KR20070059058A - 망막 디스트로핀 외래도입유전자 및 이의 이용 방법 - Google Patents

망막 디스트로핀 외래도입유전자 및 이의 이용 방법 Download PDF

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Abstract

뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)(DMD)은 디스트로핀 유전자에서 심각한 결함에 의해 발생되고 30세 이전에 환자의 사망을 유발하는 진행성 근육 질환이다. 본 발명에서는 이중 변종 생쥐(Double Mutant mice, DM)를 DMD에 대한 적절한 인간 모형으로 이용하는데, 그 이유는 이들 생쥐가 디스트로핀(dystrophin)과 유트로핀(utrophin)이 모두 부재하고(mdxl+, utrn -/-), 3개월령에 폐사하며, 중증도 근육 약화, 현저한 성장 지체, 흉추만곡증(kyphosis), 체중 감소, 느슨한 자세(slack posture), 부동(immobility)을 겪기 때문이다. 신규한 인간 망막 디스트로핀 Dp260의 외래도입유전자로부터 발현은 조기 폐사를 예방하고 중증도 근이영양증 표현형을 경등도 임상적 근질환으로 경감하는 것으로 밝혀졌다. 근전도 검사(electromyography), 조직구조(histology), 방사선 사진술(radiography), 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging), 행동 연구(behavior study)에서, DM 외래유전자도입 생쥐는 정상적으로 성장하고 정상적인 척추 만곡과 이동성을 나타내며 근육 병리가 감소하는 것으로 결론되었다. 외래유전자도입 DM 생쥐로부터 EMG와 조직구조 데이터는 비정상이 경등도 근질환의 전형적인 수준까지 감소되었음을 입증하지만, DM 생쥐는 인간 디스트로핀 결손형 근이영양증(dystrophinopathy)에서 통상적으로 관찰되는 중증도 비정상을 보였다. 외래유전자도입 DM 생쥐는 또한, 치료되지 않은 mdx 생쥐와 대조에 비하여 뚜렷한 움직임 수준을 보였다.
디스트로핀 유전자

Description

망막 디스트로핀 외래도입유전자 및 이의 이용 방법{RETINAL DYSTROPHIN TRANSGENE AND METHODS OF USE THEREOF}
관련된 출원
본 출원은 2004년 7월 16일자로 제출된 가출원 60/588,700; 2004년 9월 9일자로 제출된 가출원 60/608,252; 2004년 9월 24일자로 제출된 가출원 60/613,026에 우선권을 주장한다.
서열 목록
본 출원은 컴퓨터 판독가능 양식 및 서류 양식으로 서열 목록을 포함한다. 컴퓨터 판독가능 양식 사본은 34444.txt Copy 1과 34444.txt Copy 2로 표기된다. 이들 사본은 서로 일치하고, 본 명세서에 포함된 서열 목록의 서류 양식 사본과 일치한다. 이들 각 서열 목록은 본 출원에 참고로서 통합된다.
본 발명의 분야
본 발명은 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)(DMD)에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 DMD에 대한 신규한 모형 및 DMD에 대한 치료제에 관계한다. 이보다 더욱 구체적으로, 본 발명은 신규한 외래도입유전자(transgene), 상기 외래도입유전자를 포함하는 벡터, 상기 외래도입유전자를 동물 DNA 내에 통합하여 디스트로핀(dystrophin)의 발현을 유도하는 방법에 관계한 다. 이보다 더욱 구체적으로, 본 발명은 신규한 외래도입유전자를 이용한 DMD의 생체내 치료에 관계한다.
뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)(DMD)은 소년들에게 가장 흔히 나타나는 신경근육 질환이다. 이는 10대에 심각한 무능력을 유발하고 20대 초중반에 치명적인 심장이나 호흡기 부전을 유발하는 진행성 근육 퇴화로 특성화되는 퇴행성 X-연관된 질환(X-linked disease)이다. 현재, 수명을 연장하거나, 또는 상기 질환의 임상적 과정을 현저하게 변화시킬 수 있는 치료제는 없다. 표준 치료는 주로, 환자의 전반적인 건강을 유지하고 삶의 질을 개선하는데 집중된다. 복수의 연구에서 글루코코르티코이드(가령, 프레드니솔론)가 근육 강도 감퇴를 완화시키는 것으로 밝혀지긴 했지만, 이들의 효과는 상대적으로 짧고(18-36 개월) 상기 질환의 임상적 과정을 변화시키지 못한다.
디스트로핀 유전자에서 변이가 디스트로핀 발현의 부재를 유발하고, 이는 DMD를 유발한다. 디스트로핀의 427 kDa 동등형은 내부 막을 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)에 연결하고, 근육 활동 동안 근초(sarcolemma)를 안정화시키는 것으로 생각된다. 디스트로핀이 없으면, 내부 막은 칼슘 이온의 유입을 가능하게 하는 기계적 안정성(mechanical stability)을 상실하고, 궁극적으로 근섬유 괴사가 유발된다.
디스트로핀은 N-말단 액틴-결합 도메인, 24개의 스펙트린(spectrin)-유사 반복을 보유하는 막대 도메인(rod domain), 시스테인-풍부한 도메인, C-말단 도메인 으로 구성되는 멀티도메인 단백질이다. 2개의 후자 도메인은 DAP(디스트로핀 연관된 단백질) 복합체의 단백질 및 신트로핀(syntrophin)에 결합한다. 디스트로핀 유전자의 79개 엑손의 택일적 절단접합은 71 kDa에서부터 전장 427 kDa까지 여러 디스트로핀 동등형을 생성한다. 적어도 7개의 독립된 프로모터가 세포-특이적 방식으로 발현되는 7개의 상이한 디스트로핀 동등형의 전사를 유도한다.
mdx 생쥐가 인간 DMD에 대한 유전자 모형으로서 이용되고 있다. mdx 생쥐는 출생이후 첫 6주 동안 근이영양증(muscular dystrophy)의 징후를 보이지만, 인간에서 DMD와 달리, 이들의 후속 질환 과정은 경등도이다. 성체 mdx 생쥐의 다리 근육은 인간 DMD에서 관찰되는 현저한 약화 또는 심각한 진행성 퇴행을 보이지 않는다. mdx 생쥐 격막(diaphragm)은 인간 DMD 근육에서와 필적하는 퇴행과 섬유증을 보이긴 하지만, 이들 생쥐는 호흡기 손상을 겪지 않고 정상적인 수명을 갖는다.
유트로핀(utrophin, utrn)은 mdx 생쥐에서, 디스트로핀-연관된 단백질과 상호작용하고 근육 디스트로핀의 부족을 보충하는 디스트로핀의 상염색체 동족체(autosomal homologue)이다. 유트로핀의 최대 상향조절을 보이는 근육은 최소의 병리학적 변화를 나타낸다. 하지만, 이런 보충적 치환은 인간에서 나타나지 않는데, 이것이 mdx 생쥐와 인간 DMD 사이의 표현형적 차이를 설명할 수 있을 것으로 생각된다.
따라서, 당분야에는 인간 DMD와 동일한 표현형적 특징과 임상적 결과를 나타내는 인간 DMD의 유전자 모형이 필요하다. 더 나아가, 당분야에는 디스트로핀 또는 이의 동족체를 발현하는 유전자가 필요하다. 더 나아가, 당분야에는 디스트로핀 또 는 이의 동족체를 발현하는 유전자를 포함하고, 상기 디스트로핀 유전자 또는 이의 동족체가 발현되고 근육 디스트로핀의 부족이 보충되도록 동물 게놈을 형질감염시킬 수 있는 벡터가 필요하다. 더 나아가, 디스트로핀 또는 이의 동족체를 발현하는 DNA로 형질감염된 세포를 이용하여 DMD를 치료하는 방법이 필요하다. 더 나아가, 디스트로핀 또는 이의 동족체를 발현하는 유전자에 의해 발현되는 분리된 단백질을 이용하여 DMD를 치료하는 방법이 필요하다. 최종적으로, 병든 동물의 게놈을 형질감염시키고 디스트로핀 또는 이의 동족체를 발현하며 근육 디스트로핀의 부족을 보충하는 벡터를 이용하여 DMD를 치료하는 방법이 필요하다.
본 발명의 요약
본 발명은 선행 기술에 내재된 이들 문제점을 극복하고 격별한 최신의 개선을 제공한다. 전체적으로, 본 발명의 한 측면에서 인간 망막 디스트로핀의 동등형 및 적절한 조절 요소를 포함하는 분리된 외래도입유전자(Dp260)가 제시된다. 본 발명의 다른 측면에서 동물의 게놈 내로 삽입을 위한 벡터에 상기 Dp260 외래도입유전자를 통합 또는 삽입하여 상기 동물이 망막 디스트로핀 단백질을 발현하도록 하는 방법이 제시된다. 상기 동물은 바람직하게는, 포유동물에서 선택되고, 더욱 바람직하게는, 인간, 생쥐, 개, 말에서 선택되고, 가장 바람직하게는, 인간이다. 본 발명의 관련된 측면에서 Dp260 외래도입유전자를 포함하는 동물이 제시된다. 본 발명의 또 다른 측면에서 Dp260 외래도입유전자는 동물에서 근이영양증에 대한 유전자 요법에 이용되는 골수세포와 근원세포(myoblast)를 형질전환하는데 이용될 수 있다. 적절하게는, 동물은 포유동물이다. 더욱 적절하게는, 동물은 생쥐, 개, 말, 인간에서 선택된다. 본 발명의 다른 측면에서 Dp260 외래도입유전자는 근이영양증에 대한 다른 유전자 요법을 위하여 다른 적절한 벡터에 이용되거나, 또는 다른 적절한 형질감염 방법, 예를 들면, 리포펙션(lipofection)과 함께 이용된다. 본 발명의 다른 측면에서 Dp260에 의해 발현되는 단백질은 이를 필요로 하는 동물에 투여된다.
