG61は試験管内で構築され、E.コリ中で
クローニングされた。プラスミド起動系を用いて、これ
を次にサルモネラチピムリウムLT2株に抱合させること
によって形質転換した。pRLG61（LT2）株（RGS1と命
名）に対する氷成核分析では、高水準の氷成核活性が示
された。
子をプラスミドpRLG61のバクテリオファージP22による
同種組換によって得た。プラスミドpRLG61は、tacプロ
モーター（Bagdasarianら（1983年）Gene,26,273−28
2）の転写制御下で氷成核遺伝子inaW（Corottoら（1986
年）EMBO J.,5,231−236に記載の方法でプスードモナス
フルオレセンスMS1650から単離）を含む。複製の源とア
ンピシリン耐性遺伝子はpBR322（Bolivarら（1977年）G
ene,2,95−113）から誘導され、pRLG61はP22染色体のHi
nd III消化物からクローニングされたP22 DNAの4.3kb挿
入体を含む。pRLG61は試験管内で構築され、E.コリ中で
クローニングされた。プラスミド起動系を用いて、これ
を次にサルモネラチピムリウムLT2株に抱合させること
によって形質転換した。pRLG61（LT2）株（RGS1と命
名）に対する氷成核分析では、高水準の氷成核活性が示
された。
INA形質導入粒子は、RGS1の液体培養物を細胞当り５
プラーク形成単位（PFU）の感染の多重度（m.o.i.）で
野生型P22ファージで感染させることによって作成し
た。感染培養物を数時間インキュベーションし、粗製の
ファージ含有溶菌物を培養物をクロロホルムで処理し
（細菌細胞を溶解させ）た後、遠心分離を行って（細胞
破片をペレット化）することによって作成した。ファー
ジは、未だ活性を有する氷成のような各種の細胞物質と
共に上澄液画分に残った。次いで、塩化セシウムブロッ
クグラディエントによる遠心分離によって、氷成および
他のタン白質生細胞混入物からファージ粒子を分離し
（これを3M/5M界面から集め）た（Davisら（1980年）Ad
vanced Bacterial Genetics,Cold Sprnger Harbor Labo
ratory、コールドスプリングハーバー、ニュー・ヨー
ク、80〜82頁）。最後に、ファージ含有画分を透析し
て、塩化セシウムを除去した後、0.45μｍフィルターを
通して濾過して調製物を滅菌した。
プラーク形成単位（PFU）の感染の多重度（m.o.i.）で
野生型P22ファージで感染させることによって作成し
た。感染培養物を数時間インキュベーションし、粗製の
ファージ含有溶菌物を培養物をクロロホルムで処理し
（細菌細胞を溶解させ）た後、遠心分離を行って（細胞
破片をペレット化）することによって作成した。ファー
ジは、未だ活性を有する氷成のような各種の細胞物質と
共に上澄液画分に残った。次いで、塩化セシウムブロッ
クグラディエントによる遠心分離によって、氷成および
他のタン白質生細胞混入物からファージ粒子を分離し
（これを3M/5M界面から集め）た（Davisら（1980年）Ad
vanced Bacterial Genetics,Cold Sprnger Harbor Labo
ratory、コールドスプリングハーバー、ニュー・ヨー
ク、80〜82頁）。最後に、ファージ含有画分を透析し
て、塩化セシウムを除去した後、0.45μｍフィルターを
通して濾過して調製物を滅菌した。
それらの形成の性質のため、この調製物中の形質導入
粒子と野生型ファージの比率は小さかった。氷成核活性
の検出とトランスフェクションされた培養物からの薬物
耐性形質導入体の回収は両方とも、約1000回の正常な溶
菌性感染に対して唯１回の形質導入を生じることができ
たことを示唆していた。
粒子と野生型ファージの比率は小さかった。氷成核活性
の検出とトランスフェクションされた培養物からの薬物
耐性形質導入体の回収は両方とも、約1000回の正常な溶
菌性感染に対して唯１回の形質導入を生じることができ
たことを示唆していた。
（前記のようにRGS1をP22で感染させることによって
誘導した）低頻度形質導入粒子の調製物を用いて、inaW
遺伝子をS.チピムリウムLT2の培養物中に形質導入し
た。比較的高濃度の培養物を用いて、形質導入粒子調製
物中の主要な種である野生型ファージによる致死超感染
から形質導入細胞を保護するようにした。また、ファー
ジを宿主細胞に吸着させた後アンピシリン（Ap）を培養
液に加えて、野生型P22による溶菌性感染の割合を更に
低下させた（宿主細胞も野生型ファージもApに対する耐
性を持たなかった）。形質導入フ ァージの種特異性を、形質導入粒子調製物を用いてE.co
li AB1157株の平行トランスフェクションによって試験
した。
誘導した）低頻度形質導入粒子の調製物を用いて、inaW
遺伝子をS.チピムリウムLT2の培養物中に形質導入し
た。比較的高濃度の培養物を用いて、形質導入粒子調製
物中の主要な種である野生型ファージによる致死超感染
から形質導入細胞を保護するようにした。また、ファー
ジを宿主細胞に吸着させた後アンピシリン（Ap）を培養
液に加えて、野生型P22による溶菌性感染の割合を更に
低下させた（宿主細胞も野生型ファージもApに対する耐
性を持たなかった）。形質導入フ ァージの種特異性を、形質導入粒子調製物を用いてE.co
li AB1157株の平行トランスフェクションによって試験
した。
S.チピムリウムLT2とE.coli AB1157の末期対数相培養
物（OD600＝0.5〜1.0）に、約0.1PFU/細胞のm.o.i.で形
質導入粒子調製物を感染させた。培養物を37℃で攪拌せ
ずにインキュベーションし、粒子を20分間宿主細胞に吸
着させた。対照試料を平行して実験し、これは形質導入
ファージに「感染した」滅菌ブイヨンと未感染細菌培養
物とから成っていた。Apを感染培養物に加え、インキュ
ベーションを37℃で攪拌しながら更に40分間継続した。
次いで、培養物を24℃で１時間インキュベーションし
て、氷成核活性を発現させた。
物（OD600＝0.5〜1.0）に、約0.1PFU/細胞のm.o.i.で形
質導入粒子調製物を感染させた。培養物を37℃で攪拌せ
ずにインキュベーションし、粒子を20分間宿主細胞に吸
着させた。対照試料を平行して実験し、これは形質導入
ファージに「感染した」滅菌ブイヨンと未感染細菌培養
物とから成っていた。Apを感染培養物に加え、インキュ
ベーションを37℃で攪拌しながら更に40分間継続した。
次いで、培養物を24℃で１時間インキュベーションし
て、氷成核活性を発現させた。
次に、第３表に関連してE.コリについて前記した方法
で氷成核分析を行った。LT2とAB1157培養物のOD600測定
したところ、それぞれ1.0および0.67であった。結果
を、下記の第５表に示す。
で氷成核分析を行った。LT2とAB1157培養物のOD600測定
したところ、それぞれ1.0および0.67であった。結果
を、下記の第５表に示す。
この表は、温度の関数としての実験試料の氷成核活性
を表わしている。最初の培養物1ml当りの氷核の累積頻
度は特定の温度について与えられている。右端の欄の
（％INA+LT2）は、細胞数の画分パーセントとして表わ
した1ml当りの氷核の数を表わし、OD600＝1.0に対して
は７×106細胞数/mlと計算された。
を表わしている。最初の培養物1ml当りの氷核の累積頻
度は特定の温度について与えられている。右端の欄の
（％INA+LT2）は、細胞数の画分パーセントとして表わ
した1ml当りの氷核の数を表わし、OD600＝1.0に対して
は７×106細胞数/mlと計算された。
前記の結果は氷成核活性の発現が、感染されやすい宿
主株（LT2）の形質導入ファージ調製物による感染の結
果としてのみ起こることを示している。宿主細胞もファ
ージ自体も、検出可能な氷成核活性は発現しない。更
に、E.coli AB1157では氷成核活性の検出可能な形質導
入が観察されなかったので、この実験はinaW遺伝子の形
質導入の後にも粒子の宿主株特異性が保持されているこ
とを示している。形質導入頻度が示しているように、前
記の実験において観察された氷核の最大頻度、2.7×105
/mlは形質導入ファージ調製物のPFU当り１×10-3の氷核
に対応した。
主株（LT2）の形質導入ファージ調製物による感染の結
果としてのみ起こることを示している。宿主細胞もファ
ージ自体も、検出可能な氷成核活性は発現しない。更
に、E.coli AB1157では氷成核活性の検出可能な形質導
入が観察されなかったので、この実験はinaW遺伝子の形
質導入の後にも粒子の宿主株特異性が保持されているこ
とを示している。形質導入頻度が示しているように、前
記の実験において観察された氷核の最大頻度、2.7×105
/mlは形質導入ファージ調製物のPFU当り１×10-3の氷核
に対応した。
プラスミドpRLG61の形質導入も、アンピシリン耐性コ
ロニーをトランスフェクションした培養物から回収する
ことによって検出された。前記のような感染および初期
インキュベーションの後に、細胞をアンピシリンを含む
寒天培地に塗布した。寒天表面には、熱で殺菌したLT2
の層を予め被覆してあり、受容細胞を吸着させて、調製
物中の致死野生型ファージから保護した。アンピシリン
耐性の形質導入コロニーは、一晩インキュベーションし
た後に生じた。この結果は、形質導入ファージ調製物の
PFU当り６×10-3のAprコロニーのpRLG61に対する形質導
入頻度を示していた。したがって、２つの別個の実験に
より、この系の形質導入の頻度は、形質導入粒子調製物
のPFU当り10-3〜10-2回の範囲の形質導入であると決定
された。
ロニーをトランスフェクションした培養物から回収する
ことによって検出された。前記のような感染および初期
インキュベーションの後に、細胞をアンピシリンを含む
寒天培地に塗布した。寒天表面には、熱で殺菌したLT2
の層を予め被覆してあり、受容細胞を吸着させて、調製
物中の致死野生型ファージから保護した。アンピシリン
耐性の形質導入コロニーは、一晩インキュベーションし
た後に生じた。この結果は、形質導入ファージ調製物の
PFU当り６×10-3のAprコロニーのpRLG61に対する形質導
入頻度を示していた。したがって、２つの別個の実験に
より、この系の形質導入の頻度は、形質導入粒子調製物
のPFU当り10-3〜10-2回の範囲の形質導入であると決定
された。
要約すれば、低頻度形質導入粒子は、氷成核遺伝子を
ファージP22中に形質導入することによって調製され
た。次に、こうして産生した粒子をサルモネラチピムリ
ウムLT2株に形質導入したところ、容易に検出可能な氷
成核活性を付与することを見出した。実験の対照試料に
おけるバックグラウンド氷成核活性は存在しないことが
見出され、P22に対して非許容性である細菌のE.coliの
トランスフェクションの試みからは氷成核活性は生じな
かった。
ファージP22中に形質導入することによって調製され
た。次に、こうして産生した粒子をサルモネラチピムリ
ウムLT2株に形質導入したところ、容易に検出可能な氷
成核活性を付与することを見出した。実験の対照試料に
おけるバックグラウンド氷成核活性は存在しないことが
見出され、P22に対して非許容性である細菌のE.coliの
トランスフェクションの試みからは氷成核活性は生じな
かった。
3. ファージP22高頻度形質導入系 下記に、ファージP22を用いて展開した高頻度形質導
入（HFT）系を説明する。この系は、サルモネラの感染
をうけやすい株にinaW遺伝子の高頻度形質導入を行うこ
とができた。このHFT系は、形質導入したリポーター遺
伝子（プルードモナスフルオレセンスからのinaW氷成核
遺伝子）が高頻度形質導入粒子／ファージ（HFTPs）を
産生させるのに用いられるサルモネラの溶原性株に含ま
れるP22プロファージとの永久共組込み体として存在す
るように構成された。HFTP産生株を増殖することによっ
て、あらゆる細胞がTPsの（組換プロファージの溶菌性
サイクルを誘導した場合の）潜在的産生体であり、非形
質導入野生型の復帰ファージに対して高率のTPsを生じ
る培養物を生じた。
入（HFT）系を説明する。この系は、サルモネラの感染
をうけやすい株にinaW遺伝子の高頻度形質導入を行うこ
とができた。このHFT系は、形質導入したリポーター遺
伝子（プルードモナスフルオレセンスからのinaW氷成核
遺伝子）が高頻度形質導入粒子／ファージ（HFTPs）を
産生させるのに用いられるサルモネラの溶原性株に含ま
れるP22プロファージとの永久共組込み体として存在す
るように構成された。HFTP産生株を増殖することによっ
て、あらゆる細胞がTPsの（組換プロファージの溶菌性
サイクルを誘導した場合の）潜在的産生体であり、非形
質導入野生型の復帰ファージに対して高率のTPsを生じ
る培養物を生じた。
２種類の基本的成分を用いて、HFT系を構成した。
ｉ）S.チピムリウムのpolA突然変異株（DNAポリメラー
ゼＩを欠く）、およびii）ColE1型の複製源を有するプ
ラスミドpRLG68、氷成核活性およびアンピシリン（Ap）
耐性をコードする起動性プラスミド。
ｉ）S.チピムリウムのpolA突然変異株（DNAポリメラー
ゼＩを欠く）、およびii）ColE1型の複製源を有するプ
ラスミドpRLG68、氷成核活性およびアンピシリン（Ap）
耐性をコードする起動性プラスミド。
AA3007とよばれる（Whitfield ＆ Levin（1973年）J.
