JP2012518409A - タンパク質の組み合わせを含有する細胞培養培地 - Google Patents

タンパク質の組み合わせを含有する細胞培養培地 Download PDF

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Abstract

本発明は、タンパク質の組み合わせを含有する細胞培養培地、ならびにそれらの細胞培養培地を作製する方法、および培養細胞の成長特性を改善するためにそれらの細胞培養培地を使用する方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、タンパク質の組み合わせを含有する細胞培養培地、ならびにそれらの細胞培養培地を作製する方法、および培養細胞の成長特性を改善するためにそれらの細胞培養培地を使用する方法に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２００９年２月２０日に出願された、米国特許仮出願第６１，１５４，２０４号の利益を主張し、その全体の内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
細胞培養技術は、組織から除去された動物または植物細胞が、適切な栄養素および状況を提供された時に成長することを可能にする。細胞は分裂することができ、栄養枯渇または毒性蓄積等の培養変数によって制限されるまで成長し続けることができる（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｍ．＆ Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｈ．，“Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，”Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９８９）１２：９７−１１０）。細胞培養技術は、細胞の通常の生理学または生化学の研究（Ｂａｌａｂａｎ，Ｂ．＆ Ｕｒｍａｎ，Ｂ．，“Ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｓ ａ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｏｏｌ，”Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ（２００３）７（６）：６７１−８２）、特定の細胞型への多様な化学化合物または薬物の効果を試験すること（Ｆａｒｋａｓ，Ｄ．＆ Ｔａｎｎｅｎｂａｕｍ，Ｓ．Ｒ．，“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ａ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗ，”Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．（２００５）６（２）：１１１−２５）、人工組織を生み出すために、多様な細胞型の逐次的または同時の組み合わせを研究すること（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｓｉｌｋ ｓｃａｆｆｏｌｄｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，”Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（２００６））、ならびに大規模の細胞培養物から有益な生物製剤を合成すること（Ｚｅｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｒｕｇ ｓｔｕｄｉｅｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｎ ｔｈｅ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，”Ａｌｔｅｒｎ．Ｌａｂ Ａｎｉｍ．（２００２）３０（５）：５２５−３８）を含む多数の適用を有する。細胞培養技術はまた、体外受精（Ｂｌａｋｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｕｐｐｌｉｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩＶＦ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ，”Ｊ Ａｓｓｉｓｔ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｇｅｎｅｔ．（２００２）１９（３）：１３７−４３、Ｂｕｎｇｕｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｌｂｕｍｉｎ ａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｕｒｃｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＩＶＦ：ａ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｓｔｕｄｙ，”Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｎｌｉｎｅ（２００２）４（３）：２３３−６）幹細胞研究（Ｃｏｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ，ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００４）３６（４）：５５５−６７）、ワクチン産生（Ｃｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ａｌｂｍｉｎ，”Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（２００２）１９（５）：５６９−７７、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，ＨＡＶＲＩＸ（登録商標）（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ）−Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２００５）、ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｇｓｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ａｓｓｅｔｓ／ｕｓ＿ｈａｖｒｉｘ．ｐｄｆから入手可能、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｂｙ ａｎ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ，”ＪＡＭＡ（１９９４）２７１（１７）：１３２８−３４、Ｍｅｒｃｋ，ＰＲＯＱＵＡＤ（登録商標）−Ｍｅａｓｌｅｓ，Ｍｕｍｐｓ，Ｒｕｂｅｌｌａ，ａｎｄ Ｖａｒｉｃｅｌｌａ（Ｏｋａ／Ｍｅｒｃｋ）Ｖｉｒｕｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｌｉｖｅ−Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２００５）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｕｓａ／ｐｉ＿ｃｉｒｃｕｌａｒｓ／ｐ／ｐｒｏｑｕａｄ／ｐｒｏｑｕａｄ＿ｐｉ．ｐｄｆから入手可能、Ｌｉｔｗｉｎ，Ｊ．，“Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｖｅｒｏ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｓ ｃｅｌｌ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ｉｎ ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ，”Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０（２）：１６９−７４）、人工皮膚を含む組織工学（Ａｔａｌａ，Ａ．，“Ｆｕｔｕｒｅ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｓｕｒｇｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．（１９９９）２６（１）：１５７−６５，ｉｘ−ｘ、Ｓｈｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｅｒｌｅｃａｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｎｏｖｅｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ ｐｅｒｌｅｃａｎ ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，”Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００６）２８１（８）：５１７８−８７）、および臓器（Ｎｅｒｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｉｎ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｏｒｎｅａ，”Ｃｒｙｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５）２６（２）：１３１−６、Ｈａｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ，”Ｓｕｒｇｅｒｙ（２００５）１３８（５）：９３２−９）、ならびに遺伝子および細胞療法（Ｃｈａｄｄ，Ｈ．Ｅ．＆ Ｃｈａｍｏｗ，Ｓ．Ｍ．，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）１２（２）：１８８−９４）にも使用されている。
生物製剤は、広範囲の細胞産物を包含し、増殖のために動物細胞を必要とする特定のタンパク質またはウイルスを含む。例えば、モノクローナル抗体等の治療用タンパク質は、大規模培養で遺伝子操作された細胞を生育させることによって、大量に合成することができる（Ｄｅｗａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｉｌａｒ Ｊ（２００５）４６（３）：３０７−１３）。そのような商業的に有益な生物製剤の数は、過去１０年で急速に増加しており、哺乳類細胞培養科学技術への現在の広範な関心につながっている（Ｍｉｚｒａｈｉ，Ａ．，“Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ-ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ，”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．（１９８８）６（２）：２０７−２０）。
上の適用のいずれにおいていも、細胞培養を使用する主な利点は、クローン細胞のバッチを使用することで得ることができる結果の一貫性および再生産性である。特に大規模での細胞培養の必要性は、ウイルスワクチンの必要性とともに明らかになった。１９４０年代および１９５０年代の大規模なポリオの流行によって、効果的なワクチンの開発努力が奨励された。１９４９年、ポリオウイルスがヒト細胞の培養物中で成長可能であることが示され、それは、細胞培養を使用する大量のポリオワクチンの開発への重要な関心につながった（Ｌｉｇｏｎ，Ｂ．Ｌ．，“Ｔｈｏｍａｓ Ｈｕｃｋｌｅ Ｗｅｌｌｅｒ ＭＤ：Ｎｏｂｅｌ Ｌａｕｒｅａｔｅ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｉｏｎｅｅｒ ｉｎ ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，Ｖａｒｉｃｅｌｌａ−ｚｏｓｔｅｒ ｖｉｒｕｓ，ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ｒｕｂｅｌｌａ，ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｓｅｍｉｎ．Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００２）１３（１）：５５−６３）。不活性ウイルスから産生されたポリオワクチンは、動物培養細胞の最初の商用産物の１つとなった（Ｆｕｒｅｓｚ，Ｊ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ 質 ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓｓ-Ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，”Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（２００６））。
動物由来細胞培養培地成分の使用に関連する安全性および道徳的配慮によって、細胞培養培地および培地成分に対する代替源を提供する努力がされている。
２００６年６月２８日に出願された、米国仮出願第６０／６９４，２３６号に基づいた、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ２００７／００２７６２号は、植物細胞を使用する細胞培養培地の成分の組換え生産、およびそのような組換えタンパク質を含有する細胞培養培地に関する。この出願の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
したがって、細胞培養中に使用された時に、培養細胞の改善された成長および／または生産性をもたらす、タンパク質成分の組み合わせを含有する細胞培養培地または培地栄養補助剤を提供することが、本発明の目的である。
本発明の一実施形態は、細胞培養培地基材と、成長因子、ラクトフェリン、トランスフェリン、アルブミン、インスリン、成長ホルモン、フィブロネクチン接合因子、ラミン接合因子、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、胸腺因子、ハプトコリン、ラクタヘドリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファフェトプロテイン、免疫グロブリン、およびアルファラクトアルブミンから成る群から選択される２つ以上のタンパク質とを含む、細胞培養培地である。
本発明のさらに別の実施形態は、細胞培養培地基材と、アルブミンと、成長因子、ラクトフェリン、トランスフェリン、インスリン、成長ホルモン、フィブロネクチン接合因子、ラミン接合因子、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、胸腺因子、ハプトコリン、ラクタヘドリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファフェトプロテイン、免疫グロブリン、およびアルファラクトアルブミンから成る群から選択される少なくとも１つの追加のタンパク質とを含む、細胞培養培地である。
さらなる実施形態によると、細胞培養培地中に提供され得る成長因子は、上皮細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、インスリン様成長因子、腸トレフォイル因子、形質転換成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、神経成長因子、および線維芽細胞成長因子から成る群から選択される。
本発明の別の実施形態は、細胞培養培地基材と、ラクトフェリンと、上皮細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、インスリン様成長因子、腸トレフォイル因子、形質転換成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、トランスフェリン、アルブミン、インスリン、成長ホルモン、フィブロネクチン接合因子、ラミン接合因子、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、胸腺因子、ハプトコリン、ラクタヘドリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファフェトプロテイン、免疫グロブリン、およびアルファラクトアルブミンから成る群から選択される少なくとも１つの追加のタンパク質を含む、細胞培養培地である。
さらなる実施形態によると、細胞培養培地中に含有されるタンパク質は、組換えタンパク質、好ましくは、組換えヒトタンパク質である。またさらなる実施形態によると、細胞培養培地中のタンパク質の１つ以上が、植物産生された異種タンパク質であり、好ましくは、細胞培養培地中のタンパク質の２つ以上が、植物産生された異種タンパク質であり、より好ましくは、細胞培養培地中のタンパク質の全てが、植物産生された異種タンパク質である。
さらなる実施形態によると、細胞培養培地中に提供され得るタンパク質の好ましい組み合わせは、ラクトフェリンおよびアルブミンを含む。
本発明の別の実施形態は、補充細胞培養培地を産生するための方法を提供し、細胞培養培地基材を提供すること、成長因子、ラクトフェリン、トランスフェリン、アルブミン、インスリン、成長ホルモン、フィブロネクチン接合因子、ラミン接合因子、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、胸腺因子、ハプトコリン、ラクタヘドリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファフェトプロテイン、免疫グロブリン、およびアルファラクトアルブミンから成る群から選択される２つ以上のタンパク質を提供すること、ならびに補充細胞培養培地を形成するために、２つ以上のタンパク質を細胞培養培地基材と組み合わせることを含む。
さらなる実施形態によると、細胞培養培地を産生するための方法で使用されるタンパク質は、組換えタンパク質、好ましくは、組換えヒトタンパク質である。またさらなる実施形態によると、細胞培養培地を産生するための方法で使用されるタンパク質の１つ以上が、植物産生された異種タンパク質、好ましくは、細胞培養培地を産生するための方法で使用されるタンパク質の２つ以上が、植物産生された異種タンパク質、より好ましくは、細胞培養培地を産生するための方法で使用されるタンパク質の全てが、植物産生された異種タンパク質である。
さらなる実施形態によると、細胞培養培地を産生する方法で提供され得る成長因子は、上皮細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、インスリン様成長因子、腸トレフォイル因子、形質転換成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、神経成長因子、および線維芽細胞成長因子から成る群から選択される。
さらなる実施形態によると、細胞培養培地を産生する方法で使用され得るタンパク質の好ましい組み合わせは、ラクトフェリンおよびアルブミンを含む。
本発明の別の実施形態は、細胞を培養するための方法を提供し、細胞培養培地基材を提供すること、補充細胞培養培地を形成するために、細胞培養培地基材を、成長因子、ラクトフェリン、トランスフェリン、アルブミン、インスリン、成長ホルモン、フィブロネクチン接合因子、ラミン接合因子、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、胸腺因子、ハプトコリン、ラクタヘドリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファフェトプロテイン、免疫グロブリン、およびアルファラクトアルブミンから成る群から選択される２つ以上のタンパク質で補充すること、ならびに培養するべき細胞を補充細胞培養培地内に導入することを含む。補充細胞培養培地中で成長する細胞は、非補充細胞培養培地中で成長する細胞と比較して、改善された成長特性を示す。
さらなる実施形態によると、細胞を培養するための方法で使用されるタンパク質は、組換えタンパク質、好ましくは、組換えヒトタンパク質である。またさらなる実施形態によると、細胞を培養するための方法で使用されるタンパク質の１つ以上が、植物産生された異種タンパク質、好ましくは、細胞を培養するための方法で使用されるタンパク質の２つ以上が、植物産生された異種タンパク質、より好ましくは、細胞を培養するための方法で使用されるタンパク質の全てが、植物産生された異種タンパク質である。
さらなる実施形態によると、細胞を培養するための方法で使用され得る成長因子は、上皮細胞成長因子、ケラチノサイト成長因子、インスリン様成長因子、腸トレフォイル因子、形質転換成長因子、顆粒球コロニー刺激因子、神経成長因子、および線維芽細胞成長因子から成る群から選択される。
さらなる実施形態によると、細胞を培養する方法で使用され得るタンパク質の好ましい組み合わせは、ラクトフェリンおよびアルブミンを含む。
本発明のさらなる態様は、本発明の細胞培養培地中の培養細胞を培養することによる、培養細胞の改善された成長速度、および培養細胞のより高い生産性を達成するための方法を含む。
別の実施形態では、本発明には、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含む栄養補助剤が含まれ、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率から成る。
別の実施形態では、本発明には、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含む栄養補助剤が含まれ、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、およびｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０１重量／重量％の熱ショックタンパク質を含む。本実施形態の態様では、熱ショックタンパク質は、イネ熱ショックタンパク質である。別の態様では、熱ショックタンパク質は、イネＨＳＰ７０遺伝子およびイネ胚乳内腔結合タンパク質から成る群から選択される。別の態様では、熱ショックタンパク質は、イネ（ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜）、ＥＥＣ６９０７３／ＯｓＩ＿３７９３８、およびＡＡＢ６３４６９から成る群から選択される。
特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０１重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０４重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０６重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０８重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．１重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。
特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリン関連タンパク質は、ラクトフェリンである。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリン関連タンパク質は、トランスフェリンである。特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、ラクトフェリンは、ヒトである。特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、トランスフェリンは、ヒトである。特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、ラクトフェリンは、組換え体である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、ラクトフェリンは、血漿に由来する。特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、トランスフェリンは、組換え体である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、トランスフェリンは、血漿に由来する。特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、ＩＧＦ−１は、ヒトである。特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、ＩＧＦ−１は、組換え体である。
特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対５０〜約１対２００である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、の比率トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対７５〜約１対１８０である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対８０〜約１対１２０である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対５０〜約１対１０００である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対５０〜約１対２０００である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対５０〜約１対３０００である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対５０〜約１対４０００である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対５０〜約１対５０００である。
特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンとアルブミンとの比率は、約１対３〜約１対０．３３である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンとアルブミンとの比率は、約１対０．５〜約１対２である。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンとアルブミンとの比率は、約１対０．８〜約１対１．２である。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞の細胞成長を高めるための方法を含み、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞の細胞成長を高めるための方法が含み、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明は、無血清培地への栄養補助剤の添加を含む、無血清培地に適応された細胞の生産性を高めるための方法を含み、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明は、無血清培地への栄養補助剤の添加を含む、無血清培地に適応された細胞の生産性を高めるための方法を含み、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、およびｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明は、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内の乳酸塩の蓄積を低減するための方法を含み、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明は、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内の乳酸塩の蓄積を低減するための方法を含み、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、およびｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明は、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内のブドウ糖および他の糖の消費を低減するための方法を含み、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明は、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内のブドウ糖および他の糖の消費を低減するための方法を含み、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、およびｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内での培養の開始から採取まで、タンパク質を産生するのに必要とされる時間を削減する方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、およびｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内での培養の開始から採取まで、タンパク質を産生するのに必要とされる時間を削減する方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、およびｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、バイオリアクターへの栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内の細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、バイオリアクターへの栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内の細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、無血清培地への栄養補助剤の添加を含む、本発明には、無血清条件下で成長する細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、無血清培地への栄養補助剤の添加を含む、無血清条件下で成長する細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、低密度で蒔かれる時に細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、低密度で蒔かれる時に細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、単細胞クローンから培養される細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、単細胞クローンから培養される細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、培養培地への栄養補助剤の添加を含む、培養中で成長する初代細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、培養中で成長する初代細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、およびｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、トランスフェクションの前、最中、または直後の細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、トランスフェクション後の細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、トランスフェクションの前、最中、または直後の細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、トランスフェクション後の細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、凍結保存もしくは解凍の前、最中、または直後の細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、凍結保存後の細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、およびｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、本発明には、凍結保存もしくは解凍の前、最中、または直後の細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、凍結保存後の細胞の生存率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対１，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。
別の実施形態では、培養への栄養補助剤の添加を含む、本発明には、培養中の細胞から産生される組換え産物の収率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５のトランスフェリン関連タンパク質とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。本方法の一態様では、細胞培養物の生存率が増加する。本方法の一態様では、産物は、タンパク質または細胞内細菌である。別の態様では、タンパク質は、抗体である。一態様では、タンパク質は、組換えタンパク質であり、別の態様では、タンパク質は、単量体であり、別の態様では、タンパク質は、多量体タンパク質であり、別の態様では、抗体は、全長である。別の態様では、抗体は、一本鎖抗体である。
別の実施形態では、本発明には、培養への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞から産生される組換え産物の収率を改善するための方法が含まれ、栄養補助剤は、組換えアルブミンおよびインスリン関連成長因子の混合物を含み、組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、ならびにｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、栄養補助剤は、約１対１００，０００〜約１対５，０００のインスリン関連成長因子とアルブミンとの比率（重量／重量）から成る。本方法の一態様では、細胞培養物の生存率が増加する。本方法の一態様では、産物は、タンパク質または細胞内細菌である。別の態様では、タンパク質は、抗体である。一態様では、タンパク質は、組換えタンパク質であり、別の態様では、タンパク質は、単量体であり、別の態様では、タンパク質は、多量体タンパク質であり、別の態様では、抗体は、全長である。別の態様では、抗体は、一本鎖抗体である。
これらの方法のいずれかの一態様では、栄養補助剤は、インスリンをさらに含む。これらの方法のいずれかの一態様では、栄養補助剤は、ＩＧＦ−１をさらに含む。別の態様では、栄養補助剤は、セレンおよびエタノールアミンをさらに含む。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞は、組織培養細胞である。別の態様では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。別の態様では、細胞は、ハイブリドーマ細胞である。別の態様では、細胞は、ベロ細胞である。別の態様では、細胞は、フローサイトメトリーで選別される。別の態様では、細胞は、初代細胞である。一態様では、初代細胞は、胚性幹細胞である。別の態様では、初代細胞は、Ｂ細胞由来である。別の態様では、細胞初代細胞は、Ｔ細胞由来である。別の態様では、細胞は、Ｂ細胞であるかＢ細胞由来である。別の態様では、細胞は、Ｔ細胞であるかＴ細胞由来である。別の態様では、細胞は。別の態様では、細胞は、マイクロ流体素子で単離される。別の態様では、細胞は、単細胞サブクローニングで単離される。
特許請求される方法のいずれかの一態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０１重量／重量％の熱ショックタンパク質を含む。本実施形態の態様では、熱ショックタンパク質は、イネ熱ショックタンパク質である。別の態様では、熱ショックタンパク質は、イネＨＳＰ７０遺伝子およびイネ胚乳内腔結合タンパク質から成る群から選択される。別の態様では、熱ショックタンパク質は、イネ（ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜）、ＥＥＣ６９０７３／ＯｓＩ＿３７９３８、およびＡＡＢ６３４６９から成る群から選択される。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０１重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０４重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０６重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．０８重量／重量％のＨＳＰ７０。別の態様では、組換えアルブミンは、少なくとも約０．１重量／重量％のＨＳＰ７０を含む。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリン関連タンパク質は、ラクトフェリンである。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリン関連タンパク質は、トランスフェリンである。特許請求される方法のいずれかの一態様では、ラクトフェリンは、ヒトである。特許請求される方法のいずれかの一態様では、トランスフェリンは、ヒトである。特許請求される方法のいずれかの一態様では、ラクトフェリンは、組換え体である。特許請求される方法のいずれかの一態様では、トランスフェリンは、組換え体である。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対５０〜約１対２００である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対７５〜約１対１８０である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対８０〜約１対１２０である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対１２０〜約１対２００である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対２００〜約１対１，０００である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対１，０００〜約１対２，０００である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対２，０００〜約１対３，０００である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対３，０００〜約１対４，０００である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンとアルブミンとの比率は、約１対４，０００〜約１対５，０００である。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンとアルブミンとの比率は、約１対３〜約１対０．３３である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンとアルブミンとの比率は、約１対０．５〜約１対２である。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンとアルブミンとの比率は、約１対０．８〜約１対１．２である。
ラクトフェリンを含む特許請求される方法のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンは、約１００ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌの終末濃度に添加される。ラクトフェリンを含む特許請求される方法のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンは、約４００ｍｇ／Ｌ〜８００ｍｇ／Ｌの終末濃度に添加される。ラクトフェリンを含む特許請求される方法のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンは、約８００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの終末濃度に添加される。ラクトフェリンを含む特許請求される方法のいずれかの別の態様では、ラクトフェリンは、約１０００ｍｇ／Ｌ〜２０００ｍｇ／Ｌの終末濃度に添加される。
トランスフェリンを含む特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンは、約１μｇ／Ｌ〜５０μｇ／Ｌの終末濃度に添加される。トランスフェリンを含む特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンは、約２μｇ／Ｌ〜１０μｇ／Ｌの終末濃度に添加される。トランスフェリンを含む特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンは、約３μｇ／Ｌ〜８μｇ／Ｌの終末濃度に添加される。トランスフェリンを含む特許請求される方法のいずれかの別の態様では、トランスフェリンは、約４μｇ／Ｌ〜６μｇ／Ｌの終末濃度に添加される。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、組換えアルブミンは、約１００ｍｇ／Ｌ〜２０００ｍｇ／Ｌの終末濃度に添加される。特許請求される方法のいずれかの別の態様では、組換えアルブミンは、約２００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの終末濃度に添加される。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、３０％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、４０％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、５０％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、６０％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で測定される時、組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、７０％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、８０％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、９０％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、１００％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、１５０％より大きい。
特許請求される方法のいずれかの別の態様では、細胞の生存率における改善は、同一の培養条件下で単独で添加された場合の組換えアルブミンまたはトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、２００％より大きい。
本発明の他の新規特性および利点は、以下を検討すると、または本発明の実践により学ぶ際に、当業者に明らかになるであろう。
本発明、それによって満たされる必要性、ならびにその目的、特性、および利点のより完全な理解のために、ここで、添付図面に関連して行われる以下の説明を参照する。
