CN113677697A

CN113677697A - 使用重叠的aav载体生产大型拟抗肌萎缩蛋白

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Publication number: CN113677697A
Application number: CN202080025191.0A
Authority: CN
Inventors: I·理查德; W·洛斯塔尔
Original assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon
Current assignee: Evry Wald Esson University; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Genethon; Universite D'Evry Val D'Essonne
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2020-03-25
Publication date: 2021-11-19
Also published as: EP3947427A1; WO2020193636A1; JP2022526526A; US20220204574A1; CA3130196A1

Abstract

本发明涉及拟抗肌萎缩蛋白(QD)以及能够生产该蛋白的双AAV载体系统，所述拟抗肌萎缩蛋白在其N‑端部分具有CH1CH2H1R1R2R3H2R8R9的结构，优选地进一步包括R16和R17杆状区。

Description

使用重叠的AAV载体生产大型拟抗肌萎缩蛋白

本发明涉及基因治疗载体，其用于治疗或预防肌营养不良症，尤其是杜氏肌营养不良症(DMD)或贝克型肌营养不良症(BMD)。

本申请公开了利用重叠腺相关病毒(AAV)载体能够产生大量显示出重要功能域的活性截短抗肌萎缩蛋白。

背景技术

杜氏肌营养不良症(DMD)是最常见的进行性肌肉退行性疾病，大约每3500-5000名男婴就有一名受此影响。DMD是由X染色体上编码抗肌萎缩蛋白的基因缺失或突变引起的。抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)是组装抗肌萎缩蛋白-糖蛋白复合物所必需的，并在肌肉纤维的细胞骨架和细胞外基质之间提供机械和功能联结。抗肌萎缩蛋白的缺失会引起纤维退化、感染、坏死以及肌肉被瘢痕和脂肪组织替代，导致进行性肌无力及呼衰和心衰引起的20岁到40岁间的过早死亡(Moser,H.,Hum Genet,1984.66(1):17-40)。

这种疾病的一种较轻型称为贝克型肌营养不良症(BMD)，它与DMD的区别在于起病较迟、对轮椅支撑的依赖较晚和生存期更长。BMD通常对应于保留了阅读框的突变(MuntoniF等,Lancet Neurol,2003.2(12):731-40)。

对于DMD尚无治愈或治疗有效的方式(Rodino-Klapac,L.R.等,Curr NeurolNeurosci Rep,2013.13(3):332)，对BMD也是如此。常规疗法仅限于支持性治疗，可部分缓解体征和症状，但不直接针对发病机制治疗，也无法逆转表型。

目前针对DMD正在开发多种治疗策略，包括体外基因疗法、细胞移植疗法、DMD无义突变的药物治疗和修复抗肌萎缩蛋白基因阅读框的外显子跳跃或基因编辑策略。以上所有治疗策略均存在需要克服的问题，包括有效率、不同肌肉群的针对性、传递优化、转基因的长期表达和潜在的免疫应答(Jarmin等,Expert Opin Biol Ther,2014.14(2):209-30)。

DMD的不同基因转移疗法旨在弥补抗肌萎缩蛋白的功能丧失，并提供使用单一药物治疗所有患者的可能性。为了防止肌肉退化，可能需要正常水平的大约30％的抗肌萎缩蛋白。

抗肌萎缩蛋白基因是人类基因组中已知最大的基因，跨越2.5Mb，约占人类整个X染色体的2％。它由79个外显子(全长cDNA：11,1kb)组成，编码3685个氨基酸、427kD的抗肌萎缩蛋白。抗肌萎缩蛋白由四个结构区定义(图1A)。分别是NH₂末端的肌动蛋白结合域(外显子1-8)、中央杆状区(24个血影样蛋白的重复序列R1-24和4个铰链区H1-4；外显子9-62)、半胱氨酸(CR)富集区(外显子63-69)和羧基端(CT)结构域(外显子70至79)。

cDNA因过大而无法装配在已知的基因治疗载体系统中，尤其是在腺相关病毒(AAV)载体中，而AAV载体是根据AAV血清型的向性将基因有效转移至各个肌群中的一种有潜力的选择。AAV载体具有在分裂的(肌纤维和心肌细胞)和非分裂的(成熟肌管)肌肉细胞中表现出长期基因转导的潜力。

事实上，AAV的主要限制是它的装载能力被认为仅限大约5kb，即亲本病毒基因组的大小(Wu Z.等,Mol Ther.,2010,18(1):80-86；Lai Y.等，Mol Ther.,2010,18(1):75-79；Wang Y.等，Hum Gene Ther Methods,2012,23(4):225-33)。而较大的载体基因组意味着截短的包装基因组、大小分布范围广泛的异质基因组群和较低的表达效率(Wu Z.等，MolTher.，2010,18(1):80-86)。

为了克服AAV的DNA包装限制(＜5kb)，一些研究小组试图设计合成的截短但具备功能的抗肌萎缩蛋白(MD，也即“微抗肌萎缩蛋白”或“迷你抗肌萎缩蛋白”)。一系列微抗肌萎缩蛋白已被设计用于编码截短的抗肌萎缩蛋白，这些抗肌萎缩蛋白经过优化以包含对临床更重要的蛋白质区域。通常认为这些区域位于抗肌萎缩蛋白的N端和半胱氨酸富集区.

微抗肌萎缩蛋白包含24个血影样蛋白的重复序列中前3个和最后一个,不含C端结构域(ΔR4-R23/ΔCT)，名为MD1(见图1B)，显示出修复抗肌萎缩蛋白以及与互生蛋白(syntrophin)和肌营养蛋白(dystrobrevin)共同定位的高功能活性，但它未能在mdx小鼠(肌营养不良实验鼠)模型的肌膜处招募nNOS(Yue等，Mol Ther，2006.14(1):79-87)。

使用AAV2/8载体对营养不良的CXMDj犬进行试验，该载体编码序列优化的犬MD1微抗肌萎缩蛋白，肌肉特异性spc512启动子(AAV8-spc512-cMD1)驱动表达，(Koo等J.GeneMed.2011.13:497)实验取得了激励性的成果。局部给药可诱导肢体肌肉组织中高水平的微抗肌萎缩蛋白表达，并显著改善组织学和功能参数。不伴有免疫抑制的全身静脉给药引导骨骼肌中显著和持续水平的微抗肌萎缩蛋白，并在2年内减少营养不良症状(Le Guiner等，Nat Commun.2017.8:16105)。未观察到载体给药的毒性或免疫副反应。

然而，在肌肉功能中，缺失区域，例如R16-R17 nNOS结合位点和/或R8-R9 Par1b结合位点和/或R10-R17结合位点与F-肌动蛋白的相关性仍然存疑。

作为替代策略，已经提出依靠重组项目和使用双AAV载体系统来生产拟抗肌萎缩蛋白。如本领域已知的，双AAV系统的两个载体可以是重叠载体、反式剪接AAV载体或混合反式剪接AAV载体(参见例如Pryadkina等，Molecular Therapy,2015,2,15009)。

基于该策略，如图1C所示，Kodippili等(Human Gene Therapy,2018,29(3),299-311)报道了在杜氏肌营养不良症(DMD)犬模型中使用一对双AAV9载体表达犬ΔH2-R15迷你抗肌萎缩蛋白(SEQ ID NO:1)。更准确地说，第一个载体包含巨细胞病毒(CMV)启动子、融合到抗肌萎缩蛋白基因N端的Flag标签和ΔH2-R15迷你抗肌萎缩蛋白基因的5’部分(包括N端结构域、铰链1和3、以及血影蛋白样重复序列R1-R3、R16-R20和R21的一部分)。第二个载体包含ΔH2-R15迷你抗肌萎缩蛋白基因的3’部分(包括铰链3的一部分、血影蛋白样重复序列R20-R24、铰链4、半胱氨酸富集区和C端结构域)、融合到C端的GFP标签和SV40多聚腺苷酸化信号。两个载体共享一个375个核苷酸的抗肌萎缩蛋白基因片段(从铰链3的后部到R21的第一部分)。

无论如何，本领域仍然需要生产高水平的活性拟抗肌萎缩蛋白。

发明概述

本发明的目的在于，通过使用双AAV载体系统表达较短但具备功能性的抗肌萎缩蛋白多肽，也称为拟抗肌萎缩蛋白，来缓解或治愈毁灭性的杜氏肌营养不良症(DMD)以及贝克型肌营养不良症(BMD)。

据申请人所知，本发明首次报道了遗传工具，即双AAV载体系统，能够产生大量的表现出R16-R17 nNOS结合位点和R8-R9 Par1b结合位点的大型活性拟抗肌萎缩蛋白。这为治疗肌营养不良性疾病提供了新的治疗手段。

在过去的几年中，确实地发现了DMD病理是由肌纤维脆性和肌肉干细胞功能障碍引起的，这些病理机制损害肌肉再生并导致肌肉萎缩。卫星细胞功能障碍对DMD相关肌肉萎缩的影响是一个相对较新的发现，可以通过保留抗肌萎缩蛋白的关键结合位点和关键分子功能来改善目前基于AAV抗肌萎缩蛋白递送的策略。

Par1b，又称Marks，是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，可与抗肌萎缩蛋白相关联并调节卫星细胞的极性，从而确保不对称分裂(Dumont等，Nat Med，2015，21(12)：1455-63)。抗肌萎缩蛋白的缺乏会导致Par1b下调和不对称分裂受损，而这正是肌源性祖细胞正确生成所需的。因此，维持拟抗肌萎缩蛋白中的Par1b结合位点(R8-R9)对于保证卫星细胞极性和不对称分裂以产生肌源性祖细胞和有效的肌肉再生至关重要。

保留nNOS(神经一氧化氮合酶)的结合位点也很重要，因为众所周知抗肌萎缩蛋白介导的胞质跨膜蛋白nNOS的组装对肌膜中NO的产生是必需的，而NO的产生是控制骨骼肌血流调节的重要因素。(Ervasti,Biochim Biophys Acta,2007,1772(2):108-17)。

定义

冠词“一”和“一个”在本文中用于指代该冠词的一个或多个(即至少一个)描述对象。例如，“一个元件”是指一个元件或一个以上的元件。

如本文所用，“大约”或“近似”在提及诸如数量、时间段等可测量值时，意为涵盖指定值的±20％或±10％，优选为±5％，更优选为±1％，并且进一步优选地为±0.1％，这样的变动程度适合于执行本发明的方法。

范围：在本说明书全篇中，本发明的各个方面均可以以范围形式呈现。应理解，范围形式的描述仅仅是出于方便和简洁考虑，不应理解为对本发明范围界限的硬性限制。因此，应该认为对范围的描述已经具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的各个数值。例如，1到6的范围描述应被理解为具体地公开了以下子范围：1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及公开了包含在该范围中的个体数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。对任意广度的范围均适用。

“分离的”是指改变或脱离自然状态。例如，天然存在于活体动物的核酸或肽不是“分离的”，但相同的核酸或肽被部分或整体地从与其天然状态共存的物质中分割出后即是“分离的”。分离的核酸或肽可以以基本纯化的形式存在，也可存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。

在本发明的上下文中，常见的核酸碱基使用以下缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷，“U”指尿苷。

除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有互为简并形式且编码同一氨基酸序列的核苷酸序列。鉴于某些形式的编码蛋白质的核苷酸序列可能包含内含子，术语编码蛋白质或RNA或cDNA的核苷酸序列也可以包括内含子。

“编码”是指诸如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，用作生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板，这些聚合物和大分子具有确定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果某基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生某蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链的核苷酸序列与mRNA序列相同，通常在序列表中提供，非编码链作为基因或cDNA转录的模板，此二者均可被描述为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

本文所用的术语“多核苷酸”指核苷酸链。进一步地，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文所用的核酸和多核苷酸可以互换使用。本领域技术人员均知晓核酸是多核苷酸，其可以水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以水解成核苷。本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何方式获得的所有核酸序列，所述方式包括但不限于重组方式，即用普通克隆技术和PCR等手段从重组文库或细胞基因组中克隆核酸序列，和合成方式。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，构成蛋白质序列或肽序列的最大氨基酸数量无限制。多肽包括任何含有两个或以上由肽键相连的氨基酸的肽或蛋白质。如本文所用，该术语既指短链也指较长的链，短链在本领域中通常也被称为，例如，肽、寡肽和寡聚体，较长的链本领域中通常被称为蛋白质，有许多种类。“多肽”包括，例如生物活性片段、基本同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。所述多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或其组合。

“相同”是指两个多肽或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的某一位点被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如，如果两个DNA分子中的某一位点都被腺嘌呤占据，则这两个分子在该位点是同源或相同的。两个序列之间的同源性/同一性百分比是两个序列共有的匹配位点数除以比较位点数×100的函数。举例而言，两条序列的10个位点中有6个匹配，则这两条序列60％相同。通常，比较时取两条序列比能获得最大同源性/同一性的匹配。

“载体”是包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体是本领域已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应解释为包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的示例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。

“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与要表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；其他表达元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，例如加入了重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

如本文所用，术语“启动子”定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的，能被细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列。

如本文所用，术语“启动子/调节序列”是指表达与启动子/调节序列可操作连接的基因产物所需的核酸序列。在某些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，该序列还可以包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调控元件。例如，启动子/调节序列可以是以组织特异性方式表达基因产物的序列。

“组成型”启动子是一种核苷酸序列，当该序列与编码或指定某一基因产物的多核苷酸可操作地连接时，在细胞内的大部分或所有生理条件下都能使该基因产物在细胞中生成。

“诱导型”启动子是一种核苷酸序列，当该序列与编码或指定某一基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当细胞中存在对应于启动子的诱导物时才使该基因产物在细胞中生成。

“组织特异性”启动子是一种核苷酸序列，当该序列与编码某一基因或由某一基因指定的多核苷酸可操作连接时，如果细胞是与启动子对应的组织类型的细胞，则使基因产物优先在该细胞中产生。

术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，其指代任何适用于本文所述的方法的动物或其体外和原位的细胞。在某些非限制性实施方式中，所述患者、受试者或个体是人。

“疾病”是动物的健康状态，所述动物不能维持体内状态平衡，如果疾病没有改善，则动物的健康状况持续恶化。相比之下，动物的“紊乱”是一种健康状态，在这种状态下，动物能够维持体内状态平衡，但动物的健康状况不如没有疾病时的健康状况。如果不加以治疗，紊乱不一定会导致动物健康状况进一步下降。

如果疾病或紊乱的症状的严重性、患者经历这种症状的频率或两者都降低了，则该疾病或紊乱被“减轻”或“改善”。“减轻”或“改善”这还包括阻止疾病或障碍的进展。如果疾病或紊乱的症状的严重性、患者经历这种症状的频率或两者都被消除了，则该疾病或紊乱被“治愈”。

“治疗性”治疗是对表现出病理征象的受试者进行的处理，目的是减少或消除这些征象。

如本文所用，“治疗疾病或病症”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种体征或症状的频率或严重性。疾病和紊乱在本文对治疗的描述中可互换使用。

化合物的“有效量”是足以向施用该化合物的受试者提供有益效果的化合物的量。如本文所用，术语“治疗有效量”指足以或有效地预防或治疗(延迟或预防其发生、预防其进展、抑制、减轻或逆转)疾病或病症，包括减轻这些疾病的症状的量。运输载体的“有效量”是指足以有效地结合或运送化合物的量。

发明详述

在本发明的第一方面，提供了一种拟抗肌萎缩蛋白(QD)，较佳地为功能性拟抗肌萎缩蛋白，更佳地为人源性拟抗肌萎缩蛋白。

本申请所涉及的拟抗肌萎缩蛋白是指较天然或野生型抗肌萎缩蛋白短的肽或蛋白质。本描述本发明时，“微抗肌萎缩蛋白”、“迷你抗肌萎缩蛋白”和“拟抗肌萎缩蛋白”意义相同。在本申请的其余部分，将使用术语“拟抗肌萎缩蛋白”，因为本发明的蛋白大小比先前公布的(例如由Yue等人(MD1)公布的)微抗肌萎缩蛋白大。

在具体的实施方式中，本发明的拟抗肌萎缩蛋白大小为全长抗肌萎缩蛋白大小(例如人抗肌萎缩蛋白全长3685氨基酸)的大于35％、40％、45％、50％、55％、或甚至大于60％。在优选的实施方式中，其具有全长抗肌萎缩蛋白大小的大于61.1％、62％、63％、64％或甚至65％。对人抗肌萎缩蛋白而言，这意味着本发明的拟抗肌萎缩蛋白优选的包含大于2361个氨基酸，更优选地包含大于2400个氨基酸，例如2406aa(WL2)或2427aa(WL1)。

抗肌萎缩蛋白的结构已有记载(见图1A)，其活性片段也已披露。如本领域所应理解的，活性片段是指全长序列的一个部分或多个部分，其至少保留了全长序列的部分生物功能。

“功能性”截短的抗肌萎缩蛋白或拟抗肌萎缩蛋白是指其对应的肽或蛋白质能够至少表现出野生型抗肌萎缩蛋白的某些功能，并能够至少部分缓解与缺乏天然抗肌萎缩蛋白的一种或多种症状，尤其是纤维退化、感染、坏死以及肌肉被瘢痕和脂肪组织替代、肌无力、呼衰和心衰、以及过早死亡。

优选地,本发明的拟抗肌萎缩蛋白(或多或少地)表现出与已有技术中的微抗肌萎缩蛋白相关的至少一种特性,特别是Yue等人(Mol Ther,2006.14(1):79-87)或Kodippili等人(Human Gene Therapy,2018,29(3),299-311)披露的特性。

其中优选的特性包括：

-与至少一种DAP(“抗肌萎缩蛋白相关蛋白”)结合，特别是与互生蛋白、肌营养蛋白、nNOS和/或PAR-1b蛋白结合；

-在肌纤维膜上募集DAP复合体；

-修复微管网络；

-保护肌肉免受损伤；

-保持蛋白整体结构和血影样重复(R)域组织；

-恢复肌肉结构和功能；尤其适合于骨骼肌，同时也适合于心肌和膈膜；

-更通常地，改善肌肉功能、步态、心功能、呼吸功能、生存期、生存质量和/或期望寿命。

如本领域所知的，所述特性可以通过对多种表达抗肌萎缩蛋白的细胞进行体外实验来验证，如对iPS衍生的人DMD致病细胞的实验、从各种动物模型中分离出来的肌肉纤维的体外组织实验、或基于患DMD或BMD的动物模型甚至患者的体内实验。所述动物模型例如mdx小鼠(Foster H.等.,Mol Ther,2008.16(11):第1825-32页)，mdx^4cv小鼠(Decrouy等.,Gen Ther,1997.4(5):401-8)，D2.B10-mdx/J小鼠(Coley等.,Human Molecular genetics,2016.25(1):130-45)，CXMDj犬(Koo等.,J Gene Med,2011.13(9):497-506)或GRMD犬(LeGuiner等.,Mol Ther.,2014.22(11):1923-35)。小鼠模型通常用于测试编码微抗肌萎缩蛋白的新结构。然而，由于小鼠表现出的疾病不太严重，没有免疫反应，因此这一模型存在缺陷。另一种动物模型，犬，被认为在预测基因治疗产品在人类中的治疗潜力方面更加可靠。Larcher等人(Plos One,2014,9(10),e110371)披露的大鼠模型能表现出心肌病，因此也非常合适。

如上所述，全长抗肌萎缩蛋白(图1A)的特征在于各个结构域：

-结合肌动蛋白的N端结构域(CH1CH2)；

-4个铰链区(H1到H4)；

-24个血影样蛋白重复区或杆状区(R1到R24)；

-半胱氨酸富集区；

-C端结构域。

在一实施方式中，本发明的拟抗肌萎缩蛋白相较全长抗肌萎缩蛋白至少有一个域缺失，优选至少一个血影样重复区(R)缺失。

在另一方面，本发明的拟抗肌萎缩蛋白包含至少一个关键蛋白质结合点位，尤其是F-肌动蛋白、nNOS蛋白和PAR-1b蛋白的结合位点。优选地，适合的拟抗肌萎缩蛋白包含nNOS和/或PAR1b的结合位点。nNOS结合位点表现在杆状区的重复序列16和17(R16、R17)(Lai等.,J.Clin.Invest.,2009.119:624-635)，而体外实验证明了抗肌萎缩蛋白重复序列8和9(R8、R9)有结合PAR1b的位点(Yamashita等.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2010.391:812-817)。在优选的实施方式中，适合的拟抗肌萎缩蛋白包含所述R16-R17和/或R8-9的杆状区。

在该方面中，本发明涉及一种包含R8、R9、R16和R17杆状区的拟抗肌萎缩蛋白。

在另一方面，本发明的拟抗肌萎缩蛋白的特征在于缺乏或去除了R4、R5、R6和R7杆状区(ΔR4-R7)的N端部分。

换言之，本发明的拟抗肌萎缩蛋白具有如下的N端部分，顺序为从N端起按下列顺序：

-结合肌动蛋白的N端结构域(CH1CH2)；

-H1铰链区；

-R1、R2和R3杆状区；

-H2铰链区；

-R8和R9杆状区。

这类拟抗肌萎缩蛋白在其N端部分显示结构CH1CH2H1R1R2R3H2R8R9。

在优选的实施方式中，这类拟抗肌萎缩蛋白进一步包含R16和R17杆状区。

在特定的实施方式中，本发明的拟抗肌萎缩蛋白至少包含现有技术中MD1微抗肌萎缩蛋白的血影样重复，即R1-R2-R3和R24。

优选地，本发明的拟抗肌萎缩蛋白较MD1微抗肌萎缩蛋白还包含杆状(R)区，优选选自下组的至少一个：R14、R15、R20、R21、R22和R23。在优选的实施方式中，所述拟抗肌萎缩蛋白还包含R22-R23，并可能包含R14-15或R20-21。

在具体的实施方式中，本发明的拟抗肌萎缩蛋白缺少下述杆状区：

R4到R7、R10到R15和R18-R19。换言之，这类拟抗肌萎缩蛋白包含R1到R3、R8-R9、R16-R17和R20和R24；或

R4到R7、R10到R13和R18到R21。换言之，这类拟抗肌萎缩蛋白包含R1到R3、R8-R9、R14到R17和R22到R24；

优选地，其进一步包含：

-完整的N端结构域，对应序列SEQ ID NO:2或3的1到252位氨基酸

-完整的半胱氨酸富集(CR)区，分别对应序列SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:20的1822到2102位氨基酸，或SEQ ID NO:3的1801到2081位氨基酸；

-部分或全长C端结构域，优选全长C端结构域，分别对应序列SEQ ID NO:2或SEQID NO:20的2103到2427位氨基酸,或SEQ ID NO:3的2082到2406位氨基酸。可能的部分C端结构域为WO2016/177911中公开的MD1、MD2、MD3或MD4的截短C端结构域；

-可能地至少一个铰链(H)区，选自H1、H2、H3和H4构成的组，优选地至少H1、H2和H4，可能地为H1、H2、H3和H4。

在具体的实施方式中，本发明的拟抗肌萎缩蛋白为：

-ΔR4-R7ΔR10-R15ΔR18-R19拟抗肌萎缩蛋白(也称作WL1)，优选地具有SEQ IDNO:2所示的序列；或

-ΔR4-R7ΔR10-R13ΔR18-R21拟抗肌萎缩蛋白(也称作WL2)，优选地具有SEQ IDNO:3所示的序列；

在优选的实施方式中，本发明的拟抗肌萎缩蛋白为：ΔR4-R7ΔR10-R15ΔR18-R19或ΔR4-R7ΔR10-R13ΔR18-R21拟抗肌萎缩蛋白。在另一优选的实施方式中，本发明的拟抗肌萎缩蛋白包含或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的序列构成。