본 발명의 한 구체예는 인간 Dp260의 DNA 서열로부터 작제된다. 인간 Dp260은 디스트로핀의 동등형이고, 디스트로핀 유전자의 독특한 최초 엑손 R1 내지 엑손 30의 택일적 절단접합으로 생성된다. 인간 망막 디스트로핀은 시스테인-풍부한 C-말단 및 디스트로핀에서 발견되는 막대-유사 도메인의 대부분을 포함하지만, 디스트로핀의 N-말단 액틴-결합 도메인이 부재한다. 부가적인 2차 액틴-결합 도메인은 인간 Dp260의 스펙트린 반복(spectrin repeat)에 위치한다. 인간 Dp260은 정상적으로, 망막에서 발현되고, 액틴 및 다른 디스트로핀-관련된 단백질과 함께 위치한다. 이는 또한, 다수의 디스트로핀 기능을 공유한다. 이런 구체예에서, 외래도입유전자는 인간 망막 디스트로핀 및 적절한 조절 요소로부터 작제될 수 있다. 적절한 인간 Dp260 서열은 ATCC 클론 57670, 57672, 57674, 57676으로부터 유래되고, 당분야에 공지된 기술의 이용으로 플라스미드 내에 직접 클론될 수 있다. 본 발명에서, 외래도입유전자로서 이용하기 적합한 DNA 서열은 인간 Dp260과 동일한 기능을 보유해야 한다, 더욱 바람직하게는, 외래도입유전자의 Dp260 부분의 DNA 서열은 인간 Dp260과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 99-100% 서열 동일성을 보유해야 한다. 본 발명의 외래도입유전자 서열은 또한, 디스트로핀의 택일적 절단접합에 기인한 동등형일 수도 있다. 본 발명의 목적에 유용한 디스트로핀의 이와 같은 택일적으로 절단접합된 한가지 형태는 디스트로핀 엑손 71을 포함한다. 바람직한 형태에서, 최종 외래도입유전자는 상기 외래도입유전자의 발현을 조장하기 위하여 Dp260 서열의 상류에 프로모터와 인핸서 서열 역시 포함한다. 선호되는 조절 요소에는 생쥐 근육 크레아틴 키나아제(mouse muscle creatine kinase, MCK) 프로모터와 인핸서 및 조절 요소로서 생쥐 MCK 엑손 1과 2가 포함된다. 외래도입유전자 발현은 일정한 세포주 내로 외래도입유전자의 안정적인 형질감염, 이후, 단백질 산물의 염기서열분석으로 검사된다. 절단접합에서 오류는 정확한 절단접합 부위의 엑손 수용자 스코어(exon acceptor score)를 개선하는 통상적인 특정부위 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)에 의해 수정된다. 다른 바람직한 형태에서, 외래도입유전자는 생성되는 전사체의 적절한 안정성을 담보하는 추가의 조절 부위를 포함한다. 이와 같은 하나의 조절 부위는 적절한 폴리아데닐화(polyadenylation)를 담보하기 위하여 상기 구조체의 3' 말단에 부착된 소 성장 호르몬(BGH) 폴리 A 신호 서열이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 다른 세포를 형질감염하는데 적합한 벡터 내에, 앞서 기술된 Dp260 외래도입유전자 및 이와 연관된 조절 요소를 포함한다. 적절하게는, 상기 벡터는 디스트로핀의 기능과 유사한 기능을 보유하는 단백질을 발현하는 DNA 서열을 포함한다. 적절하게는, 상기 벡터에 이용되는 DNA 서열은 인간 Dp260과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 99-100% 서열 동일성을 보유한다. 일부 바람직한 형태에서, 상기 벡터는 인간 디스트로핀 엑손 71을 보유하는 형태의 인간 Dp260 역시 포함한다. 더욱 바람직한 형태에서, 상기 벡터는 앞서 기술된 바와 같이, 프로모터, 인핸서, 폴리 A 신호 부위와 같은 조절 요소 역시 포함한다. 상기 벡터는 다양한 상업적으로 구입가능한 플라스미드, 아데노바이러스(adenoviruse) 또는 렌티바이러스(lentiviruse)일 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에는 Dp260 외래도입유전자로 형질감염된 동물이 포함된다. 바람직한 형태에서, 형질감염에 이용되는 Dp260은 디스트로핀과 유사한 기능을 갖는 단백질을 발현하고, 바람직하게는, Dp260은 인간 Dp260이다. 상기 동물의 게놈은 인간 Dp260과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 99-100% 서열 동일성을 보유하는 DNA 서열의 적어도 하나의 사본을 포함해야 한다. 일부 형태에서, 동물은 그들의 게놈 내에 위치하는 디스트로핀 엑손 71을 보유하는 Dp260 서열의 적어도 하나의 사본을 보유한다. 동물은 바람직하게는, 포유동물이고, 더욱 바람직하게는, 인간, 생쥐, 말, 개에서 선택된다.
본 발명의 다른 구체예에서, Dp260 외래도입유전자는 제한 절단(restriction digest)으로 플라스미드로부터 외래도입유전자를 자유롭게 하고 이를 동물의 난모 세포(oocyte)에 직접 주입하는 단계를 수반하는 미세주입(microinjection) 과정으로 동물의 게놈 내에 삽입된다. 외래도입유전자가 게놈 내에 통합된 동물은 염기서열분석과 PCR 반응을 비롯한 적절한 통상적인 방법으로 확인된다. 적절하게는, 이들 동물은 근육 세포에서 Dp260을 발현하는데, 이러한 특성은 PCR과 웨스턴 블랏팅(western blotting)과 같은 통상적인 기술을 이용하여 검사할 수 있다. 이런 구체예가 도움이 되는 동물은 인간, 생쥐, 개, 말 등이다. 이런 구체예의 한가지 실례에서, 선호되는 인간 Dp260 외래도입유전자는 상기 Dp260 외래도입유전자의 DM 생쥐 난모 세포 내로 주입, 이후 mdx와 유트로핀 적중(knockout) 생쥐와의 일련의 교배에 의해 이중 변종(DM) 생쥐의 게놈 내로 삽입되었다. 물론, 생쥐는 다른 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스의 이용 및 나신(naked) DNA의 전기천공을 비롯한 임의의 통상적인 방법을 통하여 형질감염될 수도 있다. 형질전환되지 않은 DM 생쥐는 인간에서 근이영양증과 유사한 생리 증상을 보이고, 디스트로핀 및 이의 뮤린 유사체, 유트로핀을 생산하지 않는다. 부가적으로, DM 생쥐는 중증 표현형, 짧은 수명, 근육에서 높은 수준의 괴사 및 노화됨에 따라 근이영양증의 징표인 복합 연속 방전(complex repetitive discharge)(CRD)의 증가된 발병률을 보인다. 대조적으로, Dp260 외래도입유전자를 발현하는 DM 생쥐(DM/Tg+)는 경등도 근질환의 증상과 정상 수명을 보인다. 부가적으로, DM/Tg+ 생쥐는 DM 생쥐에서 관찰되는 중증 척추 만곡(흉추만곡증) 또는 다리 근육 약화를 보이지 않는다. 또한, 이들은 노화됨에 따라, 낮아진 수준의 괴사 및 낮아진 CRD 발병률을 보인다. DM 생쥐와 DMD을 겪는 인간 개체 사이의 유사성으로 인하여, DM 생쥐는 상기 질환에 대한 이상적인 모형인 것으로 생각된다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, Dp260 외래도입유전자는 생쥐, 개, 말, 인간으로부터 추출된 세포를 안정적으로 형질감염시키는데 이용된다. 이는 선별가능 마커(즉, 네오마이신 내성)를 통합하는 렌티바이러스 벡터의 이용으로 수행될 수 있다. 적절하게는, 형질감염된 세포는 근원세포인데, 그 이유는 이들 세포가 근육 세포로 분화되기 때문이다. 더욱 적절하게는, 형질감염된 세포는 골수세포이다, 이보다 더욱 적절하게는, 형질감염된 세포는 SP(side population) 골수세포이다, 가장 적절하게는, 형질감염된 세포는 Lin-, Sca+, Kit+ 세포-표면 마커를 갖는 SP(side population) 세포이다. 이들 형질감염체(transfactant) 세포는 형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS)와 같은 공지된 방법을 통하여 확인가능하다. 이들은 Hoechst 염료를 배제하는 능력에 의해 정의될 수도 있다. 부가적으로, 이들 형질감염체 세포는 근육 세포로 분화될 가능성에서 증가를 나타낸다. 이들 세포의 형질전환 방법에는 플라스미드, 아데노바이러스, 렌티바이러스와 같은 벡터의 이용, 더욱 바람직하게는, 나신 DNA의 전기천공이다. Dp260의 안정적인 발현은 PCR과 웨스턴 블랏팅 실험의 이용을 통하여 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 유전자 요법의 이용을 통하여 동물 내에 Dp260을 제공하는 방법이 제시된다. 동물은 바람직하게는, 포유동물이고, 더욱 바람직하게는, 인간, 생쥐, 개, 말에서 선택된다. 이런 치료의 목적은 근이영양증 증상의 완화이다. 이런 구체예의 한가지 바람직한 형태에서, 세포는 환자로부터 분리되고, 가급적, 인간 Dp260과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 이보다 더욱 바람직하게는 적어도 97%, 가장 바람직하게는 99-100% 서열 동일성을 보유하는 DNA 서열을 포함하는 외래도입유전자로 안정적으로 형질감염된다. 상기 방법의 일부 바람직한 형태에서, 이들 세포는 인간 디스트로핀 엑손 71을 보유하는 형태의 Dp260을 포함하는 DNA 서열로 형질감염된다. 본 발명의 바람직한 외래도입유전자는 Dp260의 안정적인 발현을 위한 적절한 조절 요소 역시 포함한다. 적절하게는, 형질감염되는 세포는 근원세포 또는 골수세포이다. 더욱 적절하게는, 이들 세포는 앞서 기술된 바와 같이 상기한 세포 표면 마커를 보유하고, 근육 세포로 분화될 가능성이 특히 높은 SP(side population) 골수세포이다. 가장 적절하게는, 이들 세포는 치료를 받는 환자로부터 채취되고, 체외에서 Dp260 외래도입유전자로 형질감염되고, 자가 조직이식에서 동일 환자로 재투입된다. 이러한 자가 조직이식은 형질감염된 세포가 환자 자신의 세포이기 때문에, 면역 반응이 발생하는 가능성을 감소시키고, 또한 면역억제의 필요성을 제거한다. 형질감염된 세포의 자가 골수 이식조직은 질병의 과정 동안 다양한 시점에 이용될 수 있다. 골수 세포가 손상이 심한 세포에 더욱 강하게 부착되기 때문에, 상기 절차는 장기간동안 근이영양증으로 고생하는 노인 환자에게 적합하다. 또한, 이러한 과정은 환자의 평생 동안 여러 시점에 수행될 수 있는데, 그 이유는 이들 자가 골수 이식조직의 효과가 부가적이어서 건강하고 기능적인 근육량을 증가시키기 때문이다.
중요하게는, 본 발명은 면역학적 관점에서 유익하다. 일반적으로, 임의의 유형의 유전자 치료에서 장애물은 외래도입유전자 산물의 면역원성(immunogenicity)이다. 전장 디스트로핀은 상기 외래도입유전자의 발현 실패를 유발할 수 있는 면역 반응을 유도할 수 있다(1). Dp260 외래도입유전자의 독특한 특성은 인간 디스트로핀의 자연 발생 동등형을 발현한다는 것이다. Dp260 단백질은 망막에서 주로 발현되고 다른 조직에서 소량으로 발현된다. 이런 이유로, 망막 디스트로핀은 자연 동등형이다. 외래도입유전자로부터 Dp260의 도입은 특히, Dp260의 발현에 영향을 주지 않는 엑손 30의 상류가 결실된 환자에서 면역 반응을 유도하지 않는다. 이는 전장 디스트로핀 외래도입유전자 및 스펙트린 도메인 코딩 영역의 대부분이 제거되거나 파괴되는 마이크로-디스트로핀 외래도입유전자에 비하여 명백한 이점이다. 또한, 마이크로디스트로핀은 면역 반응을 잠재적으로 유도하는데, 그 이유는 상기 단백질이 신항원(neoantigen)으로 간주될 수 있기 때문이다(상기 마이크로디스트로핀 단백질은 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy) 환자에게 이질의 서열을 포함한다). 본 발명의 Dp260 외래도입유전자는 유전자 요법에서 이러한 중요한 장벽을 성공적으로 제거한다.