コドン最適化ヒトラクトフェリン配列（「ｃｏｄ ｏｐｔ ｌａｃ」）と天然ヒトラクトフェリン配列（「ｎａｔｉｖｅ ｌａｃ」）の比較であり、４１３（５９．６％）のコドン変化および４６７（２２．５％）のヌクレオチド変化を伴って、６９３コドンを示すように整列される。 ５，８１７ｂｐプラスミドであるＡＰＩ１６４（ＧＴ１−Ｌａｃ）プラスミドマップであり、ヒトラクトフェリンへの発現カセットを示し、Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ヒトラクトフェリン、Ｎｏｓターミネータ、およびカナマイシン耐性選択可能なマーカーを含有する。 組換えヒトラクトフェリンの発現に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。イネ種子抽出物からの総タンパク量をラエムリ試料緩衝液中に懸濁し、勾配ゲルで実行し、クマシーブルーで染色した。レーン１は、分子量マーカーである。レーン３〜６は、精製ヒト由来ラクトフェリンである（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）。レーン８〜１３は、ホモ接合性の独立した遺伝子組換えイネ系統からの単一種子抽出物であり、レーン１４は、非形質転換イネ品種Ｔａｉｐｅｉ３０９からの種子抽出物である。 Ｒ２からＲ１０世代の遺伝子組換え米穀粒中の組換えヒトラクトフェリンの安定発現である。１ｇの玄米粉からの総可溶性タンパク量を４０ｍＬの抽出緩衝液で抽出し、遠心分離で浄化した。抽出物を、ＥＬＩＳＡによって分析した。抽出を３回繰り返し、標準偏差がエラーバーとして示される。 Ｇｔ１シグナルペプチド（Ｇｔ１ ＳＰ）とＰ０２７６８（スイスプロット）に由来する天然タンパク質配列に基づくコドン最適化ヒトアルブミン（最適化ＨＳＡ）配列との間の融合のＤＮＡおよびタンパク質配列を示す。 ５，４９６ｂｐプラスミドであるＡＰＩ５０４（ＧＴ１−ＨＳＡ）のプラスミドマップであり、ヒトアルブミンへの発現カセットを示し、Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ヒトアルブミン、Ｎｏｓターミネータ、およびカナマイシン耐性選択可能なマーカーを含有する。 １２，３８８ｂｐプラスミドであるＡＰＩ５０８（ＪＨ／ＧＴ１−ＨＳＡ）のプラスミドマップであり、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）への発現カセットを示し、Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１シグナルペプチド、コドン最適化ヒトアルブミン、Ｎｏｓターミネータ、およびカナマイシン耐性選択可能なマーカーを含有する。 アルブミンの他の供給源および精製の方法と比較した、イネから産生された組換えＨＡＳのＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによる比較を示す。図８Ａは、血清由来（非組換えＨＳＡ）に対するクロマトグラムを示す。図８Ｂは、精製のために「旧式の方法」Ｂ０００を用いて作製されたイネ組換えＨＳＡ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１０７）に関するクロマトグラムを示す。図８Ｃは、精製のために「新規の方法」Ｂ００００Ｃを用いて作製されたイネ組換えＨＳＡ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）に関するクロマトグラムを示す。図８Ｄは、血清由来アルブミン（１Ａ、点線）および新規の方法を用いて調製されたＣｅｌｌａｓｔｉｍ ＨＳＡ（１Ｃ、実線）に関するクロマトグラムのオーバーレイを示す。図８Ｅは、旧式の方法Ｂ０００を用いて調製されたＨＳＡ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１０７）（１Ｂ、点線）および新規の方法Ｂ００００Ｃを用いて調製されたＨＳＡ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）（１Ｃ、実線）に関するクロマトグラムのオーバーレイを示す。 ＨＡＳの他の供給源および精製の方法と比較した、イネから産生された組換えアルブミンのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析による比較を示す。図９Ａは、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１アルブミンおよびＣｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）の比較を示す。レーン１は、分子量マーカーである。レーン４は、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍアルブミン（１０μｇ）であり、レーン７は、Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（１０μｇ）である。図９Ｂは、以前の方法（Ｂ０００）（レーン２、３、および４）ならびにＣｅｌｌａｓｔｉｍの新規の方法（Ｂ００００Ｃ）（レーン６、７、および８）からの３つのＣｅｌｌａｓｔｉｍロットのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析による比較を示す。１レーンにつき２０μｇで、６つの試料を装填した。 ：酵母組換えＨＳＡ（Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅ）、ヒト血漿由来ＨＡＳ（Ｓｅｒａｃａｒｅ）、および植物組換えＨＳＡ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）の、細胞成長および生存率を促進するそれらの能力に関する、効果の比較を示す。（図１０Ａ）。図１０Ｂは、組換えアルブミン産生のための、旧式の方法（Ｂ０００）および新規の方法（Ｂ００００Ｃ）を用いて産生されたアルブミンの内毒素量の比較を示す。図１０Ｃは、組換えアルブミン産生のための、旧式の方法（Ｂ０００）および新規の方法（Ｂ００００Ｃ）を用いて産生されたＣｅｌｌａｓｔｉｍ ＨＡＳの存在下で成長した細胞の細胞成長および生存率の比較を示す。 ：植物由来組換えＨＡＳが、ＡＴＰアフィニティーカラムによって選択的に濃縮され（レーン４および９）、抗ＨＳＰ抗体に対して反応することができるタンパク質を含むことを示す、２つの独立した実験のウエスタンブロット法を示す。レーン３および７は、１０μｇの出発原料を示し、レーン４および９は、ＡＴＰアフィニティーカラムからの溶出および濃縮後の画分を示し、レーン５および８は、溶出後におけるＡＴＰでの洗浄を示し、レーン１０は、ｈｓｐ正の対照である。（詳細については、実施例９を参照）。 ：熱ショックタンパク質を除去するために、ＡＴＰアフィニティーカラム上で新規の方法を用いて産生されたアルブミンを通過させた後の、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ組換えアルブミンの細胞成長および生存率の効果の比較を示す。（詳細については、本文を参照）。 ：培養中のハイブリドーマ細胞による抗体の産生への、トランスフェリン（ｐＴＦ）との組み合わせの血漿由来ヒト血清アルブミン（ｐＨＳＡ）の同一の濃度と比較した、トランスフェリン（ｐＴＦ）との組み合わせの１ｇ／Ｌの組換え植物由来ヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の効果の比較を示す。
定義
本開示がより容易に理解され得るために、ある特定の用語をまず定義する。詳細説明を通してさらなる定義を説明する。別途示されない限り、本明細書で使用される全ての用語は、下に提供される意味を有するか、または通常、本発明の当業者にとって、該用語が有する同一の意味と一致する。実践者は、当分野の定義および用語に関して、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、およびＧｅｌｖｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ，ｅｄｓ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照されたい。
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値に対する許容可能な誤差の範囲内を意味し、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの制限に依存する。例えば、「約」は、当分野における実践に従い、１または１を超える標準偏差以内を意味することができる。あるいは、組成物に対する「約」は、２０％以下、好ましくは、１０％以下、より好ましくは、５％以下のプラスまたはマイナス範囲を意味することができる。
「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原に結合するか、もしくは抗原結合（すなわち、特異結合）に対して、無傷抗体と（すなわち、それらが由来する無傷抗体と）競合する、免疫グロブリンまたは抗体のポリペプチド部分を指す。結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷免疫グロブリンの酵素もしくは化学分解によって産生することができる。結合フラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ、一本鎖、および一本鎖抗体が含まれる。
「アポトーシス」（「正常な」または「プログラム化された」細胞死）という用語は、不要もしくは無用な細胞が、発達および他の通常の生物過程の間に排除される、生理学的過程を指す。アポトーシスは、正常な生理学的条件下で発生する細胞死の様式であり、細胞は、それ自身の死亡における積極的な参与物である（「細胞自殺」）。これは、ほとんどの場合、正常な細胞回転および組織の恒常性、胚形成、免疫寛容の誘導ならびに維持、神経系および内分泌依存性組織萎縮の進行中に見出される。アポトーシスはまた、ストレスに反応して、組織培養条件下で成長する細胞内で誘発され得る。アポトーシスを経験する細胞は、特徴的な形態学的および生化学的特性を示し、容易に測定ならびに定量化することができる。これらの特性には、クロマチン凝集、細胞核および細胞質凝縮、リボソームを含有する膜結合小胞（アポトーシス小体）への細胞質および細胞核の分割、形態学的に無傷のミトコンドリアならびに核物質が含まれる。生体内において、これらのアポトーシス小体は、マクロファージまたは隣接する上皮細胞のいずれかによって、急速に認識され、貪食される。生体内でのアポトーシス細胞の除去のためのこの効率的な機構のおかげで、炎症反応は誘発されない。生体外において、アポトーシス小体、ならびに残存する細胞片は、最終的に肥大し、最終的に溶解する。生体外細胞死のこの末期は、「二次壊死」と称されている。
本明細書で使用される「１つの細胞」、「複数の細胞」、「１つの細胞株」、「宿主細胞」、および「複数の宿主細胞」という用語は、互換可能に使用され、植物および動物細胞を包含し、無脊椎動物、非哺乳類脊椎動物、ならびに哺乳類細胞を含む。全てのそのような名称には、細胞集団および子孫が含まれる。したがって、「形質転換細胞」および「トランスフェクタント」という用語には、転移の回数に関係なく、一次対象細胞およびそれに由来する細胞株が含まれる。例示的な非哺乳類脊椎動物細胞には、例えば、鳥の細胞、爬虫類の細胞、および両生類の細胞が含まれる。例示的な無脊椎動物細胞には、例えば、毛虫（ヨトウガ）細胞、蚊（ネッタイシマカ）細胞、ミバエ（キイロショウジョウバエ）細胞、シュナイダー細胞、およびカイコ細胞等の昆虫細胞が含まれるが、それらに限定されない。例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７−５５（１９８８）を参照されたい。細胞、例えば、胚性幹細胞および多能性幹細胞を含む幹細胞は、分化され得るか、もしくは部分的に分化され得るか、または分化され得ない。さらに、臓器または臓器系に由来する組織試料は、本発明に従って使用されてもよい。例示的な哺乳類細胞には、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ウサギ、マウス、ハムスター、ラット、およびテンジクネズミを含む齧歯類に由来する細胞、ならびにその派生物および子孫が含まれる。
「細胞培養物」または「組織培養物」という用語は、懸濁液中で成長する細胞、またはローラーボトル、組織培養フラスコ、ディッシュ、複数ウェルプレート等の容器内の多種多様の表面もしくは基質に接着して成長する細胞を指す。撹拌型発酵槽内のマイクロキャリアに付着して成長する接着細胞を含む、バイオリアクター等の大規模なアプローチもまた、「細胞培養物」という用語によって包含される。さらに、特許請求される本発明の方法において、接触依存的細胞を培養することのみならず、懸濁培養技術を使用することもまた可能である。例示的なマイクロキャリアには、例えば、デキストラン、コラーゲン、プラスチック、ゼラチン、およびセルロース、ならびにＢｕｔｌｅｒ，Ｓｐｉｅｒ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：２８３−３０３（１９８８）に記載される他のものが含まれる。例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ（商標）もしくはＣｙｔｏｐｏｒｅ（商標）等の多孔質担体、ならびにＤＥＡＥ−デキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ１（商標）四級アミンコーティングデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ（商標））等のデキストランベースの担体、またはゼラチン被覆されたデキストラン（Ｃｙｔｏｄｅｘ３（商標））等のゼラチンベースの担体も使用されてもよい。タンパク質の大規模および小規模産生の両方に関する細胞培養手順が、本発明によって包含される。流動層バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養、または撹拌槽型バイオリアクターシステムを含むが、それらに限定されない手順が、マイクロキャリアの有無に関わらず使用されてもよく、代案として、バッチ、フェドバッチ、または還流モードで操作されてもよい。
「１つの細胞培養培地」、「複数の細胞培養培地」、および「培養培地」という用語は、細胞および細胞株を培養、保存、処理、維持するために使用される溶液を指す。そのような溶液には、通常、細胞接着、成長、および細胞環境の維持のために必要な多様な因子が含まれる。例えば、典型的な溶液には、基礎培地製剤、細胞型に依存する多様な栄養補助剤、および時折、抗生物質が含まれ得る。いくつかの実施形態では、溶液には、以下の部類の１つ以上のうちの少なくとも１つの成分が含まれ得る：１）通常、ブドウ糖等の炭水化物の形でのエネルギー源、２）全ての必須アミノ酸、ならびに通常、基本的な一組の２０個のアミノ酸およびシスチン、３）低濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機化合物、４）遊離脂肪酸、および５）非常に低い濃度、通常、ミクロモル範囲で典型的に必要とされる有機化合物もしくは自然発生元素として定義される微量元素。
溶液は、任意で、以下の部類のいずれかのうちの１つ以上の成分で補充され得る：１）例えば、インスリン、トランスフェリン、および上皮細胞成長因子等のホルモンおよび他の成長因子、２）例えば、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩、トリス、ヘペス、および重炭酸ナトリウム等の塩および緩衝剤、３）例えば、アデノシン、チミジン、およびヒポキサンチン等のヌクレオシドおよび塩基、ならびに４）タンパク質および組織加水分解物。概して、任意の好適な細胞培養培地が使用され得る。培地には、例えば、ウシ胎仔血清または子牛血清等の血清が含まれ得る。あるいは、培地は、無血清であってもよく、無動物質を含まなくてもよく、または無タンパク質であってもよい。
「細胞培養培地成分」または「細胞培養成分」という用語は、細胞培養培地用の栄養補助剤として使用される任意の異種タンパク質を指す。
「細胞培養培地材料」という用語には、細胞培養培地成分、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、アミノ酸、脂質、ビタミン、抗生物質、有機塩、および無機塩が含まれる。
「細胞培養培地栄養補助剤」という用語は、細胞培養培地への添加に対して、他の材料の有無に関わらず、１つまたは複数の細胞培養培地成分の組み合わせを指す。
「細胞培養培地基材」または「基礎培地」という用語は、例えば、以下の成分のいずれかまたは全てを含有し得る細胞培養培地を指す：タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、アミノ酸、有機および／または無機塩、緩衝剤（例えば、重炭酸塩）、ビタミン、ホルモン、抗生物質、およびｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッド）。本発明に従って使用することができる細胞培養培地基材の例には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）、ハム栄養混合物、ＭＣＤＢ培地、最小必須培地イーグル、ＲＰＭＩ培地、エームズ培地、ＢＧＪｂ培地（フィットンジャクソン改変）、クリック培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、フィッシャー培地、グラスゴー最小必須培地（ＧＭＥＭ）、イスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、マッコイ５Ａ改変培地、ＮＣＴＣ培地、スイムＳ−７７培地、ウェイマウス培地、およびウィリアム培地Ｅが挙げられる。細胞培養培地基材は、細胞培養培地成分または細胞培養培地栄養補助剤を用いて補充され得る。
幹細胞培養を参照する時の「細胞系統」という用語は、最初期の前駆細胞から完全な成熟細胞までの細胞型（すなわち、特殊化細胞）の発達の段階の全てを指す。
「細胞の生存率」または「生存率」という用語は、任意の所与の時間において細胞の集団に存在する、生細胞および死細胞の相対量を指す。細胞の生存率は、集団の任意の所与の試料における生細胞および死細胞の相対数を測定することによって決定され得る。細胞の生存率はまた、細胞成長の速度と細胞死の総合的なバランスを表す全集団の細胞成長の速度を測定することによって推定され得る。細胞成長の速度は、同様に、細胞を計数することによって、および細胞成長の速度を直接スコア化するいかなる市販の細胞増殖アッセイを使用することによっても、直接測定され得る。
「馴化培地」は、胚性幹細胞を多能性状態で培養および維持することができるフィーダー細胞の培養から得られる細胞培養培地を指す。フィーダー細胞は、いくつかの成分の馴化培地を枯渇させるが、同様に、恐らく少量の成長因子を含む細胞由来物質で培地を富化する。本明細書で使用される「フィーダー細胞因子」という用語は、フィーダー細胞によって馴化培地中に放出される細胞由来物質を意味する。細胞培養培地中に放出される細胞因子は、胚性幹細胞の成長を高めるのに、または多能性状態で胚性幹細胞を維持するのに有用である。当業者に知られており、本明細書に記載される技術を用いて、フィーダー細胞因子を特定および精製することができる。
「保存アミノ酸置換」または「保存的突然変異」という語句は、共通の性質を有する別のアミノ酸による１つのアミノ酸の置換を指す。個々のアミノ酸間の共通の性質を定義するための機能的手段は、同種生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の正規化された頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．およびＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。そのような分析に従って、アミノ酸が優先的に相互に交換し、したがって、総合的なタンパク質構造へのそれらの影響において最も相互に類似するように、アミノ酸の群を定義することができる（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．およびＲ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。
このように定義されるアミノ酸群の例には、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓから成る「荷電／極性基」、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐから成る「芳香族基または環状基」、ならびにＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｙｓから成る「脂肪族基」が挙げられる。
各群内で、下位群を特定することもでき、例えば、荷電／極性アミノ酸の群を、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓから成る「正に荷電した下位群」、ＧｌｕおよびＡｓｐから成る「負に荷電した下位群」、ならびにＡｓｎおよびＧｌｎから成る「極性下位群」から成る下位群に細分化することができる。芳香族基または環状基を、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、およびＴｒｐから成る「窒素環下位群」、ＰｈｅおよびＴｙｒから成る「フェニル下位群」から成る下位群に細分化することができる。脂肪族基を、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅから成る「大型の脂肪族非極性下位群」、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＣｙｓから成る「脂肪族弱極性下位群」、ＧｌｙおよびＡｌａから成る「小残基下位群」から成る下位群に細分化することができる。
保存的突然変異の例には、例えば、正電荷を維持することができるように、ＬｙｓをＡｒｇに、およびその逆、負電荷を維持することができるように、ＧｌｕをＡｓｐに、およびその逆、遊離ＯＨを維持することができるように、ＳｅｒをＴｈｒに、遊離ＮＨ２を維持することができるように、ＧｌｎをＡｓｎに、上の下位群内のアミノ酸の置換が挙げられる。
「細胞毒性」という用語は、化学化合物（化学もしくはタンパク質汚染物質、界面活性剤、または毒素等）の細胞を死滅させる性質を指す。壊死およびアポトーシスとは対照的に、細胞毒性という用語は、必ずしも特定の細胞死機構を示す必要はない。
本明細書で使用される「減少」という用語または「減少した」、「低減する」、または「低減した」という関連用語は、統計的に有意な減少を指す。誤解を避けるために、用語は、通常、所与のパラメータにおいて少なくとも１０％の減少を指し、少なくとも２０％の減少、３０％の減少、４０％の減少、５０％の減少、６０％の減少、７０％の減少、８０％の減少、９０％の減少、９５％の減少、９７％の減少、９９％またはさらに１００％の減少（すなわち、測定されたパラメータはゼロである）を包含することができる。
本明細書で使用される「発達」、「分化する」、および「成熟」という用語は、幹細胞を説明するために使用される際、少なくとも２つの異なる細胞系統に分化する可能性を有する段階から、特定化および最終分化された細胞への、細胞の進行を指す。本出願の目的のために、そのような用語を互換可能に使用することができる。
本明細書で使用される「発現」という用語は、宿主細胞内のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞中の所望の産物の発現レベルは、細胞中に存在する対応するｍＲＮＡの量、または選択配列によってコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択配列から転写されたｍＲＮＡを、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡへの原位置ハイブリダイゼーションによって、またはＰＣＲによって定量化することができる。例えば、選択配列によってコードされるタンパク質を、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降、タンパク質の生物学的活性のためのアッセイ、またはタンパク質の免疫染色に続くＦＡＣＳ分析が含まれるが、それらに限定されない多様な方法で定量化することができる。
「発現制御配列」は、宿主細胞内でコード配列の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化信号、ターミネータ、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）等のＤＮＡ調節配列である。例示的な発現制御配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で説明される。
「フィーダー細胞」という用語は、生体外で成長し、かつ少なくとも１つの因子を培養培地中に分泌し、培養中での対象となる別の細胞の成長を支持するために使用することができる細胞の培養物を指す。本明細書で使用する際、「フィーダー細胞層」を、「フィーダー細胞」という用語と互換可能に使用することができる。フィーダー細胞は、相互の上部に成長する前に培養ディッシュの表面を完全な層で披覆する単分子層を含むことができるか、または細胞のクラスターを含むことができる。
細胞培養の「増殖期」という用語は、細胞が定速で分裂する指数関数的細胞成長（対数期）の期間を指す。この段階の間に、細胞は、ある期間、細胞成長が最大化されるような条件下で培養される。宿主細胞の成長周期の決定を、想起される特定の宿主細胞に対して、過度の実験なしで決定することができる。「ある期間、細胞成長が最大化されるような条件下で」等は、特定の細胞株に対して、細胞成長および分裂に最適であるように決定されるそれらの培養条件を指す。増殖期の間、特定の細胞株、例えば、哺乳類細胞に対して最適成長が達成されるように、細胞は、必要な添加物を含有する培養液中で、通常約３０〜４０℃、一般的に約３７℃で、湿気のある制御された雰囲気内で培養される。
「異種ＤＮＡ」という用語は、別の供給源に由来する細胞中に導入されたか、または同一の供給源からであるが、異なる（すなわち、非天然）環境に位置付けられるＤＮＡを指す。「異種タンパク質」または「組換えタンパク質」という用語は、異種ＤＮＡによって全体的または部分的にコードされるタンパク質、または内因性遺伝子の発現を活性化する異種ＤＮＡによって全体的または部分的に作製される発現制御配列（プロモーターもしくはエンハンサー等）から発現されるタンパク質を指す。
「相同的」という用語は、類似の機能もしくはモチーフで遺伝子またはタンパク質を特定するために使用される配列類似性の数学に基づく比較を説明する。本発明の核酸およびタンパク質配列を、例えば、他のファミリーメンバー、関連配列、または相同体を特定するため、公開データベースに対して検索を実行するために、「問い合わせ配列」として使用することができる。そのような検索を、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて、実行することができる。本発明の核酸分子に対するヌクレオチド配列相同性を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行することができる。本発明のタンパク質分子に対するアミノ酸配列相同性を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行することができる。比較目的としてギャップド整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２で説明されるように、ギャップドＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴならびにギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する時、各々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用することができる。
「相同性」という用語は、「共通の進化的起源」を有する２つのタンパク質間の関係を指し、それらのタンパク質は、同一種の動物におけるスーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）からのタンパク質、ならびに異なる種の動物由来の相同性タンパク質を含む（例えば、ミオシン軽鎖ポリペプチド等、Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５０：６６７，１９８７を参照）。そのようなタンパク質（およびそれらのコード核酸）は、パーセント同一性の観点から、あるいは特定の残基もしくはモチーフならびに保存位置の存在による、それらの配列類似性によって反映される配列相同性を有する。
「成長因子」という用語は、アンフィレギュリン、アンジオポエチン、ベータセルリン（骨形態形成タンパク質−１３、骨形態形成タンパク質−１４、骨形態形成タンパク質−２、ヒトＢＭＰ−３、骨形態形成タンパク質−４、ヒトＢＭＰ−５、骨形態形成タンパク質−６、骨形態形成タンパク質−７、ヒトＣＤ１３５リガンド／Ｆｌｔ−３リガンド、ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ヒトクリプト−１、ヒトＣＴＧＦ（結合組織成長因子）、ヒトＥＧＦ（上皮増殖因子）、ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ（内分泌腺由来血管内皮成長因子）、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ヒトＦＧＦ（線維芽細胞成長因子１−２３）、ヒトＧＤＦ−１１、ヒトＧＤＦ−１５、ヒトＧＤＦ−８、ヒト成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ、ＧＲＦ、ＧＨＲＨ、成長ホルモン放出ホルモン）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ヒト肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、ヒトヘレグリンベータ１、ヒトインスリン、ヒトＩＧＦ−１（インスリン様成長因子−１）、ヒトＩＧＦ−２（インスリン様成長因子−２）、ヒトＩＧＦＢＰ−１（インスリン様成長因子結合タンパク質−１）、ヒトＩＧＦＢＰ−３（インスリン様成長因子結合タンパク質−３）、腸トレフォイル因子（ＩＴＦ）、ヒトケラチノサイト成長因子１および２、ヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ヒトＭＳＰ、ヒトミオスタチン、ヒトミオスタチン、プロ（プロペプチド）、ヒトＮＲＧ１、ヒトＮＧＦ、ヒトオンコスタチンＭ、ヒト骨芽細胞特異的因子１（ＯＳＦ−１、プレイオトロフィン）、ヒトＰＤ−ＥＣＧＦ（血小板由来血管内皮細胞成長因子）、ヒトＰＤＧＦ、ヒトＰＩＧＦ、ヒト胎盤成長因子１（ＰＬＧＦ１）、ヒト胎盤成長因子２（ＰＬＧＦ２）、ヒトＳＣＧＦ−ａ（幹細胞増殖因子アルファ）、ヒトＳＣＧＦ−ｂ（幹細胞増殖因子ベータ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）／ＣＤ１１７リガンド、ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ、ＴＨＰＯ）、ヒト形質転換成長因子、ヒトＴＧＦアルファ（形質転換成長因子アルファ、ＴＧＦａ）、ヒトＴＧＦ−ベータ１（形質転換成長因子ベータ１、ＴＧＦｂ）、ヒトＴＧＦ−ベータ１．２（形質転換成長因子ベータ１、ＴＧＦｂ）、ヒトＴＧＦ−ベータ２（形質転換成長因子ベータ２、ＴＧＦｂ）、ヒトＴＧＦ−ベータ３（形質転換成長因子ベータ３、ＴＧＦｂ）、ヒトＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ヒトＶＥＧＦ−１２１、ヒトＶＥＧＦ−１６５、およびヒトＶＥＧＦ−Ａを指す。
本明細書で使用される「同一性」は、配列が配列適合を最大化するように整列される時の、すなわち、ギャップおよび挿入を考慮する時の、２つ以上の配列における対応する位置での同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の割合を意味する。Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７、ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．，ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載される方法を含むが、それらに限定されない知られている方法で、同一性を容易に計算することができる。同一性を決定するための方法は、試験される配列間に最大適合をもたらすように設計される。さらに、同一性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム内で成文化される。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ならびにＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））が含まれるが、それらに限定されない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ ＮＬＭ ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）から公的に入手可能である。周知のスミスウォーターマンアルゴリズムも同一性を決定するために使用することができる。
「免疫グロブリン」または「抗体」（本明細書で互換可能に使用される）という用語は、典型的に２つの重鎖および２つの軽鎖から成る基本的な４ポリペプチド鎖構造を有し、鎖は、例えば、鎖間ジスルフィド結合によって安定化される、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。「一本鎖免疫グロブリン」または「一本鎖抗体」（本明細書で互換可能に使用される）という用語は、１つの重鎖および１つの軽鎖から成る２ポリペプチド鎖構造を有し、鎖は、例えば、鎖間ペプチドリンカーによって安定化される、抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。「ドメイン」という用語は、例えば、ベータ−プリーツシートおよび／または鎖内ジスルフィド結合によって安定化されるペプチドループ（例えば、３〜４個のペプチドループを含む）を含む重鎖または軽鎖ポリペプチドの球状領域を指す。ドメインは、さらに、、本明細書で「定常」または「可変」と称され、これは「定常」ドメインの場合、多様なクラスメンバーのドメイン内の配列変動の相対的欠如、または「可変」ドメインの場合、多様なクラスメンバーのドメイン内の著しい配列変動に基づく。抗体またはポリペプチド「ドメイン」は、しばしば、互換可能に、当分野で抗体またはポリペプチド「領域」と称される。抗体軽鎖の「定常」ドメインは、互換可能に、「軽鎖定常領域」、「軽鎖定常ドメイン」、「ＣＬ」領域、または「ＣＬ」ドメインと称される。抗体重鎖の「定常」ドメインは、互換可能に、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＣＨ」領域、または「ＣＨ」ドメインと称される。抗体軽鎖の「可変」ドメインは、互換可能に、「軽鎖可変領域」、「軽鎖可変ドメイン」、「ＶＬ」領域、または「ＶＬ」ドメインと称される。抗体重鎖の「可変」ドメインは、互換可能に、「重鎖定常領域」、「重鎖定常ドメイン」、「ＶＨ」領域、または「ＶＨ」ドメインと称される。免疫グロブリンまたは抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得、単量体型または多量体型で存在し、例えば、五量体型で存在するＩｇＭ抗体および／または単量体型、二量体型、もしくは多量体型で存在するＩｇＡ抗体である。「フラグメント」という用語は、無傷もしくは完全抗体または抗体鎖よりも少ないアミノ酸残基を含む抗体または抗体鎖の一部もしくは一部分を指す。無傷もしくは完全抗体または抗体鎖の化学または酵素処理を介して、フラグメントを得ることができる。組換え手段によってフラグメントを得ることもできる。例示的なフラグメントには、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、および／またはＦｖフラグメントが挙げられる。
本明細書で使用される「増加する」という用語または「増加した」、「高める」、「高まった」という関連用語は、統計的に有意な増加を指す。誤解を避けるために、用語は、通常、所与のパラメータにおいて少なくとも１０％の増加を指し、対照値に対して少なくとも２０％の増加、３０％の増加、４０％の増加、５０％の増加、６０％の増加、７０％の増加、８０％の増加、９０％の増加、９５％の増加、９７％の増加、９９％またはさらに１００％の増加を包含することができる。
「単離された」という用語は、本明細書に開示される細胞培養成分、すなわち、アルブミン、またはトランスフェリン関連タンパク質を説明するために使用される時に、その自然環境の成分から特定、および分離、ならびに／または回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染物質成分は、典型的には、タンパク質に関する研究、診断、または治療用途を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性もしくは非タンパク性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、クマシーブルー、または好ましくは、銀染色を用いて、非還元もしくは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価される時に、少なくとも９５％の均一性まで精製される。単離されたタンパク質は、目的のタンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内の原位置でタンパク質を含む。しかしながら、通常、単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
「成熟特異的タンパク質プロモーター」という用語は、種子成熟の間に、大幅に上方制御された活性（２５％より大きい）を示すプロモーターを指す。
「成熟植物」という用語は、完全に分化した植物を指す。
本明細書で使用される「マーカー」は、核酸または目的の細胞内で差次的に発現されるポリペプチド分子である。この文脈において、差次的発現は、陽性マーカーに対して増加したレベルおよび陰性マーカーに対して減少したレベルを意味する。マーカー核酸またはポリペプチドの検出可能なレベルは、当分野で知られている多種多様の方法のいずれかを用いて、目的の細胞を他の細胞から同定または区別することができるように、他の細胞と比較して、目的の細胞内で十分に高い、もしくは低い。
「膵臓内分泌系統のマーカー」を発現する細胞は、転写因子ＰＤＸ−１および以下の転写因子、すなわち、ＮＧＮ−３、ＮＲｘ２．２、ＮＲｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ベータ、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、およびＰａｘ６の少なくとも１つに対する遺伝子発現を伴う細胞を指す。膵臓細胞系統の特性を示すマーカーを発現する細胞には、膵臓β細胞が含まれる。
本明細書で使用される「内胚葉系統の特性を示すマーカー」を発現する細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３ベータ、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、ブラキュリ、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、またはＯＴＸ２。最終内胚葉系統の特性を示すマーカーを発現する細胞には、原始線条前駆細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞、および最終内胚葉細胞が含まれる。
本発明の方法に由来する多能性マーカーを発現する細胞は、以下から成る群から選択される多能性マーカーの少なくとも１つを発現する：ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＦｏｘＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ−２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａｌ−６０、およびＴｒａｌ−８１。
本明細書で使用される「中胚葉系統の特性を示すマーカー」を発現する細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３ベータ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６。
本明細書で使用される「外胚葉系統の特性を示すマーカー」を発現する細胞は、以下のマーカーの少なくとも１つを発現する細胞を指す：ＢＭＰ−４、ノギン、コーディン、Ｏｔｘ２、Ｆｏｘ Ｊ３、ネスチン、ｐ６３／ＴＰ７３Ｌ、ベータＩＩＩチューブリン。
「単子葉植物種子成分」は、単子葉植物種子、典型的には、成熟単子葉植物種子から抽出可能な、炭水化物、タンパク質、および脂質成分を指す。
所与の細胞、タンパク質、ポリペプチド、核酸、形質、または表現型に関連して、本明細書で使用される「天然の」または「野生型」という用語は、それが典型的に自然の中で見出される型を指す。
本明細書で互換可能に使用される「操作可能に連結される」および「操作可能なように連結される」という用語は、それらの意図された方法でそれらが機能することを許す方法で、２つ以上のヌクレオチド配列または配列要素の位置付けを指す。いくつかの実施形態では、本発明に記載の核酸分子は、染色質を開放するか、および／または開放状態で染色質を維持することができる、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された、１つ以上のＤＮＡ要素を含む。他の実施形態では、核酸分子は、（ａ）翻訳を増加させることができるヌクレオチド配列、（ｂ）細胞の外で組換えタンパク質の分泌を増加させることができるヌクレオチド配列、および（ｃ）ｍＲＮＡの安定性を増加させることができるヌクレオチド配列から選択される１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含んでもよく、そのようなヌクレオチド配列は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列に、操作可能なように連結される。概して（しかし必然的ではないが）、操作可能に連結されるヌクレオチド配列は近接し、必要に応じて読み枠に存在する。しかしながら、染色質を開放するか、および／または開放状態で染色質を維持することができる操作可能に連結されるＤＮＡ要素は、通常、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列の上流に位置付けられるが、必ずしもそれと近接しない。多様なヌクレオチド配列の操作可能な連結は、当分野で周知の組換え方法、例えば、ＰＣＲ法を用いて、好適な制限酵素部位での核酸連結によって、またはアニーリングで、多様なヌクレオチド配列の操作可能な連結を達成される。好適な制限酵素部位が存在しない場合に、従来の実践に従って、合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターを使用することができる。
「植物細胞」は、植物に由来する任意の細胞を指し、未分化組織（例えば、カルス）、ならびに植物種子、花粉、珠芽、胚芽、懸濁培養物、分裂組織部位、葉、根、芽、配偶体、胞子体、および小胞子を含む。
本明細書で互換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。これらの用語には、一本鎖、二本鎖、もしくは三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的かつ生化学的に修飾された、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基が含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸塩基（典型的には、ＲＮＡもしくはＤＮＡで見出され得る）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸塩群基を含むことができる。さらに、適切な条件下で相補鎖を合成し、鎖をアニーリングするか、または適切なプライマーとともにＤＮＡポリメラーゼを用いて新たに相補鎖を合成するかのいずれかによって、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から、二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。核酸分子は、多くの異なる形態、例えば、遺伝子もしくは遺伝子フラグメント、１つ以上のエクソン、１つ以上のイントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーの形態を取る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体、ウラシル、他の糖、フルオロリボース（ｆｌｕｏｒｏｒｉｂｏｓｅ）およびチオアート等の連結基、ならびにヌクレオチド分枝等の修飾されたヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される「ＤＮＡ」または「ヌクレオチド配列」は、塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのみならず、メチル化ヌクレオチド等のこれらの塩基、非荷電連結およびチオアート等のヌクレオチド間修飾、糖類似体の使用、ならびにポリアミド等の修飾された構造、および／または代替の骨格構造等のそれらの類似体もしくはこれらの塩基の修飾された型のいずれをも含む。
