JP2008506394A - 網膜ジストロフィントランスジーン及びそれらの使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、DMDに対して適切なヒトモデルとして二重変異体マウス(DM)を利用する。これらのマウスは、ジストロフィン及びユートロフィン(mdxl+,utrn -/-)の両方を欠損し、3ヵ月で死亡し、重い筋肉衰弱、顕著な成長遅延、脊柱後彎、減量、緩い姿勢(slack posture)及び不動性状態を患うからである。新規なヒト網膜ジストロフィンDp260のトランスジーンからの発現は、早死を防ぎ、重篤な筋ジストロフィーを緩い臨床的筋疾患に弱めることを明らかにした。筋電図、組織学、ラジオグラフィー、磁気共鳴イメージング、及び行動研究は、DMトランスジェニックマウスが、正常に成育し、正常な背骨の彎曲及び運動性を持ち、筋疾患を弱めたと結論した。トランスジェニックDMマウスによるEMG及び組織学的なデータは、異常性を緩やかな筋疾患に典型的なレベルまで弱めることを明らかにしたが、一方、DMマウスは、ヒトジストロフィン異常症に共通して見られる著しい異常性が見られた。また、トランスジェニックDMマウスは、何も処理をしていないmdxマウス及びコントロールと同等の測定可能な運動レベルも有した。
【選択図】なし
Description
本願は、次の出願の優先権主張をする。シリアルナンバー:60/588,700;出願:2004年6月16日;シリアルナンバー60/608,252;出願:2004年9月9日;及びシリアルナンバー60/613,026;出願:2004年9月24日,これらの教示及び内容は、参照により、ここに含まれる。
デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)は、よくある男児の神経筋疾患である。
これは、進行性の筋変性を特徴とする劣性X連鎖型疾患であり、20代において重い障害及び20代半ば早期に心不全または呼吸不全を引き起こす。
現在、延命または前記疾患の臨床経過を大きく変えるような治療方法はない。標準的な治療は、主に、患者の一般的な健康や彼らの生活の質を改善することに集中する。
グルココルチコイド(例えば、プレドニゾロン)は、複数の研究において、筋力低下を緩和するための結果が認められたが、それらの効果はかなり短く(18−36ヶ月)、前記疾患の臨床経過を変えない。
2つの後者のドメインは、DAP(ジストロフィン関連タンパク質)複合体のタンパク質とシントロフィンに結合している。
ジストロフィン遺伝子の79のエクソンの選択的スプライシングは、71kDaから全長427kDaの範囲である、いくつかのジストロフィン アイソホームを生産する。
少なくとも7つの独立したプロモーターが、細胞特異的な方法で発現される7つの異なるジストロフィン アイソホームの転写を制御する。
成熟mdxマウスの肢筋は、重い衰弱またはヒトDMDに見られる重い進行性の変性が見られない。
mdxマウスの横隔膜には、ヒトDMD筋に相当する変性や繊維化が見られるが、マウスは、呼吸器障害を患うこともなく、それらは通常の寿命を持つ。
ユートロフィンの最大のアップレギュレーションで筋肉は、最小の病理上の変化を示す。
しかしながら、この補充となる代替は、ヒトでは起こらず、これが、mdxマウスとヒトDMD間における表現型の違いとおそらく説明されるだろう。
さらに、当技術で必要とされるものとしては、ジストロフィンまたはそれらのホモローグを発現する遺伝子である。
また、さらに、当技術で必要とされるものとしては、ジストロフィンを発現する遺伝子、またはそれらのホモローグを含むベクターであり、そのベクターはジストロフィン遺伝子、またはそれらのホモローグのような動物ゲノムをトランスフェクトでき、それは発現され、それによって、筋ジストロフィンの欠損を補充する。
さらに必要とされるのは、ジストロフィンまたはそれらのホモローグを発現するDNAをトランスフェクトされた細胞を利用するDMDの治療方法である。
また、さらに必要とされるのは、ジストロフィンまたはそれらのホモローグを発現する遺伝子によって発現された単離タンパク質を利用してDMDを治療する方法がある。
最終的に、必要とされるのは、冒された動物のゲノムへトランスフェクトされ、ジストロフィン、またはそれらのホモローグを発現し、筋ジストロフィンの欠損を補充する、ベクターを利用してDMDを治療する方法である。
本発明は、先行技術固有の諸問題を解決し、当技術において、明確な進歩を提供する。大まかに言うと、本発明のひとつの態様としては、ヒト網膜ジストロフィンのアイソホーム,Dp260と称される,及び適切な制御エレメントを含む単離されたトランスジーンを含む。
本発明のもうひとつの態様として、このDp260トランスジーンを動物のゲノムへ挿入するためのベクターに組込みまたは挿入し、それによって網膜ジストロフィンタンパク質を発現させる方法が提供される。
好ましくは、動物は、哺乳類からなる群から選択され、より好ましくは、ヒト、マウス、イヌ及びウマからなる群から選択され、特に好ましくは、動物は、ヒトである。
本発明に関する態様としては、Dp260トランスジーンを含む動物が供給される。本発明のもうひとつの態様としては、Dp260トランスジーンは、動物の筋ジストロフィーのための遺伝子治療に使用するために、骨髄細胞及び筋原細胞を形質転換するために使用することができる。
好ましい動物は、哺乳類である。より好ましくは、動物は、マウス、イヌ、ウマ、及びヒトからなる群から選択される。
本発明のもうひとつの態様としては、Dp260トランスジーンは、他の適切なベクター中で使用されたり、または、他の適切なトランスフェクション方法で,例えば、リポフェクションのような,筋ジストロフィーのための遺伝子治療の他の方法,に使用される。
本発明のもうひとつの態様としては、Dp260により発現されるタンパク質は、それを必要とする動物へ投与される。
ヒト網膜ジストロフィンは、ジストロフィンに見られるシスティンに富むドメイン、C末端ドメイン、及び多くのロッド類似ドメインを含むが、ジストロフィンのN末端アクチン結合ドメインを欠いている。
加えて、第二アクチン結合ドメインは、ヒトDp260のスペクトリンリピートに位置している。ヒトDp260は、通常、網膜で発現され、アクチンと他のジストロフィン関連タンパク質とともに局在している。それはまた、多くのジストロフィン機能を共有している。
本実施形態において、トランスジーンは、ヒト網膜ジストロフィン及び適切な制御エレメントから構築される。
適切なヒトDp260配列は、ATCCクローン57670、57672、57674、及び57676から由来されるものでもよく、当業者であればよく知られている技術を使用して、直接的にプラスミド中へクローンすることができる。