본 명세서에는 아래의 정의가 적용된다: “서열 동일성(sequence identity)”은 당분야에 공지된 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열, 다시 말하면, 참고 서열 및 상기 참고 서열과 비교되는 소정의 서열 사이의 관계를 의미한다. 서열 동일성은 소정의 서열과 참고 서열을 최적으로 정렬하여 이들 서열 가닥 사이의 정합(match)에 의한 결정에서 최대의 서열 유사성(sequence similarity)을 달성한 이후, 이들 두 서열을 비교함으로써 결정된다. 이런 정렬이후, 서열 동일성은 위치별(position-by-position basis)로 확인된다, 가령, 이들 서열은 특정 위치에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 동일한 경우에 상기 위치에서 “동일”하다. 이후, 이들 동일한 위치의 총수는 참고 서열에서 뉴클레오티드 또는 잔기의 총수로 나눠지고 서열 동일성 %가 제공된다. 서열 동일성은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)에 기술된 것들을 비롯한 공지된 방법으로 편의하게 산정될 수 있다. 서열 동일성을 결정하는데 선호되는 방법은 검사되는 서열 사이에 최대 정합을 제공하도록 설계된다. 서열 동일성을 결정하는 방법은 소정의 서열 사이의 서열 동일성을 결정하는 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 프로그램으로 체계화된다. 이러한 프로그램의 실례에는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. BLASTX 프로그램은 NCBI와 다른 출처(BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVINLMNIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990))로부터 공개적으로 입수가능하다. 이들 프로그램은 소정의 서열과 참고 서열 사이에 최대 수준의 서열 동일성을 달성하기 위하여 디폴트 갭 가중(default gap weight)을 이용하여 서열을 최적으로 정렬한다. 예로써, 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% “서열 동일성”을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드는 소정의 폴리뉴클레오티드 서열이 참고 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드 마다 최대 5개의 점 돌연변이(point mutation)를 보유한다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드에, 참고 서열의 전체 뉴클레오티드 중에서 최대 5%의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 결실되거나 치환되고, 또는 참고 서열의 전체 뉴클레오티드의 최대 5% 비율까지 뉴클레오티드가 참고 서열에 삽입된다. 참고 서열의 이들 돌연변이는 참고 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 종결 위치(terminal position)에서 또는 이들 종결 위치 사이의 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열에서 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 또는 참고 서열 내에서 하나이상의 연속 그룹으로 산재된다. 이와 유사하게, 참고 아미노산 서열과 적어도 95% “서열 동일성”을 갖는 소정의 아미노산 서열을 보유하는 폴리펩티드는 소정의 폴리펩티드 서열이 참고 아미노산 서열의 각 100개의 아미노산 마다 최대 5개의 아미노산 변형을 보유한다는 것을 의미한다. 다시 말하면, 참고 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 소정의 폴리펩티드 서열을 획득하기 위하여, 참고 서열의 전체 아미노산 잔기 중에서 최대 5%의 아미노산 잔기가 다른 아미노산으로 결실되거나 치환되고, 또는 참고 서열의 전체 아미노산의 최대 5% 비율까지 아미노산이 참고 서열에 삽입된다. 참고 서열의 이들 변형은 참고 아미노산 서열의 아미노 또는 카르복실 종결 위치에서 또는 이들 종결 위치 사이의 임의의 위치에서 발생하고, 참고 서열에서 잔기 사이에 개별적으로 또는 참고 서열 내에서 하나이상의 연속 그룹으로 산재된다. 적절하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존성 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)으로 구별된다. 하지만, 보존성 치환은 서열 동일성을 결정할 때 정합으로 간주되지 않는다. 또한, 특정 단백질을 코딩하는 DNA는 코드의 축퇴성(degeneracy)로 인하여, 뉴클레오티드 서열에서 상이하지만 여전히 동일한 단백질을 발현 또는 코딩할 수 있다. DNA 코딩에서 이러한 경미한 변형은 당업자에 의해 충분히 이해되고, 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서, “형질감염(transfection)”은 핵산-매개된 유전자 전달에 의해, 예로써, 발현 벡터를 통한 핵산의 수용자 세포(recipient cell)로의 도입을 의미한다. 본 명세서에서, “형질전환(transformation)”은 외인성 DNA 또는 RNA의 세포 유입(cellular uptake)의 결과로써 세포의 유전형이 변하는 과정을 의미하는데, 가령, 형질전환된 세포가 디스트로핀 단백질의 재조합 형태를 발현하거나, 또는 전이된 유전자로부터 항-센스 발현의 경우에 상기 디스트로핀 단백질의 자연-발생 형태의 발현이 교란된다.
본 명세서에서, “외래도입유전자”는 이러한 유전자가 도입된 외래유전자도입 동물 또는 세포에 부분적으로 또는 완전하게 이질성, 다시 말하면, 외인성이거나, 또는 이러한 유전자가 도입된 외래유전자도입 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 상동하지만 이러한 유전자가 도입된 세포의 게놈을 변화시키는 방식으로 동물의 게놈 내로 삽입되거나 삽입되도록 설계된(가령, 이는 자연 유전자의 위치와 상이한 위치에 삽입되거나, 또는 이의 삽입이 적중을 유도한다) 핵산 서열(가령, 디스트로핀 단백질 또는 이의 안티센스 전사체를 인코딩하는 핵산 서열)을 의미한다. 외래도입유전자는 선별된 핵산의 최적 발현을 위하여 필요한 하나이상의 조절 서열 및 인트론과 같은 임의의 다른 핵산을 포함할 수 있다.
“벡터”는 상기 벡터에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 선호되는 벡터는 이들 벡터에 연결된 핵산의 자율적인 복제 및/또는 발현이 가능한 벡터이다.
“외래유전자도입” 동물은 아세포 수준(subcellular level)에서 정교한 유전자 조작, 예를 들면, 미세주입 또는 벡터를 통한 재조합 바이러스로 감염 또는 나신 DNA의 전기천공에 의해, 직접적으로 또는 간접적으로 획득되는 유전자 정보를 보유하는 세포를 포함하는 임의의 동물을 의미한다. 본 명세서에서, “외래유전자도입”은 고전적인 이종교배(crossbreeding) 또는 시험관내 수정(in vitro fertilization)을 포함하지 않고, 오히려 하나이상의 세포가 재조합 DNA 분자를 수용하는 동물을 나타낸다. 상기 분자가 동물의 크로모좀 내에 통합되는 것이 매우 바람직하긴 하지만, 본 발명에는 크로모좀외 복제 DNA 서열의 이용 역시 포함된다, 예를 들면, 상기 분자는 인공 효모 크로모좀 내로 조작될 수 있다. 적절하게는, 본 발명의 외래유전자도입 동물은 “생식세포주 외래유전자도입 동물”을 포함하는데, 이는 유전자 정보가 생식세포주(germ line cell)에 흡수되고 통합됨으로써 상기 정보를 후손에게 전달하는 능력을 갖는 외래유전자도입 동물을 의미한다. 후손이 이러한 정보의 일부 또는 전부를 실제로 보유하면, 이들 후손 역시 외래유전자도입 동물이다.
본 명세서에서, “핵산”은 데옥시리보핵산(DNA) 및 적절한 경우에, 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 상기 용어는 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체 역시 등가물(equivalent)로서 포괄하고, 구체예에서 단일(센스 또는 안티센스)-과 이중-가닥 폴리뉴클레오티드로 기술된다.
“안정적인 형질감염”은 형질감염된 세포의 게놈 내로 외래 DNA의 도입과 통합을 의미한다. “안정적인 형질감염체”는 게놈 DNA 내로 외래 DNA를 안정적으로 통합한 세포를 의미한다.
본 특허 또는 특허 출원은 적어도 하나의 색채 도면이나 사진을 포함한다. 색채 도면이나 사진을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원의 사본은 신청서를 제출하고 필요한 수수료를 납부하면 사무국에 의해 제공될 것이다.
도 1은 외래도입유전자의 작제에 이용된 모든 제한 부위를 표시하는 인간 Dp260 외래도입유전자 구조체의 개요도이다;
도 2a는 MCK 플라스미드 단독으로 형질감염된 근원세포와 비교하여, Dp260 외래도입유전자 구조체로 형질감염된 근원세포의 웨스턴 블랏 겔 분석 결과이다;
도 2b는 DM/Tg+ 생쥐와 DM 생쥐의 뒷다리 근육의 웨스턴 블랏 겔 분석 결과이다;
도 3a는 단클론 C-말단 특이적 항-디스트로핀으로 면역표지되고 Alexa-488 공액된 이차 항체로 검출되는, 8주령 DM/Tg+ 생쥐로부터 비장근(soleus muscle)의 횡단 절편의 사진이다;
도 3b는 단클론 C-말단 특이적 항-디스트로핀으로 면역표지되고 Alexa-488 공액된 이차 항체로 검출되는, 8주령 DM 생쥐로부터 비장근의 횡단 절편의 사진이다;
도 3c는 단클론 C-말단 특이적 항-디스트로핀으로 면역표지되고 Alexa-488 공액된 이차 항체로 검출되는, 16주령 DM/Tg+ 생쥐로부터 비장근의 횡단 절편의 사진이다;
도 4a는 DM/Tg+ 생쥐와 DM 생쥐의 상대적 크기와 형태를 비교하는 사진이다;
도 4b는 DM/Tg+ 생쥐의 방사선 x-레이 영상인데, 여기서 척추만곡(spinal curvature)은 측각 분석(goniometric analysis)으로 측정되었다;
도 4c는 DM 생쥐의 방사선 x-레이 영상인데, 여기서 척추만곡(spinal curvature)은 측각 분석(goniometric analysis)으로 측정되었다;
도 4d는 DM/Tg+ 생쥐의 자기 공명 영상(MRI) 연구 결과이다;
도 4e는 DM 생쥐의 MRI 연구 결과이다;
도 4f는 정상 대조 생쥐의 MRI 연구 결과이다;
도 5a는 DM/Tg+ 생쥐로부터 근전도 검사(EMG) 기록이다;
도 5b는 DM 생쥐로부터 EMG 기록이다;
도 5c는 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐가 노화됨에 따라 복합 연속 방전(complex repetitive discharge)을 보이는 근복 사분면(muscle belly quadrant)의 평균 수치 의 그래프이다;
도 5d는 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐가 노화됨에 따라 CRD의 평균 총수를 보여주는 그래프이다;
도 6a는 8주령 DM/Tg+ 생쥐의 비장근의 톨루이딘 블루(toluidine blue)-염색된 횡단 절편의 사진이다;
도 6b는 8주령 DM 생쥐의 비장근의 톨루이딘 블루(toluidine blue)-염색된 횡단 절편의 사진이다;
도 6c는 8주령 야생형 생쥐의 비장근의 톨루이딘 블루(toluidine blue)-염색된 횡단 절편의 사진이다;
도 7a는 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐의 장지신근(extensor digitorum longus muscle)에서 괴사 부위의 연령-상관된 비율을 정량하는 그래프이다;
도 7b는 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐의 비장근에서 괴사 부위의 연령-상관된 비율을 정량하는 그래프이다;
도 8a는 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐의 장지신근에서 집중된 핵(centralized nucleus)을 보이는 근섬유의 연령-상관된 비율을 정량하는 그래프이다;
도 8b는 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐의 비장근에서 집중된 핵(centralized nucleus)을 보이는 근섬유의 연령-상관된 비율을 정량하는 그래프이다;
도 9는 힘 측정판 굴절계(force plate actometer)를 이용하여 측정된 DM, DM/Tg+, 성체 mdx, 성체 C57BL/6J 생쥐의 운동 활동(locomotor activity)의 막대그래프인데, 여기서 각 오차 막대(error bar)에 대한 범위는 평균의 ± 1 표준 오 차(standard error)이고, 수평 점선은 DM/Tg+ 생쥐가 경험하는 3가지 운동 활동 세션에 대한 95% 신뢰 구간(confidence interval)을 나타낸다;
도 10에서는 모든 제한 부위 및 주석이 붙은 목적 영역을 포함하는 Dp260 외래도입유전자를 도시한다.
아래의 실시예에서는 본 발명에 따른 바람직한 방법을 기술한다. 하지만, 이들 실시예는 예시의 목적으로 제공되며, 본 발명의 전체 범위를 결코 한정하지 않는다.
