JP2008522637A - 細胞および/または組織培養における目的の生成物の増殖および合成を促進するペプチド画分 - Google Patents
細胞および/または組織培養における目的の生成物の増殖および合成を促進するペプチド画分 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本工程の目的は、ナタネタンパク質の濃縮物を製造し、ナタネタンパク質が豊富な出発材料(ナタネケーク中30%〜40%に対して、タンパク質物質70%〜80%(固形分比))を得ることである。
本工程の目的は、前記タンパク質を加水分解し、ペプチドからなる溶液を得ることである。
本工程は、加水分解物中に存在する「大きな」分子、本質的には大きなタンパク質およびペプチドを取り除くことを目的とし、それにより、後続のろ過工程中の目詰まりを低減することができる。
本工程の目的は、3000Daよりも大きいサイズの分子(タンニンなどのフェノール化合物およびポリペプチド)を取り除くことにより、小ペプチドを回収することである。使用する方法は、加水分解物に含有される小ペプチドを富化するための従来の膜を使った方法である。
この目的は、工程4の後に得られた小ペプチド溶液中の遊離アミノ酸量を低減し、同溶液を脱塩化することにより、混合物の浸透圧モル濃度を低減することである。従来の脱塩化法が使用される。塩濃度が80%低下することにより、工程5においてペプチドをそれらの電荷に応じてより良好に分画することができる。
本工程は、小ペプチドをそれらのサイズおよび電荷に従って分画することを含む。
−工程1:有血清培地75%/無血清培地+ペプチド抽出物25%、
−工程2:有血清培地50%/無血清培地+ペプチド抽出物50%、
−工程3:有血清培地25%/無血清培地+ペプチド抽出物75%、および
−工程4:無血清培地+ペプチド抽出物100%。
−工程1:有血清培地75%/無血清培地+ペプチド抽出物25%、
−工程2:有血清培地50%/無血清培地+ペプチド抽出物50%、
−工程3:有血清培地25%/無血清培地+ペプチド抽出物75%、および
−工程4:無血清培地+ペプチド抽出物100%。
−工程1: 本発明の主題である方法を実施する工程、
−工程2: 無血清培地から細胞および/または組織を回収する工程、ならびに
−工程3: 前記細胞および/または組織を無タンパク質培地中に直接的に播種する工程。
後述のプロトコルは図1に例証されている。より詳細には、本実施例は、好ましい実施態様の1つに従って、全ての工程を繰り返し、それらの詳細を提供する。当業者に明らかな変形を本方法に導入してもよいことは明らかである。
本工程に関して行われるプロトコルを、下記のスキームに表す。
細菌起源の酵素調製物であるアルカラーゼ(Alcalase)2.4L(登録商標)を、酵素濃度/基質濃度比=1/10で使用する。
次いで、工程2の最後で得られた加水分解物のpHを4まで低下させて、大きな分子を沈殿させ、上澄み中のペプチドを濃縮する。この新たな工程により、後続のろ過工程中の目詰まりの原因となる大きな分子を排除し、比較的小さなペプチドを濃縮することができる。
本工程の目的は、3000Daよりも大きいサイズの分子を排除することによって、小ペプチドを精製することである(フェノール化合物+ポリペプチド)。
本工程の目的は、工程4の後に得られた小ペプチド溶液中の遊離アミノ酸量を低減し、同溶液を脱塩化して、混合物の浸透圧モル濃度を低下させることである。
本目的は、小ペプチドをそれらのサイズおよび電荷に応じて分画することである。
−理論的には1000g/モル未満のモル質量を有するペプチドを本質的に含有する透過物、
−この透過物と比較して、第一には酸性アミノ酸を含有するペプチド含量が高く、第二には塩基性アミノ酸を含有するペプチド含量が低い残留物。
2.1 ケルダール法による窒素アッセイ
・試薬
−鉱化触媒(17% Na2SO4;1.5% CuSO4.5 H2O;1.5%塩類):Prolabo,22550−293
−1N H2SO4:Labosi A4715891
−35% H2O2: Labosi,A4823251
−40% NaOH:Merck,191537
−H3BO3:Labosi,A4703851
−Vapodest 4 titramatic自動ケルダール装置:Gerhardt GmbH&Co.KG(ドイツ、ボン(Bonn))
