KR20070107680A

KR20070107680A - 세포 및/또는 조직 배양으로 소정 제품의 생장 및 합성을촉진하는 펩티드 분획

Info

Publication number: KR20070107680A
Application number: KR1020077016170A
Authority: KR
Inventors: 아니 마르크; 쟝 류이 조르강; 베랑제르 파르쥬-아다니
Original assignee: 피에르 파브르 메디카먼트; 상뜨로 나쇼날 드 라 러쉐르쉐 샹띠피크
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2007-11-07
Also published as: US20120088303A1; US7993923B2; US20090124010A1; RU2007126855A; CN101084304A; FR2879214A1; IL183711A0; CA2590693A1; EP1824963A1; JP2008522637A; NO20073483L; BRPI0518634A2; MX2007007154A; WO2006064020A1; AU2005315612A1

Abstract

본 발명은 세포 또는 조직 배양 배지의 제조 및/또는 보충에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 평지씨, 특히 평지씨 케이크에서 분리한 펩티드 분획을 함유하는 무혈청 및/또는 무단백질 세포 배양 배지에 관한 것이다. 상기 펩티드 분획을 함유하는 세포 배지의 제조 방법과 그 용도도 역시 개시되어 있다.

Description

세포 및/또는 조직 배양으로 소정 제품의 생장 및 합성을 촉진하는 펩티드 분획 {PEPTIDE FRACTIONS PROMOTING GROWTH AND SYNTHESIS OF DESIRED PRODUCT(S) INTO CELL AND/OR TISSUE CULTURE}

본 발명은 세포나 조직 배양 배지를 보충하는 분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게 말하자면, 본 발명은 평지씨, 특히 평지씨 케이크에서 분리한 펩티드 분획을 함유하는 무혈청 및/또는 무단백질 세포 배양 배지에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 펩티드 분획을 함유하는 세포의 배양 방법 및 그 용도에 관한 것이다.

생세포의 존재가 알려진 이래로, 세포의 배양 형식과 기술은 끊임없이 증가되고 다양화하여 왔다.

최초에는, 세포 배지는 혈장, 혈청 또는 배아 추출물 등의 비특정(非特定) 배지를 이용하였다. 1950년대 중반까지는, 염 및 글루코스 이외에, 세포가 합성할 수 없는 다양한 아미노산류 및 비타민류를 함유하는 최초의 특정 배지가 출현하지 못하였다.

더욱이 최근에는, 제공된 모든 아미노산 중에서, L-글루타민이 주로 퓨린 및 피리미딘을 합성시키기 위한 에너지원과 탄소원 및 질소원으로서 중요한 역할을 한다는 것을 증명되기에 이르렀다. 그러나, 첫째의 결점은 글루타민이 자유 아미노산 형태로는 안정하지 못하고 암모늄 이온과 피로글루탐산으로 분해되기 쉽게 될 것이라는 사실에 있다. 이 문제의 해결책은, 곡물 가수 분해물의 이용에 기초하여, 퀘스트 인터내셔널 (QUEST INTERNATIONAL)의 명의로 출원된 특허 출원 WO 96/26266에 의하여 제공되었다.

일반적으로, 세포와 조직, 특히 동물 세포는 생체 외에서 5~20%의 혈청, 통상 소태아 혈청 (fetal calf) 또는 FCS가 보충된 소위 기저 또는 기초 배지인 영양 배지 내에 배양된다.

그러나, 이러한 혈청의 이용에는, ⅰ) 차후 제거되어야 하는 동물 단백질의 도입, ⅱ) 곰팡이, 박테리아, 바이러스 또는 프리온 등의 감염균의 도입 가능성, 그리고 ⅲ) 가변 특성 및 고비용 등의 기타의 결점이 있다.

또한, 특히 의약품에서의 광우병 (BSE)의 위험을 줄이기 위하여, 국내법 및 국제법이 동물 기원의 생성물의 이용을 가까운 미래에 금지할 것이라는 것이 예상된다.

이들 결점 중에서, 감염균의 도입이 가장 큰 문제로 남아 있으며, 무혈청 배지 또는 SFM의 이용을 촉진시켜 왔다. 그러나, 오늘날 사용되는 어떤 SFM도 여전히 동물에서 얻은 펩톤과 가수 분해물을 함유하고 있기 때문에, 전술한 감염 위험성 면에서 완전히 만족스럽지는 않다.

일반적으로, 동물 기원 물질이 결여된 SFM은 곡물 출발 물질, 예컨대 쌀 (WO 98/15614; WO 99/57246) 또는 밀 (WO 99/47648) 등의 고단백 출발 물질로부터 얻는다. 기타 사용된 출발 물질의 예로서는, 콩 (WO 01/23527; WO 00/03000) 또는 오이 (WO 99/47648)를 들 수 있다. 그러나, 이러한 배양 배지는 비교적 구득 가격이 고가이고, 일반적으로 예컨대 식품 용도 등의 기타의 용도로 사용될 수 있는 잠재성이 있는 고단백을 함유하는 출발 물질로부터 얻는다. 그러므로, 동물 기원의 생성물이 전혀 없고 저렴하며, 또는 적어도 그의 가치를 조금은 이용할 수 있는 출발 물질로부터 유도된 배양 배지를 개발하여야 할 실질적인 필요가 있다.

본 발명은 무혈청이며 최초 단백질 함량이 낮은 식물성 출발 물질에서 얻은 배양 배지를 제시함으로써 선행 기술의 이러한 결점을 극복할 것을 제안하고 있다.

특히, 본 발명은 무혈청 생체 외 세포 또는 조직 배양 배지를 제조 및/또는 보충하는 펩티드 추출물의 용도에 관한 것으로서, 상기 추출물은 평지씨로 이루어져 있는 것에 특징이 있는 식물성 출발 물질을 연속 분획함으로써 얻은다.

"무혈청 배지"라는 용어는 FCS, FBS (소태아 혈청) 또는 임의의 혈청 유사체 등의 동물 기원 무혈청 배지를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

오늘날, 세포 배양으로부터 얻은 대부분의 생성물은 모노클로널 항체, 바이러스 및 재조합 단백질이다. 산업의 관점에서, 조직으로부터의 세포 또는 독물학(毒物學)에서 동물 모델을 위한 대체 물질로서의 세포 이외에 오늘날 가장 폭넓게 배양되는 세포는 하이브리도마, VERO 세포 (아프리카 녹색 원숭이 신장 세포), BHK 세포 (새끼 햄스터 신장), CHO 세포 (중국 햄스터 난소), NSO 세포 또는 배큘로바이러스 (baculovirus)에 감염된 Spodoptera frugiperda (sf9) 세포이다. 하이브리도마는 모노클로널 항체 제조 세포인 반면, VERO 및 CHO 세포는 일반적으로 바이러스 또는 기타 재조합 단백질의 제조용으로 사용된다. 물론, 이들 열거된 것들에 한정되는 것은 아니고, 본 발명은 임의의 종류의 세포에 관련될 수 있다.

비한정적인 예로서, 다음의 조직, 즉 연골 조직, 근육 세포, 피부, 골세포(骨細胞), 힘줄, 배아 세포, 인공 기관도 역시 들 수 있다.

본 발명의 제1의 특징은 오일 생성 식물, 특히 평지씨의 이용에 기초하는 것이다. 사실상, 오늘날 이용되는 곡물이나 다른 출발 물질과 달리, 이 평지씨는 특히 지방질이 풍부하고 단백질은 적다. 이러한 이유로 오늘날까지 당해 분야의 당업자들은 배양 배지 제조용으로 평지씨를 사용하려고 하지 않아 왔는데, 이는 배양 배지의 제조를 위해서 고단백 출발 물질을 사용하는 것이 필요하다고 인식되었기 때문이다.

그리고, 선행 기술의 편견과는 반대로, 평지씨를 이용하여 무혈청 및/또는 무단백질 배양 배지를 제조하는 것이 가능하다는 사실이 매우 놀랍게도 입증되기에 이르렀다. 더욱 놀랍게도, 평지씨로부터 얻은 펩티드 추출물을 함유하는 배지는 배양하는 세포나 조직의 최종 농도를 유의적으로 증가시킬 뿐만 아니라, 배양하는 세포에 의하여 관심 있는 1개 이상의 분자의 특이적 생성 속도를 증가시킬 수 있다는 것도 역시 증명되기에 이르렀다.

나아가, 최종 세포나 조직 농도의 이러한 증가가 단독으로 영양의 영향과 연관되는 것이 아니라는 사실도 입증되기에 이르렀다.

한 가지 양호한 관점에 의하면, 본 발명은 전술한 추출물의 사용에 관한 것으로서, 상기 펩티드 추출물은 세포나 조직 농도의 증가 및/또는 세포 수명의 증가 및/또는 관심 있는 1개 이상의 분자의 특이적 생성 속도와 관련된 기능을 수행한다는 점에 특징이 있고, 상기 기능은 펩티드 형태의 아미노산들 중의 기본 아미노산 조성물 단독이 아니라 상기 아미노산들로 이루어진 조성물에 의하여 구속된다.