Bacteriol.,116,54−58）polA株はColE1によって誘導さ
れたプラスミドの自律複製を支持することはできないの
で、この株を特異的に用いた。引き続く操作においてそ
の使用を促進するため、最初にAA3007のスペクチノマイ
シン耐性（Scr）誘導体を次のようにして選択した。AA3
007の培養物を5mlのＬ−ブイヨン（LB）中で一晩（ON）
37℃で生育させ、次に、ON培養物2mlを用いて、Scを100
μg/mlの濃度で含む200mlのＬブイヨン培養物に対する
接種物として用いた。24時間生育させた後、LB＋Sc（S
c、50μg/ml）プレート上で、プレート当り24時間液体
培養物50μを用いて培養物の複製培養物を作成した。
Scrコロニーは、37℃でプレートを24時間生育させた
後、同定し単離した。一つのこのようなScrコロニーはA
A3007Scr株の源であり、これ以後RGS10と命名した。RGS
10上のP22の生育を確認し、P22に対して溶原性となっ
た。RGS11と呼ばれるP22に対して溶原性となった誘導体
を、RGS10の芝生上に形成されたP22プラークの曇り中心
から細胞をストリークすることによって単離した。
Bacteriol.,116,54−58）polA株はColE1によって誘導さ
れたプラスミドの自律複製を支持することはできないの
で、この株を特異的に用いた。引き続く操作においてそ
の使用を促進するため、最初にAA3007のスペクチノマイ
シン耐性（Scr）誘導体を次のようにして選択した。AA3
007の培養物を5mlのＬ−ブイヨン（LB）中で一晩（ON）
37℃で生育させ、次に、ON培養物2mlを用いて、Scを100
μg/mlの濃度で含む200mlのＬブイヨン培養物に対する
接種物として用いた。24時間生育させた後、LB＋Sc（S
c、50μg/ml）プレート上で、プレート当り24時間液体
培養物50μを用いて培養物の複製培養物を作成した。
Scrコロニーは、37℃でプレートを24時間生育させた
後、同定し単離した。一つのこのようなScrコロニーはA
A3007Scr株の源であり、これ以後RGS10と命名した。RGS
10上のP22の生育を確認し、P22に対して溶原性となっ
た。RGS11と呼ばれるP22に対して溶原性となった誘導体
を、RGS10の芝生上に形成されたP22プラークの曇り中心
から細胞をストリークすることによって単離した。
HFT系の他のキー要素はプラスミドpRLG68であり、こ
れは高発現inaW（氷成核）遺伝子の（同種組換による）
組込みが促進されるように設計された。pRLG68を２段階
で構成される。最初に、4.6kbのBamH I/Hind III制限酵
素フラグメントで得られるinaWのクローンを発現ベクタ
ープラスミドpKK223−３にクローニングした（Brosius
＆ Holly（1984年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,6929−
6983）。pKK223−３はアンピシリン耐性（Arp）遺伝
子、複製源およびpBR322の「bom」部位（であってある
種の細胞抱合系によって起動されるもの）を含み（Boli
varら（1977年）Gene,2,95−113）、更にこれはプラス
ミドのポリリンカー（マルチクローニング部位）領域に
接近して挿入された外来遺伝子に増進するように配置さ
れた強力なtacプロモーター（de Boerら（1983年）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,80,21−25）を含む。中間のinaW/
pKK223−３構築物はpRLG66と呼ばれた。pRLG68の構築の
第二および最終段階は、P22染色体性DNAのフラグメント
のpPLG66中の部位への挿入を含んだ。P22物理地図でBam
H Iフラグメント「Ｂ」としてしられる2.5kbのP22フラ
グメント（Rutila ＆ Jackson（1981）Virology,113,76
9−775）をP22染色体のBamH I消化物から精製し、pRLG6
6の（tacプロモーター領域の直ぐ蒸留の）特異BamH I部
位に挿入して、本質的なプラスミドの機能を妨害したり
inaWの発現を干渉したりしないようにした。P22フラグ
メントは究極的にはHFTP産生株の構築中にP22プロファ
ージ中の外来DNAの挿入の点となるので、このフラグメ
ントはP22の基本的ライフサイクルに本質的な遺伝子を
欠いているものを選択した。生成するP22/pRLG68構築物
はpRLG68と呼ばれた。
れは高発現inaW（氷成核）遺伝子の（同種組換による）
組込みが促進されるように設計された。pRLG68を２段階
で構成される。最初に、4.6kbのBamH I/Hind III制限酵
素フラグメントで得られるinaWのクローンを発現ベクタ
ープラスミドpKK223−３にクローニングした（Brosius
＆ Holly（1984年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,6929−
6983）。pKK223−３はアンピシリン耐性（Arp）遺伝
子、複製源およびpBR322の「bom」部位（であってある
種の細胞抱合系によって起動されるもの）を含み（Boli
varら（1977年）Gene,2,95−113）、更にこれはプラス
ミドのポリリンカー（マルチクローニング部位）領域に
接近して挿入された外来遺伝子に増進するように配置さ
れた強力なtacプロモーター（de Boerら（1983年）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA,80,21−25）を含む。中間のinaW/
pKK223−３構築物はpRLG66と呼ばれた。pRLG68の構築の
第二および最終段階は、P22染色体性DNAのフラグメント
のpPLG66中の部位への挿入を含んだ。P22物理地図でBam
H Iフラグメント「Ｂ」としてしられる2.5kbのP22フラ
グメント（Rutila ＆ Jackson（1981）Virology,113,76
9−775）をP22染色体のBamH I消化物から精製し、pRLG6
6の（tacプロモーター領域の直ぐ蒸留の）特異BamH I部
位に挿入して、本質的なプラスミドの機能を妨害したり
inaWの発現を干渉したりしないようにした。P22フラグ
メントは究極的にはHFTP産生株の構築中にP22プロファ
ージ中の外来DNAの挿入の点となるので、このフラグメ
ントはP22の基本的ライフサイクルに本質的な遺伝子を
欠いているものを選択した。生成するP22/pRLG68構築物
はpRLG68と呼ばれた。
（pBR322前駆体から究極的に誘導される）pRLG68のbo
m領域は、細菌の接合中に起動して移動させ、接合およ
び起動の機能は接合ドナー株によってトランスに提供さ
れるようにした。したがって、pRLG68をE.coli GJ23株
中に形質転換し、この株中でpRLG68がR64drd11/pGJ28系
（Van Hauteら（1983）EMBO J.,2,411−417）によって
起動可能にし、且つそこから中間種接合を介してRGS11
に移動した。pRLG68は、（polA突然変異により）受容体
RGS11株中で自律的に複製することができなかったの
で、交配からの任意のAprScr生成物はP22 DNAのプラス
ミド領域とプロファージ中の同種領域との間の同種組換
から生じるP22プロファージ中のpRLG68挿入体を含むも
のと仮定した。若干数の代表的クローンの（そのAA3007
およびRGS11前駆体株と一緒）のサザンブロット法によ
る分析では、pRLG68/P22共組込み体の形成と一致する結
果が得られた。生成する株はRGS12と呼ばれ、HFTPsを産
生する株であった。
m領域は、細菌の接合中に起動して移動させ、接合およ
び起動の機能は接合ドナー株によってトランスに提供さ
れるようにした。したがって、pRLG68をE.coli GJ23株
中に形質転換し、この株中でpRLG68がR64drd11/pGJ28系
（Van Hauteら（1983）EMBO J.,2,411−417）によって
起動可能にし、且つそこから中間種接合を介してRGS11
に移動した。pRLG68は、（polA突然変異により）受容体
RGS11株中で自律的に複製することができなかったの
で、交配からの任意のAprScr生成物はP22 DNAのプラス
ミド領域とプロファージ中の同種領域との間の同種組換
から生じるP22プロファージ中のpRLG68挿入体を含むも
のと仮定した。若干数の代表的クローンの（そのAA3007
およびRGS11前駆体株と一緒）のサザンブロット法によ
る分析では、pRLG68/P22共組込み体の形成と一致する結
果が得られた。生成する株はRGS12と呼ばれ、HFTPsを産
生する株であった。
HFTPsは、P22および他の関連ファージの溶原に溶菌サ
イクルを誘導することが知られている薬物であるマイト
マイシン−ＣでRGS12の培養物を処理することによっ
て、この株から産生した（Arberら（1983年）Lambda I
I,Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリン
グハーバー、ニュー・ヨーク、443−445頁）。このよう
なRGS12の誘導によって子孫ファージ流の複数とパッケ
ージングが起こり、これらの粒子の多くは組換HFTPsで
あった。RGS12の培養物をＬブイヨン中で37℃で中間−
指数相（A600＝0.40）まで生育させ、この時点でマイト
マイシン−Ｃを5mMの最終濃度になるまで加えた。培養
フラスコを箔で覆い、細菌の光活性DNA修復機能を促進
する光を遮断し（これによって誘導の効率をできるだけ
低くし）、インキュベーションを数時間再開して、細菌
細胞を完全に溶解した。細菌破片を2,000×ｇで20分間
遠心分離することによって溶菌培養物から除き、上澄液
を0.45μｍフィルター通して除菌した。更に、RGS12上
澄液を55℃で15分間加熱したところ、（材料の標準的液
滴凍結分析によって分析した）残留している氷成核活性
を破壊し、HFTP自体には悪影響を及ぼさないことが判っ
た。実験上の対照として、PGS11（非組換で溶原性のRGS
12の祖先株）から同様な方法でファージを産生した。
イクルを誘導することが知られている薬物であるマイト
マイシン−ＣでRGS12の培養物を処理することによっ
て、この株から産生した（Arberら（1983年）Lambda I
I,Cold Spring Harbor Laboratory、コールドスプリン
グハーバー、ニュー・ヨーク、443−445頁）。このよう
なRGS12の誘導によって子孫ファージ流の複数とパッケ
ージングが起こり、これらの粒子の多くは組換HFTPsで
あった。RGS12の培養物をＬブイヨン中で37℃で中間−
指数相（A600＝0.40）まで生育させ、この時点でマイト
マイシン−Ｃを5mMの最終濃度になるまで加えた。培養
フラスコを箔で覆い、細菌の光活性DNA修復機能を促進
する光を遮断し（これによって誘導の効率をできるだけ
低くし）、インキュベーションを数時間再開して、細菌
細胞を完全に溶解した。細菌破片を2,000×ｇで20分間
遠心分離することによって溶菌培養物から除き、上澄液
を0.45μｍフィルター通して除菌した。更に、RGS12上
澄液を55℃で15分間加熱したところ、（材料の標準的液
滴凍結分析によって分析した）残留している氷成核活性
を破壊し、HFTP自体には悪影響を及ぼさないことが判っ
た。実験上の対照として、PGS11（非組換で溶原性のRGS
12の祖先株）から同様な方法でファージを産生した。
幾つかの実験では、RGS12 HFTPを特性決定した。第一
に、マイトマイシン−Ｃによって誘導されたRGS11およ
びRGS12培養物からのファージ調製物の力価を、同様に
処理した非突然変異体LT2（P22）＋の溶原性株（LT2はR
GS11およびRGS12の激しい非突然変異性原種体である）
から産生したファージの試料と比較した。力価は、LT2
（P22）＋、RGS11およびRGS12調製物に対してそれぞれ1
09、108および107PFU/mlであった。ファージ力価は細菌
叢に形成されたプラークを計数することによって測定さ
れるので、溶菌性感染を行うことができるファージのみ
が分析可能である。RGS12調整物の力価から比較的低い
ことは、TPの比率が著しいことを示唆しており、ほとん
どのTPは溶菌性の生育が不完全であり（それらが含む異
種DNAは本質的なDNAを締め出すことになる）からであ
る。これは、生成したRSG11およびRGS12ファージDNAの
制限消化物の電気泳動分析によって確認され、これはRG
S12ファージDNAに余分な制限フラグメントの存在を示し
た。余分なフラグメントの大きさはpRLG68/P22プロファ
ージ共組込み体で予言したものと一致した。更に、それ
らの相対的強度から、ファージ粒子のほとんどが余分の
DNAを含むことが判った。
に、マイトマイシン−Ｃによって誘導されたRGS11およ
びRGS12培養物からのファージ調製物の力価を、同様に
処理した非突然変異体LT2（P22）＋の溶原性株（LT2はR
GS11およびRGS12の激しい非突然変異性原種体である）
から産生したファージの試料と比較した。力価は、LT2
（P22）＋、RGS11およびRGS12調製物に対してそれぞれ1
09、108および107PFU/mlであった。ファージ力価は細菌
叢に形成されたプラークを計数することによって測定さ
れるので、溶菌性感染を行うことができるファージのみ
が分析可能である。RGS12調整物の力価から比較的低い
ことは、TPの比率が著しいことを示唆しており、ほとん
どのTPは溶菌性の生育が不完全であり（それらが含む異
種DNAは本質的なDNAを締め出すことになる）からであ
る。これは、生成したRSG11およびRGS12ファージDNAの
制限消化物の電気泳動分析によって確認され、これはRG
S12ファージDNAに余分な制限フラグメントの存在を示し
た。余分なフラグメントの大きさはpRLG68/P22プロファ
ージ共組込み体で予言したものと一致した。更に、それ
らの相対的強度から、ファージ粒子のほとんどが余分の
DNAを含むことが判った。
下記の実験では、前記と同様にして作成したのと同じ
RGS12 HFTPの調製物を用いた。RGS12 HFTPを用いる氷成
核活性（INA）の形質導入による細菌細胞の検出を、以
後「形質導入分析」と呼ぶことにする。形質導入分析法
は、細菌を含む試料のHFTPによる感染と、試料中で発現
した氷成核活性（INA）の最終的定量から成っている。
初期の実験は、HFTP系を用いて細菌を特性決定し且つ検
出を最適にするために行った。最終的に、実験は、下記
の実施例のような実際の食品試料中の細菌の分析を模倣
するために行った。
RGS12 HFTPの調製物を用いた。RGS12 HFTPを用いる氷成
核活性（INA）の形質導入による細菌細胞の検出を、以
後「形質導入分析」と呼ぶことにする。形質導入分析法
は、細菌を含む試料のHFTPによる感染と、試料中で発現
した氷成核活性（INA）の最終的定量から成っている。
初期の実験は、HFTP系を用いて細菌を特性決定し且つ検
出を最適にするために行った。最終的に、実験は、下記
の実施例のような実際の食品試料中の細菌の分析を模倣
するために行った。
下記の実験は、全卵混合物中に存在するサルモネラの
検出を説明するために行った。S.チピムリウムLT2株の
培養物を、Ｌブイヨン中で37℃で光学濃度（A600）が0.
35になるまで生育させた。次に、この培養物を10倍ずつ
希釈して生の混合した卵（すなわち、卵黄と卵白を一緒
に混合したもの）に加え、卵中に希釈列は、最初の（A
600＝0.35）培養物に対して10-5にまで及んだ。細菌はR
GS12 HFTPを用いて下記のようにして形質導入によって
分析した。10-2〜10-5細菌希釈液／卵のそれぞれの40μ
の試料を滅菌したＬブイヨン360μに加え、最初の
試料の10倍希釈液を構成した。更に、細菌を接種してい
ない混合物の対照試料を同様にして作成した（LBで1:10
に希釈）。細菌を接種していない混合物の対照を除いた
それぞれの試料にRGS12 HFTP調製物100μを加え（全
体で２×106PFUを含んだ）、対照は代わりに滅菌したＬ
ブイヨンを等量加えた。次に、試料を37℃で１時間およ
び23℃で１時間インキュベーションして、形質導入した
INAを発現させた。次に、形質導入した試料のINAを、下
記のようにして液滴凍結分析法によって測定した。それ
ぞれの形質導入した試料に、螢光染料混合物（100mMカ
ルボキシ−フルオレセイン、100mMトリス−HCl pH7.0）
1/100容積を加えて、分析の際に凍結物の検出を容易に
した（染料の色は凍結により螢光性の黄色から鈍い赤色
に変化する）。次に、それぞれ試料の希釈液を、（総て
の希釈液中1mM強度での）同じカルボキシフルオレセイ
ン緩衝液で10-1から10-5までの10倍ずつで作成した。
（最初の細菌培養物の形質導入希釈液である）最初の分
析試料のそれぞれ希釈液の20×10μの液滴を、次に温
度調節した冷却槽の表面に浮かせたパラフィンで被覆し
た箔上に載せた。次に、槽の温度を−2.0℃から−12.0
℃まで80分間を要して下げたときの液滴の凍結を監視し
た。次に、未処理の凍結液滴データーを用いて、最初の
試料中における氷核の頻度を算出した（Vali（1971年）
J.Atmos.Sci.,28,402−409）。その最終的形態では、デ
ーターは累積INA温度スペクトル、すなわち、ある温度
範囲における1ml当りの氷核の数として表わされてい
る。上記の実験の結果を第５表に示す。
検出を説明するために行った。S.チピムリウムLT2株の
培養物を、Ｌブイヨン中で37℃で光学濃度（A600）が0.