本発明の目的において、トランスジーンに使用される好ましいDNA配列は、ヒトDp260と同じ機能を持つべきであり、より好ましくは、トランスジーンのDp260部分のDNA配列が少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは、少なくとも90%、さらにより好ましくは、少なくとも95%、さらにより好ましくは、少なくとも97%、及び特に好ましくは、99−100%、ヒトDp260と同一配列を持つ。
本発明のトランスジーン配列は、また、ジストロフィンの選択的スプライシングの結果からなるアイソホームでもあってもよい。
本発明の目的のために利用されるジストロフィンのそのような選択的スプライシングされた形態(spliced form)のひとつは、ジストロフィンエクソン71を含む。
好ましい形態は、最終的に得られたトランスジーンもまた、トランスジーンの発現を容易にするために、Dp260配列の上流にプロモーター及びエンハンサ配列を含む。
好ましい制御エレメントは、マウス筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター及びエンハンサ,及び制御エレメントとしてマウスMCKエクソン1及び2を含む。
トランスジーンの発現は、トランスジーンを細胞系統へ安定にトランスフェクションし、その後、そのタンパク質産物の配列分析によりテストされる。
スプライシングのエラーは、正しいスプライス部位のエクソン受容体の刻み目(score)を改良するために、公知部位定方向突然変異誘発によって、修復される。
その他の好ましい形態としては、トランスジーンは、その結果である転写の適切な安定性を確実にするために追加的な制御部位を含む。
そのような制御部位のひとつは、適切なポリアデニル化を確実にするために、ウシ成長ホルモン(BGH)ポリAシグナル配列を構造体の3’末端に付加する。
そのようなベクターとして、好ましくは、ジストロフィンの機能と同様の機能を持つタンパク質を発現するDNA配列を含む。
好ましくは、そのようなベクターに使われるDNA配列としては、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、特により好ましくは、少なくとも97%、最も好ましくは、99〜100%、ヒトDp260と同一性がある。
より好ましい形態としては、前記ベクターもまた、ヒトジストロフィンエクソン71を含むヒトDp260の形態を含む。
より好ましい形態としては、前記ベクターもまた、先述したような、プロモーター、エンハンサ、及びポリAシグナル部位のような制御エレメントを含む。
本ベクターは、種々の市販のプラスミド、アデノウィルス、またはレンチウィルスであってもよい。
好ましい形態としては、トランスフェクションのために使用されるDp260は、ジストロフィンと同様の機能を持つタンパク質を発現し、好ましくは、Dp260はヒトDp260である。
そのような動物のゲノムは、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも95%、特により好ましくは少なくとも97%、最も好ましくは99〜100%、ヒトDp260と配列相同性があるDNA配列のコピーを少なくとも1つ含むことが望ましい。
ある形態としては、動物は、それらのゲノムに配置される、ジストロフィンエクソン71を含むDp260の配列のコピーを少なくとも1つ含む。
好ましくは、動物は、哺乳類、及びより好ましくは、動物は、ヒト、マウス、ウマ、及びイヌからなる群から選択される。
トランスジーンをそれらのゲノムへ組み込まれた動物は、シークエンシング及びPCR反応を含む適当な公知の方法によって識別される。
好ましくは、これらの動物は、それらの筋細胞でDp260を発現し、その特性は、PCR及びウェスタンブロッティングのような公知の技術を使用してテストされることができる。
そのような実施形態で恩恵を受ける動物としては、ヒト、マウス、イヌ、及びウマが含まれる。
この実施態様のある例としては、好ましいヒトDp260トランスジーンは、Dp260トランスジーンをDMマウス卵母細胞へ挿入することにより二重変異体(DM)マウスのゲノムへ挿入され、続いて、mdxとユートロフィンノックアウトマウスとの一連の交雑を行った。
当然、マウスもまた、裸DNAのエレクトロポレーションだけでなく、アデノウィルスまたはレンチウィルスのような他のベクターの使用を含む、いずれかの公知の方法によりトランスフェクトされうる。
トランスフェクトされていないDMマウスは、ヒトの筋ジストロフィーに似た身体的症状が現れ、ジストロフィンだけでなく、そのマウスの類似体、ユートロフィンも生産されなかった。
その上、DMマウスは、短い生存率をもち、それらの筋肉の高いレベルのネクローシスをもつ致命的な表現型が見られ、それらの年齢に応じて、複合反復放電(CRDs)発生率の増加、筋ジストロフィーの特徴を示した。
対照的に、Dp260トランスジーンを発現するDMマウス(DM/Tg+)は、緩やかなミオパシーのみの症状が表れ、通常の生存率をもつ。
その上、DM/Tg+マウスは、DMマウスに見られる致命的な背骨の彎曲(脊柱後彎)または肢筋の衰弱が見られなかった。
それらはまた、それらの年齢に応じて、ネクローシスのレベルがより低く、またCRDの発生もより低くあらわれる。
DMマウス及びDMDを患うヒト固体間の類似性によると、DMマウスは、その疾患の理想的なモデルのようである。
これは、選択的マーカー(例えば、ネオマイシン抵抗性)を含むレンチウィルスベクターの使用により実行される。
好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、筋原細胞がよい。そのような細胞は、筋細胞へ分化するからである。
より好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、骨髄細胞がよく、さらに好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、SP骨髄細胞(side population bone marrow cell)さらに好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、Lin−,Sca+及びKit+細胞表面マーカーをもつSP細胞(side population cell)である。
これらのトランスフェクト細胞は、螢光励起細胞分離捕集装置(FACS)のようなよく知られている方法により確認可能である。
それらは、さらに、ヘキスト染色を除去するそれらの能力によって定義される。
さらに、これらのトランスフェクト細胞は、筋細胞への分化が増加する可能性をみせる。
