상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose) 또는 이의 약학적으 로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈 또는 이의 염을 함유하는 피부질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 하기의 화학식1로 표시된다.
본 발명에 따른 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 그 자체 또는 염의 형태, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한, 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 당업계에 공지된 방법에 따라 단리하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 탄닌산(tannic acid)으로부터 통상의 메타놀리시스(methanolysis)와 순상 또는 역상 크로마토그래피에 의해 단리하여 사용할 수 있다. 또한, 작약으로부터 통상적인 추출공정 및 크로마토그래피에 의해 단리 될 수 있으며(대한민국 공개특허 제2003-0075947), 당업계에 공지된 화학적 방법에 따라 화학적으로 합성될 수도 있다.
본 발명에 따른 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 다양한 피부질환 매개물질들을 억제하여 피부질환을 예방 및 치료할 수 있다.
자외선에 의해 유발되는 피부질환의 주원인은 자외선에 의해 형성된 활성 산소종이 신호체계에 신호를 보내어, 콜라겐과 같은 피부의 세포간물질의 성분을 분 해하는 효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 합성을 촉진하는 것이다(Angel, P. et al., Cell, 49:729-739, 1987; Devary, Y., et al., Science, 261:1442-1445, 1993). MMP-1은 콜라겐을 파괴하여 피부 탄력 저하, 피부의 각질 비후, 주름 생성 등의 피부질환 증상을 유발시킨다. 또한, MMP-1은 콜라겐 구조를 분해해야 할 필요성이 있을 때 대사과정에서 발현하여 상처의 복구, 조직의 재흡수, 배아의 발달, 혈관생성 및 세포이동과 같은 생리적 현상에 중심적 기능을 하는 콜라겐 대사를 조정하며 류마티스, 암세포 전이시에 기저막의 분해과정에 관여한다(Bresalier R.S. et.al., Cancer Res., 47:1398-1406, 1987). 따라서 자외선 조사에 의하여 증가된 MMP-1 발현을 억제하면 피부 탄력 저하, 피부의 각질 비후, 주름 생성 등이 예방되며 자외선 조사에 의한 피부질환이 예방 및 치료될 수 있다.
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 시험관 내 및 생체 내에서 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 감소시킨다.
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 시험관 내에서 자외선 조사에 의해 감소된 타입 I 프로콜라겐의 발현을 증가시키며, 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 이때, 축합형 탄닌 유도체이며 녹차 카테킨의 주 구성성분인 EGCG의 피부보호 효과가 알려져 있으므로 그 효과를 함께 확인하였다. 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 처리시에 타입 I 프로콜라겐의 발현증가는 EGCG의 처리에 비하여 현격히 증가한다. 또한 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 MMP-1 억제효과는 국내특허(대한민국특허 등록 제10-0439590)에서 확인한 EGCG의 MMP-1 억제효과보다 훨씬 뛰어나다( 도 2 및 도 3).
또한, 생체 내 실험에서도 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 자외선에 의하여 유발되는 타입 I 프로콜라겐의 감소 및 MMP-1의 발현을 억제한다 (도 8 및 도 9 참조).
COX-2는 체내의 염증 반응에 관여하는 물질로서 피부 세포에서 자외선과 같은 외부 자극에 의해 대량으로 발현되며, 세포막에 있는 아라키돈산을 프로스타글라딘으로 전화시켜 피부 세포 손상을 촉진하며 피부손상 조직에서 과발현된다. 따라서 COX-2의 발현을 억제하여 염증성 피부질환을 예방할 수 있다.
또한, COX-2의 과발현은 다양한 악성 종양에서 나타났으며, 아포토시스를 억제하고 종양 유발 세포의 침습성을 증가시키는 것으로 보고되었다(Dempke et al., J. Can. Res. Clin. Oncol. 127:411-17, 2001). 따라서 COX-2의 발현을 억제하여 피부암을 예방할 수 있다.
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 시험관 내에서 자외선 조사에 의해 증가된 COX-2의 발현을 감소시키는 효과를 나타낸다(도 4).