在一实施方式中，所述拟抗肌萎缩蛋白与公开的拟抗肌萎缩蛋白，特别是序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的是“基本相同”的，即大约60％相同，优选地大约70％相同，更优选地大约80％相同，更进一步优选地大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或再进一步优选地大约99％相同。

在特定的实施方式中，本发明的ΔR4-R7ΔR10-R15ΔR18-R19拟抗肌萎缩蛋白在其编码序列中至少存在以下两种突变之一(与SEQ ID NO:2所示序列相比)：

-第49位丝氨酸取代精氨酸(R→S)；和/或

-第748位丝氨酸取代苯丙氨酸(F→S)。

在具体的实施方式中，本发明的ΔR4-R7ΔR10-R15ΔR18-R19拟抗肌萎缩蛋白包含或由SEQ ID NO:20所示的序列组成。

本发明的另一方面涉及一种核酸序列，所述核酸序列编码上述的拟抗肌萎缩蛋白。

在一实施方式中，所述编码本发明的拟抗肌萎缩蛋白的核酸序列包含或由SEQ IDNO:4所示的序列构成。

在一实施方式中，所述编码本发明的拟抗肌萎缩蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:4所示的序列是“基本相同”的，即大约60％相同，优选地大约70％相同，更优选地大约80％相同，更进一步优选地大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或再进一步优选地大约99％相同。

在优选的实施方式中，本发明的核酸序列包含或由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22所示的序列构成。

在另一实施方式中，所述编码本发明的拟抗肌萎缩蛋白的核酸序列包含或由SEQID NO:21所示的序列构成。

在一实施方式中，所述编码本发明的拟抗肌萎缩蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:21所示的序列是“基本相同”的，即大约60％相同，优选地大约70％相同，更优选地大约80％相同，更进一步优选地大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或再进一步优选地大约99％相同。

在优选的实施方式中，本发明的拟抗肌萎缩蛋白是使用所谓的双AAV载体系统产生的。

本发明的表达系统通常由2个AAV载体组成。在基于2个AAV载体共有的重叠区域进行体内重组后，能够产生大量拟抗肌萎缩蛋白。因此，编码拟抗肌萎缩蛋白的核酸序列可分为两部分，即编码其N端部分的5’序列和编码其C端的3’序列。5’序列的3’端和3’序列的5’端是同源的，甚至是相同的，以便进行同源重组。

在本发明的另一方面，涉及包含2个AAV载体的双AAV载体系统，其中

第一AAV载体包含在5’和3’AAV ITR之间的第一核酸序列，该序列编码拟抗肌萎缩蛋白的N端部分，

第二AAV载体包含在5’和3’AAV ITR之间的第二核酸序列，该序列编码拟抗肌萎缩蛋白的C端部分，

其中所述第一和第二核酸序列包含重叠区，所述重叠区允许通过重组生产本发明的拟抗肌萎缩蛋白。

如下文所述，在本发明的框架内，术语“重叠区”(或“重叠序列”)和“同源区”(或“同源序列区”)具有相同含义，可互换使用。

换言之，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含重组的腺相关病毒(AAV)载体，优选两个载体，所述载体携带有互补结构，允许表达本发明的拟抗肌萎缩蛋白。

在本发明的框架内，术语“组合物”可以被“结合物”、“组合”或“表达载体”替代。其意指两个AAV载体共同工作且必须互相接触，以形成同源重组然后产生活性蛋白。不过，他们可以处于一个单独的组合物中，也可能处在两个分开的组合物中并在使用前混合。

在特定的实施例中，第一腺相关病毒(AAV)载体包括：

i)AAV 5’ITR(反向末端重复)序列；

ii)由启动子控制的基因部分；

iii)AAV 3’ITR序列。

此外，第二腺相关病毒(AAV)载体包括：

iv)AAV 5’ITR(反向末端重复)序列；

v)优选地连有多聚腺苷酸化信号的基因部分；

vi)AAV 3’ITR序列。

这两个AAV载体具有互补序列，该互补序列在重组时将形成一个功能单元。如技术人员所知，重组是由于细胞DNA修复途径，通过识别每条AAV载体上的同源序列发生的。

因此，所述的两个AAV载体的基因部分需要满足下列条件：

-所述第一和第二AAV载体的基因部分共同含有编码本发明拟抗肌萎缩蛋白(优选为人源)的开放阅读框；

-所述第一和第二AAV载体的基因部分都含有同源区，所述同源区在同源重组后能够允许所述开放阅读框的重建。

“双AAV系统”意指由两个AAV载体构成的载体系统，所述系统中每个载体都携带有编码需要运送到细胞中的本发明拟抗肌萎缩蛋白的序列的一部分，编码所述拟抗肌萎缩蛋白的开放阅读框(ORF)由第一和第二核酸序列间的相互作用重组入细胞中。本发明的双载体系统使用包含允许(同源)重组的序列的载体，即重叠载体。因此，通过在导入每个AAV载体的抗肌萎缩蛋白基因上加入一段合适的重叠区来进行同源重组，以重组拟抗肌萎缩蛋白。

在本发明中，系统中每个腺相关病毒(AAV)载体都包含一表达结构，也称为“表达盒”或“插入物”。本申请中所述的“插入物”优选地定义为位于AAV基因组5’和3’ITR(“反向末端重复”)序列间的核酸序列。

如本领域所公知，所述插入物的大小不应太多地超过野生型AAV基因组长度。例如，AAV2包含2个各145bp的ITR序列，并含有4682bp(包括ITR序列)的基因组。

在特定的实施方式中，导入每个AAV载体的编码部分拟抗肌萎缩蛋白的核酸序列的长度小于5kb，例如小于4.9、4.8、4.7、4.6或4.5kb。

为了获益和限制AAV包装的大小，所述核酸序列对应于外显子。换言之，所述核酸序列优选为cDNA片段。

为获益，由两AAV结合得来的阅读框编码拟抗肌萎缩蛋白(MD)，优选地编码功能性的拟抗肌萎缩蛋白，更优选地编码人源性拟抗肌萎缩蛋白，如前所述。

在优选的实施方式中，由所述双AAV载体系统生产的拟抗肌萎缩蛋白包含至少2000个氨基酸(aa)，优选至少2100aa、2200aa、2300aa、2400aa或2500aa。在另一实施方式中，由所述AAV载体生产的微抗肌萎缩蛋白包含不超过3000个氨基酸(aa)，优选不超过2900aa、2800aa、2700aa、2600aa、2550aa或2500aa。在优选的实施方式中，由所述双AAV载体系统生产的拟抗肌萎缩蛋白包含介于2400个到2500个aa，即其大小对应于全长抗肌萎缩蛋白大小的约70％。

在本发明的双载体系统中，所述第一和第二核酸序列具有一序列同源区来促进分子间同源重组，由此通过重组双AAV系统中的两个载体来生产大型拟抗肌萎缩蛋白转基因，也即分别地编码拟抗肌萎缩蛋白N端部分和C端部分的核酸序列。在实行所述重叠系统的特定实施方式中，序列同源区的长度可以在较大范围内变化，只要生成的插入物(包括5’-和3’-ITR序列、和表达控制序列)的大小满足封装入AAV载体的大小限制。本领域技术人员很清楚该大小限制，并且能够基于该知识调整所述第一和第二核酸序列的大小，从而调整序列同源区的大小。因此，在特定的实施方式中，所述序列同源区是抗肌萎缩蛋白基因的多核苷酸序列，其长度为小于4599个核苷酸，例如小于4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500或1000个核苷酸。在另一特定的实施方式中，所述序列同源区是拟抗肌萎缩蛋白基因的多核苷酸序列，其长度为至少100个核苷酸，例如至少100、200、300、400、500、600、700或800个核苷酸。在另外的特定实施方式中，所述序列同源区是拟抗肌萎缩蛋白基因的多核苷酸序列，其长度包括在100到1000个核苷酸之间，特定地在500到1000个核苷酸之间，例如在700到900个核苷酸之间，优选地在750到850个核苷酸之间。

在另一实施方式中，所述同源区包含至少一个(1)完整血影样区域(R)，优选两个(2)完整区域，可能还包括另外两个(2)截短的区域，和可选的一个(1)铰链区(H)。它们可能对应于天然抗肌萎缩蛋白上的相邻区域。优选地，它们位于天然抗肌萎缩蛋白的中心区，例如位于R14和R21之间。

在具体的实施方式中，所述重叠区对应于编码下述部分的序列：

-截短的R16、R17、H3和截短的R20，或

-截短的R14、R15、R16和截短的R17；或

-截短的H3、R20和R21。

在特定的实施方式中，所述第一核酸序列可编码抗肌萎缩蛋白的N端结构域、H1、R1到R3、H2、R8、R9、R16、R17、H3和截短的R20，所述第二核酸序列可编码抗肌萎缩蛋白的截短的R16、R17、H3、R20到R24、H4、CR区和C端结构域(所述抗肌萎缩蛋白为如前所述的全长的或截短的，优选全长的)。

在具体的实施方式中，所述第一核酸序列包括或由SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:23所示的序列组成，所述第二核酸序列包括或由SEQ ID NO:7所示的序列组成。序列SEQ IDNO:12的800bp的重叠区对应SEQ ID NO:6(或SEQ ID NO:23)所示序列的3779到4578位核苷酸和SEQ ID NO:7所示序列的173到972位核苷酸。

在另一实施方式中，所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:6(或SEQ ID NO:23)所示序列的646到4578位核苷酸，所述第二核酸序列包含SEQ ID NO:7所示序列的173到4323位核苷酸。

在具体的实施方式中，所述第一核酸序列包括或由SEQ ID NO:8所示的序列组成，所述第二核酸序列包括或由SEQ ID NO:9所示的序列组成。800bp的重叠区对应SEQ ID NO:8所示序列的3798到4597位核苷酸和SEQ ID NO:9所示序列的193到992位核苷酸。在另一实施方式中，所述800bp的重叠区序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。

在另一实施方式中，所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:8所示序列的665到4597位核苷酸，所述第二核酸序列包含SEQ ID NO:9所示序列的193到4343位核苷酸。

在另一实施方式中，所述第一核酸序列可编码抗肌萎缩蛋白的N端结构域、H1、R1到R3、H2、R8、R9、R14、R15、R16和截短的R17、所述第二核酸序列可编码抗肌萎缩蛋白的截短的R14、R15、R16、R22到R24、H4、CR区和C端结构域(所述抗肌萎缩蛋白为如前所述的全长的或截短的，优选全长的)。

在具体的实施方式中，所述第一核酸序列包括或由SEQ ID NO:13所示的序列组成，所述第二核酸序列包括或由SEQ ID NO:14所示的序列组成。800bp的重叠区对应SEQ IDNO:13所示序列的3701到4500位核苷酸和SEQ ID NO:14所示序列的182到981位核苷酸。在另一实施方式中，所述800bp的重叠区序列如SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16或SEQ ID NO:17所示。

在另一实施方式中，所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:13所示序列的646到4500位核苷酸，所述第二核酸序列包含SEQ ID NO:14所示序列的182到4347位核苷酸。

在另一特定的实施方式中，所述第一核酸序列可编码抗肌萎缩蛋白的N端结构域、H1、R1到R3、R16、R17、R18、R19、H3、R20和R21、所述第二核酸序列可编码抗肌萎缩蛋白的截短的H3、R20到R24、H4、CR区和C端结构域(所述抗肌萎缩蛋白为如前所述的全长的或截短的，优选全长的)。

在具体的实施方式中，所述第一核酸序列包括或由SEQ ID NO:18所示的序列组成，所述第二核酸序列包括或由SEQ ID NO:19所示的序列组成。375bp的重叠区对应SEQ IDNO:18所示序列的4091到4465位核苷酸和SEQ ID NO:19所示序列的193到567位核苷酸。

编码拟抗肌萎缩蛋白的核酸序列优选为人源的，但也可以是犬的、大鼠的、小鼠的或非人灵长类动物的序列。在一实施方式中，所述核酸序列来源于将要被施用于的生物，优选地为人源序列以便施用于人体。

在本发明中，所述序列同源区，即重叠区，可以是经过优化以进行重组的序列。此类序列包括如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的序列，是从对应的野生型序列(SEQ ID NO:9所示序列的193到992位核苷酸)优化而来的，或如SEQ ID NO:15、SEQID NO:16或SEQ ID NO:17所示的序列，是从对应的野生型序列(SEQ ID NO:14所示序列的182到981位核苷酸)优化而来的。

根据已知的方法，存在不同的方法优化编码蛋白质的序列，以增加mRNA水平(重组和转录)和/或蛋白质水平(翻译)。在本发明中，本发明的双AAV载体系统中载体的序列优选地经过优化以促进重组，并可能增加拟抗肌萎缩蛋白多肽的体内表达。

在实施中，可优化下述序列：

-编码抗肌萎缩蛋白N端部分的第一核酸序列；

-编码抗肌萎缩蛋白C端部分的第二核酸序列；和/或

-位于第一和第二核酸序列间的重叠区。

在特定的实施方式中，抗肌萎缩蛋白的非重叠序列和重组区都经过了优化。序列优化可包含核酸序列的许多变化，包括密码子的优化、GC含量的增加、CpG岛数量的减少、选择性开放阅读框(ARF)数量的减少和/或剪接供体和剪接受体位点数量的减少。由于遗传密码的简并性，不同的核酸分子可能编码同一蛋白质。众所周知，不同生物的遗传密码往往倾向于使用编码相同氨基酸的几个密码子中的一个，而不是其他密码子。通过密码子优化，向核苷酸序列中引入变化，该变化利用了给定细胞环境中存在的密码子偏性，使所得到的密码子优化核苷酸序列与非密码子优化序列相比，更有可能在该给定细胞环境中以相对较高的水平表达。在本发明优选的实施方式中，此类编码拟抗肌萎缩蛋白且经过序列优化的核酸序列和编码同一蛋白的非密码子优化的核酸序列相比，经密码子优化的方式(例如利用人类特定的密码子使用偏性)促进了它在人细胞中的表达和稳定性。在特定的实施方式中，拟抗肌萎缩蛋白的完整序列，即非重叠和重叠区，都经过了优化以促进其在目的或宿主细胞中的产生，尤其是在人体中。

在本发明的另一方面，涉及一种AAV载体，所述AAV载体对应本发明双AAV载体系统的第一AAV载体或第二AAV载体。

每个AAV载体都包含编码抗肌萎缩蛋白基因的相关部分(分别为N端和C端部分)的核酸序列，所述序列优选地如上文所定义，但也包括在整个基因重组后正确表达所述拟抗肌萎缩蛋白所需的所有序列。

在一实施方式中，所述第一和第二AAV载体的第一和第二核酸序列受到调控序列的控制。优选地，所述第一核酸序列前是启动子，后面是可选的内含子，第二核酸序列后面是一段多聚腺苷酸化信号。

该启动子可以是天然的或合成的(人工的)启动子，可以是诱导型或组成型启动子。

在一实施方式中，所述启动子是普遍存在的启动子，或具有低组织特异性。举例而言，所述表达载体可含有磷酸甘油酸激酶1(PGK)、EF1、ACTA1、β-肌动蛋白、肌间线蛋白(Desmin)、所有MCK变体、心肌肌钙蛋白和CMV启动子。

在优选的实施方式中，启动子序列被筛选以充分调控置于其控制下的核酸序列的表达，包括调控表达水平和组织特异性。

在一实施方式中，所述表达载体包含肌肉组织特异性启动子。该启动子能够在骨骼肌、膈肌、可能的心肌和卫星细胞中强表达。技术人员所知的合适启动子如肌间线蛋白启动子、肌酸激酶(MCK)启动子、截短型肌酸激酶启动子，例如CK6、CK7或CK8启动子、Syn启动子、MyoD、Myf5、Vcam、Pax3和Pax7卫星细胞启动子。另一种启动子是合成启动子C5-12(spC5-12)。也可以使用包含来自两个或更多转录调控元件的序列的杂交启动子(参见例如PCT/EP2019/053061)。

优选地，将第一核酸序列置于肌肉特异性启动子的控制下。换言之，第一AAV载体进一步包含肌肉特异性启动子，该启动子可操作地连接到编码抗肌萎缩蛋白N端部分的核酸序列上。

如本领域所知，有待引入一个或另一个AAV载体中的其他可能的调控序列包括但不限于：

-多聚腺苷酸化信号，优选地位于编码功能性微抗肌萎缩蛋白的序列的3’端；

-转录稳定序列，例如内含子；

-增强子序列；

-miRNA靶序列，其可抑制编码功能性抗肌萎缩蛋白的序列在非靶组织中的表达，其中所述表达是非期望性的，例如在其可能有毒的情况下。

在一方面，所述内含子选自下组：一种人β珠蛋白b2(或HBB2)内含子、FIX内含子和鸡β-珠蛋白内含子，其中所述内含子可选地为修饰的内含子，例如修饰的HBB2内含子、修饰的FIX内含子或修饰的鸡β-珠蛋白内含子。

在另一实施方式中，所述多聚腺苷酸化信号选自人β珠蛋白多聚腺苷酸化信号、牛生长激素多聚腺苷酸化信号、SV40多聚腺苷酸化(pA)信号或另一自然发生或人工多聚腺苷酸化信号中选择。

在特定的实施方式中，本发明的双AAV载体系统包括下列元件中的至少一个，优选地包括全部：

-spC5-12启动子，优选地对应SEQ ID NO:6(或SEQ ID No:23)所示序列的173到506位核苷酸；

-嵌合内含子，优选地对应SEQ ID NO:6(或SEQ ID No:23)所示序列的507到639位核苷酸；和

-SV40 pA信号，优选地对应SEQ ID NO:7所示序列的4324到4545位核苷酸。

为了克隆和生产病毒颗粒，可以将表达构造插入适合于选择、复制和生产拟抗肌萎缩蛋白的质粒中。

本发明所述的包含表达构建物的病毒载体是腺相关病毒(AAV)载体。

腺相关病毒(AAV)载体已成为治疗各种疾病的强有力的基因传递工具。AAV载体具有许多特性，包括低致病性、较轻的免疫原性以及以稳定有效的方式转导有丝分裂后细胞和组织的能力，这些特性使其非常适合基因治疗。通过选取合适的AAV血清型、启动子和传递方法，AAV载体中包含的特定基因的表达可以被特定地靶向一种或多种类型细胞。

在一实施方式中，编码序列被包含在AAV载体中。目前已知的天然存在AAV血清型超过100种。AAV衣壳存在许多天然变种，使我们能够识别和选自拥有特定的适合于抗肌萎缩蛋白疾病的特性的AAV。可以用常规的分子生物技术改造AAV病毒，使这些病毒得到优化，以向特定细胞输送核酸序列、最小化其免疫原性、调整稳定性和病毒寿命、使其有效降解、准确输送到细胞核。

根据上文提到的，使用AAV是DNA外源传递的常见模式，因为它相对无毒性、能高效地传递基因，并且可以方便地针对特定目的进行优化。在分离自人或非人灵长类(NHP)的特征良好的AAV血清型中，人血清型2是第一个被开发用作基因转移载体的AAV。目前使用的其他AAV血清型包括AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。另外，也可以使用非天然的工程化变种和嵌合或杂交AAV。

用于组装载体的理想的AAV片段包括衣壳蛋白，所述衣壳蛋白包括vp1、vp2、vp3和可变区，病毒复制相关蛋白，所述病毒复制蛋白包括rep78、rep68、rep52和rep40，以及编码上述蛋白的序列。这些片段可以方便地用在各种载体系统和宿主细胞中。

这些片段可以单独应用、和其他AAV血清型序列或片段联合应用、或和源自其他AAV或非AAV病毒序列的元件联合应用。如本文所用，人工AAV血清型包括但不限于含有非天然存在的衣壳蛋白的AAV。该人工衣壳可以用任何合适的技术生成，如使用选定的AAV序列(例如一段vp1衣壳蛋白的片段)联合异质序列，所述异质序列可取自另一个选定的AAV血清型、同一AAV血清型上的非连续部分、取自非AAV病毒来源、或取自非病毒来源。人工AAV血清型可以是但不限于嵌合AAV衣壳、重组AAV衣壳或“人源化的”AAV衣壳。其中示例性的AAV或人工AAV包括AAV2/8(US7,282,199)、AAV2/5(可从美国国立卫生研究院获得)、AAV2/9(WO2005/033321)、AAV2/6(US 6,156,303)、AAVrh8(WO2003/042397)、和rh74-AAV9(EP18305399.0)。在一实施方式中，本发明的组合物和方法中可用的载体至少包括编码选定的AAV血清型衣壳的序列，例如AAV8衣壳或其片段。

在另一实施方式中，可用的载体至少包括编码选定的AAV血清型病毒复制相关蛋白，例如AAV8病毒复制相关蛋白或其片段。可选地，这些载体可同时包含AAV衣壳蛋白和病毒复制相关蛋白。在同时包含AAV衣壳蛋白和病毒复制相关蛋白的载体中，所述AAV病毒复制相关序列和衣壳序列可以是来自同一血清型的，例如都来自于AAV8.或者，所用的载体的病毒相关复制序列和衣壳序列来自不同的AAV血清型。在一实施方式中，所述病毒复制相关序列和衣壳序列可以由不同来源表达(例如，不同载体，或宿主细胞和载体)。在另一实施方式中，所述病毒复制相关序列在框架中与另一AAV血清型的衣壳序列相融合，以构建嵌合AAV载体，例如AAV2/8(US 7,282,199)。

在一实施方式中，所述第一和第二AAV载体各自是具有AAV来源衣壳的AAV载体，例如AAV1、AAV2、AAV2变体、AAV3、AAV3变体、AAV3B、AAV3B变体、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6变体、AAV7、AAV8、AAV9、AAV2G9、AAV10(例如AAVcy10和AAVrh10)、AAVrh74、AAVdj、AAV-Anc80、AAV-LK03、AAV2i8、和猪AAV，例如AAVpo4和AAVpo6蛋白衣壳，或是具有嵌合衣壳的AAV载体，优选地具有AAV8、AAV9、AAVrh74、AAV2i8衣壳或AAV9-rh74嵌合衣壳，更优选地具有AAV8、AAV9或AAVrh74衣壳，进一步优选地具有AAV8或AAV9衣壳。

在本发明使用的AAV载体中，AAV基因组优选为单链核酸。

如本领域所知的，重组病毒颗粒可以通过，例如293HEK细胞三重转染、单纯疱疹病毒系统和通过巴库洛病毒系统或使用特定的细胞系得到。优选地，所述病毒颗粒通过293HEK细胞三重转染得到。

载体滴度通常表示为每毫升病毒基因组数(vg/ml)。

本发明还涉及如上文所述的使用双AAV载体系统转导的细胞，尤其是肌肉细胞。

在另一实施方式中，本发明涉及一种组合物，优选为治疗组合物或药物，包括上文所述的双AAV载体系统和可能的其他活性分子(其他基因治疗产品、化学分子、肽、蛋白、……)，用于治疗同一疾病或其他疾病。

本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物包括双AAV载体系统或该系统的第一或第二AAV载体。所述药物组合物包括治疗有效量的治疗剂(本发明的核酸或载体)，和药学上可接受的载体。在特定的实施方式中，术语“药学上可接受的”指经联邦或州政府监管机构批准，或在美国或欧洲药典或其他公认药典中列出的用于动物和人类的药物。术语“载体”指与药剂一同施用的稀释剂、佐剂、敷料、或赋形剂。所述药学载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物用于静脉注射时，优选的载体为水。盐水溶液和葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是用于注射溶液中。合适的药用辅料包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