35になるまで生育させた。次に、この培養物を10倍ずつ
希釈して生の混合した卵（すなわち、卵黄と卵白を一緒
に混合したもの）に加え、卵中に希釈列は、最初の（A
600＝0.35）培養物に対して10-5にまで及んだ。細菌はR
GS12 HFTPを用いて下記のようにして形質導入によって
分析した。10-2〜10-5細菌希釈液／卵のそれぞれの40μ
の試料を滅菌したＬブイヨン360μに加え、最初の
試料の10倍希釈液を構成した。更に、細菌を接種してい
ない混合物の対照試料を同様にして作成した（LBで1:10
に希釈）。細菌を接種していない混合物の対照を除いた
それぞれの試料にRGS12 HFTP調製物100μを加え（全
体で２×106PFUを含んだ）、対照は代わりに滅菌したＬ
ブイヨンを等量加えた。次に、試料を37℃で１時間およ
び23℃で１時間インキュベーションして、形質導入した
INAを発現させた。次に、形質導入した試料のINAを、下
記のようにして液滴凍結分析法によって測定した。それ
ぞれの形質導入した試料に、螢光染料混合物（100mMカ
ルボキシ−フルオレセイン、100mMトリス−HCl pH7.0）
1/100容積を加えて、分析の際に凍結物の検出を容易に
した（染料の色は凍結により螢光性の黄色から鈍い赤色
に変化する）。次に、それぞれ試料の希釈液を、（総て
の希釈液中1mM強度での）同じカルボキシフルオレセイ
ン緩衝液で10-1から10-5までの10倍ずつで作成した。
（最初の細菌培養物の形質導入希釈液である）最初の分
析試料のそれぞれ希釈液の20×10μの液滴を、次に温
度調節した冷却槽の表面に浮かせたパラフィンで被覆し
た箔上に載せた。次に、槽の温度を−2.0℃から−12.0
℃まで80分間を要して下げたときの液滴の凍結を監視し
た。次に、未処理の凍結液滴データーを用いて、最初の
試料中における氷核の頻度を算出した（Vali（1971年）
J.Atmos.Sci.,28,402−409）。その最終的形態では、デ
ーターは累積INA温度スペクトル、すなわち、ある温度
範囲における1ml当りの氷核の数として表わされてい
る。上記の実験の結果を第５表に示す。
第５表に示されるように、HFT系を用いるINAの形質導
入では、LT2細胞が存在する総ての試料中で、（LBで希
釈してHFTPを添加した後）この細胞を250細胞数/mlの濃
度程度まで検出することができた。また、未接種卵試料
から明らかなように、細菌が存在しないときには、バッ
クグラウンド活性は存在しなかった。これらの実験で観
測されたINAは、ここのINA+細胞が検出されたという点
において強力な結果計数性を有していた。これを簡単に
いえば、試料中の細胞の大多数はINA+表現型に形質導入
されているので、試料のINAの頻度で細菌の細胞濃度を
計算することができたのである。したがって、−12℃
（この温度ではINAの検出が最も感受性が高い）でのINA
の測定は、試料中のLT2細胞の個体数と強力に相関して
いた。
入では、LT2細胞が存在する総ての試料中で、（LBで希
釈してHFTPを添加した後）この細胞を250細胞数/mlの濃
度程度まで検出することができた。また、未接種卵試料
から明らかなように、細菌が存在しないときには、バッ
クグラウンド活性は存在しなかった。これらの実験で観
測されたINAは、ここのINA+細胞が検出されたという点
において強力な結果計数性を有していた。これを簡単に
いえば、試料中の細胞の大多数はINA+表現型に形質導入
されているので、試料のINAの頻度で細菌の細胞濃度を
計算することができたのである。したがって、−12℃
（この温度ではINAの検出が最も感受性が高い）でのINA
の測定は、試料中のLT2細胞の個体数と強力に相関して
いた。
要約すれば、高頻度形質導入系はファージP22で展開
され、tacによって促進されるinaW遺伝子の形質導入はP
22プロファージ中に氷成核遺伝子を含むサルモネラ株か
らの形質導入粒子を製造することによって最大になっ
た。DNA分析技術によってその構造を立証した後、HFT系
を形質導入分析法に用いて、接種を行った生卵の試料中
に存在するLT2細胞を検出した。形質導入分析法は、疎
らな数の細菌を検出するのに極めて高い感度を示し、バ
ックグラウンド信号がなく、且つこの分析法は存在する
細菌細胞の数を計算するのに用いることができることを
示した。
され、tacによって促進されるinaW遺伝子の形質導入はP
22プロファージ中に氷成核遺伝子を含むサルモネラ株か
らの形質導入粒子を製造することによって最大になっ
た。DNA分析技術によってその構造を立証した後、HFT系
を形質導入分析法に用いて、接種を行った生卵の試料中
に存在するLT2細胞を検出した。形質導入分析法は、疎
らな数の細菌を検出するのに極めて高い感度を示し、バ
ックグラウンド信号がなく、且つこの分析法は存在する
細菌細胞の数を計算するのに用いることができることを
示した。
4. 熱で無力化した細胞における形質導入 この実施例では、無力化した細菌のファージ形質導入
に対する応答を試験し且つこれらの細菌がこの方法によ
って検出し得るようになるまで要する回収時間を決定す
るように設計された一組の実験を説明する。
に対する応答を試験し且つこれらの細菌がこの方法によ
って検出し得るようになるまで要する回収時間を決定す
るように設計された一組の実験を説明する。
細胞の損傷は、サルモネラチピムリウムの培養液を有
害なほどの高温に暴露することによって行い、その時間
中、試料の一部を経時的に採取して、Ｌ寒天（豊富な非
選択的培地）およびSS寒天（サルモネラおよびシゲラの
単離に用いられる極めて選択的な培地）で培養した。一
晩のインキュベーションの後、それぞれの熱処理した試
料のＬおよびSS寒天上で成育したコロニーの相対数を用
いて、熱処理によって生じた損傷の程度を測定した。下
記の実験では、前記の実施例（実施例３）に記載の高頻
度形質導入（HFT）系を用いる熱によって損傷を生じた
細胞の形質導入の結果を説明する。
害なほどの高温に暴露することによって行い、その時間
中、試料の一部を経時的に採取して、Ｌ寒天（豊富な非
選択的培地）およびSS寒天（サルモネラおよびシゲラの
単離に用いられる極めて選択的な培地）で培養した。一
晩のインキュベーションの後、それぞれの熱処理した試
料のＬおよびSS寒天上で成育したコロニーの相対数を用
いて、熱処理によって生じた損傷の程度を測定した。下
記の実験では、前記の実施例（実施例３）に記載の高頻
度形質導入（HFT）系を用いる熱によって損傷を生じた
細胞の形質導入の結果を説明する。
下記の実験において、LT2の希釈培養物を水槽中に浸
漬することによって55℃に暴露した。試料の一部を、時
間０（すなわち、水槽に浸漬する直前）、および浸漬の
後60,90,120および150秒の時間に培養物から採取した。
この試料を希釈したものをＬおよびSS寒天上で直ちに培
養して、細菌に対してなされた初期の損傷を評価した。
次に、それぞれの試料を分割して、２組の同じ熱処理し
た試料を作成した。一方の組は、RGS12形質導入ファー
ジを用いて、（実施例３に記載したのと同じ）方法であ
ってインキュベーションが全部で２時間、すなわち37℃
で１時間、次いで23℃で１時間である方法を用いて形質
導入した。試料の他の組は形質導入を行わず、形質導入
を行ったものと平行してインキュベーションして、形質
導入手続き中の熱によって無力化した細胞の回収につい
て対照とした（この観察は、ファージに感染した試料で
は不明瞭であった）。次に、形質導入されない対照試料
の希釈物を、形質導入インキュベーションが終了した時
点でＬおよびSS寒天上で培養し、分析を行って、形質導
入した試料によって発現されたINAを測定した。実験の
結果を第６表に示す。
漬することによって55℃に暴露した。試料の一部を、時
間０（すなわち、水槽に浸漬する直前）、および浸漬の
後60,90,120および150秒の時間に培養物から採取した。
この試料を希釈したものをＬおよびSS寒天上で直ちに培
養して、細菌に対してなされた初期の損傷を評価した。
次に、それぞれの試料を分割して、２組の同じ熱処理し
た試料を作成した。一方の組は、RGS12形質導入ファー
ジを用いて、（実施例３に記載したのと同じ）方法であ
ってインキュベーションが全部で２時間、すなわち37℃
で１時間、次いで23℃で１時間である方法を用いて形質
導入した。試料の他の組は形質導入を行わず、形質導入
を行ったものと平行してインキュベーションして、形質