생체 내 실험 결과, 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 자외선 조사로 콜라겐이 감소된 피부조직에 처리되었을 때 콜라겐의 형성을 촉진시키는 효과를 보인다(도 7).
또한, 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 자외선에 의한 각질 비후를 억제하는 효과를 나타내며, 자외선에 의해 유발된 주름 생성을 억제하는 효과를 나타낸다(도 5 및 도 6 참조).
따라서 본 발명은 상기 화학식1로 표시되는 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 피부질환은 자외선에 의한 피부질환 또는 염증성 피부질환을 의미한다.
상기에서 ‘자외선에 의한 피부질환’은 이에 한정되지는 않으나, 광노화 또는 피부암 등이 포함될 수 있다.
또한, 상기 ‘염증성 피부질환’이란 이에 한정되지는 않으나, 피부 염증, 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 만성단순태선, 간찰진, 박탈 피부염, 구진상 두드러기, 건선, 일광 피부염 및 여드름 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다. 상기에서 ‘약학적으로 허용되는' 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
본 발명의 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 경피 투여, 피하 내, 정맥 내 , 근육 내 또는 복강 내 투여할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 ‘경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말하다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 피부질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 0.01 ㎍ 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ㎍ 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 농도는 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 피부질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
또한, 본 발명자들은 상기 실험 결과로부터 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 자외선에 의해 유발되는 주름 생성, 각질 비후, 콜라겐 분해, 타입 I 프로콜라겐 감소, MMP-1 발현증가 및 COX-2 발현 증가를 억제하는 효과를 확인하고 상기 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 함유하는 화장료 조성물을 제조하였다. 상기 화장료 조성물은 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈와 함께 화장료 조성물의 제조 분야에서 일반적으로 사용되는 하나 이상의 부형제 및 첨가제를 포함하여 당 분야의 공지의 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 유효성분으로 함유하며 피부학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 기초 화장품 조성물(화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼 및 클렌징 워터와 같은 세안제, 팩, 보디오일), 색조 화장품 조성물(화운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스), 두발 제품 조성물(샴푸, 린스, 헤어컨디셔너, 헤어젤) 및 비누 등의 형태로 제조될 수 있다. 상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포 함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 포함하는 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.
상기 본 발명의 화장료 조성물에 함유되는 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량% , 바람직하게는 0.01 내지 10 중량% 범위로 함유될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
1,2,3,4,6-펜타-오-
갈로일
-베타-디-
글루코즈의
단리
탄닌산으로부터 메타놀리시스 반응을 통하여 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 제조하였다. 상업적으로 구입할 수 있는 탄닌산(tannic acid, Sigma, MO, USA)을 반응 재료로 사용하였다. 탄닌산 10 g을 아세테이트 완충액과 메탄올이 각각 3:7 (v/v)의 비율로 혼합된 용액에서 55 ~ 65 ℃의 온도하에 15 ~ 18시간 동안 메타놀리시스 반응시켰다. 상기 메타놀리시스 반응액을 pH 6.0의 약산성 상태로 조정하고 감압 농축기를 이용하여 30 ℃ 이하에서 농축하여 메탄올을 제거하였다. 농축액은 물로 부피를 보정하고, 에틸에테르를 이용하여 극성도에 따라 분리한 다음, 그 결과물을 에틸아세테이트를 이용하여 극성도에 따라 순차적으로 분리하였다. 상기 에틸아세테이드 분획물은 감압 농축기를 사용하여 30 ℃ 이하의 온도에서 농축하였고, 잔여물층은 동결건조기로 동결건조 하였다. 그 후 고속 액체 크로마토그래피를 이용하여 각각의 용매 분획물에서의 메타놀리시스 반응 정도를 확인하여 에틸아세테이트 분획물에 탄닌 유도체 중 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 편중되어 포함되어 있음을 확인하였다(도 1 참조)
상기 에틸아세테이트 분획물 3.0 g 중 300 mg을 고속 액체 크로마토그래피 (High performance liquid chromatography, GILSON 사)의 역상 실리카 컬럼(1.0 x 300 mm, Waters사)에 주입하여 이동상 용매로 0.1 % 트리플루오르아세트산(trifluoracetic acid)이 함유된 아세토니트릴(acetonitrile)과 0.1 % 트리플루오르아세트산(trifluoracetic acid)이 함유된 물 농도를 변화 (20:80 -> 40:60) 시키 면서 시험관에 1.5 ml 씩 용출물을 얻었다. 상기 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 포함된 용출물을 감압 농축기(speed vac)로 감압 농축시켜 단리된 순수 물질을 10 mg 확보하였다. 상기 물질을 질량 분석기로 분석한 결과, 단리된 물질이 분자량 940의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈임을 확인하였다(결과 미도시).