−645 Multi−dosimat自動滴定システム:Metrohm(スイス、ヘリザウ(Herisau))
−Kjeldatherm(登録商標)KT 12 S 鉱化ブロック:Gerhardt GmbH&Co.KG(ドイツ、ボン(Bonn))。
タンパク質含量は、ケルダール法によって測定された。このアッセイ方法は、有機窒素を、硫酸アンモニウム(NH4)2SO4形態をなす無機窒素へ転換することに基づくものである。本アッセイは、Vapodest 4Sを用いて自動的に行われる。各試料について、分析を二回行うことによって平均値を算出することができる。減算後、試料に実際含有される窒素全体の値を得るために、ブランクについてもアッセイを行うことが必要である。
V:試料を滴定するのに必要なH2SO4容量(単位:ml)、
V0=ブランクを滴定するのに必要なH2SO4容量(単位:ml)、
N:H2SO4溶液力価(mol/l)、
E:試料のサイズ(単位:mgまたはml)。
・試薬
−水中50%(w/v)のトリクロロ酢酸:Prolabo,20734.295
−クロロギ酸9−フルオレニルメチル(FMOC−C1):OSI,A4700.792
−アセトニトリル2.5mg/ml:Fluka,23184
−o−フタルアルデヒド(OPA):Fluka,79760
−3−メルカプトプロピオン酸(3−MPA):Sigma,M−6750
−1mlの0.4Nホウ酸塩緩衝液(pH10.5)中、各化合物(OPAおよび3−MPA)10mg:Hewlett−Packard,5061−3339
−アミノ酸混合物の標準溶液:Sigma,AA−S−18
−2N NaOH溶液:Fluka,72071
−6N HCl:Labosi,A4715801
溶媒A:20mMの酢酸ナトリウム。0.024%(v/v)のトリエチルアミン(OSI,28 745.296)と0.5%(v/v)のテトラヒドロフラン(OSI,28 556.293)とを含有する3H2O(OSI,27652.298)。この混合物を、酢酸(OSI,20 104.298)を用いてpH7.2に調節する。
溶媒B:酢酸を用いてpH7.2に調節された100mMの酢酸ナトリウム緩衝液(OSI,27 652.298)20%(v/v)、アセトニトリル40%(v/v)およびメタノール(Prolabo,20 865.322)40%(v/v)。
−0.22μmの単回用フィルタ:Schleicher&Schuell(ドイツ、ダッセル(Dassel))
−インキュベータモデル700:Memmert(ドイツ、シュワバッハ(Schwabach))
−Hypersil C18カラム:Interchim,H5 C18−20R(フランス、モンリュソン(Montlucon))
−HP 1090クロマトグラフィシステム:Hewlett Packard(米国、パロアルト(Palo Alto))。
ペプチド画分の酸加水分解を事前に行い、遊離アミノ酸の均一な混合物を得る。1gまたは1mlの試料をストッパー付き試験管内に置く。次いで、4mlの塩酸(6N)を添加し、試験管を密封する前に窒素雰囲気下に置く。その後、インキュベータ内で110℃にて24時間加水分解を行う。冷却後、4N水酸化ナトリウムを添加することにより、加水分解物をpHが約6になるように中和する。最終的に、0.22μmのシリンジフィルタで試料をろ過する。
アミノ酸およびアラニル−グルタミンおよびグリシル−グルタミンジペプチドを、o−フタルアルデヒド(OPA)およびクロロギ酸9−フルオレニルメチル(FMOC)の存在下で誘導体化した後、逆相液体クロマトグラフィによりアッセイする。誘導体化の原理は以下の通りである。第1級アミノ酸をOPAおよび3−メルカプトプロピオン酸(3−MPA)の存在下に置き、UV範囲(338nm)において高度に蛍光性であると共に吸収性であるイソインドールを得る(Godel et al., 1992, Automated amino acid analysis using combined OPA and FMOC-C1 precolumn derivatization, LC-GC INTL., 5, 44-49)。
試料(1g〜5g)を、一定質量が得られるまでインキュベータ内で105℃に保つことによって水分含量を測定した。
・材料
