KR20070091626A

KR20070091626A - Ｒｇｄ-함유 펩티드의 방사성 표지된 접합체 및클릭-화학을 통한 그의 제조 방법

Info

Publication number: KR20070091626A
Application number: KR1020077014048A
Authority: KR
Inventors: 에릭 아르스타드; 마티아스 에버하르트 글레이저
Original assignee: 해머스미쓰 이마네트 리미티드
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2007-09-11
Also published as: EP2266629B1; AU2005317903C1; CA2589136A1; CA2817636A1; AU2005317903B8; JP5743372B2; CA2589136C; US8679455B2; WO2006067376A2; US7972588B2; RU2007122804A; AU2005317903B2; CN105012972A; RU2419627C2; BRPI0519317A2; EP2266629A1; KR101314460B1; GB0428012D0; WO2006067376A3; US20090311177A1

Abstract

본 발명은 방사성 진단제 및 방사성 치료제, 예컨대 방사성 핵종으로 표지된 생물학적으로 활성인 벡터에 관한 것이다. 또한, Cu(I) 촉매의 존재하에, 하기 화학식 I의 화합물과 하기 화학식 II의 화합물을 반응시키거나, 하기 화학식 III의 화합물과 하기 화학식 IV의 화합물을 반응시키는 것을 포함하는, 벡터의 표지화 방법에 관한 것이다.

<화학식 I>

<화학식 II>

<화학식 III>

<화학식 IV>

생성된 표지된 접합체는 진단제로서, 예를 들어 방사성 약제로서, 더욱 구체적으로는 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 단광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 또는 방사선요법에서 유용하다.

방사성 표지화 방법, 벡터, 방사성 핵종, 진단제

Description

ＲＧＤ-함유 펩티드의 방사성 표지된 접합체 및 클릭-화학을 통한 그의 제조 방법{Radiolabelled Conjugates Of RGD-Containing Peptides And Methods For Their Preparation Via Click-Chemistry}

본 발명은 방사성 진단제 및 방사성 치료제, 예컨대 방사성 핵종으로 표지된 생물학적 활성 벡터에 관한 것이다. 또한, 펩티드와 같은 벡터를 표지화하는 방법 및 시약에 관한 것이다. 생성된 표지된 접합체는 진단제, 예를 들어 더욱 구체적으로 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 단광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)에서의 또는 방사선요법을 위한 방사성 약제로서 유용하다.

진단 영상화를 위한 방사성 표지된 생활성 펩티드의 적용은 핵 의학에서 중요성이 증대되고 있다. 특이적 세포 유형과 선택적으로 상호작용하는 생물학적 활성 분자는 방사성 활성을 표적 조직에 전달하는데 유용하다. 예를 들어, 방사성 표지된 펩티드는 진단 영상화 및 방사선요법을 위해 방사성 핵종을 종양, 경색 및 감염된 조직에 전달하는데 상당한 효능을 갖는다. 반감기가 대략 110분인 ¹⁸F는 여러 수용체 영상화 연구를 위해 선택되는 양전자-방출 핵종이다. 따라서, ¹⁸F-표지된 생활성 펩티드는 PET에서의 유용성 때문에 광범위한 질병을 정량적으로 검출하 고 특성 분석하는데 상당한 임상적 효능을 갖는다. 다른 유용한 방사성 핵종으로는 ¹¹C, 방사성 요오드, 예컨대 ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²⁴I, ¹³¹I 및 ⁹⁹ ^mTc가 있다.

지금까지, 펩티드 및 생체분자 표지화를 위한 신속하고 일반적으로 적용가능한 방법이 없어서 진단제로서 펩티드 및 생체분자를 사용할 수가 없었다. 예를 들어, 펩티드 및 단백질을 ¹⁸F로 표지화하기 위해 현재 사용하는 대부분의 모든 방법은 불소 표지된 합성 단위체의 활성 에스테르를 사용한다. 펩티드 및 단백질이 활성 에스테르와 반응할 수 있는 여러 개의 관능기를 함유할 수 있기 때문에, 현재 이용되는 이들 방법은 부위-특이적이지 않다. 예를 들어, 3개의 리신 잔기를 함유하는 펩티드는 표지된 합성 단위체에 대해 모두 동일한 활성을 갖는 3개의 아민 관능성을 갖는다. 따라서, 온화한 조건하에서 방사성 핵종, 예를 들어 ¹⁸F와 같은 표지를 특히 펩티드에 신속히 화학 선택적으로 도입하여 높은 방사성 화학 수율 및 순도로 표지된 생성물을 수득할 수 있게 하는 ¹⁸F-표지된 보결 분자단과 같은 표지화제 및 방법이 여전히 요구된다. 또한, 임상적 상태에서 진단제의 제조를 용이하게 하는 자동화 방법이 요구된다

본 발명은 Cu(I) 촉매의 존재하에, 하기 화학식 I의 화합물과 하기 화학식 II의 화합물을 반응시키거나, 하기 화학식 III의 화합물과 하기 화학식 IV의 화합물을 반응시켜서, 각각 하기 화학식 V 또는 VI의 접합체를 수득하는 것을 포함하는, 벡터의 표지화 방법을 제공한다.

상기 식에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각의 링커 기이고, R^*은 방사성 핵종을 포함하는 리포터 잔기이다.

