KR20070011416A - 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 멀티 정량법 - Google Patents

저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 멀티 정량법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070011416A
KR20070011416A KR1020067022609A KR20067022609A KR20070011416A KR 20070011416 A KR20070011416 A KR 20070011416A KR 1020067022609 A KR1020067022609 A KR 1020067022609A KR 20067022609 A KR20067022609 A KR 20067022609A KR 20070011416 A KR20070011416 A KR 20070011416A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cholesterol
reagent
hydrogen peroxide
lipoproteins
low
Prior art date
Application number
KR1020067022609A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101282539B1 (ko
Inventor
게이꼬 마쯔모또
히로시 마쯔이
Original Assignee
덴카 세이켄 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 덴카 세이켄 가부시키가이샤 filed Critical 덴카 세이켄 가부시키가이샤
Publication of KR20070011416A publication Critical patent/KR20070011416A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101282539B1 publication Critical patent/KR101282539B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/60—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving cholesterol

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

본 발명은 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 정량을 가능하게 하는 시약에서의 자연 발생을 억제한 안정화 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법이며, 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질을 처리하고, 과산화수소를 생성시키는 제1 공정 및 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴과 동시에 잔존하는 저밀도 리포 단백질을 처리하여 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키는 제2 공정을 포함하며, 제1 공정에서는 퀴논 색소의 생성이 일어나지 않고, 제2 공정에서 생성된 퀴논 색소의 양으로부터 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법을 제공한다.
리포 단백질, 콜레스테롤, 과산화수소, 퀴논 색소