또한, 단리된 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 상업적 활용을 위한 생산 수율을 높이기 위해 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 편중됨을 확인한 건조중량 3.0 g의 상기 에틸아세테이트 분획물을 메타놀리시스가 끝난 탄닌산 반응액을 용매분획하는 과정에서 동량의 물과 섞은 후, 감압농축을 실시하여 에틸아세테이트 분획물을 강제적으로 물에 녹여 냉장온도에서 재결정을 시켜 미색의 결정물을 얻은 후 수용성 알코올 용액을 사용하여 수세와 재결정 반응을 반복하여 200 mg의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 단리하였다.
이와 같이, 탄닌산으로부터 단리된 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈 100 mg/ml의 농도로 DMSO에 녹여 사용 전까지 -20 ℃에 냉동 보관하였다.
<
실시예
2>
시험관
세포내
자외선에 의한 타입 I 콜라겐 감소 및
MMP
-
1증가에
대한 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 억제 효과
유아 포경에서 절제된 피부 진피층에서 분리 및 배양하여 수득한 인간 정상 피부섬유아세포(Human normal dermal fibroblast)를 6웰 플레이트(6-well plate)의 각 웰(well)에 1 x 105 개수의 세포가 되도록 접종한 후 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 10 % 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 인산 완충액(Phosphate buffered saline, PBS)을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 피부노화를 유발하기 위하여 다음과 같이 자외선 A 및 자외선 B를 조사하였다. 자외선 A의 경우는 자외선 A 램프(Sankyo Denki FL8BL lamp, Sankyo Denki Co., Japan)를 이용하여 1초당 27 mW/cm2의 에너지 양으로 총 50 mJ/cm2를 조사하였으며, 자외선 B의 경우는 자외선 B 램프(Sankyo Denki G9T5E lamp, Sankyo Denki Co., Japan)를 이용하여 1초당 1.15 mW/cm2의 에너지 양으로 총 170 mJ/cm2를 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지에 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 1, 10 ㎍/ml의 농도로 첨가하여 24 시간 더 배양하였다. 실험 그룹은 다음과 같이 나누었다:
· 무처리군 - 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 모두 처리하지 않음
· 자외선 단독 처리군 - 자외선만 처리함
· 대조군 - 자외선 및 EGCG를 처리함
· 실험군 - 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 모두 처리함
축합형 탄닌 유도체이며 녹차 카테킨의 주 구성성분인 EGCG의 MMP-1 발현 억제 및 타입 I 프로콜라겐 발현 증가효과가 국내특허에 보고되어 있으므로 이를 대조군으로 이용하였다. 배양 후 피부노화 여부를 확인하기 위하여 피부 세포간 기질 구성성분인 타입 I 프로콜라겐(type I procollagen) 및 이의 분해효소인 MMP-1의 발현정도를 타입 I 프로콜라겐 ELISA 키트(Procollagen Type I C-Peptide EIA kit, TaKaRa, Japan)와 MMP-1 ELISA 키트(MMP-1 human, ELISA system, Biotrak Assay, Amersham Biosciences, USA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 측정하였다. 세포내 타입 I 프로콜라겐 및 MMP-1의 농도는 총 세포배양액 1 ㎖ 당 단백질 ng으로 나타내었다.