如有需要，所述组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。所述组合物可以为溶液、悬浮液、乳液、缓释制剂等剂型。E.W.Martin的“雷明顿药学技术(Remington'sPharmaceutical Sciences)”中描述了合适的药物载体的示例。所述组合物将包含治疗有效量的治疗用药物，优选为纯化形式，以及合适的量的载体，以便提供适合向受试者给药的形式。

在优选的实施方式中，根据常规方法将该组合物配制成适用于人体静脉注射的药物组合物。通常，用于静脉给药的组合物是无菌等渗水缓冲液中的溶液。必要时，该组合物还可包括溶解剂和局部麻醉剂(例如利多卡因)，以缓解注射部位的疼痛。

在一实施方式中，本发明的组合物适合被施用于人。

所述组合物优选为液体剂型，优选为盐水组合物，更优选为磷酸盐缓冲盐水(PBS)组合物或乳酸林格溶液。

可通过标准临床技术确定本发明的治疗剂(即核酸或载体)在治疗肌营养不良疾病中的有效量。此外，体内和/或体外分析可以选择性地用于辅助预测最佳剂量范围。配方中的精确使用量还将取决于给药途径、体重和疾病的严重程度，并应根据医师的判断和每位患者的情况来决定。

上述的AAV载体或组合物可以用作药物，尤其是用作基因治疗产品，用于向有需要的受试者施用。本发明的另一方面涉及上述公开的AAV载体或组合物用于制备药物的用途。

合适的给药应能够将治疗有效量的基因治疗产品输送到靶组织，尤其是骨骼肌，可能包括膈肌和心脏。在本发明中，当基因治疗产品是包含编码拟抗肌萎缩蛋白的核酸序列的病毒载体时，治疗剂量定义为受试者每千克体重(kg)施用的含有拟抗肌萎缩蛋白序列的病毒颗粒(vg意为病毒基因组)的量。

可用的给药途径有局部给药、肠内给药(产生系统性作用，但通过胃肠道给药)或肠外给药(产生系统性作用，但通过胃肠道以外的途径给药)。本文公开的组合物的优选给药途径为肠外给药，包括肌肉给药(即进入肌肉)和全身给药(即进入循环系统)。基于此，术语“注射”(或“灌注”或“输注”)包括血管内，尤其是静脉内(IV)和肌肉内(IM)给药。注射通常使用注射器或输液管进行。

在一实施方式中，所述组合物的系统递送包括在局部治疗部位附近施用该组合物，即在衰弱的肌肉附近的静脉或动脉中施用。在某些实施方式中，本发明包括局部递送组合物,所述组合物能产生系统性效应。这种给药途径通常被称为“局部输注”、“孤立肢体灌注给药”或“经静脉高压肢体灌注给药”，已成功地用作肌营养不良症的基因递送方法(Zheng Fan等(2012,Molecular Therapy 20(2),456-461)。

本发明的优选给药方法是全身给药。全身注射开辟了通向全身的注射通路，能够到达受试者全身的肌肉，包括心脏和膈膜，然后对这些全身性的和仍然无法治愈的疾病产生实际的治疗。在某些实施方式中，系统性递送包括将组合物输送给受试者，使得组合物可以到达受试者全身。

在优选的实施方式中，全身给药，包括子宫内给药，是通过在血管内注射组合物实现的，即血管内(静脉内或动脉内)给药。

在一实施方式中，经由外周静脉通过静脉注射施用该组合物。或者，通过肌肉注射进行全身给药。

当进行系统性递送时，含有本发明双AAV载体系统的组合物优选以小于等于10¹⁵vg/kg或甚至10¹⁴vg/kg的剂量施用，优选地在10¹²vg/kg到10¹⁴vg/kg之间，更优选地在5.10¹²vg/kg到10¹⁴vg/kg之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9.10¹³vg/kg。为了避免潜在毒性和/或免疫反应，剂量还可以为例如1、2、3、4、5、6、7、8或9.10¹²vg/kg或更低。如技术人员所知，在保证获得满意效率的前提下，优选尽可能低的剂量。

在特定的实施方式中，治疗包括单次施用该组合物。

在一实施方式中，会在1个月，或3个月或6个月，或甚至1年、2年、5年、10年，或甚至更长时间内观察AAV载体的存在和/或拟抗肌萎缩蛋白的表达以及相关的治疗获益。

在本发明中，受试者优选为人类，但也可以是小鼠、大鼠、非人灵长类或狗。

本发明中的“肌营养不良疾病”指与抗肌萎缩蛋白基因缺陷相关的疾病。该缺陷可能是基因缺失或突变导致表达水平降低或表达缺失、在开放阅读框中引入过早的终止密码子，或产生失活的蛋白。肌营养不良疾病优选为由抗肌萎缩蛋白基因突变引起的杜氏和贝克型肌营养不良症(DMD/BMD)。所述突变可导致抗肌萎缩蛋白表达缺失或低水平表达，或产生部分或完全失活的、可能被截短的蛋白质。

可从本发明的组合物获益的受试者包括被诊断患有肌营养不良症或有可能发展为肌营养不良症的所有患者。可通过本领域技术人员已知的任何方法，基于对抗肌萎缩蛋白基因中的突变或缺失的识别，选择待治疗的受试者，包括例如对抗肌萎缩蛋白基因进行测序，和/或通过本领域技术人员已知的任何方法评估抗肌萎缩蛋白的表达水平或活性。因此，所述受试者既包括已经表现出营养不良疾病症状的受试者，也包括具有发展为所述疾病风险的受试者。在一实施方式中，所述受试者包括已经表现出肌营养不良疾病症状的受试者。在另一实施方式中，所述受试者为门诊患者和早期非门诊患者。

在一实施方式中，本发明涉及如上所述的双AAV载体系统或包含所述AAV载体的用于治疗肌营养不良疾病的组合物。在另一实施方式中，本发明涉及上述的AAV载体或包含所述AAV载体的组合物的用途，所述用途为用于制备用于治疗营养不良疾病的药物。

换言之，本发明提供了一种治疗受试者肌营养不良疾病的方法，包括向受试者施用上述的双AAV载体系统或包含所述系统的组合物。

此类双AAV载体系统和包含所述系统的组合物主要用于基因治疗，特别是用于治疗患有杜氏肌营养不良症(DMD)或贝克型肌营养不良症(BMD)的受试者。首要治疗目的是提供安全(无毒)的治疗。进一步的目的是提供有效的治疗方法，以延迟、减缓或预防疾病的发展，并可能改善在临床上易于观测的患者表型。本发明的AAV载体和组合物可用于受试者的以下方面：

-改善肌肉功能，尤其是骨骼肌，同时也包括心肌和膈膜；

-改善步态；

-改善心功能；

-改善呼吸功能；

-延长生存期，更广义地为提高生活质量和预期寿命。

除非另有说明，否则本发明的操作采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术完全在本领域技术人员的权限内。这些技术在文献中已充分介绍，例如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratoryManual)》第四版(Sambrook,2012)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(Gait,1984)；《动物细胞培养(Culture of Animal Cells)》(Freshney,2010)；《酶学实验方法(Methods in Enzymology)》；《实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)》(Weir,1997)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(Miller and Calos,1987)；《精编分子生物学实验指南(ShortProtocols in Molecular Biology)》(Ausubel,2002)；《聚合酶链反应：原理、应用和故障排除(Polymerase Chain Reaction:Principles,Applications and Troubleshooting)》(Babar,2011)；《现行免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》(Coligan,2002)。这些技术适用于生产本发明的多核苷酸和多肽，因此，在制造和实施本发明时可以使用这些技术。下面将讨论在特定实施例中尤其适用的技术。

本文引用的每项专利、专利申请和出版物的公开内容整体通过引用并入本文。

在不作进一步描述的情况下，相信本领域的普通技术人员可以根据上文的描述和下面的示例性实施例来制备和利用本发明的化合物并实施所要求保护的方法。

实施例

下面通过参考示例性实施例和附图进一步详细描述本发明。

这些示例仅供说明之用，并非构成对本发明的限制。

附图简述

图1：不同形式抗肌萎缩蛋白图谱：

A/全长抗肌萎缩蛋白图谱；

B/Yue等公开的MD1微抗肌萎缩蛋白图谱；

C/Kodippili公开的ΔH2-R15拟抗肌萎缩蛋白(SEQ ID NO:1)(DD)；

D/本发明的ΔR4-R7ΔR10-R15ΔR18-R19拟抗肌萎缩蛋白(SEQ ID NO:2)(WL1)；

E/本发明的ΔR4-R7ΔR10-R13ΔR18-R21拟抗肌萎缩蛋白(SEQ ID NO:3)(WL2)；

图2：不同形式抗肌萎缩蛋白的生产水平分析：

A/抗-抗肌萎缩蛋白抗体蛋白质印迹分析

给3月龄mdx小鼠的胫骨前肌(TA肌)注射1x10¹⁰vg AAV。Ta肌在注射后30天恢复，并进行蛋白质印迹分析检测抗肌萎缩蛋白抗体(DysB)。6至8通道(Opt)显示了使用本发明的双AAV载体系统获得的蛋白质WL1水平(280kDa)，与之相比的有分别使用AAV2/9-hMD1(通道9:138kDa)、人类对照样品(FL:通道2:427kDa)和mdx(KO:通道3和通道4)获得的蛋白质WL1水平。来自匹配年龄段的mdx小鼠和C57BL/10小鼠的的对比肌肉只注射了盐水。

B和C/给1-2月龄WT小鼠的TA肌注射1-3x10¹⁰vg AAV。在注射后30天收集TA肌，使用抗抗肌萎缩蛋白抗体(DysB和Dys2)和抗α-辅肌动蛋白水平(α-辅肌动蛋白水平用作标准参照)进行蛋白质印迹分析。不同结构表达的蛋白水平比较：

-WL1 wt(由SEQ ID NO:8+9所示序列表达)：上半印迹中通道1到3；

-WL2 wt(由SEQ ID NO:13+14所示序列表达)：上半印迹中通道4到6；

-WL1 Opt(由SEQ ID NO:6+7所示序列表达)：上半印迹中通道7到9；

-PBS：下半印迹中通道10；

-DD(由SEQ ID NO:18+19所示序列表达)：下半印迹中通道1到3；

-WL1 Opt(由SEQ ID NO:6+7所示序列表达)：下半印迹中通道4到6；

-PBS：下半印迹中通道7。

图3：1月龄的Dba2_Mdx小鼠静脉注射以下药物后，评估TA肌中抗肌萎缩蛋白的表达和分布：

-含有SEQ ID NO:6所示序列的5’AAV载体和含有SEQ ID NO:7所示序列的3’AAV载体(注射7只小鼠；n＝3只WB中的代表性小鼠)；

-仅含有SEQ ID NO:6所示序列的5’AAV载体(注射2只小鼠；n＝1只WB中的代表性小鼠)；

-仅含有SEQ ID NO:7所示序列的3’AAV载体(注射2只小鼠；n＝1只WB中的代表性小鼠)；

-无载体，即PBS(注射5只小鼠；n＝2只WB中的代表性小鼠)

Ta肌在注射后70天恢复，并进行蛋白质印迹分析和冰冻切片。

A/使用抗抗肌萎缩蛋白抗体(Dys N-ter和DysC-ter)和α-肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹(WB)分析。预期尺寸＝280kDa；全长抗肌萎缩蛋白＝427kDa。

B/用Dys N-ter抗体在冰冻切片中进行免疫标记。

每张图片上都列出了阳性纤维的百分比。

图4：抗肌萎缩蛋白对TA肌肉的疗效评价如图3所示

A/切片用苏木精、荧光桃红、藏红花色素(HPS)染色

B/TMEM8C(左上)、CD11b(右上)和纤维连接蛋白(下)的表达水平

图5：使用抗抗肌萎缩蛋白抗体(Dys N-ter和Dys C-ter)和α-肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹检测，评估如图3中治疗的小鼠心脏中抗肌萎缩蛋白的表达

图6：评估TA(胫骨前肌)和DIA(膈肌)中抗肌萎缩蛋白的表达Dba2_Mdx小鼠静脉注射下列之一:含有SEQ ID NO:6所示序列的5’AAV载体和含有SEQ ID NO:7所示序列的3’AAV载体(5’mut+3’或双Dys mut)；注射5只小鼠；

含有SEQ ID NO:23所示序列的5’AAV载体和含有SEQ ID NO:7所示序列的3’AAV载体(5’cor+3’或双Dys cor)；注射5只小鼠

实验中包括未受注射(NI)的Dba2_Mdx小鼠(n＝3)和Dba2_WT小鼠用作对照。

Ta和DA肌在注射后3周恢复，并进行蛋白质印迹分析和冰冻切片。

A/使用抗抗肌萎缩蛋白抗体(Dys2)和α-肌动蛋白抗体(用于使样品正常化)进行蛋白质印迹(WB)分析。预期尺寸＝280kDa；全长抗肌萎缩蛋白＝427kDa，L＝ladder；HL＝高分子量ladder，T+＝阳性对照。

B/用Dys2抗体在冰冻切片中进行免疫标记。每张图片上都列出了阳性纤维的百分比。

图7：抗肌萎缩蛋白对肌肉的疗效评价如图6所示：TMEM8C(左上)、CD11b(右上)和纤维连接蛋白(下)的表达水平。

材料和方法

体内基因转移本研究采用不同的小鼠模型：野生型C57BL/10和C57BL/6J；mdx和Dba_2Mdx(D2.B10 mdx/J)。所有小鼠实验均按照伦理委员会批准的方案在埃夫里动物研究所CERFE内在适当的生物学控制下进行。

采用三种质粒构建方案制备腺相关病毒载体。

处死小鼠后，收集组织(TA肌肉和心脏)，在液氮冷却的异戊烷中快速冰冻，并储存在-80℃。

蛋白质印迹实验从组织样品中提取总蛋白。蛋白质提取物通过NuPAGE^TM凝胶分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。然后用奥德赛封闭缓冲液和PBS封闭膜，然后与适当的抗体(抗抗肌萎缩蛋白DysB或Dys2抗体、兔α-肌动蛋白(Life Technologies))和二级抗小鼠或抗兔结合(680或800)抗体杂交。

免疫组化使用Mouse on Mouse(M.O.M)试剂盒(Vector Labs)对TA肌肉冰冻切片进行染色。

一级抗体在4℃下培养过夜，然后用PBS-0.1％吐温洗3次，并与山羊抗小鼠或山羊抗兔二级抗体Alexa 594(Life Technologies)一起培养。

使用抗抗肌萎缩蛋白抗体(Dys2，1:100，小鼠单克隆，Novocastra)。

HPS染色使用苏木精(核染色)、福禄考(细胞质染色)和藏红花(胶原)对TA肌肉冰冻切片进行染色。

抗肌萎缩蛋白基因的PCR定量分析通过RT-定量PCR(RTqPCR)对收集自冰冻切片的cDNA进行定量检测，检测TMEM8C(表示纤维再生/TGE Mm00481256_m1，ThermoFisher)、CD11b(表示炎症/TGE Mm00434455_m1)和纤维连接蛋白(表示纤维化/TGE Mm01256744_m1)的表达。

结果：

1)AAV载体的构建

构建不同的重组AAV2/8或AAV2/9载体以评估其产生抗肌萎缩蛋白的相对效率：

表1检测的抗肌萎缩蛋白

2)肌内(IM)给药后抗肌萎缩蛋白基因分析

为了评估本发明的双载体系统产生的蛋白质的肌肉转导和表达水平，对载体进行体内分析。

1月龄的抗肌萎缩蛋白缺陷(mdx)小鼠接受1e10 vg AAV载体肌肉注射。胫骨前肌(Tibialis anterior,TA)肌肉在注射后30天恢复，并进行蛋白质印迹分析检测抗肌萎缩蛋白抗体(DysB)(图2A)6至8通道(Opt)显示了使用本发明的双AAV载体系统获得的蛋白质WL1OPT(280kDa)水平，与之相比的有分别使用AAV2/9-hMD1(通道9:138kDa)、人抗肌萎缩蛋白(FL:通道2:427kDa)和mdx(KO:通道3和通道4)获得的蛋白质WL1水平。来自匹配年龄段的mdx小鼠和C57BL/10小鼠的的对比肌肉只注射了盐水。如上所示，这些数据证实基于双AAV载体系统可以有效地产生本发明的截短型抗肌萎缩蛋白。

在进一步的实验中评估了不同的双AAV载体系统。1月龄的wt小鼠接受1-3e10 vgAAV载体肌肉注射。胫骨前肌(TA)在注射后30天恢复，并用抗肌营养不良蛋白(Dys2和DysB)和-肌动蛋白抗体进行蛋白质印迹检测。图2B和C显示了使用StudioLight软件用-肌动蛋白标准化后获得的蛋白质定量水平。

图2B所示的结果表明，本发明的拟抗肌萎缩蛋白(WL1 Opt)产生的水平显著高于WL1 wt和WL2 wt，甚至优于根据现有技术(DD)的构建体产生的拟抗肌萎缩蛋白。

因此，使用被认为最有希望用于功能评估的所述构建物进行了进一步的实验。

3)血管内(IV)注射后抗肌萎缩蛋白基因分析

A/使用WL1 Opt

在进行了IM实验后，选择WL1 Opt进行血管内(IV)注射实验。4周龄Dba_2Mdx小鼠接受血管内注射(5e11vg/小鼠)给药(5'+3'组n＝7；5'组n＝2；3'组n＝2；PBS组n＝5)。在基因转移后70天进行终点分析。

3-1肌肉内

在静脉注射后检测基于本发明的双AAV载体系统的拟抗肌萎缩蛋白生成(图3A)。

TA肌肉切片的免疫组化分析(图3B)显示了膜上的抗肌萎缩蛋白标记，并确认了本发明的拟抗肌萎缩蛋白的正确表达，尽管小鼠之间在表达水平上存在一定的异质性。

为了评估通过静脉注射给药的本发明的拟抗肌萎缩蛋白的治疗效果，用HPS对TA切片进行染色，这能够揭示组织的大体状态，尤其是炎症、纤维再生、纤维化。与wt和mdx小鼠相比，表达本发明拟抗肌萎缩蛋白的缺陷小鼠表现的形态居于两者之间(图4A)。这一观察结果通过相关标记物的测量得到证实(见图4B)。对于每项指标，可以观察到受治疗动物的水平有所改善，位于wt和mdx小鼠中观察到的水平之间。

3-2心肌内

除了如上所述对肌肉的有益作用外，本发明的转基因拟抗肌萎缩蛋白也在接受注射的小鼠心脏中表达(见图5)。

B/使用WL1 Cor

已经注意到WL1密码子优化导致WL1 ORF中的两个突变(R49S和F748S)。因此，5’AAV载体(序列ID编号6)中的相应序列已被校正(790位置的AGC转换为AGG，2887位置的TCT转换为TTC)。

然后使用两种结构重复实验：对应于WL1 cor(SEQ ID NO:22)的新(cor)双Dys载体系统(突变校正；5'cor+3')和对应于WL1 Opt(SEQ ID NO:5)的旧(mut)双Dys载体系统(5’mut+3'，n＝5)。

如图6A/6B所示，即使在静脉注射后的早期(3周)，在胫骨前肌和膈肌中，双AAV载体系统也能观察到一定量的拟抗肌萎缩蛋白生成。

就表达水平而言，新的(cor)双Dys载体系统(突变校正；5'cor+3')，即编码天然拟抗肌萎缩蛋白的优化版本似乎是有前景的。

关于生成的拟抗肌萎缩蛋白的治疗效果，图7证实了这两种结构产生了受治疗小鼠的相似特征，即再生、炎症和纤维化相关标记物的改善。

序列表

<110> 吉尼松公司

INSERM（国家健康和医学研究院）

埃夫里-瓦尔德艾松大学

<120> 使用重叠的AAV载体生产大型拟抗肌萎缩蛋白

<130> G143-B-53376 PCT

<150> EP19305377

<151> 2019-03-25

<160> 23

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 2361

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> DD

<400> 1

Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val

1 5 10 15

Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe

20 25 30

Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg

35 40 45

Arg Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys

50 55 60

Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala

65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser

85 90 95

Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp

100 105 110

Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met

115 120 125

Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val

130 135 140

Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr

145 150 155 160

Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His

165 170 175

Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly

195 200 205

Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp

210 215 220

Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro

225 230 235 240

Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg

245 250 255

Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met

260 265 270

His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg

275 280 285

Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala

290 295 300

Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln

305 310 315 320

His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu

325 330 335

Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu

340 345 350

Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile

355 360 365

Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly

370 375 380

Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu

385 390 395 400

Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu

405 410 415

Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu

420 425 430

Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val

435 440 445

Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu

450 455 460

Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly

465 470 475 480

Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu

485 490 495

Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His

500 505 510

Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala

515 520 525

Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys

530 535 540

Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys

545 550 555 560

Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser

565 570 575

Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp

580 585 590

Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala

595 600 605

Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys

610 615 620

Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr

625 630 635 640

Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln

645 650 655

Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Glu Ile Ser Tyr Val

660 665 670

Pro Ser Thr Tyr Leu Thr Glu Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu

675 680 685

Glu Val Glu Gln Leu Leu Asn Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe

690 695 700

Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp Ser

705 710 715 720

Leu Gln Gln Ser Ser Gly Arg Ile Asp Ile Ile His Ser Lys Lys Thr

725 730 735

Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr Pro Val Glu Arg Val Lys Leu Gln Glu

740 745 750

Ala Leu Ser Gln Leu Asp Phe Gln Trp Glu Lys Val Asn Lys Met Tyr

755 760 765

Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe Asp Arg Ser Val Glu Lys Trp Arg Arg

770 775 780

Phe His Tyr Asp Ile Lys Ile Phe Asn Gln Trp Leu Thr Glu Ala Glu

785 790 795 800

Gln Phe Leu Arg Lys Thr Gln Ile Pro Glu Asn Trp Glu His Ala Lys

805 810 815

Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu Leu Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln

820 825 830

Thr Val Val Arg Thr Leu Asn Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln

835 840 845

Ser Ser Lys Thr Asp Ala Ser Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu

850 855 860

Asn Leu Arg Trp Gln Glu Val Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys

865 870 875 880

Arg Leu Glu Glu Gln Lys Asn Ile Leu Ser Glu Phe Gln Arg Asp Leu

885 890 895

Asn Glu Phe Val Leu Trp Leu Glu Glu Ala Asp Asn Ile Ala Ser Ile

900 905 910

Pro Leu Glu Pro Gly Lys Glu Gln Gln Leu Lys Glu Lys Leu Glu Gln

915 920 925

Val Lys Leu Leu Val Glu Glu Leu Pro Leu Arg Gln Gly Ile Leu Lys

930 935 940

Gln Leu Asn Glu Thr Gly Gly Pro Val Leu Val Ser Ala Pro Ile Ser

945 950 955 960

Pro Glu Glu Gln Asp Lys Leu Glu Asn Lys Leu Lys Gln Thr Asn Leu

965 970 975

Gln Trp Ile Lys Val Ser Arg Ala Leu Pro Glu Lys Gln Gly Glu Ile

980 985 990

Glu Ala Gln Ile Lys Asp Leu Gly Gln Leu Glu Lys Lys Leu Glu Asp

995 1000 1005

Leu Glu Glu Gln Leu Asn His Leu Leu Leu Trp Leu Ser Pro Ile Arg

1010 1015 1020

Asn Gln Leu Glu Ile Tyr Asn Gln Pro Asn Gln Glu Gly Pro Phe Asp

1025 1030 1035 1040

Val Gln Glu Thr Glu Ile Ala Val Gln Ala Lys Gln Pro Asp Val Glu

1045 1050 1055

Glu Ile Leu Ser Lys Gly Gln His Leu Tyr Lys Glu Lys Pro Ala Thr

1060 1065 1070

Gln Pro Val Lys Arg Lys Leu Glu Asp Leu Ser Ser Glu Trp Lys Ala

1075 1080 1085

Val Asn Arg Leu Leu Gln Glu Leu Arg Ala Lys Gln Pro Asp Leu Ala

1090 1095 1100

Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val Thr Leu

1105 1110 1115 1120

Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys Leu Glu

1125 1130 1135

Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp Phe Asn

1140 1145 1150

Arg Ala Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu Ser Leu Leu Asp Gln Val