Description

저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 멀티 정량법{METHOD OF MULTIQUANTIFICATION FOR CHOLESTEROL OF LOW-DENSITY LIPOPROTEIN}
본 발명은 생체 시료 중 피검 성분인 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시에 측정하는 방법이며, 측정에 사용하는 액상 시약을 안정화하는 것을 가능하게 하는 방법에 관한 것이다.
저밀도 리포 단백질(이하 "LDL"이라 함)은 혈액 중에서의 콜레스테롤 운반의 주역이고, 특히 죽상 동맥 경화에서 혈관벽에 침착한 콜레스테롤은 주로 LDL에서 유래하고 있다. LDL 콜레스테롤의 증가는 동맥 경화성 질환이 주요한 위험 요인이고, 분별 정량하는 것은 임상상 유용하다. 또한, 총 콜레스테롤 측정이란 카이로 미크론(CM), 초저밀도 리포 단백질(VLDL), LDL, 고밀도 리포 단백질(HDL) 등의 모든 리포 단백질 중 콜레스테롤을 측정하는 것이고, 현재도 지질 검사의 중심이 되어 있다.
종래부터의 LDL 콜레스테롤의 정량 방법은, 분획과 콜레스테롤 정량의 2개의 조작으로부터 구하는 방법과 총 콜레스테롤, HDL 콜레스테롤, 트리글리세리드값에 의해 구하는 Friedewald식에 의한 연산 방법이 있다.
분획 조작으로는 초원심법, 침전법, 면역법 등이 있지만, 시료의 초원심 처 리 또는 필터 처리에 의한 조작이 필요해지고, 임상 검사의 장소에서 간편성이나 경제성의 면에서 보급되기 어려운 상황에 있었다. 또한, Friedewald식에 의한 연산 방법도 그 사용 제한이 있으며, 개체차를 가미하지 않기 때문에 정확성에 문제가 있었다.
그러나, 최근 분획 조작을 요하지 않는 LDL 콜레스테롤 정량 방법(일본 특허 공개 (평)11-318496호 공보)이 보고되고, 현재 임상 검사용 시약으로서 검사의 장소에 적용되고 있다. 이 방법은, 제1 공정에서 시료 중 LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤을 선택적으로 소거하고(소거란 에스테르형 콜레스테롤을 분해하고, 그 분해물이 제2 공정에서 검출되지 않도록 하는 것을 의미함), 제2 공정에서 LDL 콜레스테롤을 정량하는 것이다.
그러나, 상기 LDL 콜레스테롤 측정 시약은 임상상 유용한 시약임에도 불구하고, 종래부터 총 콜레스테롤 측정이 널리 행해지고 있으며, Friedewald식으로부터 LDL 콜레스테롤값을 구할 수 있다는 등의 사정에 의해 보급되기 어려운 상황하에 있었다. 그러나, 상술한 바와 같이 Friedewald식으로부터 구하는 LDL 콜레스테롤값에는 문제점이 있고, 정확한 LDL 콜레스테롤값의 측정은 임상적으로 의의가 있다. 이 때문에, 시약을 한층 더 개량하여, 임상적인 의의가 높은 LDL 콜레스테롤 측정 시약을 보급시키는 것이 요망되고 있었다.
한편, 1회의 측정으로 HDL 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤 및 LDL 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 연속적으로 측정하는 방법의 보고가 있었다(일본 특허 공표 제2003-501630호 공보). 이 방법은, 시료를 1개의 시험용 튜브에 넣고, 시료 중 비HDL 콜레스테롤과 항아포 B항체의 복합체를 형성시킨 후, 복합체를 형성하지 않은 리포 단백질, 즉 HDL을 측정한다. 이어서 복합체를 계면활성제를 사용하여 해리시키고, 남은 비HDL 콜레스테롤을 효소적으로 측정하는 것이며, 2회의 측정값을 합함으로써 총 콜레스테롤값을 알 수 있는 것이었다. LDL 콜레스테롤의 경우에 대해서도 반응 방법은 마찬가지이고, 복합체 형성시에는 항아포 B항체가 아닌 항아포 AI항체 또는 항아포 AII항체를 사용한다. HDL 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤은 종래부터 건강 진단 등으로 널리 측정되고 있어 한번에 측정할 수 있다는 것에 의의가 있었다.
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 (평)11-318496호 공보
특허 문헌 2: 일본 특허 공표 제2003-501630호 공보
본 발명의 목적은 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 정량을 가능하게 하는 시약에서의 자연 발색을 억제한 안정화 방법을 제공하는 것이고, 1회의 측정으로 복수개 항목의 정량값이 얻어지는 멀티 정량법으로서 유용하다.
본 발명자들은 최근 주목받고 있는 LDL 콜레스테롤의 정확한 측정의 중요성 및 종래부터 잘 알려져 있는 총 콜레스테롤 측정의 중요성을 감안하여, LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시에 측정하는 계의 확립에 대해서 예의 검토를 행하였다.
본 발명자들은, 먼저 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 측정을 가능하게 하는 방법을 개발하였다(특원2002-362970, PCT/JP03/15995). 이 방법은 LDL 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 리포 단백질에 작용시키고, 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴으로써 LDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤을 측정하고, 이어서 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제를 첨가하여, 잔존하는 LDL에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 작용시키고, 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시켜 LDL 콜레스테롤을 측정하는 방법이며, 총 콜레스테롤값은 상기 2개의 측정값을 합함으로써 산출할 수 있는 방법이었다. 상기 방법은, 1회의 측정으로 복수 항목의 정량값이 얻어지는 멀티 정량법으로서 유효한 것이었다. 그러나, 이 방법에서는 사용시의 액상 시약의 상태에서 제1 시약에 퀴논 색소를 생성하는 요소가 모여 있기 때문에, 시약이 공기 산화를 받아 자연 발색된다는 문제가 있고, 액상 시약으로서의 안정성이 부족하였다.
따라서, 본 발명자들은 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 동시 정량을 가능하게 하는 시약의 안정화에 대해서 예의 검토를 행하고, 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시 정량하는 방법에 있어서, 사용하는 시약에서 자연 발색을 억제함으로써 LDL 콜레스테롤 및 총 콜레스테롤을 안정적으로 측정하는 방법을 발견하였다.
구체적인 정량법으로는, 앞선 방법에서는 제1 공정에서 시료 중 LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤의 효소 반응부터 검출까지 행하였지만, 제1 공정에서 발생하는 LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤의 효소 반응을 제2 공정의 초기에 검출할 수 있도록 하고, 그 후에 LDL 콜레스테롤을 검출할 수 있도록 한 것이다.
도 1에 본 발명의 원리를 도시한다. 도 1에 도시한 바와 같이 본 발명의 방법은 2개의 공정으로 이루어진다. 제1 공정에서는, 시료 중 LDL 이외의 리포 단백질 중의 콜레스테롤에 기초하는 반응에 의해 과산화수소가 생성되고, 제2 공정에서는 제1 공정에서 생성된 과산화수소에 의한 반응액의 흡광도 변화가 있으며, 그 후 LDL 중 콜레스테롤에 기초하는 반응이 일어나 상기 반응에 의한 반응액의 흡광도 변화가 측정된다. 제2 공정 전체의 흡광도 변화량은 총 콜레스테롤량에 대응하고, 제2 공정에서의 과산화수소의 발생량에 대한 흡광도 변화량은 LDL 콜레스테롤량에 대응한다. 이 흡광도 변화를 자동 분석 장치에 의해 측정할 때의 분석 조건을 변경함으로써, 한번의 측정으로 동시에 다항목의 측정을 할 수 있다.
종래의 멀티 정량법에서는 측정의 제1 공정에서 사용되는 제1 시약에 퀴논 색소 생성에 관한 복수개의 시약 조성물이 집약되어 있었다. 한편, 본 발명의 방법에서는, 퀴논 색소의 생성이 제2 공정만에서 일어나기 때문에, 퀴논 색소의 생성에 관한 복수개의 시약 조성물을 제1 공정에서 사용하는 제1 시약과 제2 공정에서 사용하는 제2 시약으로 분리하는 것이 가능해지고, 시약의 공기 산화에 의한 자연 발색을 억제하는 것이 가능해졌다. 시약의 자연 발색을 억제하는 것이 가능해졌기 때문에, 시약의 안정화가 가능해지며, 안정적으로 콜레스테롤을 측정할 수 있게 되었다.
본 발명의 방법을 여러 가지의 측정 조건을 설정할 수 있는 자동 분석 장치를 이용하여 행하는 경우의 자동 분석 장치의 다항목 분석에서의 1개의 측정 조건은 제2 공정에서의 총 흡광도 변화량에 의해, 총 콜레스테롤의 정량을 행하는 것이다. 또한, 다른 하나의 측정 조건은 제2 공정에서 제2 시약 첨가 후의 2점(제2 시약 첨가 직후의 급격한 흡광도 변화 후와 반응 최종점) 사이의 흡광도 변화량에 의해 LDL 콜레스테롤의 정량을 행하는 것이다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법이며, 생체 시료 중의 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질을 처리하고, 과산화수소를 생성시키는 제1 공정 및 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴과 동시에 잔존하는 저밀도 리포 단백질을 처리하고 발생된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키는 제2 공정을 포함하고, 제1 공정에서는 퀴논 색소의 생성이 일어나지 않으며, 제2 공정에서 생성된 퀴논 색소의 양으로부터 저밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법,
[2] 상기 [1]에 있어서, 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물이 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 및 퍼옥시다제를 포함하고, 제1 공정에서 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나가 첨가되며, 제2 공정에서는 제1 공정에서 첨가되지 않은 시약 조성물이 첨가되는 방법,