실험 결과, 인간 정상 피부섬유아세포에 자외선을 조사하는 경우(자외선 단독 처리군) 타입 I 프로콜라겐의 발현은 감소되는 반면, MMP-1의 발현은 증가됨을 확인할 수 있었다. 그리고 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈 처리에 의한 타입 I 프로콜라겐의 발현 증가 및 MMP-1의 발현 감소가 농도 의존적으로 나타남을 확인할 수 있었다. 또한, 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 상기 효과가 국내특허에 보고된 EGCG 효과보다 큰 것을 확인할 수 있었다(도 2 및 도 3).
상기 결과로부터, 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 자외선 조사에 의해 감소된 타입 I 프로콜라겐의 발현을 증가시키며 자외선 조사에 의해 증 가된 MMP-1의 발현을 감소시킴을 확인하였다.
<
실시예
3>
시험관
세포내
자외선에 의한 COX-2 증가에 대한 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 억제 효과
독일 N. Fusenig 교수(German Cancer Research, Germany)로부터 공여받은 인간 각질 형성 세포(HaCaT cell)를 100 mm 배양접시에 1.3 ㅧ 106 개수의 세포가 되도록 접종한 후 우태아 혈청이 10% 포함된 DMEM배지에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 인산 완충액을 이용하여 세포를 3회 수세한 다음 피부노화를 유발하기 위하여 다음과 같이 자외선 B를 조사하였다. 자외선 B 램프를 이용하여 1초당 자외선을 0.6 mW/cm2의 에너지 양으로 총 10 mJ/cm2를 조사하였다. 자외선 조사 직후, 세포를 다시 인산 완충액으로 수세하고 우태아 혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지에 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 1, 10, 30, 50 uM의 농도로 첨가하여 12시간 더 배양하였다. 실험 그룹은 다음과 같이 나누었다:
· 무처리군 - 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 모두 처리하지 않음
· 자외선 단독 처리군 - 자외선만 처리함
· 실험군 - 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 모두 처리함
12시간 배양이 끝난 후에 세포를 차가운 인산 완충액으로 수세한 다음 세포용해액(lysis buffer)으로 세포 단백질을 분리하고 COX-2 항체(Santa Cruz Biotch., USA)및 호스라디쉬-페록시다제(horseradish peroxidase)가 결합된 이차 항체(ZYMED Laboratories, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 로딩 대조군으로는 β-액틴을 사용하였다.
실험결과, 인간 각질 형성 세포에 자외선을 조사하는 경우 COX-2의 발현이 무처리군에 비해 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한, 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈 처리에 의해 COX-2의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
상기 결과로부터 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 피부 각질 형성 세포에서 자외선 조사에 의해 증가된 COX-2의 발현을 감소시킴을 확인하였다.
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실시예
4>
마우스 모델에서 자외선에 의한 주름 생성에 대한 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 억제 효과
1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 자외선에 의해 유발되는 주름 생성을 억제하는 효과가 있는지 조사하였다. 먼저 7 주령된 암컷 무모마우스(albino SKH-1 hairless mice, 한림실험동물실험사, 수원, 대한민국)를 각 그룹 당 10 마리씩 다음의 3그룹으로 나누었다:
· 무처리군 - 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 모두 처리하지 않음
· 자외선 단독 처리군 - 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 포함되지 않은 조성물을 처리함
· 실험군 - 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 포함된 조성물을 처리함
각 그룹의 마우스를 자외선 B 램프가 구비된 자외선 상자에 넣고, 최소홍반량(Minimal Erythemal Dose, MED)인 100 mJ/cm2의 자외선을 조사하였다. 자외선은 1일 1회, 주 3회 간격으로 4주 동안 1주차는 100 mJ/cm2, 2주차는 200 mJ/cm2, 3주차는 300 mJ/cm2, 4주차는 400 mJ/cm2로 증가시키면서 조사하여 마우스를 자외선에 적응시켰다. 4주 이후는 400 mJ/cm2의 조사량으로 6주간 조사하여 총 10주간 무모마우스를 자외선에 노출시켜 피부 광노화를 유발하였다(Kilgman LH, Clin Dermatol 14:183-195, 1996). 상기 실험군의 경우 자외선 조사 4주 이후부터 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 포함하는 조성물을 30% 에탄올을 포함하는 프로필렌 글라이콜 용액(7:3 [v/v] propylene glycol:ethanol)에 녹여 10 mg/200㎕/4 cm2의 양으로 마우스의 피부에 도포하였고, 상기 자외선 단독 처리군은 1,2,3,4,6- 펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 포함하지 않는 조성물을 200 ㎕/4 cm2의 양으로 실험군과 동일한 방법으로 마우스에 처리하였다. 10주 경과 후 최종 자외선 조사가 끝난 24 시간 후에 마우스의 피부사진과 피부 복제 키트(skin replica kit, Courage+Khazaka Electronic, Koln, 독일)를 이용하여 피부 주름 정도를 관찰하였다.
