CN101084304A

CN101084304A - 促进细胞和/或组织培养物中指定产物生长和合成的肽组分

Info

Publication number: CN101084304A
Application number: CNA2005800428988A
Authority: CN
Inventors: A·马克; J－L·格尔根; B·法尔热－哈丹尼
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2007-12-05
Also published as: AU2005315612A1; IL183711A0; EP1824963A1; CA2590693A1; US7993923B2; RU2007126855A; BRPI0518634A2; WO2006064020A1; JP2008522637A; US20090124010A1; FR2879214A1; US20120088303A1; NO20073483L; MX2007007154A; KR20070107680A

Abstract

本发明涉及制备和/或补充细胞或组织培养基的方法。实质上，所述发明涉及一种含有肽组分的无血清和/或无蛋白质的培养基，所述肽组分分离自油菜籽，特别是分离自油菜籽饼。本发明还涉及制备含有所述肽组分的细胞培养基的方法和其用途。

Description

促进细胞和/或组织培养物中指定产物生长和合成的肽组分

技术领域

本发明涉及补充细胞或组织培养基的领域。更特别地，本发明涉及一种无血清和/或无蛋白的细胞培养基，该培养基含有分离自油菜籽的肽组分(peptide fraction)，特别是分离自油菜籽饼的肽组分。本发明还涉及一种制备含有这些肽组分的细胞培养基的方法及其用途。

背景技术

因为活体细胞的存在已为大众所知，细胞培养基的类型和技术在不断进步和多样化。

最初，细胞培养基使用未作定义的培养介质例如血浆、血清或胚胎提取物。直到20世纪50年代中期，最初被定义的培养介质才出现，除了盐和葡萄糖外，所述的培养基中包含了细胞自身不能合成的各种氨基酸和维生素。

近来已经发现，在所有的氨基酸当中，L-谷氨酸起到一个重要作用，它既作为能量来源也可以作为碳源和氮源，并且主要用于嘌呤和嘧啶的合成。然而，存在的缺陷是谷氨酸不能以稳定的游离氨基酸形式存在并且容易分解为铵离子和焦谷氨酸。解决这个问题的方法(基于应用谷类水解反应)已在名称为QUEST INTERNATIONAL的发明专利申请WO96/26266中公开。

通常，细胞和组织，特别是动物细胞，在体外在营养培养基培养，所述培养基是碱基或基础培养基，其中补充了5-20％的血清，通常是小牛胎盘血清或FCS。

然而，这些血清的使用有其它缺陷，例如i)引入的动物蛋白必须随后除去，ii)可能引入潜在的污染物例如霉菌，细菌，病毒或朊病毒(prions)，iii)质量不稳定而且成本高。

此外，尤其是为了控制医用产品中的牛绵状脑病(BSE)的威胁，所有国家的法律和国际法律都期望在不久的将来禁止使用来源于动物的产品。

在这些缺陷中，引入污染物的威胁是最大的问题并且促使人们使用无血清的培养基或SFM。然而，当前使用的某些SFM仍然含有胨和来源于动物的水解物，因此并不能完全令人满意的解决上述提及的污染风险问题。

至于不含动物来源的材料的SFM，它们通常来源于富含蛋白质的原材料，例如谷类原料，如大米(WO98/15614；WO99/57246)或小麦。其它可用原料的例子，如大豆(WO01/23527；WO00/03000)，或者黄瓜(WO99/47648)。然而，获得这些培养基的成本通常相对较高，并且通常来源于含有高含量的蛋白质的原料，这些原料也可用于其它应用中，例如食品用途。因此实际上真正需要开发一种彻底无动物来源产品的培养基，并且不贵或者，至少它来源于其价值是被和/或轻微开发的原料。

发明内容

本发明意欲通过制备一种无血清的、来源于起始蛋白质含量低的植物原料的培养基来克服现有技术的缺陷。

更特别地，本发明涉及使用肽提取物制备和/或补充无血清的体外细胞或组织的培养基，所述提取物通过连续分离植物原料获得，特征在于所述的植物原料由油菜籽组成。

术语“无血清培养基”应该理解为不含动物来源血清例如FCS，FBS(小牛胚胎血清)或其它类似血清的培养基。

如今，源自细胞培养物的大部分产品是单克隆抗体，病毒和重组蛋白。从工业角度看，目前大规模培养的细胞，包括来自组织的细胞或在毒理学中作为动物模型的替代品在内的细胞，都是融合细胞，VERO细胞(非洲绿猴肾细胞)，BHK细胞(幼仓鼠肾细胞)，CHO细胞(中国仓鼠卵巢)，NS0细胞，或被杆状病毒感染的草地贪夜蛾(Sf9)细胞。融合细胞是生产单克隆抗体的细胞，而VERO和CHO细胞通常用于制备病毒或其它重组蛋白。当然，上述所列举的细胞并不限制本发明，本发明可以涉及任意类型的细胞。

通过不受限制的例子，要提到下述组织：软骨，肌肉细胞，皮肤，骨细胞，腱，胚胎细胞，人造器官。

本发明的第一个特征是基于产油植物，特别是油菜籽的使用。实际上，与谷类或其它当前利用的原料不同，这种菜籽尤其富含油脂并且蛋白质含量低。因为这些原因，时到今日，本领域技术人员都没有尝试使用油菜籽制备培养基，因为目前普遍认为用作培养基的原料必须优先含有大量的蛋白质。

完全令人惊讶的是，与现有技术的偏见相反，本发明证明了可以使用油菜籽制备无血清和/或无蛋白质的培养基。甚至更令人惊讶的是，本发明也证明了含有源自油菜籽的肽提取物的培养基不仅可以明显提高放置在培养基中的细胞或组织的最终浓度，也可以提高一种或多种通过培养基中的细胞产生的所需目标分子的生成率。

此外，本发明还证明了最终细胞或组织浓度的提高与不仅与营养作用相关。

根据本发明优选的方面，本发明涉及上述提取物的用途，特征在于所述肽提取物的作用是：提高细胞或组织浓度，和/或提高细胞的寿命，和/或提高细胞的一种或多种所需分子的特定生成率，上述作用不仅受基本氨基酸组成限制，而且受肽形式中的所述氨基酸组成的限制。

本发明的积极效果尤其建立在与基本组成的培养基产生的效果的比较上，所述基本组成的培养基即由游离氨基酸组成的，在所有方面与本发明的肽提取物的组成相同，不同之处在于根据本发明的提取物中的氨基酸是肽形式。这一观点可以更清楚地从下文的实施例看出。

通常，现有技术表明，目前使用的培养基是为了给细胞或组织提供营养物而制备的，所述营养物尤其是氨基酸，其作为细胞需要的能量来源和碳源、氮源。这些氨基酸通常以游离氨基酸的形式存在于培养基中。某些氨基酸为了在液态培养基中保持足够的稳定性而以二肽或三肽的形式存在(WO96/26266)。