특히, 이러한 긍정적인 효과는 기본 조성물의 배지, 즉 자유 아미노산으로 구성되고, 본 발명에 따른 추출물에서 아미노산이 펩티드 형태라는 사실을 제외하고, 본 발명의 대상인 펩티드 추출물의 조성물과 모든 면에서 동일한, 기본 조성물의 배지에 의하여 발생된 효과와 비교로 확립되었다. 이 점은 후술하는 실시예에 비추어 더 분명하게 확립될 것이다.

통상, 오늘날 사용되는 배양 배지는 세포 또는 조직에 영양, 그리고 특히 에너지원과 탄소원 및 질소원으로서 세포가 필요로하는 아미노산을 공급할 목적으로 제조되었다는 것이 선행 기술로부터 드러난다. 이들 아미노산은 일반적으로 배양 배지에서 주로 자유 아미노산 형태로 존재한다. 일부 아미노산은 액상 배지에서 충분한 안정성을 유지하기 위하여 디펩티드 또는 트리펩디드 형태로 존재한다 (WO 96/26266).

본 발명은 본 발명의 대상이자 평지씨로부터 얻은 출발 물질을 연속 분획하여 얻은 펩티드 추출물이 배양에 있어 세포나 조직의 생장을 촉진하고 세포나 조직이 살아 있도록 하는 것을 돕는 기능을 한다는 매우 놀라운 사실을 보여준다. 사실상, 후술하는 실시예에서 더 분명하게 나타나 있는 바와 같이, 동일한 양의 각 아미노산에 있어서, 농도의 증가 및 특히 세포나 조직의 수명의 증가 및 관심 있는 1개 이상의 분자의 특이적 생성 속도의 증가를 위하여 후자가 펩티드의 형태로 관찰될 필요가 있다는 것이 드러나 있다. 본 발명은 자유 아미노산의 양뿐만 아니라 주어진 펩티드 조성물, 좋기로는 디-, 트리-, 테트라- 또는 펜타펩티드에 기초하는 것으로 보인다.

이론에 구애되기를 바람이 없이, 본 발명의 대상인 상기 추출물은 생장에 있어 단독으로 적극적인 역할을 할 뿐만 아니라, 아포토시스의 유발을 감소시키는 관점에서도 역할을 할 가능성이 있는 것으로 보인다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 무혈청 생체 외 세포 또는 조직 배양 배지를 제조 및/또는 보충하는 펩티드 추출물의 용도에 관한 것으로서, 상기 추출물은 식물성 출발 물질을 연속 분획하여 얻는데, 상기 식물성 출발 물질은 평지씨로 이루어지는 것이 특징이다.

전술한 무혈청 배지와 유사한 방식으로, 전술한 펩티드 추출물의 용도는 상기 펩티드 추출물이 세포나 조직 농도의 증가 및/또는 세포 수명의 증가 및/또는 관심 있는 1개 이상의 분자의 특이적 생성 속도에 관한 기능을 한다는 데에 특징이 있고, 상기 기능은 펩티드 형태의 아미노산들 중의 기본 아미노산 조성물 단독이 아니라 상기 아미노산들로 이루어진 조성물에 의하여 구속된다.

"무단백질"이라는 표현은 단백질이 전혀 없는 배지를 의미하는 것으로 이해되어서는 안 되며 동물 기원 단백질이 없는 배지로 이해되어야 한다. 이 표현은 특히 ADCF (동물 유래 성분 불함유)라는 명칭 또는 대안으로서 "무동물성 단백질"의 의미를 포함한다.

사실상, 단백질은 일반적으로 세포나 조직의 생장을 위하여 존재할 필요가 있다. 전술한 바와 같이, 중요한 점은 동물 기원 단백질이 없어야 한다는 데에 있다. 이러한 배양 배지는 동물 기원일 수 있는 분자 또는 이러한 분자의 일부에 의한 전염의 어떤 위험성을 무혈청 배지보다 훨씬 더 신속하게 제거하는 것을 가능하게 한다.

양호한 실시 상태에 따르면, 본 발명은 전술한 바와 같은 용도에 관한 것으로서, 상기 용도는 식물성 출발 물질이 평지씨 케이크로 이루어진다는 점에 특징이 있다.

"케이크"라는 용어는 오일을 추출할 목적으로 오일을 생성하는 씨와 과육을 처리할 때 얻게 되는 고체 잔사를 의미하는 것으로 이해되어야 한다 (Petit Larousse Illustre, 1989, 제975면에서의 정의). 그러므로, 본 발명의 한 가지 이점은 사용되는 출발 물질이 저렴하다는 데에 있다. 사실상, 모든 오일 생성 작물에 있어서, 케이크는 오일 산업에 의하여 오늘날까지 큰 가치 없이 얻는 부산물로 이루어진다. 그러므로, 본 발명은 오일 산업 폐기물의 가치를 증대시키고 회복하기 위한 접근·방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 대상인 펩티드 추출물은 평지씨 케이크를 가수 분해하여 얻는 것이 좋다. 이러한 추출물을 얻기 위한 분획 방법이 개발되었다. 도 1은 양호한 방법의 공정 흐름도를 나타낸다. 물론, 이 방법 중 당업자에게 자명한 어떠한 변형도 본 발명에 포함된다.

더욱 상세하게 말하자면, 이 방법은 다음과 같은 6개의 연속 공정으로 이루어져 있다.

공정 1: 단백질 추출

이 공정의 목적은 평지씨 단백질이 풍부한 (평지씨 케이크 중의 30~40% 비하여 고형분에 대한 단백질 물질 70~80%) 출발 물질을 만들기 위하여 평지씨 단백질의 농축액을 제조하는 것이다.

공정 2: 가수 분해

이 공정의 목적은 펩티드로 이루어진 용액을 얻기 위하여 단백질을 가수 분해하는 것이다.

또한, 여기서 사용된 방법은 공지의 것이다. 미생물 기원의 효소 제제인 알칼라제 (Alcalase^®)를 사용하는 것은 필연적으로 동물 기원의 생물학적 인자 (동물 세포, 프리온 등에 대한 병원성 바이러스)의 전파(傳播) 위험성이 없다. 가수 분해 시간: 5 시간, 온도=60℃, pH=9, 효소 농도/기질 농도=1/10. 가수 분해물 중의 자유 아미노산 함량: 4 질량%.

공정 3: 산침전 , pH 4

이 공정은 후속되는 여과 공정에서 응고물을 제거 가능하도록, 가수 분해물에 존재하는 "크기가 큰" 분자, 특히 크기가 큰 단백질과 펩티드를 제거하는 것이 목적이다.

공정 4: 차단 역치가 3 kD 인 막을 이용한 한외 여과

이 공정의 목적은 크기가 3000 Da보다 더 큰 분자 (탄닌과 폴리펩티드 등의 페놀성 화합물)를 제거하여 작은 펩티드를 회수하기 위한 것이다. 사용된 방법은 가수 분해물에 함유되어 있는 작은 펩티드를 풍부하게 하는 통상의 막 공정이다.

공정 5: 차단 역치가 500 Da 인 막을 이용한 나노 여과

이 공정의 목적은 공정 4의 결과로 얻은 작은 펩티드 용액 중의 자유 아미노산의 양을 감소시키고 그 혼합물의 삼투압을 감소시키기 위하여 동일한 용액을 탈염(脫鹽)시키는 것이다. 전통적인 탈염 공정이 이용된다. 염 농도가 80% 감소되면, 이들의 전하에 따라 공정 5에서 펩티드를 더 양호하게 분획할 수 있다.

공정 6: 차단 역치가 1 kD 인 막을 이용한 한외 여과

이 공정은 크기와 전하에 따라 크기가 작은 펩티드를 분획하려는 것이다.

이 공정은 식물성 가수 분해물에 함유되어 있는 펩티드를 이들의 크기와 전하에 따라 분획하기 위하여 한외막을 사용한다는 점에서 특별한 이점이 있다. 투과물에 비하여, 본 발명에 따른 펩티드 추출물에 상응하는 최종 저지물(沮止物)은 산성 아미노산을 함유하는 펩티드 함량이 더 높고, 염기성 아미노산을 함유하는 펩티드의 함량이 더 낮다.

전술한 방법은 하나의 구체적인 예의 설명에 불과한 것일 뿐 어떠한 한정을 가하는 것이 아니라는 것에 주목해야 한다. 이후의 어떠한 변형이나 개량도 본 발명의 일부로서 간주되어야 한다.

본 발명의 대상인 펩티드 추출물을 더 철저히 특성화하기 위하여, 몇 가지 연구와 분석이 이루어졌으며, 그 상세한 프로토콜과 결과는 이하의 실시예에서 제시한다. 그러나, 본 발명의 본문에서 사용된 펩티드 추출물은 적어도 80 질량%, 좋기로는 적어도 90 질량%의 질소 함유 물질로 이루어진다는 점에 특징이 있다는 것이 드러나 있다.

"질소 함유 물질"이란 표현은 본 명세서에서는 아미노산으로 이루어진 임의의 물질로 후자가 자유 형태이거나 펩티드나 단백질로서 결합 가능하다는 것을 나타내려고 하는 것이다.

