JP2001299334A - 細胞培養液、細胞培養方法及びバイオアッセイ方法 - Google Patents
細胞培養液、細胞培養方法及びバイオアッセイ方法Info
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- JP2001299334A JP2001299334A JP2000118958A JP2000118958A JP2001299334A JP 2001299334 A JP2001299334 A JP 2001299334A JP 2000118958 A JP2000118958 A JP 2000118958A JP 2000118958 A JP2000118958 A JP 2000118958A JP 2001299334 A JP2001299334 A JP 2001299334A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 神経細胞を安定に培養するための培養液及び
その培養方法を提供する。 【解決手段】 ＤＭＥＭとＦ−１２培養液をベースと
し、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ア
ルブミン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラー
ゼ、グルタミン酸、システインを配合した神経細胞用培
養液。
その培養方法を提供する。 【解決手段】 ＤＭＥＭとＦ−１２培養液をベースと
し、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ア
ルブミン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラー
ゼ、グルタミン酸、システインを配合した神経細胞用培
養液。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は神経細胞の培養に関
わる技術であり、さらに詳しくは、その培養液、培養方
法であり、これを用いた生物試験法は、神経科学、神経
生物学、神経化学等の細胞レベルの研究に、またはその
応用である医薬品の開発等に関連するものである。
わる技術であり、さらに詳しくは、その培養液、培養方
法であり、これを用いた生物試験法は、神経科学、神経
生物学、神経化学等の細胞レベルの研究に、またはその
応用である医薬品の開発等に関連するものである。
【０００２】
【従来の技術】神経細胞の培養は、アルツハイマー病な
どの脳神経性疾患の治療薬の開発等に限らず、神経細胞
の働きを研究する上で、欠くことのできない技術となっ
ている。神経細胞の初代培養は、株化した細胞を用いる
場合に比べ、安定した培養が難しい等の問題がある。こ
の点を改良し安定な薬理試験にも耐え得るような培養系
を作り出すべく、種々の試みがなされてきた。現在普通
に用いられる培養液としてはＭＥＭ、ダルベッコ改変Ｍ
ＥＭ培養液（ＤＭＥＭ）ハムのＦ−１２培養液（Ｆ−１
２）等がある。培養液に加える栄養成分から成る添加物
として、BottensteinらのN2添加物、［Proceeding of N
ational Academy of Science,U.S.A.76:514(1979)］ や
BrewerらのB27添加物［Brain Research 65:494(1989)
他］がある。これらは、インシュリン、トランスフェリ
ンなどの栄養因子やビタミン類を配合したものである。
またグリア細胞の培養上清を含有する神経細胞用培養液
（特開平9-289891号公報、特開平9-322765号公報）も報
告されている。これらは全て、種々の成分を配合し、神
経細胞の安定した培養を目指したものである。
どの脳神経性疾患の治療薬の開発等に限らず、神経細胞
の働きを研究する上で、欠くことのできない技術となっ
ている。神経細胞の初代培養は、株化した細胞を用いる
場合に比べ、安定した培養が難しい等の問題がある。こ
の点を改良し安定な薬理試験にも耐え得るような培養系
を作り出すべく、種々の試みがなされてきた。現在普通
に用いられる培養液としてはＭＥＭ、ダルベッコ改変Ｍ
ＥＭ培養液（ＤＭＥＭ）ハムのＦ−１２培養液（Ｆ−１
２）等がある。培養液に加える栄養成分から成る添加物
として、BottensteinらのN2添加物、［Proceeding of N
ational Academy of Science,U.S.A.76:514(1979)］ や
BrewerらのB27添加物［Brain Research 65:494(1989)