실시예 1
인간 Dp260 외래도입유전자 구조체의 생성과 분석
MCK 엑손 1(SEQ ID NO: 2), 인트론 1(SEQ ID NO: 3) 및 엑손 2의 5' 비번역 부분을 포함하는 엑손 2의 일부분(SEQ ID NO: 4)과 함께, 생쥐 근육 크레아틴 키나아제(MCK) 프로모터와 인핸서(SEQ ID NO: 1)가 최종 외래도입유전자를 생성하는데 이용되었다. 첫 번째 엑손과 첫 번째 인트론의 일부를 포함하는 MCK의 조절 요소(SEQ ID NO: 5)는 pBluescript II SK 벡터(Stratagene, La Jolla, CA) 내로 직접 클론하였다. MCK ATG 개시 코돈까지, MCK 인트론 1과 엑손 2의 나머지 부분으로 구성되는 첫 번째 PCR 앰플리콘(SEQ ID NO: 6)은 PCR로 증폭하고 NdeI 제한 부위를 생성하였다. 이는 인간 게놈 PCR 앰플리콘의 NdeI 제한 부위에 결찰을 가능하게 하였다. 두 번째 PCR 앰플리콘은 망막 디스트로핀 특유의 첫 번째 엑손 R1의 ATG 개시 코돈으로 시작하고 인트론 R1로 연속되며 엑손 30(SEQ ID NO: 7)에서 종결되는 데, 이는 MCK 개시 코돈이 정상적으로 위치하는 정확한 위치에 배열되었다. 상기 두 번째 PCR 앰플리콘(SEQ ID NO: 7)은 조작된 FspI 부위 역시 포함하였다. 세 번째 PCR 산물은 인간 디스트로핀 cDNA 클론 cDMD 4-5a(ATCC No. 51670)를 이용하여 증폭하였다. 상기 산물은 5' 말단에 FspI 제한 부위 및 3' 말단에 자연 발생 AatII 부위를 보유하도록 설계되고, 상기 구조체에 추가되었다. 인간 디스트로핀 코딩 서열의 나머지 부분은 자연 발생 제한 부위를 이용하여 3가지 인간 디스트로핀 cDNA 클론, cDMD 5b-7, 8, 9-14(각각, ATCC No. 57672, 57674, 57676)를 상기 구조체에 결찰시켜 만들었다. 상기 전사체의 적절한 안정성과 폴리아데닐화를 담보하기 위하여, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리 A 신호 서열(SEQ ID NO: 8)(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 상기 구조체의 3' 말단에 추가하였다. 상기 신호 서열은 PCDNA 3.1 Hygro 플라스미드 프라이머(Invitrogen.com website)를 이용한 PCR 산물로부터 생성하였다. 본 발명에서 이들 프라이머 서열은 각각, SEQ ID NO: 21과 22로서 포함된다. SEQ ID NO: 21은 BGH-Afl, 다운 프라이머(down primer) 내에 Af1III 제한 부위를 보유한다. SEQ ID NO: 22는 BGH-Not, 업 프라이머(up primer) 내에 NotI 제한 부위를 보유한다. 이는 도 1에 도시된 구조체(SEQ ID NO: 9)를 생성하였는데, 상기 도면에는 작제에 이용된 모든 제한 부위가 기재되었다.
ABI 377 자동화 염기서열분석장치(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용하여 Dp260 외래도입유전자의 전체 코딩 영역(SEQ ID NO: 10)의 서열 정확성(sequence accuracy)을 확인하였다. 야생형 아미노산 서열을 유지하는 2개의 침묵 돌연변이(silent mutation)가 발견되었다. 서열에서 2개의 다른 변화가 발견되 었는데, 제조업체의 프로토콜에 따른 특정부위 돌연변이유발(Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)로 야생형 서열로 환원시켰다. 염기서열분석에서, 상기 구조체는 엑손 71(SEQ ID NO: 11)이 부재하는 것으로 밝혀졌다. 이는 인간과 생쥐 유전자에서 정상적인 절단접합 변이체의 결과이고, 신트로핀 결합 부위가 상기 엑손의 하류에 위치한다. 인간 Dp260 외래도입유전자 전사체와 단백질 산물의 발현은 Jaynes et al., Mol. Cell. Biol. 6:2855-2865 (1986)의 방법에 따라, 분화된 근육 세포주인 MM14 근원세포 세포주(Hauschka, University of Washington) 내에 안정적인 형질감염으로 검사하였다.
MM14 근원세포 세포주 내로 외래도입유전자의 안정적인 형질감염을 확립한 이후, cDNA PCR 산물 분석과 염기서열분석의 결과는 외래유전자도입 mRNA의 대부분이 MCK 엑손 1에서 디스트로핀 엑손 30으로 직접적으로 절단접합되고, MCK 엑손 2/엑손 R1 분절(SEQ ID NO: 12)이 결실된다는 것을 입증하였다. 정보 내용 분석은 MCK 엑손 2 수용자의 훨씬 약한 6.2 비트 스코어(bit score)와 비교하여 12.1 비트의 강한 엑손 30 수용자 부위 스코어(acceptor site score)를 제시하였다. MCK 인트론 1의 3' 영역에서 3개의 뉴클레오티드는 특정부위 돌연변이유발(Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene)에 의해 변형되어 엑손 2 수용자에 대한 비트 스코어를 12.4 비트로 증가시키고 이를 더욱 강한 절단접합 수용자 부위로 변모시켰다. 후속의 형질감염 실험은 상기 RNA 산물의 정확한 절단접합을 확증하였다. 돌연변이된 뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 5 내에 위치 6363, 6364, 6368(도 10에서 별표로 표시됨)에서 발견되는데, 이들 모두 "g"에서 "t"로 돌연변이되었다. 발 현된 단백질(SEQ ID NO: 13)은 형질감염된 근원세포로부터 만들어진 단백질 제조물의 웨스턴 블랏(western blot)을 이용하여 분석하였다. 웨스턴 블랏 결과는 형질감염된 세포에서, Dp427에 비하여 Dp260 단백질의 강한 발현을 입증하였다(도 2a). 삽입체가 없는 MCK 플라스미드를 이용한 대조 형질감염은 Dp260 단백질의 발현을 보이지 않고, Dp427 근육 디스트로핀의 발현을 보였다.
실시예 2
DM 인간 Dp260 외래유전자도입 생쥐의 생산
상기 인간 Dp260 외래도입유전자 구조체는 Endo Free Plasmid Kit(Quiagen, Valencia, CA)로 추출하고, 난모 세포(oocyte) 주입에 앞서 NotI 제한 절단으로 상기 플라스미드 벡터로부터 분리시켰다. 상기 구조체는 200개의 난자에 주입하고, 이후, 이들 난자는 상상 임신(psuedopregnant) 암컷에 이식하고 출산하고 이유시켰다. Dp260 외래도입유전자에 대한 유전자형판별(genotyping)에서, 인간 Dp260 외래도입유전자를 통합하는 2마리 생쥐가 확인되었다. 유전자형판별은 400 bp 이하의 외래도입유전자-특이적 산물(SEQ ID NO: 16)을 증폭하는 MCK-특이적 전방 프라이머(SEQ ID NO: 14)와 디스트로핀 인간 엑손 30-특이적 역 프라이머(SEQ ID NO: 15)를 이용한 PCR 반응으로 수행하였다. 이들 두 계통의 생쥐는 외래도입유전자의 강한 발현을 보였는데, 생쥐 게놈 내로 삽입 위치 및 생쥐 게놈 내로 삽입된 외래도입유전자의 사본 수에서 상이하다. TgN(DMD 260)1Raw 외래도입유전자를 보유하는 것으로 확인된 이들 외래유전자도입 생쥐는 이후, Tg+ 동물이라 한다.
유트로핀 적중 utrn-/- 생쥐(Stephen Hauschka, University of Washington)는 유트로핀 유전자의 엑손 64에 삽입된 네오마이신(neo) 내성 유전자의 존재 또는 부재에 기초한 PCR 반응을 이용하여 확인하였다. 삽입된 neo 유전자(SEQ ID NO: 18)의 서열 및 유트로핀 유전자의 엑손 64(SEQ ID NO: 19)의 3' 말단으로부터 개발된 프라이머를 이용하여 312 bp 앰플리콘(SEQ ID NO: 17)을 생성하였다. 야생형 대립유전자는 5' 말단에 추가의 전방 프라이머(SEQ ID NO: 20)를 이용하여 확인하고, utrn 적중 생쥐에서 결실시켰다. utrn 적중을 위한 컨지닉(congenic) C57BL/6J 계통 및 Tg+ 생쥐는 10세대 동안 C57BL/6J 생쥐에 역교배(backcrossing)로 생산하였다.
외래도입유전자를 포함하거나 포함하지 않는 DM(utrn -/-, mdx) 수컷은 utrn 적중 생쥐, Tg+ 생쥐, mdx 생쥐(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)를 이용한 일련의 교배로 생산하였다. mdx 돌연변이를 보유하는 생쥐는 Amalfitano & Chamberlain, Muscle & Nerve 19: 1549-1553 (1996)에 기술된 바와 같이 ARMS PCR 검사를 이용하여 확인하였다. mdx 암컷과 utrn -/- 수컷의 첫 번째 교배는 암컷을 생산하고, 이들 암컷은 이후 Dp260 Tg+ 수컷과 교배하였다. 이는 암컷 보균자(XmdX, X+, utrn -/-, Tg+)를 생산하고, 이들은 동형접합성 utrn -/- 수컷에 교배하여 인간 Dp260 외래도입유전자를 포함하거나 포함하지 않는 DM 수컷(XmdxY, utrn -/-)을 생산하 였다. 이들 교배는 48마리의 DM 생쥐 및 48마리의 DM/Tg+ 생쥐를 결과하였다.
실시예 3
웨스턴 블랏팅
인간 MCK/Dp260 Tg 또는 MCK 플라스미드 단독으로 안정적으로 형질감염된 분화된 MM14 근원세포 세포 배양액을 수집하였다. 단백질은 Dounce 균질화기에서 1 ㎖의 균질화 완충액(50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, l mM EDTA, 0.04 ㎎/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 0.0025 ㎎/㎖ 펩스타틴(pepstatin) A, 0.025 ㎎/㎖ 레우펩틴(leupeptin), 1 mM 페닐메틸 술포닐플루라이드(phenylmethyl sulfonylfluoride), 0.1% Triton X100)에서 균질화로 3백만개의 세포로부터 추출하였다. 근육 조직 역시, DM/Tg+ 생쥐와 DM 생쥐의 뒷다리로부터 수집하였다(100 ㎎). 상기 조직은 동결시키고 냉각된 절구와 절구공이를 이용하여 1 ㎖의 균질화 완충액에서 균질화시켰다. 균질액은 4℃에서 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 세포 잔해를 침전시켰다.
4X 적하 완충액(loading buffer)(Invitrogen)을 상층액에 첨가하고, 70℃에서 10분간 이들 단백질을 열 변성시켰다. NuPAGE Tris-Acetate SDS Gel System(Invitrogen)을 이용하여 24 ㎕의 분량을 4-8% 아크릴아마이드에서 분석하였다. 단백질은 Novex 챔버(Invitrogen) 내에 Hybond-C 초막(super membrane)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)으로 이전하였다. 상기 막은 4% 유제(milk)를 포함하는 Tris-NaCl-Tween 완충액(TNT) 내에 4℃에서 하룻밤동안 차단하여 비특이적 결합을 예방하였다. 이후, 막은 실온에서 일차 항체와 함께 2시간 동안 배양하였다. 근원세포 웨스턴 블랏의 경우에, 일차 항체(VIA4-2 A3, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)는 디스트로핀의 카르복시 말단의 마지막 17개의 아미노산에 대해 생성된 생쥐 단클론 IgM이었다. 뒷다리 근육 웨스턴 블랏의 경우에, 일차 항체는 디스트로핀 C-말단 특이적 IgG(MANDRA-1, Sigma)이었다.
근원세포 제조를 위하여, 상기 막은 TNT 완충액을 이용하여 여러 번 세척하였다. 이차 항체(항-생쥐 IgM, 과산화효소 공액됨, Sigma)를 실온에서 1시간동안, 또는 4℃에서 하룻밤동안 도포하였다. 추가의 세척이후, 막은 ECL(강화된 화학발광) 검출 용액(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)에 노출시키고, 이후 x-레이 필름에 노출시켰다. 뒷다리 근육 웨스턴 블랏의 경우에, 디스트로핀 단백질 밴드의 비색 시각화(colorimetric visualization)를 위하여 항-생쥐 IgG 알칼리성 포스파타아제 공액체(Sigma)와 BCIP/NBT(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-포스페이트/니트로블루 테트라졸륨 클로라이드(nitroblue tetrazolium chloride)) 키트(KPL, Gaithersburg, MD)를 함께 이용하였다.