−SuperdexペプチドHR 10/30カラム(7000−200Da):Amersham Biosciences(スウェーデン、ウプサラ(Uppsala))
−0.22μmのMinisart RC 25フィルタ:Sartorius(ドイツ、ゲッティンゲン(Goettingen))
−真空ろ過装置、焼結ガラス漏斗SM 16309:Sartorius(ドイツ、ゲッティンゲン(Goettingen))
−BioCAD(登録商標)700Eクロマトグラフィシステム:Applied Biosystems(米国、フォスターシティ(Foster City))
−画分収集器モデル203B:Gilson(米国、ミドルトン(Middleton))
操作条件は以下の通りである:
−溶離剤:0.45μmでろ過したACN/H2O/TFA(40/60/0.1−v/v/v)
−ヘリウムで脱気した溶媒:5ml/分
−溶離剤流速:0.6ml/分
−カラム温度:周囲温度(25℃)
−検出:214nmのUV
−射出容量:50μl
−分析時間:45分
画分内のフェノール化合物量をシナピン酸当量として推定した。モル質量224g/モルのシナピン酸(Sigma,D 7927)を参照として使用した。その理由は、Naczk M. et al., 1992, Recovery of rapeseed tannins by various solvent systems, Food Chem., 45, 51-54によれば、シナピン酸が、ナタネケークに主として存在する(70%〜90%)フェノール酸であるからである。
ペプチド抽出物の窒素性物質およびフェノール物質の組成:
(表2を参照)
(表3参照)
(表4参照)
参照培地(o)=RPMI 1640(Sigma)+BITS+ET+グルタミン;
目的の培地(Δ)=参照培地+本発明によるペプチド抽出物4g/l。
使用する培養システムは、125mlのエルレンマイヤーフラスコ(Vu=25ml)からなる。
(表5を参照)
使用する培養システムは、静置培養フラスコからなる。
使用する培養システムは、96ウェルプレート(Vu=200μl)からなる。Cellscreen装置(Innovatis)を用いて成長を行った。
6.1.10%の血清を含む培地から、本発明による抽出物を含有する無血清培地への移行
使用した培養システムは、静置培養フラスコからなる。
使用した基礎培地はαMEMである。実施した適応は、急激な適応である。得られた結果を図4に示す。
使用する基礎培地はRPMIである。
急激な適応の場合、FCSを混合物(ペプチド抽出物+BITS+ET+Q)と急激に置換すると、細胞死が迅速に観察される。
ハイブリドーマ細胞の連続継代培養が実施された。得られた結果を図5に示す。同図において、曲線(Δ)は、本発明による抽出物の存在下での適応を示し、曲線(o)は、本発明による抽出物の不存在下での細胞の適応を示す。D0からD17まで、FCSを10%から1%まで低下させる。D17からD35まで、FCSを徐々に取り除き、混合物(ペプチド抽出物、BITS、ET、Q)と交換する。D47で、BITSを取り除く。
使用した基礎培地は、αMEM+リボ核酸およびデオキシリボ核酸である。
ハイブリドーマ細胞の場合と同じ観察が報告される(データは示さず)。
CHO K1 dhfr−細胞の数種の連続継代培養が実施された。得られた結果を図6に示す。同図において、曲線(Δ)は、ペプチド抽出物の存在下での適応を示し、一方、曲線(o)は、ペプチド抽出物の不存在下での細胞の適応を示す。D0からD12まで、FCSを10%から2%まで低下させる。D12からD40まで、FCSを徐々に取り除き、混合物(ペプチド抽出物、BITS、ET、Q)と交換する。D40で、BITSを取り除く。
6.2.1.CHO C5の連続継代培養(懸濁細胞)
使用する培養システムは、静置培養フラスコからなる。CHO C5細胞の数種の連続継代培養を、参照培地(O)、目的の培地(Δ)および動物タンパク質を含まない目的の培地(x)において実施した。参照培地について得られた結果を図7Aに示す。目的の培地について得られた結果に関し図7Bに示す。
使用した培養システムは500mlのスピナー(Vu=160ml)である。
使用した培養システムは、2リットルの細胞培養器(使用可能容量Vu=1.21)からなる。