「多能性幹細胞」という用語は、胚芽、胎児、または成体組織から得られる幹細胞を包含する。好ましい一実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞である。別の実施形態では、多能性幹細胞は、始原生殖細胞等の胎児幹細胞である。別の実施形態では、多能性幹細胞は、成熟幹細胞である。
本明細書で使用される「多能性」という用語は、外胚葉性、内胚葉性、および中胚葉性細胞の１つに少なくとも成長することができる細胞を指す。本明細書で使用される「多能性」という用語には、分化全能性および多分化能である細胞が含まれる。本明細書で使用される「分化全能性細胞」という用語は、細胞の全ての系統に成長することができる細胞を指す。「多分化能」という用語は、末期分化されていない細胞を指す。
「プロモーター」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本明細書で使用されるプロモーター配列は、転写開始部位によってその３’末端で境界付けられ、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小限の数の塩基または要素を含むように上流（５’方向）に伸長する。転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって都合よく定義される）は、プロモーター配列内で、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）に見出すことができる。真核生物プロモーターは、頻繁に（しかし常にではないが）、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することができる。原核生物プロモーターは、〜１０および〜３５コンセンサス配列に加えて、シャインダルガーノ配列を含有する。
恒常的、誘導性、および抑制可能なプロモーターを含む、多種多様の異なる供給源からの多数のプロモーターが当分野で周知である。代表的な供給源には、例えば、ウイルス性、哺乳動物、昆虫、植物、酵母、および細菌性細胞型が含まれ、これらの供給源からの好適なプロモーターは、容易に入手可能であるか、またはオンラインで、もしくは例えば、ＡＴＣＣ等の寄託機関、ならびに他の商用もしくは個々の供給源から公的に入手可能な配列に基づいて合成的に作製することができる。プロモーターは、一方向性（すなわち、１つの方向で転写を開始する）または双方向性（すなわち、３’または５’方向のいずれかで転写を開始する）であることができる。プロモーターの非限定的な例には、例えば、Ｔ７細菌性発現システム、ｐＢＡＤ（ａｒａＡ）細菌性発現システム、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、イネ胚乳特異的グルテリン（Ｇｔ１）プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓウイルス性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターには、Ｔｅｔシステム（米国特許第５，４６４，７５８号および同第５，８１４，６１８号）、エクジソン誘導性システム（Ｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）９３（８）：３３４６−３３５１、Ｔ−ＲＥｘ（商標）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＬａｃＳｗｉｔｃｈ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびＣｒｅ−ＥＲＴタモキシフェン誘導性リコンビナーゼシステム（Ｉｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９９）２７（２２）：４３２４−４３２７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（２３）：ｅ９９、米国特許第７，１１２，７１５号、ならびにＫｒａｍｅｒ ＆ Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３０８：１２３−１４４）または当分野で知られている、所望の細胞内での発現に好適な任意のプロモーターが含まれる。
「目的のタンパク質」という用語は、研究、診断、または治療目的に有用であり得る任意のタンパク質を指す。目的のタンパク質には、哺乳類タンパク質もしくは非哺乳類タンパク質が含まれてもよく、任意で受容体またはリガンドが含まれてもよい。例示的な目的のタンパク質には、レニン等の分子、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、アルファ１−抗トリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、およびフォンヴィレブランド因子等の凝固因子、タンパク質Ｃ等抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤、ウロキナーゼもしくはヒト尿または組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲンアクチベーター、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子アルファおよびベータ、ＣＤ４０リガンド、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３、ＯＰＧ、Ｆａｓリガンド等のＴＮＦおよびＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）ファミリーのメンバー、エンケファリナーゼ、ランテス（活性化において制御され、通常、Ｔ細胞で発現および分泌される）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１アルファ）、ヒト血清アルブミン等の血清アルブミン、ミュラー管抑制因子、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、プロレラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ベータラクタマーゼ等の微生物タンパク質、ＤＮａｓｅ、ＩｇＥ、ＣＴＬＡ−４等の細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンもしくは成長因子に対する受容体、タンパク質ＡもしくはＤ、リウマチ因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、もしくはＮＴ−６）等、またはＮＧＦ−β等の神経成長因子等の神経栄養因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧ−β３、ＴＧＦ−β４、もしくはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦアルファおよびＴＧＦベータ等の形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、タンパク質に結合するインスリン様成長因子、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、およびＣＤ２０等のＣＤタンパク質、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロンアルファ、ベータ、およびガンマ等のインターフェロン、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０のインターロイキン（ＩＬ）、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、分解促進因子、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部、ｇｐ１２０等のウイルス性抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４、およびＶＣＡＭ等のインテグリン、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、もしくはＨＥＲ４受容体等の腫瘍関連抗原、ならびに上記のポリペプチドのいずれかの変異体および／またはフラグメント、ならびにＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ３４等のＣＤタンパク質等の多様なタンパク質抗原に対する抗原、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、もしくはＨＥＲ４受容体等のＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、およびそのαもしくはβサブユニットのいずれかを含むαｖ／β３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、もしくは抗ＣＤ１１ｂ抗体）等の細胞接着分子、ＶＥＧＦ等の成長因子、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ−４、タンパク質Ｃ、Ａｐｏ−２（ＤＲ５）、ＤＲ４、ＤｃＲ１、ＤｃＲ２、ＤｃＲ３等のＡｐｏ−２Ｌ受容体、ならびに上に列挙した抗体の変異体および／またはフラグメント等が含まれるが、それらに限定されない。本発明の一実施形態では、目的のタンパク質には、Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓリガンド、またはＴＮＦアルファ等の、それ自身が、生体外または生体内において、哺乳類もしくは非哺乳類細胞内でアポトーシスを誘導することができるタンパク質が含まれる。
細胞培養の「産生段階」という用語は、細胞成長がプラトーに達している間の期間を指す。産生段階の間、対数細胞成長が終わり、タンパク質産生が主要となる。この期間中、培地は通常、継続するタンパク質産生を支持し、所望のタンパク質産物を達成するよう補充される。
「植物中で産生される」という用語は、本明細書に開示される細胞培養成分を説明するために使用される時、タンパク質が植物細胞から直接的または間接的に得られたことを意味する。組換えタンパク質に対して、「植物中で産生される」という用語は、組換えタンパク質が植物細胞内で発現され、次いで、宿主細胞タンパク質および脂質から精製されたことを意味する。植物中で産生されたタンパク質は、少なくとも３つの基準によって他の生物から精製したタンパク質から分化され得る。１）植物中で産生されるタンパク質には、異なる生物内で産生されるタンパク質と比較して、翻訳後修飾の異なるパターンが典型的に含まれ、質量スペクトル分析によって容易に特定され得る。２）植物中で産生されるタンパク質には、異なる発現システムで産生されるか、もしくは異なる供給源から精製される同一のタンパク質と比較して、異なる一組の結合した共同因子、脂質、および夾雑タンパク質が典型的に含まれる。３）植物中で産生されるタンパク質は、異なる供給源から産生または精製される同一のタンパク質と比較して、異なる生物学的活性を示し得る。植物中で産生されるタンパク質の活性の相違は、異なる生物から産生または単離されるタンパク質と比較して、植物中で産生されるタンパク質の立体配座、フォールディング、凝集状態、翻訳後修飾、もしくは結合した因子、または同時精製された夾雑タンパク質の相違から生じ得る。植物中で産生されるタンパク質の特定の活性の相違は、定義される濃度ならびにアッセイ条件、例えば、実施例１１〜１９に開示される、細胞成長および因子相乗作用アッセイを用いて、ルーチンアッセイによって容易に確証され得る。具体的には、植物中で産生されるタンパク質は、非植物産生のタンパク質の同一の濃度と比較して、単独または他の因子との組み合わせのいずれかで少なくとも少なくとも１０％より大きい細胞成長活性を示し得る。好ましくは、植物中で産生されるタンパク質は、非植物産生のタンパク質の同一の濃度と比較して、単独または他の因子との組み合わせのいずれかで少なくとも２０％より大きい細胞成長活性を示し得る。より好ましくは、植物中で産生されるタンパク質は、非植物産生のタンパク質の同一の濃度と比較して、単独または他の因子との組み合わせのいずれかで少なくとも少なくとも３０％より大きい細胞成長活性を示し得る。より好ましくは、植物中で産生されるタンパク質は、非植物産生のタンパク質の同一の濃度と比較して、単独または他の因子との組み合わせのいずれかで少なくとも少なくとも４０％より大きい細胞成長活性を示し得る。さらにより好ましくは、植物中で産生されるタンパク質は、非植物産生のタンパク質の同一の濃度と比較して、単独または他の因子との組み合わせのいずれかで少なくとも少なくとも５０％より大きい細胞成長活性を示し得る。
「単離された」または「精製された」という用語は、本明細書に開示される細胞培養成分を説明するために使用される時、その自然環境の成分から特定、および分離、ならびに／または回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染物質成分は、典型的には、タンパク質に関する研究、診断、または治療用途を妨害するであろう物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性もしくは非タンパク性溶質を含み得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、クマシーブルー、または好ましくは、銀染色を用いて、非還元もしくは還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価される時、少なくとも９５％の均一性にまで精製される。単離されたタンパク質には、目的のタンパク質の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内の原位置でタンパク質が含まれる。しかしながら、通常、単離されたタンパク質は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、ポリペプチドを産生する細胞に対して、外因性、すなわち、異種もしくは外来性ポリペプチドを指す。
アポトーシスまたは細胞培養との関連において「ストレス」という用語は、以下のうちの任意の組み合わせを含む、組織培養に対する非最適条件を指す：毒素の存在、栄養素もしくは成長因子の欠乏または枯渇、低酸素状態、熱ストレス（好ましい範囲と比較して、温度が高すぎるか、または低すぎる）、細胞間接触の損失、ウイルス感染、浸透ストレス（好ましい範囲と比較して、浸透圧が高すぎるか、または低すぎる）、酸化ストレス、細胞密度（好ましい範囲と比較して、細胞密度が高すぎるか、または低すぎる）、およびｐＨストレス（好ましい範囲と比較して、ｐＨが高すぎるか、または低すぎる）。
「形質転換」という用語は、宿主細胞または生物内への１つ以上の核酸分子の転移を指す。宿主細胞内に核酸分子を導入する方法には、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、微量注入、陽イオン性脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、スクレープローディング、弾道導入、またはウイルス感染もしくは他の感染病原体が含まれる。「形質転換された」、「形質導入された」、「遺伝子導入」、および「組換え体」は、組換えもしくは異種核酸分子（例えば、１つ以上のＤＮＡコンストラクトもしくはＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡ対応物）が導入された宿主細胞または生物を指す。核酸分子は、安定的に発現させることができるか（すなわち、機能的形態で細胞中に約３ヶ月以上維持される）、または機能的形態で細胞中に３ヶ月未満不安定に維持させることができ、すなわち、一時的に発現される。例えば、「形質転換された」、「形質導入された」、および「遺伝子導入された」細胞は、形質転換過程を経て、外来性核酸を含有する。「非形質転換された」という用語は、形質転換過程を経ていない細胞を指す。
細胞培養の「過渡期」という用語は、産生段階のための培養条件に従う間の期間を指す。過渡期の間、ｐＨ、イオン濃度、および温度等の環境因子を成長条件から産生条件に移行させることができる。
「種子産物」という用語には、脱ぷ（だっぷ）全粒種等の種子破片、粉末種子（フライス加工によって脱ぷ（だっぷ）され、粉状に挽かれた種子）、種子抽出物、好ましくは、タンパク質抽出物（粉末種子のタンパク質画分が炭水化物画分から分離されたもの）、麦芽（麦芽抽出物もしくは麦芽シロップを含む）、および／または遺伝子組換え穀物に由来する精製タンパク質が含まれるが、それらに限定されない。
「種子成熟」は、代謝可能な貯蔵物質、例えば、糖、オリゴ糖、澱粉、フェノール性物質、アミノ酸、およびタンパク質が、空胞標的の有無に関わらず、種子（穀物）の多様な組織、例えば、内胚乳、種皮、糊粉層、および胚盤上皮に沈着される受精に始まり、穀物の肥大、穀物の充填をもたらし、穀物の乾燥に至る期間を指す。
「配列類似性」という用語は、共通の進化的起源を共有し得るか、もしくは共有し得ない核酸配列とアミノ酸配列との間の同一性または一致の程度を指す（上のＲｅｅｃｋらを参照）。しかしながら、一般の使用、および本明細書における適用において、「相同性」という用語は、「大いに」等の副詞と修飾される時、配列類似性を指し得、共通の進化的起源に関連し得るか、もしくは関連し得ない。
特定の実施形態では、ヌクレオチドの少なくとも約８５％、より好ましくは、少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％が、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＣＬＵＳＴＡＬ等の知られている配列比較アルゴリズムによって決定して、核酸配列の定義される長さ上で適合する時、２つの核酸配列は、「実質的に相同」または「実質的に類似」する。そのような配列の例は、本発明の特異遺伝子の対立遺伝子または種変異体である。実質的に相同である配列はまた、ハイブリダイゼーションによって、例えば、その特定のシステムに対して定義されるストリンジェント条件下におけるサザンハイブリダイゼーション実験において特定され得る。
同様に、本発明の特定の実施形態では、８０％を超えるアミノ酸残基が同一である時、または約９０％を超えるアミノ酸残基が類似する（すなわち、機能的に同一である）時、２つのアミノ酸配列は「実質的に相同」もしくは「実質的に類似」する。好ましくは、類似する、もしくは相同のポリペプチド配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｖｅｒｓｉｏｎ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）パイルアッププログラムを使用することによる、または上で説明したプログラムおよびアルゴリズムのいずれかを使用することによる整列によって特定される。プログラムは、初期設定値、すなわち、ギャップ生成ペナルティ＝−（１＋１／κ）であって、κはギャップエクステンションペナルティであり、平均適合＝１、平均不適合＝−０．３３３で、スミスおよびウォーターマンの局所的相同性アルゴリズムを使用することができる。
本明細書および添付の請求の範囲で使用される、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別様に明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの分子」への言及は、そのような分子の１つ以上を含み、「１つの試薬」は、そのような異なる試薬の１つ以上を含み、「１つの抗体」は、そのような異なる抗体の１つ以上を含み、「その方法」への言及は、本明細書で説明される方法に修正または代用される場合もある、当業者に知られている同等のステップおよび方法への言及を含む。
本発明の実践は、別途示されない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を採用する。そのような技術は、文献内で説明される。実践者は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．（１９９３）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、およびＧｅｌｖｉｎ ａｎｄ Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ，ｅｄｓ．（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｊ．Ｍ．Ｐｏｌａｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ，１９９０，Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄｉｔｏｒ），１９８４，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ、Ｄ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ＰｈｙｓｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ ｂｙ Ｅｄｗａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（１９９９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４−７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）（１９８８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−３，４−２），１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ，Ｐｒａｂｈａｖａｔｈｉ Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ（２００１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）、ならびにＬａｂ Ｒｅｆ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ，Ｅｄｉｔｅｄ Ｊａｎｅ Ｒｏｓｋａｍｓ ａｎｄ Ｌｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ，２００２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３を参照されたい。これらの一般的教科書の各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
上で述べた出版物は、本出願の出願日前のそれらの開示のためのみに提供される。本明細書において、本発明が先行発明に基づいてそのような開示に先行する資格を有しないことを認めるものと如何様にも解釈されない。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者が一般に理解するものと同一の意味を有する。任意の方法、組成物、試薬、細胞、本明細書に説明されるものと類似または同等のものを、本発明の実践もしくは試験で使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に説明される。本明細書で言及する全ての出版物は、全ての図、図式、等式、図解、および図面を含めて、参考文献が関連して引用された特定の情報を説明および開示するために、本明細書に組み込まれる。
Ｉ．本発明の栄養補助剤を使用する方法
しばしば、細胞培養培地は、５〜１０％の濃度の血清で補充される。血清は、細胞成長に対して未定義の必須物質を含有する複合混合物である。一般に使われる血清は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である。その複雑性、一貫性の欠如、および病原菌汚染に対する潜在的危険性のため、細胞培養産業および管理機関は、血清の細胞培養培地への添加に対する代替法を模索している。
基礎培地に添加される細胞培養成分および細胞培養栄養補助剤は、細胞成長を促進するはっきりと異なる機能を供給する。これらのタンパク質成分は、典型的には動物由来である。動物性材料からの潜在的な病原菌汚染の懸念の増加に伴って、細胞培養産業は、動物成分を含まない培地を開発する努力をしている。植物ベースの加水分解および微生物系を用いて産生される組換えタンパク質の使用によっていくつかの成功がもたらされているが、植物ベースの加水分解は、成分の未定義の混合物であり、微生物源からの組換えタンパクは、日常的な細胞培養で使用するには高価すぎる。非動物由来成分の代替供給源は、細胞培養技術に依存する産業にとって有益であろう。
したがって、一実施形態では、本発明は、ラクトフェリン、トランスフェリン、アルブミン、インスリン、成長ホルモン、フィブロネクチン接合因子、ラミン接合因子、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、胸腺因子、ハプトコリン、ラクタヘドリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファフェトプロテイン、免疫グロブリン、アルファラクトアルブミン、および派生物、破片、ならびに生物学的に活性であるそのフラグメントから成る群から選択される２つ以上のタンパク質で補充される細胞培養培地を提供すること、ならびに培養するために細胞を細胞培養培地に導入することを含む、細胞を培養する方法を提供する。細胞培養培地中で成長する細胞は、強化されていない細胞培養培地中で成長する細胞と比較して、改善された成長特性を示す。
したがって、一実施形態では、本発明は、ラクトフェリン、トランスフェリン、アルブミン、インスリン、成長ホルモン、フィブロネクチン接合因子、ラミン接合因子、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、胸腺因子、ハプトコリン、ラクタヘドリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファフェトプロテイン、免疫グロブリン、アルファラクトアルブミン、および派生物、破片、ならびに生物学的に活性であるそのフラグメントから成る群から選択される２つ以上のタンパク質で補充される細胞培養培地を提供すること、ならびに培養するために細胞を細胞培養培地に導入することを含む、細胞を培養する方法を提供する。細胞培養培地中で成長する細胞は、強化されていない細胞培養培地中で成長する細胞と比較して、改善された成長特性を示す。
さらなる実施形態によると、本発明の細胞を培養する方法において使用されるタンパク質の組み合わせおよび栄養補助剤は、細胞培養培地中に存在する細胞の成長および／または生産性に相乗効果を提供する。またさらなる実施形態によると、細胞を培養する方法で使用され得るタンパク質の１つの組み合わせを含む栄養補助剤には、ラクトフェリンおよびアルブミンが含まれる。
別の態様では、栄養補助剤は、細胞成長ならびに生産性に相乗効果を提供するトランスフェリン関連タンパク質およびアルブミンの組み合わせを含む。
本発明のさらなる態様には、本発明の栄養補助剤を細胞培養培地に添加することによって、培養細胞の改善された成長速度および培養細胞のより高い生産性を達成するための方法が含まれる。
特許請求される栄養補助剤は、アポトーシスを防止し、特にストレスに応じて、組織培養の間、細胞の生存率を改善するのに著しい改善を提供する組織および細胞培養物ならびに組換えタンパク質産生への広範囲の適用において有用である。
アポトーシスは、特徴的な細胞形態学および細胞死につながる一連の生化学的事象を含む。これらの変化には、膜の非対称および付着の損失、細胞ブレブ形成細胞収縮、細胞核断片化、染色質凝縮、ならびに染色体ＤＮＡ断片化等の細胞膜に対する変化が含まれる。
アポトーシスの過程は、細胞外（外因性誘導因子）または細胞内（内因性誘導因子）のいずれかで開始し得る様々な範囲の細胞信号によって制御される。細胞外信号には、毒素、ホルモン、成長因子、一酸化窒素、サイトカインが含まれ得、異なる程度で組織培養培地中に存在し得る。これらの信号は、アポトーシスに肯定的（すなわち、誘発する）または否定的（すなわち、抑制する、阻害する、もしくは弱める）に影響を及ぼし得、したがって、全体の細胞の生存率に影響を与える。ＡＴＰ含有量、カルシウムレベル、ならびに多数のアポトーシスおよび抗アポトーシス遺伝子を含む多数の細胞内成分もまた、アポトーシスを調節する助けとなる。細胞は、ストレスに応じて細胞内アポトーシス信号を開始し得、それはほぼ細胞自殺をもたらし得る。組織培養中に遭遇するストレスを誘導する作用因子には、例えば、内毒素等の組織培養成分ならびにプラスチック容器から浸出される重金属に関連する毒素、トランスフェクション試薬（例えば、リポフェクタミンおよび類似の脂質ベースのトランスフェクション試薬）、ウイルス性形質転換、無血清培養に関連する栄養素ならびに成長因子欠乏、または例えば、界面活性剤および電気穿孔によって引き起こされる細胞膜への損傷による、バイオリアクター内の高密度培養ならびに増加した細胞内カルシウム濃度に関連する細胞分化プロトコルの低酸素状態ならびに酸化ストレスが含まれる。
細胞死の実際の過程が発生する前に、アポトーシス信号は、アポトーシス経路の活性化を監視するゲートキーパーの機能を果たす調節タンパク質を克服しなければならない。生体内において、細胞はもはや死ぬ必要がない場合、このステップがその過程を停止させる。いくつかのタンパク質がこのステップに関与するが、調節の２つの主要機構が同定されており、ミトコンドリア機能性に関連するもの、およびアダプタータンパク質を介してアポトーシス機構に信号を変換することに直接関与するものを含む。
細胞培養条件下で成長する細胞は、アポトーシス信号を誘発し得、かつアポトーシスに対して細胞の感受性を増加し得る、上述の日常的な組織培養手順に関連する細胞ストレスを経験し得る。例えば、無血清培養に関連する栄養欠乏、バイオリアクター内での高密度成長に関連する酸化ストレス、ＤＮＡトランスフェクション試薬に関連する細胞毒性化合物の使用、および凍結保存に関連する熱ストレスは、細胞がアポトーシスに入りやすくし得る。そのような信号を乗り切る細胞の能力を高めるために、これらの手順中に、細胞死に対する細胞のコミットメントを防止することによって、細胞の生存率を改善することが可能であり、それによって、これらのアプローチの成功および有用性を改善する。
近年、アポトーシスの開始を阻害するか、もしくはその影響を低減する真核細胞中の多数の遺伝子が特定されている。これらの遺伝子のいくつかは、細胞中のカスパーゼ依存的アポトーシス経路を阻害し、実際、抗アポトーシス遺伝子でトランスフェクトした細胞は、生物学的に要件の厳しい条件下で成長するトランスフェクトした細胞の延命および生産性に有用であり得る。（米国特許第６，５８６，２０６号、同第７，５３１，３２７号、米国特許出願米国第２００９／０１７０１６５号、同米国２００９／０１８１４２６号）。
さらに、ある場合には、外因性熱ショックタンパク質の添加は、様々な条件下で培養中の細胞の生存を改善することを示している（Ｎｏｖｏｓｅｌｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９４ ５９７−６０６（２００５）、Ｔｉｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ＆ Ｃｈａｐ ９（１）８８−９０（２００４）、Ｇｕｚｈｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ＆ Ｃｈａｐ．３（１）６７−７７（１９９８）、Ｈｏｕｎｅｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ ＆ Ｃｈａｐ １（３）１６１−１６６（１９９６）、Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２９Ａ８０７−８１２（１９９３）。
本発明は、植物由来組換え細胞培養成分タンパク質が、特定の混合で、培養で成長する哺乳類細胞に添加された時に、細胞成長および生存率を驚くほど高めたという証明に一部基づいている。驚いたことに、タンパク質のいくつかの組み合わせは、細胞成長および生産性に、個々のタンパク質での使用と比較して、予期せぬ利益を提供する相乗効果を提供する。具体的には、植物由来組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質を含むそのような栄養補助剤は、改善された培養生存率、延長された細胞生存、細胞成長の改善された速度、ならびに組織培養バイオリアクターから産生される組換えタンパク質の改善された収率をもたらす。栄養補助剤が予想外に改善された活性および安定性を示すため、標準の組換えまたは精製タンパク質の使用と比較して、それらは著しい改善を提供する。
本出願に開示される栄養補助剤は、例えば、細胞の生存率を改善するのに、ならびに培養中で成長する細胞の細胞成長速度を加速するのに有用である。一態様では、本発明の栄養補助剤は、細胞培養からの組換えタンパク質の収率を改善または高めるのに有用である。本発明で提供するさらなる改善が、下で詳しく説明される。
一実施形態では、本発明には、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞の細胞成長を高めるための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、無血清培地への栄養補助剤の添加を含む、無血清培地に適応された細胞の生産性を高めるための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内の乳酸塩の蓄積を低減するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内のブドウ糖および他の糖の消費を低減するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、バイオリアクター内の培養中の細胞への栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内での培養の開始から採取までの、タンパク質を産生するために必要とされる時間を減らす方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、バイオリアクターへの栄養補助剤の添加を含む、バイオリアクター内の細胞の生存率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、無血清培地への栄養補助剤の添加を含む、無血清条件下で成長する細胞の生存率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、低密度で播種する時に細胞の生存率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、単細胞クローンから成長する細胞の生存率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養培地への栄養補助剤の添加を含む、培養中で成長する初代細胞の生存率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、トランスフェクションの前、最中、または直後の細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、トランスフェクション後の細胞の生存率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、凍結保存もしくは解凍の前、最中、または直後の細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含む、凍結保存後の細胞の生存率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、細胞培養培地への本発明の栄養補助剤の添加を含む、培養中で成長する幹細胞の細胞成長速度または生存率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養の増殖期、過渡期、または産生段階のうちの１つ以上の間に、細胞培養培地への本発明の栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞から産生される組換え産物の収率を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養の増殖期、過渡期、または産生段階のうちの１つ以上の間に、培養への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞から産生される組換え産物の精製を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養の増殖期、過渡期、または産生段階のうちの１つ以上の間に、培養への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞から産生される組換え産物のタンパク質分解を減少するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養の増殖期、過渡期、または産生段階のうちの１つ以上の間に、培養への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞から産生される組換え産物の生物活性を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養の増殖期、過渡期、または産生段階のうちの１つ以上の間に、培養への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞から産生される組換え産物の安定性を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養の増殖期、過渡期、または産生段階のうちの１つ以上の間に、培養への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞から産生される組換え産物の構築を改善するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養の増殖期、過渡期、または産生段階のうちの１つ以上の間に、培養への栄養補助剤の添加を含む、培養中の細胞から産生されるよりヒト様にグリコシル化した組換え産物を作製するための方法が含まれる。
一実施形態では、本発明には、培養の増殖期、過渡期、または産生段階のうちの１つ以上の間に、培養への組換えアルブミンを含む栄養補助剤の添加を含む、より低い免疫原性で培養中の細胞から産生される組換え産物を作製するための方法が含まれる。
これらの方法のいずれにおいても、本発明の栄養補助剤は、培養中（および発酵の間）の宿主細胞の生存率を増加させることによって、機能的組換えタンパク質の収率、およびまたは純度、生物活性、安定性、ならびに構築を増加させるための単純かつ費用効率の高い方法を提供する。さらに、本発明の栄養補助剤は、細胞培養中のアポトーシスを減少させるか、または阻害することによって、培養培地中の有害なプロテアーゼの数または存在を減少させ、タンパク質分解に対して発現した目的のタンパク質を保護することができ、それによって、活性タンパク質の増加した量および無傷タンパク質の増加した収率によって証明されるように、産生された目的のタンパク質の質を増加させる。さらに、出願者は、本発明の栄養補助剤が、界面活性剤、重金属、および培養成分中に存在する内毒素汚染物等の薬剤の潜在的な悪影響に対して細胞を保護し得るか、またはトランスフェクションもしくは凍結保存の間に細胞に導入される毒性試薬から細胞を保護し得る。
特許請求される方法のいずれにおいても、本発明の栄養補助剤を、任意の都合のよい時、例えば、培地を変更する時、細胞を継代する時、または細胞を低密度で播種する時に、培養培地に直接、もしくは混合で添加することができる。任意で、栄養補助剤は、細胞培養過程の初期（開始する時、０日目）に培養培地に添加される。一態様では、本発明の栄養補助剤は、予測されるストレスの多い事象前、例えば、凍結保存前、トランスフェクション前、または血清枯渇前等に添加され得る。
別の態様では、栄養補助剤は、アポトーシスの誘導が典型的に発生するより前に、細胞の培養の間に培養培地に添加される。例えば、大規模細胞培養の間、アポトーシスの誘導は培養の約３日目または４日目に観察され得、したがって、栄養補助剤は、好ましくは、３日目または４日目の前に添加される。任意で、栄養補助剤の所望の量が、細胞培養を通して、または細胞培養の期間中、例えば、発酵全体を通して、毎日添加される。例として、５日間の培養では、栄養補助剤は、０日目に、その後、培養が終了するまで２４時間おきに添加され得る。
したがって、一実施形態では、本発明は、本発明の栄養補助剤をバイオリアクターに添加することによって、バイオリアクター内で産生される組換えタンパク質の収率および質を改善する方法を提供する。一実施形態では、バイオリアクターは、細菌性細胞を含む。別の態様では、バイオリアクターは、酵母細胞を含む。別の態様では、バイオリアクターは、植物細胞を含む。別の態様では、バイオリアクターは、哺乳類細胞を含む。
別の実施形態では、本発明は、本発明の栄養補助剤を細胞培養に添加することによって、細菌性細胞中で産生される組換えタンパク質の収率および質を改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の栄養補助剤を細胞培養に添加することによって、酵母細胞中で産生される組換えタンパク質の収率および質を改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の栄養補助剤を細胞培養に添加することによって、植物細胞中で産生される組換えタンパク質の収率および質を改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の栄養補助剤を細胞培養に添加することによって、昆虫細胞中で産生される組換えタンパク質の収率および質を改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の栄養補助剤を細胞培養に添加することによって、哺乳類細胞中で産生される組換えタンパク質の収率および質を改善する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養系の産生段階の前または最中に、本発明の栄養補助剤を細胞培養系に添加することによって、細胞培養系の産生段階の収率を増加させ、それによって、バイオリアクターの生産性を増加させる方法を提供する。
本方法の一態様では、産生段階の収率が約１０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約２０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約３０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約４０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約５０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約６０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約７０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約８０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約９０％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約１００％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約２００％増加する。本方法の一態様では、産生段階の収率が約５００％増加する。
これらの方法のいずれかの一態様では、栄養補助剤が添加されなかった対照細胞培養系と比較して、収率が増加する。これらの方法のいずれかの一態様では、トランスフェリン関連タンパク質または組換え血清アルブミンのいずれかを欠如する栄養補助剤が添加される対照細胞培養系と比較して、収率が増加する。一態様では、同一の培養条件下で測定される時、単独で添加された場合の組換えアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、収率が増加する。