상기 링커 기 L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 임의로 1 내지 30개의 헤 테로원자, 적합하게는 1 내지 10개의 헤테로원자, 예컨대 산소 또는 질소를 포함하는, C₁ _-60 탄화수소기, 적합하게는 C₁ _-30 탄화수소기이다. 적합한 링커 기로는 알킬, 알케닐, 알키닐 쇄, 방향족, 폴리방향족 및 헤테로방향족 고리가 있으며, 이들은 예를 들어 1개 이상의 에테르, 티오에테르, 술폰아미드 또는 아미드 관능기에 의해 임의로 치환될 수 있고, 단량체 및 중합체는 에틸렌글리콜, 아미노산, 또는 탄수화물 서브유닛을 포함한다.

용어 "탄화수소기"는 탄소 및 수소로 이루어진 유기 치환기를 의미하고, 이들 기는 포화, 불포화 또는 방향족 부분을 포함할 수 있다.

링커 기 L1, L2, L3 및 L4는 생성된 화학식 V 또는 VI의 화합물의 양호한 생체내 약물동력학, 예컨대 유리한 배설 특성을 제공하도록 선택될 수 있다. 상이한 지용성 및/또는 전하를 갖는 링커 기의 사용은 펩티드의 생체내 약물동력학을 진단에 적합하도록 상당히 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 화학식 V 또는 VI의 화합물이 신장 배설에 의해 신체로부터 제거되는 것이 바람직한 경우에는 친수성 링커가 사용되고, 간담즙성 배설에 의해 제거되는 것이 바람직한 경우에는 소수성 링커가 사용된다. 폴리에틸렌 글리콜 잔기를 포함하는 링커는 일부 상황에서 바람직한 느린 혈중 제거율을 갖는 것으로 밝혀졌다.

R^*는 방사성 핵종, 예를 들어 양전자-방출 방사성 핵종을 포함하는 리포터 잔기이다. 이에 적합한 양전자-방출 방사성 핵종으로는 ¹¹C, ¹⁸F, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ¹²⁴I, ⁸²Rb, ⁶⁸Ga, ⁶⁴Cu 및 ⁶²Cu가 있고, 이 중 ¹¹C 및 ¹⁸F가 바람직하다. 다른 유용한 방사성 핵종으로는 ¹²³I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ²¹¹At, ⁹⁹ ^mTc 및 ¹¹¹In이 있다. 적합하게는, 금속성 방사성 핵종은 예를 들어 당업자에게 공지된 방법에 따른 직접 도입에 의해 킬레이팅제에 도입된다. 금속성 리포터의 킬레이팅화는 화학식 I 또는 IV의 화합물을 각각 화학식 II 또는 III의 화합물과 반응시키기 전에 수행하여, Cu(I) 촉매의 킬레이팅화를 피하는 것이 바람직하다.

R^*이 이루는 적합한 킬레이팅제로는 하기 화학식 X의 화합물이 있다.

상기 식에서,

각각의 R^1A, R^2A, R^3A 및 R^4A는 독립적으로 R^A 기이고;

각각의 R^A 기는 독립적으로 H, 또는 C₁ _-10 알킬, C₃ _-10 알킬아릴, C₂ _-10 알콕시알킬, C₁ _-10 히드록시알킬, C₁ _-10 알킬아민, C₁ _-10 플루오로알킬, 또는 2개 이상의 R^A 기이고, 그들이 결합한 원자와 함께 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 고리를 형성하거나, 또는

R^*는 하기 화학식 i, ii, iii 또는 iv로 제시된 킬레이팅제를 포함할 수 있다.

킬레이팅제의 바람직하게 예는 하기 화학식 v로 표시된다.

화학식 X의 킬레이팅제를 포함하는 화학식 II 또는 IV의 화합물은 방사성 표지되어, 실온에서 거의 중성 pH의 수성 조건하에 양호한 방사선 화학 순도 (RCP)를 제공할 수 있다.

화학식 I 및 III에서 및 본 발명의 다른 측면에서, 달리 구체적으로 언급하지 않는다면, 표지화에 적합한 벡터는 펩티드이며, 그 예로는 소마토스타틴 유사체, 예컨대 옥트레오티드, 봄베신, 혈관활성 장관 펩티드, 화학주성 펩티드 유사체, α-멜라닌 세포 자극 호르몬, 뉴로텐신, Arg-Gly-Asp 펩티드, 인간 프로-인슐린 연결 펩티드, 인슐린, 엔도텔린, 안지오텐신, 브라디키닌, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 글루타티온, 칼시토닌, 마가이닌 I 및 II, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 가스트린, 콜레시스토키닌, 물질 P, 바소프레신, 포르밀-노르류신-류실-페닐알리닐 -노르류실-티로실-리신, 아넥신 V 유사체, 혈관활성 단백질-1 (VAP-1) 펩티드, 및 카스파제 펩티드 기질이 있다. 표지화에 바람직한 펩티드는 Arg-Gly-Asp 펩티드 및 그의 유사체, 예컨대 WO 01/77415 및 WO 03/006491에 기재된 것, 바람직하게는 하기 단편을 포함하는 펩티드, 더욱 바람직하게는 하기 화학식 A의 펩티드이다.

<단편>

상기 식에서, X⁷은 -NH₂ 또는

이고, 여기서, a는 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1이다.

숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 방법은 또한 다른 생체분자, 예컨대 단백질, 호르몬, 다당류, 올리고뉴클레오티드, 및 항체 단편, 세포, 박테리 아, 바이러스, 뿐만 아니라 소형 약물-유사 분자의 방사성 표지화를 위해 사용되어 다양한 진단제를 제공할 수 있다. 화학식 I 및 III에서 및 본 발명의 다른 측면에서, 달리 구체적으로 언급하지 않는다면, 방사성 표지화에 특히 적합한 벡터는 펩티드, 단백질, 호르몬, 세포, 박테리아, 바이러스, 및 소형 약물-유사 분자이다.

화학식 I의 화합물과 화학식 II의 화합물의 반응, 또는 화학식 III의 화합물과 화학식 IV의 화합물의 반응은 적합한 용매, 예를 들어 아세토니트릴, C₁ _-4 알킬알콜, 디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란 또는 디메틸술폭시드, 또는 이들의 수성 혼합물 중에서, 또는 물 중에서, 5 내지 100℃의 온도, 바람직하게는 실온에서 수행할 수 있다. Cu(I) 촉매는 상기 반응을 진행시키기에 충분한 양으로, 전형적으로 촉매량 또는 과량으로, 예컨대 화학식 I 또는 III의 화합물에 대해 0.02 내지 1.5 몰 당량으로 존재한다.

적합한 Cu(I) 촉매로는 Cu(I) 염, 예컨대 CuI, CuOTf.C₆H₆ 또는 [Cu(NCCH₃)₄][PF₆]이 있지만, 유리하게는 Cu(II) 염, 예컨대 황산구리(II)가 환원제, 예컨대 아스코르브산 또는 그의 염, 예를 들어 아스코르브산나트륨, 히드로퀴논, 퀴논, 금속성 구리, 글루타티온, 시스테인, Fe² ⁺ 또는 Co² ⁺의 존재하에 사용될 수 있다. Cu(I)는 또한 원래 구리 원소 입자의 표면상에 제공되며, 따라서 예를 들어 분말 또는 과립 형태의 구리 원소 또한 촉매로서 사용될 수 있다. 조절된 입도를 갖는 Cu(I) 촉매, 특히 구리 원소의 사용은 놀랍게도 개선된 방사선 화학 수율을 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 측면에서, Cu(I) 촉매, 특히 구리 원소는 0.001 mm 내지 1 mm, 바람직하게는 0.1 mm 내지 0.7 mm, 더욱 바람직하게는 대략 0.4 mm의 입도를 갖는다.

본 발명은 표지 도입을 위한 정확한 부위가 펩티드 또는 벡터 전구체의 합성 동안에 미리 선택되는, 방사성 표지화의 더욱 화학선택적인 접근법을 제공한다. 벡터의 예정된 부위에서 발생하는 라이게이션 반응은 단지 하나의 가능한 생성물을 제공한다. 따라서, 이 방법은 화학선택적이며, 그의 적용은 광범위한 펩티드, 생체분자, 저분자량 약물을 위해 일반적으로 고려된다. 또한, 알킨 및 아지드 관능기 둘 다 대부분의 반응 조건하에서 안정하고, 대부분의 일반적인 펩티드 관능기에 대해 비반응성이어서, 표지화 합성 동안 보호 및 탈보호 단계를 최소화시킨다. 또한, 표지화 반응 동안에 형성된 트리아졸 고리는 가수분해되지 않고, 산화 및 환원에 매우 안정한데, 이는 표지된 벡터가 생체내 안정성이 높다는 것을 의미한다. 트리아졸 고리는 또한 크기 및 극성의 면에서 아미드와 필적가능하여서, 표지된 펩티드 또는 단백질은 그들의 천연 대응체에 대한 양호한 모방체이다.

벡터가 펩티드 또는 단백질인 화학식 I 및 III의 화합물은 펩티드 합성의 표준 방법, 예를 들어, 문헌 [Atherton, E. and Sheppard, R.C.; "Solid Phase Synthesis"; IRL Press: Oxford, 1989]에 기재된 고상 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 화학식 I 또는 III의 화합물에서 알킨 또는 아지드 기의 도입은 펩티드의 N 또는 C-말단 또는 상기 펩티드 서열 내에 함유된 다른 관능기의 반응에 의해 달성될 수 있으며, 이러한 변형은 벡터의 결합 특성에 영향을 미치지 않는다. 알킨 또는 아지드 기는, 바람직하게는 예를 들어 펩티드 아민 관능기와 활성화 산의 반응, 또는 펩티드 산 관능기와 아민 관능기의 대안적인 반응에 의해 형성된 안정한 아미드 결합에 의해 화학식 I 또는 III의 화합물에 도입되고, 펩티드 합성 동안에 또는 이후에 도입된다. 알킨 또는 아지드 기를 세포, 바이러스, 박테리아와 같은 벡터에 도입하는 방법은 예를 들어 문헌 [H.C. Kolb and K.B. Sharpless, Drug Discovery Today, Vol 8 (24), December 2003] 및 그의 참고문헌에서 확인할 수 있다. 화학식 I 또는 III의 화합물에 알킨 또는 아지드 기를 도입하는데 유용한 적합한 중간체는 다음과 같다.

또다른 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 방법에 의해 표지화 벡터, 예컨대 펩티드 및 단백질에 유용한 신규한 보결 분자단을 제공한다. 따라서, 하기 화학식 II 또는 IV의 화합물이 제공된다.

<화학식 II>

<화학식 IV>

상기 식에서, L2 및 L4는 상기 정의된 각각의 링커 기이고, R^*는 상기 정의된 리포터 잔기이다. 본 발명의 이러한 측면의 한 실시양태에서, R^*가 ¹⁸F이어서 보결 분자단은 하기 화학식 IIa 및 IVa를 갖는다.