1155 1160 1165

Ile Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile Asn Glu

1170 1175 1180

Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr Met Gln Asp Leu Glu Gln Arg Arg

1185 1190 1195 1200

Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys Asn Lys

1205 1210 1215

Thr Ser Asn Gln Glu Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg Ile Glu Arg

1220 1225 1230

Ile Gln Asn Gln Trp Asp Glu Val Gln Glu His Leu Gln Asn Arg Arg

1235 1240 1245

Gln Gln Leu Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr Gln Trp Leu Glu Ala

1250 1255 1260

Lys Glu Glu Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln Ala Arg Ala Lys Leu Glu

1265 1270 1275 1280

Ser Trp Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ile Gln Lys Lys Ile

1285 1290 1295

Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gln Trp Gln Thr Asn

1300 1305 1310

Val Asp Val Ala Asn Asp Leu Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp Tyr Ser

1315 1320 1325

Ala Asp Asp Thr Arg Lys Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile Asn Ala

1330 1335 1340

Ser Trp Arg Ser Ile His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu Ala Ala Leu

1345 1350 1355 1360

Glu Glu Thr His Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu Glu Lys

1365 1370 1375

Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val Leu Gln

1380 1385 1390

Asp Ala Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly Val Lys

1395 1400 1405

Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu Ala His

1410 1415 1420

Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile Leu Arg

1425 1430 1435 1440

Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg Leu Asp

1445 1450 1455

Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu Asn Ile

1460 1465 1470

Arg Ser His Leu Glu Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu His Leu

1475 1480 1485

Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp Glu Leu

1490 1495 1500

Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln Lys Gln

1505 1510 1515 1520

Asn Asp Val His Arg Ala Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys Glu Pro

1525 1530 1535

Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr Glu Gln

1540 1545 1550

Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu Leu Pro

1555 1560 1565

Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys Gln Ala

1570 1575 1580

Glu Glu Val Asn Thr Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His Ser Ala Asp

1585 1590 1595 1600

Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu Leu Gln

1605 1610 1615

Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu Val Ile

1620 1625 1630

Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser Leu Gln

1635 1640 1645

Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala Pro Leu

1650 1655 1660

Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu Thr Thr

1665 1670 1675 1680

Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu Asp Leu

1685 1690 1695

Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg Val Arg

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Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr

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Lys Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met

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Pro Asp Glu Leu Gln Lys Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala Lys Glu

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Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val

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aaaaatgtaa tgaaaaatat catggctgga ttgcaacaaa ccaacagtga aaagattctc 420

ctgagctggg tccgacaatc aactcgtaat tatccacagg ttaatgtaat caacttcacc 480

accagctggt ctgatggcct ggctttgaat gctctcatcc atagtcatag gccagaccta 540

tttgactgga atagtgtggt ttgccagcag tcagccacac aacgactgga acatgcattc 600

aacatcgcca gatatcaatt aggcatagag aaactactcg atcctgaaga tgttgatacc 660

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catttggaag ctcctgaaga caagtcattt ggcagttcat tgatggagag tgaagtaaac 1020

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caattgggaa gtaagctgat tggaacagga aaattatcag aagatgaaga aactgaagta 1260

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tattcactca aacaagatct tctttcaaca ctgaagaata agtcagtgac ccagaagacg 1920

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tattgcactc cgactacatc aggagaagat gttcgagact ttgccaaggt actaaaaaac 6360

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ccaatgagag aggacacaat gtag 7284

<210> 5

<211> 7284

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WL1 opt

<400> 5

atgctgtggt gggaggaggt ggaggactgc tatgagagag aggatgtgca gaagaagacc 60

ttcaccaagt gggtgaatgc ccagttcagc aagtttggca agcagcacat tgagaacctg 120

ttctctgacc tgcaggatgg caggagcctg ctggacctgc tggagggcct aacaggccag 180

aagctgccca aggagaaggg cagtaccagg gtgcatgccc tgaacaatgt gaacaaggcc 240

ctgagggtgc tgcagaacaa caatgtggac ctagtgaata ttggcagtac agatattgtg 300

gatggcaacc acaagctgac cctgggcctg atctggaata ttatcctaca ctggcaggtg 360

aagaatgtga tgaagaatat tatggctggc ctgcagcaga ccaactctga gaagatcctg 420

ctgagctggg tgaggcagag taccaggaac tacccccagg tgaatgtgat caacttcacc 480

accagctggt ctgatggcct ggccctgaat gccctaatcc acagccacag gcctgacctg 540

tttgactgga actctgtggt gtgccagcag tctgccaccc agaggctaga gcatgccttc 600

aatattgcca ggtaccagct ggggattgag aagctgctgg accctgagga tgtggataca 660

acctaccctg acaagaagag catcctgatg tacatcacca gcctgttcca ggtgctgccc 720

cagcaggtga gcattgaggc catccaggag gtggagatgc tacccaggcc ccccaaggtg 780

accaaggagg agcacttcca gctacaccac cagatgcact acagccagca gatcacagtg 840

agcctggccc agggctatga gaggaccagc agccccaagc ccaggttcaa gagctatgcc 900

tacacccagg ctgcctatgt gaccacctca gaccccacca ggagcccctt ccccagccag 960

cacctggagg cccctgagga caagagcttt ggcagcagcc tgatggagtc tgaggtgaac 1020

ctggacaggt accagacagc cctggaggag gtgctgagct ggctgctgtc tgctgaggat 1080

accctacagg cccagggaga gatcagcaat gatgtggagg tggtgaagga ccagttccat 1140

acccatgagg gctacatgat ggacctaaca gcccaccagg gcagggtggg caacatcctg 1200

cagctgggca gcaagctgat tggcacaggc aagctgtctg aggatgagga gacagaggtg 1260

caggagcaga tgaacctgct gaacagcagg tgggagtgcc tgagggtggc cagtatggag 1320

aagcagagca acctacacag ggtgctgatg gacctgcaga accagaagct gaaggagctg 1380

aatgactggc tgaccaagac agaggagagg accaggaaga tggaggagga gcccctgggc 1440

cctgacctgg aggacctaaa gaggcaggtg cagcagcaca aggtgctgca ggaggacctg 1500

gagcaggagc aggtgagggt gaacagccta acccatatgg tggtggtggt ggatgagagc 1560

tcaggagacc atgctacagc tgccctggag gagcagctga aggtgctggg agacaggtgg 1620

gctaatatct gcaggtggac agaggacagg tgggtgctgc tgcaggatat cctgctgaag 1680

tggcagaggc tgacagagga gcagtgcctg ttctctgcct ggctgtcaga gaaggaggat 1740

gctgtgaaca agatccatac aacaggcttc aaggaccaga atgagatgct gagcagcctg 1800

cagaagctgg ctgtgctgaa ggctgacctg gagaagaaga agcagagtat gggcaagctg 1860

tacagcctga agcaggacct gctgagtacc ctgaagaaca agtctgtgac ccagaagaca 1920

gaggcctggc tggacaactt tgccaggtgc tgggataacc tggtgcagaa gctggagaag 1980

agtacagccc agatcagcca ggctgtgaca acaacccagc ccagcctgac ccagacaaca 2040

gtgatggaga cagtgacaac agtgacaacc agggagcaga tcctagtgaa gcatgcccag 2100

gaggagctgc cccccccccc cccccagaag aagaggcaga ttacagtgga tggcctggag 2160

aagacagtga gcctccagaa ggacctgtca gagatgcatg agtggatgac ccaggctgag 2220

gaggagtacc tggagaggga ctctgagtac aagacccctg atgagctgca gaaggctgtg 2280

gaggagatga agagggccaa ggaggaggcc cagcagaagg aggccaaggt gaagctgctg 2340

acagagtctg tgaactctgt gattgcccag gccccccctg tggcccagga ggccctgaag 2400

aaggagctgg agaccctgac aaccaactac cagtggctgt gcaccaggct gaatggcaag 2460

tgcaagaccc tagaggaggt gtgggcctgc tggcatgagc tgctgagcta cctggagaag 2520

gccaacaagt ggctgaatga ggtggagttc aagctgaaga ccacagagaa catccctgga 2580

ggagctgagg agatctctga ggtgctggac agcctggaga acctaatgag gcactctgag 2640

gacaacccca accagatcag gatcctggcc cagaccctga cagatggagg agtgatggat 2700

gagctgatca atgaggagct ggagaccttc aacagcaggt ggagggagct acatgaggag 2760

gctgtgagga ggcagaagct gctagagcag atccatacag tgagggagga gacaatgatg 2820

gtgatgacag aggatatgcc cctggagatc agctatgtgc ccagcaccta cctaacagag 2880

atcacccatg tgagccaggc cctgctggag gtggagcagc tgctgaatgc ccctgacctg 2940

tgtgccaagg actttgagga cctgttcaag caggaggaga gcctgaagaa catcaaggac 3000

agcctgcagc agagctcagg caggattgat attatccaca gcaagaagac agctgccctg 3060

cagtctgcta cccctgtgga gagggtgaag ctgcaggagg ccctgagcca gctggacttc 3120

cagtgggaga aggtgaacaa gatgtacaag gacaggcagg gcaggtttga caggtcagtg 3180

gagaagtgga ggaggttcca ctatgacatc aagatcttca accagtggct gacagaggct 3240

gagcagttcc taaggaagac ccagatccct gagaactggg agcatgccaa gtacaagtgg 3300

taccttaagg agctgcagga tggcattggc cagaggcaga cagtggtgag gaccctgaat 3360

gctacagggg aggagattat ccagcagagc agcaagacag atgccagtat cctgcaggag 3420

aagctgggca gcctgaacct gaggtggcag gaggtgtgca agcagctgtc tgacaggaag 3480

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acccagacag tgaccctggt gacccagcct gtggtgacca aggagacagc tatcagcaag 3600

ctggagatgc ccagcagcct gatgctggag gtgcctgccc tggctgactt caacagggcc 3660

tggacagagc tgacagactg gctgagcctg ctggaccagg tgatcaagag ccagagggtg 3720

atggtggggg acctggagga tatcaatgag atgattatca agcagaaggc tacaatgcag 3780

gacctggagc agaggaggcc ccagctggag gagctgatta cagctgccca gaacctaaag 3840

aacaagacca gcaaccagga ggccaggaca attattacag acaggattga gaggatccag 3900

aaccagtggg atgaggtgca ggagcacctg cagaacagga ggcagcagct gaatgagatg 3960

ctgaaggaca gtacccagtg gctggaggcc aaggaggagg ctgagcaggt gctgggccag 4020

gccagggcca agctggagag ctggaaggag ggcccctaca cagtggatgc catccagaag 4080

aagatcacag agaccaagca gctggccaag gacctgaggc agtggcagac caatgtggat 4140

gtggccaatg acctggccct gaagctgctg agggactact cagctgatga caccaggaag 4200

gtgcacatga tcacagagaa catcaatgcc agctggagga gcatccacaa gagggtgtct 4260

gagagggagg ctgccctaga ggagacccac aggctgctgc agcagttccc cctggacctg 4320

gagaagttcc tggcctggct gacagaggct gagacaacag ccaatgtgct gcaggatgct 4380

accaggaagg agaggctgct ggaggacagc aagggagtga aggagctgat gaagcagtgg 4440

caggacctac agggggagat tgaggcccat acagatgtgt accacaacct ggatgagaac 4500

agccagaaga tcctgaggag cctggagggc tctgatgatg ctgtgctgct gcagaggagg 4560

ctggacaata tgaacttcaa gtggtctgag ctgaggaaga agagcctaaa tatcaggagc 4620

cacctggagg ccagctctga ccagtggaag aggctacacc tgagcctgca ggagctgctg 4680

gtgtggctgc agctgaagga tgatgagcta agcaggcagg cccctattgg gggagacttc 4740

cctgctgtgc agaagcagaa tgatgtgcac agggccttca agagggagct gaagaccaag 4800

gagcctgtga ttatgagtac cctggagaca gtgaggatct tcctgacaga gcagcccctg 4860

gagggcctgg agaagctgta ccaggagccc agggagctgc cccctgagga gagggcccag 4920

aatgtgacca ggctgctgag gaagcaggct gaggaggtga atacagagtg ggagaagctg 4980

aacctacact ctgctgactg gcagaggaag attgatgaga ccctggagag gctgcaggag 5040

ctgcaggagg ctacagatga gctggacctg aagctgaggc aggctgaggt gatcaagggc 5100

agctggcagc ctgtggggga cctgctgatt gacagcctac aggaccacct ggagaaggtg 5160

aaggccctga ggggagagat tgccccccta aaggagaatg tgagtcatgt gaatgacctg 5220

gccaggcagc tgaccaccct gggcatccag ctgagcccct acaacctgag caccctggag 5280

gacctgaaca ccaggtggaa gctgctgcag gtggctgtgg aggacagggt gaggcagcta 5340

catgaggccc acagggactt tggccctgcc agccagcact tcctaagcac ctctgttcag 5400

ggcccctggg agagggccat cagccccaac aaggtgccct actacatcaa ccatgagacc 5460

cagaccacct gctgggacca ccccaagatg acagagctgt accagagcct ggctgacctg 5520

aacaatgtga ggttctctgc ctacaggaca gccatgaagc tgaggaggct gcagaaggcc 5580

ctgtgcctgg acctgctgag cctgtctgct gcctgtgatg ccctagacca gcacaacctg 5640

aagcagaatg accagcccat ggacatcctt cagatcatca actgcctgac caccatctat 5700

gacaggctag agcaggagca caacaacctg gtgaatgtgc ccctgtgtgt ggacatgtgc 5760

ctgaactggc tgctgaatgt gtatgacaca ggcaggacag gcaggatcag ggtgctgagc 5820

ttcaagacag gcatcatcag cctatgcaag gctcacctgg aggacaagta caggtacctg 5880

ttcaagcagg tggccagcag cacaggcttc tgtgaccaga ggaggctggg cctgctactt 5940

catgacagca ttcagatccc caggcagctg ggagaggtgg ccagctttgg aggcagcaac 6000

attgagccct cagtgaggag ctgcttccag tttgccaaca acaagcctga gattgaggct 6060

gccctgttcc tggactggat gaggctggag cctcagagca tggtgtggct gcctgtgctg 6120

cacagggtgg ctgctgctga gacagccaag catcaggcca agtgcaacat ctgcaaggag 6180

tgccccatca ttggcttcag gtacaggagc ctaaagcact tcaactatga catctgccag 6240

agctgcttct tctcaggcag ggtggccaag ggccacaaga tgcactaccc catggtggag 6300

tactgcaccc ccaccacctc aggagaggat gtgagggact ttgccaaggt gctgaagaac 6360

aagttcagga ccaagaggta ctttgccaag caccccagga tgggctacct gcctgtgcag 6420

acagtgctgg agggggacaa catggagacc cctgtgaccc tgatcaactt ctggcctgtg 6480

gactcagccc ctgccagcag cccccagctg agccatgatg acacccacag caggattgag 6540

cactatgcca gcaggctggc tgagatggag aacagcaatg gcagctacct aaatgacagc 6600

atcagcccca atgagagcat tgatgatgag cacctgctaa tccagcacta ctgccagagc 6660

ctgaaccagg acagccccct gagccagccc aggagccctg cccagatcct gatcagcctg 6720

gagtctgagg agagggggga gctggagagg atcctggctg acctggagga ggagaacagg 6780

aaccttcagg ctgagtatga caggctaaag cagcagcatg agcacaaggg cctgagcccc 6840

ctacccagcc cccctgagat gatgcccacc agcccccaga gccccaggga tgctgagctg 6900

attgctgagg ccaagctgct gaggcagcac aagggcaggc tggaggccag gatgcagatc 6960

ctagaggacc acaacaagca gctggagagc cagctacaca ggctgaggca gctgctggag 7020

cagcctcagg ctgaggccaa ggtgaatggc accacagtga gcagccccag caccagcctg 7080

cagaggtctg acagcagtca gcccatgctg ctcagggtgg tgggcagtca gacctctgac 7140

agcatgggag aggaggacct gctgagcccc cctcaggaca ccagcacagg cctggaggag 7200

gtgatggagc agctgaacaa cagcttcccc agcagcaggg gcaggaacac ccctggcaag 7260

cccatgaggg aggacaccat gtag 7284

<210> 6

<211> 4768

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 5' WL1 opt

<400> 6

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta ttggccgtcc 180

gccctcggca ccatcctcac gacacccaaa tatggcgacg ggtgaggaat ggtggggagt 240

tatttttaga gcggtgagga aggtgggcag gcagcaggtg ttggcgctct aaaaataact 300

cccgggagtt atttttagag cggaggaatg gtggacaccc aaatatggcg acggttcctc 360

acccgtcgcc atatttgggt gtccgccctc ggccggggcc gcattcctgg gggccgggcg 420

gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg gcggcccacg agctacccgg 480

aggagcggga ggcgccaagc tctagagtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag 540

accaatagaa actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta 600

ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc tctccacagg ccaccatgct gtggtgggag 660

gaggtggagg actgctatga gagagaggat gtgcagaaga agaccttcac caagtgggtg 720

aatgcccagt tcagcaagtt tggcaagcag cacattgaga acctgttctc tgacctgcag 780

gatggcagga gcctgctgga cctgctggag ggcctaacag gccagaagct gcccaaggag 840

aagggcagta ccagggtgca tgccctgaac aatgtgaaca aggccctgag ggtgctgcag 900

aacaacaatg tggacctagt gaatattggc agtacagata ttgtggatgg caaccacaag 960

ctgaccctgg gcctgatctg gaatattatc ctacactggc aggtgaagaa tgtgatgaag 1020

aatattatgg ctggcctgca gcagaccaac tctgagaaga tcctgctgag ctgggtgagg 1080

cagagtacca ggaactaccc ccaggtgaat gtgatcaact tcaccaccag ctggtctgat 1140

ggcctggccc tgaatgccct aatccacagc cacaggcctg acctgtttga ctggaactct 1200

gtggtgtgcc agcagtctgc cacccagagg ctagagcatg ccttcaatat tgccaggtac 1260

cagctgggga ttgagaagct gctggaccct gaggatgtgg atacaaccta ccctgacaag 1320

aagagcatcc tgatgtacat caccagcctg ttccaggtgc tgccccagca ggtgagcatt 1380

gaggccatcc aggaggtgga gatgctaccc aggcccccca aggtgaccaa ggaggagcac 1440

ttccagctac accaccagat gcactacagc cagcagatca cagtgagcct ggcccagggc 1500

tatgagagga ccagcagccc caagcccagg ttcaagagct atgcctacac ccaggctgcc 1560

tatgtgacca cctcagaccc caccaggagc cccttcccca gccagcacct ggaggcccct 1620

gaggacaaga gctttggcag cagcctgatg gagtctgagg tgaacctgga caggtaccag 1680

acagccctgg aggaggtgct gagctggctg ctgtctgctg aggataccct acaggcccag 1740

ggagagatca gcaatgatgt ggaggtggtg aaggaccagt tccataccca tgagggctac 1800

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acagctgccc tggaggagca gctgaaggtg ctgggagaca ggtgggctaa tatctgcagg 2280

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gaggagcagt gcctgttctc tgcctggctg tcagagaagg aggatgctgt gaacaagatc 2400

catacaacag gcttcaagga ccagaatgag atgctgagca gcctgcagaa gctggctgtg 2460

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aactttgcca ggtgctggga taacctggtg cagaagctgg agaagagtac agcccagatc 2640

agccaggctg tgacaacaac ccagcccagc ctgacccaga caacagtgat ggagacagtg 2700

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tctgtgattg cccaggcccc ccctgtggcc caggaggccc tgaagaagga gctggagacc 3060