실험 결과, 자외선 조사에 의해 주름의 발생 빈도가 증가하였고 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 처리하면 주름의 발생빈도가 감소하였다(도 5).
상기 실험 결과로부터, 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 주름의 발생을 억제함을 확인하였다.
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실시예
5>
마우스 모델에서 각질
비후에
대한 1,2,3,4,6-펜타-오-
갈로일
-베타-디-
글루코즈의
억제 효과
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 무모 마우스에 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 처리한 후 피부조직을 적출하였다. 적출한 조직을 4% 중성 완충 포르말린(formalin) 용액에 24 시간 이상 침지시킨 후, 통상적인 방법에 따라 조직을 수세, 탈수, 투명 과정을 거쳐 최종적으로 파라핀에 포배 (embeding)하여 파라핀 블록을 만든 후에, 5 ㎛의 두께로 조직절편을 제조하였다. 세포의 배열 및 형태학적 변화를 통하여 피부 각질층의 비후 정도를 확인하기 위하여 상기 조직절편을 탈파라핀, 순차적인 함수 과정을 거쳐, 시판되는 마이어 헤마토실린 용액(hematoxylin solution according to Mayer)과 에오신 용액(eosin solution)을 이용한 진행성 염색과정을 거친 후에, 다시 조직 절편을 순차적인 탈수, 투명, 봉입 과정을 거치는 헤마토실린-에오신(H&E) 방법으로 염색하였다. 광학현미경으로 관찰한 결과, 상기 염색에서 헤마토실린 염색액은 핵을 청색으로 염색하고, 에오신 염색액은 세포질을 적색으로 염색한다.
실험 결과, 자외선을 조사하지 않은 조직(무처리군)에 비해 자외선을 조사한 조직(자외선 단독 처리군)에서 피부 각질층의 비후가 상당히 많이 증가되었다. 그러나 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 처리한 경우(실험군)에서는 피부 각질층의 비후가 현저히 감소하였다(도 6).
상기 실험 결과로부터, 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 자외선에 의해 유발되는 피부 각질층의 비후를 억제함을 확인하였다.
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실시예
6>
마우스 모델에서 1,2,3,4,6-펜타-오-
갈로일
-베타-디-
글루코즈의
콜라겐 형성 촉진 효과
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 무모 마우스에 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일- 베타-디-글루코즈 및 자외선을 처리한 후 피부조직을 적출하였다. 자외선으로 인해 손상된 피부 결합조직 중 콜라겐의 변화를 확인하기 위하여 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 피부조직 절편을 제조하였다. 상기 조직절편을 탈파라핀, 함수 과정을 거쳐, 세가지의 염색약을 이용하여 염색하는 마손 트라이콤(masson trichome) 특수 염색을 시행하였다. 보다 상세하게는 와이거트 헤마토실린 용액(Weigert's Iron Hematoxylin solution)에 담구어 핵을 염색한 후, 비브리히 스칼렛 용액(Biebrich sacrlet acid fusion solution)에 담구어 조직 내 세포질과, 케라틴, 근육섬유 등을 염색하였다. 마지막으로 2% 라이트 그린 용액(2% light green solution)에 담그어 최종적으로 콜라겐만을 염색하는 염색과정을 거친 후에, 다시 조직 절편을 탈수, 투명, 봉입 과정을 거치는 마손 트라이콤(masson trichome) 특수 염색을 수행한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 세포핵은 검은색으로 염색되며, 조직절편 내 세포질과 케라틴, 근육섬유들은 적색으로, 진피층의 콜라겐은 청록색으로 관찰된다.