完全令人惊讶地，本发明显示本发明的肽提取物通过连续分离来源于油菜籽的原料而获得，其功能在于促进培养中细胞或组织的生长和保证它们存活。事实上，如下文中的实施例可以更清楚的显示，对于相同量的每种氨基酸而言，有必要使后者采用肽段的形式这样才能提高浓度，特别是提高细胞或组织的寿命，以及提高一种或多种所需分子特定的生成率。已经证明，本发明不仅仅基于游离氨基酸的量，而且还基于肽的特定组成，所述肽优选二肽，三肽，四肽或五肽。

不希望被任何理论所束缚，但本发明的目标提取物不仅仅对生长起到积极作用，而且还可以降低细胞凋亡的诱导作用。

根据另一方面，本发明涉及肽提取物在制备和/或补充无蛋白质的体外细胞或组织的培养基中的用途，所述提取物可通过连续分离植物原料获得，其特征在于所述植物原料由油菜籽组成。

在某种意义上与前述的无血清培养基类似，上述肽提取物的用途的特征在于所述的肽提取物具有提高细胞或组织浓度，和/或提高细胞寿命，和/或提高一种或多种所需分子的生成率的功能，所述功能不仅受基础氨基酸组成的限制，而且受所述氨基酸在肽形式中的组成限制。

表达形式“无蛋白质”不应被理解为完全无蛋白质的培养基，而应被理解为完全无动物源蛋白质的培养基。围绕这一表达，也可以叫做ADCF(无动物来源成分)或者叫做“无动物蛋白质”。

事实上，蛋白质的存在通常对于细胞或组织的生长是必须的。如上面所述，重要的在于不存在动物来源的蛋白质。这样的培养基可以消除(甚至比无血清培养基更彻底)动物来源的分子、或该分子的一部分带来的污染的威胁。

根据优选的实施方案，本发明可以直接涉及上述用途，所述用途的特征在于植物原料由油菜籽饼组成。

术语“饼”应被理解为当产油的种子和水果中的油被提取后获得的残余固体(参见Petit Larousse Illustré，1989，975页)。因此，本发明的一个优势在于使用的原料成本低。实际上，在所有产油作物中，饼是油脂工业的主要副产品，其价值至今还没有引起重视。因此本发明提供一种回收和提高油脂工业废弃物利用价值的方法。

本发明的目标肽提取物优选通过水解油菜籽饼获得。已经公开了获得这种提取物的分离提取过程。图1是优选方法的流程图。当然，对于本领域技术人员来说任何修改都是显而易见的，都是本发明的一部分。

更优选地，该方法包括六个连续的步骤，它们分别是：

步骤1：蛋白质的提取

此步骤的目的是生产油菜籽蛋白的浓缩物，以期获得富含油菜籽蛋白的原料(固体的70-80％是蛋白质，而油菜籽饼中蛋白质含量为30-40％)。

步骤2：水解

此步骤的目的是水解蛋白质，以期获得含有肽的溶液。

此处还应说明的是，使用的方法是常规方法。使用Alcalase^_碱性蛋白酶，它是一种来源于微生物的酶制剂，因此不会引起引入来源于动物的生物成分(病原性对抗动物细胞的病毒，朊病毒等)的危险。水解时间：5小时，T°＝60℃，pH＝9，酶浓度/底物浓度比率＝1/10。水解产物中游离氨基酸的浓度：4％质量。

步骤3：酸沉淀，pH4

此步骤的目的在于去除“大”分子，尤其是水解产物中的大分子蛋白质和肽，此操作可减少后续过滤步骤发生的结渣(clogging)。

步骤4：用截留值(cutoff threshold)为3kDa的膜超滤

此步骤的目的在于通过除去分子量大于3000Da的分子(酚类化合物如单宁和多肽)来收集小肽。使用的方法是常规的膜方法以增加水解物中含有的小肽。

步骤5：用截留值为500Da的膜进行纳米过滤

本步骤的目的是降低由步骤4获得的小肽溶液中的游离氨基酸的量，并且对此溶液脱盐以降低混合物的等渗容摩。使用的是常规脱盐方法。将盐浓度降低80％更利于在步骤5中根据小肽的带电荷对其进行更好的分离。

步骤6：用截留值为1kDa的膜进行超滤

本步骤包括根据分子大小和带电荷分离小肽。

本步骤的独特优势在于它根据肽的大小和电荷使用超滤膜来分离植物水解物中含有的肽。与渗透物相比，相应于本发明的肽提取物的最终的滞留物包括较高浓度的含有酸性氨基酸的肽和较低浓度的含有碱性氨基酸的肽。

值得一提的是前述的方法仅仅给出了一种过滤的具体实施方式，但是这并不是对本发明的限制。今后的任何改良或提高都应该认为是本发明的一部分。

为了更全面地限定本发明的目标肽提取物的特征，已经进行了几项研究和检测，其详细的方法和结果会在后面的实施例中叙述。而且，本发明的上下文中使用的肽提取物的特征在于，其含有至少80％，优选至少90％质量的氮原料。

表达方式“氮原料”，在本发明的描述中被定义为任何含有氨基酸的原料，后者可以是游离态的或连接形成肽或蛋白质的形式。

这样的氮原料浓缩物，可通过前述方法从低蛋白质含量的产油原料特别是油菜籽中获得。这一特征是非常有利的，因为大多数用于补充培养基的植物提取物具有较低含量的氮原料。例如，在名为“QUESTINTERNATIONAL”(WO96/26266)的发明专利申请中所述的来源于谷类的提取物含有的氮原料，其含量对于以下提取物分别为，大豆提取物54％，小麦提取物75％，大米提取物69％。

本发明与现有技术的区别在于所使用的肽提取物中的氮原料含量高。

此外，发明人证明了所述的氮原料几乎不含有游离的氨基酸，但主要由小分子肽组成。涉及的方法和结果在随后的实施例中介绍。

更特别地，根据本发明的用途的特征在于所述的氮原料含有大约50％到大约60％的分子量小于500道尔顿的肽。

一般认为，小于500道尔顿的肽主要是二肽、三肽、四肽、五肽形式。事实上，氨基酸的平均摩尔分子量大约为150g/mol，甘氨酸的摩尔分子量最低为75.1g/mol，色氨酸的摩尔分子量最高为204.2g/mol。

根据本发明的另一个方面，所述用途的特征在于所述的氮原料含有大约20％到大约30％的分子量为500-1000道尔顿的肽。

本发明的目标肽提取物令人感兴趣的特征还在于，所述提取物显示出含有高含量的酸性氨基酸。

更优选地，本发明涉及上述用途，的特征在于所述的提取物含有大约20％到40mol％的天冬氨酸和20％到40mol％的谷氨酸和/或它们各自的酰胺。

最后，本发明的特征在于所述的肽提取物含有小于1％质量的酚类化合物。

更特别地，所述肽提取物具有下面的总氨基酸组成：

氨基酸	Mol％
氨基酸	Mol％	丙氨酸精氨酸天冬氨酸+天冬酰胺半胱氨酸谷氨酸+谷氨酰胺甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸蛋氨酸苯基丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸	2-65-910-14015-197-111-52-65-92-60-31-53-75-95-9未检出1-55-9