[3] 상기 [1] 또는 [2]에 있어서, 제1 공정에 있어서, 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 작용시켜 과산화수소를 생성시키고, 제2 공정에서 적어도 저밀도 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 작용시켜 과산화수소를 생성시키는 방법,
[4] 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 있어서, 제2 공정에 있어서, 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키고, 측정계에 적어도 저밀도 리포 단백질에 작용하는 계면활성제를 첨가하며, 측정계에 잔존하는 저밀도 리포 단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 효소를 작용시켜 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시켜 측정하는 방법,
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 있어서, 제2 공정에서의 전체의 흡광도 변화량이 총 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정값이 되고, 제2 공정에서의 과산화수소의 생성량에 대한 흡광도 변화량이 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정값이 되는, 상기 2개의 값에 기초하여 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 존재량을 동시에 측정하는 방법,
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 제2 공정에서의 흡광도의 변화가 제2 시약의 첨가 직후의 급격한 증가와, 그 후의 완만한 증가의 2상성의 증가를 나타내고, 후자의 완만한 흡광도 변화량으로부터 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 정량을 행하는 방법,
[7] 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 있어서, 제2 공정 전체의 흡광도 변화량으로부터 총 콜레스테롤의 정량을 행하는 방법,
[8] 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 있어서, 임상 화학 검사용 자동 분석 장치를 이용하고, 1회의 측정에서 다른 측정 조건으로 분석을 하는 방법,
[9] 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법이며, 제1 시약을 첨가하여 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질을 처리하고, 과산화수소를 생성시키는 제1 공정 및 제2 시약을 첨가하여 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴과 동시에 잔존하는 저밀도 리포 단백질을 처리하여 과산화수소를 발생시켜 퀴논 색소로 전화시키는 제2 공정을 포함하는 방법에 있어서, 액상 시약을 안정화시키는 방법이며, 제1 공정에서 첨가되는 제1 시약에 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물인 4-아미노안티피린 또는 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나가 포함되고, 제2 시약에는 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 및 퍼옥시다제 중 제1 시약에 포함되지 않는 것이 포함되는, 액상 시약을 안정화시키는 방법,
[10] 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서, 액상 시약을 안정화시키는 방법이며, 제1 공정에서 첨가되는 제1 시약에 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물인 4-아미노안티피린 또는 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나가 포함되고, 제2 시약에는 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 및 퍼옥시다제 중 제1 시약에 포함되지 않는 것이 포함되는, 액상 시약을 안정화시키는 방법,
[11] 상기 [9] 또는 [10]에 있어서, 추가로 제1 시약에 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제가 포함되고, 제2 시약에 적어도 저밀도 리포 단백질에 작용하는 계면활성제가 포함되는 방법,
[12] 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법이며, 제1 시약을 첨가하여 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질을 처리하고, 과산화수소를 생성시키는 제1 공정 및 제2 시약을 첨가하여 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴과 동시에 잔존하는 저밀도 리포 단백질을 처리하여 과산화수소를 발생시켜 퀴논 색소로 전화시키는 제2 공정을 포함하는 방법을 행하기 위한 키트이며, 제1 시약에 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물인 4-아미노안티피린 또는 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나가 포함되고, 제2 시약에는 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 및 퍼옥시다제 중 제1 시약에 포함되지 않는 것이 포함되는 키트,
[13] 상기 [12]에 있어서, 추가로 제1 시약에 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제가 포함되고, 제2 시약에 적어도 저밀도 리포 단백질에 작용하는 계면활성제가 포함되는 키트.
<발명의 효과>
본 발명의 방법에 의해서, 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시에 정량하는 방법에서 사용하는 시약은 공기 산화에 의해 자연 발색하지 않고, 액체 상태로 안정적으로 유지하는 것이 가능해진다. 또한, 1회의 측정으로 LDL 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 안정적으로 측정할 수 있다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2004-106006호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은 본 발명의 멀티 정량법의 원리를 도시한 도면이다.
도 2는 본 발명의 멀티 정량 방법에 의해 측정한 LDL 중 콜레스테롤값과, 단독으로 측정한 LDL 중 콜레스테롤값의 상관을 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명의 멀티 정량 방법에 의해 측정한 총 콜레스테롤값과, 단독으로 측정한 총 콜레스테롤값의 상관을 도시한 도면이다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명은 생체 시료 중 LDL 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 리포 단백질의 처리에 의해 생성된 색소의 흡광도를 지표로 한번의 측정으로 정량하는, 생체 시료의 LDL 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시에 측정하는 방법이다. 또한 본 발명은, 시약이 공기 산화에 의해 자연스럽게 발색되는 것을 방지하여, 시약 또는 시약 조성물의 안정성을 높이고, 또한 시약을 장기간 두어도 안정적인 결과가 얻어지는 방법이다. 본 발명의 방법에서는, 생체 시료 중의 리포 단백질을 처리하여 과산화수소를 발생시키고, 이어서 상기 과산화수소를 퀴논 색소로 전화한 후, 퀴논 색소의 흡광도를 측정함으로써 생체 시료 중 리포 단백질에 포함되는 콜레스테롤을 측정한다. 본 발명의 방법은, 생체 시료 중의 LDL 이외의 리포 단백질을 처리하여 과산화수소를 생성시키는 제1 공정과, 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴과 동시에, 잔존하는 LDL을 처리하여 과산화수소를 생성시키고, 상기 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키는 제2 공정으로 이루어진다. 즉, 본 발명의 방법에서, LDL 이외의 리포 단백질과 LDL를 개별적인 공정으로 처리하고, 상기 처리에 의해서 생성된 과산화수소의 퀴논 색소로의 전화 및 생성된 퀴논 색소의 검출을 하나의 공정으로 행한다. 여기서 리포 단백질의 처리란, 리포 단백질을 계면활성제 및 효소로 처리하는 것을 말한다. 리포 단백질을 계면활성제로 처리하면 리포 단백질 중의 콜레스테롤이 유리하고, 상기 콜레스테롤을 효소(콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제)로 처리하면 과산화수소가 생성된다. 즉, 리포 단백질의 처리는 리포 단백질로부터 콜레스테롤이 유리되고, 추가로 콜레스테롤로부터 과산화수소가 생성되는 일련의 처리를 포함한다. 또한, 콜레스테롤의 처리란 유리된 콜레스테롤을 효소로 처리하여 과산화수소를 생성시키는 것을 말한다. 생성된 과산화수소를 이어서 퍼옥시다제에 의해 퀴논 색소로 전화시킨다. 본 발명에서, "시약"이란, 시약 조성물이 포함되어 있는 것을 말하고, "시약 조성물"이란, 시약을 구성하고 있는 계면활성제나 효소 등의 물질을 말한다.