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gaggtgtggg cctgctggca tgagctgctg agctacctgg agaaggccaa caagtggctg 3180

aatgaggtgg agttcaagct gaagaccaca gagaacatcc ctggaggagc tgaggagatc 3240

tctgaggtgc tggacagcct ggagaaccta atgaggcact ctgaggacaa ccccaaccag 3300

atcaggatcc tggcccagac cctgacagat ggaggagtga tggatgagct gatcaatgag 3360

gagctggaga ccttcaacag caggtggagg gagctacatg aggaggctgt gaggaggcag 3420

aagctgctag agcagatcca tacagtgagg gaggagacaa tgatggtgat gacagaggat 3480

atgcccctgg agatcagcta tgtgcccagc acctacctaa cagagatcac ccatgtgagc 3540

caggccctgc tggaggtgga gcagctgctg aatgcccctg acctgtgtgc caaggacttt 3600

gaggacctgt tcaagcagga ggagagcctg aagaacatca aggacagcct gcagcagagc 3660

tcaggcagga ttgatattat ccacagcaag aagacagctg ccctgcagtc tgctacccct 3720

gtggagaggg tgaagctgca ggaggccctg agccagctgg acttccagtg ggagaaggtt 3780

aacaagatgt acaaggacag gcagggcagg tttgacaggt cagtggagaa gtggaggagg 3840

ttccactatg acatcaagat cttcaaccag tggctgacag aggctgagca gttcctaagg 3900

aagacccaga tccctgagaa ctgggagcat gccaagtaca agtggtacct taaggagctg 3960

caggatggca ttggccagag gcagacagtg gtgaggaccc tgaatgctac aggggaggag 4020

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aacctgaggt ggcaggaggt gtgcaagcag ctgtctgaca ggaagaagag gctggaggag 4140

cagcctgacc tggcccctgg cctgacaaca attggagcca gccctaccca gacagtgacc 4200

ctggtgaccc agcctgtggt gaccaaggag acagctatca gcaagctgga gatgcccagc 4260

agcctgatgc tggaggtgcc tgccctggct gacttcaaca gggcctggac agagctgaca 4320

gactggctga gcctgctgga ccaggtgatc aagagccaga gggtgatggt gggggacctg 4380

gaggatatca atgagatgat tatcaagcag aaggctacaa tgcaggacct ggagcagagg 4440

aggccccagc tggaggagct gattacagct gcccagaacc taaagaacaa gaccagcaac 4500

caggaggcca ggacaattat tacagacagg attgagagga tccagaacca gtgggatgag 4560

gtgcaggagc acctgcagtt tacgcgtttt gcggccgctt tacgtagata agtagcatgg 4620

cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 4680

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<210> 7

<211> 4715

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 3' WL1 opt

<400> 7

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta tttgaacaag 180

atgtacaagg acaggcaggg caggtttgac aggtcagtgg agaagtggag gaggttccac 240

tatgacatca agatcttcaa ccagtggctg acagaggctg agcagttcct aaggaagacc 300

cagatccctg agaactggga gcatgccaag tacaagtggt accttaagga gctgcaggat 360

ggcattggcc agaggcagac agtggtgagg accctgaatg ctacagggga ggagattatc 420

cagcagagca gcaagacaga tgccagtatc ctgcaggaga agctgggcag cctgaacctg 480

aggtggcagg aggtgtgcaa gcagctgtct gacaggaaga agaggctgga ggagcagcct 540

gacctggccc ctggcctgac aacaattgga gccagcccta cccagacagt gaccctggtg 600

acccagcctg tggtgaccaa ggagacagct atcagcaagc tggagatgcc cagcagcctg 660

atgctggagg tgcctgccct ggctgacttc aacagggcct ggacagagct gacagactgg 720

ctgagcctgc tggaccaggt gatcaagagc cagagggtga tggtggggga cctggaggat 780

atcaatgaga tgattatcaa gcagaaggct acaatgcagg acctggagca gaggaggccc 840

cagctggagg agctgattac agctgcccag aacctaaaga acaagaccag caaccaggag 900

gccaggacaa ttattacaga caggattgag aggatccaga accagtggga tgaggtgcag 960

gagcacctgc agaacaggag gcagcagctg aatgagatgc tgaaggacag tacccagtgg 1020

ctggaggcca aggaggaggc tgagcaggtg ctgggccagg ccagggccaa gctggagagc 1080

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aagctgctga gggactactc agctgatgac accaggaagg tgcacatgat cacagagaac 1260

atcaatgcca gctggaggag catccacaag agggtgtctg agagggaggc tgccctagag 1320

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gaggcccata cagatgtgta ccacaacctg gatgagaaca gccagaagat cctgaggagc 1560

ctggagggct ctgatgatgc tgtgctgctg cagaggaggc tggacaatat gaacttcaag 1620

tggtctgagc tgaggaagaa gagcctaaat atcaggagcc acctggaggc cagctctgac 1680

cagtggaaga ggctacacct gagcctgcag gagctgctgg tgtggctgca gctgaaggat 1740

gatgagctaa gcaggcaggc ccctattggg ggagacttcc ctgctgtgca gaagcagaat 1800

gatgtgcaca gggccttcaa gagggagctg aagaccaagg agcctgtgat tatgagtacc 1860

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caggagccca gggagctgcc ccctgaggag agggcccaga atgtgaccag gctgctgagg 1980

aagcaggctg aggaggtgaa tacagagtgg gagaagctga acctacactc tgctgactgg 2040

cagaggaaga ttgatgagac cctggagagg ctgcaggagc tgcaggaggc tacagatgag 2100

ctggacctga agctgaggca ggctgaggtg atcaagggca gctggcagcc tgtgggggac 2160

ctgctgattg acagcctaca ggaccacctg gagaaggtga aggccctgag gggagagatt 2220

gcccccctaa aggagaatgt gagtcatgtg aatgacctgg ccaggcagct gaccaccctg 2280

ggcatccagc tgagccccta caacctgagc accctggagg acctgaacac caggtggaag 2340

ctgctgcagg tggctgtgga ggacagggtg aggcagctac atgaggccca cagggacttt 2400

ggccctgcca gccagcactt cctaagcacc tctgttcagg gcccctggga gagggccatc 2460

agccccaaca aggtgcccta ctacatcaac catgagaccc agaccacctg ctgggaccac 2520

cccaagatga cagagctgta ccagagcctg gctgacctga acaatgtgag gttctctgcc 2580

tacaggacag ccatgaagct gaggaggctg cagaaggccc tgtgcctgga cctgctgagc 2640

ctgtctgctg cctgtgatgc cctagaccag cacaacctga agcagaatga ccagcccatg 2700

gacatccttc agatcatcaa ctgcctgacc accatctatg acaggctaga gcaggagcac 2760

aacaacctgg tgaatgtgcc cctgtgtgtg gacatgtgcc tgaactggct gctgaatgtg 2820

tatgacacag gcaggacagg caggatcagg gtgctgagct tcaagacagg catcatcagc 2880

ctatgcaagg ctcacctgga ggacaagtac aggtacctgt tcaagcaggt ggccagcagc 2940

acaggcttct gtgaccagag gaggctgggc ctgctacttc atgacagcat tcagatcccc 3000

aggcagctgg gagaggtggc cagctttgga ggcagcaaca ttgagccctc agtgaggagc 3060

tgcttccagt ttgccaacaa caagcctgag attgaggctg ccctgttcct ggactggatg 3120

aggctggagc ctcagagcat ggtgtggctg cctgtgctgc acagggtggc tgctgctgag 3180

acagccaagc atcaggccaa gtgcaacatc tgcaaggagt gccccatcat tggcttcagg 3240

tacaggagcc taaagcactt caactatgac atctgccaga gctgcttctt ctcaggcagg 3300

gtggccaagg gccacaagat gcactacccc atggtggagt actgcacccc caccacctca 3360

ggagaggatg tgagggactt tgccaaggtg ctgaagaaca agttcaggac caagaggtac 3420

tttgccaagc accccaggat gggctacctg cctgtgcaga cagtgctgga gggggacaac 3480

atggagaccc ctgtgaccct gatcaacttc tggcctgtgg actcagcccc tgccagcagc 3540

ccccagctga gccatgatga cacccacagc aggattgagc actatgccag caggctggct 3600

gagatggaga acagcaatgg cagctaccta aatgacagca tcagccccaa tgagagcatt 3660

gatgatgagc acctgctaat ccagcactac tgccagagcc tgaaccagga cagccccctg 3720

agccagccca ggagccctgc ccagatcctg atcagcctgg agtctgagga gaggggggag 3780

ctggagagga tcctggctga cctggaggag gagaacagga accttcaggc tgagtatgac 3840

aggctaaagc agcagcatga gcacaagggc ctgagccccc tacccagccc ccctgagatg 3900

atgcccacca gcccccagag ccccagggat gctgagctga ttgctgaggc caagctgctg 3960

aggcagcaca agggcaggct ggaggccagg atgcagatcc tagaggacca caacaagcag 4020

ctggagagcc agctacacag gctgaggcag ctgctggagc agcctcaggc tgaggccaag 4080

gtgaatggca ccacagtgag cagccccagc accagcctgc agaggtctga cagcagtcag 4140

cccatgctgc tcagggtggt gggcagtcag acctctgaca gcatgggaga ggaggacctg 4200

ctgagccccc ctcaggacac cagcacaggc ctggaggagg tgatggagca gctgaacaac 4260

agcttcccca gcagcagggg caggaacacc cctggcaagc ccatgaggga ggacaccatg 4320

tagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa 4380

aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct 4440

gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggaga 4500

tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtatttac gtagataagt 4560

agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 4620

ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct 4680

ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 4715

<210> 8

<211> 4787

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WL1 wt 5'AAV

<400> 8

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta tttactagtt 180

ttctcgagtt tggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 240

gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 300

tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 360

aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 420

cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 480

cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagagtaag tatcaaggtt 540

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg 600

cgtttctgat aggcacctat tggtcttact gacatccact ttgcctttct ctccacaggc 660

caccatgctt tggtgggaag aagtagagga ctgttatgaa agagaagatg ttcaaaagaa 720

aacattcaca aaatgggtaa atgcacaatt ttctaagttt gggaagcagc atattgagaa 780

cctcttcagt gacctacagg atgggaggcg cctcctagac ctcctcgaag gcctgacagg 840

gcaaaaactg ccaaaagaaa aaggatccac aagagttcat gccctgaaca atgtcaacaa 900

ggcactgcgg gttttgcaga acaataatgt tgatttagtg aatattggaa gtactgacat 960

cgtagatgga aatcataaac tgactcttgg tttgatttgg aatataatcc tccactggca 1020

ggtcaaaaat gtaatgaaaa atatcatggc tggattgcaa caaaccaaca gtgaaaagat 1080

tctcctgagc tgggtccgac aatcaactcg taattatcca caggttaatg taatcaactt 1140

caccaccagc tggtctgatg gcctggcttt gaatgctctc atccatagtc ataggccaga 1200

cctatttgac tggaatagtg tggtttgcca gcagtcagcc acacaacgac tggaacatgc 1260

attcaacatc gccagatatc aattaggcat agagaaacta ctcgatcctg aagatgttga 1320

taccacctat ccagataaga agtccatctt aatgtacatc acatcactct tccaagtttt 1380

gcctcaacaa gtgagcattg aagccatcca ggaagtggaa atgttgccaa ggccacctaa 1440

agtgactaaa gaagaacatt ttcagttaca tcatcaaatg cactattctc aacagatcac 1500

ggtcagtcta gcacagggat atgagagaac ttcttcccct aagcctcgat tcaagagcta 1560

tgcctacaca caggctgctt atgtcaccac ctctgaccct acacggagcc catttccttc 1620

acagcatttg gaagctcctg aagacaagtc atttggcagt tcattgatgg agagtgaagt 1680

aaacctggac cgttatcaaa cagctttaga agaagtatta tcgtggcttc tttctgctga 1740

ggacacattg caagcacaag gagagatttc taatgatgtg gaagtggtga aagaccagtt 1800

tcatactcat gaggggtaca tgatggattt gacagcccat cagggccggg ttggtaatat 1860

tctacaattg ggaagtaagc tgattggaac aggaaaatta tcagaagatg aagaaactga 1920

agtacaagag cagatgaatc tcctaaattc aagatgggaa tgcctcaggg tagctagcat 1980

ggaaaaacaa agcaatttac atagagtttt aatggatctc cagaatcaga aactgaaaga 2040

gttgaatgac tggctaacaa aaacagaaga aagaacaagg aaaatggagg aagagcctct 2100

tggacctgat cttgaagacc taaaacgcca agtacaacaa cataaggtgc ttcaagaaga 2160

tctagaacaa gaacaagtca gggtcaattc tctcactcac atggtggtgg tagttgatga 2220

atctagtgga gatcacgcaa ctgctgcttt ggaagaacaa cttaaggtat tgggagatcg 2280

atgggcaaac atctgtagat ggacagaaga ccgctgggtt cttttacaag acatccttct 2340

caaatggcaa cgtcttactg aagaacagtg cctttttagt gcatggcttt cagaaaaaga 2400

agatgcagtg aacaagattc acacaactgg ctttaaagat caaaatgaaa tgttatcaag 2460

tcttcaaaaa ctggccgttt taaaagcgga tctagaaaag aaaaagcaat ccatgggcaa 2520

actgtattca ctcaaacaag atcttctttc aacactgaag aataagtcag tgacccagaa 2580

gacggaagca tggctggata actttgcccg gtgttgggat aatttagtcc aaaaacttga 2640

aaagagtaca gcacagattt cacaggctgt caccaccact cagccatcac taacacagac 2700

aactgtaatg gaaacagtaa ctacggtgac cacaagggaa cagatcctgg taaagcatgc 2760

tcaagaggaa cttccaccac cacctcccca aaagaagagg cagattactg tggatggttt 2820

ggagaaaact gtaagcctcc agaaagatct atcagagatg cacgaatgga tgacacaagc 2880

tgaagaagag tatcttgaga gagattttga atataaaact ccagatgaat tacagaaagc 2940

agttgaagag atgaagagag ctaaagaaga ggcccaacaa aaagaagcga aagtgaaact 3000

ccttactgag tctgtaaata gtgtcatagc tcaagctcca cctgtagcac aagaggcctt 3060

aaaaaaggaa cttgaaactc taaccaccaa ctaccagtgg ctctgcacta ggctgaatgg 3120

gaaatgcaag actttggaag aagtttgggc atgttggcat gagttattgt catacttgga 3180

gaaagcaaac aagtggctaa atgaagtaga atttaaactt aaaaccactg aaaacattcc 3240

tggcggagct gaggaaatct ctgaggtgct agattcactt gaaaatttga tgcgacattc 3300

agaggataac ccaaatcaga ttcgcatatt ggcacagacc ctaacagatg gcggagtcat 3360

ggatgagcta atcaatgagg aacttgagac atttaattct cgttggaggg aactacatga 3420

agaggctgta aggaggcaaa agttgcttga acagattcac actgtccgtg aagaaacgat 3480

gatggtgatg actgaagaca tgcctttgga aatttcttat gtgccttcta cttatttgac 3540

tgaaatcact catgtctcac aagccctatt agaagtggaa caacttctca atgctcctga 3600

cctctgtgct aaggactttg aagatctctt taagcaagag gagtctctga agaatataaa 3660

agatagtcta caacaaagct caggtcggat tgacattatt catagcaaga agacagcagc 3720

attgcaaagt gcaacgcctg tggaaagggt gaagctacag gaagctctct cccagcttga 3780

tttccaatgg gaaaaagtta acaaaatgta caaggaccga caagggcgat ttgacagatc 3840

tgttgagaaa tggcggcgtt ttcattatga tataaagata tttaatcagt ggctaacaga 3900

agctgaacag tttctcagaa agacacaaat tcctgagaat tgggaacatg ctaaatacaa 3960

atggtatctt aaggaactcc aggatggcat tgggcagcgg caaactgttg tcagaacatt 4020

gaatgcaact ggggaagaaa taattcagca atcctcaaaa acagatgcca gtattctaca 4080

ggaaaaattg ggaagcctga atctgcggtg gcaggaggtc tgcaaacagc tgtcagacag 4140

aaaaaagagg ctagaagagc agcctgacct agctcctgga ctgaccacta ttggagcctc 4200

tcctactcag actgttactc tggtgacaca acctgtggtt actaaggaaa ctgccatctc 4260

caaactagaa atgccatctt ccttgatgtt ggaggtacct gctctggcag atttcaaccg 4320

ggcttggaca gaacttaccg actggctttc tctgcttgat caagttataa aatcacagag 4380

ggtgatggtg ggtgaccttg aggatatcaa cgagatgatc atcaagcaga aggcaacaat 4440

gcaggatttg gaacagaggc gtccccagtt ggaagaactc attaccgctg cccaaaattt 4500

gaaaaacaag accagcaatc aagaggctag aacaatcatt acggatcgaa ttgaaagaat 4560

tcagaatcag tgggatgaag tacaagaaca ccttcagttt acgcgttttg cggccgcttt 4620

acgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt 4680

tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 4740

gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc 4787

<210> 9

<211> 4753

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WL1 wt 3'AAV

<400> 9

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta tttgcggccg 180

ctttacgcgt ttttaacaaa atgtacaagg accgacaagg gcgatttgac agatctgttg 240

agaaatggcg gcgttttcat tatgatataa agatatttaa tcagtggcta acagaagctg 300

aacagtttct cagaaagaca caaattcctg agaattggga acatgctaaa tacaaatggt 360

atcttaagga actccaggat ggcattgggc agcggcaaac tgttgtcaga acattgaatg 420

caactgggga agaaataatt cagcaatcct caaaaacaga tgccagtatt ctacaggaaa 480

aattgggaag cctgaatctg cggtggcagg aggtctgcaa acagctgtca gacagaaaaa 540

agaggctaga agagcagcct gacctagctc ctggactgac cactattgga gcctctccta 600

ctcagactgt tactctggtg acacaacctg tggttactaa ggaaactgcc atctccaaac 660

tagaaatgcc atcttccttg atgttggagg tacctgctct ggcagatttc aaccgggctt 720

ggacagaact taccgactgg ctttctctgc ttgatcaagt tataaaatca cagagggtga 780

tggtgggtga ccttgaggat atcaacgaga tgatcatcaa gcagaaggca acaatgcagg 840

atttggaaca gaggcgtccc cagttggaag aactcattac cgctgcccaa aatttgaaaa 900

acaagaccag caatcaagag gctagaacaa tcattacgga tcgaattgaa agaattcaga 960

atcagtggga tgaagtacaa gaacaccttc agaaccggcg ccaacagttg aatgaaatgt 1020

taaaggattc aacacaatgg ctggaagcta aggaagaagc tgagcaggtc ttaggacagg 1080

ccagagccaa gcttgagtca tggaaggagg gtccctatac agtagatgca atccaaaaga 1140

aaatcacaga aaccaagcag ttggccaaag acctccgcca gtggcagaca aatgtagatg 1200

tggcaaatga cttggccctg aaacttctcc gggattattc tgcagatgat accagaaaag 1260

tccacatgat aacagagaat atcaatgcct cttggagaag cattcataaa agggtgagtg 1320

agcgagaggc tgctttggaa gaaactcata gattactgca acagttcccc ctggacctgg 1380

aaaagtttct tgcctggctt acagaagctg aaacaactgc caatgtccta caggatgcta 1440

cccgtaagga aaggctccta gaagactcca agggagtaaa agagctgatg aaacaatggc 1500

aagacctcca aggtgaaatt gaagctcaca cagatgttta tcacaacctg gatgaaaaca 1560

gccaaaaaat cctgagatcc ctggaaggtt ccgatgatgc agtcctgtta caaagacgtt 1620

tggataacat gaacttcaag tggagtgaac ttcggaaaaa gtctctcaac attaggtccc 1680

atttggaagc cagttctgac cagtggaagc gtctgcacct ttctctgcag gaacttctgg 1740

tgtggctaca gctgaaagat gatgaattaa gccggcaggc acctattgga ggcgactttc 1800

cagcagttca gaagcagaac gatgtacata gggccttcaa gagggaattg aaaactaaag 1860

aacctgtaat catgagtact cttgagactg tacgaatatt tctgacagag cagcctttgg 1920

aaggactaga gaaactctac caggagccca gagagctgcc tcctgaggag agagcccaga 1980

atgtcactcg gcttctacga aagcaggctg aggaggtcaa tactgagtgg gaaaaattga 2040

acctgcactc cgctgactgg cagagaaaaa tagatgagac ccttgaaaga ctccaggaac 2100

ttcaagaggc cacggatgag ctggacctca agctgcgcca agctgaggtg atcaagggat 2160

cctggcagcc cgtgggcgat ctcctcattg actctctcca agatcacctc gagaaagtca 2220

aggcacttcg aggagaaatt gcgcctctga aagagaacgt gagccacgtc aatgaccttg 2280

ctcgccagct taccactttg ggcattcagc tctcaccgta taacctcagc actctggaag 2340

acctgaacac cagatggaag cttctgcagg tggccgtcga ggaccgagtc aggcagctgc 2400

atgaagccca cagggacttt ggtccagcat ctcagcactt tctttccacg tctgtccagg 2460

gtccctggga gagagccatc tcgccaaaca aagtgcccta ctatatcaac cacgagactc 2520

aaacaacttg ctgggaccat cccaaaatga cagagctcta ccagtcttta gctgacctga 2580

ataatgtcag attctcagct tataggactg ccatgaaact ccgaagactg cagaaggccc 2640

tttgcttgga tctcttgagc ctgtcagctg catgtgatgc cttggaccag cacaacctca 2700

agcaaaatga ccagcccatg gatatcctgc agattattaa ttgtttgacc actatttatg 2760

accgcctgga gcaagagcac aacaatttgg tcaacgtccc tctctgcgtg gatatgtgtc 2820

tgaactggct gctgaatgtt tatgatacgg gacgaacagg gaggatccgt gtcctgtctt 2880

ttaaaactgg catcatttcc ctgtgtaaag cacatttgga agacaagtac agataccttt 2940

tcaagcaagt ggcaagttca acaggatttt gtgaccagcg caggctgggc ctccttctgc 3000

atgattctat ccaaattcca agacagttgg gtgaagttgc atcctttggg ggcagtaaca 3060

ttgagccaag tgtccggagc tgcttccaat ttgctaataa taagccagag atcgaagcgg 3120

ccctcttcct agactggatg agactggaac cccagtccat ggtgtggctg cccgtcctgc 3180

acagagtggc tgctgcagaa actgccaagc atcaggccaa atgtaacatc tgcaaagagt 3240

gtccaatcat tggattcagg tacaggagtc taaagcactt taattatgac atctgccaaa 3300

gctgcttttt ttctggtcga gttgcaaaag gccataaaat gcactatccc atggtggaat 3360

attgcactcc gactacatca ggagaagatg ttcgagactt tgccaaggta ctaaaaaaca 3420

aatttcgaac caaaaggtat tttgcgaagc atccccgaat gggctacctg ccagtgcaga 3480

ctgtcttaga gggggacaac atggaaactc ccgttactct gatcaacttc tggccagtag 3540

attctgcgcc tgcctcgtcc cctcagcttt cacacgatga tactcattca cgcattgaac 3600

attatgctag caggctagca gaaatggaaa acagcaatgg atcttatcta aatgatagca 3660

tctctcctaa tgagagcata gatgatgaac atttgttaat ccagcattac tgccaaagtt 3720

tgaaccagga ctcccccctg agccagcctc gtagtcctgc ccagatcttg atttccttag 3780

agagtgagga aagaggggag ctagagagaa tcctagcaga tcttgaggaa gaaaacagga 3840

atctgcaagc agaatatgac cgtctaaagc agcagcacga acataaaggc ctgtccccac 3900

tgccgtcccc tcctgaaatg atgcccacct ctccccagag tccccgggat gctgagctca 3960

ttgctgaggc caagctactg cgtcaacaca aaggccgcct ggaagccagg atgcaaatcc 4020

tggaagacca caataaacag ctggagtcac agttacacag gctaaggcag ctgctggagc 4080

aaccccaggc agaggccaaa gtgaatggca caacggtgtc ctctccttct acctctctac 4140

agaggtccga cagcagtcag cctatgctgc tccgagtggt tggcagtcaa acttcggact 4200

ccatgggtga ggaagatctt ctcagtcctc cccaggacac aagcacaggg ttagaggagg 4260

tgatggagca actcaacaac tccttcccta gttcaagagg aagaaatacc cctggaaagc 4320

caatgagaga ggacacaatg tagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 4380

cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 4440

atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 4500

gtttcaggtt cagggggaga tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg 4560

tggtattgtc gactttacta gtttttacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa 4620