表中显示的百分比为平均值，测量该百分比的方法在实施例中有清楚的描述。同一实施例中举例说明了不同的优选浓度。

根据优选的实施方式，本发明的用途，其特征在于所述细胞包含真核细胞，优选动物细胞。

优选的真核细胞的不受限制的例子是工业中应用的细胞，例如CHO，BHK，NS0，PER C6，VERO，HEK293等细胞。

根据另一方面，本发明不局限于如上所述的肽提取物用作补充元素的用途，本发明还涉及将其用作无血清培养基。

更优选地，本发明涉及一种通过使用或包含上述肽提取物获得的无血清细胞或组织培养基。

正如前面所述，所述培养基优选含有根据培养要求的类型选择的“基础”培养基，可以向其中添加血清或其他增补剂，如水解物。本发明的目标培养基可以根据添加的提取物的性质区分，即如前所述来源于产油植物原料的提取物，特别是来源于油菜籽的提取物。

此处使用的“碱性培养基”取决于希望制备的培养基的性质。通过不受限制的实施例，使用了下述培养基：RPMI(Roswell ParkMemorial Institute)，MEM(Minimum Essential Medium)，Iscove’s，IMDM(Iscov’s Modified Dulbecco’s medium)，Ham’s，NCTC，TC100，Grace等。

实际上，本发明的提取物以溶液形式使用，其中相同的肽提取物的浓度可以根据期望制备的培养基的类型而不同。通过不受限制的例子，在CHO(中国仓鼠卵巢)型细胞的培养中，优选的浓度为2-6g/l，优选4g/l。从后面的实施例中可以看出，较低浓度是不够的，而较高浓度将导致对细胞生长的抑制或者可能导致细胞凋亡。

在后面的实施例中，所使用的相关培养基主要是RPMI 1640培养基(SIGMA-ALDRICH)。

根据一个具体实施方式，根据本发明的培养基的特征在于它还含有维生素、无机盐、游离氨基酸、有机酸和/或糖。

本发明还包括本发明的培养基用于大规模培养细胞或组织的用途。

根据本发明的另一方面，本发明还涉及的培养基不仅是无血清的，而且还是无蛋白质的，即上面解释的，是无动物蛋白质的培养基。

本发明还包括通过使用或包含上述肽提取物而获得的无蛋白质的细胞或组织培养基。

与前面所述的无血清培养基相同，根据一种实施方案，本发明的无蛋白质培养基也含有维生素、无机盐、游离氨基酸、有机酸和/或糖。

本发明还涉及本发明的无蛋白质培养基用作大规模培养细胞或组织的用途。

根据另一实施方式，本发明涉及一种体外细胞或组织培养的方法。这种方法的具体步骤通过如下不受限制的例子可以阐明，i)小规模(96孔板)静态培养；ii)略大规模(25cm²，75cm²和175cm²培养烧瓶)静态培养；然后iii)加大规模(锥形瓶，摇瓶和可控制的细胞培养仪)动态培养。更优选地，可以使用本领域技术人员所公知的常规接种技术。

更特别地，本发明涉及一种在无血清培养基中体外细胞或组织培养的方法，其特征在于包括将所述细胞或组织接种到含有肽提取物的培养基中的步骤，所述肽提取物通过连续分离植物原料获得，所述植物原料包括油菜籽。

一个具体实施方案就是进行上述分离步骤，获得具有所述性质的提取物。

更特别地，根据本发明的方法，其特征在于所述原料包含油菜籽饼。

甚至更特别地，本发明的方法的特征在于所述提取物包含至少80％，优选至少90％质量的氮原料。

更特别地，本发明的方法的特征在于所述氮原料含有大约50％到大约60％的分子量小于500道尔顿的肽。

甚至更特别地，本发明的方法的特征在于所述氮原料含有大约20％到大约30％的分子量为500-1000道尔顿的肽。

优选地，根据本发明的方法的特征在于所述提取物包含大约20到40mol％的天冬氨酸和20到40mol％谷氨酸和/或20到40mol％它们各自的酰胺。

最后，甚至更优选地，根据本发明的方法的特征在于所述提取物具有下述总氨基酸组成：

氨基酸	Mol％
氨基酸	Mol％	丙氨酸精氨酸	2-65-9

天冬氨酸+天冬酰胺半胱氨酸谷氨酸+谷氨酰胺甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸蛋氨酸苯基丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸

10-14015-197-111-52-65-92-60-31-53-75-95-9未检出1-55-9

与针对上述培养基相似的方式，本发明的另一个方面涉及一种体外细胞或组织培养的方法，所述方法的特征在于在无蛋白质培养基中进行。

更特别地，所述在无蛋白质培养基中进行的体外细胞或组织的培养方法的特征在于其包括将所述细胞或组织接种到含有肽提取物的培养基中，所述肽提取物是通过连续分离植物原料获得的，所述植物原料包括油菜籽。

与在无血清培养基中培养的方法相似，本发明涉及的在无蛋白质培养基中培养的方法的特征在于，所述原料包括油菜籽饼。

更特别地，本发明的方法的特征在于所述提取物含有至少80％，优选至少90％质量的氮原料。

甚至于更特别地，本发明的方法的特征在于所述氮原料含有大约50％到大约60％的分子量小于500道尔顿的肽。

特别地，本发明的方法的特征在于所述氮原料含有大约20％到大约30％的分子量为500到1000道尔顿的肽。

甚至于更特别地，本发明的方法的特征在于所述提取物含有大约20到40mol％的天冬氨酸和20到40mol％的谷氨酸和/或20到40mol％的它们各自的酰胺。

更优选地，根据本发明的方法，其特征在于所述提取物含有下列的总氨基酸组成：

最后，根据本发明的最后一个方面，在将血清培养基调整为根据本发明的培养基时，本发明的优势很好的显示出来。实际上，由于本领域技术人员所了解的不同原因，例如：(i)用基因修饰的方法(转染)获得新的细胞系，(ii)在含有血清的培养基中先冷冻后解冻提高细胞的生命力；(iii)更高的生长和(iv)细胞对剪切力的高耐受性，所以采用先在含有血清的培养基中开始培养，然后快或慢的，换成在无血清和/或无蛋白质的培养基中培养是具有优势的。众所周知，这种转换是很难进行的，因为细胞很难抵抗住这种转换过程中带来的压力，在多数情况下，对于它们来说这是致命的。为了避免这种压力，细胞先被转移到含有降低了浓度的血清的培养基中，这使得细胞更容易适应新的无血清培养基。这一阶段就是适应期，是长而单调的。