단백질 함량이 낮은 오일 생성 식물, 특히 평지씨로부터 질소 함유 물질의 농도는 전술한 방법에 의하여 얻은다. 이러한 특징은 배양 배지에 보충되는 대부분의 식물 추출물이 질소 함유 물질의 함량이 훨씬 낮다는 점에서 매우 유리하다. 실시예에 의하여, 퀘스트 인터내셔널의 명의로 출원된 특허 출원서(WO 96/26266)에 기재되어 있는 곡물 유래 추출물은 질소 함유 물질 함량이 각각 콩 추출물에 대하여 54%, 밀 추출물에 대하여 75% 및 쌀 추출물에 대하여 69%이다.

그러므로, 본 발명은 사용된 펩티드 추출물의 질소 함유 물질 함량이 높다는 점에서 선행 기술과 다르다.

그 밖에, 상기 질소 함유 물질이 자유 아미노산을 거의 함유하지 않으며, 주로 매우 작은 펩티드로 이루어져 있다는 것이 본 발명에 의하여 역시 입증되어 있다. 프로토콜과 결과는 후술하는 실시예를 참고하여야 한다.

특히 말하자면, 본 발명에 따른 용도는 상기 질소 함유 물질이 분자 크기가 500 달톤 미만인 펩티드 약 50% ~ 약 60%로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

일반적으로, 500 달톤 미만인 펩티드는 주로 디-, 트리-, 테트라- 또는 펜타펩티드 형태로 있다고 인식되어있다. 사실상, 아미노산의 평균 분자량은 대략 150 g/몰로서 글리신이 75.1 g/몰로 가장 작고, 트립토판이 204.2 g/몰로 가장 크다.

본 발명의 또 한 가지 관점에 의하면, 용도는 상기 질소 함유 물질이 분자 크기가 500~1000 달톤인 펩티드 약 20% ~ 약 30%로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

여전히 본 발명의 대상인 펩티드 추출물을 특성화함에 있어서, 상기 추출물은 산성 아미노산의 함량이 높다는 것이 입증되어 있다.

그러므로, 특히 본 발명은 전술한 용도에 관한 것으로서, 상기 추출물이 20~40 몰%의 아스파르트산 글루탐산 및/또는 이들 각각의 아미드를 함유한다는 점에 특징이 있다.

마지막으로, 본 발명은 상기 펩티드 추출물이 페놀 화합물 1 질량% 미만을 함유한다는 점에 특징이 있다.

더 상세히 말하자면, 상기 펩티드 추출물은 다음의 총아미노산 조성을 갖는다.

아미노산	몰%
알라닌	2~6
알기닌	5~9
아스파르트산 + 아스파라긴	10~14
시스테인	0
글루탐산 + 글루타민	15~19
글리신	7~11
히스티딘	1~5
이소루이신	2~6
루이신	5~9
리신	2~6
메티오닌	0~3
페닐알라닌	1~5
프롤린	3~7
세린	5~9
트레오닌	5~9
트립토판	미검출
티로신	1~5
발린	5~9

상기 표의 백분률은 평균값이다. 측정 방법은 실시예에 분명하게 상세히 설명되어 있다. 또한, 여러가지 양호한 농도가 동일한 실시예에서 설명될 것이다.

최선의 실시 상태에 따르면, 본 발명의 용도는 상기 세포가 진핵 세포, 좋기로는 동물 세포로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

양호한 진핵 세포의 비한정적인 예로서, 산업에 이용되는 세포, 예컨대 CHO, BHK, NS0, PER C6, VERO, HEK293 등의 세포를 들 수 있다.

또 다른 관점에 의하면, 본 발명은 전술한 바와 같은 펩티드 추출물의 보충 인자로서의 용도에 한정되는 것이 아니라, 역시 무혈청 배양 배지에도 관련되는 것이다.

특히, 본 발명은 전술한 바와 같은 펩티드 추출물을 함유하거나 이용하여 얻은 무혈청 세포 또는 조직 배양 배지에 관한 것이다.

전술한 바와 같이, 상기 배양 배지는 좋기로는 소정의 배양 형식에 따라 선택된 "기본" 배지에 혈청 또는 가수 분해물 등의 기타 보충제를 부가하여 이루어진다. 본 발명의 대상인 배양 배지는 첨가된 추출물의 성질, 즉 오일 생성 식물, 더 좋기로는 전술한 바와 같이 평지씨로부터 얻은 추출물의 성질에 의하여 구별된다.

따라서, 사용된 "기본" 배지는 소정의 배양의 성격에 좌우된다. 비한정적인 예로서, 다음의 배지, 즉 RPMI (로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트; Roswell Park Memorial Institute), MEM (최소 필수 배지; Minimum Essential Medium), Iscove's, IMDM (이스코브의 변형 둘베코 배지; Iscove's Modified Dulbecco's medium), Ham's, NCTC, TC100, Grace 등을 들 수 있다.

실제로, 본 발명에 따른 추출물은 소정의 배양 형식에 따라 동일한 펩티드 추출물의 농도를 다양화할 수 있는 용액의 형태로 사용된다. 비한정적인 예로서, CHO (중국 햄스터 난소) 타입 세포의 배양 사례에서, 양호한 농도는 2~6 g/ℓ, 좋기로는 4 g/ℓ 가량이다. 후술하는 실시예에서 나타나있는 바와 같이, 더 저농도는 충분하지 않으며, 더 고농도는 세포 생장을 방해하거나 또는 잠재적인 세포 아포토시스를 유발한다.

후술하는 실시예에 있어서, 사용된 대조 배지는 RPMI 1640 배지 (SIGMA-ALDRICH)이다.

한 가지 실시 상태에 따르면, 본 발명의 배양 배지는 이것이 또한 비타민, 무기염, 자유 아미노산, 유기산 및/또는 당도 역시 함유한다는 점에 특징이 있다.

본 발명은 또한 세포나 조직의 대량 배양을 위한 본 발명에 따른 배양 배지의 용도도 포함한다.

본 발명의 또 다른 관점에 의하면, 무혈청뿐만 아니라 무단백질인, 즉 전술한 바와 같이 동물 단백질이 없는 배양 배지도 역시 포함한다.

또한, 본 발명의 대상은 전술한 바와 같은 펩티드 추출물을 함유하거나 사용하여 얻은 무단백질 세포 또는 조직 배양 배지이다.

한 가지 실시 상태에 따르면, 무혈청 배지에 대하여 전술한 것과 유사한 방법으로, 본 발명에 따른 무단백질 배양 배지도 역시 비타민, 무기염, 자유 아미노산, 유기산 및/또는 당을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 세포나 조직의 대량 배양을 위한 본 발명에 따른 무단백질 배양 배지의 용도도 포함한다.

또 다른 실시 상태에 따르면, 본 발명은 생체 외 세포나 조직 배양 방법에 관한 것이다. 상기 방법의 실제 공정과 관련하여, 비한정적인 예로서, ⅰ) 매우 소규모 (96 웰 플레이트)의 고정식 배양, ⅱ) 약간 대규모 (25　cm², 75　cm² 및 175　cm²배양플라스크)의 고정식 배양, 이어서 ⅲ) 증대된 규모 (삼각 플라스크, 스피너 (spinner) 및 조절된 배양기)의 교반 배양을 들 수 있다. 특히 시딩 (seeding)은 본 기술 분야의 당업자에게 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.

더 상세히 말하자면, 본 발명은 무혈청 배지에서 생체 외 세포나 조직을 배양하는 방법에 관한 것으로, 평지씨로 이루어진 식물성 출발 물질을 연속 분획하여 얻은 펩티드 추출물을 함유하는 배지에 상기 세포나 조직을 시딩하는 것으로 이루어지는 점에 특징이 있다.

한 가지 실시 상태는 열거된 성질의 추출물을 얻기 위하여 전술한 분획 공정을 수행하는 것으로 이루어져 있다.

특히, 본 발명에 따른 방법은 상기 출발 물질이 평지씨 케이크로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

나아가, 본 발명에 따른 방법은 상기 추출물이 적어도 80 질량%, 좋기로는 적어도 90 질량%의 질소 함유 물질로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

특히, 본 발명에 따른 방법은 상기 질소 함유 물질이 분자 크기가 500 달톤 미만인 펩티드 약 50% ~ 약 60%로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

더욱 더 상세히 말하자면, 본 발명에 따른 방법은 상기 질소 함유 물질이 분자 크기가 500~1000 달톤인 펩티드 약 20% ~ 약 30%로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

좋기로는 본 발명에 따른 방법은 상기 추출물이 20~40 몰%의 아스파르트산과 글루탐산 및/또는 이들 각각의 아미드를 포함하는 점에 특징이 있다.

마직막으로, 더욱 좋기로는 본 발명에 따른 방법은 상기 추출물의 총아미노산 조성이 다음과 같다는 점에 특징이 있다.

또 다른 관점에 의하면 본 발명은 전술한 배양 배지와 유사한 방법으로, 무단백질 배지라는 점에 특징이 있는, 생체 외 세포 또는 조직을 배양하는 방법에 관한 것이다.

특히, 무단백질 배지에서 생체 외 세포 또는 조직을 배양하는 방법은 평지씨로 이루어진 식물성 출발 물질을 연속 분획하여 얻은 펩티드 추출물을 함유하는 배지 내에 상기 세포 또는 조직을 시딩하는 것으로 이루어지는 점에 특징이 있다.