상기 식에서, L2 및 L4는 상기 정의된 각각의 링커 기이다.

바람직한 화학식 IV의 화합물은 다음과 같다.

또다른 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I 또는 III의 화합물을 제공한다.

<화학식 I>

<화학식 III>

상기 식에서, L1 및 L3은 상기 정의된 각각의 링커 기이고, 벡터는 상기 정의된 바와 같다. 적합하게는, 본 발명의 이러한 측면에서, 벡터는 펩티드 또는 단백질이다. 바람직한 화학식 I 및 III의 화합물은 벡터가 Arg-Gly-Asp 펩티드 또는 그의 유사체, 예컨대 WO 01/77415 및 WO 03/006491에 기재된 것, 바람직하게는 하기 단편을 포함하는 펩티드, 더욱 바람직하게는 하기 화학식 A의 펩티드인 화합물이다.

<단편>

<화학식 A>

상기 식에서, X⁷은 -NH₂ 또는

이고, 여기서, a는 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 화학식 V 및 VI의 표지된 벡터를 제공한다. 바람직한 화학식 V 및 VI의 화합물은 벡터가 Arg-Gly-Asp 펩티드 또는 그의 유사체, 예컨대 WO 01/77415 및 WO 03/006491에 기재된 것, 바람직하게는 하기 단편을 포함하는 펩티드, 더욱 바람직하게는 하기 화학식 A의 펩티드인 화합물이다.

<단편>

<화학식 A>

상기 식에서, X⁷은 -NH₂ 또는

이고, 여기서, a는 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1이다.

R^*가 ¹¹C 방사성 표지를 포함하는 화학식 II의 화합물은 예를 들어 하기 반응식에 따라 제조할 수 있다.

상기 식에서, -NuH는 친핵성 반응 중심, 예컨대 히드록실, 티올 또는 아민 관능기이다.

R^*가 ¹⁸F인 화학식 II의 화합물은 하기와 같은 친전자성 또는 친핵성 불소화 반응에 의해 제조될 수 있다.

화학식 II의 화합물의 제조에 적합한 방사성 불소화 방법은 상전이제, 예컨대 환형 폴리에테르, 예를 들어 18-크라운-6 또는 크립토픽스(Kryptofix) 2.2.2.의 존재하에 이탈기 (예컨대, 알킬 또는 아릴 술포네이트, 예를 들어 메실레이트, 트리플레이트 또는 토실레이트; 니트로 또는 트리알킬암모늄염)가 도입된 전구체와 ¹⁸F^-의 반응을 포함한다. 상기 반응을 당업계에 공지된 표준 조건하에 용액 상에서 (비양성자성 용매, 예컨대 용매로서 아세토니트릴을 이용하여) (예를 들어, 문헌 [M.J. Welch and C.S. Redvanly "Handbook of Radiopharmaceuticals", published by Wiley]), 또는 고체 지지체를 이용하여 수행하여, WO 03/002157에 기재된 방법에 따라 화학식 II의 화합물의 정제를 용이하게 할 수 있다.

화학식 IV의 화합물은 화학식 II의 화합물의 합성에 대해 기재된 것과 유사한 방법에 의해 적합한 아세틸렌 전구체로부터 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 유효량의 (예를 들어, 생체내 영상화, 적합하게는 PET 또는 SPECT에 이용하기에 유효한 양) 상기 정의된 화학식 V 또는 VI의 화합물을 1종 이상의 제약상 허용되는 보조제, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 방사성 제약 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 화학식 V 또는 VI의 화합물 중 벡터는 상기 기재된 바와 같이 Arg-Gly-Asp 펩티드 또는 그의 유사체이다.

본 발명의 추가의 실시양태는 의학용으로, 특히 생체내 영상화 (적합하게는 PET 또는 SPECT)에 사용되는 상기 정의된 화학식 V 또는 VI의 화합물에 관한 것이다. 바람직하게는, 화학식 V 또는 VI의 화합물 중 벡터는 상기 기재된 바와 같이 Arg-Gly-Asp 펩티드 또는 그의 유사체이다.

화학식 V 및 VI의 표지된 벡터는 목적하는 신호를 수득하기에 충분한 양으로 생체내 영상화를 위해 환자에게 투여될 수 있으며, PET 또는 SPECT 영상화를 위한 방사성 핵종의 전형적인 투여량으로서 체중 70 kg 당 0.01 내지 100 mCi, 바람직하게는 0.1 내지 50 mCi가 일반적으로 충분할 것이다.

따라서, 화학식 V 및 VI의 표지된 벡터는 당업계에 널리 알려진 방식으로 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 투여를 위해 제제화될 수 있다. 예를 들어, 임의로 제약상 허용되는 부형제가 첨가된 화합물은 수성 매질 중에 현탁되거나 용해될 수 있으며, 생성된 용액 또는 현탁액은 멸균된다.