完全令人惊讶地，本发明的发明人已经证明这种压力能够通过如下方法避免，即将这种培养基换成含有本发明的目标肽组分的无血清培养基，甚至于直接转换。本发明的这一性质会在随后的实施例和附图中被清晰地展示。

因此，本发明涉及一种将在血清培养基中进行的体外培养直接转变为在无血清培养基中进行的体外培养的方法，特征在于其包括从血清培养基中收集细胞和/或组织，和将它们直接接种到如本发明所述的无血清培养基中的过程。

根据另一个有利方面，本发明涉及一种将在血清培养基中进行的体外培养调整为在无血清培养基中进行培养的方法，其特征在于其包括从血清培养基中收集细胞和/或组织，然后逐步将它们分别接种到具有递减的血清浓度的培养基中。

本发明包括一种如前所述的调整方法，其特征在于所述的调整方法包括如下四个步骤：

步骤1：75％血清培养基/25％无血清培养基+肽提取物，

步骤2：50％血清培养基/50％无血清培养基+肽提取物，

步骤3：25％血清培养基/75％无血清培养基+肽提取物，

步骤4：100％无血清培养基+肽提取物。

根据另一方面，本发明涉及一种直接将在血清培养基中进行的体外培养转换为在无蛋白质培养基中进行培养的方法，其特征在于其包括从血清培养基中收集细胞和/或组织，然后将它们或它直接接种到本发明所述的无蛋白质培养基中。

根据另一个具体实施方案，本发明包括一种将在血清培养基中进行的体外培养调整为在无蛋白质培养基中进行培养的方法，其特征在于它包括从血清培养基中收集细胞和/或组织，然后将它们逐步分别接种到具有递减浓度的血清培养基中。

更优选地，本发明的调整方法的特征在于所述方法包括下列四个步骤：

步骤1：75％血清培养基/25％无血清培养基+肽提取物，

步骤2：50％血清培养基/50％无血清培养基+肽提取物，

步骤3：25％血清培养基/75％无血清培养基+肽提取物，

步骤4：100％无血清培养基+肽提取物。

最后，根据最后一个方面，本发明涉及一种将在血清培养基中进行的体外培养调整为在无蛋白培养基中进行培养的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：

步骤1：进行本发明的方法；

步骤2：从无血清培养基中收集细胞和/或组织；

步骤3：将所述细胞和/或组织直接接种到无蛋白质培养基中；

本发明的优势会在实施例和后面的附图中展示，其中：

图1显示了制备本发明的肽提取物的方法的一个具体实施方案的流程图；

图2显示了除菌过滤对本发明的提取物的效果；

图3的柱状图显示了本发明的提取物的浓度对最大细胞密度的效果；

图4显示了将来自血清培养基的VERO细胞调整为含有本发明提取物的无血清培养基和无蛋白质培养基；

图5显示了将来自血清培养基的杂种细胞调整为含有本发明提取物的无血清培养基；

图6展示了将来自血清培养基的CHO K1 dhfr细胞调整到含有本发明提取物的无血清培养基和无蛋白质培养基；

图7A和7B显示了将来自无血清培养基的CHO C5细胞调整到含有本发明提取物的无血清培养基和无蛋白质培养基；

图8显示了在延长CHO C5细胞培养的情况下活细胞浓度的变化；

图9，10和11显示了本发明的提取物对培养的CHO C5细胞产生的干扰素的特定生成率的影响；和

图12显示了本发明的提取物的功能不仅仅与基本氨基酸组成相关，而且与所述氨基酸在肽形式中的组成相关。

实施例

实施例1：用于制备本发明的肽提取物的方法的方案

图1描述了下面所述的方案。更特别地，本实施例根据一个优选的实施方案重申了所有的步骤，描述了该方案的细节。可以理解的是，对于所有本领域技术人员来说，可以对该方法进行各种变化是显而易见的。

步骤1：提取油菜籽蛋白的方案

进行该步骤的方案如下面描述的方式进行。

30kg脱油的油菜籽饼+300L 0.2M的氢氧化钠

|

涡轮式混合器(30min，室温)

↓

饼/碱提取物的混合物

|

卧式螺旋沉降离心机(3500g)

↓

收集提取物并且用盐酸(35％v/v)调整到pH4

|

澄清模式的板式分离器(3000g)

↓

收集沉淀物

|

用水对沉淀物的最后洗涤

↓

油菜籽饼蛋白浓缩物

使用的植物蛋白是脱油的工业粗粉，其是油脂工业(Novance，Compiègne，France)的废弃物，其中含有35％重量的氮原料。从该底物开始，通过用氢氧化钠提取和在蛋白质的pH等电点(pH4)酸沉淀的方法制备蛋白质浓缩物(75％的氮原料)。

用于从油菜籽饼中制备浓缩物的方法的蛋白质总产率约为28％。

所制备的浓缩物的组成如下(见表1)。

表1：制备的浓缩物的成分

	蛋白质	纤维素	脂肪	灰分	其它
	蛋白质	纤维素	脂肪	灰分	其它	含量(％)	75	14	5	3	3

步骤2：水解油菜籽饼蛋白浓缩物的方案

用来源于微生物的酶制剂Alcalase2.4L^_(碱性蛋白酶)，酶浓度/底物浓度比率＝1/10。

浓缩物通过碱性蛋白酶2.4L^_(NovoNordisk，Bagsvaerd，Denmark)的作用，并调节pH(加入氢氧化钠维持在pH9)在恒温搅拌器(60℃)被酶水解。水解5小时后，水解度达到28％(恒pH(pH-stat)技术)，通过将酶失活(90℃持续10min)终止反应。

步骤3：酸沉淀，pH4

然后将在步骤2结束时获得的水解物的pH值降低到4，使得大分子沉淀然后浓缩上清液中的肽。这个新步骤可以去除在下面的过滤步骤中会发生结渣的大分子，并且浓缩相对较小的肽。

步骤4：用截留值(cutoff threshold)为3kDa的膜超滤

此步骤的目的在于通过除去分子量大于3000Da的分子(酚类化合物+多肽)来纯化小分子肽。

此方法使用商业再生纤维素膜来浓缩理论摩尔分子量小于3000g/mol的肽。

步骤5：用截留值为500Da的膜进行纳米过滤

此步骤的目的在于降低由步骤4获得的含有小肽的溶液中的游离氨基酸的量，并且对该溶液脱盐以降低所述混合物的等渗容摩。

这一分离步骤使用含有聚胺/聚砜复合薄膜的膜，可降低80％的盐浓度，从而在下面的步骤6中可以实现根据肽的带电荷对其进行更好的分离。

步骤6：用截留值为1kDa的膜超滤

目的在于根据小肽的分子量(size)和带电荷对其进行分离。

使用常规再生纤维素膜达到分离目的，根据分子量和带电荷数，作为使用所述膜的条件和经步骤5后回收的肽的函数，经步骤5后收集的肽的摩尔分子量理论上可以保持在500到3000g/mol之间。经此步骤后可以得到两个组分：