他］がある。これらは、インシュリン、トランスフェリ
ンなどの栄養因子やビタミン類を配合したものである。
またグリア細胞の培養上清を含有する神経細胞用培養液
（特開平9-289891号公報、特開平9-322765号公報）も報
告されている。これらは全て、種々の成分を配合し、神
経細胞の安定した培養を目指したものである。
【０００３】この方向とは逆に、神経細胞に与える種々
の因子や化学物質が与える影響や効果を調べる目的では
培養液中に配合される成分は可能な限り少ない方が良
く、披検物質の影響がマスクされるようでは都合が悪い
場合もある。このような観点から、成分を規定した培養
液としては、ＭＥＭ培養液やＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液
にＮ２添加物を加えたものが最少の栄養成分添加培養液
として、よく用いられてきた。しかし、培養安定性が低
すぎる点が問題となり、これを避ける目的で、血清添加
培養液をまず使用し、次に血清を抜いた培養液に変える
方法が取られている。これに代わることのできる、少な
い成分からなり、安定した培養が可能な培養液で満足で
きるものは存在しなかった。
の因子や化学物質が与える影響や効果を調べる目的では
培養液中に配合される成分は可能な限り少ない方が良
く、披検物質の影響がマスクされるようでは都合が悪い
場合もある。このような観点から、成分を規定した培養
液としては、ＭＥＭ培養液やＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液
にＮ２添加物を加えたものが最少の栄養成分添加培養液
として、よく用いられてきた。しかし、培養安定性が低
すぎる点が問題となり、これを避ける目的で、血清添加
培養液をまず使用し、次に血清を抜いた培養液に変える
方法が取られている。これに代わることのできる、少な
い成分からなり、安定した培養が可能な培養液で満足で
きるものは存在しなかった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、これらの
問題点を比較検討し、栄養成分の絞り込みや、アミノ酸
の必要度を検討し安定な培養系を構成できる処方として
の本発明に至ったもので、以下に示す培養液処方と培養
方法等を提供することを目的とする。
問題点を比較検討し、栄養成分の絞り込みや、アミノ酸
の必要度を検討し安定な培養系を構成できる処方として
の本発明に至ったもので、以下に示す培養液処方と培養
方法等を提供することを目的とする。
【０００５】
【問題を解決するための手段】即ち本発明の第一の発明
は、（１）インシュリン、トランスフェリン、亜セレン
酸、アルブミン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタ
ラーゼ、0.005〜0.05mMのグルタミン酸、及び0.02〜2mM
のシステインを少なくとも含むことを特徴とする細胞細
胞培養液であり、第２の発明は、第一の発明の培養液を
用いる細胞の培養方法であり、さらに第３の発明は、第
２の発明の細胞培養方法を用いるバイオアッセイ方法で
ある。
は、（１）インシュリン、トランスフェリン、亜セレン
酸、アルブミン、スーパーオキシドジスムターゼ、カタ
ラーゼ、0.005〜0.05mMのグルタミン酸、及び0.02〜2mM
のシステインを少なくとも含むことを特徴とする細胞細
胞培養液であり、第２の発明は、第一の発明の培養液を
用いる細胞の培養方法であり、さらに第３の発明は、第
２の発明の細胞培養方法を用いるバイオアッセイ方法で
ある。
【０００６】
【発明の実施形態】培養液は通常の方法で調製が可能で
ある。例えば予め調製した培養液に、以下の成分を添加
調製する方法などがある。培養液に含有される各成分の
好ましい濃度は、インシュリン1〜100μg／mL、トラン
スフェリン1〜100μg／mL、亜セレン酸1〜100ng／mL、
アルブミン0.5〜2.5mg／mL、スーパーオキシドジスムタ
ーゼ1〜100μg／mL、カタラーゼ1〜100μg／mL、グルタ
ミン酸0.005〜0.05mM、システインまたはその誘導体0.0
2〜2mMである。また、アスパラギン酸もグルタミン酸と
同様に過剰興奮性毒性を示す場合があり、グルタミン酸
と同様の濃度が好ましい。
ある。例えば予め調製した培養液に、以下の成分を添加
調製する方法などがある。培養液に含有される各成分の
好ましい濃度は、インシュリン1〜100μg／mL、トラン
スフェリン1〜100μg／mL、亜セレン酸1〜100ng／mL、