제1 공정에서, 생체 시료 중의 LDL 이외의 리포 단백질을 계면활성제 및 효소로 처리하여 과산화수소를 생성시킨다. 그러나, 제1 공정에 사용하는 제1 시약에 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물의 셋트가 포함되어 있지 않기 때문에, 생성된 과산화수소가 퀴논 색소로 전화되지 않는다. 제2 공정에서는, LDL을 계면활성제 및 효소로 처리하고, 상기 반응에 의해 새롭게 과산화수소가 발생한다. 제2 공 정에서 사용하는 제2 시약을 측정계에 첨가했을 때, 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물의 셋트가 측정계 중에 포함되고, LDL 중 리포 단백질의 처리와 동시에, 측정계에 존재하는 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키는 반응이 일어난다. 제2 공정이 개시될 때에, 제1 공정에서 생성된 LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤로부터 생성된 과산화수소가 측정계 중에 존재하고, 상기 과산화수소는 제2 공정의 개시와 동시에 퀴논 색소로 전화된다. 한편, 제2 공정에서의 LDL의 처리에 의해 발생된 과산화수소는, 생성과 동시에 퀴논 색소로 전화된다. 제2 공정에서, LDL의 처리에 의해 생성되는 과산화수소는, 콜레스테롤의 효소에 의한 처리가 진행됨에 따라 경시적으로 증가한다. 따라서, 제2 공정의 LDL의 처리에 의해 생성된 과산화수소는 퀴논 색소로 전화되기 때문에, 퀴논 색소도 경시적으로 증가한다. 제2 공정 개시 직후에 생성된 퀴논 색소에 의한 흡광도 변화는, 제1 공정에서 생성된 과산화수소의 양, 즉 LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤의 존재량을 반영하고, 제2 공정이 종료할 때의 퀴논 색소에 의한 흡광도의 변화는, 제1 공정에서 생성된 과산화수소의 양 이외에 제2 공정에서 생성된 과산화수소의 양, 즉 LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 반영한다. 다시 말하면, 제2 공정에서의 전체의 흡광도 변화량이 생체 시료 중 총 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정값이 되고, 제2 공정에서의 과산화수소의 발생량에 대한 흡광도 변화량이 LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정값이 된다. 상기 2개의 흡광도 변화량, 즉 제2 공정에서의 전체의 흡광도 변화량 및 제2 공정에서의 과산화수소의 발생량에 대한 흡광도 변화량에 기초하여 생체 시료 중 LDL 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 존재량을 동시에 측정할 수 있 다. 본 발명의 방법에서, 제1 공정과 제2 공정에서 다른 시약이 사용되지만, 2개의 시약의 조성, 주로 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물의 조성을 나눠서 연구함으로써 시약 자체의 안정화가 도모됨과 동시에, 콜레스테롤을 측정하는 방법에서도 안정적인 결과가 얻어진다. 시약 조성물이란, 특정한 화학 반응에 관계하는 시약 및/또는 완충액 등의 화학 반응을 행하게 하는 데에 필요한 시약의 조성물을 말한다. 본 발명의 방법에서는, 액체로 공급되는 액상 시약의 안정화를 도모할 수 있다. 콜레스테롤의 처리에 의해 생성된 과산화수소는, 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물의 존재하에서 유색 퀴논(퀴논 색소)이 생성된다. 시약 중에 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물이 혼합된 액체 상태로 존재하는 경우, 과산화수소가 존재하지 않아도 공기 산화의 영향에 의해 경시적으로 퀴논 색소가 생성되고, 시약이 자연 발색된다. 따라서, 콜레스테롤을 측정하기 위한 시약 또는 시약 조성물의 안정성을 유지할 수 없으며, 콜레스테롤의 측정 안정성도 보증할 수 없게 된다. 본 발명에서는, 2개의 시약 중 하나에 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물을 모두 혼재시키지 않고, 최종적으로 측정계에 2개의 시약을 첨가했을 때에 처음으로 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물이 모두 계에 첨가되도록 한다.
본 발명의 방법의 측정 대상인 리포 단백질 중에 포함되는 콜레스테롤로는, 에스테르형 콜레스테롤(콜레스테롤에스테르) 및 유리형 콜레스테롤이 있다. 본 명세서에서, 단순히 "콜레스테롤"이라는 경우에는, 이들을 모두 포함한다.
본 발명의 방법에 제공되는 생체 시료로는, HDL, LDL, VLDL 및 CM 등에 리포 단백질을 포함할지도 모르는 시료이고, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장 등의 체액이나 그 희석물을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다. "LDL 이외의 리포 단백질"이란, HDL, VLDL, CM 등을 말한다.
"총 콜레스테롤의 존재량이 반영된 측정값" 또는 "LDL 중 콜레스테롤의 존재량이 반영된 측정값"이란, 생체 시료 중의 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 농도 또는 절대량을 정량한 경우에 얻어지는 값을 말한다. 측정 방법은 한정되지 않고, 복수개의 측정을 조합하여 최종적으로 생체 시료 중 리포 단백질 중의 콜레스테롤 농도 또는 절대량에 따른 값, 예를 들면 비례 또는 반비례한 값이 얻어지는 경우, 그 값을 말한다. 예를 들면, 리포 단백질의 콜레스테롤을 특정한 약제로 일련의 처리를 행함으로써 발생하는 화합물에 기인하는 흡광도를 측정값의 일례로서 들 수 있다. 또한, 이 경우의 측정값은 절대량도 변화량도 포함된다.
예를 들면, 도 1에서 도시한 제2 공정에서의 흡광도 변화는 제1 공정의 처리에 의해 생성되는 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴으로써 발생하는 흡광도에, 제2 공정의 처리에 의해 생성되는 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴으로써 발생하는 흡광도가 추가되어 있다. 도 1에서 제2 공정의 측정 2에서 얻어지는 흡광도의 흡광도 변화량(측정 2에서 얻어지는 흡광도와 측정 1에서 얻어지는 흡광도의 차)으로부터 LDL 중의 콜레스테롤의 존재량이 반영된 흡광도가 얻어지지만, 이 흡광도는 "LDL 중 콜레스테롤의 존재량이 반영된 측정값"이다. 또한, 제2 공정의 측정 2에서 얻어지는 총 흡광도는, LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤의 존재량을 반영한 흡광도에 LDL 중 콜레스테롤의 존재량에 대응한 흡광도가 추가된 값이고, 이 흡광도는 "총 콜레스테롤의 존재량이 반영된 측정값"이다. 단, 실제로는, 정확한 측정값을 얻기 위해서, 측정 2에서 얻어지는 흡광도로부터 제2 시약을 첨가하기 전의 흡광도를 뺀 값에 기초하여 콜레스테롤량을 산출한다.
2종의 측정값을 한번의 측정으로 얻는다는 경우의 "한번의 측정"이란, 생체 시료를 측정에 제공한 후 필요한 복수개의 측정값을 얻기까지의 연속적인 일련의 처리를 포함한다. 한번의 측정 사이에는 복수회의 시약의 첨가나 측정값의 획득이 포함되지만, 원심 분리 등에 의한 분리 조작이나 복합체 형성에 의한 분리 조작은 포함되지 않는다. 적합하게는 단독의 측정용 튜브 또는 웰 중에서 한번에 측정이 완료된다.
"2개의 측정값에 기초하여 생체 시료 중 LDL 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 존재량을 동시에 얻는다"란, 2개의 측정값으로부터 연산에 의해 LDL 중의 콜레스테롤 및 총 콜레스테롤의 농도 또는 절대값을 얻는 것을 말한다. 예를 들면, 도 1에서 측정 2에서 얻어지는 측정값의 변화량, 즉 측정 1과 2의 양 측정값의 차로부터 LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 알 수 있고, 측정 2에서 얻어지는 측정값에 의해 총 콜레스테롤의 존재량을 알 수 있다.
제1 공정에서의 처리는, LDL 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 효소 반응에 의해 콜레스테롤을 분해함으로써 행해진다. 상기 처리에 의해 생성된 과산화수소는 제2 공정까지 소거, 검출되지 않고 유지되어 있다. 계면활성제가 작용한다는 것은, 계면활성제가 리포 단백질을 분해하여 리포 단백질 중 콜레스테롤을 유리시키는 것을 말한다.
LDL 이외의 리포 단백질, 즉 HDL, VLDL, CM 등에 포함되는 콜레스테롤을 선택적으로 반응시키는 구체적인 방법으로는 이하의 것을 들 수 있다.
즉, LDL 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 작용시키고, 과산화수소를 발생시킨다.
제1 공정의 반응액 중 콜레스테롤 에스테라제 농도는 0.2 내지 2.0 IU/㎖ 정도가 바람직하고, 유래로는 슈도모나스속 세균으로부터 생성되는 것이 효과적이다. 또한 콜레스테롤 옥시다제 농도는 0.1 내지 0.7 IU/㎖ 정도가 바람직하고, 세균이나 효모에서 유래하는 것을 사용하는 것이 바람직하다.
제1 공정에서 사용되는 LDL 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 바람직한 예로서, HLB값이 13 이상 15 이하, 바람직하게는 13 이상 14 이하인 폴리알킬렌옥시드 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로는 고급 알코올 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬메르캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수 있다. 또한 계면활성제의 HLB값의 산출 방법은 주지되어 있고, 예를 들면 문헌["신계면활성제", 호리우찌 히로시 저, 쇼와 61년, 산쿄 슈빤]에 기재되어 있다.
HLB값이 13 이상 15 이하인 폴리알킬렌옥시드 유도체의 바람직한 구체예로는, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알코올에테르, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌벤질페닐에테르 등으로 HLB값이 13 이 상 15 이하인 화합물을 들 수 있지만 이것으로 한정되는 것은 아니다.
제1 공정에서 사용되는 계면활성제로서, 예를 들면 폴리옥시에틸렌 유도체로, HLB값은 13.2인 에말겐 B66(카오사 제조)을 들 수 있다.
제1 공정에서 사용되는 상기 계면활성제의 농도는 0.1 내지 10 g/ℓ 정도가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 5.0 g/ℓ 정도이다.