무혈청 배지에서 배양하는 방법과 유사한 방법으로, 무단백질 배지에서 배양하는 본 방법은 상기 출발 물질이 평지씨 케이크로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

특히, 본 발명에 따른 방법은 상기 추출물이 적어도 80 질량%, 좋기로는 적어도 90 질량%의 질소 함유 물질로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

더 상세히 말하자면, 본 발명에 따른 방법은 상기 질소 함유 물질이 분자 크기가 500 달톤 미만인 펩티드 약 50% ~ 약 60%로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

좋기로는, 본 발명에 따른 방법은 상기 질소 함유 물질이 분자 크기가 500~1000 달톤인 펩티드 약 20% ~ 약 30%로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

더 좋기로는, 본 발명에 따른 방법은 상기 추출물이 20~40 몰%의 아스파르트산과 글루탐산 및/또는 이들 각각의 아미드를 포함한다는 점에 특징이 있다.

더 상세히 말하자면, 본 발명에 따른 방법은 상기 추출물의 총아미노산 조성이 다음과 같다는 점에 특징이 있다.

마지막으로, 본 발명의 최종의 관점에 따르면, 본 발명의 배지에 대한 혈청 배지의 적응에 관한 특히 유리한 성질이 입증되어 있다. 사실상, 이것은 혈청 배지에서 배양을 시작하여, 이 배양을 다소 빠르게 무혈청 및/또는 무단백질인 배지로 전환시킬 때, 이 기술 분야의 당업자에게 알려진 다양한 이유, 예컨대 (i) 유전자 변형 (트랜스펙션)에 의한 새로운 세포주(細胞株)의 획득, (ii) 혈청을 함유하는 배지에서 동결 후 해동 도중의 세포의 높은 생존력, (iii) 고생장 및 (iv) 전단력에 대한 세포의 고저항 때문에 유리할 수 있다. 대부분의 경우 세포는 세포에 치명적인 스트레스가 되는 이러한 변화에 저항하는 것이 곤란하기 때문에, 전달이 일어나기 어렵다고 알려져 있다. 이러한 스트레스를 피하기 위하여, 세포는 세포가 새로운 무혈청 배지에 서서히 적응하도록 혈청 농도가 감소하는 배지로 서서히 전달된다. 적응기간이라 부르는 이러한 시기는 상대적으로 길고 지루하다.

매우 놀랍게도, 발명자들은 매우 뜻밖에도 본 발명의 대상인 펩티드 분획을 함유하는 무혈청 배지 내로 배양을 전달시켜서 이러한 스트레스를 피할 수 있다는 것을 알게 되었다. 본 발명의 이러한 성질은 후술하는 실시예와 도면에서 분명히 드러나게 될 것이다.

그러므로, 본 발명은 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무혈청 배지에서의 배양으로 직접 전달시키는 방법에 관한 것으로, 이것은 혈청 배지로부터 세포 및/또는 조직을 회수하여, 이들 또는 이것을 곧바로 본 명세서에 기재되어 있는 무혈청 배지에 시딩하는 것으로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

또 한 가지 유리한 관점에 따르면, 본 발명은 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무혈청 배지에서의 배양으로 적응시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 상기 혈청 배지로부터 세포 및/또는 조직을 회수하고, 이를 단계적으로 각각 혈청 농도가 감소하는 배지 내에 시딩하는 것으로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

본 발명은 전술한 적응 방법을 포함하는데, 이 적응 방법은 다음의 4 공정으로 이루어진다는 점에 특징이 있다.

-공정 1: 혈청 배지 75%/무혈청 배지 25% + 펩티드 추출물,

-공정 2: 혈청 배지 50%/무혈청 배지 50% + 펩티드 추출물,

-공정 3: 혈청 배지 25%/무혈청 배지 75% + 펩티드 추출물,

-공정 4: 무혈청 배지 100% + 펩티드 추출물.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명의 대상은 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무단백질 배지에서의 배양으로 직접 전달시키는 방법으로서, 이것은 상기 혈청 배지로부터 세포 및/또는 조직을 회수하고, 이를 직접 본 발명에 기재되어 있는 무단백질 배지 내에 시딩하는 것으로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

또 다른 실시 상태에 따르면, 본 발명은 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무단백질 배지에서의 배양으로 적응시키는 방법을 포함하는데, 이 방법은 혈청 배지로부터 세포 및/또는 조직을 회수하고, 이를 순차적으로 각각 혈청 농도가 감소하는 배지 내에 시딩하는 것으로 이루어져 있다는 점에 특징이 있다.

더 상세하게는, 본 발명에 따른 적응 방법은 다음의 4 공정을 포함한다는 점에 특징이 있다.

-공정 1: 혈청 배지 75%/무혈청 배지 25% + 펩티드 추출물,

-공정 2: 혈청 배지 50%/무혈청 배지 50% + 펩티드 추출물,

-공정 3: 혈청 배지 25%/무혈청 배지 75% + 펩티드 추출물,

-공정 4: 무혈청 배지 100% + 펩티드 추출물.

마지막으로, 최종적인 관점에 의하면, 본 발명의 대상은 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무단백질 배지에서의 배양에 적응시키는 방법으로서, 이 방법은 다음의 공정을 포함한다는 점에 특징이 있다.

-공정 1: 본 발명의 대상인 상기 방법의 수행,

-공정 2: 무혈청 배지로부터의 세포 및/또는 조직의 회수,

-공정 3: 상기 세포 및/또는 조직의 직접 무단백질 배지 내에의 시딩.

본 발명의 이점은 이하의 실시예와 도면에 따라 입증될 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 펩티드 추출물을 얻는 방법의 실시 상태의 흐름도를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 추출물의 무균 여과의 효과를 나타낸 것이다.

도 3은 최대 세포 밀도시의 본 발명에 따른 추출물 농도의 효과를 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 4는 VERO 세포가 혈청 배지로부터 본 발명에 따른 추출물을 함유하는 무혈청 배지와 무단백질 배지에 적응하는 것을 설명하는 것이다.

도 5는 하이브리도마형 세포가 혈청 배지로부터 본 발명에 따른 추출물을 함유하는 무혈청 배지에 적응하는 것을 설명하는 것이다.

도 6은 CHO K1 dhfr^-세포가 혈청 배지로부터 본 발명에 따른 추출물을 함유하는 무혈청 배지와 무단백질 배지에 적응하는 것을 설명하는 것이다.

도 7A와 7B는 CHO C5 세포가 무혈청 배지로부터 본 발명에 따른 추출물을 함유하는 무혈청 배지와 무단백질 배지에 적응하는 것을 설명하는 것이다.

도 8은 CHO C5 세포의 연장 배양 중에 생존 가능한 세포의 농도 변화를 나타낸 것이다.

도 9, 10 및 11은 배양된 CHO C5 세포에 의하여 인터페론의 특이적 생성 속도에 있어 본 발명에 따른 추출물의 효과를 설명하는 것이다.

도 12는 본 발명에 따른 추출물은 기본 아미노산 단독으로 기능을 하는 것이 아니라 상기 아미노산의 펩티드 조성물 형태로 기능한다는 것을 증명하는 것이다.

실시예 1: 본 발명의 대상인 펩티드 추출물을 생산하는 방법에 대한 프로토콜

이하에 기재된 프로토콜은 도 1에 의하여 설명된다. 특히 이 실시예는 최선의 실시 상태 중의 하나에 따라 모든 공정들을 이들의 세부 사항을 제공하면서 반복한다. 본 기술 분야의 당업자에게 자명한 변경들을 이 방법에 도입될 수 있을 것이라는 것이 분명하게 이해된다.

공정 1: 평지씨 단백질 추출물에 대한 프로토콜

이 공정에 따르는 프로토콜을 아래와 개요에 같이 도해(圖解)한다.

탈지(脫脂) 평지씨 케이크 30 ㎏ + 0.2 몰의 수산화 나트륨 300 ℓ

│

터보 믹서 (30 분, 주변 온도 T ^° )

↓

혼합 케이크/알칼리 추출물

│

수평 원심 디켄터 (3500 g)

↓

추출물의 회수와 HCl로 pH 4로 조절 (35% v/v)

│

정화 방식으로 플레이트 분리 (3000 g)

↓

침전물의 회수

│

물로 침전물을 최종 세정

↓

평지씨 케이크 단백질 농도

사용된 식물성 단백질은 유지 공업 (Novance, Compiegne, 프랑스)의 잔사인 탈지시킨 공업용 거친 가루 [조분(粗粉)]이며, 질소 함유 물질 35 질량%를 함유한 다. 이 물질로부터 출발하여, 단백질 농축물을 수산화나트륨으로 추출하고 단백질의 등전점(等電點) pH (pH 4)에서 산침전하여 제조한다 (질소 함유 물질 75%).

평지씨 케이크로부터 농축물을 얻는 방법에 의한 단백질의 전체 수율은 약 28%이다.

얻은 농축물의 조성은 다음과 같다 (표 1 참조).