アルブミン0.5〜2.5mg／mL、スーパーオキシドジスムタ
ーゼ1〜100μg／mL、カタラーゼ1〜100μg／mL、グルタ
ミン酸0.005〜0.05mM、システインまたはその誘導体0.0
2〜2mMである。また、アスパラギン酸もグルタミン酸と
同様に過剰興奮性毒性を示す場合があり、グルタミン酸
と同様の濃度が好ましい。
【０００７】また、高い濃度のシステインは神経細胞に
対して毒性を示すことが報告されている［Science 4:24
8(1990)、Brain Research 24:705(1995)］が、本発明の
濃度処方では神経細胞の培養に好適な効果を示す。Neur
oscience Letter 259:79(1999)では、細胞内グルタチオ
ンを増加させる効果は示されているものの、生存維持に
対する効果は5%程しかないことが報告されている。しか
し、本発明の処方では、後述するように生存維持効果が
大きく認められるものである。
対して毒性を示すことが報告されている［Science 4:24
8(1990)、Brain Research 24:705(1995)］が、本発明の
濃度処方では神経細胞の培養に好適な効果を示す。Neur
oscience Letter 259:79(1999)では、細胞内グルタチオ
ンを増加させる効果は示されているものの、生存維持に
対する効果は5%程しかないことが報告されている。しか
し、本発明の処方では、後述するように生存維持効果が
大きく認められるものである。
【０００８】培養液には、さらにα−トコフェロール
や、酢酸トコフェロールなどの誘導体を配合することが
安定培養には好ましい。抗酸化作用のあるグルタチオン
やＮ−アセチルシステインなどの配合も効果を示すこと
が報告されている［The Jourmel of Neuroscience 15:2
857(1995)、The Journal of Biological Chemistry 45:2
6827(1995)、Journal of Neuropharmacology 35:571(199
6)］。
や、酢酸トコフェロールなどの誘導体を配合することが
安定培養には好ましい。抗酸化作用のあるグルタチオン
やＮ−アセチルシステインなどの配合も効果を示すこと
が報告されている［The Jourmel of Neuroscience 15:2
857(1995)、The Journal of Biological Chemistry 45:2
6827(1995)、Journal of Neuropharmacology 35:571(199
6)］。
【０００９】基本となる培養液は、ＤＭＥＭとＦ−１２
培養液が適しており、その配合比は１対１から20対１の
範囲が好ましい。より限定した配合となるＭＥＭなども
用いることが可能であるし、同様類似の配合処方の培養
液も使用可能である。
培養液が適しており、その配合比は１対１から20対１の
範囲が好ましい。より限定した配合となるＭＥＭなども
用いることが可能であるし、同様類似の配合処方の培養
液も使用可能である。
【００１０】これらの培養液を用いた神経細胞の培養系
は、種々の神経栄養作用、神経保護作用、神経毒性作用
などの薬剤の研究に好適な試験系となる。例えば、ＢＤ
ＮＦ（脳由来神経栄養因子）などの神経保護作用のある
薬剤や、カイニン酸などの神経毒性を示す薬剤などの、
試験評価系に使用することができる。
は、種々の神経栄養作用、神経保護作用、神経毒性作用
などの薬剤の研究に好適な試験系となる。例えば、ＢＤ
ＮＦ（脳由来神経栄養因子）などの神経保護作用のある
薬剤や、カイニン酸などの神経毒性を示す薬剤などの、
試験評価系に使用することができる。
【００１１】培養する神経細胞は通常の方法で調製すれ
ばよく、特に限定されるものではない。一般的に胎児の
神経細胞の方が生後の細胞よりも好適である。培養方法
の種類としては、分散培養、器官培養、再凝集培養など
いずれでも可能で、特に限定されるものではない。
ばよく、特に限定されるものではない。一般的に胎児の
神経細胞の方が生後の細胞よりも好適である。培養方法
の種類としては、分散培養、器官培養、再凝集培養など
いずれでも可能で、特に限定されるものではない。
【００１２】
【実施例】以下、本発明を実施例にもとづき説明する。 （実施例１）ＤＭＥＭ、Ｆ−１２液（ＳＩＧＭＡ社製）
を10：1の比率とした培養液を調製。インシュリンを5μ
g/mL、トランスフェリンを5μg/mL、亜セレン酸を5ng/m
L（以上ＢＤ社製）、アルブミンを2.5mg/mL、システイ
ンを0.5mM、グルタミン酸を0.01mM、α−トコフェロー