別の実施形態では、本発明は、目的のタンパク質を発現する細胞への本発明の栄養補助剤の添加を含む、そのタンパク質の産生に関する正常な成長条件と比較して上昇する温度で、目的のタンパク質を産生する方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養発現システムへの本発明の栄養補助剤の添加を含む、凝集の傾向のある目的のタンパク質によって細胞培養発現システム中で形成される凝集物の量を減少させる方法を提供し、それによって、タンパク質の凝集状態が低減する。
別の実施形態では、本発明は、細胞への本発明の栄養補助剤の添加を含む、組換えタンパク質の変性および凝集を防止することによって、細胞によって発現される目的タンパク質のタンパク質の活性を増加する方法を提供し、それによって、目的のタンパク質の特定の活性が増加する。
別の実施形態では、本発明は、細胞培養発現システムへの本発明の栄養補助剤の添加を含む、凝集傾向があり、沈殿を引き起こすか、またはそれら自体が細胞に対して毒性である細胞培養発現システム中でタンパク質の発現を改善する方法を提供し、それによって、目的のタンパク質の発現が増加する。
これらの方法のいずれにおいても、添加する栄養補助剤の量は、例えば、宿主細胞の種類、細胞密度、目的のタンパク質、および培養条件等の多様な要因に依存する。培養培地に添加する栄養補助剤の所望の濃度を決定することは、当技術分野の範囲内であり、日常の最適化によって、および過度の実験なしで、実験的に解明することができる。
当業者は、異なる細胞型が、本発明の栄養補助剤に対して異なる大きさの応答を有し、これはある程度、栄養補助剤中のタンパク質の量または種類によって決定されることを容易に理解する。さらに、細胞の異なる密度は、増加した細胞数を計上するために、栄養補助剤の総量、ならびに培養物に添加される個々のタンパク質の濃度における適切な調整を必要とする。さらに、懸濁培養中で、または接着培養を介して成長する細胞は、タンパク質侵入に使用可能な異なる膜表面を有し、典型的には、異なる速度および程度の反応を示す。したがって、アポトーシスの十分な阻害、または生存率の増加もしくは正味の細胞成長を提供する濃度を選択しなければならない。典型的には、本発明の栄養補助剤は、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、または約５０重量／重量％、もしくは重量／体積％の終末濃度になるまで添加される。
細胞生存のさらなる増加がそれを超えて発生しない栄養補助剤の濃度の上限範囲が典型的には存在する。下の実施例で説明されるように、出願者は、本発明の栄養補助剤が、約２００ｍｇ／Ｌ〜約２ｇ／Ｌ、またはより好ましくは、約２００ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌ、またはより好ましくは、約２５０〜約５００ｍｇ／Ｌの濃度で細胞培養に添加される時に、アポトーシスを阻害することができることを見出した。
ＩＩ．栄養補助剤
細胞培養培地、補充細胞培養培地を産生するための方法、ならびに本発明に従って強化された細胞培養培地を用いて細胞を培養する方法には、動物、植物、細菌、酵母、および昆虫源に由来する成分が含まれ得る。本発明の一態様によると、成分は、植物源に由来し、好ましくは、単子葉植物由来である。成分は、多種多様の異なる細胞培養培地を形成するために、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＣａＣｌ２、およびＭｇＣｌ２等の無機塩と、ならびにアミノ酸、ビタミン、成長因子、糖、および抗生物質等の他の材料と混合され得る。
さらなる実施形態によると、細胞培養培地中に含有されるタンパク質は、組換えタンパク質、好ましくは、組換えヒトタンパク質である。またさらなる実施形態によると、細胞培養培地中のタンパク質の１つ以上は、植物産生された異種タンパク質であり、好ましくは、細胞培養培地中のタンパク質の２つ以上は、植物産生された異種タンパク質であり、より好ましくは、細胞培養培地中のタンパク質の全ては、植物産生された異種タンパク質である。
別の態様によると、タンパク質の１つは、アルブミンであり、少なくとも１つの追加のタンパク質は、成長因子、ラクトフェリン、トランスフェリン、インスリン、成長ホルモン、フィブロネクチン接合因子、ラミン接合因子、コラゲナーゼ、血小板由来成長因子、脳由来神経栄養因子、グリア由来神経栄養因子、胸腺因子、ハプトコリン、ラクタヘドリン、ラクトペルオキシダーゼ、アルファフェトプロテイン、免疫グロブリン、アルファラクトアルブミン、および派生物、破片、ならびに生物学的に活性であるそのフラグメントから成る群から選択される。
さらなる実施形態によると、補充細胞培養培地を産生する方法で使用されるタンパク質の組み合わせは、細胞培養培地中に存在する細胞の成長および／または生産性に相乗効果を提供する。またさらなる実施形態によると、補充細胞培養培地を産生する方法で使用され得るタンパク質の１つの組み合わせには、ラクトフェリン、トランスフェリン、メラノトランスフェリン、およびオボトランスフェリンから成る群から選択される少なくとも１つの他のタンパク質とアルブミンとの組み合わせが含まれる。
一態様では、本発明の栄養補助剤には、植物由来組換えヒト血清アルブミンが含まれる。
「アルブミン」という用語は、アルブミンの全ての自然発生形態および合成形態を指す。好ましくは、「アルブミン」という用語は、組換えアルブミンを指す。一態様では、アルブミンは、脊椎動物由来である。一態様では、アルブミンは、哺乳動物由来である。さらなる実施形態では、アルブミンはヒトである。別の態様では、組換えアルブミンは、植物細胞から産生される。特に好ましい一実施形態では、組換えアルブミンは、遺伝子組換えイネ（オリザサティバ）から産生される。多様な種のアルブミンに関する代表的な種および遺伝子バンク受入番号は、下の表Ｄ１に記載される。
Figure 2012518409
異なる種におけるアルブミンの組換え産生のために、対象となる宿主生物に対して遺伝子の核酸配列をコドン最適化することが典型的に必要であることが理解される。そのようなコドン最適化を、対象となる宿主生物に対する好ましいコドン使用頻度、ならびに標準のＤＮＡ合成を介する最適化された核酸の合成の標準分析によって完了することができる。多数の会社がサービス手数料方式でそのようなサービスを提供し、例えば、ＤＮＡ２．０（ＣＡ，ＵＳＡ）およびＯｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＡ，ＵＳＡ）が含まれる。
アルブミンは、その自然形態、すなわち、天然に見られる対立遺伝子変異体であってもよく、それらは例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端または両方から）、または他のアミノ酸欠失、付加、挿入、置換、もしくは翻訳後修飾により、それらのアミノ酸配列で異なってもよい。例えば、ピログルタミニル、イソ−アスパルチル、アルブミンのタンパク分解、リン酸化、グリコシル化、低減した、酸化、異性化、脱アミノ化変異体を含む、アルブミンの翻訳後修飾および分解産物を含む自然に発生する化学修飾もまた、本発明の方法のいずれにも明確に含まれる。
天然もしくは合成アルブミン配列のフラグメントも同様に、それらが由来するペプチドの望ましい機能的特性を有し得、本発明の方法のいずれでも使用され得る。したがって、本明細書で使用される「フラグメント」という用語には、フラグメントが全分子の生物学的または治療的に有益な活性を保持することを条件とするアルブミンのフラグメントが含まれる。
例えば、アルブミンは、銅、亜鉛、カドミウム、およびニッケルを含む、多数の生理学的に重要な金属イオンに対して、少なくとも２個の、高親和性の複数の金属結合部位を含有する。（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５ １５３−２０３（１９９４）、Ｂａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７０（１）３３−３９（１９９８）、Ｂｌｉｎｄａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（３４）２３１１６−２４（２００９）、米国特許第６，７８７，６３６号）。これらの金属は典型的にはアルブミンの組換え産生に微量存在するため、大量のこれらの金属イオンはタンパク質に対してキレート化し得る。これらのイオンの結合、特に、組換えアルブミンへのカドミウムおよびニッケルの結合は、組織培養物成分として細胞に添加される時に、タンパク質の細胞毒性に関連する。
したがって、一態様では、本発明のアルブミンは、アルブミンの複数の金属結合部位に関与する１つまたはアミノ酸の欠失を含むアルブミンのフラグメントを含むことができる。一態様では、アルブミンフラグメントは、成熟タンパク質のＮ末端において、１つ以上のアミノ酸の欠失によって作製される。別の態様では、アルブミンは、アルブミンのＮ末端金属結合部位に関与するアミノ酸のいずれかの１つ以上の欠失または突然変異を含むことができる。一態様では、欠失または突然変異するアミノ酸は、成熟タンパク質の最初の１０個のアミノ酸から独立して選択される。
したがって、本明細書で使用される「派生物」という用語は、天然の配列と比較して修飾を有する、アルブミン配列またはそのフラグメントを指す。そのような修飾は、１つ以上のアミノ酸欠失、付加、挿入、および／または置換であり得る。これらは、隣接または非隣接であり得る。代表的な変異体には、表Ｄ１に記載される遺伝子のいずれかと比較して、１〜２０個、またはより好ましくは、１〜１５、１〜１０、もしくは１〜５個のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を有するものが含まれ得る。置換アミノ酸は、任意のアミノ酸であってよく、特に、よく知られている２０個の従来のアミノ酸（Ａｌａ（Ａ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｉｎ（Ｑ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、およびＴｙｒ（Ｙ））の１つである。アルブミンの任意のそのような変異体または派生物は、本発明の方法のいずれにおいても使用され得る。
したがって、本発明のアルブミンは、アルブミンの機能的結合ドメインのいずれにおいても、アミノ酸欠失、挿入、または突然変異を含むことができる。一態様では、アルブミンには、アルブミンの結合ドメインにおける突然変異が含まれ得る。一態様では、突然変異した結合ドメインは、米国特許第５，７８０，５９３号で概説される、アスピリン、ワルファリン、ジアゼパム、ジギトキシン、クロフィブラート、イブプロフェン、もしくはＡＺＴの結合に関与するドメイン、またはＢｌｉｎｄａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４（３４）２３１１６−２４（２００９）で概説される、複数の金属結合部位である。
したがって、本発明の方法のいずれにおいても使用され得るアルブミンは、天然アルブミンアミノ酸配列、例えば、表Ｄ１に記載される天然アルブミン遺伝子配列のいずれかに実質的に相同するか、もしくは実質的に類似するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、アルブミンは、表Ｄ１に記載されるアルブミンと少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。好ましい実施形態では、本発明の方法のいずれにおける使用のためのアルブミンも、以下の下線部分に示されるように、成熟分泌性ヒト血清アルブミン（配列番号１）と少なくとも８０％同一である（スイスプロットＰ０２７６８）：
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬ ＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧ ＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥ ＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥ ＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡ ＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦ
ＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶ ＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤ ＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬ ＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴ ＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥ ＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰ
ＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫ ＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶ ＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡ ＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫ ＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨ ＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦ
ＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴ ＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡ ＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲ ＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱ ＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦ ＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶ
ＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡ ＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴ ＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣ ＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤ ＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥ ＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫ
ＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫ ＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤ ＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡ ＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣ ＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦ ＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲ
ＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬ ＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴ ＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰ ＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥ ＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮ ＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥ
ＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡ ＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰ ＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶ ＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫ ＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭ ＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶ
ＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫ ＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣ ＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰ ＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴ ＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴ ＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬ
ＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱ ＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫ ＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡ ＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥ ＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴ ＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶ
ＡＡＳＱＡＡＬＧＬ。
他のタンパク質に対するアルブミンの融合タンパク質も含まれ、これらの融合タンパク質は、活性、標的、安定性、または効力を高め得る。
アルブミン活性もしくは生物学的半減期を保持または安定化する天然アルブミン構造の化学修飾もまた、本明細書で説明される方法のいずれでも使用することができる。そのような化学修飾戦略には、制限なしに、ペグ化、グリコシル化、ならびにアシル化が含まれ（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３６）：２１９６９−２１９７７，１９９６、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．：Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４（４）：４５９−４７６，（２００２）、Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｒｅｓ．４６（３−４）：２５３−２６４，（１９９５）、Ｇａｒｂｅｒ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．７（６）６６６−７４（２００５）を参照）、ＣおよびＮ末端保護基ならびにペプチド模倣ユニットも含まれ得る。
天然Ｌ−アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸の異性体は、アルブミンの上記の形態のいずれにも組み込まれ得、本発明の方法のいずれにおいても使用され得る。アルブミンの全てのそのような変異体、派生物、融合タンパク質、またはフラグメントが含まれ、本明細書に特許請求もしくは開示される方法のいずれかにおいて使用され得、ならびに「アルブミン」という用語下に包含される。
本発明の栄養補助剤の一態様では、アルブミンは、植物中で産生された組換えヒト血清アルブミンである。別の態様では、アルブミンには、約２％未満の凝集アルブミンが含まれる。別の態様では、アルブミンには、約１％未満の凝集アルブミンが含まれる。
一実施形態では、本発明の栄養補助剤には、同時精製組換えアルブミンおよびｈｓｐの肯定的な影響をさもなければ遮蔽または阻害するであろう本質的に界面活性剤もしくは内毒素を含んでいないイネｈｓｐの調製が含まれる。一態様では、本発明の栄養補助剤は、約１ＥＵ未満の内毒素を有し、アルブミンは、少なくとも約９５％純粋である。別の態様では、本発明の栄養補助剤には、熱ショックタンパク質に結合する組換えアルブミンを含む組成物が含まれる。別の態様では、本発明の栄養補助剤には、組換えアルブミンおよびイネｈｓｐ７０相同体が含まれる。一態様では、イネｈｓｐ７０相同体は、ＨＳＰ７０、Ｂｉｐ、およびイネ間質タンパク質から選択される。
本明細書で使用される「熱ショックタンパク質」、「ＨＳＰ」、または「ｈｓｐ」という用語には、抗アポトーシス活性を保持する熱ショックタンパク質スーパーファミリーの全ての自然発生形態および合成形態が含まれる。そのような熱ショックタンパク質には、小さい熱ショックタンパク質／ＨＳＰＢファミリー、Ｈｓｐ４０／ＤｎａＪファミリー、ＨＳＰ７０／ＨＳＰＡファミリー、ＨＳＰ９０／ＨＳＰＣファミリー、ＨＳＰ１１０／ＨＳＰＨファミリー、およびシャペロンファミリー、ならびに２つ以上の熱ショックタンパク質またはそれらに由来するヌクレオチド交換因子（例えば、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ４０の複合体）のペプチドフラグメントおよびタンパク質複合体が含まれる。熱ショックタンパク質は、それらの自然形態、すなわち、機能的に同等の変異体と見なされ得る異なる種において、天然に見られる異なる変異体であってもよく、またはそれらは、機能的に同等のその自然派生物であってもよく、トランケーション（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端または両方から）、または他のアミノ酸欠失、付加、挿入、置換、もしくは翻訳後修飾により、それらのアミノ酸配列で異なってもよい。例えば、ピログルタミニル、イソ−アスパルチル、ＨＳＰのタンパク分解、リン酸化、グリコシル化、酸化、異性化、ならびに脱アミノ化変異体を含む、ＨＳＰの翻訳後修飾および分解産物を含む自然に発生する化学派生物もまた、本発明の方法のいずれかに明確に含まれる。
「トランスフェリン関連タンパク質」という用語は、トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノトランスフェリン、およびオボトランスフェリンを含むトランスフェリンファミリータンパク質を指す。これまでに解析されている全ての種にわたるトランスフェリンファミリーメンバーの結晶構造は、高度の構造上の類似性を示し、これは、トランスフェリン、ラクトフェリン、およびオボトランスフェリンが６０〜８０％の配列同一性を共有するため、驚くべきことではない。（Ｗａｌｌｙ ａｎｄ Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ（２００７）２０ ２４９−２６２）。全てのトランスフェリン関連タンパク質は、約３４０個の残基の２つのドメインを含有し、それらは古代の複製事象から進化したと考えられる。血清トランスフェリン、オボトランスフェリン、およびラクトフェリンに関して、重複ローブの各々は、Ｆｅ（ＩＩＩ）の１つの原子ならびに１つの炭酸アニオンに結合する。少数の特記すべき例外を除いて、各々の鉄原子は、４個の保存アミノ酸残基、すなわち、アスパラギン酸、２つのチロシン、およびヒスチジンに配位する一方で、アニオン結合は、近接近してアルギニンならびにトレオニンに関連する。（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０９ ７１１−７３４）。
ヒトトランスフェリンおよびラクトフェリンは、６１％以上の配列同一性を共有し、類似した三次元構造を有する。トランスフェリンは、ＴＦ−受容体複合体が内部移行され、鉄がエンドソーム内に放出され、かつ複合体が、ＴＦが放出された細胞表面に再循環される、受容体媒介エンドサイトーシス過程において、遊離鉄イオンを受け取り、それを細胞に送達することによって、血液内で鉄を輸送する。対照的に、ラクトフェリンもしくはオボトランスフェリンに関する鉄輸送の役割は知られていない。比較して、これらのタンパク質は、全ての利用可能な鉄を隔離することによって、侵略細菌が鉄を獲得するのを防止するように機能すると考えられる。ヒトトランスフェリンは、ヒトラクトフェリンが放出するよりも高いｐＨで鉄を放出し、それは、恐らく、ヒトトランスフェリンがエンドサイトーシス後に鉄をエンドソーム内に放出する必要性、ならびにラクトフェリンが胃等の低ｐＨ環境で鉄を保持する必要性に関連する（Ｂａｋｅｒ ＆ Ｂａｃｋｅｒ（２００４）Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ １７ ２０９−２１６）。
「トランスフェリン」という用語は、トランスフェリンの全ての自然発生形態および合成形態を指す。一態様では、「トランスフェリン」という用語は、組換えトランスフェリンを指す。一態様では、「トランスフェリン」という用語は、血漿由来トランスフェリンを指す。一態様では、トランスフェリンは、脊椎動物由来である。一態様では、トランスフェリンは、哺乳動物由来である。さらなる実施形態では、トランスフェリンは、ヒトである。別の態様では、組換えトランスフェリンは、植物細胞から産生される。特に好ましい一実施形態では、組換えトランスフェリンは、遺伝子組換えイネ（オリザサティバ）から産生される。トランスフェリンの様々な種に関する代表的な種および遺伝子バンク受入番号は、下の表Ｄ２に記載される。
Figure 2012518409
トランスフェリンは、その自然形態、すなわち、天然に見られる異なるアポ型、もしくは対立遺伝子変異体であってもよく、それらは例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端または両方から）、または他のアミノ酸欠失、付加、挿入、置換、もしくは翻訳後修飾により、それらのアミノ酸配列で異なってもよい。例えば、ピログルタミニル、イソ−アスパルチル、トランスフェリンのタンパク分解、リン酸化、グリコシル化、低減した、酸化、異性化、および脱アミノ化変異体を含む、トランスフェリンの翻訳後修飾および分解産物を含む自然に発生する化学修飾もまた、本発明の方法のいずれかに明確に含まれる。
本発明の方法のいずれにおいて使用され得るトランスフェリンも、天然トランスフェリンアミノ酸配列、例えば、表Ｄ２に記載される天然トランスフェリン遺伝子配列のいずれかに実質的に相同するか、もしくは実質的に類似するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、トランスフェリンは、表Ｄ２に記載されるトランスフェリンと少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。好ましい実施形態では、本発明の方法のいずれかにおける使用のためのトランスフェリンは、成熟ヒトトランスフェリンと少なくとも８０％同一である。
「ラクトフェリン」という用語は、ラクトフェリンの全ての自然発生形態および合成形態を指す。一態様では、「ラクトフェリン」という用語は、組換えラクトフェリンを指す。一態様では、「ラクトフェリン」という用語は、乳由来ラクトフェリンを指す。一態様では、ラクトフェリンは、脊椎動物由来である。一態様では、ラクトフェリンは、哺乳動物由来である。さらなる実施形態では、ラクトフェリンは、ヒトである。別の態様では、組換えラクトフェリンは、植物細胞から産生される。特に好ましい一実施形態では、組換えラクトフェリンは、遺伝子組換えイネ（オリザサティバ）から産生される。ラクトフェリンの様々な種に関する代表的な種および遺伝子バンク受入番号は、下の表Ｄ３に記載される。
Figure 2012518409
ラクトフェリンは、その自然形態、すなわち、天然に見られる異なるアポ型、もしくは対立遺伝子変異体であってもよく、それらは例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端または両方から）、または他のアミノ酸欠失、付加、挿入、置換、もしくは翻訳後修飾により、それらのアミノ酸配列で異なってもよい。例えば、ピログルタミニル、イソ−アスパルチル、ラクトフェリンのタンパク分解、リン酸化、グリコシル化、低減した、酸化、異性化、および脱アミノ化変異体を含む、ラクトフェリンの翻訳後修飾および分解産物を含む自然に発生する化学修飾もまた、本発明の方法のいずれかに明確に含まれる。本発明の方法のいずれにおいて使用され得るラクトフェリンも、天然ラクトフェリンアミノ酸配列、例えば、表Ｄ３に記載される天然ラクトフェリン遺伝子配列のいずれかに実質的に相同するか、もしくは実質的に類似するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、ラクトフェリンは、表Ｄ３に記載されるラクトフェリンと少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。好ましい実施形態では、本発明の方法のいずれかにおける使用のためのラクトフェリンは、成熟ヒトラクトフェリンと少なくとも８０％同一である。
「メラノトランスフェリン」という用語は、メラノトランスフェリンの全ての自然発生形態および合成形態を指す。一態様では、「メラノトランスフェリン」という用語は、組換えメラノトランスフェリンを指す。一態様では、「メラノトランスフェリン」という用語は、細胞または組織から精製されるメラノトランスフェリンを指す。一態様では、メラノトランスフェリンは、脊椎動物由来である。一態様では、メラノトランスフェリンは、哺乳動物由来である。さらなる実施形態では、メラノトランスフェリンは、ヒトである。別の態様では、組換えメラノトランスフェリンは、植物細胞から産生される。特に好ましい一実施形態では、組換えメラノトランスフェリンは、遺伝子組換えイネ（オリザサティバ）から産生される。メラノトランスフェリンの様々な種に関する代表的な種および遺伝子バンク受入番号は、下の表Ｄ４に記載される。
Figure 2012518409
「オボトランスフェリン」という用語は、オボトランスフェリンの全ての自然発生形態および合成形態を指す。一態様では、「オボトランスフェリン」という用語は、組換えオボトランスフェリンを指す。一態様では、オボトランスフェリンは、脊椎動物由来である。一態様では、オボトランスフェリンは、トリ由来である。別の態様では、組換えオボトランスフェリンは、植物細胞から産生される。特に好ましい一実施形態では、組換えオボトランスフェリンは、遺伝子組換えイネ（オリザサティバ）から産生される。オボトランスフェリンの様々な種に関する代表的な種および遺伝子バンク受入番号には、ＣＡＡ２６０４０．１が含まれる。
「インスリン関連成長因子」または「ＩＧＦ−１」という用語は、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１Ａ、ＩＧＦ−１Ｂ、ＩＧＦ−２Ａ、およびＩＧＦ−２Ｂを含む、インスリン関連成長因子の全ての自然発生形態および合成形態を指す。一態様では、「インスリン関連成長因子」という用語は、組換えインスリン関連成長因子を指す。一態様では、「インスリン関連成長因子」という用語は、細胞または組織から精製されるインスリン関連成長因子を指す。一態様では、インスリン関連成長因子は、脊椎動物由来である。一態様では、インスリン関連成長因子は、哺乳動物由来である。さらなる実施形態では、インスリン関連成長因子は、ヒトである。別の態様では、組換えインスリン関連成長因子は、植物細胞から産生される。特に好ましい一実施形態では、組換えインスリン関連成長因子は、遺伝子組換えイネ（オリザサティバ）から産生される。インスリンの様々な種に関する代表的な種および遺伝子バンク受入番号は、下の表Ｄ５に記載される。
Figure 2012518409
インスリン関連成長因子は、その自然形態、すなわち、天然に見られる異なるアポ型、もしくは対立遺伝子変異体であってもよく、それらは例えば、トランケーション（例えば、Ｎ末端もしくはＣ末端または両方から）、または他のアミノ酸欠失、付加、挿入、置換、もしくは翻訳後修飾により、それらのアミノ酸配列で異なってもよい。例えば、ピログルタミニル、イソ−アスパルチル、インスリン関連成長因子のタンパク分解、リン酸化、グリコシル化、低減した、酸化、異性化、および脱アミノ化変異体を含む、インスリン関連成長因子の翻訳後修飾および分解産物を含む自然に発生する化学修飾もまた、本発明の方法のいずれにも明確に含まれる。本発明の方法のいずれにおいて使用され得るインスリン関連成長因子も、天然インスリン関連成長因子アミノ酸配列、例えば、表Ｄ５に記載される天然インスリン関連成長因子遺伝子配列のいずれかに実質的に相同するか、もしくは実質的に類似するアミノ酸配列を有し得る。あるいは、インスリン関連成長因子は、表Ｄ５に記載されるインスリン関連成長因子と少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。好ましい実施形態では、本発明の方法のいずれかにおける使用のためのインスリン関連成長因子は、成熟ヒトインスリン関連成長因子と少なくとも８０％同一である。
一態様では、栄養補助剤には、約１対５、約１対１０、約１対１５、約１対２０、または約１対２５のラクトフェリンとアルブミンとの比率で混合されたラクトフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のラクトフェリンの濃度は、約０．１〜約０．５ｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも３０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対１、約１対２、約１対３、約１対４、または約１対５のラクトフェリンとアルブミンとの比率で混合されたラクトフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のラクトフェリンの濃度は、約０．５〜約０．８ｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも３０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対０．５、約１対０．７５、約１対１，０、約１対１．２５、約１対１．５、約１対１．７５、または約１対２．０のラクトフェリンとアルブミンとの比率で混合されたラクトフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養物中のラクトフェリンの濃度は、約０．８〜約１．５ｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも３０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対０．２５、約１対０．３３、約１対０．６６、約１対１．００、約１対１．３３、約１対１．６６、または約１対２．０のラクトフェリンとアルブミンとの比率で混合されたラクトフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のラクトフェリンの濃度は、約１．０〜約１．５ｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも３０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対０．８、約１対１、または約１対１．２のラクトフェリンとアルブミンとの比率で混合されたラクトフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のラクトフェリンの濃度は、約０．１〜約１．５ｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも５０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対２０、約１対１００、または約１対２００のトランスフェリンとアルブミンとの比率で混合されたトランスフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のトランスフェリンの濃度は、約１〜約１０μｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも５０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対５００、約１対１０００、および約１対２０００のトランスフェリンとアルブミンとの比率で混合されたトランスフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のトランスフェリンの濃度は、約１〜約１０μｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも５０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対３０００、約１対４０００、および約１対５０００のトランスフェリンとアルブミンとの比率で混合されたトランスフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のトランスフェリンの濃度は、約１〜約１０μｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも５０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対８０、約１対１００、および約１対１２０のトランスフェリンとアルブミンとの比率で混合されたトランスフェリンおよび組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のトランスフェリンの濃度は、約３〜約８μｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも８０％の増加を示す。
一態様では、栄養補助剤には、約１対１０００００、約１対１００００、または約１対１０００のＩＧＦ−１とアルブミンとの比率で混合されたＩＧＦ−１および組換えアルブミンの混合物が含まれる。これらの栄養補助剤のいずれかの一態様では、培養中のＩＧＦ−１の濃度は、約１〜約１０μｇ／Ｌである。一態様では、栄養補助剤は、組織培養成分の組み合わせと同一の濃度で培養に添加され、同一の培養条件下で測定された場合の各々の細胞培養成分の相加効果のみと比較して、生産性において少なくとも５０％の増加を示す。
本発明の別の態様では、栄養補助剤は、成長因子、セレン酸ナトリウム、およびエタノールアミンから成る群から選択される１つ以上の付加的因子を含有する。
本発明の別の態様では、成長因子は、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子１−２３（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ）、ケラチノサイト成長因子１および２（ＫＧＦ）、ならびに白血病抑制因子（ＬＩＦ）から独立して選択される。一態様では、成長因子は、インスリンである。別の態様では、成長因子は、トランスフェリンである。
一態様では、本発明の栄養補助剤は、水溶液中で単離した細胞培養成分を混合することによって調製され得る。
１つの成分パートＡ（アルブミンまたは別の細胞培養成分）を含有する知られている濃度の液体を、パートＢ（トランスフェリン関連タンパク質またはＩＧＦ−１等）を含有する液体に混ぜ合わせ、成分の所望の比率を含有する比率を得ることもできる。他の細胞培養成分に対する任意の所望の範囲において、アルブミンの乾燥重量に基づく比率を得るために、粉末、凍結乾燥、またはさもなければ乾燥粉末（アルブミン）を、細胞培養成分（トランスフェリン関連タンパク質等）を含有する水溶液に直接添加することができる。粉末、凍結乾燥、またはさもなければ乾燥アルブミンを、細胞培養成分粉末とブレンドし、完全に重量測定に基づいた比率を得ることもできる。得られた粉末を、当分野に共通の好適な緩衝液中に、非常に低い濃度（ピコモル）から非常に高い濃度（ミリモル）に及ぶ濃度で溶解し、細胞培養成分を再構成することができる。
一態様では、本発明の栄養補助剤は、したがって、組換えアルブミンおよび１つ以上のトランスフェリン関連タンパク質ならびに／またはＩＧＦ−１を含む。そのような栄養補助剤は、滅菌液または粉末形状として一般に調製される。組成物中のトランスフェリン関連タンパク質の総量は、細胞培養成分の５０％〜約０．０００１％の重量まで様々であり得る。他の態様では、組成物中のトランスフェリン関連タンパク質の総量は、約０．０１％〜約０．０２％、もしくは約０．０１％〜約０．０９％、もしくは約０．０２％〜約０．０４％、もしくは約０．０２％〜約０．０６％、もしくは約０．０２％〜約０．０８％まで様々であり得る。別の態様では、組成物中のトランスフェリン関連タンパク質の量は、アルブミンに対して、約０．０１％より大きい、またはより好ましくは、約０．０５％より大きい、またはより好ましくは、約０．１重量／重量％より大きい、またはより好ましくは、約０．２重量／重量％のトランスフェリン関連タンパク質より大きい。
特許請求される栄養補助剤のいずれかの一態様では、組換えアルブミンは、本質的に内毒素および界面活性剤を含んでいない。別の態様では、アルブミンは、１ｍｇ当たり、約１ＥＵ未満の内毒素を有する。さらに別の態様では、アルブミンは、約１０ｐｐｍ未満の界面活性剤を含有する。特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、アルブミンは、９５％より大きい純度を有する。
特許請求される栄養補助剤のいずれかの別の態様では、栄養補助剤は、イネ熱ショックタンパク質に結合される組換えアルブミンを含み、複合体は、約１ＥＵ未満の内毒素を有し、アルブミンに対して少なくとも９５％純粋である。一態様では、組換えアルブミンは、イネ中で産生される。
これらの方法のいずれかの別の態様では、栄養補助剤は、細胞培養成分として組換えアルブミンを含有し、アルブミンは、本質的に凝集アルブミンを含んでいない。これらの栄養補助剤のいずれかの別の態様では、組換えアルブミンは、約２％未満の凝集アルブミンを有する。
したがって、一態様では、本発明の栄養補助剤は、１つ以上の結合したｈｓｐを伴う組換えアルブミンを含む。そのような栄養補助剤は、滅菌液または粉末形状として一般に調製される。アルブミン組成物中のｈｓｐの総量は、アルブミンの５％〜約０．００１％の重量まで様々であり得る。他の態様では、アルブミン組成物中のｈｓｐの総量は、約０．０１％〜約０．０２％、もしくは約０．０１％〜約０．０９％、もしくは約０．０２％〜約０．０４％、もしくは約０．０２％〜約０．０６％、もしくは約０．０２％〜約０．０８％まで様々であり得る。別の態様では、アルブミン組成物中のｈｓｐの量は、アルブミンに対して、約０．０２％より大きい、またはより好ましくは、約０．０３％より大きい、またはより好ましくは、約０．０４重量／重量％より大きい、またはより好ましくは、約０．０５重量／重量％のｈｓｐより大きい。
ＩＩＩ．細胞培養培地成分の産生
本発明の栄養補助剤における使用のためのアルブミンおよびトランスフェリン関連タンパク質、ならびに他の細胞培養培地成分を、任意の好適な方法、例えば、自然発生源からの単離によって、発現システムを含む遺伝子操作された宿主細胞（以下を参照）から、もしくは例えば、自動ペプチドシンセサイザーを使用する化学合成によって、またはそのような方法の任意の組み合わせによって調製することができる。そのようなポリペプチドを調製するための手段は、当分野でよく理解されている。