실험 결과, 자외선을 조사하지 않은 조직(무처리군)에 비해 자외선을 조사한 조직(자외선 단독 처리군)에서는 표피층의 두께가 많이 증가되었고, 콜라겐 섬유의 분절현상(fragmentation)이 얇아진 형태를 확인할 수 있었다. 한편, 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 처리한 경우(실험군)에는 자외선 단독 처리군에 비해 콜라겐이 양적으로 증가되어 있고 변성 콜라겐의 양이 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 7).
상기 결과로부터, 자외선에 의해 유발되는 콜라겐 손상에 대하여 1,2,3,4,6- 펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 콜라겐 변성을 저해하고 콜라겐 형성 촉진 효과를 보임을 확인하였다.
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실시예
7>
마우스 모델에서 자외선에 의한 타입 I 콜라겐 감소 및
MMP
-
1증가에
대한 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 억제 효과
상기 실시예 2에서 확인한 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 효과를 마우스 모델에서 다시 한번 확인하기 위하여, 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 무모 마우스에 자외선 및 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 처리하였다. 처리 후 적출하여 얻은 피부조직을 이용하여 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 절편을 제조한 후 탈파라핀 및 함수 과정을 거친 다음, Griffiths의 방법 (Grittiths et al., New Eng J Med. 329:530-535, 1993)에 따라 면역조직화학법을 수행하였다. rat anti-human 타입 I 프로콜라겐 항체 (Chemicon, USA) 및 rabbit anti-human MMP-1 항체를 이용하여 타입 I 프로콜라겐 및 MMP-1의 발현을 광학현미경을 이용하여 확인하였다.
실험 결과, 자외선만 조사한 경우(자외선 단독 처리군)에는 타입 I 프로콜라겐의 발현이 감소된 것으로 나타났으나, 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 처리한 경우(실험군)에는 자외선 단독 처리군에 비해 타입 I 프로콜라겐의 발현이 증가된 것으로 나타났다(도 8).
또한, 타입 I 프로콜라겐의 분해효소인 MMP-1의 경우 자외선에 의해 발현이 증가되었으나, 이러한 발현 증가는 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈에 의해 억제되었음을 확인할 수 있었다(도 9).
상기 실험 결과로부터 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 자외선에 의한 타입 I 프로콜라겐의 감소 및 MMP-1의 발현 증가를 억제함을 확인하였다.
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적용예
1> 피부
광노화
피부 광노화는 자외선에 대한 만성노출로 인하여 외부환경의 위해 요소와 함께 인체내 유해 산소가 형성되어 이로 인해 세포막의 지질성분이 과산화되고 세포막이 경화되어 산소와 영양의 세포내 공급이 원활치 못하게 됨에 따라 발생한다. 상기 원인에 의하여 피부의 신진대사와 피부 세포의 세대교체(turn-over)가 늦어지면서 피부 각질층은 더욱 두꺼워지고 피부 진피층의 교원섬유인 콜라겐(collagen)은 파괴되며 기질인 히아루론산의 감소와 함께 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)도 변성되어 피부탄력이 저하되면서 피부가 생기가 없어 보이며 칙칙해 보이고 건조함과 함께 거칠어지게 되는 피부 건성화, 탄력상실, 주름형성, 모세 혈관벽 약화, 노인성 색소 침착증 등의 일련의 피부 광노화현상이 발생된다. 따라서 이들의 피부 증상을 막기 위해 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 타입 I 프로콜라겐의 합성을 증가시키는 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 피부 광노화 치료에 효과적이다.