一种是主要含有摩尔分子量理论上小于1000g/mol的肽的渗透物(permeate)；

一种是滞留物，与渗透物相比，其首先具有较高含量的含有酸性氨基酸的肽，和其次含有较低含量的含有碱性氨基酸的肽。

本发明的目标肽提取物含有通过上述方法中获得的滞留物。

显然，可以对该方法进行改良。通过不受限制的实施例，可能预想在步骤5和6中将pH值调整到4而不是9，或者可选择地去除步骤5。

实施例2：用于鉴定本发明的目标提取物的方案

2.1用凯氏定氮法分析氮

·试剂

矿化催化剂(17％Na₂SO₄；1.5％CuSO₄·5H₂O；1.5％盐)：Prolabo，22550-293

-1N H₂SO₄：Labosi，A4715891

-35％H₂O₂：Labosi，A4823251

-40％NaOH：Merck，191537

-H₃BO₃：Labosi，A4703851

·原料

-Vapodest 4管滴定全自动凯氏定氮仪(Vapodest4 titramaticautomatic Kjeldahl apparatus)：Gerhardt GmbH & Co.KG，Bonn，Germany。

-645多剂量(Multi-dosimat)自动滴定仪：Metrohm，Herisau，Switzerland。

-Kjeldatherm^_KT 12 S矿化砖：Gerhardt GmbH & Co.KG，Bonn，Germany。

·检测方案

用凯氏定氮法测定蛋白质含量。测定方法的原理是：将有机氮转化为硫酸铵(NH₄)₂SO₄形式的无机氮。检测用Vapodest 4S自动进行。对于每一个样品，要分析两次后计算平均值。必须测定空白样，为了在减去之后获得样品中实际含有的总氮值。

结果表示为质量形式的氮浓度，根据下列公式：氮的量(g/l)＝(V-V0)×N×14/E

其中V：滴定样品使用的H₂SO₄的体积，单位为ml，

V0：滴定空白样品时使用的H₂SO₄的体积，单位为ml，

N：H₂SO₄溶液的滴定量(mol/l)，

E：样品的量，单位为mg或ml。

通过油菜籽蛋白的转化系数(6.25)可以获得蛋白质含量，其本身是从这些蛋白质含有的氮含量(16％)计算得出：蛋白质的量＝6.25×氮量。计算结果就是本发明的肽提取物的蛋白质含量，其大约为90％(见后面的表2)。

2.2肽的酸水解和氨基酸的检测

·试剂

-三氯乙酸的50％(w/v)水溶液：Prolabo，20734.295

-9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC-C1)：OSI，A4700.792，

-2.5mg/ml的乙腈：Fluka，23184

-邻苯二甲醛(OPA)：Fluka，79760

-3-巯基丙酸(3-MPA)：Sigma，M-6750

-将每种化合物(OPA和3-MPA)10mg加入到1ml的0.4N硼酸盐缓冲液中，pH10.5：Hewlett-Packard，5061-3339

-氨基酸混合物的标准溶液：Sigma，AA-S-18

-2N NaOH溶液：Fluka，72071

-6N HCl：Labosi，A4715801

洗脱液：

溶剂A：20mM的乙酸钠·3H₂O(OSI，27652.298)，含有0.024％(v/v)的三乙胺(OSI，28 745.296)和0.5％(v/v)的四氢呋喃(OSI，28 556.293)。混合物用乙酸(OSI，20 104.298)调整到pH7.2。

溶剂B：20％(v/v)的100mM乙酸钠缓冲溶液(OSI，27 652.298)，用乙酸调整到pH7.2，40％(v/v)的乙腈和40％(v/v)的甲醇(Prolabo，20 865.322)

·器材

-0.22μm一次性过滤器：Schleicher & Schuell，Dassel，Germany

-700型培养箱：Memmert，Schwabach，Germany

-Hypersil C18柱：Interchim，H5 C18-20R，Monlucon，France

-HP 1090色谱系统：Hewlett Packard，Palo Alto，United States。

·方法

先进行肽组分的酸水解，以获得游离氨基酸的均匀混合物。将1g或1ml的样品放到被塞住的检验试管中。然后加入4ml的氢氯酸(6N)，随之将检验试管在密封前放置到氮气中。在培养箱中110℃水解反应24小时。冷却后，通过加入4N氢氧化钠将水解物调整到大约pH值6的中性状态。将样品最后通过0.22um的注射式过滤器过滤。

酸水解的缺陷在于它破坏了色氨酸，并且将谷氨酰胺和天冬酰胺分别转化为谷氨酸和天冬氨酸。可以在碱水解后通过铁交换色谱来分析色氨酸(Hugli T.E.et al.，1972，Determination of the tryptophan contentof peroteins by ion exchange chromatography of alkaline hydrolysates(，Ibid.，247，2828-2834)。考虑到油菜籽中的色氨酸的量非常少(GodonB.，1996，Les méthods courantes de laboratoire pour la séparation etl’analyse des protéins végétales[Current laboratory methods for theseparation and analysis of plant proteins].In：publisher Lavoisier.Protéinesvégétales[Plant proteins]，65-80)，这种氨基酸不能被分析。至于谷氨酰胺和天冬酰胺，它们的量可以与对应的酸性氨基酸整合得出，其形式为Glx和Asx(Glx＝Gln+Glu，Asx＝Asn+Asp)。

·方案

在邻苯二甲醛(OPA)和9-芴基甲基氯甲酸酯(FMOC)存在下衍生化后，通过反向液相色谱分析氨基酸和丙氨酰-谷氨酰和甘氨酰-谷氨酰二肽。衍生化的原则如下所述：在OPA和3-巯基丙酸(3-MPA)存在的条件下加入伯氨基酸，生成异吲哚，异吲哚是高荧光性的并且在UV范围(338nm)内被吸收(Godel等.，1992，Automated amino acidanalysis using combined OPA and FMOC-C1 precolumn derivatization，LC-GC INTL.，5，44-49)。

根据相同的原理，在FMOC存在的条件下仲氨基酸被衍生化，生成衍生物，该衍生物是高荧光性的并且在UV范围内(262nm)被吸收。检测阈值为100pmol。

通过使用Hewlett Packard HP 1090液相色谱系统可以使样品自动衍生化。3ul的样品先用1.5ul的2N NaOH全部调整到中性，从而实现完全的衍生化。然后将全部衍生物与6.0ul的0.4N硼酸盐缓冲液、2.5ul的OPA+3-MPA溶液和2.5ul的FMOC溶液混合。混合持续15min以实现衍生化作用；最后，将全部衍生物注入到Hypersil C18层析柱上。洗脱溶剂是先100％A溶液洗脱17min，然后用40％的A溶液和60％的B溶液洗脱1min，最后，用100％的B溶液洗脱7min。氨基酸根据它们的极性被分离；最大极性的在分析开始时就被从柱上洗脱下来，而极性最小的在分析结束时被从柱上洗脱下来。当它们被从柱上洗脱下来后，伯氨基酸和二肽通过用UV分析仪在338nm处检测，仲氨基酸通过用UV分析仪在262nm处测定。总分析时间为25min。