組換え産生のために、細胞培養培地成分をコードする核酸を組み込むように宿主細胞を遺伝子操作することができる。典型的には、核酸は、選択の発現システムにおける高レベル発現のためにコドン最適化され、宿主細胞中の目的のタンパク質の発現を可能にするために、発現ベクター中に組み込まれる。ベクターは、円形二重鎖ＤＮＡとして存在し、数キロベース（ｋｂ）から数百ｋｂの大きさに及び得る。好ましいクローニングベクターは、ポリヌクレオチド配列のクローニングおよび組換え操作を促進するように自然発生プラスミドから修飾されている。多くのそのようなベクターは、当分野では周知であり、かつ市販されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｉｎ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８９）），Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｉｎ：Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｖｏｌ．３，Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ｐｐ．５６３−６０８（１９８０）を参照されたい。
植物細胞からタンパク質を産生するための一般的かつ特定の方法は、以下の特許および適用から得られることができ、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：米国特許公開第２００３／０１７２４０３号Ａ１（”Ｐｌａｎｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”）、米国特許第６，９９１，８２４号（”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｉｌｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ”）、米国特許公開第２００３／０２２１２２３号（”Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｏｔ Ｓｅｅｄｓ”）、米国特許公開第２００４／００６３６１７号（”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｏｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ”）、および国際出願ＰＣＴ／米国第２００４／０４１０８３号（”Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｅｅｄｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ｓｅｅｄ−Ｓｔｏｒａｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｓ Ｆｕｓｉｏｎ Ｃａｒｒｉｅｒｓ”）。植物細胞からタンパク質を産生するための他の一般的かつ特定の方法は、例えば、以下の参考文献から得られることができ、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：米国特許第５，６９３，５０７号、米国特許第５，９３２，４７９号、米国特許第６，６４２，０５３号、および同第６，６８０，４２６号（ｅａｃｈ ｔｉｔｌｅｄ ”Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ”）、米国特許公開第２００５／００６６３８４号（”Ｓｉｔｅ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”）、米国特許公開第２００５／０２２１３２３号（”Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｔｒａｎｓ−Ｓｐｌｉｃｉｎｇ”）、米国特許公開第２００６／００２６７１８号（”Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ”）、ならびに米国特許公開第２００６／００７５５２４号（Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｉｎ ａ Ｍｕｌｔｉ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｏｒｇａｎｉｓｍ”）、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｔ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃｏｎｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）２３（６）：７１８−７２３。
発現ベクターには、プラスミド、エピソーム、コスミッド、レトロウイルス、またはファージが含まれ、発現ベクターは、細胞培養培地成分をコードするＤＮＡ配列を発現するために使用されることができ、一態様では、発現制御配列の構築を含む。プロモーターおよび他の調節要素の選択は、目的とする宿主細胞によって異なる可能性があり、多くのそのような要素は市販されており、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ，ＵＳＡ）のＧａｔｅｗａｙ Ｓｙｓｔｅｍ等の分離部品から容易に組み立てることができる。細胞培養培地成分への発現システムは、安定的または一過性発現システムであってもよい。
代表的な市販のウイルス性発現ベクターには、Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．から入手可能なＰｅｒ．Ｃ６システム等のアデノウイルスベースのシステム、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＬＰ１等のレンチウイルス性ベースのシステム、タバコモザイクウイルスベースのベクター（Ｌｉｎｄｂｏ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００７）７ ５２−５８）等のレトロウイルスベクターが含まれるが、それらに限定されない。
エピソーム発現ベクターは、宿主細胞中で複製可能であり、かつ適切なエピソーム選択圧の存在下で、宿主細胞内の染色体外エピソームとして存続する。（例えば、Ｃｏｎｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：１７３５−１７４２（２００４）を参照）。代表的な市販のエピソーム発現ベクターには、エプスタインバー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を利用するエピソームプラスミドが含まれるが、それらに限定されず、具体例として、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのベクターｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７が挙げられる。ＥＢＶベースのベクターの宿主域は、ＥＢＮＡ１結合タンパク質２（ＥＰＢ２）の同時発現を介して、事実上任意の真核細胞型にまで増加することができ（Ｋａｐｏｏｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ．Ｊ．２０：２２２−２３０（２００１））、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのベクターｐｃＤＮＡ３．１ならびにＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりにＴ抗原およびＳＶ４０複製起点を使用するエピソームベクターの非限定的な例を表す。
組込み発現ベクターは、宿主細胞のＤＮＡ中に無作為に組み込んでもよく、または発現ベクターと宿主細胞染色体との間の特異的組換えを可能にする組換え部位を含んでもよい。そのような組込み発現ベクターは、所望のタンパク質の発現をもたらすために、宿主細胞の染色体の内因性発現制御配列を利用することができる。部位特異的様式で組み込まれるベクターの例には、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｆｌｐ−ｉｎシステム（例えば、ｐｃＤＮＡ（商標）５／ＦＲＴ）またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＥｘｃｈａｎｇｅ−６ Ｃｏｒｅ Ｖｅｃｔｏｒｓで見出され得るもの等のｃｒｅ−ｌｏｘシステムの成分が挙げられる。無作為な方法で宿主細胞染色体中に組み込まれるベクターの例には、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ３．１（Ｔ抗原の不在下で導入される場合）、またはＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩもしくはｐＦＮ１０Ａ（ＡＣＴ）Ｆｌｅｘｉ（登録商標）が挙げられる。
あるいは、目的の内因性遺伝子の発現を調節するように、細胞中の遺伝子座に強力なプロモーターまたはエンハンサー配列を導入し、かつ組み込むために、発現ベクターを使用することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ ＭＲ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．（２００５）、６（６）：５０７−１２、Ｓｃｈｉｎｄｅｈｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（２００５）、２３（１）：１０−５）。このアプローチを、目的の内因性遺伝子の誘導性発現を提供するように、細胞のゲノムＤＮＡ中にＴｅｔ−Ｏｎプロモーター（米国特許第５，４６４，７５８号および同第５，８１４，６１８号）等の誘導性プロモーターを挿入するために使用することもできる。活性化コンストラクトはまた、目的の遺伝子に特異的な所望の遺伝子座への活性化配列の相同的または非相同的組換えを可能にするように標的化配列を含むこともできる（例えば、Ｇａｒｃｉａ−Ｏｔｉｎ ＆ Ｇｕｉｌｌｏｕ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．（２００６）１１：１１０８−３６を参照）。あるいは、４−ヒドロキシタモキシフェンの存在下でトランス遺伝子を活性化するために、Ｃｒｅ−ＥＲシステム等の誘導性リコンビナーゼシステムを使用することができる（Ｉｎｄｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９９）２７（２２）：４３２４−４３２７、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．（２０００）２８（２３）：ｅ９９、および米国特許第７，１１２，７１５号）。
細胞培養培地成分を産生するための好適な細胞には、原核生物細胞、酵母、昆虫細胞、植物発現システム、および哺乳類発現システムが含まれる。これらの一般的な指針の範囲内で、有用な微生物宿主には、バシラス属、エシェリキア属（大腸菌等）、シュードモナス属、ストレプトミセス属、サルモネラ属、エルビニア属、枯草菌、バチルスブレビス菌、大腸菌の多様な菌株（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ番号３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ番号５３３３８））由来の細菌が含まれるが、それらに限定されない。
酵母の多くの菌株は、当業者に知られており、また、ハンゼヌラ属、クリベロマイセス属、ピキア属、リノスポリジウム属、サッカロミセス属、およびシゾサッカロミセス属、ならびに他の菌類由来のものを含む、細胞培養培地成分の発現のための宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母細胞には、例えば、サッカロミセスセレビシアエおよびピキアパストリスが含まれる。
さらに、所望する場合、昆虫細胞システムを、本発明の栄養補助剤および方法における使用のための細胞培養培地成分を産生するために利用することができる。そのようなシステムは、例えば、Ｋｉｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−８１７（１９９３）、Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−５７２（１９９３）、およびＬｕｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ． （Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９（１９９３）によって説明される。好ましい昆虫細胞には、Ｓｆ−９およびＨＩ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
細胞培養培地成分の発現のために、多くの好適な植物発現システムを使用することができ、例として、例えば、任意の単子葉植物または双子葉植物が挙げられる。好適な単子葉植物には、制限なしに、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、トウモロコシ、キビ、ライコムギ、またはソルガムが含まれ、好ましくは、イネである。他の好適な植物には、シロイヌナズナ、ムラサキウマゴヤシ、タバコ、ピーナッツ、およびダイズが含まれる。
一般的に、植物での使用のための発現ベクターには、キメラ遺伝子を構成する以下の操作可能に連結する要素が含まれる：植物タンパク質をコードする遺伝子に由来し、細胞培養培地成分をコードする遺伝子に操作可能に連結するプロモーター。プロモーター領域は、種子成熟条件下での誘導を可能にする様式で調節されるように選択される。本発明における使用のためのプロモーターは、典型的には、イネ、オオムギ、コムギ、カラスムギ、ライムギ、トウモロコシ、キビ、ライコムギ、またはソルガム等の穀類に由来する。
一態様では、キメラ遺伝子には、種子成熟中に増加した発現を示すプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターの例には、以下の成熟特異的単子葉植物貯蔵タンパク質の１つに関連する成熟特異的プロモーター領域が挙げられる：イネグルテリン、オリジン、ならびにプロラミン、オオムギホルデイン、コムギグリアジンおよびグルテリン、トウモロコシゼインおよびグルテリン、カラスムギグルテリン、ならびにソルガムカフィリン、キビペニセチン、ならびにライムギセカリン。
一態様では、キメラ遺伝子には、ｉ）成熟特異的単子葉植物貯蔵タンパク質の遺伝子由来のプロモーター、ｉｉ）プロモーターに操作可能に連結し、胚乳細胞、好ましくは、タンパク質貯蔵体等の胚乳細胞小器官に連結するポリペプチドを標的とすることができる単子葉植物種子特異的信号配列（Ｎ末端リーダー配列もしくはＣ末端トレーラー配列等）をコードする第１のＤＮＡ配列、ならびにｉｉｉ）翻訳フレーム中で第１のＤＮＡ配列と連結し、細胞培養培地成分をコードする第２のＤＮＡ配列が含まれる。信号配列は、好ましくは、植物細胞中の細胞培養培地成分から切断される。
キメラ遺伝子は、典型的には、次いで、（ｉ）プラスミドまたはウイルス起源であり、ベクターが細菌から所望の植物宿主にＤＮＡを移動させるのを許すためにベクターに必要な特性を提供する、キメラ遺伝子の上流および／または下流のコンパニオン配列、（ｉｉ）選択可能なマーカー配列、ならびに（ｉｉｉ）通常、転写開始調節領域からのベクターの反対端における転写終結領域を有する、好適な植物形質転換ベクター内に設置される。適切な発現ベクターおよび好適な調節配列の多数の種類が、多種多様の植物宿主細胞に関して当分野で知られている。
少なくとも１つの選択的精製タグおよび／または少なくとも１つの特定のプロテアーゼ切断部位が、単子葉植物種子貯蔵タンパク質担体からの細胞培養培地成分の最終的な放出のために提供され得る。例えば、化学分解部位を提供する戦略的メチオニンまたはトリプトファン残基は、内因性植物タンパク質からの細胞培養培地成分の放出のために、ドメイン間のフレーム内で操作され得る。他の選択的プロテアーゼ切断部位には、エンテロキナーゼ（ｅｋ）、因子Ｘａ、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、ＧＥＮＥＮＡＳＥ（商標）（サブチリシンＢＰＮ’の変異体）、α−溶菌プロテアーゼ、またはタバコエッチウイルスプロテアーゼが含まれるが、それらに限定されない。あるいは、融合タンパク質の切断は、臭化シアンまたはＮ−クロロサクシニミド等の化学分解剤を介して実行され得る。
多数の好適な哺乳類宿主細胞が当分野でも知られており、多くは、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９から入手可能である。例として、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：４２１６−４２２０（１９８０））、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）２９３もしくは２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ９２）等の哺乳類細胞が挙げられるが、それらに限定されない。好適な哺乳類宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、ならびに産物産生および精製のための方法は当分野で知られている。他の好適な哺乳類細胞株は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ならびにＣＶ−１細胞株（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳類宿主細胞には、形質転換細胞株を含む、霊長類細胞株および齧歯類細胞株が含まれる。
本発明のＤＮＡコンストラクト（またはＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡ）を用いてそのようなタンパク質を産生するために、無細胞転写および翻訳システムを採用することができる。
本発明の組換えタンパク質の産生は、当分野で周知の方法によって、発現システムを含む遺伝子操作された宿主細胞から調製され得る。したがって、さらなる態様では、本発明は、細胞培養培地成分をコードする１つのポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを含む発現システム、およびそのような発現システムで遺伝子操作される宿主細胞、ならびに組換え技術によるそのようなタンパク質の産生に関する。一実施形態では、宿主細胞は、目的の熱ショックタンパク質を内因的に発現する。
本発明の栄養補助剤の発現タンパク質の精製が必要である場合、本発明のタンパク質を、細胞を溶解させる前または細胞溶解後の細胞環境のいずれかから回収することができる。タンパク質は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出物、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法で、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。精製のために高速液体クロマトグラフィーも同様に採用される。
特許、公開された特許出願、ならびに関連出版物の探索は、本開示を読解する当業者に、アルブミンを調製および精製するための重大かつ可能な方法を提供する。例えば、米国特許 第４，０７５，１９７号、同第４，０８６，２２２号、同第４，０９３，６１２号、同第４，０９７，４７３号、同第４，１３６，０９４号、同第４，２２８，１５４号、同第５，２５０，６６２号、同第５，６５６，７２９号、同第５，６７７，４２４号、同第５，７１０，２５３号、同第５，７２８，５５３号、同第５，９９４，５０７号、同第６，００１，９７４号、同第６，６３８，７４０号、同第６，６１７，１３３号、および同第７，４２３，１２４号は、アルブミンを精製するための多様な方法を開示する。一態様では、本発明での使用のためのアルブミンは、上述の当分野で認識される方法のいずれかを用いて精製され、次に、水溶液中で熱ショックタンパク質と混合される。陰イオン交換クロマトグラフィーおよびＡＴＰアガロース親和性クロマトグラフィーを含む熱ショックタンパク質の精製のための方法が当分野で周知である（Ｗｅｌｃｈ ＆ Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（２４）１４９４９−１４９５９；（１９８２）、Ｗｅｌｃｈ ＆ Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（６）１２２９−１２３７（１９８５）。タンパク質をリフォールディングするための周知の技術が、ポリペプチドが細胞内合成、分離、および／または精製の間に変性する時に、活性立体配座を再生するために採用され得る。
好ましい一態様では、組換えアルブミンは、組換えアルブミンおよび熱ショックタンパク質の両方、または例えば、下ならびに実施例の項で説明されるｈｓｐタンパク質複合体の直接的な同時精製を可能にする手順を用いて精製される。一態様では、組換えアルブミンは、イネ中で産生され、熱ショックタンパク質は、内因性イネ熱ショックタンパク質である。
本方法の一態様では、発現ベクターは、宿主細胞中の組換えアルブミンの発現を増加させるために使用され、一方、宿主細胞内因性熱ショックタンパク質の発現は、宿主細胞ｈｓｐ遺伝子の発現を活性化することによって達成される。別の態様では、発現ベクターは、熱ショックタンパク質の発現を増加させるために使用される。別の態様では、発現ベクターは、熱ショックタンパク質およびアルブミンの発現を増加させるために使用される。別の態様では、熱ショックタンパク質およびアルブミンをコードする核酸配列は、同一の発現ベクター内に配置される。
アルブミンおよびｈｓｐ７０の類似した電気陰性度の理由から、陰イオン交換クロマトグラフィーは、Ｈｓｐ中で濃縮されるアルブミンを調製する好ましい方法である。例えば、アルブミンおよびＨｓｐ７０の両方を、高ｐＨ（７．５以上）で、ポリペプチド（巨大分子排除限界および好適な大きさ）のイオン交換に好適であるビーズ上に付着させた四級アミンまたはジエチルアミノエチルのいずれかから成る樹脂を含む陰イオン交換カラムに結合させる。そのような樹脂の例は、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ（ＧＥ）Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＧＥ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅである。それらの類似した電気陰性度の理由から、低ｐＨ条件（ｐＨ６．５を下回る）を利用することは、同様に、陽イオン交換体での２つの分子の同時精製を可能にする。そのような陽イオン交換体の例は、ＧＥのＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＳｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅベースの樹脂である。アルブミンおよびＨｓｐ７０は、類似した等電点を有するため、混合モード樹脂も同様に、アルブミンおよびＨｓｐ７０の同時精製のために採用され得る。Ｈｓｐ７０およびアルブミンの両方が、脂肪酸および他の疎水性分子に結合することで周知であるため、オクチルセファロース（ＧＥ）等の疎水性ベースの樹脂上でアルブミンおよびＨｓｐを同時精製することも可能である。Ｈｓｐ７０タンパク質およびアルブミン（６５〜７５ｋＤａ）の同様の大きさの理由から、ｈｓｐとともにアルブミンを同時精製し、したがって濃縮するために、６５〜７５ｋＤａより高い分子排除および６５〜７５ｋＤａより低い分子排除の両方を利用する接線流限外濾過による、２つのタンパク質の同時精製およびＨｓｐ７０の濃縮が採用され得る。
同様に、それらの類似した分子量の理由から、分子篩およびゲル濾過またはサイズ排除クロマトグラフィー等の、大きさに基づいてポリペプチドを分離する任意の方法は、アルブミンおよびＨｓｐ７０を効率的に同時精製するはずである。さらに、疎水性ならびに電気陰性度または表面電荷の観点でのＨｓｐ７０およびアルブミンの類似した性質の理由から、多数の条件下での沈殿により同時精製され得る。それらの条件のいくつかは、硫酸アンモニウムによる沈殿、尿素等の変性剤による沈殿、または等電点および溶解度に基づく沈殿である。
該方法は、他の供給源からｈｓｐを有するアルブミンを濃縮するためにも適用される。例えば、哺乳類細胞等の脊椎動物細胞、および昆虫等の無脊椎動物細胞、ならびに植物、および酵母等の菌類等に基づく、天然および遺伝子組換え動物の原料血清に由来するアルブミン、ならびに組換え生物および組織培養システムから産生されるアルブミンである。
特許、公開された特許出願、ならびに関連出版物の探索もまた、本開示を読解する当業者に、トランスフェリン関連タンパク質を調製および精製するための重大かつ可能な方法を提供する。例えば、米国特許第７，３６８，１４１号、同第７，３５４，９０２号、同第５，７０８，１４９号、同第５，５９６，０８２号、同第５，１６９，９３６号、同第４，７９１，１９３号、および同第４，６６７，０１８号は、トランスフェリン関連タンパク質を精製するための多様な方法を開示する。
ＩＶ．例示的な細胞
理論によって拘束されることを望むことなく、初代細胞、不死化細胞、分化細胞、未分化細胞、または幹細胞等の細胞を含む、アポトーシスに感受性の高い任意の細胞が、本発明の方法において、特殊化の様々な程度で使用され得ることが企図される。特定の実施形態では、本発明の方法で使用される細胞は、目的のタンパク質、例えば、治療用タンパク質または抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子でトランスフェクトされる。
特定の実施形態では、本発明の方法で使用される細胞は、真核細胞、例えば、哺乳類細胞である。哺乳類細胞の例には、ヒトＢ細胞、およびＴ細胞、ならびにハイブリドーマ等のその派生物、ならびにＢ細胞もしくはＴ細胞のマーカーを発現する細胞、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ，ＮＶ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））、サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８（１９８２））、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ＮＳＯマウス骨髄腫細胞（ＥＣＡＣＣ、ＳＩＧＭＡ）、およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられるが、それらに限定されない。有用な細胞株のさらなる例には、ＨＴ１０８０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１２１）、ＭＣＦ−７乳癌細胞（ＡＴＣＣ ＢＴＨ２２）、Ｋ−５６２白血病細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４３）、ＫＢ癌細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１７）、２７８０ＡＤ卵巣癌細胞（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｌｉｃｋ，Ａ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：５９２７−５９３２（１９８８）を参照）、ラジ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）、ジャーカット細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ１５２）、ナマルワ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４３２）、ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）、ダウディ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２１３）、ＲＰＭＩ８２２６細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ１５５）、Ｕ−９３７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５９３）、バウス黒色腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９６０７）、ＷＩ−３８ＶＡ１３亜株２Ｒ４細胞（ＡＴＣＣ ＣＬＬ７５．１）、およびＭＯＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８２）、ならびに別の種のヒト細胞および細胞の融合によって産生されるヘテロハイブリドーマ細胞が挙げられるが、それらに限定されない。これらおよび他の細胞ならびに細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡ）から市販されている。多くの他の細胞株が当分野で知られており、かつ当業者に精通しており、したがって、そのような細胞株を、本発明の方法で同様にうまく使用することができる。特定の実施形態では、本発明の方法で使用される細胞は、ＣＨＯ細胞またはＮＳＯ細胞である。ハイブリドーマおよび抗体産生細胞もまた、本発明の方法で使用され得る。
別の実施形態では、本発明の方法のいずれかで使用される細胞は、幹細胞である。幹細胞は、自己再生前駆体、非再生前駆体、および末期分化細胞を含む、子孫細胞を産生するために、単細胞レベルで自己再生するだけではなく分化もするそれらの能力によって定義される未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）由来の多様な細胞系統の機能的細胞に生体外で分化し、また移植後に複数の胚葉の組織を生み出し、胚盤胞への注入後に、全てではないとしても実質的にほとんどの組織に十分に寄与するそれらの能力によって特徴付けられる。
本発明の方法のいずれかで使用され得るヒト胚性幹細胞の種類には、妊娠中の任意の時点、典型的であっても必ずしもではないが、妊娠の約１０〜１２週間前に採取される前胚組織（例えば、胚盤胞等）、胚組織、または胎生組織を含む、妊娠後に形成される組織に由来するヒト胚細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、例えば、ヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、およびＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）等のヒト胚性幹細胞またはヒト胚幹細胞の樹立株である。そのような細胞の初期の確立または安定化の間の本開示の組成物の使用も同様に企図され、その場合、供給源細胞は、供給源組織から直接採取される初代多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下ですでに培養された多能性幹細胞集団から採取される細胞もまた好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）等の変異ヒト胚性幹細胞株も同様に好適である。一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら （米国特許第５，８４３，７８０号、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ｆｆ．，１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）によって説明されるように調製される。
さらに、ハイブリドーマ細胞を本発明の方法で使用することもできる。「ハイブリドーマ」という用語は、免疫学的起源の不死化細胞株および細胞を産生する抗体の融合によって産生されるハイブリッド細胞株を指す。該用語は、ヘテロハイブリッド骨髄腫融合の子孫を包含し、それは、後にトリオーマ細胞株として一般に知られている血漿細胞と融合されるヒト細胞およびマウス骨髄腫細胞株との融合の結果である。さらに、該用語は、例えば、クアドローマ等の抗体を産生する任意の不死化ハイブリッド細胞株を含むように意図されている。例えば、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５３７：３０５３（１９８３）を参照されたい。ハイブリッド細胞株は、ヒト、ウサギ、およびマウスを含む任意の種であることができる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される細胞株は、抗体産生細胞株である。抗体産生細胞株は、当業者に周知の技術を使用して選択および培養されてもよい。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）を参照されたく、補足を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一般的に、細胞培養中の組換えタンパク質発現に好適な任意の細胞を本発明の方法で使用することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される細胞には、所望の組換えタンパク質、例えば、本発明の方法を使用して産生されることが望ましい治療用タンパク質または抗体をコードする異種核酸分子が含まれ得る。特定の実施形態では、本発明の方法は、１つ以上の汚染物質の低減したレベルの存在下で、所望の組換えタンパク質、例えば、治療用タンパク質または抗体の高力価を産生するのに有用である。
Ｖ．細胞培養培地
細胞成長およびタンパク質産生に好適な任意の好適な培養培地またはフィード培地が、本発明の方法で使用され得る。好適な培養またはフィード培地は、宿主細胞および目的の過程とのそれらの適合性のために選択される。好適な培養またはフィード培地が当分野で周知であり、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（ＳＩＧＭＡ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＳＩＧＭＡ）、ＲＰＭＩ−１６４０（ＳＩＧＭＡ）等の商用培地を含むが、それらに限定されず、ダルベッコ変法イーグル培地（ＳＩＧＭＡ）は、動物細胞を培養するのに好適である。さらに、Ｈａｍ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ，（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，５８：４４、Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，（１９８０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０２：２５５、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第５，１２２，４６９号、または同第４，５６０，６５５号、国際公開 ＷＯ第９０／０３４３０号、およびＷＯ第８７／００１９５号で説明される培地のいずれかが使用され得る。
任意のそのような培地は、必要に応じて、ホルモン、および／または他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮細胞成長因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩等）、緩衝液（ヘペス等）、ヌクレオシド（アデノシンおよびチミジン等）、抗生物質（Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（商標）等）、微量元素（ミクロモルの範囲での終末濃度において通常存在する無機化合物として定義される）、ならびにブドウ糖もしくは同等のエネルギー源で補充され得る。任意の他の必要な栄養補助剤はまた、当業者に知られているであろう適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨ等の培養条件は、先に発現のために選択された宿主細胞で使用された条件であり、当業者には明らかである。特定の細胞にとって必要な成長因子は、例えば、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、およびＢａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｓａｔｏ，Ｃｅｌｌ，２２：６４９（１９８０）で説明されるように、過度の実験なしで、経験的に容易に決定される。
組換え脊椎動物細胞培養中の目的のタンパク質の合成への適合に好適な他の方法、ベクター、および宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）、Ｍａｎｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０−４６（１９７９）、ＥＰ１１７，０６０、およびＥＰ１１７，０５８で説明される。一般的に、哺乳類細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコル、および実践的技術を、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｄ．（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１）で見出すことができる。
ＶＩ．例示的な細胞培養発現産物
特許請求される方法のいずれかの一態様では、本発明の栄養補助剤は、目的のタンパク質を発現および産生するために使用される細胞の生存率ならびに成長を改善するために使用される。細胞は、目的のタンパク質を内因的に発現してもよく、またはその細胞に対するバックグラウンドを超えるレベルで目的のタンパク質を発現するように遺伝子的に修飾された、操作された細胞株であってもよい。
細胞は、目的のタンパク質をコードする核酸での形質転換によって、または内因性遺伝子の発現を促進する活性化配列の形質転換によって、タンパク質を発現するように遺伝子的に修飾されてもよい。一態様では、目的のタンパク質は、発現ベクターから発現され得、その中で、当分野で知られている、恒常的発現または誘導性発現のいずれかを可能にするために、目的のタンパク質のコード配列が発現制御配列に操作可能に連結される。
目的のタンパク質は、任意のタンパク質、またはそのフラグメントであってもよく、それには、商業的、治療的、診断的価値があるものであり、それらには、制限なしに、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗体、抗酸化分子、操作された免疫グロブリン様分子、一本鎖抗体、ヒト化抗体、融合タンパク質、酵素、免疫共刺激分子、免疫調節分子、標的タンパク質のトランスドミナントネガティブ変異体、毒素、条件付き毒素、抗原、腫瘍抑制タンパク質、成長因子、膜タンパク質、血管作用性タンパク質およびペプチド、抗ウイルス性タンパク質およびリボザイム、ならびにその派生物（関連レポーター基を伴って等）が含まれる。目的のタンパク質は、プロドラッグ活性化酵素も含んでもよい。
いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、糖タンパク質、または１つ以上の翻訳後修飾を有する任意の他のタンパク質から成る。例えば、真核生物宿主における産生に好適である任意のタンパク質を、ここで説明される方法および組成物を使用して発現させることができる。
本発明の方法を、任意の所望の組換えタンパク質またはそのフラグメントを産生するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で説明される方法を使用して産生される組換えタンパク質は、治療用タンパク質である。他の実施形態では、組換えタンパク質は、抗体またはその機能的フラグメントである。本発明の方法を使用して産生され得る抗体には、例えば、多クローン性、単クローン性、単一特異性、多特異性、完全なヒト、ヒト化、一本鎖、キメラ、ハイブリッド、ＣＤＲ移植を含む。それは、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、およびｓｃｆｖ等の全長ＩｇＧ１抗体またはその抗原結合フラグメントを含み得る。
本発明の範囲内の抗体には、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５−４２８９（１９９２）、米国特許第５，７２５，８５６号）を含む抗ＨＥＲ２抗体、米国特許第５，７３６，１３７号（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標））のキメラ抗ＣＤ２０「Ｃ２Ｂ８」等の抗ＣＤ２０抗体、米国特許第５，７２１，１０８号の２Ｈ７抗体のキメラもしくはヒト化変異体、Ｂ１、またはトシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ（商標））、抗ＩＬ−８（Ｓｔ Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ，１０３：９３２（１９９３）、および国際公開ＷＯ第９５／２３８６５号）、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体ｈｕＡ４．６．１ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ，７：５３−６４（１９９２）、国際公開ＷＯ第９６／３００４６号、および１９９８年１０月１５日に出版されたＷＯ第９８／４５３３１号）等のヒト化および／もしくは親和性成熟抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＰＳＣＡ抗体（ＷＯ第０１／４０３０９号）、Ｓ２Ｃ６およびそのヒト化変異体（ＷＯ第００／７５３４８号）を含む抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ１１ａ（米国特許第５，６２２，７００号、ＷＯ第９８／２３７６１号、Ｓｔｅｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｔｌ．４：３−７（１９９１）、およびＨｏｕｒｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５８：３７７−３８０（１９９４））、抗ＩｇＥ（Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３−２６３２（１９９３）、および国際公開ＷＯ第９５／１９１８１号）、抗ＣＤ１８（１９９７年４月２２日に刊行された米国特許第５，６２２，７００、または１９９７年７月３１日に出版されたＷＯ第９７／２６９１２号）、抗ＩｇＥ（Ｅ２５、Ｅ２６、およびＥ２７を含む、１９９８年２月３日に刊行された米国特許第５，７１４，３３８号、もしくは１９９２年２月２５日に刊行された米国特許第５，０９１，３１３号、１９９３年３月４日に出版されたＷＯ第９３／０４１７３号、または１９９８年６月３０日に出願された国際出願ＰＣＴ／米国第９８／１３４１０号、米国特許第５，７１４，３３８号）、抗Ａｐｏ−２受容体抗体（１９９８年１１月１９日に出版されたＷＯ第９８／５１７９３号）、抗ＴＮＦアルファ、ｃＡ２（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、ＣＤＰ５７１、およびＭＡＫ−１９５を含む抗体（１９９７年９月３０日に刊行された米国特許第５，６７２，３４７号、Ｌｏｒｅｎｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６（４）：１６４６−１６５３（１９９６）、およびＤｈａｉｎａｕｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２３（９）：１４６１−１４６９（１９９５）を参照）、抗組織因子（ＴＦ）（１９９４年１１月９日に交付された欧州特許第０ ４２０ ９３７号Ｂ１）、抗ヒトアルファ４ベータ７インテグリン（１９９８年２月１９日に出版されたＷＯ第９８／０６２４８号）、抗ＥＧＦＲ（１９９６年１２月１９日に出版されたＷＯ第９６／４０２１０号のキメラ化もしくはヒト化２２５抗体）、ＯＫＴ３等の抗ＣＤ３抗体（１９８５年５月７日に刊行された米国特許第４，５１５，８９３号）、抗ＣＤ２５もしくはＣＨＩ−６２１等の抗ｔａｃ抗体（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（商標））および（ＺＥＮＡＰＡＸ（商標））（１９９７年１２月２日に刊行された米国特許第５，６９３，７６２号を参照）、ｃＭ−７４１２抗体等の抗ＣＤ４抗体（Ｃｈｏｙ ｅｔ ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ３９（１）：５２−５６（１９９６））、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ等の抗ＣＤ５２抗体（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３３７（１９８８））、Ｇｒａｚｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２（１９９５）のＦｃガンマＲＩに対して対象とされるＭ２２抗体等の抗Ｆｃ受容体抗体、ｈＭＮ−１４等の抗癌胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐｌ）：５９３５ｓ−５９４５ｓ（１９９５）、ｈｕＢｒＥ−３、ｈｕ−Ｍｃ ３、およびＣＨＬ６を含む乳房上皮細胞に対して対象とされる抗体（Ｃｅｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３）：５８５２ｓ−５８５６ｓ（１９９５）、ならびにＲｉｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９１６ｓ−５９２０ｓ（１９９５））、Ｃ２４２等の結腸癌細胞に結合する抗体（Ｌｉｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１）：１−９（１９９６））、抗ＣＤ３８抗体、例えば、ＡＴ１３／５（Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（２）：９２５−９３７（１９９５））、Ｈｕ Ｍ１９５等の抗ＣＤ３３抗体（Ｊｕｒｃｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５９０８ｓ−５９１０ｓ（１９９５）およびＣＭＡ−６７６もしくはＣＤＰ７７１、ＬＬ２またはＬｙｍｐｈｏＣｉｄｅ等の抗ＣＤ２２抗体（Ｊｕｗｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（２３ Ｓｕｐｐｌ）：５８９９ｓ−５９０７ｓ（１９９５））、１７−１Ａ等の抗ＥｐＣＡＭ抗体（ＰＡＮＯＲＥＸ（商標））、アブシキシマブまたはｃ７Ｅ３Ｆａｂ等の抗ＧｐＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体（ＭＥＤＩ−４９３（ＳＹＮＡＧＩＳ（商標）等のＲＥＯＰＲＯ（商標）抗ＲＳＶ抗体）、ＰＲＯＴＯＶＩＲ（商標）等の抗ＣＭＶ抗体、ＰＲＯ５４２等の抗ＨＩＶ抗体、抗ＨｅｐＢ抗体ＯＳＴＡＶＩＲ（商標）等の抗肝炎抗体、抗ＣＡ１２５抗体ＯｖａＲｅｘ、抗イディオタイプＧＤ３エピトープ抗体ＢＥＣ２、抗アルファｖベータ３抗体ＶＩＴＡＸＩＮ（商標）、ｃｈ−Ｇ２５０等のＩＮＧ−１抗ヒト腎細胞癌抗体、抗ヒト１７−１Ａ抗体（３６２２Ｗ９４）、抗ヒト大腸腫瘍抗体（Ａ３３）、ＧＤ３ガングリオシドに対して対象とされる抗ヒト黒色腫抗体Ｒ２４、抗ヒト扁平上皮癌（ＳＦ−２５）、ならびにＳｍａｒｔ ＩＤ１０および抗ＨＬＡ ＤＲ抗体Ｏｎｃｏｌｙｍ（Ｌｙｍ−１）等の抗ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）抗体が含まれるが、それらに限定されない。本明細書の抗体に対する好ましい標的抗原は、ＨＥＲ２受容体、ＶＥＧＦ、ＩｇＥ、ＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、およびＣＤ４０である。