[표 1] 얻은 농축물 조성

	단백질	섬유	지질	재	기타
함량 (%)	75	14	5	3	3

공정 2: 평지씨 케이크 단백질 농축물을 가수 분해하는 프로토콜

효소 농도/기질 농도 비 = 1/10에서 미생물 기원의 효소 제조인 알칼라제 2.4 L^®를 사용.

상기 농축물을 pH를 조절하면서 (수산화나트륨을 첨가하여 pH 9를 유지한다) 알칼라제 2.4 L^®(NovoNordisk, Bagsvaerd, Denmark)을 이용하여, 항온 (60℃) 교반 리액터에서 효소로 가수 분해한다. 5 시간의 가수 분해 후, 가수 분해 정도가 28%에 해당하면 (pH 고정 기술), 효소를 비활성화시켜 (90℃에서 10분) 반응을 정지한다.

공정 3: 산침전 , pH 4

공정 2의 결과 얻은 가수 분해물의 pH를 4로 낮추어 크기가 큰 분자를 침전시키고 상징액 중의 펩티드를 농축시킨다. 이 새로운 공정은 후속되는 여과 공정에서 막힘의 원인이 되는 크기가 큰 분자를 제거하고, 비교적 작은 펩티드를 농축하 는 것을 가능하게 한다.

공정 4: 차단 역치가 3 kDa 인 막을 이용한 한외 여과

이 공정의 목적은 크기가 3000 Da을 초과 (페놀 화합물 + 폴리펩티드)하는 분자를 제거하여 작은 펩티드를 정제하기 위한 것이다.

이 방법은 3000 g/몰 미만인 이론적인 몰 질량의 펩티드를 농축하기 위하여 통상의 재생 셀룰로오스막을 사용한다.

공정 5: 차단 역치가 500 Da 인 막을 이용한 나노여과

이 공정의 목적은 공정 4 이후에 얻은 작은 펩티드 용액 중의 자유 아미노산의 양을 감소시키고, 혼합물의 삼투압을 감소시키기 위하여 동일한 용액을 탈염시키는 것이다.

폴리아미드/폴리술폰 조성물 필름으로 이루어진 막을 포함하는 이 분리 공정으로 인하여 염농도가 80% 감소하여, 다음의 공정 6에서 이들의 전하에 따라 펩티드를 더 잘 분획되게 한다.

공정 6: 차단 역치가 1 kDa 인 막을 이용한 한외 여과

목적은 펩티드의 크기와 전하에 따라 작은 펩티드를 분획하는 것이다.

이론적으로 몰 질량이 500~3000 g/몰인 공정 5 이후에 회수된 펩티드를 막에사용되는 조건의 함수로서, 이들의 크기와 전하에 따라 분획할 목적으로 통상의 재생 셀룰로오스막이 사용된다.

이 공정을 실현하면 2개의 분획이 생성된다.

- 이론적으로 몰 질량이 1000 g/몰 미만인 펩티드를 본래 함유하는 투과물

- 이 투과물에 비하여 첫째로 산성 아미노산을 함유하는 펩티드의 함량이 높고, 둘째로 염기성 아미노산을 함유하는 펩티드의 함량이 낮은 저지물.

본 발명의 대상인 펩티드 추출물은 전술한 방법을 수행하여 얻은 저지물로 이루어진다.

각종 변형들이 자명하게 도입될 수 있다. 비한정적인 예로서, 공정 6 대신에 공정 5와 6 중에 pH를 4로 조절하거나, 대신에 공정 5를 제거하는 것을 고려할 수 있다.

실시예 2: 본 발명의 대상인 추출물을 특성화하기 위하여 수행된 프로토콜

2.1 킬달법에 의한 질소 분석

반응 물질

- 무기화 촉매 (17% Na₂SO₄; 1.5% CuSO₄ _.5 H₂O; 1.5% 염). Prolabo, 22550~293

- 1N H₂SO₄. Labosi, A4715891

- 35% H₂O₂. Labosi, A4823251

- 40% NaOH. Merck, 191537

- H₃BO₃. Labosi, A4703851

재료

- 바포데스트 4 티트라매틱 자동 킬달 기구 (Vapodest 4 titramatic automatic Kjeldahl apparatus). Gerhardt GmbH & Co. KG, Bonn, 독일.

- 645 멀티 도시맷 자동 적정 시스템 (645 Multi-dosimat automatic titration system). Metrohm, Herisau, 스위스.

- 킬다텀^®KT 12 S 무기화 블록(Kjeldatherm^® KT 12 S mineralization block) . Gerhardt GmbH & Co. KG, Bonn, 독일.

분석 프로토콜

킬달법에 의하여 단백질 함량을 측정하였다. 이 분석법은 유기 질소를 황산 암모늄 (NH₄)₂SO₄의 형태로 무기 질소로 전환하는 것에 기초한다. 바포데스트 4S로 자동 분석을 행한다. 각각의 시료에 대하여 평균값을 계산할 수 있도록 분석을 2회 실시한다. 시료에 실제로 함유되어 있는 전체 질소 값을 구하기 위하여, 맹검(盲檢) 시료의 분석을 행하여 그 값을 감하는 것이 필요하다.

결과를 다음의 공식에 따라 질량에 의한 질소 농도로서 나타낸다.

질소 함량 (g/ℓ)=(V-V0) x N x 14/E

여기서, V: 시료를 적정하는 데 필요한 H₂SO₄의 부피, ㎖,

V₀: 맹검 시료를 적정하는 데 필요한 H₂SO₄의 부피, ㎖,

N: H₂SO₄ 용액 적정 농도 (몰/ℓ),

E: 시료의 크기 mg 또는 ㎖.

단백질 백분률은 평지씨 단백질의 전환률 (6.25)에 의하여 얻어지는데, 이들 단백질의 질소 함량 (16%)으로부터 계산된다. 단백질 함량 =6.25 x 질소의 양. 이 계산으로부터 본 발명의 대상인 추출물의 단백질 %는 약 90%로 나타난다 (후술하는 표 2 참조).

2.2. 펩티드의 산가수 분해 및 아미노산의 분석

반응 물질

- 트리클로로아세트산 50% (w/v) 수용액. Prolabo, 20734.295

- 9-플루오레닐메틸 클로로포메이트 (FMOC-Cl). OSI, A4 700.792,

- 아세토니트릴 2.5 mg/㎖. Fluka, 23184

- o-프탈알데히드 (OPA). Fluka, 79760

- 3-머캡토프로피온산 (3-MPA). Sigma, M-6750

- 0.4 N 붕산염 완충 용액 1 ㎖ 중에 화합물 (OPA 및 3-MPA) 각각 10 mg, pH 10.5. 휴렛패커드, 5061~3339

- 아미노산 혼합물의 표준 용액. Sigma, AA-S-18

- 2N NaOH 용액. Fluka, 72071

- 6N HCl. Labosi, A4715801

용리 용액:

용매 A: 트리에틸아민 0.024% (v/v)(OSI, 28 745.296), 테트라히드로퓨란 0.5% (v/v) (OSI, 28 556.293)를 함유하는 아세트산나트륨·3 H₂O 20 mM (OSI, 27652.298). 이 혼합물을 아세트산을 사용하여 pH 7.2로 조절한다 (OSI, 20 104.298).

용매 B: 아세트산을 사용하여 pH 7.2로 조절된 아세트산나트륨 완충 용액 100 mM 20% (v/v) (OSI, 27 652.298), 아세토니트릴 40% (v/v) 및 메탄올 40% (v/v)(Prolabo, 20 865.322).

재료

- 0.22 mm 단일용(single-use) 필터 . Schleicher & Schuell, Dassel, 독일

- 배양 모델 700. Memmert, Schwabach, 독일

- 하이퍼실(Hypersil) C18 컬럼. Interchim, H5 C18-20R, Montlucon, 프랑스

- HP 1090 크로마토그래피 장치. 휴렛 패커드, Palo Alto, 미국.

방법

자유 아미노산의 동종의 혼합물을 얻기 위하여, 펩티드 분획을 미리 산가수 분해하였다. 1 g 또는 1 ㎖의 시료를 마개를 닫은 시험관에 넣는다. 염산 (6 N) 4 ㎖를 첨가하고 시험관을 밀봉하여 닫기 전에 질소 분위기하에 놓는다. 그리고 나서 배양기에서 110℃, 24 시간 가수 분해한다. 냉각 후, 가수 분해물을 4N 수산화나트륨으로 약 pH 6으로 중화시킨다. 마지막으로, 시료를 0.22 mm 시린지 필터로 여과한다.

산가수 분해의 불리한 점은 트립토판이 파괴되고, 글루타민과 아스파라긴이 각각 글루탐산 및 아스파르트산으로의 전환된다는 것이다. 트립토판 분해는 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 알칼리성 가수 분해 후에 이루어질 수 있다. (Hugli T.E. et al., 1972, Determination of the tryptophan content of proteins by ion exchange chromatography of alkaline hydrolysates, Ibid., 247, 2828~2834). 트립토판의 양이 평지씨에서 매우 제한적이라면 (Godon B., 1996, Les methodes courantes de laboratoire pour la separation et l'analyse des proteines vegetales [Current laboratory methods for the separation and analysis of plant proteins]. In. publisher Lavoisier. Proteines vegetales [Plant proteins], 65~80), 이 아미노산은 분석되지 않는다. 글루타민과 아스파라긴에 관하여, 이들의 정량화는 Glx 및 Asx (Glx =Gln + Glu, Asx =Asn + Asp)의 형태로 대응하는 산성 아미노산에 통합될 것이다.