これらの細胞を形質転換するための方法は、プラスミド、アデノウィルス、レンチウィルスのようなベクターの使用、及び好ましくは、裸DNAのエレクトロポレーションの使用が含まれる。
Dp260の安定な発現は、PCR及びウェスタンブロッティング試験の利用により検出される。
好ましくは、動物は、哺乳類であり、またさらに好ましくは、ヒト、マウス、イヌ及びウマからなる群から選択される。
そのような治療の終着点は、筋ジストロフィー症状の緩和である。
本実施形態のある好ましい形態としては、細胞は、患者から取り出され、またトランスジーンを安定にトランスフェクトされる。前記トランスジーンは、好ましくは、少なくとも80%、より好ましくは、少なくとも85%、さらにより好ましくは、少なくとも90%、よりさらに好ましくは、少なくとも95%、特により好ましくは、少なくとも97%、最も好ましくは99〜100%、ヒトDp260配列同一性のあるDNA配列を含む。
この方法のさらに好ましい形態としては、そのような細胞は、ヒトジストロフィンエクソン71を含むDp260の形態を含むDNA配列がトランスフェクトされる。
本発明の好ましいトランスジーンは、また、Dp260の安定な発現のために適切な制御エレメントを含んでもよい。
好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、筋原細胞または骨髄細胞である。
さらにより好ましくは、これらの細胞は、先述したような、SP骨髄細胞であり、先述したような細胞表面マーカーを伴い、そのような細胞は、特に筋細胞へ分化する可能性のある細胞である。
より好ましくは、これらの細胞は、患者受取治療(patient receiving therapy)から取得され、体外でDp260トランスジーンがトランスフェクトされ、自家移植で同じ患者へ返還される。
そのような自家移植は、トランスフェクトされる細胞が患者自身のものであるため、免疫応答が発生する可能性を減らし、さらに、免疫抑制剤の必要性をなくす。
トランスフェクトされる細胞の自家骨髄移植は、疾患の工程中の様々なポイントに間に合って使用されうる。
骨髄細胞は、より損傷した細胞により強くひきつけられる。従って、この工程を長い間、筋ジストロフィーを患っている年齢が高い患者に適切である。
また、この工程は、患者の生存中、何回か行うことができる。そのような自家骨髄移植の効果は、付加的であり、それによって、健康、機能的な筋肉の重量が増加するからである。
一般的に、遺伝子治療の何れの型でも障害となるのは、トランスジーン産物の免疫遺伝性である。
全長のジストロフィンは、トランスジーン(1)の発現を欠失した結果を来すことができる免疫遺伝応答を誘導することができる。
Dp260トランスジーンの特異的な性質は、ヒトジストロフィンの自動的に生じるアイソホームを発現する。
Dp260タンパク質は、網膜で主に発現し、その他組織で少量発現する。
従って、網膜ジストロフィンは、自動的なアイソホーム(natural isoform)である。
トランスジーンによるDp260の挿入は、Dp260の発現に影響を及ぼさないエクソン30の上流の欠失をもつ患者に特に免疫遺伝性の応答を誘導しない。
これは、全ジストロフィントランスジーン並びに大部分のスペクトリンドメインコード領域が取り去るまたは取り除かれたマイクロジストロフィントランスジーンよりも明らかに優位にある。
マイクロジストロフィンもまた、そのタンパク質が新生抗原(マイクロジストロフィンタンパク質は、ディシェンヌ型筋ジストロフィーによる患者とは無関係である配列を含む)と考えられるので、免疫性の応答を強力に誘導するであろう。
本発明のDp260トランスジーンは、正常な遺伝子治療のためのこの重要な障害を克服する。
配列同一性は、そのような配列間の一致によって決定されるように、配列類似性の最高度を示すように、配列が最適に整列させられた後、与えられた配列と参照配列を比較することによって決定される。
そのような整列において、配列同一性は、位置対位置を基礎として確かめられ、例えば、配列は、特定の位置で、もしその位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば“同一”である。
このような位置同一性の合計数は、その後、参照配列の全ヌクレオチドまたはアミノ酸で配分され、%配列同一性として与えられる。
上記公知の方法とは、コンピューテーショナル モレキュラー バイオロジー(Computational Molecular Biology),Lesk,A.N.,オックスフォード ユニバーシティー プレス(Oxford University Press),ニューヨーク(1988),バイオコンピューティング:インフォマティクス アンド ゲノム プロジェクト(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),Smith,D.W.編,アカデミック プレス(Academic Press),ニューヨーク(1993);コンピューター アナライシス オブ シーケンス データ,パートI(Computer Analysis of Sequence Data,Part I)Griffin,A.M.,及びGriffin,H.G編,ヒューマーナ プレス(Humana Press),ニュージャージー(1994);シーケンス アナライシス イン モレキュラー バイオロジー(Sequence Analysis in Molecular Biology),von Heinge G.,アカデミック プレス(Academic Press)(1987);シーケンス アナライシス プライマー(Sequence Analysis Primer),Gribskov,M.及びDevereux.J.編,M ストクックトン プレス(M.Stockton Press),ニューヨーク(1991);及びCarillo,H.,及びLipman,D.,SIAM J.アプライド マス(Applied Mass).,48:1073(1988),に記載されている内容を含むが、これに限定されない。
配列同一性を決定する方法は、与えられた配列間で配列同一性を決定するために公共で利用されているコンピュータープログラムにまとめられている。
そのようなプログラムを含む例としては、GCGプログラムパッケージ(the GCG program package)(Devereux,J等.,ヌクレイック エシドズ リサーチ,12(1):387(1984)),BLASTP,BLASTN及びFASTA(Altschul,S.F等,J.Molec.Biol.,215:403−410(1990).BLASTXプログラムは、公共に利用されているNCBI及びその他のソース(BLASTマニュアル,Altschul,S等.,NCVINLM NIH Bethesda,MD20894,Altschul,S.F等., J.Molec.Bio.,215:403−410(1990),ここで参照された内容は、本願明細書にすべて含まれる))が含まれるが、これらに限定されない。