추가의 측면으로, 본 발명은 인간 또는 동물 신체의 한 부분 이상의 영상을 형성하기 위해 약제를 상기 신체에 투여하는 것을 포함하는, 생체내 영상화 방법, 적합하게는 PET에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서 화학식 V 또는 VI의 표지된 벡터의 용도를 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 인간 또는 동물 신체, 예를 들어 혈관계에 약제를 투여하는 단계, 및 생체내 영상화 기술, 예컨대 PET를 이용하여 약제가 분포된 상기 신체의 한 부분 이상의 영상을 형성하는 단계를 포함하며, 상기 약제가 화학식 V 또는 VI의 표지된 벡터를 포함하는 것인, 인간 또는 동물 신체의 영상을 형성하는 방법을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 화학식 V 또는 VI의 표지된 벡터를 인간 또는 동물 신체에 투여하는 단계, 및 상기 표지된 벡터의 흡수를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 투여 및 검출은 임의로 바람직하게는 반복해서, 예를 들어 약물 처치 이전, 동안 및 이후에 이루어지는 것인, 인간 또는 동물 신체를 증상에 대항하는 약물로 처리한 효과를 모니터링하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 화학식 II 또는 IV의 보결 분자단 또는 그의 전구체 및 화학식 I 또는 III의 화합물을 포함하는 방사성 불소화 추적자의 제조를 위한 키트가 제공된다.

상기 키트의 사용시에, 상기 전구체 화합물은 상기 기재된 방법에 의해 화학식 II 또는 IV의 상응하는 화합물로 전환될 것이다. 화학식 II 및 IV의 화합물은 정제되지 않은 형태로 사용될 수 있지만, 바람직하게는 화학식 II 및 IV의 화합물은 고상 추출 (SPE) 카트리지를 통해 반응 혼합물을 통과시킴으로써, 크로마토그래피에 의해, 또는 증류에 의해 폐 반응물로부터 분리될 수 있다. 그 후, 화학식 II 및 IV의 화합물은 각각 본원에 기재된 적합한 용매에 적합하게 용해될 수 있는 화 학식 I 및 III의 화합물에 부가될 것이다. 과하지 않은 온도에서 1 내지 90분 동안 반응시킨 후, 표지된 펩티드를 예를 들어 SPE에 의해 정제하고 수집한다.

본원에 기재된 화학은 또한 진단 약물 또는 생체내 영상화 제제로서 스크리닝에 적합한 방사성 표지된 벡터의 라이브러리를 제조하는데 이용될 수 있다. 따라서, 화학식 II 또는 IV의 보결 분자단의 혼합물을 각각 상기 기재된 방법을 이용하여 1종 이상의 화학식 I 또는 III의 화합물과 반응시켜, 방사성 표지된 벡터의 라이브러리를 수득할 수 있다.

본 발명은 실시예에 의해 기술되며, 하기 약어들이 이용된다.

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

DMF: N,N-디메틸포름아미드

DMSO: 디메틸술폭시드

ESI-MS: 전자분무 이온화 질량 스펙트럼

r.t.: 실온

TOF-ESI-MS: 비행 시간형 전자분무 이온화 질량 스펙트럼

FT-IR: 푸리에(Fourier) 변환 적외선

ppm: 백만분율

TFA: 트리플루오로아세트산

ACN: 아세토니트릴

참조 화합물의 제조

실시예 1 - 화합물 (2), 1- 아지도 2- 플루오로에탄의 제조

톨루엔-4-술폰산 2-플루오로-에틸 에스테르, 화합물 (1)을 문헌 [E.U.T. van Velzen et al. in Synthesis (1995) 989-997]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 화합물 (1) (128 mg, 0.586 mmol) 및 아지드화나트륨 (114 mg, 1.758 mmol)을 무수 DMF (10 ml)와 혼합하고, 실온에서 48시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하였지만, 생성물 (2)는 반응 용액으로부터 단리되지 않았다.

실시예 2 - 화합물 (3), 1-(2- 플루오로 -에틸)-4- 페닐 -1H-[1,2,3] 트리아졸의 제조

DMF (1 ml) 중 페닐아세틸렌 (105 ㎕, 0.977 mmol)을 질소하에 물 (0.3 ml) 중 황산구리(II) 5수화물 (12 mg, 0.0489 mmol) 및 L-아스코르브산 (16 mg, 0.0977 mmol)의 교반중인 용액에 첨가하였다. DMF (5 ml) 중 화합물 (2) (1.172 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 12시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (5 ml)로 희석하고, 조 생성물을 디클로로메탄 (3 x 5 ml)으로 추출하고, 중탄산나트륨 용액 (10％, 3 x 10 ml) 및 염수 (1 x 5 ml)로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조한 후, 용매를 감압하에 제거하고, 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 헥산/에틸아세테이트)를 이용하여 정제하였다.

실시예 3 - 화합물 (4), 4-[1-(2-플루오로-에틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-일]-페닐아민의 제조

DMF (0.7 ml) 중 4-에티닐아닐린 (40 mg, 0.344 mmol)을 질소하에 물 (1.2 ml) 중 황산구리(II) 5수화물 (129 mg, 0.516 mmol) 및 L-아스코르브산 (182 mg, 1.032 mmol)의 교반중인 용액에 첨가하였다. DMF (2.45 ml) 중 화합물 (2) (0.287 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 수산화나트륨 용액 (1M, 5 ml)으로 켄칭하였다. 생성물을 에틸 아세테이트 (3 x 5 ml)로 추출하고, 물 (5 ml) 및 염수 (2 ml)로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조한 후, 용매를 감압하에 제거하고, 조 물질을 플래쉬 크로마토그래피 (실리카, 헥산/에틸아세테이트)를 이용하여 정제하였다.