프로토콜

아미노산, 알라닐-글루타민 디펩티드 및 글리실-글루타민 디펩티드는 o-프탈알데히드 (OPA)와 9-플루오레닐-메틸 클로로포메이트 (FMOC)의 존재하에 유도체화한 후, 역상 액체 크로마토그래피에 의하여 분석한다. 유도체화의 원리는 다음과 같다. 즉, 일차 아미노산을 OPA와 3-머캡토-프로피온산 (3-MPA)의 존재하에 넣어서 UV 범위 (338nm)에서 형광성과 흡수성이 높은 이소인돌을 얻는다 (Godel et al., 1992, Automated amino acid analysis using combined OPA and FMOC-Cl precolumn derivatization, LC-GC INTL., 5, 44-49).

동일한 원리에 따라, 이차 아미노산을 FMOC의 존재하에 유도체화하여, UV 범위 (262 nm)에서 형광성과 흡수성이 높은 유도체를 얻는다. 검출 한계는 약 100 pmol이다.

이들 시료는 휴렛패커드 HP 1090 액체 크로마토그래피 장치를 이용하여 자동적으로 유도체화시킨다. 완벽한 유도체화를 얻기 위하여, 먼저 시료 3 ㎕를 2　N NaOH 1.5 ㎕로 중화시킨다. 이어서 0.4 N 붕산염 완충 용액, OPA + 3-MPA 용액 2.5 ㎕ 및 FMOC 용액 2.5 ㎕과 혼합한다. 15분간 혼합을 지속하여 유도체화 시키고, 전체를 하이퍼실 C18 분리 칼럼에 주입한다. 용리 용매는 17분용의 100% 용액 A, 이어서 1분용의 40% 용액 A와 60% 용액 B, 마지막으로 7분용의 100% 용액 B로 구성된다. 아미노산들을 이들의 극성에 따라 분리하는데, 가장 극성이 큰 것은 분석 초기에 칼럼으로부터 용출되고, 가장 극성이 작은 것은 분석 말기에 용출된다. 이들이 칼럼으로부터 용출될 때, 일차 아미노산과 디펩티드는 338 nm에서 UV 검출기에 의하여 검출되고, 이차 아미노산은 262 nm에서 UV 검출기에 의하여 검출된다. 전체 분석 시간은 25분이다.

자유 아미노산 함량의 측정은 산가수 분해 공정이 없는 것을 제외하고는, 동일한 프로토콜에 따라 실시한다.

시료 분석에 앞서, 17개의 아미노산을 함유하는 농도가 각각 0.25, 0.5 및 2.5 mM인 3개의 용액을 사전에 2N NaOH로 중화하지 않고 유도체화하여, 주입한다. 얻은 프로파일은 각 아미노산에 대한 표준 범위를 설정하는 데 제공되는데, 이어서 이것은 피크의 통합 후 (휴렛패커드 장치), 시료 중에 함유된 각 아미노산의 농도를 측정하는 것을 가능하게 한다.

2.3. 고체의 분석

질량이 일정해질 때까지, 시료 (1~5 g)를 105℃ 배양기에 넣어 수분 함량을 측정하였다.

2.4. 사이즈 배제 크로마토그래피에 의한 펩티드 크기의 측정

재료

- 슈퍼덱스 펩티드 HR 10/30 칼럼 (7000~200 Da). Amersham Biosciences, Uppsala, 스웨덴

- 0.22 ㎛ 미니사르트 (Minisart) RC 25 필터. Sartorius, Goettingen, 독일

- 진공 여과 장치, 소결형 유리 깔때기 (sintered glass funnel) SM　16309. Sartorius, Goettingen, 독일

- 바이오캐드(BioCAD^®700^E 크로마토그래피 장치. Applied Biosystems, Foster City, 미국

- 분획 수집 모델 203B. Gilson, Middleton, 미국.

방법

측정 조건은 다음과 같다.

- 용리액: ACN/H₂O/TFA (40/60/0.1 - v/v/v), filtered through 0.45 mm

- 헬륨으로 탈기시킨 용매: 5 ㎖/분

- 용리액 이동 속도: 0.6 ㎖/분

- 칼럼 온도: 주변 온도 (25℃)

- 탐지: 자외선 214 nm

- 주입 부피: 50 ㎕

- 분석 시간: 45 분

몰 질량이 알려져 있는 펩티드로 칼럼을 미리 보정한다. 체류 시간의 함수로서 몰 질량의 로그 함수를 작도하여 2개의 직선을 얻는다. 분자의 몰 질량 (MM)과 이들의 칼럼상에서의 체류 시간의 연관 관계를 측정하는 것은 다양한 분획을 함유하는 펩티드의 크기에 따른 분포를 정의하는 것을 가능하게 한다.

2.5. 페놀 화합물의 분석

분획에 있는 페놀 화합물의 양을 시나프산 등가량으로 측정하였다. 몰 질량이 224 g/몰인 시나프산 (Sigma, D 7927)을 대조 물질로 사용하였는데, 문헌 (Naczk M. et al., 1992, Recovery of rapeseed tannins by various solvent systems, Food Chem., 45, 51~54)에 따르면, 이것은 평지씨 케이크에 지배적으로 존재 (70~90%)하는 페놀산이기 때문이다.

이 경우 이 산의 최대 흡수 파장에 상당하는 310 nm에 고정된 파장을 검출하는 것을 제외하고는, 사이즈 배제 HPLC와 동일한 크로마토그래피 조건하에 보정 및 측정을 행하였다 (Sakakibara H. 등, 2003, Simultaneous determination of all polyphenols in vegetables, fruits and teas, J. Agric. Food Chem., 51, 571~581). 각 분획 중의 페놀 화합물의 함량은 시나프산 등가량/고체 100 g으로 나타내었다. 측정 곡선을 설정하는 데 이용되는 기준의 체류 시간과 체류 시간 (34~37분)이 동일한 피크의 아래 영역의 비율을 계산하여 자유 페놀 화합물의 함량을 측정하였다.

실시예 2의 결과를 아래 표에 나타낸다.

펩티드 추출물 중의 질소 및 페놀 물질의 조성: (표 2 참조)

[표 2]

	펩티드 함량	% 자유 아미노산/PM	폴리페놀의 함량 (mg/ 100 g S)
추출물	90%	3%	탄닌 31% 결합 페놀산 65% 자유 페놀산 4%

PM: 펩티드 물질; S. 고체.

펩티드 크기 분포 (총 펩티드 물질에 대하여): (표 3 참조)

[표 3]

크기(Da)	>5000	5000~1000	1000~500	<500
	0%	20%	23%	57%

펩티드 추출물의 아미노산 조성 (3 분석): (표 4 참조)

[표 4]

aa	%	%	%
Asx	13	12	12
Glx	17	17	20
Ser	7	7	5
His	3	3	2
Gly	9	9	9
Thr	7	7	5
Ala	4	4	5
Arg	7	7	7
Tyr	2	3	3
Cys	0	0	0
Val	7	7	8
Met	1	1	0
Phe	3	3	3
Ile	4	4	4
Leu	7	7	7
Lys	4	4	4
Pro	5	5	6
	100	100	100

Asx: 아스파르트산 + 아스파라긴

Glx: 글루탐산 + 글루타민

후술하는 실시예 4~9 전체에 있어서, 본문에서 달리 지시하지 아니하는 한, 배양은 다음의 배양 배지에서 CHO~C5로 수행하였다.

대조 배지 (○)=RPMI 1640 (Sigma) + BITS + ET + 글루타민

관련 배지 (△)=대조 배지 + 본 발명에 따른 펩티드 추출물 4 g/ℓ.

실시예 3: 무균 여과 효과

이용된 배양 장치는 125 ㎖ 삼각 플라스크, Vu=25 ㎖로 이루어져 있다.

CHO~C5 세포를 0.22 ㎛ 무균 여과에 의하여 무균 대조 배지 (○) 또는 무균 관련 배지 (△)에서 1회 (점선 기호) 또는 3회 (실선 기호) 배양하였다.

얻은 결과는 도 2에 나타나 있다.

후자로부터, 0.22 ㎛ 여과시, 후자로부터 본 발명에 따른 펩티드 추출물의 효과에 감소가 없다는 것이 드러나 있다.

실시예 4: 본 발명에 따른 펩티드 추출물의 "부동" 효과 (표 5 참조)

이용된 배양 장치는 고정 배양 플라스크로 구성된다.

[표 5]

		-196℃에서의 저장 기간
		1 주	1 개월	5 개월
해동 후 다시 배양에 놓여진 시간(h)		0 24 48 96	0 24 48 96	0 24 48 96 120
생존력 %	대조 M 관련 M	61 44 60 81 64 52 56 85	46 33 36 65 58 46 55 74	44 34 36 53 72 39 38 45 68 92

본 발명에 따른 추출물의 존재하에 동결 세포의 양호한 회수가 관찰된다. 이 성질은 예컨대 보존 또는 기타 운반을 위하여 실제로 세포를 종종 동결하고 이어서 해동한다는 점에서 특히 유리하다.