これらのプログラムは、与えられた配列及び参照配列間で高度の配列同一性を出すために、デフォルトギャップウェイト(default gap weight)を使って、最適に位置あわせをする。
説明すれば、参照配列に対して、少なくとも、例えば、95%“配列同一性”を有するヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドとは、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドに対して、5つまでの変異を含むであろう、与えられたポリヌクレオチド配列を除いた参照配列と同一であることを意味する。
別の言葉で言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも95%同一性を持つヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド中には、参照配列中の合計ヌクレオチドの5%までのヌクレオチドが、欠失または他のヌクレオチドに置換され、または参照配列中の5%までのヌクレオチド数が参照配列中に組み込まれている。
参照配列のこれら変異は、参照ヌクレオチド配列の5’または3’末端部位またはそれらの末端部位間の何れかでおこり、参照配列中に個別か、または参照配列内の一つまたはそれ以上の連続群としてヌクレオチド間に散在する。
同様に、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、95%配列同一性をもつ与えられたアミノ酸配列をもつポリペプチドとは、ポリペプチドの与えられたアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の各100アミノ酸に対して、5アミノ酸までの変異を含む、与えられたポリペプチド配列以外は、参照配列と同一であることを意味する。
言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも95%配列同一性を有するポリペプチド配列を得るために、参照配列中の5%までのアミノ酸残基を欠失、または他アミノ酸に置換、または参照配列中のアミノ酸残基の合計の5%以上のアミノ酸数を参照配列へ組み込めばよい。
参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ基末端部位またはカルボキシル基末端部位、またはこれら末端間のいずれかでおこり、参照配列中の残基間で、個別か、参照配列内の一つかまたはそれ以上の連続群に散在している。
好ましくは、同一でない残基部位は、保存アミノ酸置換によって異なっている。
しかしながら、保存置換は、配列同一性を決定する時、一致するものとして含まれない。
個別のタンパク質をコードするDNAは、コードの縮重により、ヌクレオチド配列は異なるが、また、同じタンパク質を発現またはコードする。
そのようなわずかなDNAコードの改変は、当業者によりよく知られていて、本発明に含まれる。
ここで使われるような“形質転換”は、外来DNAまたはRNAの細胞内への取り込み、例えば、形質転換された細胞が、ジストロフィンタンパク質の組換え形態を発現する、または、伝達された遺伝子からのアンチセンス発現の場合、ジストロフィンタンパク質の自然発生形態が阻害される、結果、細胞の遺伝子型が、変化するプロセスを指す。
トランスジーンは、一つまたはそれ以上の制御配列及び、選択された核酸の最適な発現のために必要であるイントロンのようないくつかの核酸を含む。
好ましいベクターは、それらが結合されるために、自立的増殖および/連結された核酸の発現ができるものである。
本明細書中における“トランスジェニック”は、古典的な交配または体外受精を含まず、どちらかといえば、一つまたはそれ以上の細胞が、組換えDNA分子を収納した動物をさす。
この分子が動物の染色体中に統合されることが、極めて好ましいものの、本発明は、酵母人工染色体の中に設計されるような、染色体外の複製するDNA配列の使用も含んでいる。
好ましくは、本発明のトランスジェニック動物は、遺伝情報が取り込まれ、さらには生殖細胞に組み込まれ、その結果として、子孫に情報を伝えることができる能力を与えるトランスジェニック動物を示す“生殖細胞系列トランスジェニック動物”を含む。
そのような子孫が、実際に、その情報の一部あるいは全部を持っているのであれば、その情報の一部あるいは全部を持っているとすれば、その時には、それらもまたトランスジェニック動物である。
この用語は、ヌクレオチドアナログ由来のRNAまたはDNAを等価物として、また、1本鎖(センスまたはアンチセンス)及び2本鎖ポリヌクレオチドで記載されている実施態様にも適用できることとして、含むと理解されるべきである。
“安定したトランスフェクタント”という用語は、外来DNAをゲノムDNAへ安定に組み込んだ細胞をさす。
ヒトDp260トランスジーン構造体の準備及び分析
マウス筋クレアチンキナーゼ(MCK)プロモーター及びエンハンサ(配列番号1)が、MCKエクソン1(配列番号2)、イントロン1(配列番号3)、及びエクソン2の5’非翻訳部位を含むエクソン2(配列番号4)の一部に加えて、最終トランスジーンを作製するのに使用された。
MCKの制御エレメントは、最初のエクソン及びはじめのイントロン(配列番号5)の一部とともに、pBluescript II SKベクター(ストラータジーン,ラホーヤ,CA)へ直接クローンされた。
MCKのATG 開始コドンまでの、MCKイントロン1の残りの部分及びエクソン2からなる、1番目のPCRアンプリコン(配列番号6)は、NdeI制限サイトを作るために、PCRによって増幅された。
これによって、ヒトのゲノム PCRアンプリコンのNdeI制限サイトへのライゲーションが可能になった。
2番目のPCRアンプリコン(配列番号7)は、MCK開始コドンが通常位置するまさにその場所に位置する、網膜ジストロフィンに特異な最初のエクソンR1のATG開始コドンから始まり、イントロンR1に続き、そしてエクソン30で終了した。
2番目のPCRアンプリコン(配列番号7)は、また、組み込まれたFspIサイトを含んだ。
3番目のPCR産物は、ヒト ジストロフィン cDNA クローン cDND4−5a(ATCC番号 57670)を使って増幅された。
この産物は、その5’末端でFspI制限サイトを含み、その3’末端で自動的に生じるAatII部位を含むように設計され、構造体に添加された。