생쥐 뒷다리 근육의 웨스턴 블랏 분석 결과는 DM/Tg+ 생쥐에서 Dp260의 강한 발현을 지시하는 반면, DM 생쥐로부터 뒷다리 근육의 웨스턴 블랏 분석 결과는 Dp260 발현을 지시하지 않았다.
실시예 4
면역세포화학( immunocytochemistry )과 조직 연구
새로 희생된 동물로부터 뒷다리는 털을 제거하고 인산염 완충액, pH 7.4 (PBS)에 녹인 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 4시간 내지 6시간동안 담갔다. 하나의 뒷다리로부터 비장근과 장지신근(extensor digitorum longus muscle)을 절제하고, 4℃에서 24시간 내지 48시간동안 고정시키고, 이후 파라핀에 포매시켰다. 그 다음, 이들은 잘게 절단하고 표준 조직학적 방법을 이용하여 톨루이딘 블루로 염색하였다. 반대쪽(contralateral) 다리로부터 근육을 1-2 ㎜3 블록으로 절단하고, Tokuyasu, Histochem J. 21:163-171 (1989)에 따라 수크로오스와 폴리비닐피롤리돈의 혼합물로 동결보호(cryoproteion)하고, 액체 질소에서 급속 동결시켰다. FCS가 부착된 Reichert Ultracut S 마이크로톰(microtome)을 이용하여 1.5 ㎕ 두께 횡단 절편을 수득하였다.
동결 절편은 0.2% 젤라틴과 0.5% 무지방 분유를 포함하는 TBS(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.001% NaN3, pH 7.6) 내에 4℃에서 하룻밤동안 차단하였다. 절편은 실온에서 TBS로 5분간 세척하고, 이후 차단 용액(blocking solution)에 희석된 일차 항체에서 90분간 배양하였다. 이용된 항체는 1:25 희석된 C-말단 특이적 단클론 항-디스트로핀(MANDRA-1)(Sigma), 또는 1:200 희석된 토끼 다클론 항-라미닌(laminin)(Sigma)이었다. 절편은 PBS에서 5분간 2회 씻어내고, 5% 염소 혈청을 포함하는 TBS에서 30분간 차단하고, TBS로 2회 씻어냈다. 이들은 Alexa-488 공액된, 종-특이적 이차 항체(Molecular Probes, Eugene, OR)와 함께 60분간 배양하고, 이후 씻어내고 관찰을 위한 표본으로 하였다. 라미닌-표지된 슬라이드는 핵을 가시화시키기 위하여 0.2 ㎎/㎖ 요오드화 프리피디엄(propidium iodide)으로 10분간 카운터염색하고, 이후 씻어내고 다시 표본으로 하였다. 영상은 CCD 카메라가 구비 된 Olympus BX-50 형광현미경(epifluorescence microscope)을 이용하여 기록하였다.
조직 절편의 정량적 분석을 위하여, 공개 도메인 NIH 영상 프로그램을 이용하여 매킨토시 컴퓨터에서 단면적(cross-sectional area)을 계수화하였다. 수치는 전체 근육 단면적에 대한 괴사/재생의 비율로서 표시하였다. 비-주변 핵(non-peripheral nucleus)을 보유하는 근섬유의 비율은 요오드화 프리피디엄과 항-라미닌으로 표지된 동결 절편의 디지털 영상을 이용하여 결정하였다. 평균간 차이는 스튜던트 t-검증(Student's t-test)을 이용하여 분석하였다.
면역조직화학 결과는 Dp260, Tg+ 생쥐에서, Dp260 단백질이 근초(sarcolemma) 막에 국지화된다는 것을 지시하였다. DM 생쥐는 디스트로핀을 보유하지 않았고, 국지화를 나타내지 않았다(도 3b). 8주령 DM/Tg+ 생쥐에서 형광 강도(fluorescence intensity)는 도 3a에 도시된 바와 같이 세포마다 변하지만, 16주령에는 도 3c에 도시된 바와 같이 더욱 균일하고 세포 막으로 더욱 국지화되는 것으로 나타났다.
근육의 조직 분석에서, Dp260 외래도입유전자를 포함하지 않는 DM 생쥐(도 6b)는 넓은 부위에서 근섬유 퇴행, 섬유증 및 대규모 괴사와 근육 조직의 염증을 지시하는 식세포에 의한 침윤을 보였다. 이런 병리가 DM/Tg+ 생쥐에서 Dp260 외래도입유전자의 발현에 의해 완전히 소멸되지는 않지만, 병든 부위가 DM 생쥐에서 관찰되는 것들보다 훨씬 국지적이고 제한적이다. DM/Tg+ 생쥐의 비장근의 외형은 야생형 연령-대응된 대조 동물의 비장근의 형태에 더욱 근접하였다(도 6c). 정량적 분석에서, 양쪽 유형에서 괴사 부위의 비율이 노화됨에 따라 감소하지만, 16주 시점에 DM/Tg+ 생쥐는 EDL과 비장근이 거의 괴사되지 않는 반면, DM 생쥐는 폐사 때까지 점진적으로 증가하는 근육 괴사를 보이는 것으로 나타났다. 중심에 집중된 핵을 갖는 근섬유의 이러한 비율은 골격근(skeletal muscle)에서 만성적인 퇴행과 재생의 마커이다. 이는 노화됨에 따라 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐 모두에서 증가하지만, DM/Tg+ 평균은 비장근과 EDL 근육 모두에서 연령-대응된 평균보다 유의하게 낮았다(p<0.05).
실시예 5
자기 공명 영상( MRI )과 방사선사진술
시상(Sagittal) MRI는 생쥐 용적 코일(volume coil) 및 아래의 파라미터: TR/TE = 2000/14 ms; 시야각(field of view) = 60 x 30 ㎜; 영상 매트릭스(image matrix) = 256 x 256 픽셀(pixel); 조각 두께(slice thickness) = 1 ㎜; 평균 수(number of average) = 2를 보유하는 스핀-에코 영상 연쇄(spin-echo imaging sequence)를 이용하여 horizontal bore 9.4 T Varian 시스템에서 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐를 대상으로 수행하였다. MRI는 DM 생쥐(도 4e)에서 관찰되는 중증 형태 손상이 DM/Tg+ 생쥐(도 4d)에서 관찰되지 않음을 입증하였다. DM 생쥐는 또한, 야생형 동물에 비하여 척추주위근(paravertebral muscle) 다발과 심근(myocardium) 모두의 두께에서 명백한 감소를 보였다(도 4f). DM/Tg+ 동물에서 이들 특징은 MRI에 의해 야생형 동물과 구별되지 않았다. DM/Tg+ 생쥐의 심장 근육의 너비는 DM 생쥐에서보다 두껍고 정상 대조 생쥐에서와 동등한 것으로 보인다.
DMD에서 관찰되는 동일한 성격의 사분된 척추만곡(scoliosis)인 흉추만곡증(kyphosis)은 중증 이영양성 DM 생쥐의 특징이다. 표준 방법을 이용하여 3마리의 DM 생쥐와 3마리의 DM/Tg+ 생쥐에서 수행된 방사선사진술(radiography)은 생쥐에서 흉추만곡증(kyphosis)에 대한 인간 Dp260 발현의 효과를 입증한다. 도 4b에 도시된 x-레이 영상은 DM 생쥐의 심각하게 흉추만곡된 척추를 보이는데, 상기 생쥐의 만곡은 측각 분석(goniometric analysis)에 의해 120°로 측정된다. 대조적으로, DM/Tg+ 생쥐는 도 4c에서 관찰되는 바와 같이, 정상 생쥐에서 관찰되는 것과 유사한 56°의 척추 만곡을 나타낸다.
실시예 6
근전도 검사( EMG ) 연구
바늘-전극 삽입에 대한 금전도 반응(electromyographic response)은 Carter et al., Am. J. Phys. Med. Rehabil. 71:2-5 (1992) 및 Dumitru, Electrodiagnostic Medicine 2d Edition, 276-277에 기술된 방법을 이용하여 DM/Tg+ 생쥐와 DM 생쥐로부터 얻은 다리 근육에서 기록하였다. EMG 연구는 Neuromax EMG 시스템(XL Tek, Ontario, Canada)을 이용하여 전경골근(tibialis anterior)에서 수행하였다. 설정은 60 Hz에서 노치 필터(notch filter)와 적응 필터(adaptive filter), 30 Hz에서 저주파수 필터(low frequency filter), 10,000 Hz에서 고주파수 필터(high frequency filter), 200 mv/division에서 증가(gain), 10 ms/division에서 시간축(timebase), 네거티브 트리거 기울기(negative trigger slope)로 표준화시켰다. 접지 전극(ground electrode)과 기준 전극(reference electrode)은 0.25 ㎜2 기록 표면(TECA Corp., Ontario, Canada)을 보유하는 단극 바늘 전극(monopolar needle electrode)인 피하 배치된 EEG 피하-기록용 바늘(NicoletO19-409700, Nicolet Biomedical, Madison, WI)이었다. 모든 생쥐는 0.6 ㎎/체중 g의 Avertin(tribromoethanol, Sigma)로 마취시켰다. 체중은 각 EMG 검사에서 획득하였다.
EMG 검사에서 CRD의 존재는 근막 불안정성(muscle membrane instability) 및 근육 병리(muscle pathology)를 암시한다. CRD를 추적하기 위하여, 근복(muscle belly)은 4개의 동등한 사분면으로 분할하고, 4주 간격으로 얼마나 많은 사분면이 CRD을 나타내는 지를 기록하고, 또한 전체적으로 얼마나 많은 CRD(삽입활동전위(insertional activity)를 보유)가 존재하는 지를 기록하였다. EMG 활성은 바늘을 대략 0.5 ㎜ 증분(increment)으로 중심으로부터 외부로 방사상 전진시킴으로써 네 방향에서 기록하였다. 각 사분면에서 네 방향 전진을 수행하고, 연구되는 동물의 측면은 4주 간격으로 교대시켜 외상 인공물(trauma artifact)을 최소화시켰다. CRD를 나타내는 사분면은 0 내지 4의 스코어로 기록하고, CRD 총합은 0 내지 16의 스코어로 기록하였다.
근전도 검사는 DM 생쥐와 DM/Tg+ 생쥐의 근막 안정성과 근육 병리를 직접적으로 평가한다. 나이든 DM/Tg+ 생쥐는 개별 운동 단위(motor unit)가 반응하는 정상적인 EMG 패턴을 보인다(도 5a). DM 생쥐는 디스트로핀 결손형 근이영양증(dystrophinopathy)에서의 비정상을 전형으로 하는 CRD 패턴을 보인다. CRD는 근 육 탈신경(muscle denervation) 및 근질환에 연관된 신경병적 질환에서 통상적으로 관찰된다. 시간의 추이에서 전기생리학적 반응(electrophysiological response)을 이들 두 생쥐 군에서 수집하고 그들의 임상적 외관(clinical appearance)과 상관시켰다. 4주령 생쥐에서, CRD를 나타내는 사분면의 수에서, 또는 DM 생쥐 군과 DM/Tg+ 생쥐 군 사이의 전체 CRD의 발생률에서 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 5c와 5d). 생쥐가 노화됨에 따라, DM 생쥐는 더욱 많은 사분면이 CRD를 나타내고 전체 CRD가 증가하는 반면, DM/Tg+ 생쥐는 이들 두 수치가 훨씬 낮았다(도 5c와 5d). 8주 시점에, CRD를 나타내는 사분면의 수(p=0.002)(도 5c) 및 CRD의 총수(p<0.001)(도 5c) 모두에서 이들 차이가 유의하였다. CRD는 DM 생쥐의 모든 사분면에서 관찰된 반면, DM/Tg+ 생쥐에서는 훨씬 적은 수의 사분면에서 관찰되었다. DM 생쥐는 8주와 12주 사이에 폐사한 반면, DM/Tg+ 생쥐는 최대 24주까지 생존하였다. 이들 EMG 연구 결과는 CRD를 나타내는 사분면의 수와 CRD의 총수가 경등도 근질환의 전형적인 수준까지 감소한다는 것을 입증한다.