→ペプチド抽出物が生細胞に与える好ましい効果は、反応器のスケールで確認される(*3.3)。
→最終IFN産生の大幅な増加(*5.3)が認められる。
→この増加は、生細胞の増加だけでなく、特定産生率の増大(最大値が事実上倍増)の組み合わせた結果であり得る。
使用する培養システムは、500mlのスピナー(Vu=160ml)からなる。
Claims (38)
- 無血清in vitro細胞または組織培養培地を調製および/または補充するためのペプチド抽出物の使用であって、該抽出物が植物出発材料の連続分画によって得られるものであり、該植物出発材料がナタネからなるものである、使用。
- 無タンパク質in vitro細胞または組織培養培地を調製および/または補充するためのペプチド抽出物の使用であって、該抽出物が植物出発材料の連続分画によって得られるものであり、該植物出発材料がナタネからなるものである、使用。
- 前記ペプチド抽出物が、細胞または組織濃度の増加、および/または前記細胞の寿命の延長、および/または1つ以上の目的分子の特定産生率に関する機能を発揮するものであり、該機能が、構成アミノ酸組成だけでなく、ペプチド形態での前記アミノ酸の組成にも制約されるものである、請求項1または2に記載の使用。
- 前記植物出発材料がナタネケークからなるものである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用。
- 前記ペプチド抽出物が、少なくとも80質量%、好ましくは少なくとも90質量%の窒素物質からなるものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用。
- 前記窒素物質が、500ダルトン未満の分子サイズを有する約50%〜約60%のペプチドからなるものである、請求項5に記載の使用。
- 前記窒素物質が、500ダルトン〜1000ダルトンの分子サイズを有する約20%〜約30%のペプチドからなるものである、請求項5または6に記載の使用。
- 前記抽出物が、20モル%〜40モル%のアスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに/またはそれら各々のアミドを含むものである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の使用。
- 前記ペプチド抽出物が、1質量%未満のフェノール化合物を含むものである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用。
- 細胞を培養するための、請求項1〜10のいずれか一項に記載の使用であって、前記細胞が、真核細胞、好ましくは動物細胞からなるものである、使用。
- 請求項1および3〜11のいずれか一項に記載のペプチド抽出物の使用によって得られる、無血清細胞または組織培養培地。
- ビタミン類、無機塩類、遊離アミノ酸類、有機酸類および/または糖類をさらに含んでなる、請求項12に記載の培養培地。
- 細胞または組織のバルク培養のための、請求項12または13に記載の培養培地の使用。
- 請求項2〜11のいずれか一項に記載のペプチド抽出物の使用によって得られる、無タンパク質細胞または組織培養培地。
- ビタミン類、無機塩類、遊離アミノ酸類、有機酸類および/または糖類をさらに含んでなる、請求項15に記載の培養培地。
- 細胞または組織のバルク培養のための、請求項15または16に記載の培養培地の使用。
- 血清を含まない培地におけるin vitro細胞または組織培養の方法であって、植物出発材料の連続分画によって得られるペプチド抽出物を含む培地中に前記細胞または組織を播種することからなり、前記植物出発材料がナタネからなるものである、方法。
- 前記植物出発材料がナタネケークからなるものである、請求項18に記載の方法。
- 前記抽出物が、少なくとも80質量%、好ましくは少なくとも90質量%の窒素物質からなるものである、請求項18または19に記載の方法。