ヒトジストロフィンをコードする配列の残りの部分は、3つのヒトジストロフィンcDNAクローン,cDMD 5b−7,8,及び9−14(ATCC番号 57672,57674,及び57676),自動的に生じる制限サイトを利用して構造体にライゲートすることにより作製された。
ウシ成長ホルモン(BGH)ポリAシグナル配列(配列番号8)(インビトロゲン,カールズバッド,CA)は、転写産物の適度な安定性及びポリアデニル化を保証するために、構造体の3’末端が添加された。
このシグナル配列は、Invitrogen.comウェブサイトから、PCDNA3.1Hygroプラスミドプライマーを利用したPCR産物から作製された。
このプライマー配列は、個々に、配列番号21及び22として、この明細書中に含まれる。
配列番号21は、BGH−Af1の中にAf1III制限サイトを含み、下流プライマーである。配列番号22は、BGH−Notの中にNotI制限サイトを含み、上流プライマーである。
この結果、作製に使用された全制限サイトとともに示される、図1(配列番号9)に示す構造体が得られた。
野生型アミノ酸配列を保有する2つのサイレント変異が発見された。他の2つの変異が配列中に発見されたが、それらは製造元のプロトコール(クイックチェンジ 部位特異的突然変異キット、ストラータジーン)に従って、部位特異的突然変異により野生型配列へ復帰させられた。
塩基配列決定は、また、その構造体がエクソン71(配列番号11)を欠くことも明らかにした。
これは、ヒト及びマウス遺伝子の正常なスプライスバリアントによるものであり、シントロフィン結合部位は、このエクソンの下流である。
ヒトDp260トランスジーン転写の発現及びタンパク質産物は、MM14筋原細胞系統(ハウシュカ,ワシントン大学)、つまり分化した筋細胞由来の系統において、Jaynesらのモレキュラー セル バイオロジー(Mol Cell.Biol)6:2855-2865(1986)に記載の方法に従った、安定したトランスフェクションにより試験された。
なお、上記文献に記載された技術及び内容は、ここに引用され、本発明に含まれる。
情報量分析により、MCKエクソン2受容体サイトのかなり弱い6.2ビットスコアと比較して、12.1ビットの強いエクソン30受容体サイトのスコアが示された。
MCKイントロン1の3’領域の3つのヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発(クイック チェンジ 部位特異的突然変異誘発キット、ストラータジーン)によって変換され、エクソン2受容体のビットスコアを12.4ビットに増加し、より強いスプライス受容サイトにした。
続いて行ったトランスフェクション実験により、RNA産物の正しいスプライシングが確認された。
変異したヌクレオチドは、配列番号5の6363,6364及び6368の位置(図10のアスターリスクでマークされた)に発見され、全て“g”から“t”へ突然変異されていた。
発現したタンパク質(配列番号13)は、トランスフェクトされた筋原細胞から調整されたタンパク質試料のウェスタンブロットを使って分析された。
ウェスタンブロットは、Dp427(図2a)と比較すると、トランスフェクトされた細胞のDp260の強い発現を示した。
インサートのないMCKプラスミドを使ったコントロールトランスフェクションは、Dp260を発現しなかったが、Dp427筋ジストロフィンの発現を示した。
DMヒトDp260トランスジェニックマウスの生産
ヒトDp260トランスジーン構造体は、エンドー フリー プラスミドキット(キアゲン、バレンシア、CA)を用いて抽出され、卵母細胞注入に先立って、NotIによる制限消化よって、プラスミドベクターからリリースされた。
構造体は、200個の卵へ注入され、それを擬似妊娠した雌に移植し、出産し、離乳した。
Dp260トランスジーンに対する遺伝子型判別は、ヒトDp260トランスジーンを組み込んだ2匹のマウスを識別した。
遺伝子型判別は、MCK特異的フォーワードプライマー(配列番号14)およびジストロフィン ヒト エクソン30特異的リバースプライマー(配列番号15)を使ったPCR反応により実行され、これにより、400bp未満のトランスジーン特異的産物(配列番号16)が増幅された。
両系統のマウスはトランスジーンの強い発現を示し、ゲノムへの挿入位置、及びマウスゲノムに挿入されたトランスジーンのコピー数によって相違しているのだろう。
トランスジェニックマウスは、このように、Tg+動物として以下に記載されているTgN(DMD260)1 Raw トランスジーンをもつことによって識別される。
312塩基対のアンプリコン遺伝子(配列番号17)は、挿入されたneo遺伝子(配列番号18)及びユートロフィン遺伝子のエクソン64の3’末端の塩基配列(配列番号19)から開発されたプライマーを使い、作製された。
野生型アレルは、追加のフォーワードプライマー(配列番号20)をutrnノックアウトマウスでは欠損している5’末端に、使用することで識別された。
utrnノックアウト及びTg+マウスに対するコンジェニックC57BL/6J系統は、C57BL/6Jマウスを10世代と戻し交配することにより作製された。
mdx変異を持っているマウスは、以前、Amalfitano & Chamberlain in Muscle & Nerve 19 ; 1549-1553 (1996)に記載されたARMS PCRアッセイを利用して識別された。
最初にmdx雌をutrn-/-雄と交配することによって、引き続いてDp260 Tg+雄に交配される雌が生産された。
これで、ヒトDp260トランスジーンを有するまたは有さないDM雄(XmdxY,utrn-/-)を生産するための、同型接合の utrn-/-雄に交配される雌キャリア(Xmdx,X+,utrn-/-,Tg+)を産生した。
これらの交配は、48匹のDMマウスと48匹のDM/Tg+マウスの結果を生じた。
ウェスタンブロッティング
ヒトMCK/Dp260 TgあるいはMCKプラスミドのみのいずれかが安定にトランスフェクトされ、分化したMM14筋原細胞の培養物が採取された。
タンパク質は、ダンス型ホモジナイザーの中で、1mLホモジナイズ緩衝液(50mM Tris pH8,150mM NaCl,1mM EDTA,0.04mg/mL アプロチニン,0.0025 mg/ mL ぺプスタチンA,0.025 ロイペプチン,1mM フェニルメチルスルホニルフルオライド, 0.1% Triton X100)でホモジナイズすることにより、3百万個の細胞から抽出された。
筋肉組織は、またDM/Tg+及びDMマウスの後肢から採取された(100mg)。
前記組織は、凍結され、1mLホモジナイズ緩衝液中、冷却した乳鉢及び乳棒を使用してホモジナイズされた。
ホモジネートは、細胞の破片を沈殿させるために、10分間、13,000rpm、4℃で遠心分離された。