組換えタンパク質は、受容体（例えば、膜結合性もしくは細胞質）または構造タンパク質（例えば、細胞骨格タンパク質）等の細胞タンパク質であってもよい。組換えタンパク質は、細胞によって分泌される細胞因子であってもよく、または１つ以上の信号形質導入経路で内部的使用されてもよい。非制限例には、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ１４７、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−１３受容体、ＩＬ−１８受容体サブユニット、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体、肝細胞成長因子、破骨細胞分化抑制因子リガンド、インターフェロンガンマ、Ｂリンパ球刺激因子Ｃ５補体ＴＡＧ−７２、インテグリンアルファ４ベータ７、インテグリンＶＬＡ−４、Ｂ２インテグリン、ＴＲＡＩＬ受容体１、２、３、および４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦ、接着分子ＶＡＰ−１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、細胞間接着分子−３（ＩＣＡＭ−３）、ロイコインテグリンアドヘシン、血小板糖タンパク質ｇｐ ＩＩｂ／ＩＩＩａ、心臓ミオシン重鎖、副甲状腺ホルモン、ｒＮＡＰｃ２、ならびにＣＴＬＡ４（細胞毒性Ｔリンパ球関連抗原である）が挙げられるが、それらに限定されない。
組換えタンパク質はまた、ウイルス、細菌、または真菌等の感染病原体に由来し得る。タンパク質は、細菌性膜もしくは細胞壁に由来してもよく、または細菌性シトソルに由来し得る。タンパク質は、細菌性もしくは酵母酵素、転写因子、または構造タンパク質であり得る。細菌性もしくは酵母タンパク質は、膜結合性、細胞質であり得、または分泌され得る。感染病原体の例には、ミュータンス菌、および黄色ブドウ球菌、ならびにカンジダアルビカンスが挙げられるが、それらに限定されない。
上述のタンパク質の任意の全てまたは一部を含む組換え融合タンパク質を産生するために、本発明の方法を使用することもできる。例えば、上述のタンパク質の１つに加えて、ロイシンジッパー、コイルドコイル、抗体のＦｃ部分、または実質的に類似したタンパク質等の多量体化ドメインを含む組換え融合タンパク質を、本発明の方法を使用して産生することができる。例えば、国際出願ＷＯ第９４／１０３０８号、Ｌｏｖｅｊｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１２８８−１２９３、Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４０１−０５、Ｈａｒｂｕｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｎａｔｕｒｅ ３７１：８０−８３、Ｈａｎｇ．ｋａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ７：２５５−６４を参照されたい。
本明細書で説明される方法によって産生される１つ以上の組換えタンパク質を含む薬学的組成物もまた、この本発明によって包含される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物には、医薬的に許容可能な担体がさらに含まれる。本明細書で使用される「医薬的に許容可能な担体」という用語は、１つ以上の適合性の固体もしくは液体賦形剤、希釈剤、または対象への投与に好適なカプセル化物質を意味する。
ＶＩＩ．幹細胞
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、本質的にフィーダー細胞のない培養システムで培養されるが、それにもかかわらず、大幅な分化を経ることなく、本発明の栄養補助剤を含むヒト胚性幹細胞の増殖を支持する。分化なしでの無フィーダー培養におけるヒト胚性幹細胞の成長は、先に別の細胞型で培養することで馴化され、本発明の栄養補助剤をさらに含む培地を使用することによって支持される。あるいは、分化なしでの無フィーダー培養中におけるヒト胚性幹細胞の成長は、本発明の栄養補助剤を含む化学的に定義された培地を使用することによって支持される。胚性幹細胞自己再生を誘発することができる異なる成長因子で補充される不馴化血清置換（ＳＲ）培地中に維持される、胚性幹細胞中の無フィーダー無血清培養システムの例には、米国特許出願、米国第２００５０１４８０７０号、米国第２００５０２４４９６２号、米国第２００５０２３３４４６号、米国特許第６，８００，４８０号、ならびにＰＣＴ公開ＷＯ第２００５０６５３５４号および同ＷＯ第２００５０８６８４５号に開示される例が挙げられる。
代替実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞を支持し、本発明の栄養補助剤をさらに含むフィーダー細胞の層で最初に培養される。次いで、ヒト胚は、本質的にフィーダー細胞のない培養システムに転送されるが、それにもかかわらず、実質的な分化を経ることなく、本発明の栄養補助剤をさらに含むヒト胚性幹細胞の増殖を支持する。これらのアプローチのいずれにおいても、本発明の栄養補助剤の使用は、著しく高まった細胞成長速度および改善された細胞の生存率をもたらす。
本発明の栄養補助剤での使用に好適な馴化培地の例は、米国第号２００２００７２１１７号、米国特許第第６，６４２，０４８号、ＷＯ第２００５０１４７９９号、およびＸｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２−９８０，２００４）に開示される。本発明の栄養補助剤での使用に好適な化学的に定義された培地の例は、米国第２００７００１００１１号で見出され得る。
フィーダー細胞の例には、線維芽細胞、ＭＲＣ−５細胞、胎児腎臓細胞、間葉細胞、骨肉腫細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、Ｆａｌｌｏｐｉａｎ導管上皮細胞、肝細胞、心臓細胞、骨髄間質細胞、顆粒膜細胞、骨格筋細胞、筋細胞、および大動脈血管内皮細胞から成る群から選択されるフィーダー細胞が挙げられる。好ましい実施形態では、ＭＲＣ−５細胞は、ＡＴＣＣカタログ番号５５−Ｘを有し、形質転換されてＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−２３０９を有し、ヒト骨肉腫細胞は、ＡＴＣＣ受入番号ＨＴＢ−９６を有し、および間葉細胞は、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１４８６を有するヒト胎児口蓋間葉細胞である。他の好ましい実施形態では、ヒト線維芽細胞は、皮膚ケロイド線維芽細胞、ＫＥＬ ＦＩＢであり、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１７６２を有するか、もしくは胎児皮膚線維芽細胞であり、ならびに骨髄間質細胞、ＨＳ−５は、ＡＴＣＣ受入番号ＣＲＬ−１１８８２を有する。
好適な培養培地は、例えば、以下の成分等から作製され得る：ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ社＃１１９６５−０９２、ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ社＃１０８２９−０１８、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２／５０％のＤＭＥＭ基礎培地、２００ｍＭのＬ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ社＃１５０３９−０２７、非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ社１１１４０−０５０、β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ社＃Ｍ７５２２、ヒト組換え塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ社＃１３２５６−０２９。
一実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、本発明の栄養補助剤を含む組成物とともに、調製前に本発明の方法に従って処理された好適な培養基質上に播種される。一実施形態では、調製物は、例えば、基底膜に由来するもの等の、または接着分子受容体リガンド結合の一部を形成し得る細胞外マトリックス成分である。一実施形態では、好適な培養基質は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬは、再構成された基底膜を形成するために室温でゲル化するＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性の製剤である。
他の細胞外マトリックス成分および成分の混合物は、代替物として好適であり、本発明の栄養補助剤と共に使用することができる。これには、単独または本発明の栄養補助剤との多様な組み合わせで、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸等が含まれ得る。
別の実施形態では、本発明は、胚性幹細胞培養を包含し、本発明の栄養補助剤を含むヒト多能性幹細胞および無フィーダー無血清培養システムを含む。一実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞培養を包含し、本発明の栄養補助剤を含むヒト多能性幹細胞および無フィーダー無血清培養システムを含む。
別の実施形態では、本発明は、胚性幹細胞培養を包含し、本発明の栄養補助剤を含むヒト胚性幹細胞およびヒトフィーダー細胞培養物を含む。別の実施形態では、本発明は、ヒト多能性幹細胞培養を包含し、本発明の栄養補助剤を含むヒト多能性幹細胞およびヒトフィーダー細胞培養物を含む。
別の実施形態では、本発明は、多能性マーカーを発現する細胞を含む細胞の集団を得るための方法を提供し、
ヒト胚性幹細胞を培養するステップ、
ヒト胚性幹細胞を、多能性マーカーを発現する細胞に分化するステップを含み、分化は、本発明の栄養補助剤の存在下で行われる。
別の実施形態では、本発明は、外胚葉性、内胚葉性、または中胚葉性細胞の特性を示すマーカーを発現する細胞を含む細胞集団を得るための方法を提供し、
多能性幹細胞を培養するステップ、
ａ． 多能性幹細胞を外胚葉性、内胚葉性、または中胚葉性細胞の特性を示すマーカーを発現する細胞に分化するステップを含み、分化は、本発明の栄養補助剤の存在下で行われる。
これらの方法のいずれにおいても、幹細胞を、当分野の任意の方法で、内胚葉、外胚葉、または中胚葉系統の特性を示すマーカーを発現する細胞に分化することができる。例えば、多能性マーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１５３４−１５４１（２００５）、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１，１６５１−１６６２（２００４）、ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５，２９−３８（２００７）、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２−１４０１（２００６）に開示される方法に従って、最終内胚葉系統の特性を示すマーカーを発現する細胞に分化され得る。
内胚葉系統の特性を示すマーカーを発現する細胞は、当分野の任意の方法で、膵臓内分泌系統の特性を示すマーカーを発現する細胞にさらに分化され得る。例えば、膵臓内胚葉系統の特性を示すマーカーを発現する細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４，１３９２−１４０１（２００６）に開示される方法に従って、膵臓内分泌系統の特性を示すマーカーを発現する細胞に分化され得、分化は、本発明の栄養補助剤の存在下で行われる。
分化のこれらの方法のいずれかの一態様では、ヒト胚性幹細胞は、細胞外マトリックスで被覆された組織培養基質上で培養および分化される。細胞外マトリックスは、マウス肉腫細胞から抽出される可溶化基底膜調製物（ＭＡＴＲＩＧＥＬの商品名でＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから販売されている）であり得る。あるいは、細胞外マトリックスは、成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬであり得る。あるいは、細胞外マトリックスは、フィブロネクチンであり得る。代替実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、ヒト血清で被覆された組織培養基質上で培養および分化される。一態様では、組織培養基質は、細胞外マトリックスおよび本発明の栄養補助剤で被覆される。
細胞外マトリックスは、組織培養基質を被覆する前に希釈されてもよい。細胞外マトリックスを希釈するための、および組織培養基質を被覆するための好適な方法の例は、Ｋｌｅｉｎｍａｎ，Ｈ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：３１２（１９８６）、ならびにＨａｄｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：１５１１（１９８５）で見出され得る。
幹細胞分化の方法の一態様では、培養培地は、例えば、インスリンおよびＩＧＦ（ＷＯ第２００６０２０９１９号に開示される）等の内胚葉、外胚葉、または中胚葉系統の細胞へのヒト胚性幹細胞の文化を可能にするために、ある特定の因子の十分に低い濃度を含有しなければならない。これは、血清濃度を低下させることによって、またはあるいは、インスリンおよびＩＧＦを欠如する化学的に定義された培地を使用することによって、達成され得る。化学的に定義された培地の例は、Ｗｉｌｅｓら（Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９９９ Ｆｅｂ．２５、２４７（１）：２４１−８）に開示される。これらの方法のいずれかの好ましい実施形態では、培養培地は、本発明の栄養補助剤を含む。
培養培地は、ヒト胚性幹細胞由来の内胚葉、中胚葉、または外胚葉系統の特性を示すマーカーを発現する細胞の形成を増強し得る少なくとも１つの他の付加的因子も含有し得る。少なくとも１つの付加的因子は、例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−β１、２、および３を含むＴＧＦ−βファミリーのメンバー、血清アルブミン、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバー、血小板由来成長因子−ＡＡおよび−ＢＢ、多血小板血漿、インスリン成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、成長分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−ＩおよびＩＩ（ＧＬＰ−およびＩＩ）、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２ミメト体、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ベータメルカプトエタノール、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩおよびＩＩ、例えば、トリエチレンペンタミン等の銅キレート化剤、ホルスコリン、Ｎａ−酪酸、アクチビン、ベータセルリン、ＩＴＳ、ノギン、神経突起成長因子、ノーダル、バルプロ酸、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、スフィンゴシン１、ＶＥＧＦ、ＭＧ１３２（ＥＭＤ，ＣＡ）、Ｎ２およびＢ２７栄養補助剤（Ｇｉｂｃｏ，ＣＡ）、例えば、シクロパミン（ＥＭＤ，ＣＡ）等のステロイドアルカロイド、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリー、ウシ下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、インディアンヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグ、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニックヘッジホッグ阻害剤、またはそれらの組み合わせであってもよい。これらの方法のいずれかの好ましい実施形態では、上に記載される少なくとも１つの付加的因子を含有する培養培地は、本発明の栄養補助剤をさらに含む。
少なくとも１つの他の付加的因子は、例えば、ＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１４６９）、ＣＡＰＡＮ−１（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−７９）、ＢｘＰＣ−３（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１６８７）、ＨＰＡＦ−ＩＩ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９７）等の膵臓細胞株、例えば、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号：ＨＴＢ−８０６５）等の肝細胞株、および例えば、ＦＨｓ ７４（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−２４１）等の腸細胞株から得られる馴化培地によって供給され得る。好ましい実施形態では、これらの方法のいずれにおいても、馴化培地は、本発明の栄養補助剤をさらに含む。
別の実施形態では、本発明は、ヒトもしくは動物における疾患または状態の実験的、治療的、および予防的治療のための前述の幹細胞のいずれかの細胞または組織を使用する方法を包含する。好ましくは、疾病は、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、脊髄損傷、脳卒中、黄斑変性症、熱傷、肝不全、心疾患、糖尿病、デュシェンヌ筋ジストロフィー、骨形成不全症、変形性関節症、リウマチ性関節炎、貧血症、白血病、乳癌、固形腫瘍、およびＡＩＤＳから成る群から選択される。好ましい実施形態では、疾病は、パーキンソン病またはアルツハイマー病である。より好ましい実施形態では、疾病は、パーキンソン病である。
ＶＩＩＩ．組換えタンパク質の大規模産生
一実施形態では、本発明の栄養補助剤を、栄養補助剤の存在下で宿主細胞を培養することによって目的のタンパク質を産生するために使用することができる。一実施形態では、細胞培養は、撹拌槽型バイオリアクターシステム内で実行され、フェドバッチ培養手順が採用される。別の実施形態では、使い捨て型波動バイオリアクターが採用される。バイオリアクターシステムでは、バイオリアクターの大きさは、１，０００リットルもしくは１２，０００リットルサイズ等の、目的のタンパク質の所望の量を産生するのに十分に大きいが、より小さい（すなわち、２リットル、４００リットル）またはより大きい（すなわち、２５，０００リットル、５０，０００リットル）バイオリアクター容器が適切であり得るので、そのような大きさに限定されない。好ましいフェドバッチ培養では、哺乳類宿主細胞および培養培地は、初めに培養容器に供給され、培養の終了前の定期的な細胞および／または産物採取のを伴い、又は伴わず、さらなる培養栄養物が、培養中に、連続的に、または離散的増分で、培養物にフィードされる。フェドバッチ培養は、例えば、半連続フェドバッチ培養を含んでもよく、全ての培養物（細胞および培地を含む）は断続的に除去され、新鮮培地に取り換えられる。フェドバッチ培養は、細胞培養のための全ての成分（細胞および全ての培養栄養物を含む）が、培養過程の最初に培養容器に供給される単純なバッチ培養と区別される。浮遊物が培養容器から培養過程中には除去されないが、培養過程の終了時に除去される場合に、フェドバッチ培養を灌流培養とさらに区別することができる（灌流培養では、細胞は、例えば、濾過、カプセル化、マイクロキャリアを固定すること等によって培養中に抑制され、培養培地は、連続的または断続的に導入され、培養容器から除去される）。
さらに、培養細胞は、特定の宿主細胞および企図される特定の産生計画に好適であり得る任意の計画または日常的方法に従って繁殖され得る。したがって、本発明は、単一ステップまたは複数のステップの培養手順を企図する。単一ステップ培養では、宿主細胞は、培養環境に植え付けられ、本発明の方法ステップは、細胞培養の単一産生段階中に採用される。あるいは、多段階培養が構想される。多段階培養では、細胞は、多数のステップまたは段階で培養され得る。例えば、細胞は、最初のステップまたは増殖期培養で成長し得、貯蔵庫から除去される細胞は、成長および高い生存率を促進するのに好適な本発明の栄養補助剤を含む培地に植え付けられる。細胞は、好適な期間の増殖期において、宿主細胞培養への新鮮培地の添加によって維持され得る。
本発明の好ましい態様によると、フェドバッチまたは連続的な細胞培養条件は、細胞培養の増殖期において哺乳類細胞の成長を高めるために考案される。増殖期では、細胞は、成長を最大限に生かす条件下および期間で成長する。温度、ｐＨ、溶存酸素（ｄＯ２）等の培養条件は、特定の宿主を伴って使用される条件であり、当業者には明らかである。通常、ｐＨは、酸（例えば、ＣＯ２）または塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３もしくはＮａＯＨ）のいずれかを使用して、約６．５〜７．５のレベルに調整される。ＣＨＯ細胞等の哺乳類細胞を培養する好適な温度範囲は、約３０〜３８℃であり、好ましくは、約３７℃であり、好適なｄＯ２は、５〜９０％の空気飽和である。
特定の段階において、細胞は、細胞培養の産生段階またはステップで植え付けるために使用されてもよい。あるいは、上述のように、産生段階またはステップは、植え付けまたは増殖期もしくはステップに続いてもよい。
本発明によると、細胞培養の産生段階中の細胞培養環境は制御される。現在開示される方法のステップに従って、本発明の栄養補助剤の添加を、目的のタンパク質の所望の容量および質が得られた細胞培養液中で達成および維持されるように調整することができる。好ましい態様では、細胞培養の産生段階の前に細胞培養の過渡期が先行し、そこでは、本発明の栄養補助剤の添加が細胞培養の産生段階を開始する。
上述の方法のいずれかおいても、本発明の栄養補助剤との組み合わせで、細胞培養培地の酪酸塩またはトリコスタチンＡ等の薬剤の所望の量を含むことが望ましいことが企図される。酪酸ならびに酪酸ナトリウム等の酪酸塩およびその塩の多様な形成が当分野で知られており、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ等の供給源から公的に入手可能である。酪酸塩は、細胞培養の生産性およびタンパク質発現を高めることが、文献で報告されている［Ａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．，３１０：１７１−１７６（１９９５）、Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１：７６３１−７６４８（１９８３）、Ｋｒｕｇｈ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２：６５−８２（１９８２）、Ｌａｍｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２９：５５−６４（１９９９）、Ｃｈｏｔｉｇｅａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：２１７−２２１（１９９４）］。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）は、ヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤であり、酪酸塩のように、細胞培養の生産性およびタンパク質発現を高める役割を果たし得る［Ｍｅｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７：３６９７−３７０７（１９９７）］。酪酸塩は、タンパク質発現にいくらかのプラスの効果があるが、酪酸塩は、ある特定の濃度で、培養細胞中でアポトーシスを誘導することができ、それによって、培養物の生存率、ならびに生存細胞密度を減少させることも当分野で理解される［Ｈａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５５：４９８−５０５（１９９３）、Ｃａｌａｂｒｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９５：３１−３８（１９９３）、Ｆｉｌｌｉｐｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９８：２５７−２６５（１９９４）、Ｍｅｄｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７：３６９７−３７０７（１９９７）］。本発明の方法では、酪酸塩またはＴＳＡの所望の量が産生段階の開始時に細胞培養に添加され得、より好ましくは、温度変化が実行された後に細胞培養に添加され得る。酪酸塩またはＴＳＡを、当業者によって経験的に決定される所望の量で添加することができるが、好ましくは、酪酸塩を、約１〜約２５ｍＭの濃度で、より好ましくは、約１〜約６ｍＭの濃度で、細胞培養物に添加する。
目的のタンパク質の発現は、適切に標識されたプローブを使用して、例えば、ＥＬＩＳＡ、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、または原位置ハイブリダイゼーションによって、試料中で直接測定され得る。多様な標識を採用してもよく、最も一般的には、放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾ヌクレオチドを使用して等、他の技術も採用してもよい。次に、ビオチンは、アビジンまたは抗体に結合するために部位としての機能を果たし、それは、放射性ヌクレオチド、蛍光色素分子、または酵素等の多岐にわたる標識で標識化されてもよい。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡタンパク質二本鎖を含む特定の二本鎖を認識することができる抗体を採用してもよい。抗体を順に標識化してもよく、二本鎖が表面に結合される場合に、表面上での二本鎖の形成時に二本鎖に結合する抗体の存在を検出することができるように、アッセイを実行してもよい。
あるいは、遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接定量化するために、細胞もしくは組織切片の免疫組織化学染色、および細胞培養または体液のアッセイ等の免疫学的方法によって測定されてもよい。免疫組織化学染色技術を用いて、細胞試料を典型的には脱水および固定によって調製し、その後に、結合した遺伝子産物に特異的な標識抗体との反応が続き、酵素標識、蛍光標識、発光標識等の標識は通常、視覚的に検出可能である。
試料液体の免疫組織化学染色および／またはアッセイに有用な抗体は、単クローン性または多クローン性のいずれかであってもよく、任意の哺乳動物で調製されてもよい。多くは市販されている。
本明細書で特許請求される栄養補助剤を、トランスフェクション中に細胞のトランスフェクション効率および生存率を増加させるために使用することができる。リポフェクタミン等の多様なトランスフェクション技術で使用される条件および試薬は、細胞に対して相対的に毒性である一方で、電気穿孔は細胞に激しく圧力を加える可能性がある。トランスフェクション試薬のより高い濃度の使用、ならびにより広範な電気穿孔条件は、より高いトランスフェクション効率を達成するのに好ましい。したがって、トランスフェクション前、最中、および後の本発明の栄養補助剤の添加は、より高いトランスフェクション効率、ならびに組換えタンパク質のより高い収率をもたらすことができる。
Ａｐｏ−２リガンド／ＴＲＡＩＬまたはＦａｓリガンド等のアポトーシスを誘導する目的のタンパク質を発現するために、本発明の栄養補助剤を使用することができる。本発明の栄養補助剤の存在は、そのようなアポトーシス活性を阻止し得、目的のタンパク質の改善された発現を可能にし得る。
さらに、凍結／貯蔵／解凍手順を経験する細胞の生存率を増加させるために、該方法を使用することができる。これらの手順の間、一般に、細胞は生存能力を失う可能性がある。細胞培養培地に添加されるアポトーシス阻害剤の存在は、増加した細胞の生存率を提供することができ、細胞のアリコート間またはバイアル間の細胞生存率を還元または排除するのに役立つことができる。
ＩＸ．キット
細胞の生存率を促進するためのキットも本発明によって包含される。一実施形態では、本発明に記載のキットは、（ａ）トランスフェクションのための１つ以上の試薬または装置、および（ｂ）本発明の栄養補助剤から成る。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げられるキットには、トランスフェクション装置、トランスフェクション薬剤、および栄養補助剤の使用に関する詳細を含む、使用説明書および／または販売促進用資料が含まれる。
別の実施形態では、本発明に記載のキットは、（ａ）凍結もしくは解凍細胞のための１つ以上の試薬または装置、ならびに（ｂ）本発明の栄養補助剤から成る。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げられるキットには、凍結もしくは解凍細胞株のためのプロトコルならびに試薬の使用に関する詳細を含む、使用説明書および／または販売促進用資料が含まれる。
別の実施形態では、本発明に記載のキットは、（ａ）細胞を培養するための１つ以上の組織培養産物、ならびに（ｂ）本発明の栄養補助剤から成る。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げられるキットには、希釈クローニング技術のためのプロトコルならびにそのようなアプローチにおける試薬の使用に関する詳細を含む、使用説明書および／または販売促進用資料が含まれる。
全ての出版物、特許、および特許出願は、個々の出版物、特許、または特許出願が、参照によりその全体が組み込まれることを、具体的にかつ個別に示されるのと同じ程度に、参照によりそれらの全体が明示的に本明細書に組み込まれる。以下の実施例が図解されるが、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
実施例１：組換えヒトラクトフェリンの発現
Ａ．遺伝子組換えイネにおけるヒトラクトフェリン発現のための発現ベクター
ヒト乳腺ラクトフェリンの完全なヌクレオチド配列を、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＣＡ，ＵＳＡ）によってコドン最適化および合成した。ヒト乳ラクトフェリン遺伝子（ジェンバンク受入番号：発現の最適レベルを得るために、ＨＳＵ０７６４２）を、イネ種子タンパク質の翻訳において、最も頻繁に使用されるコドンで再合成した（図１）。変化したコドンの数が全配列の２２．４６％の割合を占めたが、アミノ酸組成物は、天然ヒトラクトフェリンと同一のままである。コドン最適化遺伝子を含有するプラスミドをＬａｃ−ｇｅｒと名付けた。Ｌａｃ−ｇｅｒをＳｍａＩ／ＸｈｏＩで消化し、ラクトフェリン遺伝子を含有するフラグメントを、ＮａｅＩで部分的に消化し、かつＸｈｏＩで完全に消化されたｐＡＰＩ１４１にクローン化した。イネ種子におけるｈＬＦの発現に関して、コドン最適化遺伝子を、イネ胚乳特異的グルテリン（Ｇｔ１）プロモーターおよびＮＯＳターミネータに操作可能に連結した。得られたプラスミドをｐＡＰＩ１６４と命名した（図２）。
Ｂ．産生システム
イネ品種Ｔａｉｐｅｉ３０９（オリザサティバ、ジャポニカ）を組換えヒトラクトフェリンのための産生システムとして選択し、遺伝子組換えイネ事象を、プラスミドｐＡＰＩ１６４を有する胚形成イネカルスと選択可能なマーカーとしてハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有するコンパニオンマーカープラスミドとの粒子衝突によって発生させた。完全に成長し、繁殖力のあるイネ植物を、この手順で得た。
Ｃ．米穀粒における組換えヒトラクトフェリンの高レベルタンパク質発現
組換えヒトラクトフェリンの発現は、種子成熟特異的プロモーターＧｔ１の制御下にあった。独立した遺伝子組換えイネ事象をスクリーニングした際、組換えヒトラクトフェリンの高レベル発現は、図３において明白である。成熟イネ種子抽出物からの総可溶性タンパク量は、ラエムリゲルで実行し、タンパク質を可視化するためにクマシーブルーで染色した。約８０ｋＤの組換えラクトフェリンタンパク質が、染色ゲルで示されるように、全ての遺伝子組換え系統で得られた。組換えヒトラクトフェリンの発現レベルは、０．５％の種子量に対応した。組換えヒトラクトフェリンの安定発現を、１０世代にわたって監視した。発現レベルを玄米の約０．５％の種子量で維持される（図４）。
実施例２：組換えヒトトランスフェリンの発現および精製
米穀粒からの組換えヒトの精製。
標準の食品工業手順を使用して、米穀粒を脱穀分離し、平均の１００メッシュ粉まで製粉する。下に説明される抽出後に、残存する外皮および固形物を破棄する。室温で４０分間撹拌して、組換えヒトトランスフェリンを抽出緩衝液（２０ｍＭのトリス塩基、ｐＨ７．５）で粉から抽出する。濾過助剤（Ｃｅｌｌｐｕｒｅ３００）を抽出混合物に２０ｇ／Ｌで添加した後、１０ｋＤａの再生セルロースでフィルタプレスを通して濾過する。
ＤＥＡＥクロマトグラフィーの準備をするために、フィルタプレス濾液を３０ＫＤａの分子量カットオフセルロース膜で、１０ｍＭのトリス塩基ｐＨ８．５にダイア濾過し、濃縮した。濃縮物をカラムに装填する前に、ＤＥＡＥカラムを（２０ｍＭのトリス塩基、４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）で洗浄した。装填した後、カラムを１０ｍＭのトリス塩基の３容積、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１１４、ｐＨ８．５の緩衝液、続いて、１０ｍＭのトリス塩基の７容積、ｐＨ８．５の緩衝液で洗浄した。次に、トランスフェリンを、２０ｍＭのトリス塩基、４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５で溶出した。
ＤＥＡＥカラムから回収されたトランスフェリンを、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０の緩衝液に、１０ＫＤａの分子量カットオフセルロース膜でダイア濾過し、濃縮した。ダイア濾過後、組換えトランスフェリンを乾燥させる前に０．２μのフィルタを通して濾過した。
実施例３：米穀粒における組換えヒトアルブミンの発現
多様なデータベースからのヒトアルブミン（ＨＳＡ）のタンパク質配列を比較した。受入番号Ｐ０２７６８（スイスプロット）で表されるコンセンサス配列を、米穀粒におけるヒトアルブミンの好適な発現に対する遺伝子コドン最適化のための基盤として使用した（図５）。遺伝子合成をＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）で実行し、ｐＵＣ−ＨＳＡを作製するために、合成フラグメントをｐＵＣベースのベクターに挿入した。正しいＤＮＡならびにタンパク質配列の確認後、ｐＵＣ−ＨＡＳをＭｌｙＩおよびＸｈｏｌで消化した。コドン最適化ＨＳＡ遺伝子を含有するフラグメントをＮａｅＩおよびＸｈｏＩで予切断されたｐＡＰＩ４０５に挿入した。プラスミドＡＰＩ４０５は、Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１信号配列、およびｎｏｓターミネータを含んだｐＡＰＩ１４１の派生物であった。
ｐＡＰＩ４０５へのＭｌｙＩ／ＸｈｏＩフラグメントの挿入は、ｐＡＰＩ５０４をもたらした（図６）。次に、プラスミドＡＰＩ５０４を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。全発現カセット、Ｇｔ１プロモーター、Ｇｔ１信号配列、コドン最適化ＨＳＡ遺伝子、およびｎｏｓターミネータを含有するＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを、ｐＡＰＩ５０８をもたらす同一の酵素で予消化されたｐＪＨ２６００にクローン化した（図７）。プラスミドＪＨ２６００は、大腸菌とアグロバクテリウムとの間のシャトルベクターであった。ＤＮＡ配列検証後、イネ形質転換のために、ｐＡＰＩ５０８をアグロバクテリウム内に移動させた。プラスミドＡＰＩ５０４も、先に説明した手順に従って、衝突ベースの形質転換を介して使用した。形質転換の際に、遺伝子組換え植物が生成され、温室に送り、そこで遺伝子組換えＲ０の植物が成熟成長してＲ１種子を結実した。
イネ種子におけるＨＡＳの発現を監視するために、１０ｍＬの抽出緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を使用して、各々のＲ０植物から１０個のＲ１種子を抽出した。上澄みを回収し、イネ抽出物からの発現レベルをＥＬＩＳＡで監視した（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）。結果は、イネ遺伝子組換え種子におけるＨＳＡ発現レベルが、０．０１〜０．８５％の玄米粉量（１ｋｇ当たり０．１〜８．５グラムの粉）に及ぶことを示した。最も高い発現レベルを有する８つの事象の結果を、以下の表に示す（表Ｅ１）。
Figure 2012518409
実施例４：細胞培養培地成分としての組換えヒトラクトフェリンの精製
組換えヒトラクトフェリンで補充された細胞培養培地を調製するために、組換えヒトラクトフェリンを米粉から精製した。組換えヒトＬＦの高レベルを発現する遺伝子組換えイネ系統（１６４−１２）を選択した。ここでＬＦ１６４と命名したこの系列を、夏季に屋外播種、および冬季に温室播種を交互に行う、１年に２回の産生で播種した。タンパク質精製のために、ｒｈＬＦを発現する水稲を外皮分離し（Ｒｉｃｅ Ｍｉｌｌ、ＰＳ−１６０、Ｒｉｍａｃ，ＦＬ）、次いで、ハンマーミル（８ＷＡ，Ｓｃｈｕｔｔｅ−Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）を使用して粉砕化した（１００メッシュの平均粒径）。
５０Ｌのタンクで１時間、２ｋｇの米粉と２０Ｌの抽出緩衝液（０．０２Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、および０．３Ｍの塩化ナトリウム）を混合することによって、遺伝子組換え粉からのタンパク質抽出を実行した。混合時間の最後に、懸濁液を一晩静置させるか、もしくは１分当たり３７５０回の速度で遠心分離した。両方の場合において、Ｍ−０５およびＭ−７０セルロース／パーライトベースフィルタ（Ｅｒｔｅｌ Ａｌｓｏｐ，ＮＹ）を使用して、それぞれ、プレートならびにフレームフィルタプレス（Ｅｒｔｅｌ Ａｌｓｏｐ，８Ｓ，ＮＹ）を通して上澄みを濾過した。
さらなる精製のために、ｒｈＬＦおよび他の米粉可溶性タンパク質を含有する濾液をイオン交換カラムに装填した。ＳＰセファロース高速流（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮＪ）を充填したＩＮＤＥＸ２００／５００プロセスカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＮＪ）を使用した。カラムを１時間当たり１５０〜２００ｃｍの線流速で実行した。樹脂床の充填、清掃、試験を製造業者の指示ごとに実行した（ＨＥＴＰ試験）。１時間当たり１７５ｃｍの線速度で濾液を樹脂に装填し、Ａ２８０がベースラインに戻るまで、０．３ＭのＮａＣｌを含有する０．０２Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で洗浄した。０．８ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用して、組換えｈＬＦを溶出した。１時間当たり２００ｃｍおよび１５０ｃｍで、それぞれ、洗浄および溶出を実行した。
１ｆｔ２ ５０ｋＤａのポリエーテルスルホン（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ＭＡ）膜を有するＣｅｎｔｒａｍａｔｅモジュール（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ＭＡ）を使用して、溶出したｈＬＦを濃縮および脱塩（限外濾過）した。１分当たり約１．５Ｌのクロスフロー速度および１０ｐｓｉｇの平均膜透過圧で濾過を実行した。溶出したｒｈＬＦを０．２５Ｌの最終容積に濃縮および脱塩し、次いで、凍結乾燥させた。通常、１キログラムの遺伝子組換え米粉から、約３グラムの精製組換えヒトラクトフェリンが回収された。
米粉から精製された組換えヒトラクトフェリンは、鉄で約５０％飽和される（部分的ラクトフェリン）。次いで、５０％の飽和組換えヒトラクトフェリンを、鉄摂取処理によって９０％超に鉄飽和させ、ホロラクトフェリンを得、結合した鉄を除去するために、酸処理によって鉄飽和を１０％未満にさせ、アポラクトフェリンを得た。精製されたラクトフェリン（ホロ、部分的、およびアポ）を細胞培養培地成分として使用した。
実施例５：組換え血清ヒトアルブミン（ｒＨＳＡ）の精製および特徴付け
Ｂ０００産生過程の概要
米穀粒からｒＨＳＡを精製するために、上で説明される、組換えヒト血清を発現する米穀粒を脱穀分離して粉砕化し、ｒＨＳＡ抽出緩衝液（酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９）と３０分間混合した。濾過による浄化後、１時間当たり約１５０ｃｍの速度で、濾液をアニオン交換カラム（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で装填した。装填した時点で、次に、樹脂を平衡緩衝液で洗浄し、いかなる非結合タンパク質をも除去した。溶出したｒＨＳＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、約９０％の純度である。次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの走査分析に基づいて、９０％から約９８％に純度を高めるために、Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することができる。次に、ｒＨＳＡを濃縮し、凍結乾燥前に限外濾過によって脱塩する。