ル酢酸エステルを5μg/mL、スーパーオキシドジスムタ
ーゼを１μg/mL（7.5U/mL）、カタラーゼを1μg/mL（以
上ＳＩＧＭＡ社製）に添加調製した。
を10：1の比率とした培養液を調製。インシュリンを5μ
g/mL、トランスフェリンを5μg/mL、亜セレン酸を5ng/m
L（以上ＢＤ社製）、アルブミンを2.5mg/mL、システイ
ンを0.5mM、グルタミン酸を0.01mM、α−トコフェロー
ル酢酸エステルを5μg/mL、スーパーオキシドジスムタ
ーゼを１μg/mL（7.5U/mL）、カタラーゼを1μg/mL（以
上ＳＩＧＭＡ社製）に添加調製した。
【００１３】（比較例１、２）比較例１として、基本と
なる培養液をＤＭＥＭとし、インシュリンを5μg/mL、
トランスフェリンを5μg/mL、亜セレン酸を5ng/mL（以
上ＢＤ社製）、アルブミンを2.5mg/mL、システインを0m
M、グルタミン酸を0mM、α−トコフェロール酢酸エステ
ルを5μg/mL、スーパーオキシドジスムターゼを１μg/m
L（7.5U/mL）、カタラーゼを1μg/mL（以上ＳＩＧＭＡ
社製）の培養液を調製した。比較例２として、ＤＭＥ
Ｍ、Ｆ−１２液を10：1の比率とした培養液を調製。イ
ンシュリンを5μg/mL、トランスフェリンを5μg/mL、亜
セレン酸を5ng/mL（以上ＢＤ社製）、アルブミンを2.5m
g/mL、システインを2.5mM、グルタミン酸を0.01mM、α
−トコフェロール酢酸エステルを5μg/mL、スーパーオ
キシドジスムターゼを１μg/mL（7.5U/mL）、カタラー
ゼを1μg/mL（以上ＳＩＧＭＡ社製）に添加調製した。
なる培養液をＤＭＥＭとし、インシュリンを5μg/mL、
トランスフェリンを5μg/mL、亜セレン酸を5ng/mL（以
上ＢＤ社製）、アルブミンを2.5mg/mL、システインを0m
M、グルタミン酸を0mM、α−トコフェロール酢酸エステ
ルを5μg/mL、スーパーオキシドジスムターゼを１μg/m
L（7.5U/mL）、カタラーゼを1μg/mL（以上ＳＩＧＭＡ
社製）の培養液を調製した。比較例２として、ＤＭＥ
Ｍ、Ｆ−１２液を10：1の比率とした培養液を調製。イ
ンシュリンを5μg/mL、トランスフェリンを5μg/mL、亜
セレン酸を5ng/mL（以上ＢＤ社製）、アルブミンを2.5m
g/mL、システインを2.5mM、グルタミン酸を0.01mM、α
−トコフェロール酢酸エステルを5μg/mL、スーパーオ
キシドジスムターゼを１μg/mL（7.5U/mL）、カタラー
ゼを1μg/mL（以上ＳＩＧＭＡ社製）に添加調製した。
【００１４】（実施例、比較例の培養試験）神経細胞は
wistar系ラットの胎児（胎生17日）の大脳を神経細胞分
散液（住友ベークライト社製）により、その規定された
方法で分散調製した。2.5×105cells／ｍＬに調製した
細胞液をポリ−L―リジン（ＳＩＧＭＡ社製）をコート
した48ウェルプレートに200μL/ウェル加え、炭酸ガス
インキュベーター中で5日間培養した。顕微鏡下培養形
態を観察したところ、実施例１の培養液では良好な神経
突起の伸長が認められた。比較例１、比較例２の培養液
では実施例の培養液に比し突起の伸長等が劣っていた。
次にハンクス液で２回洗浄後、ＤＭＥＭ液にインシュリ
ンを5μg／mL、トランスフェリンを5μg／mL、亜セレン
酸を5ng／mL、ＭＴＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を0.15mM加え
た培養液に交換し２時間培養した。培養液を捨てＤＭＳ
Ｏを200μL/ウェル加え生成した色素を溶解、96ウェル
プレート（住友ベークライト製）に150μL／ウェル量移
し替えた。マルチプレート用分光光度計を用い、測定波
長550nmで吸光度を測定した。結果は図１に示すとお
り、実施例の培養液を用いた場合、数値が高く生存細胞
数が多い。
wistar系ラットの胎児（胎生17日）の大脳を神経細胞分
散液（住友ベークライト社製）により、その規定された
方法で分散調製した。2.5×105cells／ｍＬに調製した
細胞液をポリ−L―リジン（ＳＩＧＭＡ社製）をコート
した48ウェルプレートに200μL/ウェル加え、炭酸ガス
インキュベーター中で5日間培養した。顕微鏡下培養形
態を観察したところ、実施例１の培養液では良好な神経
突起の伸長が認められた。比較例１、比較例２の培養液
では実施例の培養液に比し突起の伸長等が劣っていた。
次にハンクス液で２回洗浄後、ＤＭＥＭ液にインシュリ
ンを5μg／mL、トランスフェリンを5μg／mL、亜セレン