실시예 7
이동성 연구
운동 활동(locomotor activity) 데이터는 단일 힘 측정판 굴절계(force plate actometer)(Steve Fowler)에서 기록하였다. 상기 힘 측정판 굴절계는 12 ㎝ x 12 ㎝ 감각 범위(sensing area)를 이용하였다. 공간 분해능(spatial resolution)은 1 ㎜이고, 시간 분해능(temporal resolution)은 0.02 s이었다. 생쥐는 가는 사포로 거칠어진 아크릴 플라스틱 표면에서 이동하고, 기록 작업(recording session) 은 어둡고 조용한 방에서 15분간 지속되었다. Steve Fowler에 의해 작성된 소프트웨어를 이용하여 상기 데이터를 기록하고 분석하였는데, 이들 데이터는 DM/Tg+ 생쥐에 대한 평균 95% 신뢰 구간(confidence interval)을 찾아냄으로써 분석하였다.
상기 힘 측정판 굴절계(force plate actometer)는 이동한 거리로 생쥐의 이동성(mobility)을 측정하였다. 6주 시점에, DM 생쥐는 DM/Tg+ 생쥐보다 적게 이동하고(도 9), DM 군 데이터는 한계적 유의성(marginal significance)(p=0.07)을 보이는 t-검증의 결과로 95% 신뢰 구간을 벗어났다. 10주 시점에, DM 생쥐는 DM/Tg+ 생쥐에 비하여 유의하게 손상되었다(p=0.002). DM/Tg+ 생쥐는 처리되지 않은 mdx 생쥐와 C57BL/6J 대조 생쥐에 필적하는 수준으로 이동하였는데, 이 결과는 DM/Tg+ 생쥐에 대한 95% 신뢰 수준 내에 포함된다. DM/Tg+ 생쥐는 또한, 정상적으로 이동하고 전반적으로 좋은 건강 상태로 보였으며, 감소된 활동, 비정상적인 동요성 보행(waddling gait) 및 DM 생쥐의 전형적인 거북하고 경직된 다리를 보이지 않았다.
실시예 8
DM / Tg + 생쥐에서 중증 근이영양증 표현형의 완화
DM 생쥐에서 관찰되는 중증 근이영양증 표현형은 DM/Tg+ 생쥐에서 개선되었는데, DM/Tg+ 생쥐는 정상적으로 성장하고 DM 생쥐보다 오랫동안 생존한다. DM 생쥐는 크기가 보통 이하인 반면, DM/Tg+ 생쥐는 정상적으로 성장하였다(도 4a). 임상적 웰빙(Clinical well being)은 근육량과 체력의 상관관계로 인하여, 체중으로 측정하였다. 4주 시점에, DM/Tg+ 생쥐의 평균 체중[18.1± 0.7g(n=14)]은 DM 생쥐의 평균 체중[14.1± 0.6g(n=7)]보다 유의하게 많았다(p=0.001). 8주 시점에, DM/Tg+ 생쥐는 26.9± 0.7g(n=12)까지 성장하고, 16주 시점에, 30.8± 1.2g(n=6)까지 성정하였다. 8주 시점에, DM 생쥐는 단지 I7.9± 1.3g(n=6)까지 성장하고 그 직후에 폐사하였다.
전반적으로, DM/Tg+ 생쥐는 체중을 연령과 상관된 정상 수준까지 증가시킨 반면, DM 생쥐는 최소의 체중 증가를 보이고 조기에 폐사하였다. 수명 연구를 위하여 생산된 28마리의 DM/Tg+ 생쥐 모두 30마리의 DM 생쥐의 평균 폐사 연령(2.9± 0.3 개월)보다 오래 생존하였다. 이들 DM/Tg+ 생쥐 중에서 23마리는 6개월을 초과하여 생존하였고, 이들 중에서 6마리만 폐사하였다. 이러한 21%의 감소율은 실험실 생쥐에서 전형적이다. 이들 DM/Tg+ 생쥐 중에서 7마리는 1년 이상 생존하였다.
실시예 9
세포 분리, 형질감염, 투여에 의한 DMD 처리
생쥐, 개, 말, 인간으로부터 세포는 이들 동물로부터 분리하고, 앞서 기술된 바와 같이, 통상적인 방법을 이용하여 망막 디스트로핀 단백질을 코딩하는 유전자 삽입체로 안정적으로 형질감염시킨다. 이후, 안정적으로 형질감염된 세포는 DMD의 적어도 하나의 임상적 증상의 심각도를 감소시키기 위하여 동물에 투여한다. 적절하게는, 개별 동물로부터 분리된 이들 세포는 자가 조직이식에서처럼 동일한 개별 동물에 투여된다. 이러한 절차는 개별 동물의 평생 동안 필요에 따라 반복된다. 더욱 구체적으로, 골수세포는 줄기 세포 분화유연성(stem cell plasticity)을 유지시키는 조건하에 분리되고 배양될 수 있다. 이들은 이후, 선별가능 마커 유전자, 다시 말하면, 네오마이신 내성 유전자를 보유하는 Dp260 외래도입유전자를 포함하는 렌티바이러스로 형질감염된다. 대안으로, 외래도입유전자를 골수세포에 도입하기 위한 방법으로서 전기천공이 이용될 수 있다. 이는 선별가능 유전자 마커: 네오마이신 내성 유전자를 보유하는 두 번째 플라스미드와의 동시-형질감염(co-transfection)으로 수행될 수 있다. 네오마이신에서 선별이후, 이들 세포는 수용자로 이식될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CHILDREN'S MERCY HOSPITAL WHITE, ROBERT GAEDIGK, ROGER FITZGERALD-GUSTAFSON, KATHLEEN <120> RETINAL DYSTROPHIN TRANSGENE AND METHODS OF USE THEREOF <130> 34444 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 3350 <212> DNA <213> Murinae gen. sp. <400> 1 ccatcctggt ctatagagag agttccagaa cagccagggc tacagataaa cccatctgga 60 aaaacaaagt tgaatgaccc aagaggggtt ctcagagggt ggcgtgtgct ccctggcaag 120 cctatgacat ggccggggcc tgcctctctc tgcctctgac cctcagtggc tcccatgaac 180 tccttgccca atggcatctt tttcctgcgc tccttgggtt attccagtct cccctcagca 240 ttccttcctc agggcctcgc tcttctctct gctccctcct tgcacagctg gctctgtcca 300 cctcagatgt cacagtgctc tctcagagga ggaaggcacc atgtaccctc tgtttcccag 360 gtaagggttc aatttttaaa aatggttttt tgtttgtttg tttgtttgtt tgtttgtttg 420 tttttcaaga cagggctcct ctgtgtagtc ctaactgtct tgaaactccc tctgtagacc 480 aggtcgacct cgaactcttg aaacctgcca cggaccaccc agtcaggtat ggaggtccct 540 ggaatgagcg tcctcgaagc taggtgggta agggttcggc ggtgacaaac agaaacaaac 600 acagaggcag tttgaatctg 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taaatatata aaataacaat cttgcagcac 1380 ctgaggtcac cactggaatg tgcacacctg tgcacataca tgagcctgca ctacaaacaa 1440 aaatattaac agtaactgtt agaatcccag ctgcaacttc atgccaggtg ccaggtccat 1500 gctcatcagt cagggactgg aactcagaga tctcctggga aagcttcagt ctcacagatt 1560 caaaagccag agagatctag tcacagcctg gggcccagag cagtgactta ggagagccgt 1620 gccttttaaa gtggaccttg tagacagcca gaggtggagg gactgggaga agtggctgaa 1680 gcctccagac tcattcccac gcccacatct ggactaattt ggatcagaat ctcaggggag 1740 cccttatggc ttttctcagg tgtgcacata taatctttac cagggtcctc acacagagcc 1800 tgtcagattg gttttcaatt tctgtgacaa acaccatgac caagacaacc tagaaaagag 1860 aaagcattaa tttggggctc agggttctgg agcggcaggg aggtgggcat ggtgctggag 1920 cagaggctgg aagctcacat ctttatcaac aaccagaggc agtgagagcc acttgggaat 1980 ggggtggctt ttcggaaatc tcaaagccca caagcaatgg cacacctcct ccaacaaggc 2040 cacacctccg aatccttccc aaacagttcc accgactggg gaccaaacat tcaaatatgt 2100 gagtctgagg ctcttctcat tcaaatcacc acagacccaa gaacaatcga ataaaatatt 2160 tgtgttatgt gccaggcact ggccgaggcg 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gccgcc 16 <210> 5 <211> 6375 <212> DNA <213> Murinae gen. sp. <400> 5 ccatcctggt ctatagagag agttccagaa cagccagggc tacagataaa cccatctgga 60 aaaacaaagt tgaatgaccc aagaggggtt ctcagagggt ggcgtgtgct ccctggcaag 120 cctatgacat ggccggggcc tgcctctctc tgcctctgac cctcagtggc tcccatgaac 180 tccttgccca atggcatctt tttcctgcgc tccttgggtt attccagtct cccctcagca 240 ttccttcctc agggcctcgc tcttctctct gctccctcct tgcacagctg gctctgtcca 300 cctcagatgt cacagtgctc tctcagagga ggaaggcacc atgtaccctc tgtttcccag 360 gtaagggttc aatttttaaa aatggttttt tgtttgtttg tttgtttgtt tgtttgtttg 420 tttttcaaga cagggctcct ctgtgtagtc ctaactgtct tgaaactccc tctgtagacc 480 aggtcgacct cgaactcttg aaacctgcca cggaccaccc agtcaggtat ggaggtccct 540 ggaatgagcg tcctcgaagc taggtgggta agggttcggc ggtgacaaac agaaacaaac 600 acagaggcag tttgaatctg agtgtatttt gcagctctca agcaggggat tttatacata 660 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa accaaacatt acatctctta gaaactatat ccaatgaaac 720 aatcacagat accaaccaaa accattgggc agagtaaagc acaaaaatca tccaagcatt 780 acaactctga aaccatgtat 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gatacagaac cttctgaagg gagagatctg ggctgggagc 4200 ccggggtgtc cttgaggccc agagcctggc tgtgtgtcct cctggccacc ccagcccacc 4260 tgtcccaatg ctgacttagt gcaaggcgag ccagcaagga gggaggacag gtggcagtgg 4320 ggggtgagga gcatctaaaa atagccacaa agtagcagct tcaagggctt tgggtctctg 4380 tctgccccac actcttctct cagcttggtc caccttccct ctcaccttcc tctgaggccc 4440 ccttccagcc ccgatggagg cctgatgtcc cccatggtca gtgcttcagg gatctagtca 4500 ataaaattaa taatgaaaaa caacagtaat aaaatacacg tgacgtgact ggggcagctt 4560 agggcttagt tcaaatccca gtgttcacac cctttaaaag acaagacaaa acaaaacagc 4620 tggctgtggg ggagaacatc agaatccccc tggggaggtg gggacagggg atctgtgggg 4680 ctccatggcc agccagccta gctccaggcc tgcgagagac cctacctcaa gataaaaata 4740 aaataaaata aaataaatat ataaaataac aatcttgcag cacctgaggt caccactgga 4800 atgtgcacac ctgtgcacat acatgagcct gcactacaaa caaaaatatt aacagtaact 4860 gttagaatcc cagctgcaac ttcatgccag gtgccaggtc catgctcatc agtcagggac 4920 tggaactcag agatctcctg ggaaagcttc agtctcacag attcaaaagc cagagagatc 4980 tagtcacagc ctggggccca 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agaaactgcc aagcatcagg 5880 ccaaatgtaa catctgcaaa gagtgtccaa tcattggatt caggtacagg agtctaaagc 5940 actttaatta tgacatctgc caaagctgct ttttttctgg tcgagttgca aaaggccata 6000 aaatgcacta tcccatggtg gaatattgca ctccgactac atcaggagaa gatgttcgag 6060 actttgccaa ggtactaaaa aacaaatttc gaaccaaaag gtattttgcg aagcatcccc 6120 gaatgggcta cctgccagtg cagactgtct tagaggggga caacatggaa acgcctgcct 6180 cgtcccctca gctttcacac gatgatactc attcacgcat tgaacattat gctagcaggc 6240 tagcagaaat ggaaaacagc aatggatctt atctaaatga tagcatctct cctaatgaga 6300 gcatagatga tgaacatttg ttaatccagc attactgcca aagtttgaac caggactccc 6360 ccctgagcca gcctcgtagt cctgcccaga tcttgatttc cttagagagt gaggaaagag 6420 gggagcttga gagaatccta gcagatcttg aggaagaaaa caggaatctg caagcagaat 6480 atgaccgtct aaagcagcag cacgaacata aaggcctgtc cccactgccg tcccctcctg 6540 aaatgatgcc cacctctccc cagagtcccc gggatgctga gctcattgct gaggccaagc 6600 tactgcgtca acacaaaggc cgcctggaag ccaggatgca aatcctggaa gaccacaata 6660 aacagctgga gtcacagtta cacaggctaa ggcagctgct ggagcaaccc caggcagagg 6720 ccaaagtgaa tggcacaacg gtgtcctctc cttctacctc tctacagagg tccgacagca 6780 gtcagcctat gctgctccga gtggttggca gtcaaacttc ggactccatg ggtgaggaag 6840 atcttctcag tcctccccag gacacaagca cagggttaga ggaggtgatg gagcaactca 6900 acaactcctt ccctagttca agaggaagaa atacccctgg aaagccaatg agagaggaca 6960 caatgtag 6968 <210> 13 <211> 2329 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ser Ala Arg Lys Leu Arg Asn Leu Ser Tyr Lys Lys Asn Ala Val 1 5 10 15 Arg Arg Gln Lys Leu Leu Glu Gln Ser Ile Gln Ser Ala Gln Glu Thr 20 25 30 Glu Lys Ser Leu His Leu Ile Gln Glu Ser Leu Thr Phe Ile Asp Lys 35 40 45 Gln Leu Ala Ala Tyr Ile Ala Asp Lys Val Asp Ala Ala Gln Met Pro 50 55 60 Gln Glu Ala Gln Lys Ile Gln Ser Asp Leu Thr Ser His Glu Ile Ser 65 70 75 80 Leu Glu Glu Met Lys Lys His Asn Gln Gly Lys Glu Ala Ala Gln Arg 85 90 95 Val Leu Ser Gln Ile Asp Val Ala Gln Lys Lys Leu Gln Asp Val Ser 100 105 110 Met Lys Phe Arg Leu Phe Gln Lys Pro Ala Asn Phe Glu Gln Arg Leu 115 120 125 Gln Glu Ser Lys Met Ile Leu Asp Glu Val Lys Met His Leu Pro Ala 130 135 140 Leu Glu Thr Lys Ser Val Glu Gln Glu Val Val Gln Ser Gln Leu Asn 145 150 155 160 His Cys Val Asn Leu Tyr Lys Ser Leu Ser Glu Val Lys Ser Glu Val 165 170 175 Glu Met Val Ile Lys Thr Gly Arg Gln Ile Val Gln Lys Lys Gln Thr 180 185 190 Glu Asn Pro Lys Glu Leu Asp Glu Arg Val Thr Ala Leu Lys Leu His 195 200 205 Tyr Asn Glu Leu Gly Ala