ctacaaggaa cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac 4680

tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag 4740

cgagcgagcg cgc 4753

<210> 10

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HR WL1部分OPT1

<400> 10

ttaacaagat gtacaaggac cggcaggggc ggttcgaccg gtcggtggag aagtggcggc 60

ggttccacta cgacatcaag atcttcaacc agtggctgac ggaggcggag cagttcctgc 120

ggaagacgca gatcccggag aactgggagc acgcgaagta caagtggtac ctgaaggagc 180

tgcaggacgg catcgggcag cggcagacgg tggtccggac gctgaacgcg acgggggagg 240

agatcatcca gcagtcctcg aagacggacg cctcgatcct gcaggagaag ctggggagcc 300

tgaacctgcg gtggcaggag gtctgcaagc agctgtcgga ccggaagaag cggctggagg 360

agcagccgga cctcgcgccg gggctgacca cgatcggggc ctcgccgacg cagacggtga 420

cgctggtgac gcagccggtg gtgacgaagg agacggccat ctccaagctg gagatgccgt 480

cgtccctgat gctggaggtg ccggcgctgg cggacttcaa ccgggcgtgg acggagctga 540

ccgactggct gtcgctgctg gaccaggtga tcaagtcgca gagggtgatg gtgggcgacc 600

tggaggacat caacgagatg atcatcaagc agaaggcgac gatgcaggac ctggagcagc 660

ggcggcccca gctggaggag ctgatcaccg cggcccagaa cctgaagaac aagacctcga 720

accaggaggc gcggacgatc atcacggacc ggatcgagcg gatccagaac cagtgggacg 780

aggtgcagga gcacctgcag 800

<210> 11

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HR WL1部分OPT2

<400> 11

ttaacaagat gtacaaggac aggcagggga ggtttgacag gtctgtggag aagtggagga 60

ggttccacta tgacatcaag atcttcaacc agtggctgac agaggctgag cagttcctca 120

ggaagaccca gatccctgag aactgggagc atgccaagta caagtggtac ctgaaggagc 180

tccaggatgg cattgggcag aggcagactg tggtcaggac cctgaatgcc actggggagg 240

agatcatcca gcagtcctcc aagacagatg ccagcatcct gcaggagaag ctggggagcc 300

tgaacctgag gtggcaggag gtctgcaagc agctgtcaga caggaagaag aggctggagg 360

agcagcctga cctggcccct ggcctgacca ccattggggc ctcccccacc cagactgtga 420

ccctggtgac ccagcctgtg gtgaccaagg agactgccat ctccaagctg gagatgccct 480

cctccctgat gctggaggtg cctgccctgg cagacttcaa cagggcctgg acagagctga 540

ctgactggct gtccctgctg gaccaggtga tcaagtccca gagggtgatg gtgggggacc 600

tggaggacat caatgagatg atcatcaagc agaaggccac catgcaggac ctggagcaga 660

ggaggcccca gctggaggag ctcatcactg ctgcccagaa cctgaagaac aagaccagca 720

accaggaggc caggaccatc atcactgaca ggattgagag gatccagaac cagtgggatg 780

aggtgcagga gcacctgcag 800

<210> 12

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HR WL1 OPT

<400> 12

ttaacaagat gtacaaggac aggcagggca ggtttgacag gtcagtggag aagtggagga 60

ggttccacta tgacatcaag atcttcaacc agtggctgac agaggctgag cagttcctaa 120

ggaagaccca gatccctgag aactgggagc atgccaagta caagtggtac cttaaggagc 180

tgcaggatgg cattggccag aggcagacag tggtgaggac cctgaatgct acaggggagg 240

agattatcca gcagagcagc aagacagatg ccagtatcct gcaggagaag ctgggcagcc 300

tgaacctgag gtggcaggag gtgtgcaagc agctgtctga caggaagaag aggctggagg 360

agcagcctga cctggcccct ggcctgacaa caattggagc cagccctacc cagacagtga 420

ccctggtgac ccagcctgtg gtgaccaagg agacagctat cagcaagctg gagatgccca 480

gcagcctgat gctggaggtg cctgccctgg ctgacttcaa cagggcctgg acagagctga 540

cagactggct gagcctgctg gaccaggtga tcaagagcca gagggtgatg gtgggggacc 600

tggaggatat caatgagatg attatcaagc agaaggctac aatgcaggac ctggagcaga 660

ggaggcccca gctggaggag ctgattacag ctgcccagaa cctaaagaac aagaccagca 720

accaggaggc caggacaatt attacagaca ggattgagag gatccagaac cagtgggatg 780

aggtgcagga gcacctgcag 800

<210> 13

<211> 4687

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WL2 wt 5'AAV

<400> 13

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta ttggccgtcc 180

gccctcggca ccatcctcac gacacccaaa tatggcgacg ggtgaggaat ggtggggagt 240

tatttttaga gcggtgagga aggtgggcag gcagcaggtg ttggcgctct aaaaataact 300

cccgggagtt atttttagag cggaggaatg gtggacaccc aaatatggcg acggttcctc 360

acccgtcgcc atatttgggt gtccgccctc ggccggggcc gcattcctgg gggccgggcg 420

gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg gcggcccacg agctacccgg 480

aggagcggga ggcgccaagc tctagagtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag 540

accaatagaa actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta 600

ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc tctccacagg ccaccatgct ttggtgggaa 660

gaagtagagg actgttatga aagagaagat gttcaaaaga aaacattcac aaaatgggta 720

aatgcacaat tttctaagtt tgggaagcag catattgaga acctcttcag tgacctacag 780

gatgggaggc gcctcctaga cctcctcgaa ggcctgacag ggcaaaaact gccaaaagaa 840

aaaggatcca caagagttca tgccctgaac aatgtcaaca aggcactgcg ggttttgcag 900

aacaataatg ttgatttagt gaatattgga agtactgaca tcgtagatgg aaatcataaa 960

ctgactcttg gtttgatttg gaatataatc ctccactggc aggtcaaaaa tgtaatgaaa 1020

aatatcatgg ctggattgca acaaaccaac agtgaaaaga ttctcctgag ctgggtccga 1080

caatcaactc gtaattatcc acaggttaat gtaatcaact tcaccaccag ctggtctgat 1140

ggcctggctt tgaatgctct catccatagt cataggccag acctatttga ctggaatagt 1200

gtggtttgcc agcagtcagc cacacaacga ctggaacatg cattcaacat cgccagatat 1260

caattaggca tagagaaact actcgatcct gaagatgttg ataccaccta tccagataag 1320

aagtccatct taatgtacat cacatcactc ttccaagttt tgcctcaaca agtgagcatt 1380

gaagccatcc aggaagtgga aatgttgcca aggccaccta aagtgactaa agaagaacat 1440

tttcagttac atcatcaaat gcactattct caacagatca cggtcagtct agcacaggga 1500

tatgagagaa cttcttcccc taagcctcga ttcaagagct atgcctacac acaggctgct 1560

tatgtcacca cctctgaccc tacacggagc ccatttcctt cacagcattt ggaagctcct 1620

gaagacaagt catttggcag ttcattgatg gagagtgaag taaacctgga ccgttatcaa 1680

acagctttag aagaagtatt atcgtggctt ctttctgctg aggacacatt gcaagcacaa 1740

ggagagattt ctaatgatgt ggaagtggtg aaagaccagt ttcatactca tgaggggtac 1800

atgatggatt tgacagccca tcagggccgg gttggtaata ttctacaatt gggaagtaag 1860

ctgattggaa caggaaaatt atcagaagat gaagaaactg aagtacaaga gcagatgaat 1920

ctcctaaatt caagatggga atgcctcagg gtagctagca tggaaaaaca aagcaattta 1980

catagagttt taatggatct ccagaatcag aaactgaaag agttgaatga ctggctaaca 2040

aaaacagaag aaagaacaag gaaaatggag gaagagcctc ttggacctga tcttgaagac 2100

ctaaaacgcc aagtacaaca acataaggtg cttcaagaag atctagaaca agaacaagtc 2160

agggtcaatt ctctcactca catggtggtg gtagttgatg aatctagtgg agatcacgca 2220

actgctgctt tggaagaaca acttaaggta ttgggagatc gatgggcaaa catctgtaga 2280

tggacagaag accgctgggt tcttttacaa gacatccttc tcaaatggca acgtcttact 2340

gaagaacagt gcctttttag tgcatggctt tcagaaaaag aagatgcagt gaacaagatt 2400

cacacaactg gctttaaaga tcaaaatgaa atgttatcaa gtcttcaaaa actggccgtt 2460

ttaaaagcgg atctagaaaa gaaaaagcaa tccatgggca aactgtattc actcaaacaa 2520

gatcttcttt caacactgaa gaataagtca gtgacccaga agacggaagc atggctggat 2580

aactttgccc ggtgttggga taatttagtc caaaaacttg aaaagagtac agcacagatt 2640

tcacaggctg tcaccaccac tcagccatca ctaacacaga caactgtaat ggaaacagta 2700

actacggtga ccacaaggga acagatcctg gtaaagcatg ctcaagagga acttccacca 2760

ccacctcccc aaaagaagag gcagattact gtggatggtt tggagaaaac tgtaagcctc 2820

cagaaagatc tatcagagat gcacgaatgg atgacacaag ctgaagaaga gtatcttgag 2880

agagattttg aatataaaac tccagatgaa ttacagaaag cagttgaaga gatgaagaga 2940

gctaaagaag aggcccaaca aaaagaagcg aaagtgaaac tccttactga gtctgtaaat 3000

agtgtcatag ctcaagctcc acctgtagca caagaggcct taaaaaagga acttgaaact 3060

ctaaccacca actaccagtg gctctgcact aggctgaatg ggaaatgcaa gactttggaa 3120

gaagtttggg catgttggca tgagttattg tcatacttgg agaaagcaaa caagtggcta 3180

aatgaagtag aatttaaact taaaaccact gaaaacattc ctggcggagc tgaggaaatc 3240

tctgaggtgc tagattcact tgaaaatttg atgcgacatt cagaggataa cccaaatcag 3300

attcgcatat tggcacagac cctaacagat ggcggagtca tggatgagct aatcaatgag 3360

gaacttgaga catttaattc tcgttggagg gaactacatg aagaggctgt aaggaggcaa 3420

aagttgcttg aacagccttt gaaggaattg gagcagttta actcagatat acaaaaattg 3480

cttgaaccac tggaggctga aattcagcag ggggtgaatc tgaaagagga agacttcaat 3540

aaagatatga atgaagacaa tgagggtact gtaaaagaat tgttgcaaag aggagacaac 3600

ttacaacaaa gaatcacaga tgagagaaag agagaggaaa taaagataaa acagcagctg 3660

ttacagacaa aacataacgc gttcaaggat ttgaggtctc aaagaagaaa aaaggctcta 3720

gaaatttctc atcagtggta tcagtacaag aggcaggctg atgatctcct gaaatgcttg 3780

gatgacattg aaaaaaaatt agccagccta cctgagccca gagatgaaag gaaaataaag 3840

gaaattgatc gggaattgca gaagaagaaa gaggagctga atgcagtgcg taggcaagct 3900

gagggcttgt ctgaggatgg ggccgcaatg gcagtggagc caactcagat ccagctcagc 3960

aagcgctggc gggaaattga gagcaaattt gctcagtttc gaagactcaa ctttgcacaa 4020

attcacactg tccgtgaaga aacgatgatg gtgatgactg aagacatgcc tttggaaatt 4080

tcttatgtgc cttctactta tttgactgaa atcactcatg tctcacaagc cctattagaa 4140

gtggaacaac ttctcaatgc tcctgacctc tgtgctaagg actttgaaga tctctttaag 4200

caagaggagt ctctgaagaa tataaaagat agtctacaac aaagctcagg tcggattgac 4260

attattcata gcaagaagac agcagcattg caaagtgcaa cgcctgtgga aagggtgaag 4320

ctacaggaag ctctctccca gcttgatttc caatgggaaa aagttaacaa aatgtacaag 4380

gaccgacaag ggcgatttga cagatctgtt gagaaatggc ggcgttttca ttatgatata 4440

aagatattta atcagtggct aacagaagct gaacagtttc tcagaaagac acaaattcct 4500

accggttttg cggccgcttt acgtagataa gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa 4560

ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 4620

cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 4680

agcgcgc 4687

<210> 14

<211> 4739

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WL2 wt 3'AAV

<400> 14

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta ttacgcgttt 180

taaagaagaa aaaaggctct agaaatttct catcagtggt atcagtacaa gaggcaggct 240

gatgatctcc tgaaatgctt ggatgacatt gaaaaaaaat tagccagcct acctgagccc 300

agagatgaaa ggaaaataaa ggaaattgat cgggaattgc agaagaagaa agaggagctg 360

aatgcagtgc gtaggcaagc tgagggcttg tctgaggatg gggccgcaat ggcagtggag 420

ccaactcaga tccagctcag caagcgctgg cgggaaattg agagcaaatt tgctcagttt 480

cgaagactca actttgcaca aattcacact gtccgtgaag aaacgatgat ggtgatgact 540

gaagacatgc ctttggaaat ttcttatgtg ccttctactt atttgactga aatcactcat 600

gtctcacaag ccctattaga agtggaacaa cttctcaatg ctcctgacct ctgtgctaag 660

gactttgaag atctctttaa gcaagaggag tctctgaaga atataaaaga tagtctacaa 720

caaagctcag gtcggattga cattattcat agcaagaaga cagcagcatt gcaaagtgca 780

acgcctgtgg aaagggtgaa gctacaggaa gctctctccc agcttgattt ccaatgggaa 840

aaagttaaca aaatgtacaa ggaccgacaa gggcgatttg acagatctgt tgagaaatgg 900

cggcgttttc attatgatat aaagatattt aatcagtggc taacagaagc tgaacagttt 960

ctcagaaaga cacaaattcc tgagaattgg gaacatgcta aatacaaatg gtatcttaag 1020

gaactccagg atggcattgg gcagcggcaa actgttgtca gaacattgaa tgcaactggg 1080

gaagaaataa ttcagcaatc ctcaaaaaca gatgccagta ttctacagga aaaattggga 1140

agcctgaatc tgcggtggca ggaggtctgc aaacagctgt cagacagaaa aaagaggcta 1200

gaagagcagc ctgacctagc tcctggactg accactattg gagcctctcc tactcagact 1260

gttactctgg tgacacaacc tgtggttact aaggaaactg ccatctccaa actagaaatg 1320

ccatcttcct tgatgttgga ggtaccaact catagattac tgcaacagtt ccccctggac 1380

ctggaaaagt ttcttgcctg gcttacagaa gctgaaacaa ctgccaatgt cctacaggat 1440

gctacccgta aggaaaggct cctagaagac tccaagggag taaaagagct gatgaaacaa 1500

tggcaagacc tccaaggtga aattgaagct cacacagatg tttatcacaa cctggatgaa 1560

aacagccaaa aaatcctgag atccctggaa ggttccgatg atgcagtcct gttacaaaga 1620

cgtttggata acatgaactt caagtggagt gaacttcgga aaaagtctct caacattagg 1680

tcccatttgg aagccagttc tgaccagtgg aagcgtctgc acctttctct gcaggaactt 1740

ctggtgtggc tacagctgaa agatgatgaa ttaagccggc aggcacctat tggaggcgac 1800

tttccagcag ttcagaagca gaacgatgta catagggcct tcaagaggga attgaaaact 1860

aaagaacctg taatcatgag tactcttgag actgtacgaa tatttctgac agagcagcct 1920

ttggaaggac tagagaaact ctaccaggag cccagagagc tgcctcctga ggagagagcc 1980

cagaatgtca ctcggcttct acgaaagcag gctgaggagg tcaatactga gtgggaaaaa 2040

ttgaacctgc actccgctga ctggcagaga aaaatagatg agacccttga aagactccag 2100

gaacttcaag aggccacgga tgagctggac ctcaagctgc gccaagctga ggtgatcaag 2160

ggatcctggc agcccgtggg cgatctcctc attgactctc tccaagatca cctcgagaaa 2220

gtcaaggcac ttcgaggaga aattgcgcct ctgaaagaga acgtgagcca cgtcaatgac 2280

cttgctcgcc agcttaccac tttgggcatt cagctctcac cgtataacct cagcactctg 2340

gaagacctga acaccagatg gaagcttctg caggtggccg tcgaggaccg agtcaggcag 2400

ctgcatgaag cccacaggga ctttggtcca gcatctcagc actttctttc cacgtctgtc 2460

cagggtccct gggagagagc catctcgcca aacaaagtgc cctactatat caaccacgag 2520

actcaaacaa cttgctggga ccatcccaaa atgacagagc tctaccagtc tttagctgac 2580

ctgaataatg tcagattctc agcttatagg actgccatga aactccgaag actgcagaag 2640

gccctttgct tggatctctt gagcctgtca gctgcatgtg atgccttgga ccagcacaac 2700

ctcaagcaaa atgaccagcc catggatatc ctgcagatta ttaattgttt gaccactatt 2760

tatgaccgcc tggagcaaga gcacaacaat ttggtcaacg tccctctctg cgtggatatg 2820

tgtctgaact ggctgctgaa tgtttatgat acgggacgaa cagggaggat ccgtgtcctg 2880

tcttttaaaa ctggcatcat ttccctgtgt aaagcacatt tggaagacaa gtacagatac 2940

cttttcaagc aagtggcaag ttcaacagga ttttgtgacc agcgcaggct gggcctcctt 3000

ctgcatgatt ctatccaaat tccaagacag ttgggtgaag ttgcatcctt tgggggcagt 3060

aacattgagc caagtgtccg gagctgcttc caatttgcta ataataagcc agagatcgaa 3120

gcggccctct tcctagactg gatgagactg gaaccccagt ccatggtgtg gctgcccgtc 3180

ctgcacagag tggctgctgc agaaactgcc aagcatcagg ccaaatgtaa catctgcaaa 3240

gagtgtccaa tcattggatt caggtacagg agtctaaagc actttaatta tgacatctgc 3300

caaagctgct ttttttctgg tcgagttgca aaaggccata aaatgcacta tcccatggtg 3360

gaatattgca ctccgactac atcaggagaa gatgttcgag actttgccaa ggtactaaaa 3420

aacaaatttc gaaccaaaag gtattttgcg aagcatcccc gaatgggcta cctgccagtg 3480

cagactgtct tagaggggga caacatggaa actcccgtta ctctgatcaa cttctggcca 3540

gtagattctg cgcctgcctc gtcccctcag ctttcacacg atgatactca ttcacgcatt 3600

gaacattatg ctagcaggct agcagaaatg gaaaacagca atggatctta tctaaatgat 3660

agcatctctc ctaatgagag catagatgat gaacatttgt taatccagca ttactgccaa 3720

agtttgaacc aggactcccc cctgagccag cctcgtagtc ctgcccagat cttgatttcc 3780

ttagagagtg aggaaagagg ggagctagag agaatcctag cagatcttga ggaagaaaac 3840

aggaatctgc aagcagaata tgaccgtcta aagcagcagc acgaacataa aggcctgtcc 3900

ccactgccgt cccctcctga aatgatgccc acctctcccc agagtccccg ggatgctgag 3960

ctcattgctg aggccaagct actgcgtcaa cacaaaggcc gcctggaagc caggatgcaa 4020

atcctggaag accacaataa acagctggag tcacagttac acaggctaag gcagctgctg 4080

gagcaacccc aggcagaggc caaagtgaat ggcacaacgg tgtcctctcc ttctacctct 4140

ctacagaggt ccgacagcag tcagcctatg ctgctccgag tggttggcag tcaaacttcg 4200

gactccatgg gtgaggaaga tcttctcagt cctccccagg acacaagcac agggttagag 4260

gaggtgatgg agcaactcaa caactccttc cctagttcaa gaggaagaaa tacccctgga 4320

aagccaatga gagaggacac aatgtagcag acatgataag atacattgat gagtttggac 4380

aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg 4440

ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt 4500

ttatgtttca ggttcagggg gagatgtggg aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca 4560