ｐＨＳＡ（血漿由来ＨＳＡ）との比較のために、精製組換えＨＳＡを、様々な生化学的および生物物理学的特徴付けに供した（表Ｅ２）。これらの試験は、イネ中で発現するｒＨＳＡがｐＨＳＡと同等であることを示す。
Figure 2012518409
Ｂ００００Ｃ産生過程：Ｖｅｎｔｒｉａで成長したイネに関して、イネをコンバインまたは手で採取した。この過程の間、成熟種子を、コンバイン分離器または手作業で植物性植物物質から分離した。採取したイネを、鳥類、齧歯類、トカゲ、昆虫、および他の害虫から穀粒を保護する無菌の穀粒貯蔵所、貯蔵大型バッグ、大袋、または容器に貯蔵するのに好適である約１２％の湿度にまで乾燥させた。米穀粒を粉にする必要がある時は、まず最初に脱穀分離または外皮分離する。細片および種子の外層が内胚乳および胚芽層または糠層から一掃されるように、この過程を真空下で行う。次に、脱穀分離した穀粒を、洗浄して乾燥させるか、または洗浄して湿潤均質化するように直接処理するか、もしくは乾燥させて脱穀分離した状態でさらに処理する。乾燥させて脱穀分離した物質を、白米生産者にとって一般的な精米機または脱糠機で脱糠してもよい。
脱糠し、脱穀分離したイネをこの時点で洗浄および湿潤製粉してもよく、または乾燥製粉のために乾燥させてもよく、もしくは、粉に挽いて直接処理してもよい。ローラーミルまたはピンミル等を使用して、最小量の剪断および熱での製粉が好ましい。ハンマーミルも好適である。タンパク質を水中で５分未満激しくかき混ぜて９０％にまで抽出することができるように、粉を挽かなければならない。通常は、４００マイクロメートルまたは４ミリメートルより小さい粒子の大きさが求められる。しかしながら、より長い時間を与えられる場合、より大きい粒子も抽出することができる。あるいは、９０％の抽出可能なタンパク質を可溶化するように、穀粒を洗浄して設置された液体均質器で湿潤製粉することができる。
典型的には、粉スラリーを、少なくとも水３に対して粉１、および水２０に対して粉１までの比率で混合する。典型的には、水は、ｐＨがｐＨ７前後に維持されるように、トリス／ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、ヘペス等の好適な緩衝液、および１００ｍＭのＮａＣｌ等の少量の塩を含有する。スラリーを湿潤製粉の場合に均質化した後、または乾燥粉のために完全に混合した後、バルク固体を固液分離によってスラリーから除去する。例えば、パッドを有するプレートおよびフレーム、加圧フィルタ、ベルトフィルタ、真空フラスコ、ハイドロクローン、または真空ベルトフィルタを使用して、これをデカンティング、遠心分離、または濾過によって実行する。濾過後、ケーキからタンパク質を回収するために、圧縮されたケーキを抽出緩衝液で洗浄しなければならない。珪藻土または他のフィルタ培地の添加は、濾液の透明度を促進するのに有用であるが、適切な設備を用いればその必要はない。あるいは、浄化を助けるための凝集剤を使用することができる。そのアルブミン含有量に関して浄化した濾液を検査し、回収がイネ種子において決定された発現レベルと一致することを検証しなければならない。
澱粉、沈殿タンパク質、ウイルス、および他の汚染物質を除去するために、ｐＨが５．０に達し、溶液が白色になるまで、５Ｍの酢酸を浄化した濾液に添加する。白色の溶液を少なくとも２０分間かき混ぜ、不溶性物質の沈殿を助長する。次に、限外濾過に好適な光学的透明度、または１０ＮＴＵ未満に達するように（比濁法、濁度ユニット）、沈殿した溶液をキャニスターフィルタ、カートリッジフィルタ等のデプスフィルタもしくは他の濾過装置を通して濾過する。フィルタプレス、加圧フィルタで、またはあるいはクロスフローを利用するセラミックフィルタもしくは他の物質を使用して、それを洗浄してもよい。さらに、この物質は、膨張床クロマトグラフィーカラムへの直接適用に好適である。
好ましい方法では、浄化した濾液を、０．２ミクロンフィルタを通す濾過によって洗浄し、１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．０まで中和させる。その結果、この物質は、ホローファイバー、フラットシーツによる限外濾過、または螺旋状に巻回されたクロスフロー濾過に好適である。物質を、１００キロダルトン（ｋＤａ）の大きさ、またはそれより大きい膜を通して、ウイルス、より大きい不要な汚染物質、および凝集物を除去することができる。膜を通る物質を１０または３０ｋＤａのクロスフロー膜で濃縮することができ、次いで、クロマトグラフィーのための溶液を調製するために同一の膜を使用することができる。次に、伝導率とｐＨが同等化されるまで、濃縮した物質をカラム平衡緩衝液でダイア濾過することができる。
ＧＥ ＤＥＡＥセファロースまたはＧＥ Ｑセファロース上の陰イオン交換クロマトグラフィーのための好ましい緩衝液は、ｐＨ８．０に均衡したｐＨを有する１０もしくは２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ緩衝液である。対照的に、例えば、負に帯電した樹脂、もしくは疎水性リンカー（混合モード吸収剤）と混合された負に帯電した樹脂の使用を介する陽イオン交換のための好ましい緩衝液、またはあるいはＢｌｕｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ）等のｂｌｕｅ Ｃｉｂｉｃｒｏｎは、４．８〜５．０に均衡したｐＨを有する酢酸塩またはクエン酸塩緩衝液である。
どちらのシステムに関しても、アルブミンおよび他の同様に帯電したタンパク質をマトリックスで保持し、洗浄を行い、疎水性不純物を除去する手助けをするのに必要であると見なされる界面活性剤も含み得る、少なくとも５カラム容積の装填緩衝液で洗浄することによって緩く結合した物質を除去する。物質を、陽イオン交換のために２〜４ユニット増加したｐＨ、または陰イオン交換のために２〜４ユニット減少したｐＨを有する同一の緩衝液もしくは修飾緩衝液で装填することによって、溶出することができる。結果として生じるｐＨの変化はイオンの交換を可能にし、タンパクを鋭いバンドで溶出する。溶出分画の純度を増加させるために、最初の部分（１０％）もしくは最後の部分（１０％）または両方の部分を主溶出ピークから溶出することができるように、溶出ピークを精査することができる。好ましい方法では、１００ｍＭのリン酸塩、ｐＨ４．０に調整されたｐＨを含有し、１０ｍＭのＮａＣｌを含む溶液が、タンパク質をＧＥ Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（高速流）から溶出するために使用される。この場合において、物質を溶出するために、非結合汚染物質（貫流および洗浄）と、より強力な結合汚染物質（１００ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのＮａＣｌ、および４．０に調整されたｐＨでカラム上に保持される物質）との間の識別を可能にするｐＨおよび伝導率を使用する。
溶出後、溶出した物質のｐＨが、６．０未満のｐＨを有する場合、それを１ＭのＮａＯＨで中和させる。次に、得られた溶液を、次のクロマトグラフィーステップのために、同一の緩衝液に対してダイア濾過するが、好ましい方法においては、１００ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのＮａＣｌ、およびｐＨ７．０での非結合モードを除いて、同一のマトリックス（すなわち、Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のカラムを通して溶出液を流すことを含む。
第２のカラムステップは、第１のステップと同一の原理を使用するが、結合カラム上に共溶出された汚染物質が、中性ｐＨでマトリックス上に保持される機会を有するように逆モードである。第１の捕獲カラムから物質を通る流れを、様々な代替の種類のクロマトグラフィーアプローチ、例えば、陽イオン交換、疎水性、混合モード、またはゲル濾過クロマトグラフィーで処理することができる。
好ましい方法では、濃度が１５〜２５％のアルブミンになるまで、Ｑ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ非結合カラムから物質を通る流れを１０ｋＤａまたは３０ｋＤａのクロスフロー膜上で濃縮する。次いで、緩衝液をダイア濾過によって、ダルベッコＰＢＳまたはあるいは２０ｍＭのリン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、およびｐＨ７．０等の細胞培養に好適な緩衝液に変える。次に、物質を無菌容器内に滅菌グレードフィルタで濾過する。エンベロープウイルスを破棄し、疎水性毒素および汚染物質の除去を助けるために、無菌濾過した物質を界面活性剤で処理してもよい。好ましい方法では、０．５％ｖ／ｖのトリトンＸ−１１４またはＸ−１００を、１５〜２５％のアルブミン溶液に（２３℃未満で１８℃を超える）室温で添加し、溶液を少なくとも１時間かき混ぜる、または撹拌する。次に、物質は、アルブミンの分子量よりも非常に少ない分子量排除限界を有する疎水性樹脂を通る。ＢｉｏｒａｄおよびＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからの樹脂を含む、多くの市販の樹脂が入手可能である。
生物学的活性を確認するために、カラムを通る物質を界面活性剤に敏感な細胞中で試験する。残存する残渣界面活性剤は、典型的には、アルブミン溶液に対して０．００５％未満でなければならない。次に、自由に貫流する界面活性剤を、直送のために容器内に無菌濾過してもよく、または安定剤を添加してもよく、もしくは安定剤での低温殺菌に供してもよく、または乾燥後もしくは直接乾燥して安定剤を添加してもよい。物質を凍結乾燥または噴霧乾燥で乾燥させてもよい。乾燥前に、場合によっては、ＧＥ、Ｐａｌｌ、およびＭｉｌｌｉｐｏｒｅ等から入手可能である、使い捨てかつ認証されたウイルス除去カプセルを使用して、物質をウイルス濾過ステップに供することが有用であり得る。事前濾過ステップが、濃縮した物質を２０ｎｍのフィルタに通すのに必要であり得ることを理解することが当分野において一般的である。
結果：米粉を、リン酸塩で緩衝した生理食塩水との１：５の比率で抽出し、２０分間混合した。Ｎａｌ遺伝子フィルタフラスコを使用して、液体を浄化した。その後の浄化された抽出物を、該方法で説明されるように酸沈殿に供した。次に、溶液を濾過し、中和し、浄化した濾液を得た。物質および緩衝液が平衡化されるまで、この物質を５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、ｐＨ８．０に対してダイア濾過した。次に、５０ｇ／Ｌの結合能力を可能にするために、物質を事前に平衡化したＧＥ Ｑ−セファロースカラム上に装填した（３００〜６００ｃｍｈ）。上で説明したように、装填した物質を同一の緩衝液で洗浄し、次いで、物質を１００ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのＮａＣｌ、およびｐＨ４．０で溶出した。鋭いピークに溶出された物質および回収した溶出液は、約５．８の安定したｐＨを有した。下により完全に開示されるように、本方法を使用して産生されたアルブミンを、アルブミンの他の供給源と比較した。溶出液をプールに回収し、ｐＨが６．０以上になるまで、１ＭのＮａＯＨを添加した。次に、物質を１０ｋＤａの再生セルロース膜に濃縮し、約５倍および約５等容量のダイア濾過を、１００ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で実行した。ダイア濾過した最終物質を、アルブミンタンパク質含有量（出発原料中の発現レベルとの関連で、８０％以上でなければならない）および内毒素レベル（供給物質に応じて、１ｍｇ当たり、１００ＥＵ未満でなければならない）に関して検査した。この物質を、約２〜３回の装填容量を可能にするのに十分な大きさの、１００ｍＭのリン酸塩、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化したＱ−セファロースカラム上に通した（６０〜１６０ｃｍｈ）。物質を同一の緩衝液を有する樹脂を通して洗浄し、回収した。回収した物質を１０ｋＤａの再生セルロース膜にダイア濾過し、約１０倍に濃縮するか、またはアルブミン濃度が少なくとも１０％もしくは２０％以下に達するまで濃縮し、５等容量のダイア濾過を２０ｍＭのリン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で実行した。滅菌グレードフィルタ濾過（０．２μｍ）後、溶液を、０．５％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、２０＋／−２℃で１時間かき混ぜた。インキュベーション後、製造業者の指示に従って、物質をＰａｌｌ ＳＤＲ樹脂に通した。貫流物質を無菌容器内に滅菌グレードフィルタで濾過し、タンパク質および食塩水においてよく用いられるように、冷蔵または凍結乾燥させた。
実施例６：アルブミンの他の供給源と比較した、Ｂ００００Ｃ過程を使用してイネから産生される組換えアルブミンの比較およびアルブミンの産生の先述の方法
方法：実施例５で説明される過程Ｂ０００Ｃを使用して調製されたアルブミンを、組換えアルブミンを調製するために先に使用された代替の過程（Ｂ０００）を使用して調製されたアルブミンと比較した（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ（バッチＢ２０２〜Ｂ２１７））。
アルブミン産生（旧式の方法、Ｂ０００）：
米粉および２５ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウムをＮａＯＨで６．５にｐＨ均衡し、約１：１０のＳ／Ｌの比率で、２０分間室温で混合した。濾過助剤（Ｃｅｌｌｐｕｒｅ３００）を１０ｇ／Ｌで添加し、スラリーをフィルタプレス、真空濾過、または遠心分離で濾過した。浄化した濾液を、１Ｍの酢酸で約ｐＨ５．０まで酸沈殿した。上で説明されるように、得られた溶液を５ｇ／Ｌの濾過助剤（Ｃｅｌｌｐｕｒｅ３００）の添加を伴って濾過した。物質をすぐに１ＭのＮａＯＨでｐＨ６．５〜７．０まで中和した。物質を抽出のために使用された同一の緩衝液の５等ダイア容積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）でダイア濾過した（全てのＵＦＤＦステップのための１０ｋＤａの再生セルロース）。物質を事前に平衡化したＱ−セファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に装填し、６０ｃｍｈで樹脂１リットル当たり８ｇのアルブミン結合を可能にした。
同一の緩衝液の５カラム容積でカラムを洗浄した後、１つのステップにおいて、塩濃度を２５０ｍＭのＮａＣｌに高めることによってアルブミンを溶出した。得られた物質を１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対して５〜７等ダイア容積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）でダイア濾過した。得られた物質を、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０で平衡化したＱ−セファロースカラムに通し、貫流として回収した。次に、貫流物質を濃縮し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ダイア容積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）で、１０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０に対してダイア濾過した。濃縮した最終物質を無菌濾過し、１０ｇ／Ｌの界面活性剤ＣＨＡＰＳ（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホン酸）でインキュベートし、室温で１時間混合した。１時間のインキュベーション後、物質をＢｉｏｒａｄ ＳＭ−２カラムに通した。物質を無菌濾過し、凍結乾燥させた。
サイズ排除クロマトグラフィー分析
ＨＰＬＣによる純度分析を、２１４および２８０ｎｍにおける検出セットを用いて、１分当たり１ｍＬの流速で、１００ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．０で、ＧＦ−２５０カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で実行した。標準曲線は、塩およびに水分に対する０．９２の修正率の乾燥粉で作製された５つの異なる希釈物を注入することによって生み出された。２１４ｎｍからの主ピークを、保持時間またはあるいは基準のいずれかによって統合した。未知の試料を標準注入の範囲内の濃度で注入した。乾燥粉重量ごとのアルブミンの未知の濃度（純度）を標準曲線から計算した。典型的な実験では、０、５、８、１０、１５、および２０μｇの標準物質を注入し、次いで、約５０μＬの注入量中の約１０μｇの未知の試料を注入した。ピークを統合した後の標準曲線に対する相関係数は、典型的には０．９８を超えた。
ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび濃度測定：（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）。
各タンパク質の規定量を各ウェルに装填させるために、タンパク質溶液を１〜２ｍｇ／ｍＬに希釈することによって試料を調製した。試料を、還元薬剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＮＰ０００４）を含有するトリスグリシンＳＤＳ試料緩衝液（ＬＣ２６７３ Ｎｏｖｅｘ）と１：１で混合し、７０℃まで５分間加熱した。試料をＮｏｖｅｘ４〜２０％のプレキャストゲルに装填（１０、２０、または３０μｇ）し、標準のトリスグリシンＳＤＳランニング緩衝液中で、定電圧（１３０Ｖ）で分離した。追跡用色素がゲルの先端に達した時に電気泳動は終了した。分子量マーカーには、参照として第１のレーンが含まれた。
ゲルをＧ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（７８６−３５Ｇ）で染色し、水で脱染した。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｇ４０１０）でデジタル画像を得た。次に、画像ファイルをＵＮ−ＳＣＡＮ−ＩＴ（Ｓｉｌｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐ．）で開いた。全ての可視バンドが個々の部分として含まれた２５６のグレースケールにおける肯定的な画像解析で、濃度測定を実行した。各部分に対してソフトウェアで特定化されるように、背景雑音を４隅補間によって修正した。次に、各部分またはバンドに対する信号を画素数および平均画素強度（０〜２５５）の産物から計算した。全体のレーン（全ての可視部分またはバンド）に対する信号の合計を１００％とし、アルブミン純度を計算するために不純物バンドを減算した。各バンドにおける各夾雑タンパク質の割合は、特定のバンドにおいて特定された全てのペプチドの総数で割られたペプチドマッピングによって決定されるように、その夾雑タンパク質に対して特定されたペプチドの数に応じて計算された。標準偏差が１００％中０．５％未満であるように、画像解析を３回繰り返した。
Ｐｙｒｏｇｅｎｅ ｒＦＣ法による内毒素の決定
内毒素含有量をＰｙｒｏｇｅｎｅ ｒＦＣ法で決定した。標準曲線を生成するために、凍結乾燥された内毒素標準物質を、製造業者（Ｌｏｎｚａ）によって指示されるように内毒素が含まれていない水と混合した。タンパク質試料を、そのままで液体に希釈するか、またはあるいは内毒素が含まれていない水で粉末に戻すかのいずれかを行った。測定値が標準曲線の範囲内に現れるべく、異なる希釈物を調製した。望まれない分子間相互作用を解離するために、試料を１００℃まで１０分間加熱した。典型的な実験では、試料および標準物質を、１ウェルにつき０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、および０．１の内毒素ユニットを伴って、１ウェルにつき１００μｌで添加した。試料を同様に１００μｌで添加し、アッセイ阻害または妨害に関する試験をするために、１ウェルにつき０．００１〜０．０１の内毒素ユニットでのスパイクを添加するように、追加の試料を含めた。製造業者（Ｌｏｎｚａ）に従って、１：４：５の比率で、それぞれ、ｒＦＣ酵素、アッセイ緩衝液、および基質を混合して、作業試薬を調製した。試料または標準物質と等容積で、作業試薬をウェルに添加した。蛍光プレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ ＦＬＸ８００Ｔ）を励起のために３８０ｎｍ（バンド幅＝２０ｎｍ）に設定し、発光波長を４４０ｎｍ（バンド幅＝３０ｎｍ）に設定した。０時間で得た測定値を、３７℃で１時間後に得た測定値から減算した。標準物質に対する相関係数、勾配、およびＹ切片が設定限度内であった場合に、測定値は有効であると見なされ、スパイク実験は、スパイクした内毒素が、設定限度内で測定可能および回復可能であったことを示す。さらに、複製試料に対する標準偏差は、標準偏差が指定の任意に選択された限度内であるように、合理的に一致しなければならない。全ての試料を無菌で回収し、試験のために使用された管／バイアル／容器は、正確および的確な内毒素試験に関連するため、良好な研究実践後に非常に少ない内毒素を有することが検証された。
細胞の生存率の決定
ハイブリドーマ細胞株ＡＥ１（ＡＴＣＣ）を、５％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ基礎培地中に維持した。ウシ胎仔血清の補給なしで、アルブミンを無血清条件下（ＡＦＭ６、ＫＣ Ｂｉｏ、Ｋａｎｓａｓ）で試験した。細胞を複数の継代にわたって５％のＦＢＳから無血清培地に継代培養した。各継代培養において、アルブミンの望ましい濃度の存在下で、細胞を総細胞数および生存率に関して分析した。（トリプシン処理およびＮｅｕｂａｕｅｒ血球計算器を使用して直接計数することによって評価して）。細胞を標準の培養条件下（５％のＣＯ２で３７℃）で約７０時間成長させ、その後培養物の生存率が測定された。実験を二重に行った。データは、１０５で割られた１ｍＬ当たりの生存細胞の数を示す。
界面活性剤の決定
アルブミンの界面活性剤濃度を（細胞ベースの）界面活性剤アッセイで決定した。手短に言えば、界面活性剤に敏感な細胞を、異なる量の界面活性剤でスパイクし、結果として生じる細胞の生存率および細胞の運命決定を使用して、１６の独立したデータポイントから成る標準曲を生み出した。界面活性剤濃度における変化に対する生存率における変化をプロットし、対数関数に当てはめた。次に、同一の細胞ベースのアッセイで試験された試料において未知の界面活性剤濃度を計算するために、この等式を使用した。所与のデータに関する標準曲線に対する相関係数は、０．９８１６であった。典型的には、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍの乾燥重量につき約１０ｐｐｍ以上の界面活性剤濃度は、顕著な毒性作用をもたらす。１０％のアルブミン溶液と比較すると、界面活性剤の毒作用は、界面活性剤濃度が約１００ｐｐｍ〜２００ｐｐｍ、または０．０１％〜０．０２％（ｖ／ｖ）を超える時に明らかになる。
結果および考察：
Ｉ．血漿由来血清（Ｓｉｇｍａアルブミン）のサイズ排除クロマトグラフィー、ならびに新規の方法（Ｂ０００Ｃ）（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）および旧式の方法（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１０７）を使用して産生される組換えＨＳＡ（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ）による分析。
３つの種類のアルブミンに関するＨＰＬＣサイズ排除特性（図８Ａ、Ｃ、およびＤ）は、全体の純度については、異なるアルブミン調製が一般に類似することを示す。具体的には、４．５ｋＤａおよび２４０ｋＤａ前後におけるピークは、内部標準であり、３つ全ての産物が、約１０〜１２ｋＤａで、非常に少量の標準から外れた主ピーク信号を含有する。
ヒト血漿由来アルブミン（Ｓｉｇｍａアルブミン）（図８Ａ）は、１７ｋＤａ前後で汚染物質を含有し、それに対して、新規の方法（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１）（図８Ｃ）を使用する組換えイネ由来アルブミンは、４４ＫＤａおよび５５ｋＤａ前後の２つのタンパク質汚染物質を含有し、これは新規の方法で作製されるＣｅｌｌａｓｔｉｍにおいて、旧式の方法（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１０７）（図８Ｂ）を使用する時よりも著しく高いレベルで発生する。これらのピークは、ＨＰＬＣ分離では完全に消失されないが、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１およびＳｉｇｍａアルブミン（図８Ｄ）ならびに図８Ｅで示される旧式および新規の方法を使用して作製されるＣｅｌｌａｓｔｉｍのオーバーレイ特性においてより明確に見ることができる。
これらのピークに対応するタンパク質は、さらに下で考察されるように、実施例５で説明される過程を使用して産生されるＣｅｌｌａｓｔｉｍにおいて、主アルブミンピークのペプチド質量指紋分析によって特定される夾雑タンパク質の全ての約５％を表す。
試験した全てのアルブミン産物も同様に、大体はアルブミン二量体を表す１３０ｋＤａ前後におけるピークを含有し、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ二量体ピークは、血漿由来アルブミンよりも著しく小さいことが顕著である。凝集アルブミンの生成は、業界全体において、分解または安定性喪失のための１つのマーカーとして使用されるタンパク質分解の指標である。Ｃｅｌｌａｓｔｉｍに存在するＨｓｐは、アルブミンの解離を促進すると見なされ、したがって、これはＨｓｐ７０および他のＨｓｐタンパク質の一般的に知られている機能であるため、二量体の数を低減する。
ＩＩ．Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｃａｔ番号９３０１−０１）によって産生されるアルブミンと比較した、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ ｂａｔｃｈ Ｐ０１７１（新規の方法）のＳＤＳ ＰＡＧＥによる分析。
結果：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図９ＡおよびＢ）は、全体の純度について、産物が通常類似していることを示す。図９Ａは、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ Ｐ０１７１およびＣｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）の比較を示す。レーン１は、分子量マーカーである。レーン４は、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍアルブミン（１０μｇ）であり、レーン７は、Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（１０μｇ）である。図９Ｂは、以前の方法（Ｂ０００）（レーン２、３、および４）ならびにＣｅｌｌａｓｔｉｍの新規方法（Ｂ００００Ｃ）（レーン６、７、および８）からの３つのＣｅｌｌａｓｔｉｍロットのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析による比較を示す。６つの試料を１レーンにつき２０μｇで装填した。
ゲルの目視検査は、より厳密な規格を満たす新規の方法が、試験した３ロットの中ではより一貫性があることを示す。（図９Ｂ、レーン２、３、４対レーン６、７、８）。横縞模様は、新規の方法と比較して、以前の方法からの３つの試料の中で著しく異なる。重要なことに、新規の方法の試料は、旧式の方法の試料が有するよりも著しく少ない凝集物を２５０ＫＤａ前後で有する。（旧式の方法に対して平均２％より大きく、新規の方法に対して平均１％未満）。新規の方法を使用して産生されるＣｅｌｌａｓｔｉｍで濃縮されるタンパク質汚染物質の同一性は、下でさらに考察される。
ＩＩＩ．Ｃｅｌｌａｓｔｉｍの旧式および新規バッチの能力を促進する内毒素、界面活性剤、および成長の分析。アルブミンのいくつかの異なるロットを調製するための２つの異なる方法の性能の比較（表Ｅ３およびＥ４）は、旧式の方法が、実施例５で説明される新規の方法と比較して、著しく多い内毒素および界面活性剤を含有した組換えアルブミンを産生し、細胞の生存率を著しく高めた産物をもたらしたことを証明する。
Figure 2012518409
考察：実施例５で説明される新規の方法を作製するために旧式の方法を再設計することは、下でより完全に説明されるように、全体の産物の純度および性能の両方において著しい変化をもたらした。
該変化は、界面活性剤がより少なく、内毒素がより少なく、かつ純度を高めた産物の作製を可能にした。具体的には、新規の過程は、定期的に、全体の純度の約９５％以上で組換えアルブミンを産生した。比較して、旧式の方法は、定期的に、最大純度の約９０％でアルブミンを産生した。驚いたことに、増加した産物純度にもかかわらず、過程におけるこれらの変化はまた、組換えアルブミンとの熱ショックタンパク質の高まった同時精製をもたらした（下を参照）。任意の特定の動作理論に縛られることなく、アルブミンの高純度、内毒素および／または界面活性剤の相対的欠如の組み合わせ、ならびに熱ショックタンパク質の同時精製は、アルブミンを調製するための以前の方法より著しく優れた産物をもたらすと考えられる。
具体的には、表Ｅ３およびＥ４は、組換えアルブミンを産生するための新規の方法が、例えば、５ｍｇ／ｍＬで、平均バッチ対バッチの１００パーセントの細胞の生存率における改善を（５ｍｇ／ｍＬで）もたらし、同様に、旧式の方法よりも平均１００倍少ない内毒素、および１００倍少ない界面活性剤を有する産物をもたらすことを証明する。
実施例７：細胞成長および生存率への効果の分析
上で調製された組換えアルブミンの能力を促進する細胞成長を、他の市販のアルブミン産物、アルブミンの異なる供給源と比較するために、それらを細胞成長および生存率アッセイにおいて並べて比較した。試験した３つの産物は、（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ、ロット番号Ｐ０１５３）、Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｃａｔ番号９３０１−０１）、および血漿由来アルブミン（Ｓｅｒａｃａｒｅ Ｃａｔ番号ＨＳ−４００−６０）であった。
方法：残渣培地を除去するために同一の培地で２度洗浄した後、特別に調製したハイブリドーマ細胞ＡＥ１を、培地の１ｍＬ当たり０．５×１０５細胞の密度でＤＦ１２／ＩＴＳＥ中に播種した。次に、培地および細胞は、無処理のまま放置し（負の対照）、図説明文に示される濃度で、Ｓｅｒａｃａｒｅアルブミンで処理し、Ｃｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミンで処理し、イネ由来組換えアルブミンで処理した。培養物に対する生存率が測定された後に、細胞を標準の培養条件下（５％のＣＯ２で３７℃）で約７０時間成長させた。実験を二重に行った。結果は、図１０に示される。
結果：ＮｏｖａｚｙｍｅのＣｅｌｌｐｒｉｍｅアルブミンは、生存率の損失を引き起こした（網目の棒）。Ｓｅｒａｃａｒｅアルブミン（白色の棒）は、生存率に測定可能な増加を引き起こしたが、新規の方法（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ）でのイネ中で作製された組換えアルブミン（黒色の棒）で見られる増加ほど大きくはない。これらの条件下で、イネ由来組換えアルブミンは、他のアルブミン産物のいずれと比較しても、試験した任意の濃度において、細胞の生存率を促進するのに約５倍活動的であった。負の対照は、縞模様の棒で表される。
考察：他の市販のアルブミン産物が、イネ由来組換えアルブミンと類似した全体の純度、内毒素、および界面活性剤レベルを有し得る可能性を考慮すると、他の市販のアルブミンと比較した、組換えイネ由来アルブミンの著しく優れた性能は、血漿由来アルブミン（実施例５）と比較して、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍにおいて同定された、これまで未同定であったタンパク質汚染物質が、細胞の生存率に肯定的な影響を有し得ることを示唆する。Ｃｅｌｌａｓｔｉｍの特性へのこれらのタンパク質の影響を特定、および次に特徴付けるために、下で説明されるように、組換えアルブミンの試料をペプチド質量指紋に供した。
実施例８：組換えヒト血清アルブミンのペプチド質量指紋
方法：ＮａｎｏＬＣＭＳ／ＭＳペプチドシークエンシングシステム（ＰｒｏｔＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）ならびにペプチドフラグメントの分子量に基づいてタンパク質を特定するための専売ソフトウェアを使用して、著しいタンパク質汚染物質を決定するためにアルブミンの試料を分析した。手短に、アルブミンの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、各々の主なバンドゲルバンドを、シークエンシンググレード修飾トリプシンを含むゲル中で脱染、清掃、および消化した。得られたペプチド混合物を、７５マイクロメートル内径の逆相Ｃ１８カラムを有する高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）をイオントラップ質量分析計と連結して直列で使用したＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムによって分析した。得られた質量分析データを、ＰｒｏｔＴｅｃｈの専売ソフトウェアスイートを用いて最新の非重複タンパク質データベースを検索するために使用した。報告する前に、データベース検索からの出力を手入力で有効にした。
結果：組換えアルブミンの３つの代表的なロットの試験時に、３つのＨｓｐ７０タンパク質をペプチド質量指紋で特定した（表Ｅ５）。同定された３つの特定の配列、ＡＢＦ９５２６７、ＡＢＡ９７２１１、およびＢＡＤ０７９３８を、高い関連性および相同性のあるタンパク質を特定するために、非重複データベースと比較した。これらの比較の各々からの上位ヒットの結果は、下の表Ｅ６、Ｅ７、およびＥ８に示される。
Figure 2012518409
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ，２００８ Ｊａｎ、３６（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２５−３０）中のタンパク質配列の非重複データベースにおけるＡＢＦ９５２６７配列との配列比較の結果は、下の表Ｅ６に示される。
Figure 2012518409
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）中のタンパク質配列の非重複データベースにおける配列とのＡＢＢ６３４６９の配列比較の結果は、下の表Ｅ７に示される。
Figure 2012518409
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）中のタンパク質配列の非重複データベースにおける配列との配列ＡＢＡ９７２１１の配列比較の結果は、下の表Ｅ８に示される。
Figure 2012518409
考察：ペプチド質量指紋は、アルブミン、２つのイネＨＳＰ７０遺伝子、（ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜）、ＥＥＣ６９０７３、およびイネ胚乳組織（胚乳内腔結合タンパク質）由来のＢｉＰ相同体であるＡＡＢ６３４６９で同時精製する３つのイネ熱ショックタンパク質スーパーファミリーメンバーを特定した。これらの遺伝子によってコード化された完全なアミノ酸配列は、以下に記載される。
遺伝子ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜熱ショックタンパク質７０［オリザサティバジャポニカ群］ＨＳＰ７０は、約０．０７重量／重量％でＣｅｌｌａｓｔｉｍ中の組換えアルブミンにおいて発生することが見出された。その完全なアミノ酸コード配列（配列番号５）を下に提供する。
ＭＡＧＮＫＧＥＧＰＡ ＩＧＩＤＬＧＴＴＹＳ ＣＶＧＶＷＱＨＤＲＶ ＥＩＩＡＮＤＱＧＮＲ ＴＴＰＳＹＶＡＦＴＤ ＴＥＲＬＩＧＤＡＡＫ
ＮＱＶＡＭＮＰＴＮＴ ＶＦＤＡＫＲＬＩＧＲ ＲＦＳＤＰＳＶＱＡＤ ＭＫＭＷＰＦＫＶＶＰ ＧＰＡＤＫＰＭＩＶＶ ＴＹＫＧＥＥＫＫＦＳ
１２１ ＡＥＥＩＳＳＭＶＬＴ ＫＭＫＥＩＡＥＡＦＬ ＳＴＴＩＫＮＡＶＩＴ ＶＰＡＹＦＮＤＳＱＲ ＱＡＴＫＤＡＧＶＩＳ ＧＬＮＶＭＲＩＩＮＥ
１８１ ＰＴＡＡＡＩＡＹＧＬ ＤＫＫＡＡＳＴＧＥＫ ＮＶＬＩＦＤＬＧＧＧ ＴＦＤＶＳＩＬＴＩＥ ＥＧＩＦＥＶＫＡＴＡ ＧＤＴＨＬＧＧＥＤＦ
２４１ ＤＮＲＭＶＮＨＦＶＱ ＥＦＫＲＫＨＫＫＤＩ ＴＧＮＰＲＡＬＲＲＬ ＲＴＡＣＥＲＡＫＲＴ ＬＳＳＴＡＱＴＴＩＥ ＩＥＳＬＹＥＧＩＤＦ
３０１ ＹＡＴＩＴＲＡＲＦＥ ＥＬＮＭＤＬＦＲＲＣ ＭＥＰＶＥＫＣＬＲＤ ＡＫＭＤＫＡＱＩＨＤ ＶＶＬＶＧＧＳＴＲＩ ＰＫＶＱＱＬＬＱＤＦ
３６１ ＦＮＧＫＥＬＣＫＳＩ ＮＰＤＥＡＶＡＹＧＡ ＡＶＱＡＡＩＬＳＧＥ ＧＮＱＲＶＱＤＬＬＬ ＬＤＶＴＰＬＳＬＧＬ ＥＴＡＧＧＶＭＴＶＬ
４２１ ＩＰＲＮＴＴＩＰＴＫ ＫＥＱＶＦＳＴＹＳＤ ＮＱＰＧＶＬＩＱＶＹ ＥＧＥＲＴＲＴＫＤＮ ＮＬＬＧＫＦＥＬＴＧ ＩＰＰＡＰＲＧＶＰＱ
４８１ ＩＮＶＴＦＤＩＤＡＮ ＧＩＬＮＶＳＡＥＤＫ ＴＴＧＫＫＮＫＩＴＩ ＴＮＤＫＧＲＬＳＫＥ ＥＩＥＲＭＶＱＥＡＥ ＫＹＫＡＥＤＥＱＶＲ
５４１ ＨＫＶＥＡＲＮＡＬＥ ＮＹＡＹＮＭＲＮＴＶ ＲＤＥＫＩＡＳＫＬＰ ＡＤＤＫＫＫＩＥＤＡ ＩＥＤＡＩＫＷＬＤＧ ＮＱＬＡＥＡＤＥＦＥ
６０１ ＤＫＭＫＥＬＥＳＬＣ ＮＰＩＩＳＫＭＹＱＧ ＧＡＧＧＰＡＧＭＤＥ ＤＡＰＮＧＳＡＧＴＧ ＧＧＳＧＡＧＰＫＩＥ ＥＶＤ
イネ胚乳組織（胚乳内腔結合タンパク質［オリザサティバ］）ＢｉＰ由来のＡＡＢ６３４６９ＢｉＰ相同体は、約０．０９重量／重量％でＣｅｌｌａｓｔｉｍ中の組換えアルブミンにおいて発生することが見出された。その完全なアミノ酸コード配列（配列番号６）を下に提供する。
ｍｄｒｖｒｇｓａｆｌ ｌｇｖｌｌａｇｓｌｆ ａｆｓｖａｋｅｅｔｋ ｋｌｇｔｖｉｇｉｄｌ ｇｔｔｙｓｃｖｇｖｙ ｋｎｇｈｖｅｉｉａｎ
ｄｑｇｎｒｉｔｐｓｗ ｖａｆｔｄｓｅｒｌｉ ｇｅａａｋｎｑａａｖ ｎｐｅｒｔｉｆｄｖｋ ｒｄｉｇｒｋｆｅｅｋ ｅｖｑｒｄｍｋｌｖｐ
１２１ ｙｋｉｖｎｋｉｇｋｐ ｙｉｑｖｋｉｋｄｇｅ ｎｋｖｆｓｐｅｅｖｓ ａｍｉｌｇｋｍｋｅｔ ａｅａｙｌｇｋｋｉｎ ｄａｖｖｔｖｐａｙｆ
１８１ ｎｄａｑｒｑａｔｋｄ ａｇｖｉａｇｌｎｖａ ｒｉｉｎｅｐｔａａａ ｉａｙｇｌｄｋｋｇｇ ｅｋｎｉｌｖｆｄｌｇ ｇｇｔｆｄｖｓｉｌｔ
２４１ ｉｄｎｇｖｆｅｖｌａ ｔｎｇｄｔｈｌｇｇｅ ｄｆｄｑｒｉｍｅｙｆ ｉｋｌｉｋｋｋｙｓｋ ｄｉｓｋｄｎｒａｌｇ ｋｌｒｒｅａｅｒａｋ
３０１ ｒａｌｓｎｑｈｑｖｒ ｖｅｉｅｓｌｆｄｇｔ ｄｆｓｅｐｌｔｒａｒ ｆｅｅｌｎｎｄｌｆｒ ｋｔｍｇｐｖｋｋａｍ ｄｄａｇｌｅｋｓｑｉ
３６１ ｈｅｉｖｌｖｇｇｓｔ ｒｉｐｋｖｑｑｌｌｒ ｄｙｆｅｇｋｅｐｎｋ ｇｖｎｐｄｅａｖａｙ ｇａａｖｑｇｓｉｌｓ ｇｅｇｇｄｅｔｋｄｉ
４２１ ｌｌｌｄｖａｐｌｔｌ ｇｉｅｔｖｇｇｖｍｔ ｋｌｉｐｒｎｔｖｉｐ ｔｋｋｓｑｖｆｔｔｙ ｑｄｑｑｔｔｖｓｉｑ ｖｆｅｇｅｒｓｍｔｋ
４８１ ｄｃｒｌｌｇｋｆｄｌ ｓｇｉｐａａｐｒｇｔ ｐｑｉｅｖｔｆｅｖｄ ａｎｇｉｌｎｖｋａｅ ｄｋｇｔｇｋｓｅｋｉ ｔｉｔｎｅｋｇｒｌｓ
５４１ ｑｅｅｉｄｒｍｖｒｅ ａｅｅｆａｅｅｄｋｋ ｖｋｅｒｉｄａｒｎｑ ｌｅｔｙｖｙｎｍｋｎ ｔｖｇｄｋｄｋｌａｄ ｋｌｅｓｅｅｋｅｋｖ
６０１ ｅｅａｌｋｅａｌｅｗ ｌｄｅｎｑｔａｅｋｅ ｅｙｅｅｋｌｋｅｖｅ ａｖｃｎｐｉｉｓａｖ ｙｑｒｔｇｇａｐｇｇ ｒｒｒｇｒｌｄｄｅｈ
６６１ ｄｅｌ
ＥＥＣ６９０７３／ＯｓＩ＿３７９３８［オリザサティバインディカ群］間質ＨＳＰ７０は、約０．０６重量／重量％でＣｅｌｌａｓｔｉｍ中の組換えアルブミンにおいて発生することが見出された。その完全なアミノ酸コード配列（配列番号７）を下に提供する。
ｍａｓｆｔｓｑｌｇａ ｍａｃｇａａｐｓｔｓ ｐｌａａｒｒｓｇｑｌ ｆｖｇｒｋｐａａａｓ ｖｑｍｒｖｐｒａｇｒ ａｒｇｖａｍｒｖａｃ
６１ ｅｋｖｖｇｉｄｌｇｔ ｔｎｓａｖａａｍｅｇ ｇｋｐｔｖｉｔｎａｅ ｇｑｒｔｔｐｓｖｖａ ｙｔｋｇｇｅｒｌｖｇ ｑｉａｋｒｑａｖｖｎ
１２１ ｐｅｎｔｆｆｓｖｋｒ ｆｉｇｒｋｍａｅｖｄ ｄｅａｋｑｖｓｙｈｖ ｖｒｄｄｎｇｎｖｋｌ ｄｃｐａｉｇｋｑｆａ ａｅｅｉｓａｑｖｌｒ
１８１ ｋｌｖｄｄａｓｋｆｌ ｎｄｋｉｔｋａｖｖｔ ｖｐａｙｆｎｄｓｑｒ ｔａｔｋｄａｇｒｉａ ｇｌｅｖｌｒｉｉｎｅ ｐｔａａｓｌａｙｇｆ
２４１ ｅｋｋｎｎｅｔｉｌｖ ｆｄｌｇｇｇｔｆｄｖ ｓｖｌｅｖｇｄｇｖｆ ｅｖｌｓｔｓｇｄｔｈ ｌｇｇｄｄｆｄｋｆｙ ｆｃｗｖｆｙｆｇａｍ
３０１ ｔｈｅｔｐｋｖｖｄｗ ｌａｓｎｆｋｋｄｅｇ ｉｄｌｌｋｄｋｑａｌ ｑｒｌｔｅａａｅｋａ ｋｍｅｌｓｔｌｓｑｔ ｎｉｓｌｐｆｉｔａｔ
３６１ ａｄｇｐｋｈｉｅｔｔ ｌｓｒａｋｆｅｅｌｃ ｓｄｌｉｄｒｌｋｔｐ ｖｔｎａｌｒｄａｋｌ ｓｖｄｎｌｄｅｖｉｌ ｖｇｇｓｔｒｉｐｓｖ
４２１ ｑｅｌｖｋｋｉｔｇｋ ｄｐｎｖｔｖｎｐｄｅ ｖｖｓｌｇａａｖｑｇ ｇｖｌａｇｄｖｋｄｖ ｖｌｌｄｖｔｐｌｓｌ ｇｌｅｔｌｇｇｖｍｔ
４８１ ｋｉｉｐｒｎｔｔｌｐ ｔｓｋｓｅｖｆｓｔａ ａｄｇｑｔｓｖｅｉｎ ｖｌｑｇｅｒｅｆｖｒ ｄｎｋｓｌｇｓｆｒｌ ｄｇｉｐｐａｐｒｇｖ
５４１ ｐｑｉｅｖｋｆｄｉｄ ａｎｇｉｌｓｖａａｉ ｄｋｇｔｇｋｋｑｄｉ ｔｉｔｇａｓｔｌｐｋ ｄｅｖｅｒｍｖｅｅａ ｄｋｆａｑｅｄｋｅｋ
６０１ ｒｄａｉｄｔｋｎｑａ ｄｓｖｖｙｑｔｅｋｑ ｌｋｅｌｇｄｋｖｐａ ｐｖｋｅｋｖｄａｋｌ ｎｅｌｋｅａｉａｇｇ ｓｔｑｓｍｋｄａｍａ
６６１ ａｌｎｅｅｖｍｑｉｇ ｑａｍｙｎｑｑｐｎａ ｇａａｇｐｔｐｇａｄ ａｇｐｔｓｓｇｇｋｇ ｐｎｄｇｄｖｉｄａｄ ｆｔｄｓｎ
これらのタンパク質は、アルブミンに対してイネ組換えアルブミンの新規バッチにおいて低レベルでのみ発生するので、これらの汚染物質が、組換えアルブミンの新規バッチの効果を促進しながら優れた成長に実質的に関与することを確認するための事前の必要条件は、アルブミンへのこれらの成分の添加し戻しが、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ中の各成分に対して実質的に特定されたものに匹敵するレベルで、組換えアルブミンの活性を促進しながら成長を回復または高めるかを決定することである。
実施例９：親和性クロマトグラフィーによる組換えアルブミンからの熱ショックタンパク質の分離
方法：新規の方法［ロットＰ０１５３、Ｐ０１５６、および／またはＰ０１７１］を使用して産生したＣｅｌｌａｓｔｉｍの粉末を、１リットル当たり約２０ｇで精製水と混合した。得られた溶液を、緩衝液の少なくとも５等容積で、５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．０に対してダイア濾過した。得られた溶液をＡＴＰアガロースカラムに通し、得られた貫流を画分Ａと名付けた。カラムを平衡緩衝液の５カラム容積で洗浄し、ＡＴＰアガロースに結合する物質を５０ｍＭのトリス／Ｃｌ、１ＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０で溶出した。溶出した物質を画分Ｂと名付けた。洗浄物を画分Ｃとして保持した。画分Ａを１リットル当たり１００ｇにまで直接濃縮し、ｄ−ＰＢＳでダイア濾過した。さらなる分析のために、画分Ｂを５０ｍＭのトリス／Ｃｌ中で２０倍または１００倍になるまで著しく濃縮した。さらなる参照のために、洗浄物の画分Ｃを保持した。ウエスタンブロット法のために、（アルブミンのｅ．ｃ．（減衰係数）が１ｍｇ当たり０．５３ｃｍ２であり、Ｈｓｐ７０のｅ．ｃ．が１ｍｇ当たり０．４１ｃｍ２である、Ａ２８０による）１０μｇの各タンパク質画分を、２Ｘ ＳＤＳ装填緩衝液中の４〜２０％のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに装填した。装填する前に、試料を８０℃まで約５分間加熱した。２００Ｖ（定電圧）で分離を行い、約９０分間実行した。得られたゲルを水中で３０分間〜２時間すすぎ、次いで、タンパク質を３０ｍＡ（一定電流）で２時間、ニトロセルロース膜に搬送した。得られたブロットは、転写対照としての分子量マーカータンパク質を含有し、次いで、水中で５％（ｗ／ｖ）の粉乳にブロックした。初代単クローン性抗体（マウス抗ウシＨｓｐ７０（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｈ５１４７））を５％の乳溶液中でブロット（１：２５００）に添加し、ブロットを緩徐な揺動を伴う揺動装置上で、４℃で一晩インキュベートした。次に、ブロットを毎回１：２５００の希釈で添加した５％の乳溶液中のＴＤＮおよび第二抗体（Ｐｉｅｒｃｅ抗マウスＨＲＰ共役）で４回、１０分間洗浄した。４℃での２〜３時間のインキュベーション後、ブロットを毎回ＴＤＮで４回、１０分間洗浄した。次に、得られたブロットをｐｉｃｏ（Ｐｉｅｒｃｅ）化学発光基質で５分間インキュベートした。Ｋｏｄａｋ写真用フィルムを暗室でブロットに露光し、その結果生じたフィルムを現像し、すすぎ、調整し、すすぎ、乾燥させた。フィルム上の分子量マーカー位置の正確な転移を決定するために、発光ラベルを使用した。