導入手続き中の熱によって無力化した細胞の回収につい
て対照とした（この観察は、ファージに感染した試料で
は不明瞭であった）。次に、形質導入されない対照試料
の希釈物を、形質導入インキュベーションが終了した時
点でＬおよびSS寒天上で培養し、分析を行って、形質導
入した試料によって発現されたINAを測定した。実験の
結果を第６表に示す。
１ 培養数と熱無力化実験から採取した試料のINAの比
較。
較。
個々のプレート上のコロニー数を希釈しない培養物に
ついてのml当りのコロニー形成単位（cfu）に翻訳してI
NAデーターと直接比較することができるようにした。
「＜DL」とは、コロニー数が検出限界を下回る（すなわ
ち、コロニーは希釈した培養液では検出されない）場合
を示し、この実験の培養のDLは１×103cfu/mlであっ
た。「無力化％」値は、100−％（SS上のcfu/L上のcf
u）で表わし、培養に就いての検出限界を下回る最高値
は計算で置換した。
ついてのml当りのコロニー形成単位（cfu）に翻訳してI
NAデーターと直接比較することができるようにした。
「＜DL」とは、コロニー数が検出限界を下回る（すなわ
ち、コロニーは希釈した培養液では検出されない）場合
を示し、この実験の培養のDLは１×103cfu/mlであっ
た。「無力化％」値は、100−％（SS上のcfu/L上のcf
u）で表わし、培養に就いての検出限界を下回る最高値
は計算で置換した。
熱処理の一つの明らかな効果は、細胞を完全に殺すこ
とでありこれにより増殖可能な細胞数は経過時間の終わ
りまでに95％まで減少した。後で採取した生存細胞から
無力化した細胞の数が増加することも明らかであり、す
なわちLBで培養可能な細胞の極僅かだけがSS寒天で増殖
することができた。第６表で明らかなように、90秒後に
採取した試料はほとんどまたは完全に無力化した細胞を
含んでいた。特にこれらの後者の試料では、熱処理の効
果は形質導入処理の終了まで持続し、培養物は分割する
ことが出来ず、120秒および150秒の試料では更に２時間
の内に更に死亡するものであった。しかしながら、酷く
損傷を受けた試料では増殖は見られないが、形質導入分
析を行うのに要した時間のうちに、無力化した状態から
幾分か回復した。回復の程度は一層重度に損傷を受けた
試料では少なく、最初に無力化した細胞の大半は処理の
終了までその状態のままであった。
とでありこれにより増殖可能な細胞数は経過時間の終わ
りまでに95％まで減少した。後で採取した生存細胞から
無力化した細胞の数が増加することも明らかであり、す
なわちLBで培養可能な細胞の極僅かだけがSS寒天で増殖
することができた。第６表で明らかなように、90秒後に
採取した試料はほとんどまたは完全に無力化した細胞を
含んでいた。特にこれらの後者の試料では、熱処理の効
果は形質導入処理の終了まで持続し、培養物は分割する
ことが出来ず、120秒および150秒の試料では更に２時間
の内に更に死亡するものであった。しかしながら、酷く
損傷を受けた試料では増殖は見られないが、形質導入分
析を行うのに要した時間のうちに、無力化した状態から
幾分か回復した。回復の程度は一層重度に損傷を受けた
試料では少なく、最初に無力化した細胞の大半は処理の
終了までその状態のままであった。
第６表に示した結果は、形質導入試料中に発現した氷
核の頻度は生育可能な細菌（すなわち、無力化されたま
たは無力化されていない状態で熱処理を生き延びた細
胞）のそれぞれの個体数に緊密に対応し、これは、初期
の個体数が無力化した細胞だけから成るときにも真実で
あった。これに対する重要な推論は、熱処理によって殺
された細胞は分析には現れないということである。要約
すれば、熱で無力化した細菌の形質導入による検出に対
する応答は、実質的に健康な細胞の応答と同じであっ
た。これらの結果は、ファージ形質導入分析を、無力化
細胞を確実に検出するための回復期間を必要とせずに行
うことができることを示している。
核の頻度は生育可能な細菌（すなわち、無力化されたま
たは無力化されていない状態で熱処理を生き延びた細
胞）のそれぞれの個体数に緊密に対応し、これは、初期
の個体数が無力化した細胞だけから成るときにも真実で
あった。これに対する重要な推論は、熱処理によって殺
された細胞は分析には現れないということである。要約
すれば、熱で無力化した細菌の形質導入による検出に対
する応答は、実質的に健康な細胞の応答と同じであっ
た。これらの結果は、ファージ形質導入分析を、無力化
細胞を確実に検出するための回復期間を必要とせずに行
うことができることを示している。
要約すれば、細胞損傷はS.チピムリウムLT2株の培養
物において55℃に様々な長さの時間暴露することによっ
て誘導された。熱で損傷した試料またはLB寒天およびSS
寒天の培養を次に行った。２種類の培地で増殖した細菌
コロニーの数の差を用いて、細胞培養物に対する損傷の
尺度とした。次に、形質導入分析を、RGS12 HFTP系を用
いて、これらの熱で無力化した細菌について行った。分
析の結果は、無力化した細菌が健康な細菌と同じ高率で
検出され、処理によって殺された細菌は分析による検出
では見られなかったことを示していた。
物において55℃に様々な長さの時間暴露することによっ
て誘導された。熱で損傷した試料またはLB寒天およびSS
寒天の培養を次に行った。２種類の培地で増殖した細菌
コロニーの数の差を用いて、細胞培養物に対する損傷の
尺度とした。次に、形質導入分析を、RGS12 HFTP系を用
いて、これらの熱で無力化した細菌について行った。分
析の結果は、無力化した細菌が健康な細菌と同じ高率で
検出され、処理によって殺された細菌は分析による検出
では見られなかったことを示していた。
5. P22形質導入ファージの宿主領域特異性 下記の実験では、各種の血清群からの多数の異なるサ
ルモネラ血清型の分析におけるP22由来の形質導入系の
応答を試験した。実施例３に記載した「高頻度形質導
入」（HFT）系を、下記の実験で用いた。高頻度形質導
入粒子／ファージ（HFTP）は、氷成核活性（INA）をコ
ードする高発現性遺伝子（tac促進inaW）を有し、実施
例３ではS.チピムリウムLT2株細胞を敏感に検出するこ
とができることが示された。下記の組の実験では、P22
由来とTPは（形質導入粒子分析の生物学的特異性はその
キーとなる特徴の一つであるので）P22の既知の宿主領
域に従い、様々な感受性を有する細菌株が同等な高率で
形質導入／検出され、且つ分析試料中の非P22感受性細
菌の存在は感受性細菌の検出を妨げないことを示してい
た。２つの実験からの結果を下記に示す。一つは細菌の
純粋培養物における形質導入を検討したものであり、他
方は混合培養物における形質導入を検討したものであ
る。
ルモネラ血清型の分析におけるP22由来の形質導入系の
応答を試験した。実施例３に記載した「高頻度形質導
入」（HFT）系を、下記の実験で用いた。高頻度形質導
入粒子／ファージ（HFTP）は、氷成核活性（INA）をコ
ードする高発現性遺伝子（tac促進inaW）を有し、実施
例３ではS.チピムリウムLT2株細胞を敏感に検出するこ
とができることが示された。下記の組の実験では、P22
由来とTPは（形質導入粒子分析の生物学的特異性はその
キーとなる特徴の一つであるので）P22の既知の宿主領
域に従い、様々な感受性を有する細菌株が同等な高率で
形質導入／検出され、且つ分析試料中の非P22感受性細
菌の存在は感受性細菌の検出を妨げないことを示してい
た。２つの実験からの結果を下記に示す。一つは細菌の
純粋培養物における形質導入を検討したものであり、他
方は混合培養物における形質導入を検討したものであ
る。
A.純粋培養物 サルモネラ層のKauffmann−White分類図（Kauffmann
（1978年）Das Fundamnt,Munksgaard、コペンハーゲ
ン）の血清群B,D,C1,C2およびG2に属する９種類の異な
る血清型を含む数種類のサルモネラ株が、B.Stocker博
士によって提供された。各種の株の外膜におけるP22受
容体分子の既知の存在または不在によって、P22感受性
（P22s）またはP22耐性（P22r）として分類することが
でき、血清群ＢおよびＤに属する株はP22sであり、血清
群C1,C2およびG2に属する株はP22rとなった。それぞれ
の細菌の純粋培養物について形質導入分析を行って、形
質導入が既知のP22sでしか起きないことを確認した。S.