aatgtggtat ttacgtagat aagtagcatg gcgggttaat cattaactac aaggaacccc 4620

tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 4680

caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc 4739

<210> 15

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HR WL2部分OPT1

<400> 15

agcggcggaa gaaggccctg gagatctccc accagtggta ccagtacaag cggcaggccg 60

acgacctcct gaagtgcctg gacgacatcg agaagaagct ggccagcctg ccggagcccc 120

gggacgagcg caagatcaag gagatcgacc gggagctgca gaagaagaag gaggagctga 180

acgccgtgcg ccggcaggcc gagggcctgt ccgaggacgg ggccgccatg gccgtggagc 240

ccacccagat ccagctcagc aagcgctggc gggagatcga gagcaagttc gcccagttcc 300

ggcgcctcaa cttcgcccag atccacaccg tccgggagga gacgatgatg gtgatgaccg 360

aggacatgcc cctggagatc tcctacgtgc cctccaccta cctgaccgag atcacccacg 420

tctcccaggc cctgctggag gtggagcagc tcctcaacgc ccccgacctc tgcgccaagg 480

acttcgagga cctcttcaag caggaggagt ccctgaagaa catcaaggac agcctgcagc 540

agagctccgg gcggatcgac atcatccaca gcaagaagac cgccgccctg cagagcgcca 600

cgcccgtgga gcgggtgaag ctgcaggagg ccctctccca gctggacttc cagtgggaga 660

aggtgaacaa gatgtacaag gaccggcagg ggcggttcga ccgctccgtg gagaagtggc 720

ggcgcttcca ctacgacatc aagatcttca accagtggct gaccgaggcc gagcagttcc 780

tccggaagac ccagatcccc 800

<210> 16

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HR WL2部分OPT2

<400> 16

agaggaggaa gaaggccctg gagatcagcc accagtggta ccagtacaag aggcaggctg 60

atgacctcct gaagtgcctg gatgacattg agaagaagct ggccagcctc cctgagccca 120

gggatgagag gaagatcaag gagattgaca gggagctgca gaagaagaag gaggagctga 180

atgcagtgag gaggcaggct gagggcctgt ctgaggatgg ggctgccatg gcagtggagc 240

ccacccagat ccagctcagc aagaggtgga gggagattga gagcaagttt gcccagttca 300

ggaggctcaa ctttgcccag atccacactg tcagggagga gaccatgatg gtgatgactg 360

aggacatgcc cctggagatc agctatgtgc ccagcaccta cctgactgag atcacccatg 420

tcagccaggc cctcctggag gtggagcagc tcctcaatgc ccctgacctc tgtgccaagg 480

actttgagga cctcttcaag caggaggaga gcctgaagaa catcaaggac agcctgcagc 540

agagctcagg caggattgac atcatccaca gcaagaagac agcagccctg cagagtgcca 600

cccctgtgga gagggtgaag ctgcaggagg ccctcagcca gctggacttc cagtgggaga 660

aggtgaacaa gatgtacaag gacaggcagg ggaggtttga caggagtgtg gagaagtgga 720

ggaggttcca ctatgacatc aagatcttca accagtggct gacagaggct gagcagttcc 780

tcaggaagac ccagatccct 800

<210> 17

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> HR WL2 OPT

<400> 17

agaggaggaa gaaggccctg gagatcagcc accagtggta ccagtacaag aggcaggctg 60

atgacctgct gaagtgcctg gatgacattg agaagaagct ggccagcctg cctgagccca 120

gggatgagag gaagatcaag gagattgaca gggagctgca gaagaagaag gaggagctga 180

atgctgtgag gaggcaggct gagggcctgt ctgaggatgg ggctgccatg gctgtggagc 240

ccacccagat ccagctgagc aagaggtgga gggagattga gagcaagttt gcccagttca 300

ggaggctgaa ctttgcccag atccacactg tgagggagga gaccatgatg gtgatgacag 360

aggacatgcc cctggagatc agctatgtgc ccagcaccta cctgactgag atcacccatg 420

tgagccaggc cctgctggag gtggagcagc tgctgaatgc ccctgacctg tgtgccaagg 480

actttgagga cctgttcaag caggaggaga gcctgaagaa catcaaggac agcctgcagc 540

agagctctgg caggattgac atcatccaca gcaagaagac tgctgccctg cagtctgcca 600

cccctgtgga gagggtgaag ctgcaggagg ccctgagcca gctggacttc cagtgggaga 660

aggtgaacaa gatgtacaag gacaggcagg gcaggtttga caggtctgtg gagaagtgga 720

ggaggttcca ctatgacatc aagatcttca accagtggct gactgaggct gagcagttcc 780

tgaggaagac ccagatccct 800

<210> 18

<211> 4655

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> DD 5'AAV

<400> 18

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta tttactagtt 180

ttctcgagtt tggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg 240

gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt 300

tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca 360

aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg 420

cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg 480

cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagagtaag tatcaaggtt 540

acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg 600

cgtttctgat aggcacctat tggtcttact gacatccact ttgcctttct ctccacaggc 660

caccatgctt tggtgggaag aagtagagga ctgttatgaa agagaagatg ttcaaaagaa 720

aacattcaca aaatgggtaa atgcacaatt ttctaagttt gggaagcagc atattgagaa 780

cctcttcagt gacctacagg atgggaggcg cctcctagac ctcctcgaag gcctgacagg 840

gcaaaaactg ccaaaagaaa aaggatccac aagagttcat gccctgaaca atgtcaacaa 900

ggcactgcgg gttttgcaga acaataatgt tgatttagtg aatattggaa gtactgacat 960

cgtagatgga aatcataaac tgactcttgg tttgatttgg aatataatcc tccactggca 1020

ggtcaaaaat gtaatgaaaa atatcatggc tggattgcaa caaaccaaca gtgaaaagat 1080

tctcctgagc tgggtccgac aatcaactcg taattatcca caggttaatg taatcaactt 1140

caccaccagc tggtctgatg gcctggcttt gaatgctctc atccatagtc ataggccaga 1200

cctatttgac tggaatagtg tggtttgcca gcagtcagcc acacaacgac tggaacatgc 1260

attcaacatc gccagatatc aattaggcat agagaaacta ctcgatcctg aagatgttga 1320

taccacctat ccagataaga agtccatctt aatgtacatc acatcactct tccaagtttt 1380

gcctcaacaa gtgagcattg aagccatcca ggaagtggaa atgttgccaa ggccacctaa 1440

agtgactaaa gaagaacatt ttcagttaca tcatcaaatg cactattctc aacagatcac 1500

ggtcagtcta gcacagggat atgagagaac ttcttcccct aagcctcgat tcaagagcta 1560

tgcctacaca caggctgctt atgtcaccac ctctgaccct acacggagcc catttccttc 1620

acagcatttg gaagctcctg aagacaagtc atttggcagt tcattgatgg agagtgaagt 1680

aaacctggac cgttatcaaa cagctttaga agaagtatta tcgtggcttc tttctgctga 1740

ggacacattg caagcacaag gagagatttc taatgatgtg gaagtggtga aagaccagtt 1800

tcatactcat gaggggtaca tgatggattt gacagcccat cagggccggg ttggtaatat 1860

tctacaattg ggaagtaagc tgattggaac aggaaaatta tcagaagatg aagaaactga 1920

agtacaagag cagatgaatc tcctaaattc aagatgggaa tgcctcaggg tagctagcat 1980

ggaaaaacaa agcaatttac atagagtttt aatggatctc cagaatcaga aactgaaaga 2040

gttgaatgac tggctaacaa aaacagaaga aagaacaagg aaaatggagg aagagcctct 2100

tggacctgat cttgaagacc taaaacgcca agtacaacaa cataaggtgc ttcaagaaga 2160

tctagaacaa gaacaagtca gggtcaattc tctcactcac atggtggtgg tagttgatga 2220

atctagtgga gatcacgcaa ctgctgcttt ggaagaacaa cttaaggtat tgggagatcg 2280

atgggcaaac atctgtagat ggacagaaga ccgctgggtt cttttacaag acatccttct 2340

caaatggcaa cgtcttactg aagaacagtg cctttttagt gcatggcttt cagaaaaaga 2400

agatgcagtg aacaagattc acacaactgg ctttaaagat caaaatgaaa tgttatcaag 2460

tcttcaaaaa ctggccgttt taaaagcgga tctagaaaag aaaaagcaat ccatgggcaa 2520

actgtattca ctcaaacaag atcttctttc aacactgaag aataagtcag tgacccagaa 2580

gacggaagca tggctggata actttgcccg gtgttgggat aatttagtcc aaaaacttga 2640

aaagagtaca gcacagattt cacaggaaat ttcttatgtg ccttctactt atttgactga 2700

aatcactcat gtctcacaag ccctattaga agtggaacaa cttctcaatg ctcctgacct 2760

ctgtgctaag gactttgaag atctctttaa gcaagaggag tctctgaaga atataaaaga 2820

tagtctacaa caaagctcag gtcggattga cattattcat agcaagaaga cagcagcatt 2880

gcaaagtgca acgcctgtgg aaagggtgaa gctacaggaa gctctctccc agcttgattt 2940

ccaatgggaa aaagttaaca aaatgtacaa ggaccgacaa gggcgatttg acagatctgt 3000

tgagaaatgg cggcgttttc attatgatat aaagatattt aatcagtggc taacagaagc 3060

tgaacagttt ctcagaaaga cacaaattcc tgagaattgg gaacatgcta aatacaaatg 3120

gtatcttaag gaactccagg atggcattgg gcagcggcaa actgttgtca gaacattgaa 3180

tgcaactggg gaagaaataa ttcagcaatc ctcaaaaaca gatgccagta ttctacagga 3240

aaaattggga agcctgaatc tgcggtggca ggaggtctgc aaacagctgt cagacagaaa 3300

aaagaggcta gaagaacaaa agaatatctt gtcagaattt caaagagatt taaatgaatt 3360

tgttttatgg ttggaggaag cagataacat tgctagtatc ccacttgaac ctggaaaaga 3420

gcagcaacta aaagaaaagc ttgagcaagt caagttactg gtggaagagt tgcccctgcg 3480

ccagggaatt ctcaaacaat taaatgaaac tggaggaccc gtgcttgtaa gtgctcccat 3540

aagcccagaa gagcaagata aacttgaaaa taagctcaag cagacaaatc tccagtggat 3600

aaaggtttcc agagctttac ctgagaaaca aggagaaatt gaagctcaaa taaaagacct 3660

tgggcagctt gaaaaaaagc ttgaagacct tgaagagcag ttaaatcatc tgctgctgtg 3720

gttatctcct attaggaatc agttggaaat ttataaccaa ccaaaccaag aaggaccatt 3780

tgacgttcag gaaactgaaa tagcagttca agctaaacaa ccggatgtgg aagagatttt 3840

gtctaaaggg cagcatttgt acaaggaaaa accagccact cagccagtga agaggaagtt 3900

agaagatctg agctctgagt ggaaggcggt aaaccgttta cttcaagagc tgagggcaaa 3960

gcagcctgac ctagctcctg gactgaccac tattggagcc tctcctactc agactgttac 4020

tctggtgaca caacctgtgg ttactaagga aactgccatc tccaaactag aaatgccatc 4080

ttccttgatg ttggaggtac ctgctctggc agatttcaac cgggcttgga cagaacttac 4140

cgactggctt tctctgcttg atcaagttat aaaatcacag agggtgatgg tgggtgacct 4200

tgaggatatc aacgagatga tcatcaagca gaaggcaaca atgcaggatt tggaacagag 4260

gcgtccccag ttggaagaac tcattaccgc tgcccaaaat ttgaaaaaca agaccagcaa 4320

tcaagaggct agaacaatca ttacggatcg aattgaaaga attcagaatc agtgggatga 4380

agtacaagaa caccttcaga accggcgcca acagttgaat gaaatgttaa aggattcaac 4440

acaatggctg gaagctaagg aagaatttac gcgttttgcg gccgctttac gtagataagt 4500

agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct 4560

ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct 4620

ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc 4655

<210> 19

<211> 4262

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> DD 3'AAV

<400> 19

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta tttgcggccg 180

ctttacgcgt ttttggaggt acctgctctg gcagatttca accgggcttg gacagaactt 240

accgactggc tttctctgct tgatcaagtt ataaaatcac agagggtgat ggtgggtgac 300

cttgaggata tcaacgagat gatcatcaag cagaaggcaa caatgcagga tttggaacag 360

aggcgtcccc agttggaaga actcattacc gctgcccaaa atttgaaaaa caagaccagc 420

aatcaagagg ctagaacaat cattacggat cgaattgaaa gaattcagaa tcagtgggat 480

gaagtacaag aacaccttca gaaccggcgc caacagttga atgaaatgtt aaaggattca 540

acacaatggc tggaagctaa ggaagaagct gagcaggtct taggacaggc cagagccaag 600

cttgagtcat ggaaggaggg tccctataca gtagatgcaa tccaaaagaa aatcacagaa 660

accaagcagt tggccaaaga cctccgccag tggcagacaa atgtagatgt ggcaaatgac 720

ttggccctga aacttctccg ggattattct gcagatgata ccagaaaagt ccacatgata 780

acagagaata tcaatgcctc ttggagaagc attcataaaa gggtgagtga gcgagaggct 840

gctttggaag aaactcatag attactgcaa cagttccccc tggacctgga aaagtttctt 900

gcctggctta cagaagctga aacaactgcc aatgtcctac aggatgctac ccgtaaggaa 960

aggctcctag aagactccaa gggagtaaaa gagctgatga aacaatggca agacctccaa 1020

ggtgaaattg aagctcacac agatgtttat cacaacctgg atgaaaacag ccaaaaaatc 1080

ctgagatccc tggaaggttc cgatgatgca gtcctgttac aaagacgttt ggataacatg 1140

aacttcaagt ggagtgaact tcggaaaaag tctctcaaca ttaggtccca tttggaagcc 1200

agttctgacc agtggaagcg tctgcacctt tctctgcagg aacttctggt gtggctacag 1260

ctgaaagatg atgaattaag ccggcaggca cctattggag gcgactttcc agcagttcag 1320

aagcagaacg atgtacatag ggccttcaag agggaattga aaactaaaga acctgtaatc 1380

atgagtactc ttgagactgt acgaatattt ctgacagagc agcctttgga aggactagag 1440

aaactctacc aggagcccag agagctgcct cctgaggaga gagcccagaa tgtcactcgg 1500

cttctacgaa agcaggctga ggaggtcaat actgagtggg aaaaattgaa cctgcactcc 1560

gctgactggc agagaaaaat agatgagacc cttgaaagac tccaggaact tcaagaggcc 1620

acggatgagc tggacctcaa gctgcgccaa gctgaggtga tcaagggatc ctggcagccc 1680

gtgggcgatc tcctcattga ctctctccaa gatcacctcg agaaagtcaa ggcacttcga 1740

ggagaaattg cgcctctgaa agagaacgtg agccacgtca atgaccttgc tcgccagctt 1800

accactttgg gcattcagct ctcaccgtat aacctcagca ctctggaaga cctgaacacc 1860

agatggaagc ttctgcaggt ggccgtcgag gaccgagtca ggcagctgca tgaagcccac 1920

agggactttg gtccagcatc tcagcacttt ctttccacgt ctgtccaggg tccctgggag 1980

agagccatct cgccaaacaa agtgccctac tatatcaacc acgagactca aacaacttgc 2040

tgggaccatc ccaaaatgac agagctctac cagtctttag ctgacctgaa taatgtcaga 2100

ttctcagctt ataggactgc catgaaactc cgaagactgc agaaggccct ttgcttggat 2160

ctcttgagcc tgtcagctgc atgtgatgcc ttggaccagc acaacctcaa gcaaaatgac 2220

cagcccatgg atatcctgca gattattaat tgtttgacca ctatttatga ccgcctggag 2280

caagagcaca acaatttggt caacgtccct ctctgcgtgg atatgtgtct gaactggctg 2340

ctgaatgttt atgatacggg acgaacaggg aggatccgtg tcctgtcttt taaaactggc 2400

atcatttccc tgtgtaaagc acatttggaa gacaagtaca gatacctttt caagcaagtg 2460

gcaagttcaa caggattttg tgaccagcgc aggctgggcc tccttctgca tgattctatc 2520

caaattccaa gacagttggg tgaagttgca tcctttgggg gcagtaacat tgagccaagt 2580

gtccggagct gcttccaatt tgctaataat aagccagaga tcgaagcggc cctcttccta 2640

gactggatga gactggaacc ccagtccatg gtgtggctgc ccgtcctgca cagagtggct 2700

gctgcagaaa ctgccaagca tcaggccaaa tgtaacatct gcaaagagtg tccaatcatt 2760

ggattcaggt acaggagtct aaagcacttt aattatgaca tctgccaaag ctgctttttt 2820

tctggtcgag ttgcaaaagg ccataaaatg cactatccca tggtggaata ttgcactccg 2880

actacatcag gagaagatgt tcgagacttt gccaaggtac taaaaaacaa atttcgaacc 2940

aaaaggtatt ttgcgaagca tccccgaatg ggctacctgc cagtgcagac tgtcttagag 3000

ggggacaaca tggaaactcc cgttactctg atcaacttct ggccagtaga ttctgcgcct 3060

gcctcgtccc ctcagctttc acacgatgat actcattcac gcattgaaca ttatgctagc 3120

aggctagcag aaatggaaaa cagcaatgga tcttatctaa atgatagcat ctctcctaat 3180

gagagcatag atgatgaaca tttgttaatc cagcattact gccaaagttt gaaccaggac 3240

tcccccctga gccagcctcg tagtcctgcc cagatcttga tttccttaga gagtgaggaa 3300

agaggggagc tagagagaat cctagcagat cttgaggaag aaaacaggaa tctgcaagca 3360

gaatatgacc gtctaaagca gcagcacgaa cataaaggcc tgtccccact gccgtcccct 3420

cctgaaatga tgcccacctc tccccagagt ccccgggatg ctgagctcat tgctgaggcc 3480

aagctactgc gtcaacacaa aggccgcctg gaagccagga tgcaaatcct ggaagaccac 3540

aataaacagc tggagtcaca gttacacagg ctaaggcagc tgctggagca accccaggca 3600

gaggccaaag tgaatggcac aacggtgtcc tctccttcta cctctctaca gaggtccgac 3660

agcagtcagc ctatgctgct ccgagtggtt ggcagtcaaa cttcggactc catgggtgag 3720

gaagatcttc tcagtcctcc ccaggacaca agcacagggt tagaggaggt gatggagcaa 3780

ctcaacaact ccttccctag ttcaagagga agaaataccc ctggaaagcc aatgagagag 3840

gacacaatgt agcagacatg ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa 3900

tgcagtgaaa aaaatgcttt atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca 3960

ttataagctg caataaacaa gttaacaaca acaattgcat tcattttatg tttcaggttc 4020

agggggagat gtgggaggtt ttttaaagca agtaaaacct ctacaaatgt ggtattgtcg 4080

actttactag tttttacgta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac 4140

ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 4200

gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 4260

gc 4262

<210> 20

<211> 2427

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<400> 20

Met Leu Trp Trp Glu Glu Val Glu Asp Cys Tyr Glu Arg Glu Asp Val

1 5 10 15

Gln Lys Lys Thr Phe Thr Lys Trp Val Asn Ala Gln Phe Ser Lys Phe

20 25 30

Gly Lys Gln His Ile Glu Asn Leu Phe Ser Asp Leu Gln Asp Gly Arg

35 40 45

Ser Leu Leu Asp Leu Leu Glu Gly Leu Thr Gly Gln Lys Leu Pro Lys

50 55 60

Glu Lys Gly Ser Thr Arg Val His Ala Leu Asn Asn Val Asn Lys Ala

65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Gln Asn Asn Asn Val Asp Leu Val Asn Ile Gly Ser

85 90 95

Thr Asp Ile Val Asp Gly Asn His Lys Leu Thr Leu Gly Leu Ile Trp

100 105 110

Asn Ile Ile Leu His Trp Gln Val Lys Asn Val Met Lys Asn Ile Met

115 120 125

Ala Gly Leu Gln Gln Thr Asn Ser Glu Lys Ile Leu Leu Ser Trp Val

130 135 140

Arg Gln Ser Thr Arg Asn Tyr Pro Gln Val Asn Val Ile Asn Phe Thr

145 150 155 160

Thr Ser Trp Ser Asp Gly Leu Ala Leu Asn Ala Leu Ile His Ser His

165 170 175

Arg Pro Asp Leu Phe Asp Trp Asn Ser Val Val Cys Gln Gln Ser Ala

180 185 190

Thr Gln Arg Leu Glu His Ala Phe Asn Ile Ala Arg Tyr Gln Leu Gly

195 200 205

Ile Glu Lys Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Thr Thr Tyr Pro Asp

210 215 220

Lys Lys Ser Ile Leu Met Tyr Ile Thr Ser Leu Phe Gln Val Leu Pro

225 230 235 240

Gln Gln Val Ser Ile Glu Ala Ile Gln Glu Val Glu Met Leu Pro Arg

245 250 255

Pro Pro Lys Val Thr Lys Glu Glu His Phe Gln Leu His His Gln Met

260 265 270

His Tyr Ser Gln Gln Ile Thr Val Ser Leu Ala Gln Gly Tyr Glu Arg

275 280 285

Thr Ser Ser Pro Lys Pro Arg Phe Lys Ser Tyr Ala Tyr Thr Gln Ala

290 295 300

Ala Tyr Val Thr Thr Ser Asp Pro Thr Arg Ser Pro Phe Pro Ser Gln

305 310 315 320

His Leu Glu Ala Pro Glu Asp Lys Ser Phe Gly Ser Ser Leu Met Glu

325 330 335

Ser Glu Val Asn Leu Asp Arg Tyr Gln Thr Ala Leu Glu Glu Val Leu

340 345 350

Ser Trp Leu Leu Ser Ala Glu Asp Thr Leu Gln Ala Gln Gly Glu Ile

355 360 365

Ser Asn Asp Val Glu Val Val Lys Asp Gln Phe His Thr His Glu Gly

370 375 380

Tyr Met Met Asp Leu Thr Ala His Gln Gly Arg Val Gly Asn Ile Leu

385 390 395 400

Gln Leu Gly Ser Lys Leu Ile Gly Thr Gly Lys Leu Ser Glu Asp Glu

405 410 415

Glu Thr Glu Val Gln Glu Gln Met Asn Leu Leu Asn Ser Arg Trp Glu

420 425 430

Cys Leu Arg Val Ala Ser Met Glu Lys Gln Ser Asn Leu His Arg Val

435 440 445

Leu Met Asp Leu Gln Asn Gln Lys Leu Lys Glu Leu Asn Asp Trp Leu

450 455 460

Thr Lys Thr Glu Glu Arg Thr Arg Lys Met Glu Glu Glu Pro Leu Gly

465 470 475 480

Pro Asp Leu Glu Asp Leu Lys Arg Gln Val Gln Gln His Lys Val Leu

485 490 495

Gln Glu Asp Leu Glu Gln Glu Gln Val Arg Val Asn Ser Leu Thr His

500 505 510

Met Val Val Val Val Asp Glu Ser Ser Gly Asp His Ala Thr Ala Ala

515 520 525

Leu Glu Glu Gln Leu Lys Val Leu Gly Asp Arg Trp Ala Asn Ile Cys

530 535 540

Arg Trp Thr Glu Asp Arg Trp Val Leu Leu Gln Asp Ile Leu Leu Lys

545 550 555 560

Trp Gln Arg Leu Thr Glu Glu Gln Cys Leu Phe Ser Ala Trp Leu Ser

565 570 575

Glu Lys Glu Asp Ala Val Asn Lys Ile His Thr Thr Gly Phe Lys Asp

580 585 590

Gln Asn Glu Met Leu Ser Ser Leu Gln Lys Leu Ala Val Leu Lys Ala

595 600 605

Asp Leu Glu Lys Lys Lys Gln Ser Met Gly Lys Leu Tyr Ser Leu Lys

610 615 620

Gln Asp Leu Leu Ser Thr Leu Lys Asn Lys Ser Val Thr Gln Lys Thr

625 630 635 640

Glu Ala Trp Leu Asp Asn Phe Ala Arg Cys Trp Asp Asn Leu Val Gln

645 650 655

Lys Leu Glu Lys Ser Thr Ala Gln Ile Ser Gln Ala Val Thr Thr Thr

660 665 670

Gln Pro Ser Leu Thr Gln Thr Thr Val Met Glu Thr Val Thr Thr Val

675 680 685

Thr Thr Arg Glu Gln Ile Leu Val Lys His Ala Gln Glu Glu Leu Pro

690 695 700

Pro Pro Pro Pro Gln Lys Lys Arg Gln Ile Thr Val Asp Gly Leu Glu

705 710 715 720

Lys Thr Val Ser Leu Gln Lys Asp Leu Ser Glu Met His Glu Trp Met

725 730 735

Thr Gln Ala Glu Glu Glu Tyr Leu Glu Arg Asp Ser Glu Tyr Lys Thr

740 745 750

Pro Asp Glu Leu Gln Lys Ala Val Glu Glu Met Lys Arg Ala Lys Glu

755 760 765

Glu Ala Gln Gln Lys Glu Ala Lys Val Lys Leu Leu Thr Glu Ser Val

770 775 780

Asn Ser Val Ile Ala Gln Ala Pro Pro Val Ala Gln Glu Ala Leu Lys

785 790 795 800

Lys Glu Leu Glu Thr Leu Thr Thr Asn Tyr Gln Trp Leu Cys Thr Arg

805 810 815

Leu Asn Gly Lys Cys Lys Thr Leu Glu Glu Val Trp Ala Cys Trp His

820 825 830

Glu Leu Leu Ser Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Trp Leu Asn Glu Val

835 840 845

Glu Phe Lys Leu Lys Thr Thr Glu Asn Ile Pro Gly Gly Ala Glu Glu

850 855 860

Ile Ser Glu Val Leu Asp Ser Leu Glu Asn Leu Met Arg His Ser Glu

865 870 875 880

Asp Asn Pro Asn Gln Ile Arg Ile Leu Ala Gln Thr Leu Thr Asp Gly

885 890 895

Gly Val Met Asp Glu Leu Ile Asn Glu Glu Leu Glu Thr Phe Asn Ser

900 905 910

Arg Trp Arg Glu Leu His Glu Glu Ala Val Arg Arg Gln Lys Leu Leu

915 920 925

Glu Gln Ile His Thr Val Arg Glu Glu Thr Met Met Val Met Thr Glu

930 935 940

Asp Met Pro Leu Glu Ile Ser Tyr Val Pro Ser Thr Tyr Leu Thr Glu

945 950 955 960

Ile Thr His Val Ser Gln Ala Leu Leu Glu Val Glu Gln Leu Leu Asn

965 970 975

Ala Pro Asp Leu Cys Ala Lys Asp Phe Glu Asp Leu Phe Lys Gln Glu

980 985 990

Glu Ser Leu Lys Asn Ile Lys Asp Ser Leu Gln Gln Ser Ser Gly Arg

995 1000 1005

Ile Asp Ile Ile His Ser Lys Lys Thr Ala Ala Leu Gln Ser Ala Thr

1010 1015 1020

Pro Val Glu Arg Val Lys Leu Gln Glu Ala Leu Ser Gln Leu Asp Phe

1025 1030 1035 1040

Gln Trp Glu Lys Val Asn Lys Met Tyr Lys Asp Arg Gln Gly Arg Phe

1045 1050 1055

Asp Arg Ser Val Glu Lys Trp Arg Arg Phe His Tyr Asp Ile Lys Ile

1060 1065 1070

Phe Asn Gln Trp Leu Thr Glu Ala Glu Gln Phe Leu Arg Lys Thr Gln

1075 1080 1085

Ile Pro Glu Asn Trp Glu His Ala Lys Tyr Lys Trp Tyr Leu Lys Glu

1090 1095 1100

Leu Gln Asp Gly Ile Gly Gln Arg Gln Thr Val Val Arg Thr Leu Asn

1105 1110 1115 1120

Ala Thr Gly Glu Glu Ile Ile Gln Gln Ser Ser Lys Thr Asp Ala Ser

1125 1130 1135

Ile Leu Gln Glu Lys Leu Gly Ser Leu Asn Leu Arg Trp Gln Glu Val

1140 1145 1150

Cys Lys Gln Leu Ser Asp Arg Lys Lys Arg Leu Glu Glu Gln Pro Asp

1155 1160 1165

Leu Ala Pro Gly Leu Thr Thr Ile Gly Ala Ser Pro Thr Gln Thr Val

1170 1175 1180

Thr Leu Val Thr Gln Pro Val Val Thr Lys Glu Thr Ala Ile Ser Lys

1185 1190 1195 1200

Leu Glu Met Pro Ser Ser Leu Met Leu Glu Val Pro Ala Leu Ala Asp

1205 1210 1215

Phe Asn Arg Ala Trp Thr Glu Leu Thr Asp Trp Leu Ser Leu Leu Asp

1220 1225 1230

Gln Val Ile Lys Ser Gln Arg Val Met Val Gly Asp Leu Glu Asp Ile

1235 1240 1245

Asn Glu Met Ile Ile Lys Gln Lys Ala Thr Met Gln Asp Leu Glu Gln

1250 1255 1260

Arg Arg Pro Gln Leu Glu Glu Leu Ile Thr Ala Ala Gln Asn Leu Lys

1265 1270 1275 1280

Asn Lys Thr Ser Asn Gln Glu Ala Arg Thr Ile Ile Thr Asp Arg Ile

1285 1290 1295

Glu Arg Ile Gln Asn Gln Trp Asp Glu Val Gln Glu His Leu Gln Asn

1300 1305 1310

Arg Arg Gln Gln Leu Asn Glu Met Leu Lys Asp Ser Thr Gln Trp Leu

1315 1320 1325

Glu Ala Lys Glu Glu Ala Glu Gln Val Leu Gly Gln Ala Arg Ala Lys

1330 1335 1340

Leu Glu Ser Trp Lys Glu Gly Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ile Gln Lys