제1 공정은, pH 5 내지 9의 완충액 중에서 행하는 것이 바람직하고, 완충액으로는 트리스, 트리에탄올아민, 구드 완충액(Good's buffer) 등의 아민을 포함하는 완충액이 바람직하다. 특히 구드 완충액인 Bis-Tris, PIPES, MOPSO, BES, HEPES 및 POPSO가 바람직하고, 완충액의 농도는 10 내지 500 mM 정도가 바람직하다.
제1 공정의 반응 온도는 30 내지 40 ℃ 정도가 적당하고, 37 ℃가 가장 바람직하다. 또한 반응 시간(제1 시약을 첨가한 후부터, 제2 시약을 첨가하기까지의 시간)은 2 내지 10 분간 정도이면 좋고, 5 분간이 바람직하다.
본 발명의 방법에서는, 제1 공정을 알부민의 존재하에서 행하는 것이 바람직하다. 알부민은, 알부민이면 어떤식으로든 한정되는 것은 아니고, 혈청 알부민 등의 시판되고 있는 알부민을 바람직하게 사용할 수 있다, 특히 지방산이 없는 것이 바람직하다. 알부민의 기원은 어떤식으로든 한정되는 것은 아니고, 인간, 소, 돼지, 말 등 어느 동물일 수도 있으며, 특히 널리 사용되고 있는 소혈청 알부민을 바람직하게 사용할 수 있다. 제1 공정의 반응 용액 중 상기 알부민의 농도는 0.1 내지 5.0 g/㎗가 바람직하고, 0.3 내지 3.0 g/㎗가 보다 바람직하다.
이상과 같이, 제1 공정에서 사용되는 제1 시약은 적어도 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제가 포함된다. 상기 시약은, 추가로 적당한 완충액 및 알부민이 포함되어 있을 수도 있다. 또한, 제1 공정에서 사용되는 시약은, 퀴논 색소 생성에 관여하는 시약 조성물을 모두 포함하는 것은 아니고, 4-아미노안티피린 또는 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나를 포함한다. 또한, 제1 공정에서 사용되는 제1 시약은 퍼옥시다제를 포함하지 않는다.
제1 공정에서는, 생체 시료 중에 존재하고 있던 LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤의 양에 대응하여 과산화수소가 발생하고, 상기 과산화수소는 소실, 검출되지 않고 제2 공정으로 넘겨진다.
계속되는 제2 공정에서는 제1 공정에서 처리한 LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤로부터 생성된 과산화수소의 정량과 제1 공정 종료시에 잔존하고 있던 LDL 중의 콜레스테롤을 처리하여 정량한다.
LDL 중의 콜레스테롤의 처리는 LDL을 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제로 처리함으로써 행한다. LDL 중의 콜레스테롤은 상기 계면활성제 및 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제의 작용에 의해 과산화수소가 생성된다. 여기서, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제는 제1 공정에서 사용되는 제1 시약에 포함되어 있고 제1 공정에서 측정계에 첨가된 것을 이용할 수 있다. 또한, 제2 공정에 사용되는 제2 시약에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제가 포함되어 있을 수도 있다. 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제는, LDL에만 선택적으로 작용하는 계면활성제이거나, 모든 리포 단백질에 작용하는 계면활성제일 수도 있다.
LDL의 측정값은 제2 시약 첨가 후의 흡광도 변화량으로부터 산출되기 때문에, 그 반응 속도, 즉 사용되는 계면활성제의 반응 강도가 측정값에서의 정확성을 좌우하게 된다. 이 때문에 적절한 반응 강도를 가지고 있는 계면활성제를 선택하는 것이 바람직하다.
LDL에만 선택적으로 작용하거나, 모든 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 바람직한 예로서, 제1 시약으로 사용되고 있지 않는 폴리알킬렌옥시드 유도체를 들 수 있다. 유도체의 예로는 고급 알코올 축합물, 고급 지방산 축합물, 고급 지방산 아미드 축합물, 고급 알킬아민 축합물, 고급 알킬메르캅탄 축합물, 알킬페놀 축합물을 들 수 있다.
폴리알킬렌옥시드 유도체의 바람직한 구체예로서, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌세틸에테르, 폴리옥시에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 고급 알코올에테르, 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르, 폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르, 폴리옥시에틸렌벤질페닐에테르 등으로 제1 시약에 사용되고 있지 않는 화합물을 들 수 있다. 제2 공정에서 사용되는 계면활성제로서, 예를 들면 폴리옥시에틸렌라우릴알코올로, HLB값이 13.3인 Polidocanol(Thesit)(로슈·다이아노스틱스사 제조)을 들 수 있다.
제2 공정에서 사용되는 계면활성제의 농도는, 0.1 내지 100 g/ℓ 정도가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1 내지 50 g/ℓ 정도이다.
제2 공정의 그 밖의 바람직한 반응 조건은, 제1 공정에서의 바람직한 반응 조건과 마찬가지이다. 단, 본 발명의 방법의 제2 공정에서는, 제2 공정 개시 직후에 측정계에 포함되어 있던 LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤 유래의 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키고, 한편으로 LDL 중 콜레스테롤은 제2 공정의 진행과 함께 과산화수소를 생성하고 상기 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킨다. LDL 이외의 리포 단백질의 처리에 의해 생성된 퀴논 색소에 의한 흡광도의 증가는 제2 시약의 첨가와 동시에 개시하여 빠른 속도로 진행되어 단시간에 종결된다. 한편, 제2 시약을 첨가한 후에 LDL이 처리되어 과산화수소가 생성되고, 이어서 퀴논 색소가 생성되기 때문에, LDL의 존재량을 반영하는 흡광도는 제2 시약의 첨가 후 약간 시간을 두고 증가하기 시작하고, 그 증가 속도도 크지 않다. 즉 제2 공정에서의 흡광도의 증가는, 제2 공정 개시 직후의 급격한 증가와 완만한 증가의 2상성을 나타낸다. 최초의 급격한 증가가 LDL 이외의 리포 단백질의 존재량을 반영하는 증가이고 나중의 완만한 증가가 LDL의 존재량을 반영하는 증가이다.
따라서, LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤에서 유래하는 퀴논 색소와 LDL 중의 콜레스테롤에서 유래하는 퀴논 색소를 개별적으로 측정하고, LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 정확하게 정량할 수 있도록 LDL 중 콜레스테롤에서 유래하는 퀴논 색소의 생성을 제2 시약 첨가 후의 30 초 이상 5 분 이내에 종결시키는 것이 바람직하다.
LDL 이외의 리포 단백질 중 콜레스테롤은 제1 공정에서 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제의 작용에 의해 생성된 과산화수소를 정량함으로써 행할 수 있다. 또한, LDL 중 콜레스테롤은 적어도 제2 공정에서 LDL에 작용하는 계면활 성제를 첨가하고, 상기 계면활성제와 제1 공정에서 첨가한 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제의 작용에 의해 생성된 과산화수소를 정량함으로써 행할 수 있다. 과산화수소의 정량은, 생성된 과산화수소를 퍼옥시다제 효소에 의해서 4-아미노안티피린과 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물과의 산화 축합 반응에 의해 유색 퀴논으로 전화하고, 파장 400 내지 700 nm에서 측정하는 방법에 의해 행할 수 있다. 이 때, 제2 공정에서 사용되는 제2 시약을 측정계에 첨가했을 때, 퍼옥시다제 효소, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물의 퀴논 색소의 생성에 관한 시약 조성물이 모두 계에 포함된다. 즉, 제2 공정에서 사용하는 제2 시약은, LDL에 작용하는 계면활성제를 적어도 포함하고, 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 및 수소 공여체 화합물(페놀계 또는 아닐린계) 중 제1 공정에서 사용되는 제1 시약에 포함되지 않는 시약 조성물을 포함하고 있다. 또한, 제2 공정에서 사용되는 제2 시약은 완충액, 알부민, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 중 어느 하나를 포함할 수도 있다.
제2 공정의 반응에서 발생한 유색 퀴논의 흡광도의 측정값은, 제1 공정의 반응에서 생성된 과산화수소에서 유래하는 흡광도에 제2 공정에서 생성된 과산화수소에서 유래하는 흡광도가 추가된 것이고, 생체 시료 중 모든 리포 단백질 중의 콜레스테롤의 존재량을 나타낸다. 또한 제1 공정 유래의 과산화수소의 흡광도를 전체의 흡광도로부터 뺀 것, 즉 제2 공정에서 생성된 과산화수소의 정량이 LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 나타낸다.
수소 공여체 화합물 중 아닐린계 수소 공여체 화합물로서, N-(2-히드록시-3- 술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(HDAOS), N-에틸-N-술포프로필-3-메톡시아닐린(ADPS), N-에틸-N-술포프로필아닐린(ALPS), N-에틸-N-술포프로필-3,5-디메톡시아닐린(DAPS), N-술포프로필-3,5-디메톡시아닐린(HDAPS), N-에틸-N-술포프로필-3,5-디메틸아닐린(MAPS), N-에틸-N-술포프로필-3-메틸아닐린(TOPS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메톡시아닐린(ADOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)아닐린(ALOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(DAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린(MAOS), N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3-메틸아닐린(TOOS) 및 N-술포프로필아닐린(HALPS) 등이 있다.