チピムリウムLT2株（P22s）のHFT系による形質導入にお
ける挙動は予め決定されていたので（実施例３を参
照）、この株を対照としてパネルに包含させた。
（1978年）Das Fundamnt,Munksgaard、コペンハーゲ
ン）の血清群B,D,C1,C2およびG2に属する９種類の異な
る血清型を含む数種類のサルモネラ株が、B.Stocker博
士によって提供された。各種の株の外膜におけるP22受
容体分子の既知の存在または不在によって、P22感受性
（P22s）またはP22耐性（P22r）として分類することが
でき、血清群ＢおよびＤに属する株はP22sであり、血清
群C1,C2およびG2に属する株はP22rとなった。それぞれ
の細菌の純粋培養物について形質導入分析を行って、形
質導入が既知のP22sでしか起きないことを確認した。S.
チピムリウムLT2株（P22s）のHFT系による形質導入にお
ける挙動は予め決定されていたので（実施例３を参
照）、この株を対照としてパネルに包含させた。
それぞれの株の純粋培養物を、37℃で中間−指数相
（A600は0.28から0.67の範囲であった）までＬブイヨン
で増殖させ、次に、それぞれの培養物の連続希釈物を
（希釈剤として滅菌したLBを用いて）最初の培養物に対
して10-7まで10倍ずつで作成した。次に、（実施例３と
同じ方向で作成した）PGS12 HFTPを用いて、実施例３に
記載した方法にしたがって形質導入を行った。それぞれ
の培養希釈物の少量（0.1ml）であって、それぞれが全
部で３×106pfuを含むHFTP調製物25μを有するものを
作成した。これらの試料を37℃で１時間、続いて23℃で
１時間インキュベーションした。インキュベーションの
後、濃縮螢光染料（次のINA分析の際に、凍結結果の検
出を容易にするために用いた）の少量（１μ）を、実
施例３に記載した通りにそれぞれの形質導入培養希釈物
に加えた。次いで、それぞれの形質導入希釈物の３つの
10μ液滴を、96ウェルマイクロタイター皿の別々のウ
ェルに入れた。次いで、このマイクロタイター皿を、−
10.0℃で平衡にした形状のぴったり合った冷却ブロック
に入れた。10〜15分後に、凍結液滴の数を数えた。結果
を第７表に示す。
（A600は0.28から0.67の範囲であった）までＬブイヨン
で増殖させ、次に、それぞれの培養物の連続希釈物を
（希釈剤として滅菌したLBを用いて）最初の培養物に対
して10-7まで10倍ずつで作成した。次に、（実施例３と
同じ方向で作成した）PGS12 HFTPを用いて、実施例３に
記載した方法にしたがって形質導入を行った。それぞれ
の培養希釈物の少量（0.1ml）であって、それぞれが全
部で３×106pfuを含むHFTP調製物25μを有するものを
作成した。これらの試料を37℃で１時間、続いて23℃で
１時間インキュベーションした。インキュベーションの
後、濃縮螢光染料（次のINA分析の際に、凍結結果の検
出を容易にするために用いた）の少量（１μ）を、実
施例３に記載した通りにそれぞれの形質導入培養希釈物
に加えた。次いで、それぞれの形質導入希釈物の３つの
10μ液滴を、96ウェルマイクロタイター皿の別々のウ
ェルに入れた。次いで、このマイクロタイター皿を、−
10.0℃で平衡にした形状のぴったり合った冷却ブロック
に入れた。10〜15分後に、凍結液滴の数を数えた。結果
を第７表に示す。
第７表に示した結果は、P22s株の中でのみINAの形質
導入が起こり、更に感受性を有する細菌はいずれの場合
にも等しく高感度で検出されることを示している。P22r
株では、INAのバックグラウンドは検出されなかった。
最初の（希釈していない）対数相の培養物のA600の測定
によれば、対応する10-7希釈物（したがって、この実験
における最低検出限界）の細胞数は100細胞数/mlより少
なかった。この水準の感度は、株LT2のみで以前に観察
した水準と一致した（実施例３を参照）。したがって、
この実験は、P22によって媒介される形質導入はファー
ジの既知の宿主領域に従い、各種のP22s株が同じ高効率
で形質導入されたことを示している。
導入が起こり、更に感受性を有する細菌はいずれの場合
にも等しく高感度で検出されることを示している。P22r
株では、INAのバックグラウンドは検出されなかった。
最初の（希釈していない）対数相の培養物のA600の測定
によれば、対応する10-7希釈物（したがって、この実験
における最低検出限界）の細胞数は100細胞数/mlより少
なかった。この水準の感度は、株LT2のみで以前に観察
した水準と一致した（実施例３を参照）。したがって、
この実験は、P22によって媒介される形質導入はファー
ジの既知の宿主領域に従い、各種のP22s株が同じ高効率
で形質導入されたことを示している。
B.混合培養物 形質導入分析の特異性のもう一つの様相は、「非標
的」細菌（すなわち、形質導入分析による検出が期待さ
れない関連細菌）がファージ形質導入によるP22s細菌の
検出が期待されることである。下記の実験では、このよ
うな設定での形質導入を検討した。
的」細菌（すなわち、形質導入分析による検出が期待さ
れない関連細菌）がファージ形質導入によるP22s細菌の
検出が期待されることである。下記の実験では、このよ
うな設定での形質導入を検討した。
この実験では、RGS12 HFTPを下記に記載したことを除
いて本実施例のＡ部の方法と同様に用いた。ただ１種類
のP22r株、S.dublinを用いて試料を作成して、P22r細菌
の存在においてS.ダブリン（S.dublin）を分析した。P2
2r細菌は、E.コリJC10291株（Willisら、（1981年）Mo
l.Gen.Genet.,183,479−504）、B.サブチリス（B.subti
llis）BR151株（ATCC No.33677）、およびS.ハバナ（サ
ルモネラの天然のP22r株）であった（本実施例のＡ部を
参照）。それぞれの株を37℃でＬブイヨン中で中間−指
数相まで生育させ、その時点でのA600を測定した。次い
で、培養物を（新たなＬブイヨン中で希釈することによ
って）同じ濃度（A600＝0.36）に調整した。
いて本実施例のＡ部の方法と同様に用いた。ただ１種類
のP22r株、S.dublinを用いて試料を作成して、P22r細菌
の存在においてS.ダブリン（S.dublin）を分析した。P2
2r細菌は、E.コリJC10291株（Willisら、（1981年）Mo
l.Gen.Genet.,183,479−504）、B.サブチリス（B.subti
llis）BR151株（ATCC No.33677）、およびS.ハバナ（サ
ルモネラの天然のP22r株）であった（本実施例のＡ部を
参照）。それぞれの株を37℃でＬブイヨン中で中間−指
数相まで生育させ、その時点でのA600を測定した。次い
で、培養物を（新たなＬブイヨン中で希釈することによ
って）同じ濃度（A600＝0.36）に調整した。
それぞれの株の制御形質導入を行って、（在るとすれ
ば）P22r細菌におけるバックグラウンドをチェックし、
S.ダブリンの純粋培養物と共に分析の応答を測定した。
S.ダブリン試料は、最初の（A600＝0.36）培養物を10倍
ずつ10-9まで希釈することによって作成し、10-2から10
-9までの希釈物のみを分析に使用した。４系列のこのよ
うな希釈液を作成し、一つの系列では、希釈剤として滅
菌LBを用い、他の３系列ではP22r細菌の未希釈（A600＝
0.36）培養物のそれぞれのものを希釈剤として用いた。
換言すれば、それぞれの試料系列は、（最初の培養物に
対して）S.ダブリンの濃度が10-2から10-9までの８種類
の希釈物からなっていた。他の未希釈培養物の一つは、
S.ダブリン希釈系列に対する希釈剤として用いたので、
他の細菌はS.dublin希釈負圧のそれぞれにおける未希釈
強度で存在した。したがって、それぞれのP22r細菌は、
（10-2のS.ダブリン希釈物中での）102倍から（10-9の
S.ダブリン希釈物中での）109倍までの過剰量の範囲に
存在した。
ば）P22r細菌におけるバックグラウンドをチェックし、
S.ダブリンの純粋培養物と共に分析の応答を測定した。
S.ダブリン試料は、最初の（A600＝0.36）培養物を10倍
ずつ10-9まで希釈することによって作成し、10-2から10
-9までの希釈物のみを分析に使用した。４系列のこのよ
うな希釈液を作成し、一つの系列では、希釈剤として滅
菌LBを用い、他の３系列ではP22r細菌の未希釈（A600＝
0.36）培養物のそれぞれのものを希釈剤として用いた。
換言すれば、それぞれの試料系列は、（最初の培養物に
対して）S.ダブリンの濃度が10-2から10-9までの８種類
の希釈物からなっていた。他の未希釈培養物の一つは、
S.ダブリン希釈系列に対する希釈剤として用いたので、
他の細菌はS.dublin希釈負圧のそれぞれにおける未希釈
強度で存在した。したがって、それぞれのP22r細菌は、
（10-2のS.ダブリン希釈物中での）102倍から（10-9の
S.ダブリン希釈物中での）109倍までの過剰量の範囲に
存在した。
それぞれの試料／希釈物は全量が0.1mlであり、それ
ぞれを個別に（全体で３×106pfuを含む）RGS12 TPを25
μ添加することによって形質導入した。多数の個体試
料を収容するため、蓋のついた滅菌96ウェルマイクロタ
イター皿中で処理を行った。インキュベーションは、37
℃で１時間の後、23℃で１時間行った。インキュベーシ
ョンの後、少量（１μ）の螢光染料濃縮物をそれぞれ
の試料に加えて、実施例３に記載したのと同じ次のINA
分析の際に凍結物の検出を容易にした。それぞれの試料
の４つの10μの量を、柔軟なプラスチック製の96ウェ
ルマイクロタイター皿の別個のウェルに入れ、この皿を
−10.0℃で平衡にした形状がぴったり合った冷却ブロッ
クに入れた。10〜15分後に凍結した液滴を計数した。結
果を第８表に示す。
ぞれを個別に（全体で３×106pfuを含む）RGS12 TPを25
μ添加することによって形質導入した。多数の個体試
料を収容するため、蓋のついた滅菌96ウェルマイクロタ