根据同样的方法测定游离氨基酸的量，但是省略了酸水解的步骤。

在分析样品前，含有17种氨基酸的三种溶液其浓度分别为0.25，0.5和2.5mM被衍生化并且没经预先用2N NaOH调整到中性就注入到柱上。所得结果为每种氨基酸建立标准范围图，其可用于在对峰积分后测定样品中含有的每种氨基酸的浓度(Hewlett Packard系统)。

2.3固体分析

通过在干燥箱中将样品(1-5g)温度升高到105℃，直到样品总量不再变化，从而测定含水量。

2.4用分子排阻色谱法测定肽的大小

·器材

-Superdex肽HR10/30柱(7000-200Da)：Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden

-0.22um Minisart RC 25过滤器：Sartorius，Goettingen，Germany

-真空过滤设备，烧结的玻璃漏斗SM 16309：Sartorius，Goettingen，Germany

-BioCAD^_700^E色谱系统：Applied Biosystems，Foster City，UnitedStates

-203B型组分收集器：Gilson，Middleton，United States.

·方法

操作条件如下：

-洗脱液：ACN/H₂O/TFA(40/60/0.1-v/v/v)，通过0.45um过滤

-用氦气脱气的溶剂：5ml/min

-洗脱液的流速：0.6ml/min

-柱温：室温(25℃)

-测定：紫外214nm

-注射体积：50ul

-分析时间：45min

洗脱柱用已知分子量的肽预先调准。作为持续时间的函数绘制摩尔分子量的对数图可以获得两条直线。确定分子的摩尔分子量(MM)和它们在柱上的持续时间之间的联系可以用来根据不同组分中含有的肽的大小定义分布。

2.5酚类化合物的分析

组分中酚类化合物的量可以作为芥子酸当量物进行估计。芥子酸(Sigma，D 7927)，摩尔分子量为224g/mol，可以用作参考物，因为它是油菜籽饼中含量最多的酚酸(在70-90％之间，根据Naczk M.Et al.，1992，Recovery of rapeseed tannins by various solvent systems，FoodChem.，45，51-54。

用与在分子排阻高效液相色谱中所使用的同样的色谱条件进行校准和检测，除了设定的检测波长不同，在该情况下为310nm，这对应于该酸的最大吸收波长(Sakakibara H.Et al.，2003，Simultaneousdetermination of all polyphenols In vegetables，fruits and teas，J.Agric.Food Chem.，51，571-581)。每个组分中的酚类化合物的总量用芥子酸当量(mg)/100g固含量表示。游离酚类化合物的含量通过计算与用于建立校准曲线的标准相同的持续时间(34-37min)的峰面积的比例而得出。

实施例2的结果在下表中给出：

肽提取物中的氮原料和酚类原料的组成(见表2)

表2：

	肽含量	游离氨基酸/PM％	多酚的量(mg/100g S)
	肽含量	游离氨基酸/PM％	多酚的量(mg/100g S)	提取物	90％	3％	31％单宁65％结合的酚酸4％游离酚酸

PM：肽原料；S：固体

肽分子量分布(以总肽原料计)：

(见表3)

表3

分子量(Da)	＞5000	5000-1000	1000-500	＜500
分子量(Da)	＞5000	5000-1000	1000-500	＜500	提取物	0％	20％	23％	57％

肽提取物中的氨基酸组成(3次分析)：

(见表4)

表4

aa	％	％	％
aa	％	％	％	AsxGlxSerHisGlyThrAlaArgTyrCysValMetPheIleLeuLysPro	1317739747207134745	1217739747307134745	1220529557308034746
	100	100	100	AsxGlxSerHisGlyThrAlaArgTyrCysValMetPheIleLeuLysPro	1317739747207134745	1217739747307134745	1220529557308034746

Asx：天冬氨酸+天冬酰胺

Glx：谷氨酸+谷氨酰胺

在后面的实施例4-9中，除非文中特别提及，所有都是在下列培养基中培养CHO-C5细胞：

对照培养基(○)＝RPMI 1640(Sigma)+BITS+ET+谷氨酰胺

所需(desired)培养基(△)＝对照培养基+4g/l的根据本发明的肽提取物。

实施例3：除菌过滤的效果

所使用的培养系统包括125ml Erlenmeyer烧瓶，Vu＝25ml。

CHO-C5细胞在对照培养基(○)或所需培养基(△)中培养，培养基用0.22um的过滤器经过1次(开放式)或3次(固体式)过滤除菌。

所得结果见图2。

从后者可以看出，当进行0.22um过滤时，根据本发明的肽提取物的效果没有降低。

实施例4：本发明的肽提取物的“冷冻保护”效果(见表5)

使用的培养系统包括静态培养烧瓶。

表5

	在-196℃耐受的贮藏时间
	在-196℃耐受的贮藏时间					1周	1个月	5个月
解冻后并再次放置在培养基中的时间(h)	0 24 48 96	0 24 48 96	0 24 48 96 120			1周	1个月	5个月
解冻后并再次放置在培养基中的时间(h)	0 24 48 96	0 24 48 96	0 24 48 96 120	存活率％	对照培养基所需培养基	61 44 60 8164 52 56 85	46 33 36 6558 46 55 74	44 34 36 53 7239 38 45 68 92

可以观察到，在根据本发明的提取物存在的条件下，经冷冻的细胞的可被较好回收。此性质对于实际生产中有着尤其重要的作用，因为细胞通常是经冷冻后，然后解冻以被如保藏或运输。

实施例5：本发明的提取物的浓缩物对最大细胞密度的影响

使用的培养系统包括96-孔板，Vu＝200ul。用细胞图像分析仪(Innovatis)跟踪监测细胞的生长。

所得结果已在图3中示出。

结果显示4g/l的浓缩物能提供最好的效果。浓缩物的浓度太高会危害生长。不希望被任何理论束缚，发明者认为抑制剂或毒性化合物的浓缩物能破坏活化剂的积极作用。

实施例6：与各种细胞调整相关的检测分析

6.1从含有10％血清的培养基转换到含有本发明的肽提取物的不含血清的培养基

使用的培养系统包括静态培养烧瓶。

6.1.1.VERO细胞(黏附细胞)