- 前記窒素物質が、500ダルトン未満の分子サイズを有する約50%〜約60%のペプチドからなるものである、請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記窒素物質が、500ダルトン〜1000ダルトンの分子サイズを有する約20%〜約30%のペプチドからなるものである、請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抽出物が、20モル%〜40モル%のアスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに/またはそれら各々のアミドを含むものである、請求項18〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 無タンパク質培地におけるin vitro細胞または組織培養の方法であって、植物出発材料の連続分画によって得られるペプチド抽出物を含む培地中に前記細胞または組織を播種することからなり、前記植物出発材料がナタネからなるものである、方法。
- 前記植物出発材料がナタネケークからなるものである、請求項25に記載の方法。
- 前記抽出物が、少なくとも80質量%、好ましくは少なくとも90質量%の窒素物質からなるものである、請求項25または26に記載の方法。
- 前記窒素物質が、500ダルトン未満の分子サイズを有する約50%〜約60%のペプチドからなるものである、請求項25〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 前記窒素物質が、500ダルトン〜1000ダルトンの分子サイズを有する約20%〜約30%のペプチドからなるものである、請求項25〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抽出物が、20モル%〜40モル%のアスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに/またはそれら各々のアミドを含むものである、請求項25〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 有血清培地におけるin vitro培養を、無血清培地における培養へ直接的に移行するための方法であって、前記有血清培地から前記細胞および/または組織を回収し、これを、請求項12または13に記載の培地中に直接的に播種することからなる、方法。
- 有血清培地におけるin vitro培養を、無血清培地における培養に適応させるための方法であって、前記有血清培地から前記細胞および/または組織を回収し、これを、請求項12または13に記載の培地中に段階的に播種することからなり、該培地の血清濃度が順に低下するものである、方法。
- 以下の4つの工程:
−工程1:有血清培地75%/無血清培地+ペプチド抽出物25%、
−工程2:有血清培地50%/無血清培地+ペプチド抽出物50%、
−工程3:有血清培地25%/無血清培地+ペプチド抽出物75%、および
−工程4:無血清培地+ペプチド抽出物100%、
を含んでなる、請求項33に記載の適応方法。 - 有血清培地におけるin vitro培養を、無タンパク質培地における培養へ直接的に移行するための方法であって、前記有血清培地から前記細胞および/または組織を回収し、これを、請求項15または16に記載の培地中に直接的に播種することからなる、方法。
- 有血清培地におけるin vitro培養を、無タンパク質培地における培養に適応させるための方法であって、前記有血清培地から前記細胞および/または組織を回収し、これを、請求項15または16に記載の培地中に段階的に播種することからなり、該培地の血清濃度が順に低下するものである、方法。
- 以下の4つの工程:
−工程1:有血清培地75%/無血清培地+ペプチド抽出物25%、
−工程2:有血清培地50%/無血清培地+ペプチド抽出物50%、
−工程3:有血清培地25%/無血清培地+ペプチド抽出物75%、および
−工程4:無血清培地+ペプチド抽出物100%、
を含んでなる、請求項36に記載の適応方法。 - 有血清培地におけるin vitro培養を、無タンパク質培地における培養に適応させるための方法であって、以下の工程:
−工程1:請求項32〜34のいずれか一項に記載の方法を実施する工程、
−工程2:前記無血清培地から前記細胞および/または組織を回収する工程、ならびに
−工程3:前記細胞および/または組織を、無タンパク質培地内へ直接的に播種する工程
を含んでなる、方法。
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