실시예 4 - 화합물 (5), 1-(2-플루오로-에틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-카르복실산 벤질아미드의 제조

문헌 [G.M. Coppola and R.E. Damon in Synthetic Communications 23 (1993) 2003-2010]의 절차에 따라 제조한 프로피온산 벤질아미드 (50 mg, 0.314 mmol)를 DMF (1 ml)에 용해시키고, 질소하에 물 (0.4 ml) 중 황산구리(II) 5수화물 (3.9 mg, 0.0157 mmol) 및 L-아스코르브산 (11 mg, 0.0628 mmol)의 교반중인 용액에 첨가하였다. DMF (3.2 ml) 중 화합물 (2) (0.377 mmol)을 첨가한 후, 실온에서 48시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨 (10％, 5 ml)으로 희석하고, 조 생성물을 디클로로메탄 (3 x 5 ml)으로 추출하고, 염수 (5 ml)로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조한 후, 용매를 감압하에 제거하고, 조 물질을 에틸아세테이트/디에틸에테르로부터의 재결정화에 의해 정제하였다.

실시예 5 - 화합물 (6), N-벤질-3-[1-(2-플루오로-에틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-일]-프로피온아미드의 제조

펜트-4-인산 벤질아미드 - 이 화합물은 N-숙신이미딜 중간체를 단리하는 것을 제외하고는 G.M. Coppola 및 R.E. Damon의 문헌 (실시예 4 참조)에 기재된 것과 유사한 방법을 이용하여 합성하였다.

N-벤질-3-[1-(2-플루오로-에틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-일]-프로피온아미드 - 메탄올 (0.5 ml) 중 펜트-4-인산 벤질아미드 (50 mg, 0.267 mmol), DMF (2.62 ml) 중 화합물 (2) (0.320 mmol), 및 디이소프로필아민 (0.233 ml, 1.335 mmol)을 질소하에 메탄올 (0.8 ml) 중 요오드화구리(I) (255 mg, 1.335 mmol)의 교반중인 현탁액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (10 ml) 중 인산수소나트륨 (1 g)의 용액으로 켄칭하고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 조 생성물을 에틸 아세테이트 (3 x 20 ml)로 추출하고, 염수 (20 ml)로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조한 후, 용매를 감압하에 제거하고, 조 물질을 컬럼 크로마토그래피 (실리카 및 에틸아세테이트/헥산)에 의해 정제하였다.

실시예 6 - 화합물 (7), 4-[1-(2-플루오로-에틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-일]-벤조산의 제조

DMF (1.5 ml) 중 나트륨 4-에티닐벤조에이트 (50 mg, 0.297 mmol)를 질소하에 물 (0.2 ml) 중 황산구리(II) 5수화물 (3.7 mg, 0.0149 mmol) 및 L-아스코르브산 (10.5 mg, 0.0595 mmol)의 교반중인 용액에 첨가하였다. DMF (0.76 ml) 중 화합물 (2) (0.356 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 12시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 HCl (20 ml, 1M)로 희석하였다. 조 생성물을 에틸 아세테이트 (3 x 10 ml)로 추출하고, 염수 (10 ml)로 세척하였다. 황산나트륨 상에서 건조한 후, 용매를 감압하에 제거하고, 조 물질을 에틸아세테이트/헥산으로부터 재결정화하였다.

실시예 7 - 화합물 (8), 1-(2-플루오로-에틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-카르복실산의 제조

DMF (0.5 ml) 중 프로피올산 (60 ㎕, 0.977 mmol)을 질소하에 물 (0.4 ml) 중 황산구리(II) 5수화물 (12 mg, 0.0489 mmol) 및 L-아스코르브산 (34 mg, 0.135 mmol)의 교반중인 용액에 첨가하였다. DMF (2.5 ml) 중 화합물 (2) (1.172 mmol)를 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물을 HCl (20 ml, 1M)로 켄칭하고, 조 생성물을 에틸 아세테이트 (3 x 20 ml)로 추출하였다. 염수 (5 ml)로 세척하고 황산나트륨 상에서 건조한 후, 용매를 감압하에 제거하고, 생성물을 에틸 아세테이트/헥산으로부터의 재결정화에 의해 정제하였다.

실시예 8 - 화합물 (9), 2-아세틸아미노-3-[1-(2-플루오로-에틸)-1H-[1,2,3]트리아졸-4-일]-프로피온산 에틸 에스테르의 제조

메탄올 (1 ml) 중 2-아세틸아미노-펜트-4-인산 에틸 에스테르 (200 mg, 1.09 mmol)를 질소하에 구리 분말 (200 mg, 40 메쉬)에 첨가한 후, DMF (3 ml) 중 화합물 (2) (1.09 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 90분 동안 교반한 다음, 80℃에서 3시간 동안 가열하였다. 화합물 (9)를 역상 플래쉬 크로마토그래피 (아세토니트릴/물)에 의해 단리하였다.

방사선 화학

실시예 9 - 화합물 (11), [ ¹⁸ F]1- 아지도 -2- 플루오로 -에탄의 제조

¹⁸F-불소화물은 풍부화된 [¹⁸O]H₂O 표적의 19 MeV 양성자 조사에 의한 ¹⁸O(p,n)¹⁸F 핵 반응을 이용하여 사이클로트론에 의해 제조하였다. 조사 후, 크립토픽스® (5 mg), 탄산나트륨 (1 mg) 및 아세토니트릴 (1 ml)의 혼합물을 ¹⁸F-물 (1 ml)에 첨가하였다. 질소 스트림 (100 ml/분)하에 80℃에서 가열함으로써 용매를 제거하였다. 그 후, 아세토니트릴 (0.5 ml)을 첨가하고, 가열 및 질소 스트림하에 증발시켰다. 이 절차를 2회 반복하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 무수 아세토니트릴 (0.2 ml) 중 화합물 (10) (1.5 ㎕; 문헌 [Z.P. Demko and K. B. Sharpless, Org. Lett. 3 (2001) 4091]의 방법에 의해 제조)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 30분 동안 교반하였다. 화합물 (11)을 증류를 통해 40±14％ (n = 7)의 붕괴-보정된 방사선 화학 수율 [효율: 76±8％ (n = 7)]로 단리하였다.