24mLの分取は、NuPAGE トリス−アセテート SDSゲルシステム(インビトロゲン)を使用した4−8%アクリルアミドゲルで分析された。
タンパク質は、ノベックスチェンバー(インビトロゲン)で、ハイボンド−Cスーパー膜(アマシャム バイオサイエンス,ピスカタウェー,NJ)へトランスファーされた。
膜は、非特異的な結合をさけるために、4%ミルクを含むトリス−NaCl−Tween buffer(TNT)で4℃、一晩ブロックされた。
膜は、その後、一次抗体とともに室温で2時間インキュベートされた。
筋原細胞のウェスタンブロットについては、一次抗体(VIA4-2 A3,アップステートバイオテクノロジー,レークプレーシド,NY)は、ジストロフィンのカルボキシ末端の最後の17アミノ酸に対して生じるマウスモノクローナルIgMであった。
肢筋のウエスタンブロットについては、一次抗体は、ジストロフィンC末端特異的IgG(MANDRA−1,シグマ)であった。
二次抗体(抗マウスIgM,ペルオキシダーゼ,シグマ)は、室温で1時間または4℃で一晩でアプライされた。
追加の洗浄後、膜は、ECL(enhanced chemilluminescence)検出液(アマシャム バイオサイエンス,ピスカタウェイ,NJ)に暴露され、続いて、X線フィルムへ露光された。
後肢筋のウェスタンブロットのために、アルカリホスファターゼを結合した抗マウスIgG(シグマ)は、ジストロフィンタンパク質バンドの比色可視化するために、BCIP/NBT(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸塩/ニトロブルーテトラゾリウム塩化物)キット(KPL,ゲーサーズバーグ,MD)が使用された。
免疫細胞化学的組織学的研究
殺してすぐの動物からの後肢は、皮を剥がれ、2%パラホルムアルデヒドを含むpH7.4 リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に4〜6時間浸漬された。
1本の後肢から、ヒラメ筋及び長指伸(EDL)筋が解剖して取り出され、4℃で24〜48時間固定され、その後、パラフィンに埋め込まれた。
それらは、その後、切片化され、標準的な組織学的な方法を使って、トルイジンブルーで染色された。
反対側の肢の筋肉は、1〜2mm3の塊へ分解され、Histochem J.21:163-171(1989)のトクヤスの方法に従い、スクロース及びポリビニルピロリドンの混合物で凍結保護され、液体窒素中で、急速凍結された。
1.5μL厚の横断切片は、FCSアタッチメントのついたレイヒェルトウルトラカットS ミクロトームを使って、得られた。
切片は、室温下、5分間、TBSで洗浄され、その後、ブロック液で希釈された一次抗体中で、90分間、インキュベートされた。
使用された抗体は、1:25で希釈されたC末端特異的モノクローナル抗ジストロフィン(MANDRA−1)(シグマ),または1:200で希釈されたウサギポリクローナル抗ラミニン(シグマ)であった。
切片は、5分間、PBS中で2回リンスされ、30分間、5%ヤギ血清を含むTBS中でブロックされ、TBSで2回リンスされた。
それらは、60分間、アレクサ488が結合した,種特異的な二次抗体(モレキュラープローブ、ユージーン、OR)とともにインキュベートされ、その後、リンスされ、観察するためにマウントされた。
ラミニンラベルされたスライドは、核を見えるように、10分間0.2mg/mLヨウ化プロピジウムで対比染色され、その後、再度リンス及びマウントされた。
画像は、CCDカメラを装備したオリンパスBX−50エピ螢光顕微鏡を使用して記録された。
値は、全筋肉のクロスセッション領域あたりの、ネクローシス/再生のパーセンテージとして示された。
非末梢核を有する筋繊維のパーセンテージは、ヨウ化プロピジウム及び抗ラミニンでラベルされた凍結断面のデジタル画像を使って決定された。
平均間の相違は、スチューデントのt検定を使って分析された。
DMマウスは、ジストロフィンを持っておらず、局在化も見られなかった(図3b)。
8週齢DM/Tg+マウスでは、図3aが示されるように、蛍光強度は、細胞間で変化したが、図3cに示されるように、16週では、より均一で、細胞膜に局在化するように見られた。
この病変は、DM/Tg+マウスDp260トランスジーンの発現により、完全には除去されないが、冒された領域は、DMマウスで見られるよりも、ずっと集中化し、限局的である。
DM/Tg+マウスのヒラメ筋の外見は、野生型同齢コントロール動物のヒラメ筋の形態にかなり類似していた(図6c)。
定量分析は、両タイプのネクローシス領域のパーセンテージは、年齢とともに減少したが、16週まで、DMマウスは、死亡するまで、進行的により多くの筋肉のネクローシスが起こるのに対し、DM/Tg+マウスはEDL及びヒラメ筋においてネクローシスがほとんど起こらないことを示している。
中心核を有する筋繊維のパーセンテージは、骨格筋の慢性変性及び再生の指標である。
それは、DM及びDM/Tg+両マウスにおいて、年齢とともに増加したが、ヒラメ筋及びEDL筋の両方において、DM/Tg+の平均は、同齢の平均よりも有意に低かった(p<0.05)。
磁気共鳴イメージング(MRI)及びラジオグラフィー
サジタルMRIは、DM、及びDM/Tg+マウスについて、水平ボア9.4T バリアン社製システム上でマウスボリュームコイル及び、次に示すパラメーター、すなわち、TR/TE=2000/14ms;視界=60×30mm;イメージマトリクス=256×256ピクセル;スライス厚=1mm;及び平均数=2でスピン−エコーイメージングシーケンスを使用して、実施された。
MRIは、DMマウスに見られる極度な外観の変形が(図4e)、DM/Tg+マウスには存在しないことを示した(図4d)。
DMマウスは、また、野生型の動物(図4f)と比較して、脊柱傍の筋束及び心筋の両方の厚さが明らかに減少していることを示した。
DM/Tg+動物のこれらの特徴は、MRIによっては、野生型動物と区別がつかなかった。
DM/Tg+マウスの心筋の幅は、DMマウスのそれよりも厚いようにみえ、正常なコントロールマウスのそれとかなり類似しているように見える。
3匹のDMおよび3匹のDM/Tg+マウスについて、通常の方法で実施したラジオグラフィーは、マウスにおける脊柱後弯に対するヒトDp260発現の効果を示す。
図4bに示されるX線画像は、DMマウスの重症な脊柱後弯の背骨、つまり、ゴニオメーター分析により120°と測定する弯曲を示す。
それに対して、DM/TM+マウスは、図4に見られるように、正常マウスに類似した、56°の背骨の湾曲を示す。
筋電図(EMG)研究