Lys Val Thr Glu Arg Lys Gln Gln Leu Glu 210 215 220 Lys Cys Leu Lys Leu Ser Arg Lys Met Arg Lys Glu Met Asn Val Leu 225 230 235 240 Thr Glu Trp Leu Ala Ala Thr Asp Met Glu Leu Thr Lys Arg Ser Ala 245 250 255 Val Glu Gly Met Pro Ser Asn Leu Asp Ser Glu Val Ala Trp Gly Lys 260 265 270 Ala Thr Gln Lys Glu Ile Glu Lys Gln Lys Val His Leu Lys Ser Ile 275 280 285 Thr Glu Val Gly Glu Ala Leu Lys Thr Val Leu Gly Lys Lys Glu Thr 290 295 300 Leu Val Glu Asp Lys Leu Ser Leu Leu Asn Ser Asn Trp Ile Ala Val 305 310 315 320 Thr Ser Arg Ala Glu Glu Trp Leu Asn Leu Leu Leu Glu Tyr Gln Lys 325 330 335 His Met Glu Thr Phe Asp Gln Asn Val Asp His Ile Thr Lys Trp Ile 340 345 350 Ile Gln Ala Asp Thr Leu Leu Asp Glu Ser Glu Lys Lys Lys Pro Gln 355 360 365 Gln Lys Glu Asp Val Leu Lys Arg Leu Lys Ala Glu Leu Asn Asp Ile 370 375 380 Arg Pro Lys Val Asp Ser Thr Arg Asp Gln Ala Ala Asn Leu Met Ala 385 390 395 400 Asn Arg Gly Asp His Cys Arg Lys Leu Val Glu Pro Gln Ile Ser Glu 405 410 415 Leu Asn His Arg Phe Ala Ala Ile Ser His Arg Ile Lys Thr Gly Lys 420 425 430 Ala Ser Ile Pro Leu Lys Glu Leu Glu Gln Phe Asn Ser Asp Ile Gln 435 440 445 Lys Leu Leu Glu Pro Leu Glu Ala Glu Ile Gln Gln Gly Val Asn Leu 450 455 460 Lys Glu Glu Asp Phe Asn Lys Asp Met Asn Glu Asp Asn Glu Gly Thr 465 470 475 480 Val Lys Glu Leu Leu Gln Arg Gly Asp Asn Leu Gln Gln Arg Ile Thr 485 490 495 Asp Glu Arg Lys Arg Glu Glu Ile Lys Ile Lys Gln Gln Leu Leu Gln 500 505 510 Thr Lys His Asn Ala Leu Lys Asp Leu Arg Ser Gln Arg Arg Lys Lys 515 520 525 Ala Leu Glu Ile Ser His Gln Trp Tyr Gln Tyr Lys Arg Gln Ala Asp 530 535 540 Asp Leu Leu Lys Cys Leu Asp Asp Ile Glu Lys Lys Leu Ala Ser Leu 545 550 555 560 Pro Glu Pro Arg Asp Glu Arg Lys Ile Lys Glu Ile Asp Arg Glu Leu 565 570 575 Gln Lys Lys Lys Glu Glu Leu Asn Ala Val Arg Arg Gln Ala Glu Gly 580 585 590 Leu Ser Glu Asp Gly Ala Ala Met Ala Val Glu Pro Thr Gln Ile Gln 595 600 605 Leu Ser Lys Arg Trp Arg Glu Ile Glu Ser Lys Phe Ala Gln Phe Arg 610 615 620 Arg Leu Asn Phe Ala Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Met 625 630 635 640 Val Met Thr Glu Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser Thr 645 650 655 Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu Glu Val Glu 660 665 670 Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe Glu Asp Leu 675 680 685 Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp Ser Leu Gln Gln 690 695 700 Ser Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His Ser Lys Lys Thr Ala Ala Leu 705 710 715 720 Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arg Val Lys Leu Gln Glu Ala Leu Ser 725 730 735 Gln Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys Val Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg 740 745 750 Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr 755 760 765 Asp Ile Lys Ile Phe Asn Gln Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu 770 775 780 Arg Lys Thr Gln Ile Pro Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp 785 790 795 800 Tyr Leu Lys Glu Leu Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val 805 810 815 Arg Thr Leu Asn Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys 820 825 830 Thr Asp Ala Ser Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Asn Leu Arg 835 840 845 Trp Gln Glu Val Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys Arg Leu Glu 850 855 860 Glu Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu Asn Glu Phe 865 870 875 880 Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ser Ile Pro Leu Glu 885 890 895 Pro Gly Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln Val Lys Leu 900 905 910 Leu Val Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys Gln Leu Asn 915 920 925 Glu Thr Gly Gly Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile Ser Pro Glu Glu 930 935 940 Gln Asp Lys Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr Asn Leu Gln Trp Ile 945 950 955 960 Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln Gly Glu Ile Glu Ala Gln 965 970 975 Ile Lys Asp Leu Gly Gln Leu Glu Lys Lys Leu Glu Asp Leu Glu Glu 980 985 990 Gln Leu Asn His Leu Leu Leu Trp Leu Ser Pro Ile Arg Asn Gln Leu 995 1000 1005 Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn Gln Glu Gly Pro Phe Asp Val Gln 1010 1015 1020 Glu Thr Glu Ile Ala Val Gln Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu Glu 1025 1030 1035 Ile Leu Ser Lys Gly Gln His Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala Thr 1040 1045 1050 Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp Lys 1055 1060 1065 Ala Val Asn Arg Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Lys Gln Pro Asp 1070 1075 1080 Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr 1085 1090 1095 Val Thr Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile 1100 1105 1110 Ser Lys Leu Glu Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala 1115 1120 1125 Leu Ala Asp Phe Asn Arg Ala Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu 1130 1135 1140 Ser Leu Leu Asp Gln Val Ile Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly 1145 1150 1155 Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr 1160 1165 1170 Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile 1175 1180 1185 Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu Ala 1190 1195 1200 Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg Ile Glu Arg Ile Gln Asn Gln Trp 1205 1210 1215 Asp Glu Val Gln Glu His Leu Gln Asn Arg Arg Gln Gln Leu Asn 1220 1225 1230 Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr Gln Trp Leu Glu Ala Lys Glu Glu 1235 1240 1245 Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln Ala Arg Ala Lys Leu Glu Ser Trp 1250 1255 1260 Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile Thr 1265 1270 1275 Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gln Trp Gln Thr Asn 1280 1285 1290 Val Asp Val Ala Asn Asp Leu Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr 1295 1300 1305 Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile 1310 1315 1320 Asn Ala Ser Trp Arg Ser Ile His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu 1325 1330 1335 Ala Ala Leu Glu Glu Thr His Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu 1340 1345 1350 Asp Leu Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr 1355 1360 1365 Ala Asn Val Leu Gln Asp Ala Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu 1370 1375 1380 Asp Ser Lys Gly Val Lys Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu 1385 1390 1395 Gln Gly Glu Ile Glu Ala His Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp 1400 1405 1410 Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp 1415 1420 1425 Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp 1430 1435 1440 Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile Arg Ser His Leu Glu 1445 1450 1455 Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu Ser Leu Gln Glu 1460 1465 1470 Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu Ser Arg Gln 1475 1480 1485 Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln Asn Asp 1490 1495 1500 Val His Arg Ala Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro Val 1505 1510 1515 Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln 1520 1525 1530 Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu 1535 1540 1545 Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys 1550 1555 1560 Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His 1565 1570 1575 Ser Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu 1580 1585 1590 Gln Glu Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg 1595 1600 1605 Gln Ala Glu Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu 1610 1615 1620 Leu Ile Asp Ser Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu 1625 1630 1635 Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn 1640 1645 1650 Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro 1655 1660 1665 Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu 1670 1675 1680 Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg Gln Leu His Glu Ala 1685 1690 1695 His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln His Phe Leu Ser Thr Ser 1700 1705 1710 Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser Pro Asn Lys Val Pro 1715 1720 1725 Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys Trp Asp His Pro 1730 1735 1740 Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu Asn Asn Val 1745 1750 1755 Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg Leu Gln 1760 1765 1770 Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys Asp 1775 1780 1785 Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp 1790 1795 1800 Ile Leu Gln Ile Ile Asn Cys Leu Thr Thr Ile Tyr Asp Arg Leu 1805 1810 1815 Glu Gln Glu His Asn Asn Leu Val Asn Val Pro Leu Cys Val Asp 1820 1825 1830 Met Cys Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr 1835 1840 1845 Gly Arg Ile Arg Val Leu Ser Phe Lys Thr Gly Ile Ile Ser Leu 1850 1855 1860 Cys Lys Ala His Leu Glu Asp Lys Tyr Arg Tyr Leu