1345 1350 1355 1360

Lys Ile Thr Glu Thr Lys Gln Leu Ala Lys Asp Leu Arg Gln Trp Gln

1365 1370 1375

Thr Asn Val Asp Val Ala Asn Asp Leu Ala Leu Lys Leu Leu Arg Asp

1380 1385 1390

Tyr Ser Ala Asp Asp Thr Arg Lys Val His Met Ile Thr Glu Asn Ile

1395 1400 1405

Asn Ala Ser Trp Arg Ser Ile His Lys Arg Val Ser Glu Arg Glu Ala

1410 1415 1420

Ala Leu Glu Glu Thr His Arg Leu Leu Gln Gln Phe Pro Leu Asp Leu

1425 1430 1435 1440

Glu Lys Phe Leu Ala Trp Leu Thr Glu Ala Glu Thr Thr Ala Asn Val

1445 1450 1455

Leu Gln Asp Ala Thr Arg Lys Glu Arg Leu Leu Glu Asp Ser Lys Gly

1460 1465 1470

Val Lys Glu Leu Met Lys Gln Trp Gln Asp Leu Gln Gly Glu Ile Glu

1475 1480 1485

Ala His Thr Asp Val Tyr His Asn Leu Asp Glu Asn Ser Gln Lys Ile

1490 1495 1500

Leu Arg Ser Leu Glu Gly Ser Asp Asp Ala Val Leu Leu Gln Arg Arg

1505 1510 1515 1520

Leu Asp Asn Met Asn Phe Lys Trp Ser Glu Leu Arg Lys Lys Ser Leu

1525 1530 1535

Asn Ile Arg Ser His Leu Glu Ala Ser Ser Asp Gln Trp Lys Arg Leu

1540 1545 1550

His Leu Ser Leu Gln Glu Leu Leu Val Trp Leu Gln Leu Lys Asp Asp

1555 1560 1565

Glu Leu Ser Arg Gln Ala Pro Ile Gly Gly Asp Phe Pro Ala Val Gln

1570 1575 1580

Lys Gln Asn Asp Val His Arg Ala Phe Lys Arg Glu Leu Lys Thr Lys

1585 1590 1595 1600

Glu Pro Val Ile Met Ser Thr Leu Glu Thr Val Arg Ile Phe Leu Thr

1605 1610 1615

Glu Gln Pro Leu Glu Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Gln Glu Pro Arg Glu

1620 1625 1630

Leu Pro Pro Glu Glu Arg Ala Gln Asn Val Thr Arg Leu Leu Arg Lys

1635 1640 1645

Gln Ala Glu Glu Val Asn Thr Glu Trp Glu Lys Leu Asn Leu His Ser

1650 1655 1660

Ala Asp Trp Gln Arg Lys Ile Asp Glu Thr Leu Glu Arg Leu Gln Glu

1665 1670 1675 1680

Leu Gln Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Leu Lys Leu Arg Gln Ala Glu

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Val Ile Lys Gly Ser Trp Gln Pro Val Gly Asp Leu Leu Ile Asp Ser

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Leu Gln Asp His Leu Glu Lys Val Lys Ala Leu Arg Gly Glu Ile Ala

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Pro Leu Lys Glu Asn Val Ser His Val Asn Asp Leu Ala Arg Gln Leu

1730 1735 1740

Thr Thr Leu Gly Ile Gln Leu Ser Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Leu Glu

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Asp Leu Asn Thr Arg Trp Lys Leu Leu Gln Val Ala Val Glu Asp Arg

1765 1770 1775

Val Arg Gln Leu His Glu Ala His Arg Asp Phe Gly Pro Ala Ser Gln

1780 1785 1790

His Phe Leu Ser Thr Ser Val Gln Gly Pro Trp Glu Arg Ala Ile Ser

1795 1800 1805

Pro Asn Lys Val Pro Tyr Tyr Ile Asn His Glu Thr Gln Thr Thr Cys

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Trp Asp His Pro Lys Met Thr Glu Leu Tyr Gln Ser Leu Ala Asp Leu

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Asn Asn Val Arg Phe Ser Ala Tyr Arg Thr Ala Met Lys Leu Arg Arg

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Leu Gln Lys Ala Leu Cys Leu Asp Leu Leu Ser Leu Ser Ala Ala Cys

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Asp Ala Leu Asp Gln His Asn Leu Lys Gln Asn Asp Gln Pro Met Asp

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Leu Asn Trp Leu Leu Asn Val Tyr Asp Thr Gly Arg Thr Gly Arg Ile

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Glu Glu Asn Arg Asn Leu Gln Ala Glu Tyr Asp Arg Leu Lys Gln Gln

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Pro Thr Ser Pro Gln Ser Pro Arg Asp Ala Glu Leu Ile Ala Glu Ala

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Lys Leu Leu Arg Gln His Lys Gly Arg Leu Glu Ala Arg Met Gln Ile

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Leu Glu Asp His Asn Lys Gln Leu Glu Ser Gln Leu His Arg Leu Arg

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Gln Leu Leu Glu Gln Pro Gln Ala Glu Ala Lys Val Asn Gly Thr Thr

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Val Ser Ser Pro Ser Thr Ser Leu Gln Arg Ser Asp Ser Ser Gln Pro

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Met Leu Leu Arg Val Val Gly Ser Gln Thr Ser Asp Ser Met Gly Glu

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<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> WL1校正

<400> 22

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aaccagtggg atgaggtgca ggagcacctg cagaacagga ggcagcagct gaatgagatg 3960

ctgaaggaca gtacccagtg gctggaggcc aaggaggagg ctgagcaggt gctgggccag 4020

gccagggcca agctggagag ctggaaggag ggcccctaca cagtggatgc catccagaag 4080

aagatcacag agaccaagca gctggccaag gacctgaggc agtggcagac caatgtggat 4140

gtggccaatg acctggccct gaagctgctg agggactact cagctgatga caccaggaag 4200

gtgcacatga tcacagagaa catcaatgcc agctggagga gcatccacaa gagggtgtct 4260

gagagggagg ctgccctaga ggagacccac aggctgctgc agcagttccc cctggacctg 4320

gagaagttcc tggcctggct gacagaggct gagacaacag ccaatgtgct gcaggatgct 4380

accaggaagg agaggctgct ggaggacagc aagggagtga aggagctgat gaagcagtgg 4440

caggacctac agggggagat tgaggcccat acagatgtgt accacaacct ggatgagaac 4500

agccagaaga tcctgaggag cctggagggc tctgatgatg ctgtgctgct gcagaggagg 4560

ctggacaata tgaacttcaa gtggtctgag ctgaggaaga agagcctaaa tatcaggagc 4620

cacctggagg ccagctctga ccagtggaag aggctacacc tgagcctgca ggagctgctg 4680

gtgtggctgc agctgaagga tgatgagcta agcaggcagg cccctattgg gggagacttc 4740

cctgctgtgc agaagcagaa tgatgtgcac agggccttca agagggagct gaagaccaag 4800

gagcctgtga ttatgagtac cctggagaca gtgaggatct tcctgacaga gcagcccctg 4860

gagggcctgg agaagctgta ccaggagccc agggagctgc cccctgagga gagggcccag 4920

aatgtgacca ggctgctgag gaagcaggct gaggaggtga atacagagtg ggagaagctg 4980

aacctacact ctgctgactg gcagaggaag attgatgaga ccctggagag gctgcaggag 5040

ctgcaggagg ctacagatga gctggacctg aagctgaggc aggctgaggt gatcaagggc 5100

agctggcagc ctgtggggga cctgctgatt gacagcctac aggaccacct ggagaaggtg 5160

aaggccctga ggggagagat tgccccccta aaggagaatg tgagtcatgt gaatgacctg 5220

gccaggcagc tgaccaccct gggcatccag ctgagcccct acaacctgag caccctggag 5280

gacctgaaca ccaggtggaa gctgctgcag gtggctgtgg aggacagggt gaggcagcta 5340

catgaggccc acagggactt tggccctgcc agccagcact tcctaagcac ctctgttcag 5400

ggcccctggg agagggccat cagccccaac aaggtgccct actacatcaa ccatgagacc 5460

cagaccacct gctgggacca ccccaagatg acagagctgt accagagcct ggctgacctg 5520

aacaatgtga ggttctctgc ctacaggaca gccatgaagc tgaggaggct gcagaaggcc 5580

ctgtgcctgg acctgctgag cctgtctgct gcctgtgatg ccctagacca gcacaacctg 5640

aagcagaatg accagcccat ggacatcctt cagatcatca actgcctgac caccatctat 5700

gacaggctag agcaggagca caacaacctg gtgaatgtgc ccctgtgtgt ggacatgtgc 5760

ctgaactggc tgctgaatgt gtatgacaca ggcaggacag gcaggatcag ggtgctgagc 5820

ttcaagacag gcatcatcag cctatgcaag gctcacctgg aggacaagta caggtacctg 5880

ttcaagcagg tggccagcag cacaggcttc tgtgaccaga ggaggctggg cctgctactt 5940

catgacagca ttcagatccc caggcagctg ggagaggtgg ccagctttgg aggcagcaac 6000

attgagccct cagtgaggag ctgcttccag tttgccaaca acaagcctga gattgaggct 6060

gccctgttcc tggactggat gaggctggag cctcagagca tggtgtggct gcctgtgctg 6120

cacagggtgg ctgctgctga gacagccaag catcaggcca agtgcaacat ctgcaaggag 6180

tgccccatca ttggcttcag gtacaggagc ctaaagcact tcaactatga catctgccag 6240

agctgcttct tctcaggcag ggtggccaag ggccacaaga tgcactaccc catggtggag 6300

tactgcaccc ccaccacctc aggagaggat gtgagggact ttgccaaggt gctgaagaac 6360

aagttcagga ccaagaggta ctttgccaag caccccagga tgggctacct gcctgtgcag 6420

acagtgctgg agggggacaa catggagacc cctgtgaccc tgatcaactt ctggcctgtg 6480

gactcagccc ctgccagcag cccccagctg agccatgatg acacccacag caggattgag 6540

cactatgcca gcaggctggc tgagatggag aacagcaatg gcagctacct aaatgacagc 6600

atcagcccca atgagagcat tgatgatgag cacctgctaa tccagcacta ctgccagagc 6660

ctgaaccagg acagccccct gagccagccc aggagccctg cccagatcct gatcagcctg 6720

gagtctgagg agagggggga gctggagagg atcctggctg acctggagga ggagaacagg 6780

aaccttcagg ctgagtatga caggctaaag cagcagcatg agcacaaggg cctgagcccc 6840

ctacccagcc cccctgagat gatgcccacc agcccccaga gccccaggga tgctgagctg 6900

attgctgagg ccaagctgct gaggcagcac aagggcaggc tggaggccag gatgcagatc 6960

ctagaggacc acaacaagca gctggagagc cagctacaca ggctgaggca gctgctggag 7020

cagcctcagg ctgaggccaa ggtgaatggc accacagtga gcagccccag caccagcctg 7080

cagaggtctg acagcagtca gcccatgctg ctcagggtgg tgggcagtca gacctctgac 7140

agcatgggag aggaggacct gctgagcccc cctcaggaca ccagcacagg cctggaggag 7200

gtgatggagc agctgaacaa cagcttcccc agcagcaggg gcaggaacac ccctggcaag 7260

cccatgaggg aggacaccat gtag 7284

<210> 23

<211> 4768

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 5' WL1校正

<400> 23

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta ttggccgtcc 180

gccctcggca ccatcctcac gacacccaaa tatggcgacg ggtgaggaat ggtggggagt 240

tatttttaga gcggtgagga aggtgggcag gcagcaggtg ttggcgctct aaaaataact 300

cccgggagtt atttttagag cggaggaatg gtggacaccc aaatatggcg acggttcctc 360

acccgtcgcc atatttgggt gtccgccctc ggccggggcc gcattcctgg gggccgggcg 420

gtgctcccgc ccgcctcgat aaaaggctcc ggggccggcg gcggcccacg agctacccgg 480

aggagcggga ggcgccaagc tctagagtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag 540

accaatagaa actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta 600

ttggtcttac tgacatccac tttgcctttc tctccacagg ccaccatgct gtggtgggag 660

gaggtggagg actgctatga gagagaggat gtgcagaaga agaccttcac caagtgggtg 720

aatgcccagt tcagcaagtt tggcaagcag cacattgaga acctgttctc tgacctgcag 780

gatggcagga ggctgctgga cctgctggag ggcctaacag gccagaagct gcccaaggag 840

aagggcagta ccagggtgca tgccctgaac aatgtgaaca aggccctgag ggtgctgcag 900

aacaacaatg tggacctagt gaatattggc agtacagata ttgtggatgg caaccacaag 960

ctgaccctgg gcctgatctg gaatattatc ctacactggc aggtgaagaa tgtgatgaag 1020

aatattatgg ctggcctgca gcagaccaac tctgagaaga tcctgctgag ctgggtgagg 1080

cagagtacca ggaactaccc ccaggtgaat gtgatcaact tcaccaccag ctggtctgat 1140

ggcctggccc tgaatgccct aatccacagc cacaggcctg acctgtttga ctggaactct 1200

gtggtgtgcc agcagtctgc cacccagagg ctagagcatg ccttcaatat tgccaggtac 1260

cagctgggga ttgagaagct gctggaccct gaggatgtgg atacaaccta ccctgacaag 1320

aagagcatcc tgatgtacat caccagcctg ttccaggtgc tgccccagca ggtgagcatt 1380

gaggccatcc aggaggtgga gatgctaccc aggcccccca aggtgaccaa ggaggagcac 1440

ttccagctac accaccagat gcactacagc cagcagatca cagtgagcct ggcccagggc 1500

tatgagagga ccagcagccc caagcccagg ttcaagagct atgcctacac ccaggctgcc 1560

tatgtgacca cctcagaccc caccaggagc cccttcccca gccagcacct ggaggcccct 1620

gaggacaaga gctttggcag cagcctgatg gagtctgagg tgaacctgga caggtaccag 1680

acagccctgg aggaggtgct gagctggctg ctgtctgctg aggataccct acaggcccag 1740

ggagagatca gcaatgatgt ggaggtggtg aaggaccagt tccataccca tgagggctac 1800

atgatggacc taacagccca ccagggcagg gtgggcaaca tcctgcagct gggcagcaag 1860

ctgattggca caggcaagct gtctgaggat gaggagacag aggtgcagga gcagatgaac 1920

ctgctgaaca gcaggtggga gtgcctgagg gtggccagta tggagaagca gagcaaccta 1980

cacagggtgc tgatggacct gcagaaccag aagctgaagg agctgaatga ctggctgacc 2040

aagacagagg agaggaccag gaagatggag gaggagcccc tgggccctga cctggaggac 2100

ctaaagaggc aggtgcagca gcacaaggtg ctgcaggagg acctggagca ggagcaggtg 2160

agggtgaaca gcctaaccca tatggtggtg gtggtggatg agagctcagg agaccatgct 2220

acagctgccc tggaggagca gctgaaggtg ctgggagaca ggtgggctaa tatctgcagg 2280

tggacagagg acaggtgggt gctgctgcag gatatcctgc tgaagtggca gaggctgaca 2340

gaggagcagt gcctgttctc tgcctggctg tcagagaagg aggatgctgt gaacaagatc 2400

catacaacag gcttcaagga ccagaatgag atgctgagca gcctgcagaa gctggctgtg 2460

ctgaaggctg acctggagaa gaagaagcag agtatgggca agctgtacag cctgaagcag 2520

gacctgctga gtaccctgaa gaacaagtct gtgacccaga agacagaggc ctggctggac 2580

aactttgcca ggtgctggga taacctggtg cagaagctgg agaagagtac agcccagatc 2640

agccaggctg tgacaacaac ccagcccagc ctgacccaga caacagtgat ggagacagtg 2700

acaacagtga caaccaggga gcagatccta gtgaagcatg cccaggagga gctgcccccc 2760

cccccccccc agaagaagag gcagattaca gtggatggcc tggagaagac agtgagcctc 2820

cagaaggacc tgtcagagat gcatgagtgg atgacccagg ctgaggagga gtacctggag 2880

agggacttcg agtacaagac ccctgatgag ctgcagaagg ctgtggagga gatgaagagg 2940

gccaaggagg aggcccagca gaaggaggcc aaggtgaagc tgctgacaga gtctgtgaac 3000

tctgtgattg cccaggcccc ccctgtggcc caggaggccc tgaagaagga gctggagacc 3060

ctgacaacca actaccagtg gctgtgcacc aggctgaatg gcaagtgcaa gaccctagag 3120

gaggtgtggg cctgctggca tgagctgctg agctacctgg agaaggccaa caagtggctg 3180

aatgaggtgg agttcaagct gaagaccaca gagaacatcc ctggaggagc tgaggagatc 3240

tctgaggtgc tggacagcct ggagaaccta atgaggcact ctgaggacaa ccccaaccag 3300

atcaggatcc tggcccagac cctgacagat ggaggagtga tggatgagct gatcaatgag 3360

gagctggaga ccttcaacag caggtggagg gagctacatg aggaggctgt gaggaggcag 3420

aagctgctag agcagatcca tacagtgagg gaggagacaa tgatggtgat gacagaggat 3480

atgcccctgg agatcagcta tgtgcccagc acctacctaa cagagatcac ccatgtgagc 3540

caggccctgc tggaggtgga gcagctgctg aatgcccctg acctgtgtgc caaggacttt 3600

gaggacctgt tcaagcagga ggagagcctg aagaacatca aggacagcct gcagcagagc 3660

tcaggcagga ttgatattat ccacagcaag aagacagctg ccctgcagtc tgctacccct 3720

gtggagaggg tgaagctgca ggaggccctg agccagctgg acttccagtg ggagaaggtt 3780

aacaagatgt acaaggacag gcagggcagg tttgacaggt cagtggagaa gtggaggagg 3840

ttccactatg acatcaagat cttcaaccag tggctgacag aggctgagca gttcctaagg 3900

aagacccaga tccctgagaa ctgggagcat gccaagtaca agtggtacct taaggagctg 3960

caggatggca ttggccagag gcagacagtg gtgaggaccc tgaatgctac aggggaggag 4020

attatccagc agagcagcaa gacagatgcc agtatcctgc aggagaagct gggcagcctg 4080

aacctgaggt ggcaggaggt gtgcaagcag ctgtctgaca ggaagaagag gctggaggag 4140

cagcctgacc tggcccctgg cctgacaaca attggagcca gccctaccca gacagtgacc 4200

ctggtgaccc agcctgtggt gaccaaggag acagctatca gcaagctgga gatgcccagc 4260

agcctgatgc tggaggtgcc tgccctggct gacttcaaca gggcctggac agagctgaca 4320

gactggctga gcctgctgga ccaggtgatc aagagccaga gggtgatggt gggggacctg 4380

gaggatatca atgagatgat tatcaagcag aaggctacaa tgcaggacct ggagcagagg 4440

aggccccagc tggaggagct gattacagct gcccagaacc taaagaacaa gaccagcaac 4500

caggaggcca ggacaattat tacagacagg attgagagga tccagaacca gtgggatgag 4560

gtgcaggagc acctgcagtt tacgcgtttt gcggccgctt tacgtagata agtagcatgg 4620

cgggttaatc attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg 4680

cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg 4740

ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgc 4768

Claims

1.一种拟抗肌萎缩蛋白(QD)，其特征在于，在其N-端部分具有CH1CH2H1R1R2R3H2R8R9的结构，优选地进一步包括R16和R17杆状区。

2.如权利要求1所述的拟抗肌萎缩蛋白，其缺少R4、R5、R6、R7杆状区(ΔR4-R7)、缺少R10、R11、R12、R13、R14、R15杆状区(ΔR10-R15)、以及缺少R18和R19杆状区(ΔR18-R19)。

3.如权利要求2所述的拟抗肌萎缩蛋白，其具有如SEQ ID NO:2所示的序列，或与之具有90％相似性的序列，优选SEQ ID NO:20所示的序列。

4.如权利要求1所述的拟抗肌萎缩蛋白，其缺少R4、R5、R6、R7杆状区(ΔR4-R7)、缺少R10、R11、R12、R13杆状区(ΔR10-R13)、以及缺少R18、R19、R20和R21杆状区(ΔR18-R21)。

5.如权利要求4所述的拟抗肌萎缩蛋白，其具有如SEQ ID NO:3所示的序列，或与之具有90％相似性的序列。

6.一种核酸序列，其编码权利要求1-5中任一项所述的拟抗肌萎缩蛋白。

7.如权利要求6所述的核酸序列，其包含或由SEQ ID NO:4所示序列组成，或包含或由与之具有70％相似性的序列，优选SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:22所示的序列组成。

8.一种包含两个AAV载体的双AAV载体系统，其特征在于，

-第一AAV载体包含在5’和3’AAV ITR之间的第一核酸序列，该序列编码拟抗肌萎缩蛋白的N端部分，

-第二AAV载体包含在5’和3’AAV ITR之间的第二核酸序列，该序列编码拟抗肌萎缩蛋白的C端部分，

所述第一和第二核酸序列包含重叠区，所述重叠区能够通过重组生产如权利要求1-5中任一项所述的拟抗肌萎缩蛋白。

9.如权利要求8所述的双AAV载体系统，其特征在于，所述第一核酸序列具有序列SEQID NO:6或SEQ ID NO:23，且所述第二核酸序列具有序列SEQ ID NO:7。

10.如权利要求8所述的双AAV载体系统，其特征在于，所述第一核酸序列具有序列SEQID NO:8，且所述第二核酸序列具有序列SEQ ID NO:9。

11.一种细胞，其特征在于，所述细胞经过如权利要求8-10中任一项所述的双AAV载体转导，优选为肌细胞。

12.一种组合物，其在药学上可接受的载体中包含有如权利要求8-10中任一项所述的双AAV载体或如权利要求11所述的细胞。

13.如权利要求8-10中任一项所述双AAV载体、如权利要求11所述的细胞或如权利要求12所述的组合物，用于制备药物。

14.如权利要求8-10中任一项所述双AAV载体、如权利要求11所述的细胞或如权利要求12所述的组合物，用于治疗肌营养不良症的疗法，特别是杜氏肌营养不良症(DMD)。

15.一种AAV载体，其特征在于，所述AAV载体是如权利要求8-10所述的双AAV载体系统中的第一AAV载体或第二AAV载体。