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적용예
2> 피부 염증
염증이란 국소적인 손상에 대한 혈관이 있는 살아있는 조직의 반응으로 자외선에 의해 생성된 활성 산소종에 의해 COX-2의 발현이 증가되어 염증이 유발된다. 염증에 의한 변화에는 혈류의 증가, 혈관벽의 투과성 증가, 백혈구의 침윤이 있는데 이 모든 변화에 세포 부착물질이 관여한다고 보고된 바 있다(Jackson, J. R. et al., FASEB J. 11:457-465, 1997). 염증 유발시 조직학적으로 염증 세포의 침윤이 증가하고 생화학적으로는 콜라겐 분해 효소의 활성도가 현격히 증가한다. 따라서 염증 반응의 진행을 담당하는 COX-2 발현을 억제하는 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈가 염증 치료에 효과적이다.
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적용예
3> 피부암
피부암은 피부에서 발생되는 모든 암을 말하며, 피부암은 어떤 종류의 피부세포에서 발생했는가에 따라 대표적으로 기저세포암, 편평상피암, 흑색종 등이 있다. 기저세포암은 피부를 포함하여 인간에게서 발생되는 가장 흔한 악성종양이다. 가장 중요한 유발인자는 자외선이며 외상이나 반흔 또는 화상이 있던 자리에 발생할 수 있다. 피부 증상은 한개 또는 여러 개의 작은 결절이 차츰 커지면서 중앙부는 함몰되고 그 부위는 궤양이나 가피 즉 딱지를 이루며 주변부는 제방모양으로 약간 융기되어 있다. 주로 자외선과 관련되므로 얼굴 특히 코, 이마, 귀, 뺨에 잘 발생한다.
편평세포암은 기저세포암 다음으로 많은 원발성 악성종양이다. 편평세포암 의 원인은 기저세포암과 마찬가지로 자외선이 중요한 원인이며 그 외에 유전적 요소, 발암물질로 알려진 여러 화학물질, 방사선, 파필로마 바이러스, 화상에 의한 반흔 등이 원인이다. 증상은 흔히 얼굴이나 손 등과 같이 자외선에 노출되는 곳에 잘 생기며 단단한 종기 모양으로 표면에 가피가 덮혀 있으며 가피 탈락 후 궤양이 나타난다.
따라서 자외선에 의하여 증가되는 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 발현을 억제하고 피부암조직에서 과발현된 COX-2 발현을 억제하는 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈는 피부암 치료에 효과적이다.
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제조예
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피부질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 함유하는 약제의 제조
<1-1> 정제의 제조
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈 25 ㎎을 부형제 직타용 락토오스 26 ㎎과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 3.5 ㎎, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 1.5 ㎎ 그리고 결합제인 직타용 L-HPC(low-hydrosyprophylcellulose) 8 ㎎과 함께 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합이 완료된 후 활탁제로서 마그네슘 스테아레이트 1 ㎎을 추가로 첨가하고 3분간 혼합하였다. 정량 시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여 정제를 제조하였다.
<1-2> 시럽제의 제조
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분 2 %(W/V)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 산부가염 2 g, 사카린 0.8 g 및 당 25.4 g을 온수 80 g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0 g, 향미료 0.04 g, 에탄올 4.0 g, 소르브산 0.4 g 및 적량의 증류수를 혼합하였다. 상기 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되도록 하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈 50 ㎎, 유당 50 ㎎, 전분 46.5 ㎎, 탈크 1 ㎎ 및 적량의 스테아린산 마그네슘을 혼합하고 이를 경질 젤라틴 캡슐에 충진 함으로써 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 주사액제의 제조
유효성분 10㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈의 염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<1-5> 크림제의 제조
스테아린산 1.5 g, 스테아릴알코올 2.2 g, 스테아린산부틸 0.5 g, 프로필렌글리콜 0.5 g, 모노스테아린산글리세린 2.0 g, 수산화칼륨 0.3 g과 같은 유성 성분, 수성 성분, 계면활성제 등이 포함된 크림 베이스 40 g에 본 발명의 1,2,3,4,6-펜타-오-갈로일-베타-디-글루코즈를 2 %(w/w) 농도로 혼합하여 혼합기에서 잘 유화시키고, 탈기, 여과 및 냉각하여 크림 조성물을 제조하였다. 상기 조성물에 첨가제로서 킬레이트제, 향료 및 색소를 첨가하고, 적은 양의 유성 성분이 존재하도록 처방은 수중유형(oil /water)으로 제조하였다.