실시예 10 - 화합물 (12)-(16), [ ¹⁸ F][1-(2-플루오로-에틸)-1H-[1,2,3]트리아졸의 제조

DMF (0.1 ml) 중 알킨 시약 (0.015 mmol)의 용액을 질소하에 황산구리(II) (5 당량) 및 L-아스코르브산 (20 당량)의 혼합물에 첨가하였다. 아세토니트릴 (0.2 ml) 중 화합물 (11)의 용액을 첨가하였다. 80℃에서 30분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 HPLC에 의해 분석하였다.

실시예 11 - 화합물 (18), [ ¹⁸ F](S)-6-아미노-2-(2-{(S)-2-[2-((S)-6-아미노-2-{[4-(2- 플루오로 -에틸)-[1,2,3] 트리아졸 -1-카르보닐]-아미노}- 헥사노일아미노 )-아세틸아미노]-3-페닐-프로피오닐아미노}-아세틸아미노)-헥산산의 제조

화합물 (17) (1 mg, 1.7 μmol)을 인산나트륨 완충액 (pH 6.0, 0.25 M, 0.05 ml)에 용해하였다. 아세토니트릴 (0.05 ml) 중 화합물 (11) (175 μCi, 6.5 MBq)에 이어 구리 과립 (400 mg, 10-40 메쉬)을 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 5분 동안 가열하였다. HPLC 분석은 86％의 방사성 표지된 펩티드 (18)를 나타내었다.

실시예 12 - 화합물 (20)의 제조

(i) 화합물 (19), Cys2 -6; c[CH ₂ CO-Lys(DL-Pra-Ac)-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys]-CCX6-NH ₂ 의 제조

Ac-DL-Pra-OH (31 mg), (7-아자벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyAOP) (104 mg) 및 N-메틸모르폴린 (NMM) (88 ㎕)을 디메틸포름아미드 (DMF) (3 mL)에 용해하고, 혼합물을 5분 동안 교반한 후, WO2005/003166에 기재된 바와 같이 제조된 DMF (4 mL) 중 ClCH₂CO-Lys-Cys(tBu)- Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-PEG-NH₂ (126 mg)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 45분 동안 교반하였다. ClCH₂CO-Lys-Cys(tBu)-Arg-Gly-Asp-Cys(tBu)-Phe-Cys-PEG-NH₂ (132 mg) 및 NMM (44 ㎕)을 추가로 첨가하고, 45분 동안 교반하였다. 그 후, DMF를 진공에서 증발시키고, 잔류물 (5 mL)을 10％ 아세토니트릴 (ACN)/물 (100 mL)로 희석하고, 생성물을 제조용 HPLC에 의해 정제하였다.

정제 및 특성 분석

희석된 잔류물을 제조용 HPLC (구배: 60분에 걸쳐 10-40％ B, A = H₂O/0.1％ TFA 및 B = ACN/0.1％ TFA, 유속: 50 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 5μ C18 (2) 250 x 50 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 31.3분)에 의해 정제하여 170 mg의 순수한 AH-112145를 수득하였다.

상기 순수한 생성물을 분석용 HPLC (구배: 10분에 걸쳐 10-40％ B, A = H₂O/0.1％ TFA 및 B = ACN/0.1％ TFA, 유속: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50 x 2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.32분)에 의해 분석하였다. 추가의 생성물 특성 분석은 전자분무 질량 분광측정에 의해 수행하였다 (MH⁺ 계산치: 1395.5, MH⁺ 실측치: 1395.7).

(ii) 화합물 20의 제조

화합물 (19) (0.5 mg, 0.35 μmol)를 인산나트륨 완충액 (pH 6.0, 50 mM)에 용해하고, 화합물 (11) (25 ㎕, 728 μCi/25 MBq) 및 구리 분말 (200 mg, 40 메쉬) 의 용액과 혼합하였다. 70℃에서 15분 동안 가열한 후, 혼합물을 방사성 HPLC에 의해 분석하였다.

접합 생성물 (20)을 세미-제조용 HPLC (컬럼 루나 C18(2), 100x10 mm, 유속 2.0 ml/분; 용매 A: 물 (0.085％ 인산 v/v), 용매 B: 물 (30％ 에탄올 v/v), 구배: 15분에 걸쳐 50％ B 내지 100％ B)를 이용하여 단리하였다. 표지된 펩티드 (20)는 10％의 붕괴-보정된 방사선 화학 수율 및 99％ 초과의 방사선 화학 순도로 수득되었다. 방사선 활성 생성물 피크 (k' = 2.03)는 화합물 (20)의 표준 샘플과 함께 주입하여 확인하였다.