針電極の挿入に対する反応に対する節電図の応答は、カーター等、Am.J.Phys.Med.Rehabil.71:2-5(1992)及びドゥミトル、Electrodiagnostic Medicine 第2版,276-277による以前記載された方法を使い、DM/Tg+マウス及びDMマウスからとった四肢筋肉について記録された。
EMG研究は、ニューロマックスEMGシステム(XL Tek,オンタリオ,カナダ)を使い、前脛骨筋について実施された。
セッティングは、ノッチフィルタ及び適応フィルターの両方を60Hzに、低周波フィルターを30Hzに、高周波フィルターを10,000Hzに、ゲインを200/divに、10ms/divに、及び負のトリガースロープに標準化された。
接地及び参照電極は、0.25mm2記録面(TECA社,オンタリオ,カナダ)をもつ単極針電極である、皮下に設置されたEEG皮下記録針(ニコレット019−409700,ニコレットバイオメディカル,マディソン,WI)であった。
全マウスは、0.6mg/g重量のアベルチン(トリブロモエタノール,シグマ)により、麻酔をかけられた。重量は、各EMGテストのたびに取得された。
CRDを測定するために、腹筋を4区画に等分割し、4週間隔で、いくつの4分区画にCRDを存在したか、及び、(挿入活性をもつ)CRDが合計でいくつあったのかを記録した。
EMG活動は、約0.5mm増分で中心から放射状に飛び出す針穿刺により4点で記録された。
各四分画分で、4つの穿刺が行われ、各象限で作られ、研究される動物の側面は、外傷によるアーチファクトを最小化するために、4週間の間隔で変更された。
CRDをもつ4画分は0から4のスコアがつけられ,CRD総数は、0から16のスコアがつけられた。
より高齢のDM/Tgマウスは、個々の運動単位が興奮し、正常なEMGパターンを表す(図5a)。
DMマウスは、ジストロフィン異常症の異常の特徴を表すCRDパターンを表す。
CRDは、筋肉神経支配除去及び筋障害性の状態と相関関係がある神経障害的状態で共通に見られる。
電気生理学的反応は、時間中ずっと、2つのマウス群について収集され、それらの臨床学的所見に相関していた。
4週齢マウスにおいて、DM及びDM/Tg+群のマウスの間で、CRDを有する四分画分数または合計CRDの罹患率はほとんど違いがなかった(図5c及び5d)。
マウスが老化するにつれて、DMマウスは、CRDを有するより大きな四分画分数及びより大きな合計CRD数を持つようになるが、それに対してDM/Tg+マウスは、各々がより少さくなった(図5c及び5d)。
8週目では、CRDを有する四分画分数(p=0.002)(図5c)及びCRDを有する四分画分数の合計数(p<0.001)(図5c)の両方において、違いは、有意に大きくなった。
CRDは、DMマウスの4つ全ての四分画分に認められるが、DM/Tg+マウスの象限が認められるCRDはより少数であった。
DMマウスは、8から12週の間に死亡したが、DM/Tg+マウスは生き残り、24週まで研究された。
それらのEMG研究は、CRDを有する四分画分の数及びCRDの総数が軽度の筋障害に典型的な水準にまで減少したことを示した。
運動性研究
運動活性データは、シングルフォースプレートアクトメーター(スティーブ ファウラーから入手)で記録された。フォースプレートアクトメーターは、12cm×12cmの感知領域を使用した。
空間解像度は、1mmであり、時間解像度は、0.02秒であった。
マウスは、目の細かいサンドペーパーで粗くしたアクリルプラスチック板で動き、記録セッションが、暗く、音響減衰した部屋で15分間続けられた。
スティーブ ファウラーにより書かれたソフトウェアが、データを記録し分析するために使われたが、DM/Tg+マウスに対する平均的な95%信頼区間を見つけることによって、データが分析された。
6週で、DMマウスは、DM/Tg+マウスほど動かず(図9)、DM群データは、マージナルな有意性(p=0.07)を表すt検定で、95%の信頼区間の丁度外側に出た。
10週で、DMマウスは、DM/Tg+マウスに比較して重大な障害をもった(p=0.002)。
DM/Tg+マウスは、何も処理されていないmdxマウス及びC57BL/6Jコントロールマウスと同等のレベルで動き、これは、DM/Tg+マウスの、95%信頼区間内に十分に入った。
DM/Tg+マウスは、また正常に動き、概して健康的に見え、さらに、DMマウスに典型的な、活動性減少、異常なよたよた歩行、制約され動きの悪い四肢を示さなかった。
DM/Tg+マウスにおける重大な筋ジストロフィー表現型の減少
DM/Tg+マウスは正常に成長しDMマウスよりも長生きするので、DMマウスに見られる重大な筋ジストロフィーの表現型は、DM/Tg+マウスにおいて、改善された。
DMマウスは、DM/Tg+マウスが正常に成長するのに対して、小型であった(図4)。臨床的な健康状態は、筋肉の質量及び強さと相関関係があるため、体重によって評価された。
4週間で、DM/Tg+マウスの平均体重[18.1±0.7g(n=14)]は、DMマウスの平均体重[14.1±0.6g(n=7)]よりも有意に大きい(p=0.001)。
8週までに、わずかDM/Tg+マウスは、26.9±0.7g(n=12)に成長し、16週までに、30.8±1.2g(n=6)に成長した。
8週までに、DMマウスは、17.9±1.3g(n=6)に成長し、その後、まもなく死亡した。
寿命研究のために生産された全28匹のDM/Tg+マウスは、30匹のDMマウスの平均寿命(2.9±0.3月)より長く生存した。
23匹のDM/Tg+マウスは6月齢以上生存し、それらのうちの6匹のみ死亡した。
この21%割合の減少は、実験マウスでは正常である。7匹のDM/Tg+マウスは、1年齢またはそれ以上の年齢に届いた。
細胞採取、トランスフェクション、及び投与によるDMD治療
マウス、イヌ、ウマ及びヒト由来の細胞は、常法を使い、また、先に記載があるように、動物から採取され、網膜ジストロフィンタンパク質をコードするように遺伝子インサートに、安定にトランスフェクトされた。
安定にトランスフェクトされた細胞は、それから、少なくともひとつのDMDの臨床症状の苦しみを減らすために、動物へ投与される。
好ましくは、細胞は、自家移植となるように、同一固体の動物から採取され、投与する。そのような措置は、各固体動物の生涯を通して必要程度で、繰り返される。
より具体的には、骨髄細胞は、幹細胞可塑性を保持する条件下で単離され、培養されてもよい。
それらは、その後、選択的なマーカー遺伝子,例えば、ネオマイシン抵抗性、をもつDp260トランスジーンを含むレンチウィルスによってトランスフェクトされる。
また、別の方法として、エレクトロポレーションがトランスジーンを骨髄細胞に導入するための方法として使用されてもよい。これは、選択的な遺伝子マーカー:ネオマイシン抵抗性遺伝子を含む2番目のプラスミドを伴うコトランスフェクションで行うことができる。