結果：結果を図１１に示す。撮されたウエスタンブロットは、分離スキームが、Ａ（貫流）およびＢ（ＡＴＰ結合）画分におけるタンパク質の２つの集団を産生することを示す。出発原料（レーン２）、画分Ａ貫流（レーン３）、画分Ｃの洗浄物（レーン４）、および画分Ｂ（レーン５）を、単クローン性抗体に反応する能力に関して試験した。さらに、正の対照としての機能を果たす市販のＨｓｐ７０タンパク質を最終レーン（レーン１０）に装填した。図１１のブロットで示されるように、貫流画分Ａ（レーン３）は、顕著な量のＨｓｐ７０を含有しない。溶出および濃縮された画分Ｂ（レーン４）は、ブロットで示されるように、抗体に対して極めて反応性に富み、７５ｋＤａの分子量マーカーを中心とする少なくとも２つのはっきりと異なるバンドを示す。洗浄物の画分Ｃ（レーン５）は、７５ｋＤａをやや下回って走る２つのバンドの存在を示す。別個の独立した実験では、貫流画分Ａ（レーン７）は、この場合もやはり抗体に反応せず、洗浄物の画分Ｃ（レーン８）も同様に抗体に反応しないが、レーン９に示されるＡＴＰ結合タンパク質で濃縮された画分（画分Ｂ）は、最初の分離で見られたのと同一のバンド模様をもたらす。
考察：ＡＴＰアガロース親和性樹脂に結合するそれらの能力に基づいて、ＨＳＰ７０タンパク質を分離するために、分離プロトコルを開発し、その有効性に関して試験した。手順は、ＡＴＰアガロースを使用する最小量の試料の取り扱い、および緩衝液を濃縮して変化を導くための限外濾過、ならびにｈｓｐの存在を検出するための抗ｈｓｐ７０抗体のみを伴った。該手順の結果（図１１）は、１０μｇの出発原料、１０μｇの貫流、または１０μｇの洗浄物画分中にある間、ａｎｔ−Ｈｓｐ抗体によって検出される十分なｈｓｐ７０が存在しないことを明瞭に証明する。対照的に、ＡＴＰアガロースカラムから溶出した画分は、抗Ｈｓｐ７０抗体によって明瞭に認識される少なくとも２つのタンパク質を含有する。したがって、結果は、分離スキームが成功し、２つの独立したクロマトグラフィーランおよびダイア濾過において再現可能であることを示す。さらに、データは、先に考察したように、ペプチド質量指紋によってもたらされた熱ショックタンパク質の特定を立証し、これらのタンパク質が機能的であり、かつ単純なＡＴＰアガロースクロマトグラフィー、続いてダイア濾過で容易に単離および濃縮することができることを証明する。熱ショックタンパク質は、組換えアルブミンと同時精製すると結論付けられる。そのような同時精製は、熱ショックタンパク質がアルブミンに結合し、かつアルブミンが安定した立体配座において熱ショックタンパク質を安定化させる役割を果たすという仮説と一致する。驚いたことに、組換えアルブミン／熱ショックタンパク質複合体は、機能熱ショックタンパク質の存在と一致する著しいＡＴＰａｓｅ活性（データ示さず）を保持する。この増加した活性は、下で説明するように、効果を促進しながら成長をもたらす時にさらに確認された。
実施例１０：細胞の生存率へのイネ組換えアルブミン由来のＨｓｐの除去の効果
方法：細胞培養試験に好適な画分Ａを産生するために、実施例９で説明した分離スキームを同様に使用した（図１２）。方法は、それをＡＴＰアガロースカラムに貫流させ、次にダイア濾過で濃縮し、細胞培養に好適なＰＢＳで緩衝する際の、最小量の画分Ａの取り扱いを伴う。方法の意図は、生存率の損失が見られるが、それがＡＴＰ結合タンパク質の除去を超える他の何らかの理由または原因の理由であるように、実験に新規の変数を導入しないことである。ハイブリドーマ細胞培養生存率を促進する能力に関して、画分Ａを純粋な対照（出発原料）に対して試験した。試験の結果は、図１２に示される。
結果：図１２に示されるように、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ出発原料（網目の棒）およびパートＡ（無地の棒）を同一の濃度で試験し、負の対照（縞模様の棒）と比較した。試験した４つの濃度全てにおいて、統計的に著しい減少が観察可能である。結果は、ＡＴＰアガロース処理後、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍの性能における著しい損失があったことを示す。処理は、Ｃｅｌｌａｓｔｉｍと比較して、ＡＴＰ結合タンパク質の除去前に、２８．０、２１．７、２６．７、および７９．５％の損失をもたらした。この実験において、試料の取り扱いまたは新規の汚染物質の不慮の導入の理由から、性能における任意の不注意による損失を最小限にすることを保証するために、試料の設計および取り扱いにおいて注意を払った。
考察：細胞培養の結果（図１２）は、単にそれをＡＴＰ結合カラムに通過させることによって、イネ由来組換えアルブミンの性能を低減することが可能であることを証明する。このデータは、実施例９に示される結果と組み合わせた時に、ＡＴＰアガロースカラムによるアルブミンからのｈｓｐの枯渇が、アルブミンの特性を促進する細胞成長を直接低減させることを証明する。したがって、この結果は、アルブミンの優れた特性が、少なくともある程度、アルブミン中の夾雑熱ショックタンパク質に起因することを証明する。
実施例１１：無血清培養におけるＣＨＯ Ｋ１の増殖へのラクトフェリンとの組み合わせでのイネ由来組換えヒト血清アルブミンの効果
植物由来ヒト血清アルブミン（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ）の固有の性状が、これらの成分との組み合わせで添加された時に、他の細胞培養成分の活性を促進しながら成長にプラスの影響を与え得るかを調査するために、さらなる一連の実験を考案し、そのような成分との最適な組み合わせを評価および同定した。
方法：ＣＨＯ Ｋ１系列のＤＰ１２クローン１９３４（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１２４４５）を、１２５ｍＬのフラスコの１４ｍＬの培地中の０．５％のＦＢＳ、１μＭのメトトレキサート、５０μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充したＳＡＦＣ３２５ＰＦ無タンパク質ＣＨＯ培地中に維持した。ＣＨＯ Ｋ１系列のＤＰ１２は、分泌産物としてヒト化単クローン性抗体を発現する。植物由来組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）（実施例３および５）ならびに植物由来組換えラクトフェリン（ｒＬＦ）（実施例１および４）の成長および生産性増強効果を、単独または組み合わせで検査した。細胞を２００ｎＭのメトトレキサート、５０μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含有する３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で２回洗浄し、同一の培地中で、１ｍＬ当たり１．５×１０５の細胞で４ｍＬの振盪バッチ培養物に播種した。４ｍＬの振盪培養物を、ｒＨＳＡもしくはｒＬＦまたは２つの添加物の多様な混合物の多様な濃度でさらに補充した。ｒＨＳＡまたはｒＬＦが添加されていない対照培養を基準として使用した。全ての培養条件を二重に実行した。Ｇｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、１４日間のバッチ期間、生存細胞の濃度を毎日測定した。培養の６日後に、対数期成長を細胞の相対的増殖によって判断した。全ての培養物を、加湿環境下で、３７℃、６％のＣＯ２で成長させた。観察された効果を正味の生存細胞濃度（観察ベースの培地）として計算した。予測効果を個々の成分の効果の合計として計算した。
表Ｅ９は、培養の６日後の生存細胞の数を示す。補給なしの培地中の細胞は、１ｍＬ当たり３．３×１０５の生存細胞に増殖した。植物由来組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）もしくは組換えラクトフェリン（ｒＬＦ）、またはそれら２つの組み合わせの添加は、下で示されるように細胞の増殖を増加させた。列２は、基準の対照培養を上回る、各々の添加物の観察された効果を示す。列３は、予測相加効果が添加物１および添加物２の合計に等しいというモデルを使用した、予測された効果を示す。
Figure 2012518409
考察：ラクトフェリンは、鉄を輸送する役割を果たす無血清細胞培養培地にとって必須因子であり、さらに、ラクトフェリンは、最近になって、いくつかの細胞型においてアポトーシスの成長因子および阻害剤として特定された（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．（２００８）４４（１０）４６４−７１、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ ４８（１）３９−４４、Ｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．（１９９７）４５（４）３１５−２０、Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９８３）７６３（４）３７７−８２）。表Ｅ９では、データは、０．１ｇ／Ｌおよび０．８ｇ／Ｌの組換えラクトフェリンの添加が、ラクトフェリン成長刺激特性と一致する細胞成長の基準速度と比較して、細胞成長の著しい増進をもたらしたことを示す。
ラクトフェリンの成長刺激効果は、植物由来組換えヒト血清アルブミンの添加によってさらに高まった。予想外に、０．１ｇ／Ｌのラクトフェリンおよび０．５ｇ／Ｌの植物由来組換えヒト血清アルブミンの組み合わせ（１対５の比率）は、同一の濃度で試験したアルブミン単独またはラクトフェリン単独のいずれかよりも約４倍高い、細胞成長における刺激をもたらした。一方で、０．１ｇ／Ｌのラクトフェリンおよび１．０ｇ／Ｌのヒト血清アルブミンの組み合わせ（１対１０の比率）は、同一の濃度において、アルブミンまたはラクトフェリン単独のいずれかよりも約４．４〜５倍近く高い、細胞成長における刺激をもたらした。
植物由来組換えヒト血清アルブミンを０．８ｇ／Ｌの濃度でラクトフェリンに添加した時に、相乗作用も同様に観察された。この著しく高い濃度においてさえ、植物由来組換えヒト血清アルブミンの添加は、２〜２．５倍、細胞成長をさらに増加させた。
アルブミンおよびラクトフェリンは、構造または機能的類似性が少ししか重複しない、はっきりと異なるタンパク質ファミリーである。したがって、それらの異なる構造および機能に基づいて、相乗作用がこれらのタンパク質で観察されるという事実は予想外である。相乗作用は、ラクトフェリンおよびアルブミンの最適な比率を使用することによって、栄養補助剤に高められた細胞培養特性（すなわち、改善された細胞成長および生存率）を提供する、改善された栄養補助剤を開発する機会を提供する。
実施例１２：無血清培養で成長するＣＨＯ Ｋ１細胞の生産性へのラクトフェリンとの組み合わせでのイネ由来組換えアルブミンの効果
方法：ＣＨＯ Ｋ１系列のＤＰ１２クローン１９３４（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１２４４５）を、１２５ｍＬのフラスコの１４ｍＬの培地中の０．５％のＦＢＳ、１μＭのメトトレキサート、５０μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充したＳＡＦＣ３２５ＰＦ無タンパク質ＣＨＯ培地中に維持した。ＣＨＯ Ｋ１系列のＤＰ１２は、分泌産物としてヒト化単クローン性抗体を発現する。植物由来組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）（実施例３および５）ならびに植物由来組換えラクトフェリン（ｒＬＦ）（実施例１および４）の成長および生産性増強効果を、単独または組み合わせで検査した。細胞を２００ｎｍのメトトレキサート、５０μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含有する３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で２回洗浄し、同一の培地中で、１ｍＬ当たり１．５×１０５の細胞で４ｍＬの振盪バッチ培養物に播種した。４ｍＬの振盪培養物を、植物由来組換えヒト血清アルブミンもしくはＬＦまたは２つの添加物の多様な混合物の多様な濃度でさらに補充した。ＨＳＡまたはＬＦが添加されていない対照培養を基準として使用した。全ての培養条件を二重に実行した。Ｇｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、１４日間のバッチ期間、生存細胞の濃度を毎日決定した。培養の６日後に、対数期成長を細胞の相対的増殖によって判断した。細胞の生存率が１０％未満にまで低下した時に（典型的には、１３日目または１４日目）、抗体生産性をバッチ培養の最後に定量ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定した。全ての培養物を、加湿環境下で、３７℃、６％のＣＯ２で成長させた。観察された効果を正味の生存細胞濃度（観察ベースの培地）として計算した。予測効果を個々の成分の効果の合計として計算した。
Figure 2012518409
表Ｅ１０は、ＣＨＯ Ｋ１細胞の生産性への、単子葉植物細胞中で産生される植物由来組換えヒト血清アルブミンおよび組換えラクトフェリン、ならびに２つのタンパク質の多様な組み合わせの効果を示す。表Ｅ１０は、基準の培地（添加物なし）中の１３日間の培養後の細胞によって産生される抗体産物の濃度が、４７．１μｇ／ｍＬの抗体産物を産生したことを示す。組換えアルブミンもしくは組換えラクトフェリン単独で、または植物由来組換えヒト血清アルブミンおよびラクトフェリンの組み合わせで補充された培地は、添加物を有さない対照培地よりも著しく高いレベルの抗体を産生した。列２は、基準の対照培地を上回る添加物の観察された効果を示す。列３は、予測添加物が各添加物単独の合計に等しいというモデルを使用した、２つの添加物の組み合わせの予測相加効果を示す。
考察：表Ｅ１０は、細胞成長および生存率における改善が、改善された抗体発現ならびに細胞生産性に直接つながったことを証明する。細胞の生存率および細胞成長の場合のように、これらをともに培養に添加した時に、タンパク質成分の最大効果が観察された。
表Ｅ１１は、実施例１２と同一の条件を使用した、拡大した範囲の濃度で添加物の効果を示す、さらなるデータセットを示す。組換えアルブミン単独、もしくはラクトフェリン単独、または両タンパク質の組み合わせで補充した培地は、添加物を含まない対照培地よりも高い抗体のレベルを産生した。列２は、基準の対照培地を上回る添加物の観察された効果を示す。列３は、同一の濃度で単独で添加された場合の各添加物の効果の合計に等しいというモデルを使用した、２つの添加物の組み合わせの予測された効果を示す。データは、組み合わせの実際の効果が、試験した２つのタンパク質の比率全体にわたって、予測された効果以上であることを示す。
Figure 2012518409
考察：１対０．３３３の低比率から１対２０までの高比率に及ぶラクトフェリン対アルブミンの比率は、細胞成長の相乗的刺激を産生した。ラクトフェリン対アルブミンの最適な比率は、１対０．３３３重量／重量（０．５ｇ／Ｌのアルブミン濃度）、１対１．２重量／重量（１．０ｇ／Ｌのアルブミン濃度）、および１対２．４重量／重量（２．０ｇ／Ｌのアルブミン濃度）で見出された。
したがって、細胞生産性の刺激は、組換えアルブミンおよびラクトフェリンの広範囲の比率を超えて発生する。ラクトフェリンおよび組換えアルブミンの最適な比率は、ある程度、両タンパク質成分の絶対濃度によって変わる。ラクトフェリン対アルブミンの好ましい比率は、約１（ラクトフェリン）対０．３３（アルブミン）〜約１（ラクトフェリン）対３（アルブミン）重量／重量に及ぶ。
実施例１３：他の細胞培養成分の存在下におけるアルブミンおよびトランスフェリンの組み合わせの効果の評価
細胞成長および生存率へのラクトフェリンおよびアルブミンの相乗効果への他の細胞培養成分の効果を決定するために、細胞成長に必須であることが先に示された他の細胞培養成分を用いて、さらなる一連の実験を無血清条件下で実行した。
方法：１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で活発に成長するハイブリドーマ細胞を、ＦＢＳを除去するために、ＦＢＳなしで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３回洗浄した。植物由来トランスフェリン、植物由来ヒト組換え血清アルブミン、亜セレン酸ナトリウム、ならびにエタノールアミン単独および組み合わせでの成長および生産性増強効果を、１ｍＬ当たり０．４×１０５の生存細胞の初期細胞密度でＤＭＥＭ／Ｆ１２中に播種された細胞において検査した。これらの実験では、トランスフェリン（ＴＦ）を５．５μｇ／ｍＬの初期濃度で使用し、植物由来組換えヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を１００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの初期濃度で使用し、亜セレン酸ナトリウム（ＳＥ）ならびにエタノールアミンをそれぞれ１：５００，０００ｖ／ｖおよび６．７μｇ／ｍＬの濃度で使用した。観察された効果を正味の生存細胞濃度（観察ベースの培地）として計算した。予測効果を個々の成分の効果の合計として計算した。
振盪培養を下の表Ｅ１２で説明するように、上に記載される栄養補助剤の多様な濃度でさらに補充した。栄養補助剤が添加されていない対照培養を基準として使用した。全ての培養条件を二重に実行した。Ｇｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、３日後に生存細胞の濃度を決定した。全ての培養物を、加湿環境下で、３７℃、６％のＣＯ２で成長させた。
Figure 2012518409
考察：組換えトランスフェリンとの組み合わせでの組換えヒト血清アルブミンは、ともに培養培地に添加された時に相乗効果を示した。この効果は、セレンの存在下でさらに増大した。しかしながら、セレンの添加は、組換え植物由来ヒト血清アルブミン単独とは相乗的に作用しなかった。トランスフェリンおよび植物由来組換えヒト血清アルブミンの最大相乗効果は、セレンの存在下、ならびに約１（トランスフェリン）対１００（アルブミン）重量／重量、および約１（トランスフェリン）対２００（アルブミン）のトランスフェリン対植物由来組換えヒト血清アルブミンの比率で発生した。
セレンは、細胞成長および発達の周知の必須の微量元素であり、生物学的システムにおけるそのプラスの役割には、グルタチオンペルオキシダーゼを活性化することによる遊離基の解毒が含まれる。さらに、セレンは、無血清培地中で非常に効果的な鉄担体の機能を果たす可能性があり、細胞成長を刺激するトランスフェリンへのその相乗的影響を説明するのに役立つ。（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．（２００６）９５（６）１１８８−９７）。
実施例１４：アルブミン、トランスフェリン、およびインスリンの組み合わせの効果の評価
方法：１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で活発に成長するハイブリドーマ細胞を、ＦＢＳを除去するために、ＦＢＳなしで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３回洗浄した。植物由来トランスフェリン、植物由来ヒト組換え血清アルブミン、亜セレン酸ナトリウム、ならびにエタノールアミン単独およびインスリンとの組み合わせでの成長および生産性増強効果を、１ｍＬ当たり０．４×１０５の生存細胞の初期細胞密度でＤＭＥＭ／Ｆ１２中に播種された細胞において検査した。これらの実験では、組換えヒトインスリン（ＩＮ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で使用し、トランスフェリン（ＴＦ）を５．５μｇ／ｍＬの初期濃度で使用し、植物由来組換えヒト血清アルブミンを０．１ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、および１ｇ／Ｌの初期濃度で使用し、亜セレン酸ナトリウムならびにエタノールアミンをそれぞれ６．７μｇ／ｍＬおよび１：５００，０００ｖ／ｖの濃度で使用した。観察された効果を正味の生存細胞濃度（観察ベースの培地）として計算した。予測効果を個々の成分の効果の合計として計算した。
振盪培養を下の表Ｅ１３で説明するように、上に記載される因子の多様な濃度でさらに補充した。栄養補助剤が添加されていない対照培養を基準として使用した。全ての培養条件を二重に実行した。Ｇｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、３日後に生存細胞の濃度を決定した。全ての培養物を、加湿環境下で、３７℃、６％のＣＯ２で成長させ、１分当たり１２０回の速度において２ｃｍの回転軌道で振盪した。
Figure 2012518409
考察：これらの研究では、インスリンおよび植物由来組換えヒト血清アルブミンの添加は、細胞成長への相乗効果を産生しなかった。対照的に、植物由来組換えヒト血清アルブミンおよびトランスフェリンならびにインスリンの添加は、細胞成長への相乗効果を産生した。
実施例１５：セレンの存在下におけるアルブミン、トランスフェリン、およびインスリンの組み合わせの効果の評価
方法：１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で活発に成長するハイブリドーマ細胞を、ＦＢＳを除去するために、ＦＢＳなしで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３回洗浄した。植物由来トランスフェリン（ＴＦ）、植物由来ヒト組換え血清アルブミン（ＨＳＡ）、亜セレン酸ナトリウム、ならびにエタノールアミン単独および組み合わせでの成長および生産性増強効果を、１ｍＬ当たり０．４×１０５の生存細胞で６．７μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウムを含有する基本培地中で検査した。これらの実験では、組換えヒトインスリン（ＩＮ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で使用し、トランスフェリン（ＴＦ）を５．５μｇ／ｍＬの初期濃度で使用し、植物由来組換えヒト血清アルブミンを１００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの初期濃度で使用し、エタノールアミンを１：５００，０００ｖ／ｖの濃度で使用した。観察された効果を正味の生存細胞濃度（観察ベースの培地）として計算した。予測効果を個々の成分の効果の合計として計算した。
振盪培養を下の表Ｅ１４で説明するように、上に記載される因子の多様な濃度でさらに補充した。栄養補助剤が添加されていない対照培養を基準として使用した。全ての培養条件を二重に実行した。Ｇｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、３日後に生存細胞の濃度を決定した。全ての培養物を、加湿環境下で、３７℃、６％のＣＯ２で成長させた。
Figure 2012518409
考察：この場合もやはり、先の実験に示されるように、植物由来組換えヒト血清アルブミンおよびインスリンの組み合わせは、これらの２つの成分をともに細胞培養培地に添加した時に、細胞成長の相乗的刺激を産生しなかった。比較して、試験した濃度範囲全体にわたって、植物由来組換えヒト血清アルブミンおよびトランスフェリンの混合物の間で相乗作用が観察された。インスリンの存在下で、植物由来組換えヒト血清アルブミンおよびトランスフェリンの相乗作用も観察された。
実施例１６：エタノールアミンの存在下におけるアルブミンおよびトランスフェリンの組み合わせの効果の評価
方法：１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で活発に成長するハイブリドーマ細胞を、ＦＢＳを除去するために、ＦＢＳなしで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３回洗浄した。植物由来トランスフェリン（ＴＦ）、植物由来ヒト組換え血清アルブミン（ＨＳＡ）、亜セレン酸ナトリウム、ならびにエタノールアミン単独および組み合わせでの成長および生産性増強効果を、１ｍＬ当たり０．４×１０５の生存細胞で１：５００，０００のエタノールアミンｖ／ｖを含有する基本培地中で検査した。これらの実験では、組換えヒトインスリン（ＩＮ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を１０μｇ／ｍＬの濃度で使用し、トランスフェリン（ＴＦ）を５．５μｇ／ｍＬの初期濃度で使用し、植物由来組換えヒト血清アルブミンを１００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、および１０００μｇ／ｍＬの初期濃度で使用し、亜セレン酸ナトリウムを６．７μｇ／ｍＬの濃度で使用した。観察された効果を正味の生存細胞濃度（観察ベースの培地）として計算した。予測効果を個々の成分の効果の合計として計算した。
振盪培養を下の表Ｅ１５で説明するように、上に記載される因子の多様な濃度でさらに補充した。 栄養補助剤が添加されていない対照培養を基準として使用した。 全ての培養条件を二重に実行した。 Ｇｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、３日後に生存細胞の濃度を決定した。 全ての培養物を、加湿環境下で、３７℃、６％のＣＯ２で成長させた。
Figure 2012518409
考察：この場合もやはり、先の実験に示されるように、植物由来組換えヒト血清アルブミンおよびインスリンの組み合わせは、これらの２つの成分をともに細胞培養培地に添加した時に、細胞成長の相乗的刺激を産生しなかった。比較して、試験した濃度範囲全体にわたって、植物由来組換えヒト血清アルブミンおよびトランスフェリンの混合物の間で相乗作用が観察された。これらの条件下で、インスリンの存在下において、植物由来組換えヒト血清アルブミンおよびトランスフェリンの相乗作用も観察された。
驚いたことに、インスリン、トランスフェリン、および植物由来組換えヒト血清アルブミンの組み合わせは、１０％の血清と比較して、優れた細胞成長を産生し、タンパク質のこれらの組み合わせの優れた特性を証明した。
実施例１７：イネ組換えで産生されるアルブミンおよび血漿由来アルブミンの比較
イネ由来組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の効果と血漿由来血清アルブミン（ｐＨ ＳＡ）の効果を直接比較するために、細胞成長を刺激するそれらの能力のためにイネ由来組換えトランスフェリンと混合した時に、両方の試料を２つの比率で直接比較した。
方法：ハイブリドーマ細胞を１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。対数期成長における細胞を採取し、ＦＢＳを除去するためにＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３回洗浄し、１）ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地、２）ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋セレン酸ナトリウム基本培地、または３）１ｍＬ当たり０．７５×１０５の生存細胞におけるＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地のいずれかに播種した。各基本培地を、組換えトランスフェリン（ＴＦ）、イネ由来組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）、血漿由来ヒト血清アルブミン（ｐＨ ＳＡ）、またはトランスフェリンとアルブミンのいずれかの形態との両方の組み合わせのいずれかでさらに補充した。３７℃、５％のＣＯ２でのインキュベーションの３日後、製造業者によって指示されるように、生存細胞の濃度をＧｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数器で決定した。観察された効果を正味の生存細胞濃度（観察ベースの培地）として計算した。予測効果は、個々の成分の効果の合計として計算した。効果係数は、予期した効果で割った観察された効果として計算した。１の効果係数は、予期した効果（添加物）を示す。１を超える効果係数は、相加効果より大きい、または相乗効果を示す。
これらの実験では、トランスフェリン（ＴＦ）を１および３ｍｇ／Ｌの初期濃度で使用し、アルブミンを５ｇ／Ｌの濃度で使用し、亜セレン酸ナトリウムを６．７μｇ／Ｌの濃度で使用し、エタノールアミンを１：５００，０００ｖ／ｖで使用した。
Figure 2012518409
Figure 2012518409
考察：表Ｅ１４は、イネ由来組換えヒト血清アルブミンとのＴＦの組み合わせが、予測された効果よりもはるかに大きい値の観察された効果を産生したことを確認する、３つの独立した実験の結果を示す。比較して、血漿由来ＨＡＳおよびトランスフェリンの組み合わせは、予期した効果に類似するか、もしくはそれ未満の値を産出した。したがって、トランスフェリンおよびラクトフェリンの活性を相乗的に高めるアルブミンの能力は、アルブミン自体の本来の特徴というよりはむしろ、アルブミンの供給源に依存していると思われる。具体的には、本実験は、トランスフェリンおよびラクトフェリン等のトランスフェリン関連タンパク質とのヒト血清アルブミンの相乗的特性が、イネ由来組換えヒト血清アルブミンの予想外の驚くべき特性であることを確証する。有意に、トランスフェリンおよび植物由来組換えアルブミンの組み合わせは、血漿由来アルブミンが、５ｇ／Ｌにおいて単独で、同一の濃度のイネ由来ヒト血清アルブミンのよりも効果的であったにもかかわらず、血漿由来アルブミンおよびトランスフェリンの組み合わせよりも、刺激細胞成長に効果的であった。
実施例１８：血漿由来トランスフェリンまたは組換えトランスフェリンのいずれかとの組み合わせで細胞成長を刺激するイネ由来組換えアルブミンの能力の評価
イネ由来組換えヒトトランスフェリン（ｒＴＦ）の効果と血漿由来トランスフェリン（ｐＴＦ）の効果を直接比較するために、細胞成長を刺激するそれらの能力のためにイネ由来組換えヒト血清アルブミンと混合した時に、両方の試料を２つの比率で直接比較した。
方法：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋から成る基本培地（ＢＭ）を０．００６７ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、１：５００，０００ｖ／ｖのエタノールアミンで構成した。基本培地は、血漿ＨＳＡ（ｐＨ ＳＡ、細胞培養グレードＳｅｒａｃａｒｅ）またはイネ由来組換えＨＳＡ（ｒＨＳＡ）のいずれかとの組み合わせで、５．５ｍｇ／Ｌの濃度でヒト血漿トランスフェリンｐＴＦを含んだ。対数期成長におけるハイブリドーマ細胞を採取し、ＦＢＳを除去するためにＤＭＥＭ／Ｆ１２中で３回洗浄し、１ｍＬ当たり０．８０×１０５の生存細胞に播種し、３７℃、６％のＣＯ２でインキュベートした。生存細胞の濃度を、製造業者によって指示されるとおり、Ｇｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数きで毎日決定した。細胞によって産生され、培地中に分泌される抗体の濃度を、定量ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で６日目に決定した。エラーバーは、標準偏差を示す。ｐＴＦおよびｒＨＳＡの組み合わせを有する抗体の産生は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ならびに１０％のＦＢＳの産生に類似した。
考察：図１３は、イネ由来組換えヒト血清アルブミンが、細胞の成長および生産性を著しく高めるように、血漿由来トランスフェリンと相乗的に作用することができたことを示す。比較して、血漿由来血清アルブミンは、類似した刺激効果を発揮できなかった。具体的には、本実験は、イネ由来ヒト血清アルブミンの相乗的特性が、同様に、血漿由来または組換え体のいずれかであったトランスフェリン関連タンパク質を伴って効果的であることを確証する。
実施例１９：インスリン関連成長因子−１との組み合わせで細胞成長を刺激するイネ由来組換えアルブミンの能力の評価
植物由来ヒト血清アルブミン（Ｃｅｌｌａｓｔｉｍ）の独特な性状が、成長因子ＩＧＦ−１等の他の細胞培養成分の活性を促進しながら成長にプラスの影響を与え得るかを調査するために、さらなる実験を実行してこの可能性を評価した。
方法：ＣＨＯ Ｋ１系列のＤＰ１２クローン１９３４（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１２４４５）を、先に説明したように、０．５％のＦＢＳ、１μＭのメトトレキサート、５０μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補充したＳＡＦＣ３２５ＰＦ無タンパク質ＣＨＯ培地中に維持した。植物由来組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）（実施例３および５）ならびに組換えインスリン関連成長因子１（ＩＧＦ１）（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）の成長および生産性増強効果を、単独または組み合わせで検査した。細胞を２００ｎＭのメトトレキサート、５０μｇ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシンを含有する３２５ＰＦ ＣＨＯ培地中で２回洗浄し、同一の培地中で、１ｍＬ当たり１．５×１０５の細胞で４ｍＬの振盪バッチ培養物に播種した。４ｍＬの振盪培養物を、ｒＨＳＡもしくはＩＧＦ−１または２つの添加物の多様な混合物の多様な濃度でさらに補充した。ｒＨＳＡまたはＩＧＦ−１が添加されていない対照培養を基準として使用した。全ての培養条件を二重に実行した。Ｇｕａｖａ ＰＣＡ細胞計数器（Ｇｕａｖａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を介して、１４日間のバッチ期間、生存細胞の濃度を毎日決定した。培養の６日後に、対数期成長を細胞の相対的増殖によって判断した。全ての培養物を、加湿環境下で、３７℃、６％のＣＯ２で成長させた。表Ｅ１７は、実験の結果を示す。ここで、観察された効果を正味の生存細胞濃度（観察ベースの培地）として計算し、予測効果を個々の成分の効果の合計として計算した。
Figure 2012518409
結果および考察：表Ｅ１７は、イネ由来組換えヒト血清アルブミンが、細胞の成長および生産性を著しく高めるように、組換えＩＧＦ−１と相乗的に作用することができたことを示す。比較して、組換えアルブミンは、インスリンと相乗的に作用することができず（表Ｅ１５）、相乗作用は、全ての細胞培養成分における一般的効果ではないことを示唆した。具体的には、本実験は、イネ由来ヒト血清アルブミンの相乗的特性が、同様に、ＩＧＦ−１を伴って効果的であることを確証する。
言うまでもなく、上の説明は、例としてのみ提供され、本発明の範囲内で詳細の修正を行うことができることが理解される。
本発明は、本開示の利益を有する関連技術分野の通常の技術者が想定するように、形態および機能に相当な修正、改変、および均等物が可能である。
本発明を、現在好ましい実施形態であると見なされるものに関して説明したが、本発明がそのように限定されることはない。逆に、本発明は、上に提供された詳細な説明の精神および範囲内に含まれる多様な修正および同等の処理を包含することを意図する。

Claims (32)

  1. 培養中の細胞の細胞成長を高めるための方法であって、前記細胞培養培地への栄養補助剤の添加を含み、前記栄養補助剤は、組換えアルブミンとトランスフェリン関連タンパク質との混合物を含み、前記組換えアルブミンは、
    ｉ） 植物中で産生され、
    ｉｉ） アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、かつ
    ｉｉｉ） 約２％未満の凝集アルブミンを有し、前記栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５の前記トランスフェリン関連タンパク質と前記組換えアルブミンとの比率（重量／重量）から成る、方法。
  2. 無血清培地に適応した細胞の生産性を高めるための方法であって、前記無血清培地への栄養補助剤の添加を含み、前記栄養補助剤は、組換えアルブミンとトランスフェリン関連タンパク質との混合物を含み、前記組換えアルブミンは、
    ｉ） 植物中で産生され、
    ｉｉ） アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、かつ
    ｉｉｉ） 約２％未満の凝集アルブミンを有し、前記栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５の前記トランスフェリン関連タンパク質対前記組換えアルブミンの比率（重量／重量）から成る、方法。
  3. 培養中の細胞から産生される組換え産物の収率を改善するための方法であって、前記培養への栄養補助剤の添加を含み、前記栄養補助剤は、組換えアルブミンとトランスフェリン関連タンパク質との混合物を含み、
    前記組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、かつｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、
    前記栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５の
    前記トランスフェリン関連タンパク質と前記組換えアルブミンとの比率（重量／重量）から成る、方法。
  4. バイオリアクター内で培養中の細胞の生存率を改善するための方法であって、前記バイオリアクター内での前記培養への栄養補助剤の添加を含み、前記栄養補助剤は、
    組換えアルブミンとトランスフェリン関連タンパク質との混合物を含み、
    前記組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、かつｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、
    前記栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５の
    前記トランスフェリン関連タンパク質と前記組換えアルブミンとの比率（重量／重量）から成る、方法。
  5. 無血清培地中で成長する細胞の生存率を改善するための方法であって、前記無血清培地への栄養補助剤の添加を含み、前記栄養補助剤は、
    組換えアルブミンとトランスフェリン関連タンパク質との混合物を含み、
    前記組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素
    を有し、かつｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、
    前記栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５の
    前記トランスフェリン関連タンパク質と前記組換えアルブミンとの比率（重量／重量）から成り、
    前記栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５の前記トランスフェリン関連タンパク質と前記組換えアルブミンとの比率（重量／重量）から成る、方法。
  6. 前記培養中の細胞の生存率が増加する、請求項２または３に記載の方法。
  7. 前記栄養補助剤は、インスリンをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  8. 前記栄養補助剤は、セレンおよびエタノールアミンをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  9. 前記細胞は、組織培養細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  10. 前記細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  11. 前記細胞は、ハイブリドーマ細胞である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  12. 前記タンパク質は、抗体である、請求項３に記載の方法。
  13. 前記組換えアルブミンは、少なくとも約０．０１重量／重量％の熱ショックタンパク質を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  14. 前記熱ショックタンパク質は、イネ熱ショックタンパク質である、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記熱ショックタンパク質は、イネＨＳＰ７０遺伝子と、イネ胚乳内腔結合タンパク質とから成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記熱ショックタンパク質は、イネ（ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜）と、ＥＥＣ６９０７３／ＯｓＩ＿３７９３８と、ＡＡＢ６３４６９とから成る群から選択される、請求項１３に記載の方法。
  17. 前記トランスフェリン関連タンパク質は、ラクトフェリンである、請求項１３に記載の方法。
  18. 前記トランスフェリン関連タンパク質は、トランスフェリンである、請求項１３に記載の方法。
  19. 前記トランスフェリンと前記組換えアルブミンとの前記比率は、約１対５０〜約１対５０００である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記ラクトフェリンは、組換えラクトフェリンである、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記ラクトフェリンと前記組換えアルブミンとの前記比率は、約１対３〜約１対０．３３である、請求項２０に記載の方法。
  22. 細胞生存率における前記改善は、同一の培養条件下で測定される時に、単独で添加された場合の前記組換えアルブミンおよび前記トランスフェリン関連タンパク質の合算効果と比較して、３０％より大きい、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
  23. 組換えアルブミンとトランスフェリン関連タンパク質との混合物を含む栄養補助剤であって、前記組換えアルブミンは、ｉ）植物中で産生され、ｉｉ）アルブミン１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満の内毒素を有し、かつｉｉｉ）約２％未満の凝集アルブミンを有し、前記栄養補助剤は、約１対５，０００〜約１対０．５の前記トランスフェリン関連タンパク質と前記組換えアルブミンとの比率（重量／重量）から成る、栄養補助剤。
  24. 前記組換えアルブミンは、少なくとも約０．０１重量／重量％の熱ショックタンパク質を含む、請求項２３に記載の栄養補助剤。
  25. 前記熱ショックタンパク質は、イネ熱ショックタンパク質である、請求項２４に記載の栄養補助剤。
  26. 前記熱ショックタンパク質は、イネＨＳＰ７０遺伝子と、イネ胚乳内腔結合タンパク質とから成る群から選択される、請求項２４に記載の栄養補助剤。
  27. 前記熱ショックタンパク質は、イネ（ｇｂ｜ＡＣＪ５４８９０．１｜）と、ＥＥＣ６９０７３／ＯｓＩ＿３７９３８と、ＡＡＢ６３４６９とから成る群から選択される、請求項２４に記載の栄養補助剤。
  28. 前記栄養補助剤は、少なくとも約０．０４重量／重量％のＨＳＰ７０を含む、請求項２４に記載の栄養補助剤。
  29. 前記トランスフェリン関連タンパク質は、ラクトフェリンである、請求項２４に記載の栄養補助剤。
  30. 前記トランスフェリン関連タンパク質は、トランスフェリンである、請求項２４に記載の栄養補助剤。
  31. 前記トランスフェリンと前記組換えアルブミンとの前記比率は、約１対５０〜約１対５０００である、請求項３０に記載の栄養補助剤。
  32. 前記ラクトフェリンと前記組換えアルブミンとの前記比率は、約１対３〜約１対０．３３である、請求項３１に記載の栄養補助剤。
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