イター皿中で処理を行った。インキュベーションは、37
℃で１時間の後、23℃で１時間行った。インキュベーシ
ョンの後、少量（１μ）の螢光染料濃縮物をそれぞれ
の試料に加えて、実施例３に記載したのと同じ次のINA
分析の際に凍結物の検出を容易にした。それぞれの試料
の４つの10μの量を、柔軟なプラスチック製の96ウェ
ルマイクロタイター皿の別個のウェルに入れ、この皿を
−10.0℃で平衡にした形状がぴったり合った冷却ブロッ
クに入れた。10〜15分後に凍結した液滴を計数した。結
果を第８表に示す。
第８表に示した結果は、分析試料中の他のP22r細菌が
存在しても標的株の検出には明確な影響を及ぼさないこ
とを示している。分析では、未形質導入細菌においても
または「形質導入」（すなわちTPに暴露した）P22r細菌
でも、バックグラウンド活性は検出されなかった。言い
換えれば、P22s細菌が存在する場合には、これらの細菌
はこの細菌の検出に有意な効果を及ぼさなかった。本実
施例のＡ部に記載した結果では、分析法の最少検出限界
（すなわち、凍結したものの最大希釈）には到達できな
かったので、希釈系列をこの実験では10-9まで延長し
て、検出限界を下回るようにした。最初の培養物は、
（A600に基づいた細菌数の計算によれば）108〜109程度
の細胞を含むので、任意の細胞が10-9の希釈において期
待されることは稀である。したがって、これらの結果
は、多数の非標的細菌の存在においても、この分析法の
検出限界は任意の細菌の分析の理論的限界付近、すなわ
ち、細胞が存在しない点まで延長されたことを示してい
る。
存在しても標的株の検出には明確な影響を及ぼさないこ
とを示している。分析では、未形質導入細菌においても
または「形質導入」（すなわちTPに暴露した）P22r細菌
でも、バックグラウンド活性は検出されなかった。言い
換えれば、P22s細菌が存在する場合には、これらの細菌
はこの細菌の検出に有意な効果を及ぼさなかった。本実
施例のＡ部に記載した結果では、分析法の最少検出限界
（すなわち、凍結したものの最大希釈）には到達できな
かったので、希釈系列をこの実験では10-9まで延長し
て、検出限界を下回るようにした。最初の培養物は、
（A600に基づいた細菌数の計算によれば）108〜109程度
の細胞を含むので、任意の細胞が10-9の希釈において期
待されることは稀である。したがって、これらの結果
は、多数の非標的細菌の存在においても、この分析法の
検出限界は任意の細菌の分析の理論的限界付近、すなわ
ち、細胞が存在しない点まで延長されたことを示してい
る。
前記の結果を要約すると、P22/inaW形質導入系の応答
を、P22感受性およびP22耐性株の両方を表わす数種類の
細菌に対して試験した。この分析の応答は、（個々の株
におけるP22受容体の既知の存在／不在にしたがって）
その予測される特異性、感受性株の検出における感度お
よび非感受性細菌の多数の存在による干渉に対するその
耐性によって評価した。この分析法は、厳密には特異的
であり、既知のP22r株では活性は生じなかった。更に、
この分析法の感度は、分析を行った総てのP22s株におい
て等しく高く、いずれの場合にも、LT2株のみを用いる
前の実験において決定された通りの最適水準で行われ
た。最後に、この分析法の感度は、多数のP22r細菌の存
在によって影響されず、分析は最適水準で行われた。
を、P22感受性およびP22耐性株の両方を表わす数種類の
細菌に対して試験した。この分析の応答は、（個々の株
におけるP22受容体の既知の存在／不在にしたがって）
その予測される特異性、感受性株の検出における感度お
よび非感受性細菌の多数の存在による干渉に対するその
耐性によって評価した。この分析法は、厳密には特異的
であり、既知のP22r株では活性は生じなかった。更に、
この分析法の感度は、分析を行った総てのP22s株におい
て等しく高く、いずれの場合にも、LT2株のみを用いる
前の実験において決定された通りの最適水準で行われ
た。最後に、この分析法の感度は、多数のP22r細菌の存
在によって影響されず、分析は最適水準で行われた。
6. 酵素マーカー遺伝子の形質導入 この実施例では、酵素マーカー遺伝子の形質導入に基
づく細菌の分析法を説明する。この系では、β−グルク
ロニダーゼまたは「gus」活性をコードする遺伝子のP22
によって媒介される形質導入を用い、次に、形質導入さ
れたGUS+細菌を螢光分析法によって検出した。
づく細菌の分析法を説明する。この系では、β−グルク
ロニダーゼまたは「gus」活性をコードする遺伝子のP22
によって媒介される形質導入を用い、次に、形質導入さ
れたGUS+細菌を螢光分析法によって検出した。
GUS活性は、E.コリK12から最初に単離されたuidA遺伝
子によってコードされる（Jeffersonら（1986年）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,83,8447−8451）。これは、良好な
特性決定された酵素マーカー系であって、細菌から高等
植物までの生物の領域で機能することが示されている
（Jeffersonら（1987年）EMBO J.,6,3901−3907）。GUS
活性の螢光分析の試薬は、市販されている。
子によってコードされる（Jeffersonら（1986年）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,83,8447−8451）。これは、良好な
特性決定された酵素マーカー系であって、細菌から高等
植物までの生物の領域で機能することが示されている
（Jeffersonら（1987年）EMBO J.,6,3901−3907）。GUS
活性の螢光分析の試薬は、市販されている。
GUS形質導入系は、実施例３に記載のinaW高頻度形質
導入系を構築するのに用いたのと同様な方法で、ファー
ジP22を用いて設計された。本実施例では、uidA遺伝子
を溶原性宿主細菌の染色体に配置するP22プロファージ
に、ファージの溶菌サイクルの誘導によりファージ自身
のDNAと共にuidA配列の複製およびパッケージングを生
じるような方法で組込んだ。
導入系を構築するのに用いたのと同様な方法で、ファー
ジP22を用いて設計された。本実施例では、uidA遺伝子
を溶原性宿主細菌の染色体に配置するP22プロファージ
に、ファージの溶菌サイクルの誘導によりファージ自身
のDNAと共にuidA配列の複製およびパッケージングを生
じるような方法で組込んだ。
uidAクローンは、プラスミドpJJ3431であって、遺伝
子が若干改質されており開始コドンにNco I部位を提供
するものから得た。改質では、遺伝子生成物のアミノ末
端に５つのエキストラアミノ酸を導入したが、GUS活性
は保持された。uidA遺伝子はpJJ3431の2.9kbのNco I/Ps
t I制限酵素フラグメント上で単離され、発現ベクターp
KK233−２の対応する部位にクローニングされた（Brosi
usら（1985年）J.Biol.Chem.,266,3539−3541）。pKK23
3−２は、「trc」と呼ばれる強力なハイブリッドプロモ
ーターとリポソーム結合部位と開始コドンとを有するui
dA遺伝子を提供し、更にこれはアンピシリン耐性（A
pr）をコードして、ある種の細菌性の抱合系によって起
動されるようにした領域（「bom」）を含んだ。生成す
る構成をpRLG73と命名した。
子が若干改質されており開始コドンにNco I部位を提供
するものから得た。改質では、遺伝子生成物のアミノ末
端に５つのエキストラアミノ酸を導入したが、GUS活性
は保持された。uidA遺伝子はpJJ3431の2.9kbのNco I/Ps
t I制限酵素フラグメント上で単離され、発現ベクターp
KK233−２の対応する部位にクローニングされた（Brosi
usら（1985年）J.Biol.Chem.,266,3539−3541）。pKK23
3−２は、「trc」と呼ばれる強力なハイブリッドプロモ
ーターとリポソーム結合部位と開始コドンとを有するui
dA遺伝子を提供し、更にこれはアンピシリン耐性（A
pr）をコードして、ある種の細菌性の抱合系によって起
動されるようにした領域（「bom」）を含んだ。生成す
る構成をpRLG73と命名した。
次に、pRLG73にP22 DNAの領域を供給し、同種組換の
標的を提供して、構築の次の段階でプラスミドをP22プ
ロファージを組込むようにした。2.5kbのP22 BamH Iフ
ラグメント「Ｂ」（Rutica ＆ JacksonのP22物理地図に
おいて命名されている；実施例３を参照されたい）を、
trcプロモーター領域の直ぐ上流のpRLG73の特異なBamH
I部位にクローニングした。P22フラグメントは最終的に
はプラスミドをファージゲノムに挿入する点であるの
で、これは任意の本質的なP22遺伝子を妨害しないよう
に選択された。生成するP22/pRLG73プラスミドをpRLG80
と呼んだ。
標的を提供して、構築の次の段階でプラスミドをP22プ
ロファージを組込むようにした。2.5kbのP22 BamH Iフ
ラグメント「Ｂ」（Rutica ＆ JacksonのP22物理地図に
おいて命名されている；実施例３を参照されたい）を、
trcプロモーター領域の直ぐ上流のpRLG73の特異なBamH
I部位にクローニングした。P22フラグメントは最終的に
はプラスミドをファージゲノムに挿入する点であるの
で、これは任意の本質的なP22遺伝子を妨害しないよう
に選択された。生成するP22/pRLG73プラスミドをpRLG80
と呼んだ。
下記の構築段階は、実施例３に記載されたinaW形質導
入系について更に詳細に記載されたのと同じ段階を、pR
LG68の代わりにpRLG80を用いて、精確に行った。pRLG80
を、E.コリ供与体株からP22に対して溶原性であるS.チ
ピムリウム受容体中に、細菌抱合によって移された。更
に、RGS11と呼ばれるS.チピムリウム受容体は、そのDNA
ポリメラーゼ遺伝子の一つに突然変異体を含み（突然変
異体の対立遺伝子は「polA」と命名されている）、これ