酸を5ng／mL、ＭＴＴ（ＳＩＧＭＡ社製）を0.15mM加え
た培養液に交換し２時間培養した。培養液を捨てＤＭＳ
Ｏを200μL/ウェル加え生成した色素を溶解、96ウェル
プレート（住友ベークライト製）に150μL／ウェル量移
し替えた。マルチプレート用分光光度計を用い、測定波
長550nmで吸光度を測定した。結果は図１に示すとお
り、実施例の培養液を用いた場合、数値が高く生存細胞
数が多い。
【００１５】
【図１】
【００１６】
【発明の効果】本発明を用いることにより、安定な神経
細胞培養系を得ることができ、細胞に与える薬剤の響評
価、各種因子の検討、細胞間相互作用の検討などが効果的
に行える。
細胞培養系を得ることができ、細胞に与える薬剤の響評
価、各種因子の検討、細胞間相互作用の検討などが効果的
に行える。
Claims (5)
- 【請求項１】 インシュリン、トランスフェリン、亜セ
レン酸、アルブミン、スーパーオキシドジスムターゼ、
カタラーゼ、0.005〜0.05mMのグルタミン酸、及び0.02
〜2mMのシステインを少なくとも含むことを特徴とする
細胞培養液 - 【請求項２】 α−トコフェロールまたはその誘導体を
含む請求項１記載の細胞培養液。 - 【請求項３】 ダルベッコ改変ＭＥＭ培養液とハムのＦ
−１２培養液の比率が１対１から20対１である請求項１
又は２記載の細胞培養液。 - 【請求項４】 請求項１〜３記載のいずれかの培養液を
用いることを特徴とする細胞培養方法。 - 【請求項５】 請求項４記載の細胞培養方法を用いるこ
とを特徴とするバイオアッセイ方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000118958A JP2001299334A (ja) | 2000-04-20 | 2000-04-20 | 細胞培養液、細胞培養方法及びバイオアッセイ方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000118958A JP2001299334A (ja) | 2000-04-20 | 2000-04-20 | 細胞培養液、細胞培養方法及びバイオアッセイ方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001299334A true JP2001299334A (ja) | 2001-10-30 |
Family
ID=18630012
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000118958A Pending JP2001299334A (ja) | 2000-04-20 | 2000-04-20 | 細胞培養液、細胞培養方法及びバイオアッセイ方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001299334A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7312025B2 (en) | 2002-07-12 | 2007-12-25 | University Of Washington | Methods and systems for extended in vitro culture of neuronal cells |
| JP2012518409A (ja) * | 2009-02-20 | 2012-08-16 | ベントリア・バイオサイエンス | タンパク質の組み合わせを含有する細胞培養培地 |
-
2000
- 2000-04-20 JP JP2000118958A patent/JP2001299334A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7312025B2 (en) | 2002-07-12 | 2007-12-25 | University Of Washington | Methods and systems for extended in vitro culture of neuronal cells |
| JP2012518409A (ja) * | 2009-02-20 | 2012-08-16 | ベントリア・バイオサイエンス | タンパク質の組み合わせを含有する細胞培養培地 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060616 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061024 |