실시예 13 - 화합물 (20)의 제조를 위한 반응 변수의 최적화

일반적인 절차: 완충액 (50 ㎕; 완충액 A: 인산나트륨, pH 6.0, 50 mM; 완충액 B: 탄산나트륨, pH 9.3, 50 mM) 중 화합물 (19) (0.5 mg, 0.35 μmol)의 용액에 아세토니트릴 (100 ㎕) 중 화합물 (11) (0.1 mCi, 3.7 MBq)에 이어 구리 촉매 (촉매 1: 구리 과립 10+40 메쉬, 촉매 2: 구리 분말 -40 메쉬, 촉매 3: 구리 분말, 수지상, 3 ㎛)를 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 15분 동안 인큐베이션하고, HPLC에 의해 분석하였다.

HPLC에 의해 측정한, pH 및 촉매 (400 mg)에 따라 화합물 (20)을 형성하는 화합물 (19)의 표지화 효율
완충액	촉매 1	촉매 2	촉매 3
A	12％	44％	-^*
B	-	33％	-^*
^* 펩티드 전구체에 대해 UV 피크가 확인되지 않음

pH 6.0 (완충액 A)에서 촉매 3의 양에 따라 화합물 (20)을 형성하는 화합물 (19)의 표지화 효율
촉매 3의 양	화합물 (20)의 표지화 효율
200 mg	23％
100 mg	37％
50 mg	27％

본원에 개시된 특정한 실시양태들은 본 발명의 여러 측면을 설명하기 위해 의도된 것이기 때문에, 본원에 기재된 발명 및 청구항이 상기 실시양태들의 범위로 한정되지 않는다. 임의의 동등한 실시양태들은 본 발명의 범위 내인 것으로 의도된다. 실제로, 본원에 도시되고 기재된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 상기 기재로부터 당업자에게 명백해 질 것이다. 이러한 변형은 또한 첨부된 청구항의 범위 내인 것으로 의도된다.

Claims

Cu(I) 촉매의 존재하에, 하기 화학식 I의 화합물과 하기 화학식 II의 화합물을 반응시키거나, 하기 화학식 III의 화합물과 하기 화학식 IV의 화합물을 반응시켜서, 각각 하기 화학식 V 또는 VI의 접합체를 수득하는 것을 포함하는, 벡터의 표지화 방법.

<화학식 I>

<화학식 II>

<화학식 III>

<화학식 IV>

<화학식 V>

<화학식 VI>

상기 식에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각의 링커 기이고, R^*은 방사성 핵종을 포함하는 리포터 잔기이다.
제1항에 있어서, R^*이 양전자-방출 방사성 핵종, 바람직하게는 ¹¹C 또는 ¹⁸F를 포함하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 벡터가 펩티드, 단백질, 호르몬, 세포, 박테리아, 바이러스, 또는 소형 약물-유사 분자, 가장 적합하게는 펩티드인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 Arg-Gly-Asp 펩티드 또는 그의 유사체인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 하기 단편을 포함하는 펩티드인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터가 하기 화학식 A의 펩티드인 방법.

<화학식 A>

상기 식에서, X⁷은 -NH₂ 또는
이고, 여기서, a는 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1이다.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Cu(I) 촉매의 공급원으로서 구리 원소가 사용되는 방법.
제7항에 있어서, 상기 구리 원소의 입도가 0.001 mm 내지 1 mm, 바람직하게는 0.1 mm 내지 0.7 mm, 더욱 바람직하게는 대략 0.4 mm인 방법.
하기 화학식 II 또는 IV의 화합물.

<화학식 II>

<화학식 IV>

상기 식에서, L2 및 L4는 각각의 링커 기이고, R^*는 제1항 또는 제2항에 정의된 바와 같은 리포터 잔기이다.
하기 화학식 V 또는 VI의 화합물.

<화학식 V>

<화학식 VI>

상기 식에서, L1, L2, L3, L4, R^* 및 벡터는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
제10항에 있어서, 상기 벡터가 Arg-Gly-Asp 펩티드 또는 그의 유사체인 화학식 V 또는 VI의 화합물.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 벡터가 하기 단편을 포함하는 펩티드, 더욱 바람직하게는 하기 화학식 A의 펩티드인 화학식 V 또는 VI의 화합물.

<단편>

<화학식 A>

상기 식에서, X⁷은 -NH₂ 또는
이고, 여기서, a는 1 내지 10의 정수, 바람직하게는 1이다.
하기 화학식 I 또는 III의 화합물.

<화학식 I>

<화학식 III>

상기 식에서, L1 및 L3은 각각의 링커 기이고, 벡터는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같다.
유효량의 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물을 1종 이상의 제약상 허용되는 보조제, 부형제 또는 희석제와 함께 포함하는 방사성 제약 조성물.
의학용으로 사용되는 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물.
생체내 영상화 방법에 사용되는 방사성 약제의 제조에 있어서 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물을 인간 또는 동물 신체에 투여하는 단계, 및 양전자 방출 단층 촬영 (PET)을 이용하여 상기 화합물이 분포된 상기 신체의 한 부분 이상의 영상을 형성하는 단계를 포함하는, 인간 또는 동물 신체의 영상을 형성하는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항의 화합물을 인간 또는 동물 신체에 투여하는 단계, 및 세포 수용체에 의한 상기 화합물의 흡수를 검출하는 단계를 포함하며, 상기 투여 및 검출은 임의로 바람직하게는 약물 처치 이전, 동안 및 이후에 이루어지는 것인, 인간 또는 동물 신체를 암과 관련된 증상, 바람직하게는 혈관형성에 대항하는 약물로 처리한 효과를 모니터링하는 방법.