使用的碱性培养基是αMEM。所述调整为突然调整。所得结果见图4。

连续传代(passage)VERO细胞，用曲线(△)表示，展示了在本发明的提取物存在的条件下的调整过程。曲线(○)演示了缺少该提取物的细胞的调整过程。从D0到D17，FCS从10％减少到1％。在D17，FCS是被突然除去的，并且用混合物(根据本发明的肽提取物，BITS，ET，Q)代替。在D36中，BITS被除去。

从结果可以看出，在本发明的肽提取物不存在的条件下，调整是不可能的(在两个传代内细胞就死亡)。在所述提取物和BITS存在的条件下，细胞的调整过程是快速的(从第三个传代阶段开始恢复生长)。在相同提取物存在而无动物蛋白的情况下(无蛋白培养基)，调整可能有些困难，但仍然是可能的。

在BITS和肽提取物存在和无血清的条件下，VERO细胞保持黏附。当移走BITS时，这些细胞也保持黏附，但是程度降低(胰酶消化作用需要的时间明显减短)。

6.1.2杂交细胞(在悬浮液中的细胞)

使用的碱性培养基是RPMI。

突然调整

在突然调整的情况下，当用混合物(肽提取物+BITS+ET+Q)直接代替FCS时很快可以观察到细胞的死亡。

逐步调整

连续传代杂交细胞。结果见图5，其中曲线(△)显示了在本发明的肽提取物存在的条件下细胞的调整过程，曲线(○)显示了本发明的提取物不存在的条件下细胞的调整过程。从D0到D17，FCS从10％降低到1％。从D17到D35，FCS是逐步去除的，并且用混合物(肽提取物，BITS，ET，Q)取代。在D47，去除了BITS。

结果可以看出，在不存在肽提取物的条件下，调整是不可能的(在25％/75％混合物中，细胞在2个传代内死亡)。在提取物和BITS存在、无血清的条件下，杂交细胞可以准确地调整(在第四个传代恢复)。除去动物蛋白(BITS)导致细胞的立即死亡。

6.1.3 CHO K1 dhfr^-(CHO DUXB11)(在悬浮液中的细胞)

使用的碱性培养基是αMEM+ribo-和脱氧核糖核苷类。

突然调整

观察到与杂交细胞相同的情况(数据未示出)。

逐步调整

进行数个CHO K1 dhfr^-细胞的连续传代。图6展示了结果，其中曲线(△)显示了在肽提取物存在的条件下的调整，而曲线(○)展示了肽提取物不存在的条件下细胞的调整过程。从D0到D12，FCS从10％降低到2％。从D12到D40，FCS是逐步去除的，并且用混合物(肽提取物，BITS，ET，Q)代替。在D40，去除了BITS。

从结果可以看出，在不存在肽提取物的条件下，调整是不可能的(在25％/75％混合物中，细胞在三个传代阶段内死亡)。在提取物和BITS存在、无血清的条件下，CHO K1细胞可以准确地调整(从第1传代恢复)。去除动物蛋白(BITS)导致生长缓慢和更长的调整期(大约6个传代阶段)，但是仍然可以调整。

6.2从无血清培养基(对照)转换到含有肽提取物的无血清培养基(所需培养基或不含动物来源蛋白质的所需培养基)

6.2.1CHO C5的连续传代培养(在悬浮液中的细胞)

使用的培养系统包括静态培养烧瓶。在对照培养基(○)中、在所需培养基中(△)和在所需的无动物蛋白质的培养基中(×)进行数个CHO C5细胞的连续传代培养。从对照培养基得到的结果见图7A。从所需培养基得到的结果见图7B。

从这些图可以看出，细胞对所需培养基的调整适应和肽提取物的积极作用保持了至少7个传代阶段。同样地，细胞在无动物蛋白质培养基中的繁殖所获得的细胞浓度与在对照培养基中培养至少7个传代阶段所获得的浓度相近。

结论是根据本发明的无蛋白质培养基能被用作保存细胞的常规培养基，而且由于细胞仅需要每3天转接一次(对照培养基是2天转接一次)，所以更是如此。

6.2.2长期培养的动力学(在悬浮液中的细胞)

使用的培养系统包括500ml的旋转器(spinners)，Vu＝160ml。

没有预先调整，在进行CHO C5细胞培养的过程中，活体细胞的浓度变化见图8。更优选地，图显示了在对照培养基(○)，无BITS(-)的对照培养基，在所需培养基(△)和在不含有BITS的所需培养基(×)中的培养过程。

从结果可以清楚地看到，当对照培养基除去动物蛋白之后对照培养基不再适合细胞生长。所需培养基事实上可以使最大浓度增加一倍。进一步的，培养的持续时间(在活体细胞明显消失前)被增加了3倍。

当动物蛋白被除去后，所需培养基仍能使细胞生长。在缺少动物蛋白而存在肽提取物的条件下，最大细胞浓度没有得到提高，但是培养的时间相对于对照培养基延长了2倍。

实施例7：肽提取物对干扰素特定生成率的影响

使用的培养系统包括2升的细胞培养器，可使用体积Vu＝1.2升。

图9展示了CHO C5细胞在对照培养基(○)和目标培养基(△)中的生长动力学曲线。

图10部分展示了由同样的CHO C5细胞在对照培养基中(○)和目标培养基(△)中产生IFN(γ干扰素)的动力学曲线。

最后，图11展示了由CHO C5细胞在对照培养基(虚线)和所需培养基(实线)中产生干扰素的特定生成率。

→肽提取物对活体细胞的积极作用经实验室反应证实(^*3.3)。

→最终IFN的产量(^*5.3)有巨大的提高。

→这种提高可能是活体细胞增加的协同结果，也是特定生成率增加的协同结果(最大值实际上被增加了一倍)。

实施例8：对不仅与基本氨基酸的组成相关、而且与所述氨基酸在其肽形式中的组成有关的功能的说明

使用的培养系统包括500ml的旋转器，Vu＝160ml

图12是在旋转器中的在对照培养基(○)、补充了游离氨基酸的对照培养基(×)和所需培养基(△)中培养的CHO C5活体细胞的动力学曲线。游离氨基酸对应于在肽提取物中存在的总氨基酸(肽和游离)。

以与肽提取物存在的比例相同的比例加入氨基酸(以肽的形式)并不能使活体细胞浓度升高。另一方面，其对延长培养时间的积极作用值得一提。单独氨基酸的组成与使用的肽提取物的肽混合物的组成相同，有助于保持细胞存活(^*3与对照培养基比较)。

肽提取物不仅通过使活体细胞数量加倍而提高了细胞数量，而且还提高了细胞的活性(与对照培养基+游离氨基酸相比，存活时间延长了50％，使用在该情况下得到的最大细胞浓度作为参考点)。这些结果没有显示出它们仅由与总氨基酸的组成相关的效果产生的。它们也是由于具有特定组成、在本发明的肽提取物中的某些肽的存在衍生出来的“生长因子”效应导致的。