これは選択的な遺伝子、すなわち、ネオマイシン抵抗性遺伝子をもつ2つ目のプラスミド、を含むコトランスフェクションによって行われてもよい。
ネオマイシンにより細胞が選択されたあと、それらは、レシピエントに移植されてもよい。
カラー図または写真があるこの特許または特許出願明細書のコピーは、官公庁への請求及び必要な手数料の支払いにより提供される。
本出願は、機械読み取りフォーマット及び紙の両方にリストされた配列を含む。機械読み取りフォーマットは、34444.txtコピー1及び34444.txtコピー2としてラベルされた。
これらのコピーは、相互に同一であり、ここに含まれる配列リストの紙コピーと同一である。
これら各配列リストは、参照によって本出願に明確に含まれる。
Claims (37)
- ジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列よりなる形質転換ベクターであって、
前記核酸配列は、形質転換に先立って、前記ベクターに含まれない形質転換ベクター。 - 前記形質転換ベクターがさらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリAシグナル部位からなる群から選択される少なくとも1つの制御エレメントを含む請求項1に記載の形質転換ベクター。
- 前記核酸配列が、前記ジストロフィンタンパク質を発現できるトランスジーンである請求項1に記載の形質転換ベクター。
- 前記核酸配列が配列番号10と少なくとも80%配列同一性をもつ請求項1に記載の形質転換ベクター。
- 前記形質転換ベクターがプラスミド及びウィルスベクターからなる群から選択される請求項1に記載の形質転換ベクター。
- 前記ジストロフィンタンパク質が網膜ジストロフィンタンパク質である請求項1に記載の形質転換ベクター。
- 核酸配列が細胞のゲノムへ組み込まれ、それによって、細胞が形質転換され、細胞、核酸配列は、前記ジストロフィンタンパク質をコードする細胞。
- 前記核酸配列が配列番号10と少なくとも80%配列同一性をもつ請求項7に記載の細胞。
- 前記核酸配列がさらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリA部位からなる群から選択される少なくとも1つの制御エレメントを含む請求項7に記載の細胞。
- 前記細胞が、筋原細胞、骨髄細胞、及びSP骨髄細胞からなる群から選択される請求項7に記載の細胞。
- 前記ジストロフィンタンパク質が、網膜ジストロフィンタンパク質である請求項7に記載の細胞。
- そのゲノムへ安定に導入される外来核酸配列をもち、
前記核酸配列は、ジストロフィンをコードする、トランスジェニック動物。 - 前記動物が、マウス、ヒト、イヌ、及びウマからなる群から選択される請求項12に記載のトランスジェニック動物。
- 前記核酸配列が配列番号10と少なくとも80%配列同一性をもつ請求項12に記載のトランスジェニック動物。
- 前記核酸配列がさらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリA部位からなる群から選択される少なくとも1つの制御エレメントを含む請求項12に記載のトランスジェニック動物。
- 前記ジストロフィンタンパク質が網膜ジストロフィンタンパク質である請求項12に記載のトランスジェニック動物。
- 請求項1に記載のベクターをそのなかにもつ形質転換細胞。
- 動物のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの臨床的症状を少なくとも1つ軽減する方法であり、前記方法は下記ステップよりなる:
ゲノムインサートを前記動物のゲノムへ導入し、前記インサートは、ジストロフィンタンパク質をコードする。 - 前記インサートが配列番号10と少なくとも80%配列同一性を持つ核酸配列である請求項18に記載の方法。
- 前記インサートがさらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリAシグナル部位からなる群から選択される少なくとも1つの制御エレメントを含む請求項18に記載の方法。
- 前記ジストロフィンタンパク質が網膜ジストロフィンである請求項18に記載の方法。
- 前記導入ステップが、
安定にベクターを前記ゲノムにトランスフェクションし、
前記ベクターが前記ゲノムインサートを含む請求項18に記載の方法。 - 前記ベクターがプラスミド及びウィルスベクターからなる群から選択される請求項22に記載の方法。
- 前記臨床症状が、複合反復放電、脊柱後彎、ネクローシス、緩い姿勢(slack posture)、顕著な成長遅延、及び重い筋肉衰弱からなる群から選択される請求項18に記載の方法。
- 前記動物が、ヒト、マウス、ウマ、及びイヌからなる群から選択される請求項18に記載の方法。
- 動物のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの臨床症状を少なくとも1つ軽減する方法であり、前記方法は下記ステップよりなる:
細胞を前記動物へ投与し、
前記細胞がジストロフィンをコードしたゲノムインサートがトランスフェクトされたものである。 - 前記方法はさらに、前記投与ステップに先立って、前記動物から細胞を受け取り、前記細胞へ前記遺伝子インサートをトランスフェンクトするステップを含む請求項26に記載の方法。
- 前記トランスフェクトステップが、ベクターを通して起こるまたは裸DNAのエレクトロポレーションを通して起こる請求項27に記載の方法。
- 前記ジストロフィンが網膜ジストロフィンである請求項26に記載の方法。
- 前記ゲノムインサートが配列番号10と少なくとも80%配列同一性がある請求項26に記載の方法。
- 前記細胞が、筋原細胞、骨髄細胞及びSP骨髄細胞からなる群から選択される請求項26に記載の方法。
- ジストロフィンタンパク質を発現する核酸配列を含むトランスジーン。
- 前記ジストロフィンが網膜ジストロフィンである請求項32に記載のトランスジーン。
- 前記核酸配列が配列番号10と少なくとも80%配列同一性をもつ請求項32に記載のトランスジーン。
- 前記核酸配列がATCCクローン57670,57672,57674,及び57676に由来する請求項32に記載のトランスジーン。
- 前記核酸配列が前記ジストロフィンの選択的スプライシングの結果生じるアイソホームに由来する請求項32に記載のトランスジーン。
- さらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリAシグナル部位からなる群から選択される少なくとも1つの制御エレメントを含む請求項32に記載のトランスジーン。
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