によってpRLG80プラスミドの自律複製を禁止した。した
がって、RGS11中のpRLG80についての製造の唯一の手段
は、プラスミドに担持された同種の領域に存在するP22
染色体中への組込みによるものであった。このような子
孫細胞は選択された後、pRLG80によって担持されたApr
マーカーによって接合され、pRLG80担持子孫も発現した
GUS活性によって同定された（GUSの比色分析用の基質が
媒溶液中に含まれるときには可視）。
入系について更に詳細に記載されたのと同じ段階を、pR
LG68の代わりにpRLG80を用いて、精確に行った。pRLG80
を、E.コリ供与体株からP22に対して溶原性であるS.チ
ピムリウム受容体中に、細菌抱合によって移された。更
に、RGS11と呼ばれるS.チピムリウム受容体は、そのDNA
ポリメラーゼ遺伝子の一つに突然変異体を含み（突然変
異体の対立遺伝子は「polA」と命名されている）、これ
によってpRLG80プラスミドの自律複製を禁止した。した
がって、RGS11中のpRLG80についての製造の唯一の手段
は、プラスミドに担持された同種の領域に存在するP22
染色体中への組込みによるものであった。このような子
孫細胞は選択された後、pRLG80によって担持されたApr
マーカーによって接合され、pRLG80担持子孫も発現した
GUS活性によって同定された（GUSの比色分析用の基質が
媒溶液中に含まれるときには可視）。
新規なP22/pRLG80溶原性株はRGS34と呼ばれ、uidA形
質導入ファージ（TP）を産生するのに用いられる株であ
った。TPの産生はRGS34の液体培養物を実施例３に記載
されたように薬物マイトマイシン−Ｃで処理することに
よって達成された。マイトマイシン−Ｃによる処理で、
培地に放出された後宿主細胞の溶菌を伴う子孫ファージ
粒子の複製およびパッケージングを生じる。RGS34の場
合には、このような誘導によってTPおよび（複製サイク
ルの際にプラスミドDNAの摘出によって生じる）正常な
ファージを産生した。しかしながら、RGS34はプラーク
法によって測定したとき、予想外に少ない数の正常ファ
ージを産生することが判った。TPは、非ファージDNAの
存在によりファージDNAの完全ゲノムを有することが妨
害されるので（ファージはそれらが有することができる
DNAの量で限定される）、プラーク形成を欠くと予想さ
れる。したがって、プラーク形成法は存在するTPの数の
直接的な尺度ではなく、TP調製物を特徴決定するための
参考数を提供する働きをするだけである。PGS34 TP調製
物は、1ml当り７×104のプラーク形成単位（pfu）を含
んでいた。対照的に、RGS11溶原性株における正常なP22
溶原の誘導では、約１×108pfu/mlを産生した。
質導入ファージ（TP）を産生するのに用いられる株であ
った。TPの産生はRGS34の液体培養物を実施例３に記載
されたように薬物マイトマイシン−Ｃで処理することに
よって達成された。マイトマイシン−Ｃによる処理で、
培地に放出された後宿主細胞の溶菌を伴う子孫ファージ
粒子の複製およびパッケージングを生じる。RGS34の場
合には、このような誘導によってTPおよび（複製サイク
ルの際にプラスミドDNAの摘出によって生じる）正常な
ファージを産生した。しかしながら、RGS34はプラーク
法によって測定したとき、予想外に少ない数の正常ファ
ージを産生することが判った。TPは、非ファージDNAの
存在によりファージDNAの完全ゲノムを有することが妨
害されるので（ファージはそれらが有することができる
DNAの量で限定される）、プラーク形成を欠くと予想さ
れる。したがって、プラーク形成法は存在するTPの数の
直接的な尺度ではなく、TP調製物を特徴決定するための
参考数を提供する働きをするだけである。PGS34 TP調製
物は、1ml当り７×104のプラーク形成単位（pfu）を含
んでいた。対照的に、RGS11溶原性株における正常なP22
溶原の誘導では、約１×108pfu/mlを産生した。
RSG34由来のファージのDNAを下記のようにして作成し
て分析した。RGS34マイトマイシン−Ｃ誘導TPの30mlを7
2,000gで３時間遠心分離してプラークをペレット化し
た。ファージペレットをTE緩衝液（10nMトリス−HCl、1
mM Na2EDTA、pH8.0）0.5mlに再懸濁した後、Na2EDTA、
ドデシル硫酸ナトリウム、およびプロテイナーゼーＫを
それぞれ20mM、0.5％および50μg/mlの最終濃度になる
ように添加してプロテアーゼで処理した後、37℃で１時
間インキュベーションした。プロテアーゼ処理の後フェ
ノール抽出を３回、およびエーテル抽出を３回行い、次
にエタノールを66％になるように添加してファージDNA
を沈澱させた。精製したファージDNAをTE緩衝液100μ
に溶解した。RGS34 TP DNAの制限消化物をゲル電気泳動
によって分析したところ、電気泳動は（正常なP22 DNA
に対して）エキストラバンドの存在を示し、これはpRLG
80のファージゲノムへの組み入れから予測されるものに
対応した。このDNA分析では、TPが実際にRGS34株によっ
て産生されることが確認された。
て分析した。RGS34マイトマイシン−Ｃ誘導TPの30mlを7
2,000gで３時間遠心分離してプラークをペレット化し
た。ファージペレットをTE緩衝液（10nMトリス−HCl、1
mM Na2EDTA、pH8.0）0.5mlに再懸濁した後、Na2EDTA、
ドデシル硫酸ナトリウム、およびプロテイナーゼーＫを
それぞれ20mM、0.5％および50μg/mlの最終濃度になる
ように添加してプロテアーゼで処理した後、37℃で１時
間インキュベーションした。プロテアーゼ処理の後フェ
ノール抽出を３回、およびエーテル抽出を３回行い、次
にエタノールを66％になるように添加してファージDNA
を沈澱させた。精製したファージDNAをTE緩衝液100μ
に溶解した。RGS34 TP DNAの制限消化物をゲル電気泳動
によって分析したところ、電気泳動は（正常なP22 DNA
に対して）エキストラバンドの存在を示し、これはpRLG
80のファージゲノムへの組み入れから予測されるものに
対応した。このDNA分析では、TPが実際にRGS34株によっ
て産生されることが確認された。
RGS34マイトマイシン−Ｃによって誘導されるTP調製
物は最初は細菌細胞破片を含んでおり、これを4,000×
ｇで10分間遠心分離することによってペレット化した
（が、残りのTPは懸濁したままであった）。しかしなが
ら、TP懸濁液に残っていたTP産生宿主細胞の溶菌の際
に、多くのGUS活性が放出された。TP懸濁液中に含まれ
る任意のGUS活性のために、uidA遺伝子の形質導入から
生じる活性を不明瞭になり易く、最初にTP調製物を精製
した後に使用する必要があった。これは、48,000gで遠
心分離を２回連続して行ってTPをペレット化した後、TP
を新鮮なＬブイヨンに再懸濁することによって行った。
これによってTP調製物のGUS活性を効果的に稀釈して、
下記の螢光GUS分析のバックグラウンド近くの水準にし
た。
物は最初は細菌細胞破片を含んでおり、これを4,000×
ｇで10分間遠心分離することによってペレット化した
（が、残りのTPは懸濁したままであった）。しかしなが
ら、TP懸濁液に残っていたTP産生宿主細胞の溶菌の際
に、多くのGUS活性が放出された。TP懸濁液中に含まれ
る任意のGUS活性のために、uidA遺伝子の形質導入から
生じる活性を不明瞭になり易く、最初にTP調製物を精製
した後に使用する必要があった。これは、48,000gで遠
心分離を２回連続して行ってTPをペレット化した後、TP
を新鮮なＬブイヨンに再懸濁することによって行った。
これによってTP調製物のGUS活性を効果的に稀釈して、
下記の螢光GUS分析のバックグラウンド近くの水準にし
た。
形質導入分析はRGS34 TPを細菌の指数相培養物に加
え、数時間インキュベーションし、次いで形質導入細胞
の抽出物を作成し、これを螢光基質法を用いてGUS活性
を測定した。S.チピムリウムLT2株（P22感受性株）およ
びS.ハバナ（サルモネラのP22耐性株）を37℃で指数相
まで生育させ、次いで（新鮮なＬブイヨン中で稀釈する
ことによって）実験の開始時にA600＝0.21に調整した。
滅菌Ｌブイヨンの試料を含めて、場合によりTP調製物を
添加した汚染したGUS活性を測定した。それぞれの0.2ml
試料に、全部で７×103pfuを含むTP調製物0.1mlを加
え、一組の対照試料を、同様にして、TPの代わりに滅菌
LBの等量を加えて調整した。次に、試料を37℃で3.5時
間インキュベーションし、その後細菌を遠心分流によっ
てペレット化し、GUS抽出緩衝液（50mM Na−PO4、pH7.
0、1mM Na2EDTA、0.1％トライトンＸ−100、10mMβ−メ
ルカプトエタノール）0.25mlに再懸濁した。次いで、そ
れぞれの細胞懸濁液にトルエン５μを加えて（細胞を
透水性にして、GUS酵素を抽出緩衝液に放出させ）、40
秒間振盪した後、室温で10分間放置した。次に、試料を
遠心分離して、細胞破片をペレット化して、相分離を行
い、それぞれの抽出液0.19mlを新しい試験管に採取し
た。
え、数時間インキュベーションし、次いで形質導入細胞
の抽出物を作成し、これを螢光基質法を用いてGUS活性
を測定した。S.チピムリウムLT2株（P22感受性株）およ
びS.ハバナ（サルモネラのP22耐性株）を37℃で指数相
まで生育させ、次いで（新鮮なＬブイヨン中で稀釈する
ことによって）実験の開始時にA600＝0.21に調整した。
滅菌Ｌブイヨンの試料を含めて、場合によりTP調製物を
添加した汚染したGUS活性を測定した。それぞれの0.2ml
試料に、全部で７×103pfuを含むTP調製物0.1mlを加
え、一組の対照試料を、同様にして、TPの代わりに滅菌
LBの等量を加えて調整した。次に、試料を37℃で3.5時
間インキュベーションし、その後細菌を遠心分流によっ
てペレット化し、GUS抽出緩衝液（50mM Na−PO4、pH7.