실시예 5: 최대 세포 밀도에서 본 발명에 따른 추출물의 농도의 효과

사용된 배양 장치는 96-웰 플레이트, Vu=200 ㎕로 구성된다. 생장은 세포 스크린 장치 (Innovatis)에 의하였다.

얻은 결과는 도 3에 나타나 있다.

이 결과는 4 g/ℓ의 농도에서 최대의 결과가 나타난다는 것을 보여준다. 농도가 너무 높으면 생장이 위협을 받는다. 이론에 구애되기를 바람이 없이, 본 발명자들은 저해물의 농도 또는 독성 화합물의 농도가 활성 인자의 적극적 (증가) 효과를 파괴할 수 있다는 가설을 제시한다.

실시예 6: 다양한 세포의 적응에 관한 분석

6.1. 10% 혈청 배지의 본 발명에 따른 추출물을 함유하는 무혈청 배지로의 전환

사용된 배양 장치는 고정 배양 플라스크로 구성된다.

6.1.1. VERO 세포 ( 부착성 세포)

이용된 기본 배지는 αMEM이다. 수행된 적응은 급격한 적응이다. 얻은 결과는 도 4에 나타나 있다.

곡선(△)에 의하여 나타낸 VERO 세포의 연속 경로는 본 발명에 따른 추출물의 존재시의 적응을 나타낸다. 곡선 (○)은 추출물의 부재시의 세포의 적응을 나타낸다. D0~D17 중에, FCS는 10~1%로 감소한다. D17에서, FCS는 급격히 제거되고 혼합물 (본 발명에 따른 펩티드 추출물, BITS, ET, Q)로 대체된다. D36에서, BITS가 제거된다.

얻은 결과로부터, 본 발명에 따른 펩티드 추출물의 부재시 적응이 불가능하다는 것으로 나타난다 (세포는 2 경로 내에서 사멸한다). 상기 추출물과 BITS가 존재시에, 세포의 적응이 빠르다 (제3 경로에서 생장 회복). 이와 동일한 추출물이 존재시 및 동물 단백질 부재시 (무단백질 배지), 적응은 약간 더 어렵긴 하지만 가능성은 남아 있다.

BITS와 펩티드 추출물의 존재시 및 혈청의 부재시, VERO 세포가 부착된 채로 있다. BITS가 제거될 때, 이들 세포는 역시 부착되어 있으나, 그 정도가 작다 (트립신화에 필요한 시간이 크게 감소한다).

6.1.2. 하이브리도마 (현탁액에 있는 세포)

사용된 기본 배지는 RPMI이다.

급격한 적응

급격한 적응의 경우에, FCS가 급격하게 혼합물 (펩티드 추출물 + BITS + ET + Q)로 대체될 때, 세포의 사멸이 빠르게 관찰된다.

온건한 적응

하이브리도마 세포의 연속 경로가 수행되었다. 얻은 결과는 도 5에 나타나 있다. 여기서 곡선 (△)은 본 발명에 따른 추출물의 존재시의 적응을 나타내고, 곡선(○)은 본 발명에 따른 추출물의 부재시의 세포의 적응을 나타낸다. D0~D17 중에, FCS는 10~1% 감소한다. D17~D35 중에, FCS는 점차 제거되어 혼합물 (펩티드 추출물, BITS, ET, Q)로 대체된다. D47에서, BITS는 제거된다.

얻은 결과는 펩티드 추출물의 존재시의 적응이 불가능하다는 것을 보여준다 (세포는 25%/75% 혼합물에서 2 경로 내에서 사멸한다). 추출물과 BITS의 존재시 및 혈청의 부재시, 하이브리도마는 올바르게 적응한다 (제4 경로에서의 회복). 동물성 단백질 (BITS)의 제거는 세포의 즉각적인 사멸을 유발한다.

6.1.3. CHO K1 dhfr ^- (CHO DUXB11) (현탁액 중의 세포)

사용된 기본 배지는 αMEM + 리보- 및 데옥시리보뉴클레오시드이다.

급격한 적응

하이브리도마 세포와 동일한 관찰이 기록된다 (자료는 없다).

온화한 적응

CHO K1 dhrf^- 세포의 일부 연속 경로가 수행되었다. 얻은 결과는 도 6에 나타나 있는데, 여기서 곡선 (△)은 펩티드 추출물 존재시의 적응을 나타내는 한편, 곡선 (○)은 펩티드 추출물의 부재시의 세포의 적응을 나타낸다. D0~D12 중에, FCS는 10~2%로 감소한다. D12~D40에서, FCS는 점차 제거되어 혼합물 (펩티드 추출물, BITS, ET, Q)로 대체된다. D40에서, BITS는 제거된다.

이 3가지 결과로부터, 펩티드 추출물의 부재시의 적응은 불가능하다 (세포는 25%/75% 혼합물에서 3 경로 내에서 사멸한다)는 것이 나타난다. 펩티드 추출물과 BITS 존재시 및 혈청의 부재시, CHO K1 세포는 올바르게 적응한다 (제1의 경로에서의 회복). 동물성 단백질 (BITS)의 제거는 생장의 느린 감소와 더 긴 적응 (약 6 경로)을 유발하나 상기 적응 가능성은 남아있다.

6.2. (대조) 무혈청 배지로부터 펩티드 추출물을 함유하는 무혈청 배지 (동물 기원 단백질이 없는 관련 배지)로의 전환

6.2.1. CHO C5 의 연속 경로 (현탁액 중의 세포)

사용된 배양 장치는 고정 배양 플라스크로 구성된다. 대조 배지 (○), 관련 배지 (△) 및 동물 단백질이 없는 관련 배지 (Ｘ)에서 CHO C5 세포의 일부 연속 경로를 수행하였다. 대조 배지에 대한 결과는 도 7A에, 관련 배지에 대한 결과는 도 7B에 나타나 있다.

이들 도로부터 관련 배지에서의 세포의 적응과, 또한 펩티드 추출물의 긍정적인 효과가 적어도 7 경로 동안 보존된다는 것이 나타난다. 이와 유사하게, 동물성 단백질 부재의 배지에서의 세포의 증식은 적어도 7 경로 중에 대조 배지에서 관찰된 것에 근접한 세포 농도를 얻는 것을 가능하게 한다.

더욱이 세포는 단지 매 3일마다 전달될 수 있기 때문에 (대조 배지가 매 2일마다인 대신), 본 발명에 따른 무단백질 배지는 세포를 유지시키는 통상의 배지로 이용될 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.

6.2.2. 연장 배양의 속도론 (현탁액 중의 세포)

사용된 배양 장치는 500 ㎖의 스피너, Vu=160 ㎖이다.

사전 적응이 없이 CHO C5 세포 배양 중에 생존 가능한 세포 농도에서의 변화를 도 8에 나타낸다. 특히 이 도면은 대조 배지 (○), BITS가 없는 기본 배지 (-), 관련 배지 (△) 및 BITS가 없는 관련 배지 (Ｘ)에서의 배양을 나타내고 있다.

이들 결과로부터, 동물성 단백질이 제거될 때, 대조 배지는 더 이상 세포가 생장하지 못하도록 한다는 것이 나타난다. 관련 배지는 최대 농도를 실질적으로 2배가 되게 한다. 더욱이 배양의 지속 (생존 가능한 세포가 완전히 사라지기 전에)은 3배 증대된다.

동물성 단백질이 제거될 때, 관련 배지는 생장 가능하다. 동물성 단백질은 부재하고 펩티드 추출물은 존재할 때, 최대 세포 농도는 증가하지 않는 한편, 배양의 수명은 대조 배지에 비하여 인자 2만큼 증가한다.

실시예 7: 인터페론의 특이적 생성 속도에 있어 펩티드 추출물의 영향

사용된 배양 장치는 2 리터 세포 배양기, 이용가능한 부피 Vu=1.2 ℓ로 구성된다.

도 9는 대조 배지 (○)와 관련 배지 (△)에서 CHO C5 세포의 생장 속도론을 나타낸다.

도 10은 그의 일부에 대하여 대조 배지 (○)와 관련 배지 (△) 내에서 동일한 CHO C5 세포에 의한 IFN (감마 인터페론) 생산 속도론을 나타낸다.

마지막으로, 도 11은 대조 배지 (점선)와 관련 배지 (실선)에서 CHO C5 세포에 의한 인터페론의 특이적 생성 속도를 설명한다.

→ 생존 가능한 세포에 있어 펩티드 추출물의 긍정적인 영향이 반응기 규모 (*3.3)에서 확인된다.

→ 최종 IFN 생성 (*5.3)에 있어 큰 증가가 주목된다.

→ 이 증가는 생존 가능한 세포에서 증가와 특이적 생성 속도에서의 증가의 결합 결과일 수 있다 (실질적으로 최대치는 2배)

실시예 8: 기본 아미노산 조성물 단독이 아니라 상기 아미노산 조성물이 펩티드 형태로 결합하여 기능하는 것의 입증

사용된 배양 장치는 500 ㎖ 스피너, Vu=160 ㎖로 구성된다.