제2 공정의 반응액 중에서 과산화수소를 퀴논 색소로 전화하는 경우의 퍼옥시다제의 농도는 0.1 내지 3.0 IU/㎖가 바람직하고, 4-아미노안티피린의 농도는 0.3 내지 3.0 mmol/ℓ가 바람직하며, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물의 농도로는 0.5 내지 2.0 mmol/ℓ가 바람직하다.
제2 공정에서, 제2 시약을 첨가하면 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물이 모두 계에 포함되기 때문에, 제1 공정에서 생성된 과산화수소를 제2 공정의 빠른 단계에서 퀴논 색소로 전화시킨다. 또한, 동시에 LDL 중의 콜레스테롤이 제2 시약에 포함되는 LDL에 작용하는 계면활성제 및 측정계에 포함되는 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제에 의한 처리를 받아 과산화수소가 생성된다. LDL 중의 콜레스테롤에서 유래하는 과산화수소를 생성과 동시에 측정계에 포함되는 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물의 작용에 의해 퀴논 색소로 전화시키기 때문에, 경시적으로 퀴논 색소의 양이 증가한다. 따라서, 도 1에 도시한 바와 같이, 제2 공 정에서, 제2 공정의 개시와 동시에 흡광도가 급격히 증가하고, 그 후 경시적인 증가를 계속한다. 제1 측정에서는 급격히 증가한 흡광도를 측정하고, 제2 측정에서는 경시적으로 증가한 흡광도를 측정한다. 제2 측정의 측정값은, 총 콜레스테롤의 존재량을 반영하고, 제2 측정의 측정값과 제1 측정의 측정값의 차는, LDL 중 콜레스테롤의 존재량을 반영한다.
제2 시약을 첨가한 후부터 제1 측정을 행하기까지의 시간, 즉 제1 공정에서 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키는 데에 요하는 시간은 0 내지 60 초간, 바람직하게는 30 초 이내이다. 또한, 제2 측정을 행하기까지의 시간, 즉 제2 공정에서 존재하는 모든 LDL 중의 콜레스테롤이 효소의 작용에 의해 과산화수소가 생성되고, 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키는 데에 요하는 시간은 1 내지 5 분이다. 제1 측정 및 제2 측정의 2점에서 측정을 행하여 2개의 측정값이 얻어지면, 이 2개의 측정값로부터 연산 처리에 의해, 총 콜레스테롤량과 LDL 중의 콜레스테롤량을 계산에 의해 구할 수 있다.
이하에 계산식을 나타낸다.
Figure 112006078601125-PCT00001
ΔATsample: 시료의 측정 2의 흡광도로부터 시료와 제1 시약만의 흡광도를 뺀 흡광도 변화량
ΔATSTD: 표준 시료의 측정 2의 흡광도로부터 표준 시료와 제1 시약만의 흡광도를 뺀 흡광도 변화량
ΔATBLK: 생리 식염액 또는 정제수를 시료로 했을 때의 측정 2의 흡광도로부터 시료와 제1 시약만의 흡광도를 뺀 흡광도 변화량
CTSTD: 표준 시료의 총 콜레스테롤 표시값
ΔALsample: 시료 측정 2의 흡광도로부터 측정 1의 흡광도를 뺀 흡광도 변화량
ΔALSTD: 표준 시료 측정 2의 흡광도로부터 측정 1의 흡광도를 뺀 흡광도 변화량
ΔALBLK: 생리 식염액 또는 정제수를 시료로 했을 때의 측정 2의 흡광도로부터 측정 1의 흡광도를 뺀 흡광도 변화량
CLSTD: 표준 시료의 LDL 콜레스테롤 표시값
본 발명의 방법에서, 각 리포 단백질이 처리를 받아 퀴논 색소가 생성되는 경로의 개략은 이하와 같다. 단, 하기는 퀴논 색소의 생성 과정(처리)의 개략을 나타내는 것이지, 시약 조성을 나타내는 것은 아니다.
Figure 112006078601125-PCT00002
화살표 아래의 시약 조성물은 각 처리(반응)에 필요한 시약 조성물이고, C에스테라제는 콜레스테롤 에스테라제, C옥시다아제는 콜레스테롤 옥시다제이다.
상기 처리 중, 본 발명의 방법의 제1 공정에서 처리 1A가 행해지고, 제2 공정에서 처리 1B, 처리 2A 및 처리 2B가 행해진다. 제2 공정에서는, 처리 1B가 제2 공정의 초기에서 완료하고, 제2 공정 전체를 통하여 처리 2A와 처리 2B가 행해진다.
제1 공정 및 제2 공정은, 바람직하게는 1개의 반응 용기 내에서 연속적으로 행해지고, 자동 분석 장치가 제2 공정에서의 흡광도 변화량과 제2 공정 완료시의 흡광도를 자동적으로 측정한다.
본 발명의 방법을 사용하는 분석 장치는, 다항목을 동시에 분석할 수 있는 다항목 동시 분석법 기능을 갖는 자동 분석 장치이다. 자동 분석 장치로는, TBA-30R(도시바), BM1250·1650·2250(닛본덴시) 등을 들 수 있다.
분석 장치의 다항목 동시 분석법 기능으로는, 반응 용기에 제1 시약으로부터 제4 시약의 첨가가 가능하고, 반응 시간도 3 내지 20 분간의 설정이 가능하다. 또한, 반응 시간의 사이 복수회 측광을 행하기 때문에, 다른 측정 시간의 설정이 가능하고, 비색 분석이나 레이트 분석에서의 다른 시간 설정이나 비색법이나 레이트법의 조합도 가능해진다. 또한 다른 파장에서의 동시 측정도 가능하다. 이들 분석 측정 조건을 적절하게 설정함으로써, 본 발명의 다수 항목 동시 측정을 달성할 수 있다.
다항목 동시 분석법 기능을 갖는 자동 분석 장치는 시판되고 있는 것을 이용할 수 있다.
본 발명은, 추가로 생체내 시료 중 LDL 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 동시에 측정하기 위한 키트를 포함한다. 본 발명의 키트는 제1 시약 및 제2 시약을 포함한다. 제1 시약은, 적어도 LDL 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 포함한다. 제1 시약은 추가로, 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물을 포함하는 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물을 포함할 수 있지만, 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물을 모두 동시에 포함하는 것은 아니다. 또한, 퍼옥시다제를 포함하지 않고, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나를 포함한다. 또한, 제1 시약은 적당한 완충액, 알부민 등을 포함할 수도 있다. 제2 시약은 적어도 LDL에 작용하는 계면활성제를 포함하고, 추가로 퍼옥시다제, 4-아미노안티피린 및 페놀계 또 는 아닐린계 수소 공여체 화합물을 포함하는 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물 중 제1 시약에 포함되어 있지 않은 것을 포함한다. 제2 시약은 또한 적당한 완충액, 알부민 등을 포함할 수도 있다. 상기 시약 조성물의 반응에 의해 발생한 유색 퀴논의 흡광도를 측정할 수 있다. 본 발명의 키트는, 추가로 농도가 이미 알려진 표준 리포 단백질 용액, 완충액 등을 포함한다.
이하, 본 발명의 실시예에 기초하여 구체적으로 설명한다. 또한 본 발명은 하기 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제1 공정 및 제2 공정에 사용하는 시약 조성물(각각, 제1 시약 조성물 및 제2 시약 조성물)을 이하의 조성이 되도록 제조하였다. 제1 시약과 제2 시약의 조성을 변경한 2개의 측정계에 대응한 시약 조성물로 하였다.
[측정계 1]
제1 시약 조성물
PIPES 완충액 pH 7.0 50 mmol/ℓ
4-아미노안티피린 1.4 mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라제 0.6 IU/㎖
콜레스테롤 옥시다제 0.5 IU/㎖
계면활성제 에멀젼 B66(카오사 제조) 0.27 ％
제2 시약 조성물
PIPES 완충액 pH 7.0 50 mmol/ℓ
계면활성제 Polidocanol(Thesit) 1 ％
(로슈·다이아노스틱스사 제조)
TOOS 6 mmol/ℓ
POD(퍼옥시다제) 6.5 IU/㎖
[측정계 2]
제1 시약 조성물
PIPES 완충액 pH 7.0 50 mmol/ℓ
TOOS 2 mmol/ℓ
콜레스테롤 에스테라제 0.6 IU/㎖
콜레스테롤 옥시다제 0.5 IU/㎖
계면활성제 에멀젼 B66(카오사제) 0.27 ％
제2 시약 조성물
PIPES 완충액 pH 7.0 50 mmol/ℓ
계면활성제 Polidocanol(Thesit) 1 ％
(로슈·다이아노스틱스사 제조)
4-아미노안티피린 4 mmol/ℓ
POD 6.5 IU/㎖
평가 대조 제품으로서 시판품인 자동 분석용 시약 LDL-EX N(덴카세이켄사 제조)과 자동 분석용 시약 T-CHO (S)N(덴카세이켄사 제조)을 사용.
(시료)
인간 혈청 58 예를 준비하였다.
자동 분석 장치로서 TBA-30R(도시바사 제조)을 사용.
(LDL-C, T-CHO 동시 분석용 시약(멀티 시약))
측정 조건: 다항목 자동 분석
시료 각 4 ㎕에 미리 37 ℃로 가온한 제1 시약 300 ㎕를 혼화하고, 37 ℃에서 5 분간 반응시킨 후에, 제2 시약 100 ㎕를 첨가하고 추가로 5 분간 반응시켰다. 제2 시약 첨가 후, 30 초 후 및 5 분 후에 600 nm에서의 흡광도를 측정하였다. LDL 콜레스테롤(LDL-C)의 측정은 제2 시약 첨가 후 30 초 후와 5 분 후의 흡광도 변화량으로부터, 총 콜레스테롤(T-CHO)의 측정은 제2 시약 첨가 후의 흡광도 변화량으로부터 산출하였다. 이 때, 미리 생리 식염액의 흡광도 변화량(이하 블랭크로 함)과 이미 알려진 농도 시료를 표준 시료로 했을 때의 흡광도 변화량을 측정하고, 이 2개의 값의 차감으로부터 "mg/㎗ 당 흡광도 변화량"을 LDL-C, T-CHO 각각에 대하여 산출한다. 이어서 시료를 측정하고, 얻어진 흡광도 변화량으로부터 블랭크를 뺀 흡광도 변화량을 "mg/㎗ 당 흡광도 변화량"과 비교하여 LDL-C와 T-CHO 농도를 산출하였다.
도 2에 평가 대상 제품인 LDL-EX N을 사용하여 측정한 LDL 중의 콜레스테롤 측정값과, 본 발명의 방법에서 측정한 측정값의 상관을 나타낸다. 도 3에 평가 대상 제품인 T-CHO (S)N을 사용하여 측정한 총 콜레스테롤 측정값과, 본 발명의 방법에서 측정한 측정값의 상관을 나타낸다. 도 2 및 도 3에 도시한 바와 같이, 본법의 동시 정량에 의해서, 각각 단독으로 LDL-C와 T-CHO 측정을 행한 값과 마찬가지 인 측정 결과가 얻어지고 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 본 명세서에서 인용한 것이다.