0、1mM Na2EDTA、0.1％トライトンＸ−100、10mMβ−メ
ルカプトエタノール）0.25mlに再懸濁した。次いで、そ
れぞれの細胞懸濁液にトルエン５μを加えて（細胞を
透水性にして、GUS酵素を抽出緩衝液に放出させ）、40
秒間振盪した後、室温で10分間放置した。次に、試料を
遠心分離して、細胞破片をペレット化して、相分離を行
い、それぞれの抽出液0.19mlを新しい試験管に採取し
た。
GUS分析は、それぞれの0.19mlの細胞抽出物に４−メ
チルウンベリフェリルグルクロニド（「MUG」GUSの螢光
基質）の20mM溶液10μを加えることによって開始し
た。MUG自身は螢光性ではないが、GUSと反応することに
よって、螢光性になる４−メチルウンベリフェロン基を
放出する。分析物を37℃で30分間インキュベーションし
た後、それぞれの分析試料の50μを採取して0.2M Na2
CO30.95mlに加えた（Na2CO3は反応を停止して、反応生
成物の螢光を増進する）。試料の螢光を、螢光分光光度
計で365nmで試料を励起して測定し、螢光の発光は455nm
で測定した。結果を第９表に示す。
チルウンベリフェリルグルクロニド（「MUG」GUSの螢光
基質）の20mM溶液10μを加えることによって開始し
た。MUG自身は螢光性ではないが、GUSと反応することに
よって、螢光性になる４−メチルウンベリフェロン基を
放出する。分析物を37℃で30分間インキュベーションし
た後、それぞれの分析試料の50μを採取して0.2M Na2
CO30.95mlに加えた（Na2CO3は反応を停止して、反応生
成物の螢光を増進する）。試料の螢光を、螢光分光光度
計で365nmで試料を励起して測定し、螢光の発光は455nm
で測定した。結果を第９表に示す。
第９表は、GUS活性の強い正の値のみが形質導入LT2試
料（試料２）に生じたことを示している。TP調製物にお
ける残留GUS活性（試料５および６の差によって測定さ
れる）は無視し得るものであるので試料２に示された活
性は形質導入によるものであった。対照的に、S.ハバナ
株では、TPに暴露することによってGUS活性は増加しな
かった。したがって、GUS形質導入系は、P22s株（LT2）
では機能するが、P22r株（S.havana）では機能しないこ
とを示していた。これらの試料で測定したバックグラウ
ンド螢光はこれらの株（或いは滅菌Ｌブロス中）での固
有のGUS活性の結果ではなく、MUG調製物における有利の
４−メチルウンベリフェロンの少量の存在によるものと
考えられた。
料（試料２）に生じたことを示している。TP調製物にお
ける残留GUS活性（試料５および６の差によって測定さ
れる）は無視し得るものであるので試料２に示された活
性は形質導入によるものであった。対照的に、S.ハバナ
株では、TPに暴露することによってGUS活性は増加しな
かった。したがって、GUS形質導入系は、P22s株（LT2）
では機能するが、P22r株（S.havana）では機能しないこ
とを示していた。これらの試料で測定したバックグラウ
ンド螢光はこれらの株（或いは滅菌Ｌブロス中）での固
有のGUS活性の結果ではなく、MUG調製物における有利の
４−メチルウンベリフェロンの少量の存在によるものと
考えられた。
上記発明の明快に理解するために、例示と実施例とに
よって幾分詳細に記載したが、請求の範囲内である程度
の変化および改質を行うことができることは明らかであ
ろう。
よって幾分詳細に記載したが、請求の範囲内である程度
の変化および改質を行うことができることは明らかであ
ろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献 特開 昭61−43998（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−500747（ＪＰ，Ａ)
Claims (41)
- 【請求項１】試料中の標的細菌を特異的に検出する方法
であって、 試料を標的細菌に特異的な形質導入粒子に暴露し、該粒
子は細菌に検出可能な表現型である氷成核活性を付与す
ることができ、 試料中に、検出可能な表現型を有する細菌の存在を検出
する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】形質導入粒子がプロモーター領域の下流に
氷成核遺伝子を有する、請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項３】氷成核遺伝子がinaW,inaY,inaZおよびiceE
から成る群から選択される、請求の範囲第１項又は第２
項に記載の方法。 - 【請求項４】試料を、異なる宿主領域特異性を有する複
数の形質導入粒子に暴露することによって、細菌の型を
前記複数の粒子によって付与される検出可能な表現型の
パターンに基づいて決定することができる、請求の範囲
第１項に記載の方法。 - 【請求項５】試料を標的細菌に特異的な固定化抗体に暴
露した後、形質導入粒子に暴露する、請求の範囲第１項
に記載の方法。 - 【請求項６】試料を患者標本、水、酪農製品および食肉
製品から成る群から選択する、請求の範囲第１項に記載
の方法。 - 【請求項７】試料が標的細菌と非標的細菌を含み、前記
形質導入粒子が標的細菌に対して特異的であるが非標的
細菌には特異的でない、請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項８】形質導入粒子に暴露する前に、試料を標的
細菌を弱体化することができる条件に暴露する、請求の
範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項９】暴露条件に加熱を含む、請求の範囲第７項
又は第８項に記載の方法。 - 【請求項１０】標的細菌がサルモネラ属のものである、
請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項１１】形質導入粒子がP22,L,ViI,8,23,25,31,4
6,102,163および175から成る群から選択されるバクテリ
オファージに由来する、請求の範囲第１項に記載の方
法。 - 【請求項１２】試料中の標的細菌を特異的に検出する方
法であって、 前記試料を、標的細菌に対して特異的な形質導入粒子の
存在下にて、前記粒子の前記細菌への付着を促進する条
件下にてインキュベーションし、前記形質導入粒子は細
菌に氷成核表現型を付与することができるものであり、 次いで、前記試料を氷成核表現型の展開を促進する条件
下でインキュベーションし、 試料中における氷成核表現型を有する細菌の存在を検出
する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項１３】試料を最初に約35℃から40℃の範囲の温
度で攪拌せずに約15から120分間インキュベーションす
る、請求の範囲第12項に記載の方法。 - 【請求項１４】試料を、次に20℃から25℃の範囲の温度
で約30分間から２時間インキュベーションする、請求の
範囲第13項に記載の方法。 - 【請求項１５】試料を、異なる宿主領域特異性を有する
複数の形質導入粒子の存在下でインキュベーションし、
更に形質導入粒子が細菌を氷成核表現型へ形質転換する
ことによって、細菌の種類を決定することをも含んで成
る、請求の範囲第14項に記載の方法。 - 【請求項１６】試料を、標的細菌に特異的な固定化抗体
に暴露し、該固定化抗体に結合した標的細菌を分離した
後、前記試料をインキュベーションすることを含んで成
る、請求の範囲第15項に記載の方法。 - 【請求項１７】増殖培地が標的細菌の増殖のために選択
的である、請求の範囲第10項に記載の方法。 - 【請求項１８】試料を患者標本、水、酪農製品および食
肉製品から成る群から選択する、請求の範囲第10項に記
載の方法。 - 【請求項１９】形質導入粒子がプロモーター領域の下流
に氷成核遺伝子を有する、請求の範囲第10項に記載の方
法。 - 【請求項２０】形質導入粒子を標的細菌のゲノム内部の
プロファージとして組み入れる、請求の範囲第10項に記
載の方法。 - 【請求項２１】氷成核表現型を有する細菌の存在を、氷
成核分析法によって検出する、請求の範囲第10項に記載
の方法。 - 【請求項２２】氷成核分析法が螢光凍結分析法である、
請求の範囲第21項に記載の方法。 - 【請求項２３】標的細菌を特異的に検出する方法であっ
て、 標的細菌を形質転換して、予め選択した細胞表面受容体
を発現させ、 形質転換した標的細菌をある環境に導入して、 この環境から細菌を集め、 集めた細菌を表面受容体に対して特異的な形質導入粒子
に暴露し、前記粒子が細菌に検出可能な表現型であって
氷成核活性を付与することができ、 集めた細菌中での検出可能な表現型を有する細菌の存在
を検出する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項２４】形質転換した細菌が導入される環境が、
細胞表面受容体を欠くことを除いて標的細菌と実質的に
同じである他の細菌を含む、請求の範囲第23項に記載の
方法。 - 【請求項２５】標的細菌がシュードモナスの種であり細
胞表面受容体がlamB遺伝子によってコードされる、請求
の範囲第23項に記載の方法。 - 【請求項２６】環境が土壌、空気および水から選択され
る、請求の範囲第24項に記載の方法。 - 【請求項２７】感染された細菌細胞に氷成核表現型を付
与することができる、試料中の標的細菌を特異的に検出
するための形質導入粒子。 - 【請求項２８】グラム陰性菌に特異的に感染することが
できる請求の範囲第27項に記載の形質導入粒子。 - 【請求項２９】グラム陰性菌がE.コリ、ビブリオコレラ
およびサルモネラから成る群から選択される、請求の範
囲第28項に記載の形質導入粒子。 - 【請求項３０】グラム陽性菌に特異的に感染することが
できる、請求の範囲第27項に記載の形質導入粒子。 - 【請求項３１】グラム陽性菌がスタフィロコッカス・ア
ウレウス（Staphylococcus aureus）およびストレプト
コッカス・ピロゲネス（Streptococcus pyrogenes）か
ら成る群から選択される、請求の範囲第30項に記載の形
質導入粒子。 - 【請求項３２】プロモーター領域から下流に氷成核遺伝
子を有する請求の範囲第27項に記載の形質導入粒子。 - 【請求項３３】氷成核遺伝子の外に選択マーカーを含ん
で成る、請求の範囲第32項に記載の形質導入粒子。 - 【請求項３４】追加の選択的マーカーが抗生物質耐性で
ある請求の範囲第33項に記載の形質導入粒子。 - 【請求項３５】プロモーターの転写制御下で氷成核遺伝
子を含むプロファージを有する細菌細胞であって、試料
中の標的細菌を特異的に検出するための形質導入粒子の
製造のための細菌細胞。 - 【請求項３６】氷成核遺伝子がinaW,inaY,inaZおよびic
eEから成る群から選択される、請求の範囲第35項に記載
の細菌細胞。 - 【請求項３７】E.コリまたはS.チピムリウムの株であ
る、請求の範囲第35項に記載の細菌細胞。 - 【請求項３８】感染した細菌細胞に氷成核表現型を付与
することができる、試料中の標的細菌を特異的に検出す
るための形質導入粒子を産生する方法であって、 プロモーターの転写制御下で氷成核遺伝子を含むプロフ
ァージを有する細菌細胞を誘導し、 前記の細菌細胞が溶菌したとき放出される形質導入粒子
を集める、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項３９】氷成核遺伝子がinaW,inaY,inaZおよびic
eEから成る群から選択される、請求の範囲第38項に記載
の方法。 - 【請求項４０】感染した細菌細胞に検出可能な表現型で
ある氷形成性を付与することができる、試料中の標的細
菌を特異的に検出するための形質導入粒子を産生する方
法であって、 検出可能な表現型をコードする氷成核遺伝子をトランス
ポゾンの本質的な末端DNA配列と結合して挿入可能な要
素を産生させ、 挿入可能な要素で組換可能なゲノムを有するバクテリオ
ファージに挿入可能な要素を導入する、 ことを含んで成る方法。 - 【請求項４１】挿入可能な要素が細菌プラスミド中に存
在し、細菌細胞中での組換によってバクテリオファージ
に導入される、請求の範囲第40項に記載の方法。
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