Phe Lys Gln 1865 1870 1875 Val Ala Ser Ser Thr Gly Phe Cys Asp Gln Arg Arg Leu Gly Leu 1880 1885 1890 Leu Leu His Asp Ser Ile Gln Ile Pro Arg Gln Leu Gly Glu Val 1895 1900 1905 Ala Ser Phe Gly Gly Ser Asn Ile Glu Pro Ser Val Arg Ser Cys 1910 1915 1920 Phe Gln Phe Ala Asn Asn Lys Pro Glu Ile Glu Ala Ala Leu Phe 1925 1930 1935 Leu Asp Trp Met Arg Leu Glu Pro Gln Ser Met Val Trp Leu Pro 1940 1945 1950 Val Leu His Arg Val Ala Ala Ala Glu Thr Ala Lys His Gln Ala 1955 1960 1965 Lys Cys Asn Ile Cys Lys Glu Cys Pro Ile Ile Gly Phe Arg Tyr 1970 1975 1980 Arg Ser Leu Lys His Phe Asn Tyr Asp Ile Cys Gln Ser Cys Phe 1985 1990 1995 Phe Ser Gly Arg Val Ala Lys Gly His Lys Met His Tyr Pro Met 2000 2005 2010 Val Glu Tyr Cys Thr Pro Thr Thr Ser Gly Glu Asp Val Arg Asp 2015 2020 2025 Phe Ala Lys Val Leu Lys Asn Lys Phe Arg Thr Lys Arg Tyr Phe 2030 2035 2040 Ala Lys His Pro Arg Met Gly Tyr Leu Pro Val Gln Thr Val Leu 2045 2050 2055 Glu Gly Asp Asn Met Glu Thr Pro Ala Ser Ser Pro Gln Leu Ser 2060 2065 2070 His Asp Asp Thr His Ser Arg Ile Glu His Tyr Ala Ser Arg Leu 2075 2080 2085 Ala Glu Met Glu Asn Ser Asn Gly Ser Tyr Leu Asn Asp Ser Ile 2090 2095 2100 Ser Pro Asn Glu Ser Ile Asp Asp Glu His Leu Leu Ile Gln His 2105 2110 2115 Tyr Cys Gln Ser Leu Asn Gln Asp Ser Pro Leu Ser Gln Pro Arg 2120 2125 2130 Ser Pro Ala Gln Ile Leu Ile Ser Leu Glu Ser Glu Glu Arg Gly 2135 2140 2145 Glu Leu Glu Arg Ile Leu Ala Asp Leu Glu Glu Glu Asn Arg Asn 2150 2155 2160 Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gln Gln His Glu His Lys 2165 2170 2175 Gly Leu Ser Pro Leu Pro Ser Pro Pro Glu Met Met Pro Thr Ser 2180 2185 2190 Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu Ile Ala Glu Ala Lys Leu 2195 2200 2205 Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu Ala Arg Met Gln Ile Leu 2210 2215 2220 Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser Gln Leu His Arg Leu Arg 2225 2230 2235 Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Ala Lys Val Asn Gly Thr 2240 2245 2250 Thr Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu Gln Arg Ser Asp Ser Ser 2255 2260 2265 Gln Pro Met Leu Leu Arg Val Val Gly Ser Gln Thr Ser Asp Ser 2270 2275 2280 Met Gly Glu Glu Asp Leu Leu Ser Pro Pro Gln Asp Thr Ser Thr 2285 2290 2295 Gly Leu Glu Glu Val Met Glu Gln Leu Asn Asn Ser Phe Pro Ser 2300 2305 2310 Ser Arg Gly Arg Asn Thr Pro Gly Lys Pro Met Arg Glu Asp Thr 2315 2320 2325 Met <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Murinae gen. sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> This is an MCK-specific forward primer <400> 14 cccagcaact gagttcttaa gtctgaaacc 30 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> This is a human dystrophin exon 30 specific reverse primer <400> 15 ctgggcttcc tgaggcattt g 21 <210> 16 <211> 368 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Amplified Product of mouse creatine kinase specific forward primer and dystrophin human exon 30-specific reverse primer <400> 16 cccagcaact gagttcttaa gtctgaaccc tttcttctca cagggtccca aaggccgcca 60 atatgagtgc caggaagctg cgaaatctgt cttacaaaaa ggtgattgtg gaagagtcta 120 gaatcttcat ttattgttca gcaggattac agaaaagcta tcaagagtaa acatttaact 180 gatacactct tattccttct ttttaggctg taaggaggca aaagttgctt gaacagagca 240 tccagtctgc gcaggagact gaaaaatcct tacacttaat ccaggagtcc ctcacattca 300 ttgacaagca gttggcagct tatattgcag acaaggtgga cgcagctcaa atgcctcagg 360 aagcccag 368 <210> 17 <211> 312 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Amplification product from neomycin resistance gene primer and the primer from human utrophin exon 64 <400> 17 cccactttgt ggttctaagt acgtggtttc aaatgtgtca gtttcatagc ctgaagaacg 60 agatcagcag cctctgttcc acatacactt cattctcagt attgttttgc caagttctaa 120 ttccatcaga agctgactct agaggatccg aaggctgcaa aaagcattat gtcgtgagtt 180 atcacactaa ctgaatcacc ttgctttggg aggttgactt tgttgttatc attaagacag 240 agacaaatgg cgaggctgag gtatttgcag agtcaatctg actttcagtg ccccctcatt 300 gaaggagtta gc 312 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> This sequence is a primer rom the neo gene <400> 18 cccactttgt ggttctaagt actgt 25 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(24) <223> This is a primer from exon 64 of utrophin. <400> 19 gctaactcct tcaatgaggg ggca 24 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 gaataatgta cgtttctctg cctacc 26 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is the forward primer from the PCDNA 3.1 Hygro plasmid from Invitrogen. <400> 21 acttatacac gtgcctcgac tgtgccttct agttg 35 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> This is the reverse primer from the PCDNA 3.1 Hygro plasmid from Invitrogen. <400> 22 ataagaatgc ggccgctccc cagcatgcct gctattgtct tc 42

Claims (37)

  1. 디스트로핀(dystrophin) 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 형질전환된 벡터에 있어서, 상기 핵산 서열은 형질전환(transformation) 이전에 상기 벡터에 포함되지 않는 것을 특징으로 하는 형질전환된 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 벡터는 프로모터, 인핸서, 폴리 A 신호 부위에서 선택되는 적어도 하나의 조절 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, 핵산 서열은 디스트로핀 단백질을 발현할 수 있는 외래도입유전자(transgene)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 벡터.
  4. 제 1항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID No. 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환된 벡터.
  5. 제 1항에 있어서, 벡터는 플라스미드와 바이러스 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환된 벡터.
  6. 제 1항에 있어서, 디스트로핀 단백질은 망막 디스트로핀 단백질인 것을 특징으로 하는 형질전환된 벡터.
  7. 세포의 게놈 내로 삽입되고 상기 세포를 형질전환시키는 핵산 서열을 포함하는 세포에 있어서, 상기 핵산 서열은 디스트로핀 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 세포.
  8. 제 7항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID No. 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 세포.
  9. 제 7항에 있어서, 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 폴리 A 신호 부위에서 선택되는 적어도 하나의 조절 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 제 7항에 있어서, 근원세포(myoblast), 골수세포, SP(side population) 골수세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
  11. 제 7항에 있어서, 디스트로핀 단백질은 망막 디스트로핀 단백질인 것을 특징으로 하는 세포.
  12. 게놈 내로 안정적으로 통합된 외인성 핵산 서열을 보유하는 외래유전자도입 동물에 있어서, 상기 핵산 서열은 디스트로핀을 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자도입 동물.
  13. 제 12항에 있어서, 생쥐, 인간, 개, 말에서 선택되는 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 동물
  14. 제 12항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID No. 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 동물.
  15. 제 12항에 있어서, 핵산 서열은 프로모터, 인핸서, 폴리 A 신호 부위에서 선택되는 적어도 하나의 조절 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 동물.
  16. 제 12항에 있어서, 디스트로핀은 망막 디스트로핀인 것을 특징으로 하는 외래유전자도입 동물.
  17. 제 1항의 벡터로 형질전환된 세포.
  18. 동물에서 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)의 적어도 하나의 임상적 증상의 심각도(severity)를 감소시키는 방법에 있어서,
    상기 동물의 게놈 내로 유전자 삽입체를 도입하고, 상기 삽입체는 디스트로핀 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 삽입체는 SEQ ID No. 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열인 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 삽입체는 프로모터, 인핸서, 폴리 A 신호 부위에서 선택되는 적어도 하나의 조절 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 디스트로핀은 망막 디스트로핀인 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  22. 제 18항에 있어서, 도입 단계는 게놈 내로 벡터를 안정적으로 형질감염(transfection)시키는 단계를 포함하고, 상기 벡터는 유전자 삽입체를 포함하는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 벡터는 플라스미드와 바이러스 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  24. 제 18항에 있어서, 임상적 증상은 복합 연속 방전(complex repetitive discharge), 흉추만곡증(kyphosis), 괴사(necrosis), 느슨한 자세(slack posture), 성장 지체(growth retardation), 중증 근육 약화(severe muscle weakness)에서 선 택되는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  25. 제 18항에 있어서, 동물은 인간, 생쥐, 말, 개에서 선택되는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  26. 동물에서 뒤시엔느 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy)의 적어도 하나의 임상적 증상의 심각도를 감소시키는 방법에 있어서,
    상기 동물에 세포를 투여하고, 상기 세포는 디스트로핀을 코딩하는 유전자 삽입체로 형질감염되는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 투여 단계에 앞서, 동물로부터 세포를 분리하는 단계 및 유전자 삽입체로 이들 세포를 형질감염시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  28. 제 27항에 있어서, 형질감염 단계는 벡터 또는 나신 DNA의 전기천공을 통하여 진행되는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  29. 제 26항에 있어서, 디스트로핀은 망막 디스트로핀인 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  30. 제 26항에 있어서, 유전자 삽입체는 SEQ ID NO. 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  31. 제 26항에 있어서, 세포는 근원세포, 골수세포, SP(side population) 골수세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 감소 방법.
  32. 디스트로핀 단백질을 발현하는 핵산 서열을 포함하는 외래도입유전자.
  33. 제 32항에 있어서, 디스트로핀은 망막 디스트로핀인 것을 특징으로 하는 외래도입유전자.
  34. 제 32항에 있어서, 핵산 서열은 SEQ ID No. 10과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 외래도입유전자.
  35. 제 32항에 있어서, 핵산 서열은 ATCC 클론 57670, 57672, 57674, 57676으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 외래도입유전자.
  36. 제 32항에 있어서, 핵산 서열은 디스트로핀의 택일적 절단접합으로부터 생성된 동등형(isoform)으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 외래도입유전자.
  37. 제 32항에 있어서, 프로모터, 인핸서, 폴리 A 신호 부위에서 선택되는 적어도 하나의 조절 요소를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 외래도입유전자.
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