Claims

1.肽提取物用于制备和/或补充无血清的体外细胞或组织培养基的用途，所述提取物由连续分离植物原料获得，其特征在于所述植物原料包括油菜籽。

2.肽提取物用于制备和/或补充无蛋白质的体外细胞或组织培养基的用途，所述提取物由连续分离植物原料获得，其特征在于所述植物原料包括油菜籽。

3.根据权利要求1和2任一所述的用途，其特征在于所述的肽提取物具有提高细胞和组织浓度和/或提高细胞寿命和/或提高一种或多种所需分子的特定生成率的功能，所述功能不仅受基本氨基酸组成限制，而且受所述氨基酸在肽形式中的组成限制。

4.根据权利要求1-3任一所述的用途，其特征在于所述植物原料包括油菜籽饼。

5.根据权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于所述肽提取物包括至少80％，优选至少90％质量的氮原料。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于所述氮原料包括大约50％到大约60％的分子量小于500道尔顿的肽。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于所述氮原料包括大约20％到大约30％的分子量为500-1000道尔顿的肽。

8.根据权利要求1-7任一所述的用途，其特征在于所述提取物包括20-40mol％的天冬氨酸和20-40mol％的谷氨酸和/或20-40mol％的它们各自的酰胺。

9.根据权利要求1-8任一所述的用途，其特征在于所述肽提取物包括小于1％质量的酚类化合物。

10.根据权利要求1-9任一所述的用途，其特征在于所述肽提取物有下面总氨基酸组成：

氨基酸 mol％丙氨酸精氨酸天冬氨酸+天冬酰胺半胱氨酸谷氨酸+谷氨酰胺甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸蛋氨酸苯基丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸 2-65-910-14015-197-111-52-65-92-60-31-53-75-95-9未检出1-55-9

11.根据权利要求1-10任一所述的用途，用于培养细胞，其特征在于所述细胞包括真核细胞，优选动物细胞。

12.一种使用权利要求1和3-11任一所述的肽提取物获得的无血清细胞或组织培养基。

13.根据权利要求12所述的培养基，其特征在于它还包括维生素、无机盐、游离氨基酸、有机酸和/或糖。

14.根据权利要求12或13所述的培养基的用途，用于大规模培养细胞或组织。

15.一种无蛋白质的细胞或组织培养基，其是通过使用权利要求2-11任一项所述的肽提取物获得的。

16.根据权利要求15所述的培养基，其特征在于它还包括维生素、无机盐、游离氨基酸、有机酸和/或糖。

17.根据权利要求15和16任一所述的培养基的用途，用于大规模培养细胞或组织。

18.一种在无血清培养基中体外培养细胞或组织的方法，其特征在于它包括将所述细胞或组织接种到含有肽提取物的培养基中，所述肽提取物由连续分离植物原料获得，所述植物原料包括油菜籽。

19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述原料包括油菜籽饼。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其特征在于所述提取物包括至少80％，优选90％质量的氮原料。

21.根据权利要求18-20任一所述的方法，其特征在于所述氮原料包括大约50％到大约60％的分子量小于500道尔顿的肽。

22.根据权利要求18-21任一所述的方法，其特征在于所述氮原料包括大约20％到大约30％的分子量为500-1000道尔顿的肽。

23.根据权利要求18-22任一所述的方法，其特征在于所述提取物包括20-40mol％的天冬氨酸和20-40mol％谷氨酸和/或20-40mol％的它们各自的酰胺。

24.根据权利要求18-23任一所述的方法，其特征在于所述提取物具有下面的总氨基酸组成：

25.一种在无蛋白质培养基中体外培养细胞或组织的方法，其特征在于它包括将所述细胞或组织接种到含有肽提取物的培养基中，所述肽提取物由连续分离植物原料获得，所述植物原料包括油菜籽。

26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于所述原料包括油菜籽饼。

27.根据权利要求25或26所述的方法，其特征在于所述提取物包括至少80％，优选90％质量的氮原料。

28.根据权利要求25-27任一所述的方法，其特征在于所述氮原料包括大约50％到大约60％的分子量小于500道尔顿的肽。

29.根据权利要求25-28任一所述的方法，其特征在于所述氮原料包括大约20％到大约30％的分子量为500-1000道尔顿的肽。

30.根据权利要求25-29任一所述的方法，其特征在于所述提取物包括20-40mol％的天冬氨酸和20-40mol％谷氨酸和/或20-40mol％的它们各自的酰胺。

31.根据权利要求25-30任一所述的方法，其特征在于所述提取物具有下面的总氨基酸组成：

氨基酸 Mol％丙氨酸精氨酸天冬氨酸+天冬酰胺半胱氨酸谷氨酸+谷氨酰胺甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸蛋氨酸苯基丙氨酸脯氨酸丝氨酸苏氨酸色氨酸 2-65-910-14015-197-111-52-65-92-60-31-53-75-95-9未检出

酪氨酸缬氨酸 1-55-9

32.一种直接将在血清培养基中进行的体外培养转换到在无血清培养基中培养的方法，其特征在于它包括从血清培养基中收集细胞和/或组织，然后将它们或它直接接种到如权利要求12或13所述的培养基中。

33.一种将在血清培养基中进行的体外培养调整为在无血清培养基中培养的方法，其特征在于它包括从血清培养基中收集细胞和/或组织，然后将它们逐步分别接种到如权利要求12或13所述的培养基中，所述培养基具有递减的血清浓度。

34.根据权利要求33中所述的调整方法，其特征在于所述调整方法包括下列四个步骤：

-步骤1：75％血清培养基/25％无血清培养基+肽提取物，

-步骤2：50％血清培养基/50％无血清培养基+肽提取物，

-步骤3：25％血清培养基/75％无血清培养基+肽提取物，

-步骤4：100％无血清培养基+肽提取物。

35.一种直接将在血清培养基中进行的体外培养转换到在无蛋白质培养基中培养的方法，其特征在于它包括从血清培养基中收集细胞和/或组织，然后将它们直接接种到如权利要求15或16所述的培养基中。

36.一种将在血清培养基中进行的体外培养调整为在无蛋白质培养基中培养的方法，其特征在于它包括从血清培养基中收集细胞和/或组织，然后将它们各自逐步接种到如权利要求15或16所述的培养基中，所述培养基具有递减的血清浓度。

37.根据权利要求36所述的调整方法，其特征在于所述调整方法包括

下列四个步骤：

-步骤1：75％血清培养基/25％无血清培养基+肽提取物，

-步骤2：50％血清培养基/50％无血清培养基+肽提取物，

-步骤3：25％血清培养基/75％无血清培养基+肽提取物，

-步骤4：100％无血清培养基+肽提取物。

38.一种将在血清培养基中进行的体外培养调整为在无蛋白质培养基中培养的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤：

-步骤1：使用如权利要求32，33和34任一所述的方法；

-步骤2：从无血清培养基中收集细胞和/或组织，

-步骤3：将所述细胞和/或组织直接接种到无蛋白质培养基中。