Claims (13)

  1. 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법이며, 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질을 처리하고 과산화수소를 생성시키는 제1 공정 및 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴과 동시에 잔존하는 저밀도 리포 단백질을 처리하여 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키는 제2 공정을 포함하며, 제1 공정에서는 퀴논 색소의 생성이 일어나지 않고, 제2 공정에서 생성된 퀴논 색소의 양으로부터 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물이 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 및 퍼옥시다제를 포함하고, 제1 공정에서 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나가 첨가되며, 제2 공정에서는 제1 공정에서 첨가되지 않은 시약 조성물이 첨가되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 공정에 있어서, 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 작용시 키고, 과산화수소를 생성시키며, 제2 공정에 있어서, 적어도 저밀도 리포 단백질에 작용하는 계면활성제의 존재하에서 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제를 작용시켜 과산화수소를 생성시키는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공정에 있어서, 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시키고, 추가로 측정계에 적어도 저밀도 리포 단백질에 작용하는 계면활성제를 첨가하며, 측정계에 잔존하는 저밀도 리포 단백질에 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제 효소를 작용시키고, 생성된 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시켜 측정하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공정에서의 전체의 흡광도 변화량이 총 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정값이 되고, 제2 공정에서의 과산화수소의 생성량에 대한 흡광도 변화량이 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 존재량을 반영한 측정값이 되는, 상기 2개의 값에 기초하여 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤의 존재량을 동시에 측정하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공정에서의 흡광도의 변화가 제2 시약의 첨가 직후의 급격한 증가와, 그 후의 완만한 증가의 2상성의 증가를 나타내고, 후자의 완만한 흡광도 변화량으로부터 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 정량을 행하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 공정의 전체의 흡광도 변화량으로부터 총 콜레스테롤의 정량을 행하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 임상 화학 검사용 자동 분석 장치를 이용하고, 1회의 측정에서 다른 측정 조건으로 분석하는 방법.
  9. 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법이며, 제1 시약을 첨가하여 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질을 처리하고, 과산화수소를 생성시키는 제1 공정 및 제2 시약을 첨가하여 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴과 동시에 잔존하는 저밀도 리포 단백질을 처리하고 과산화수소를 발생시켜 퀴논 색소로 전화시키는 제2 공정을 포함하는 방법에 있어서, 액상 시약을 안정화시키는 방법이며, 제1 공정에서 첨가되는 제1 시약에 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물인 4-아미노안티피린 또는 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나가 포함되고, 제2 시약에는 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 및 퍼옥시다제 중 제1 시약에 포함되지 않는 것이 포함되는, 액상 시약을 안정화시키는 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 있어서, 액상 시약을 안정 화시키는 방법이며, 제1 공정에서 첨가되는 제1 시약에 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물인 4-아미노안티피린 또는 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나가 포함되고, 제2 시약에는 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 및 퍼옥시다제 중 제1 시약에 포함되지 않는 것이 포함되는, 액상 시약을 안정화시키는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 추가로 제1 시약에 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제가 포함되고, 제2 시약에 적어도 저밀도 리포 단백질에 작용하는 계면활성제가 포함되는 방법.
  12. 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 중의 콜레스테롤과 총 콜레스테롤을 한번의 측정으로 정량하는 방법이며, 제1 시약을 첨가하여 생체 시료 중 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질을 처리하고, 과산화수소를 생성시키는 제1 공정 및 제2 시약을 첨가하여 제1 공정에서 얻어진 과산화수소를 퀴논 색소로 전화시킴과 동시에 잔존하는 저밀도 리포 단백질을 처리하고 과산화수소를 발생시켜 퀴논 색소로 전화시키는 제2 공정을 포함하는 방법을 행하기 위한 키트이며, 제1 시약에 퀴논 색소 생성에 관한 시약 조성물인 4-아미노안티피린 또는 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 중 어느 하나가 포함되고, 제2 시약에는 4-아미노안티피린, 페놀계 또는 아닐린계 수소 공여체 화합물 및 퍼옥시다제 중 제1 시약에 포함되지 않는 것이 포함되는 키트.
  13. 제12항에 있어서, 추가로 제1 시약에 저밀도 리포 단백질 이외의 리포 단백질에 작용하는 계면활성제, 콜레스테롤 에스테라제 및 콜레스테롤 옥시다제가 포함되고, 제2 시약에 적어도 저밀도 리포 단백질에 작용하는 계면활성제가 포함되는 키트.
KR1020067022609A 2004-03-31 2005-03-30 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 멀티 정량법 KR101282539B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2004-00106006 2004-03-31
JP2004106006A JP4647927B2 (ja) 2004-03-31 2004-03-31 低密度リポ蛋白中コレステロールのマルチ定量法
PCT/JP2005/006162 WO2005095639A1 (ja) 2004-03-31 2005-03-30 低密度リポ蛋白中コレステロールのマルチ定量法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070011416A true KR20070011416A (ko) 2007-01-24
KR101282539B1 KR101282539B1 (ko) 2013-07-04