도 12는 스피너, 대조 배지 (○), 자유 아미노산으로 보충된 대조 배지 (Ｘ) 및 관련 배지 (△)에서 배양된 생존 가능한 CHO C5 세포의 속도론을 나타낸다. 자유 아미노산은 펩티드 추출물 (펩티드 및 자유)에 존재하는 총아미노산에 대응한다.

펩티드 추출물에 존재하는 것과 동일한 비율로 펩티드 형태의 아미노산을 추가하는 것은 생존 가능한 세포 농도를 증가 가능하게 하지 않는다. 한편, 배양 수명에서의 긍정적인 효과가 주목된다. 사용된 펩티드 추출물의 펩티드 혼합물의 그것과 동등한 개별 아미노산 조성물은 세포가 살아 있도록 하는 데 기여한다 (대조 배지와 비교한 *3).

생존 가능한 세포수 및 세포의 생존력을 2배로 늘려서 (이 경우에 얻은 최대 세포 농도를 대조점으로 이용하여, 대조 배지 + 자유 아미노산과 비교한 50% 추가 시간), 펩티드 추출물의 양을 증가시킨다. 이들 결과는 오직 총아미노산 조성물과 관련된 효과에 의하여 단독으로 발생하는 것 같지 않다. 이들은 본 발명에 따른 펩티드 추출물에서 특정 조성물과 함께 특정 펩티드의 존재로부터 얻은 "생장 인자" 효과에 의하여 발생할 수 있다.

Claims

무혈청 생체 외 세포 또는 조직 배양 배지를 제조 및/또는 보충하기 위한 펩티드 추출물의 용도에 있어서, 상기 추출물은 식물성 출발 물질을 연속 분획하여 얻은 것이고, 상기 식물성 출발 물질은 평지씨로 이루어진 것을 특징으로 하는 무혈청 생체 외 세포 또는 조직 배양 배지를 제조 및/또는 보충하기 위한 펩티드 추출물의 용도.
무단백질 생체 외 세포 또는 조직 배양 배지를 제조 및/또는 보충하기 위한 펩티드 추출물의 용도에 있어서, 상기 추출물은 식물성 출발 물질을 연속 분획하여 얻은 것이고, 상기 식물성 출발 물질은 평지씨로 이루어진 것을 특징으로 하는 무단백질 생체 외 세포 또는 조직 배양 배지를 제조 및/또는 보충하기 위한 펩티드 추출물의 용도.
제1항 및 제2항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩티드 추출물은 세포나 조직 농도의 증가와 관련한 및/또는 세포 수명의 증가와 관련한 및/또는 관심 있는 1개 이상의 분자의 특이적 생성 속도와 관련한 기능을 수행하고, 상기 기능은 펩티드 형태의 아미노산들 중의 기본 아미노산 조성물 단독이 아니라 상기 아미노산들로 이루어진 조성물에 의하여 구속되는 것을 특징으로 하는 것인 용도.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 식물성 출발 물질은 평지씨 케이크로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 용도.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩티드 추출물은 적어도 80 질량%, 좋기로는 적어도 90 질량%의 질소 함유 물질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 용도.
제5항에 있어서, 상기 질소 함유 물질은 분자 크기가 500 달톤 미만인 펩티드 약 50% ~ 약 60%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 용도.
제5항 및 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질소 함유 물질은 분자 크기가 500~1000 달톤인 펩티드 약 20% ~ 약 30%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 용도.
제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 추출물은 20~40 몰%의 아스파르트산과 글루탐산 및/또는 이들 각각의 아미드를 함유하는 것을 특징으로 하는 것인 용도.
제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩티드 추출물은 페놀 화합물 1 질량% 미만을 함유하는 것을 특징으로 하는 것인 용도.

제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 펩티드 추출물은 다음의 총아미노산 조성을 나타내는 것을 특징으로 하는 것인 용도.

제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포, 좋기로는 동물 세포로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 배양 세포를 위한 용도.
제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 따른 펩티드 추출물을 이용하여 얻은 무혈청 세포 또는 조직 배양 배지.
제12항에 있어서, 비타민, 무기염, 자유 아미노산, 유기산 및/또는 당을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 배양 배지.
세포 또는 조직의 대량 배양을 위한 제12항 및 제13항 중 어느 하나의 항에 따른 배양 배지의 용도.
제2항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 따른 펩티드 추출물을 이용하여 얻은 무단백질 세포 또는 조직 배양 배지.
제15항에 있어서, 비타민, 무기염, 자유 아미노산, 유기산 및/또는 당을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 배양 배지.
세포 또는 조직의 대량 배양을 위한 제15항 및 제16항 중 어느 하나의 항에 따른 배양 배지의 용도.
무혈청 배지에서 생체 외 세포 또는 조직 배양 방법에 있어서, 평지씨로 이루어진 식물성 출발 물질을 연속 분획하여 얻은 펩티드 추출물을 함유하는 배지에 상기 세포나 조직을 시딩하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 무혈청 배지에서 생체 외 세포 또는 조직 배양 방법.
제18항에 있어서, 상기 출발 물질은 평지씨 케이크로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 추출물은 적어도 80 질량%, 좋기로는 적어도 90 질량%의 질소 함유 물질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제18항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질소 함유 물질은 분자 크기가 500 달톤 미만인 펩티드 약 50% ~ 약 60%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제18항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질소 함유 물질은 분자 크기가 500~1000 달톤인 펩티드 약 20% ~약 30%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제18항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 추출물은 20~40 몰%의 아스파르트산과 글루탐산 및/또는 이들 각각의 아미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.

제18항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 추출물은 다음의 총아미노산 조성을 나타내는 것을 특징으로 하는 것인 방법.

무단백질 배지에서 생체 외 세포 또는 조직 배양 방법에 있어서, 평지씨로 이루어진 식물성 출발 물질을 연속 분획하여 얻은 펩티드 추출물을 함유하는 배지에 상기 세포나 조직을 시딩하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 무단백질 배지에서 생체 외 세포 또는 조직 배양 방법.
제25항에 있어서, 상기 출발 물질은 평지씨 케이크로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 추출물은 적어도 80 질량%, 좋기로는 적어도 90 질량%의 질소 함유 물질로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질소 함유 물질은 분 자 크기가 500 달톤 미만인 펩티드 약 50% ~ 약 60%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제25항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 질소 함유 물질은 분자 크기가 500~1000 달톤인 펩티드 약 20% ~약 30%로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 방법.
제25항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 추출물은 20~40 몰%의 아스파르트산과 글루탐산 및/또는 이들 각각의 아미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 방법.

제25항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 추출물은 다음의 총아미노산 조성을 나타내는 것을 특징으로 하는 것인 방법.

혈청 배지로부터 세포 및/또는 조직을 회수하고 이들 또는 이것을 곧바로 제12항 또는 제13항에 따른 배지 내에 시딩하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무혈청 배지에서의 배양으로 직접 전달하는 방법.
혈청 배지로부터 세포 및/또는 조직을 회수하고 이를 순차적으로 혈청 농도가 감소하는 제12항 또는 제13항에 따른 배지 내에 각각 시딩하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무혈청 배지에서의 배양으로 적응시키는 방법.
제33항에 있어서, 상기 적응 방법은 다음의 4 공정으로 이루어진 점을 특징으로 하는 것인 적응 방법.

- 공정 1: 혈청 배지 75%/무혈청 배지 25% + 펩티드 추출물,

- 공정 2: 혈청 배지 50%/무혈청 배지 50% + 펩티드 추출물,

- 공정 3: 혈청 배지 25%/무혈청 배지 75% + 펩티드 추출물,

- 공정 4: 혈청 배지 100% + 펩티드 추출물.
혈청 배지로부터 세포 및/또는 조직을 회수하고, 이를 직접 제15항 또는 제16항에 따른 배지 내에 시딩하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 혈청 배지 에서의 생체 외 배양을 무단백질 배지에서의 배양으로 직접 전달하는 방법.
혈청 배지로부터 세포 및/또는 조직을 회수하고 이를 순차적으로 혈청 농도가 감소하는 제12항 또는 제13항에 따른 배지 내에 각각 시딩하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는, 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무단백질 배지에서의 배양으로 적응시키는 방법.
제36항에 있어서, 상기 적응 방법은 다음의 4 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는 것인 적응 방법.

- 공정 1: 혈청 배지 75%/무혈청 배지 25% + 펩티드 추출물,

- 공정 2: 혈청 배지 50%/무혈청 배지 50% + 펩티드 추출물,

- 공정 3: 혈청 배지 25%/무혈청 배지 75% + 펩티드 추출물,

- 공정 4: 혈청 배지 100% + 펩티드 추출물.
다음의 공정으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 혈청 배지에서의 생체 외 배양을 무단백질 배지에서의 배양으로 적응시키는 방법.

- 공정 1: 제32항, 제33항 및 제34항 중 어느 하나에 따른 방법의 수행,

- 공정 2: 무혈청 배지로부터의 세포 및/또는 조직의 회수,

- 공정 3: 상기 세포 및/또는 조직의 직접 무단백질 배지에의 시딩.