Family

ID=35063799

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067022609A KR101282539B1 (ko) 2004-03-31 2005-03-30 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 멀티 정량법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US7811779B2 (ko)
EP (1) EP1739189B1 (ko)
JP (1) JP4647927B2 (ko)
KR (1) KR101282539B1 (ko)
CN (2) CN1961079B (ko)
AU (1) AU2005227961B2 (ko)
CA (2) CA2828120A1 (ko)
ES (1) ES2396236T3 (ko)
HK (1) HK1099344A1 (ko)
WO (1) WO2005095639A1 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100091176A (ko) * 2007-10-10 2010-08-18 덴카 세이켄 가부시키가이샤 소입자 고비중 ｌｄｌ 콜레스테롤의 정량 방법 및 키트
WO2016117956A1 (ko) * 2015-01-23 2016-07-28 바디텍메드(주) Cdc 단백질 및 콜레스테롤 항체를 이용한 콜레스테롤 측정 방법
US10401371B2 (en) 2015-01-23 2019-09-03 Boditech Med Inc. Method of measuring cholesterol levels by using immunogenic method

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030012751A (ko) * 2001-08-04 2003-02-12 이형국 가래나무과(가래나무, 호두나무, 굴피나무)의열매껍질(과피/청피)와 잎을 이용한 조성물.
WO2007037419A1 (ja) * 2005-09-30 2007-04-05 Denka Seiken Co., Ltd. 生体試料中の２項目の測定対象物の同時分別定量方法
US20140147869A1 (en) * 2010-10-29 2014-05-29 Arkray, Inc. Method and Kit for Measuring Cholesterol in Low-Density Lipoproteins
KR102072251B1 (ko) * 2011-11-11 2020-01-31 엑시스-시일드 에이에스 혈액 샘플 분석 방법
CN102539731A (zh) * 2012-01-09 2012-07-04 宁波天康生物科技有限公司 血清低密度脂蛋白胆固醇的定量测定试剂及测定试剂盒
US9051599B2 (en) * 2012-12-10 2015-06-09 Theranos, Inc. Rapid, low-sample-volume cholesterol and triglyceride assays
CN104865392B (zh) * 2015-05-02 2016-09-14 王贤俊 一种ldl-c定量检测方法
CN105044364B (zh) * 2015-05-02 2016-09-14 王贤俊 一种采用联合遮蔽法制备的ldl-c检测试剂盒
CN105353142B (zh) * 2015-12-07 2017-05-10 郑州兰森生物技术有限公司 一种稳定性强的血清总胆固醇检测单试剂
CN107505272B (zh) * 2017-08-10 2020-09-25 东软威特曼生物科技(南京)有限公司 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒及其使用方法
CN109580511A (zh) * 2018-12-06 2019-04-05 潍坊泽成生物技术有限公司 一种高密度脂蛋白胆固醇的检测方法及检测试剂盒
CN111965365B (zh) * 2020-07-23 2021-11-19 武汉生之源生物科技股份有限公司 一种果糖胺测定试剂盒

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4378429A (en) * 1979-08-23 1983-03-29 Modrovich Ivan Endre Enzymatic method and stabilized solutions for determining total cholesterol in human serum
US5156954A (en) * 1989-03-08 1992-10-20 Cholestech Corporation Assay device and method using a signal-modulating compound
JP3193634B2 (ja) * 1996-05-29 2001-07-30 第一化学薬品株式会社 Ｌｄｌコレステロールの定量方法
EP0990904B1 (en) * 1997-04-14 2006-12-13 DENKA SEIKEN Co., Ltd. Method for quantitating cholesterol present in low density lipoproteins
US5925534A (en) * 1998-06-08 1999-07-20 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Method for measuring LDL-cholesterol
JP3767232B2 (ja) * 1998-06-08 2006-04-19 和光純薬工業株式会社 Ｌｄｌ−コレステロールの測定法
AU4932099A (en) 1998-09-18 2000-04-10 Kyowa Medex Co., Ltd. Methods for fractional quantification of cholesterol in lipoproteins and quantification reagents
EP1183535A2 (en) * 1999-05-28 2002-03-06 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Homogeneous tests for sequentially determining lipoprotein fractions
CN1281981A (zh) * 1999-07-26 2001-01-31 武汉埃克玛生物技术有限公司 血清低密度脂蛋白测定试剂
CN1124243C (zh) * 1999-09-10 2003-10-15 胡广全 轻质硅镁墙板
JP2001124780A (ja) * 1999-10-28 2001-05-11 Showa Denko Kk リポ蛋白質コレステロールの測定方法
JP4519239B2 (ja) * 2000-02-17 2010-08-04 デンカ生研株式会社 低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法
JP4456715B2 (ja) * 2000-02-28 2010-04-28 協和メデックス株式会社 レムナント様リポ蛋白中のコレステロールの測定方法および測定試薬
MXPA03004206A (es) * 2000-11-14 2003-09-22 Daiichi Pure Chemicals Co Ltd Metodo de ensayo de lipido y reactivo para su uso en el mismo.
CN1379234A (zh) * 2002-05-10 2002-11-13 肖洪武 低密度脂蛋白胆固醇测定方法及试剂
US7507551B2 (en) 2002-12-13 2009-03-24 Denka Seiken Co., Ltd. Multiple quantification method for cholesterol in low-density lipoproteins
JP2006180707A (ja) 2003-03-28 2006-07-13 Denka Seiken Co Ltd 低密度リポ蛋白中のトリグリセリドの定量方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100091176A (ko) * 2007-10-10 2010-08-18 덴카 세이켄 가부시키가이샤 소입자 고비중 ｌｄｌ 콜레스테롤의 정량 방법 및 키트
WO2016117956A1 (ko) * 2015-01-23 2016-07-28 바디텍메드(주) Cdc 단백질 및 콜레스테롤 항체를 이용한 콜레스테롤 측정 방법
US10401371B2 (en) 2015-01-23 2019-09-03 Boditech Med Inc. Method of measuring cholesterol levels by using immunogenic method

Also Published As

Publication number Publication date
US20070207515A1 (en) 2007-09-06
CN103122372B (zh) 2016-01-13
US7811779B2 (en) 2010-10-12
CA2568412A1 (en) 2005-10-13
EP1739189B1 (en) 2012-09-26
CN1961079B (zh) 2013-09-04
CN1961079A (zh) 2007-05-09
KR101282539B1 (ko) 2013-07-04
WO2005095639A1 (ja) 2005-10-13
CA2568412C (en) 2013-12-10
AU2005227961A1 (en) 2005-10-13
JP2005287378A (ja) 2005-10-20
ES2396236T3 (es) 2013-02-20
CA2828120A1 (en) 2005-10-13
JP4647927B2 (ja) 2011-03-09
EP1739189A1 (en) 2007-01-03
EP1739189A4 (en) 2009-07-08
CN103122372A (zh) 2013-05-29
AU2005227961B2 (en) 2011-02-03
HK1099344A1 (en) 2007-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101282539B1 (ko) 저밀도 리포 단백질 중 콜레스테롤의 멀티 정량법
JP5042023B2 (ja) 小粒子低比重リポ蛋白の定量方法および定量キット
JP5129572B2 (ja) 生体試料中の２項目の測定対象物の同時分別定量方法
US8178311B2 (en) Multiple quantification of cholesterol in low density lipoprotein
CN101120097A (zh) 残粒样脂蛋白（rlp）中的胆固醇的定量方法、试剂及试剂盒
KR20140096280A (ko) 혈액 샘플 분석 방법
KR20020026446A (ko) 콜레스테롤 정량용 시료의 전처리 방법 및 이를 이용한특정의 리포단백 중의 콜레스테롤 정량법
JP4200102B2 (ja) 高密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法及び試薬組成物
JP2001286297A (ja) コレステロール定量用試料の前処理方法およびこれを利用する特定のリポ蛋白中のコレステロール定量法
Behling-Kelly et al. Agarose gel electrophoresis determination of bovine lipoproteins compared with a wet chemistry method
JP2003230400A (ja) 試薬組成物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160418

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170419

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180426

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190402

Year of fee payment: 7