KR20070004877A

KR20070004877A - 다가 바이러스 벡터 및 이들의 생산을 위한 시스템

Info

Publication number: KR20070004877A
Application number: KR1020067021828A
Authority: KR
Inventors: 구앙핑 가오; 제임스 엠. 윌슨; 시앙양 조
Original assignee: 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date: 2004-04-28
Filing date: 2005-04-27
Publication date: 2007-01-09
Also published as: CN1965086A; RU2006141839A; US20070218536A1; NO20065404L; CN1965086B; SG152267A1; NZ550411A; AU2005238527A1; JP2007535326A; RU2416646C2; AU2005238527B2; WO2005106002A2; WO2005106002A3; MA28637B1; JP5690038B2; IL178773A0; EP1743028A2; MXPA06012511A; CA2562893A1; BRPI0510385A

Abstract

두 별개의 발현 카세트를 운반하는 바이러스 벡터를 생성하기 위한 시스템을 제공한다. 이 시스템은 삽입된 발현 카세트의 효율적 검출 및 선택을 가능케 하는 유일한 다가 전달 벡터를 이용한다.

다가 바이러스 벡터, 발현 카세트, 전달 벡터.

Description

다가 바이러스 벡터 및 이들의 생산을 위한 시스템{POLYVALENT VIRAL VECTORS AND A SYSTEM FOR PRODUCTION THEREOF}

항원을 발현시키는 바이러스 벡터의 사용이 설명되었다. 또한, 항원으로써 융합 단백질의 사용이 설명되었다.

융합 단백질 기제 벡터는 투약 섭생을 단순화하고 이종 증가에 대한 더 많은 기회를 만든다. 그러나, 융합 단백질 가공 처리 및 에피토프 제시의 예측불가한 성질 및 큰 삽입물을 운반하는 아데노바이러스를 생성 및 증식에 있어서의 난점들이 이들의 대규모 사용에 장애물이 되어 왔다.

필요한 것은 유전자 생성물의 전달에 유용한 바이러스 벡터를 생성하기 위한 예측가능한 방법이다.

발명의 개요

2개 이상의 별개의 발현 카세트를 운반하는 바이러스 벡터를 발생시키기 위한 시스템을 제공한다. 이 시스템은 삽입된 발현 카세트의 효율적인 검출 및 선별을 허용하는 유일한 다가 플라스미드 백본을 이용한다.

또한, 본 발명의 다가 백본을 사용하는 다가 바이러스 입자를 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 이러한 그리고 다른 구체예 및 이점은 하기에서 더 상세하게 설명된다.

도 1은 ΔE₁-ΔE₃-아데노바이러스 벡터의 어셈블리를 도시한다.

도 2는 항원을 아데노바이러스 벡터의 E1 및 E3 결실 유전자좌로 도입하는 것을 도시한다.

도 3은 E1 유전자좌만(검은 막대)으로부터, 또는 E1 및 E3 유전자좌 모두(밝은 막대)로부터 동일한 트랜스젠(α1AT)을 발현하는 재조합 침팬지 C9 아데노바이러스로부터의 발현의 생체내 비교 결과를 제공하는 막대기 차트이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 표적에 다중 발현 카세트를 운반하는 바이러스 벡터를 발생하기 위한 시스템을 제공한다. 이 시스템은 마커 유전자를 운반하는 이동가능한 클로닝 카세트를 함유한 바이러스 게놈을 운반하는 DNA 분자를 이용한다. 이 DNA 분자는 바이러스 게놈 내에 상이한 유전자좌에 위치한 다중 이종 발현 카세트를 함유하는 바이러스 게놈을 운반하는 전달 벡터를 발생시키는 데 사용된다. 이종 발현 카세트를 운반하는 바이러스 게놈은 본 발명의 전달 벡터로부터 구조되고, 적합한 바이러스 캡시드 또는 외피 단백질에 패키지되어 다가 바이러스 벡터를 생산한다.

본원에 사용된 DNA 분자 및/또는 전달 벡터는 본 발명에 따라서 바이러스 게 놈을 운반할 수 있고, 숙주 세포 내로 게놈을 전달할 수 있는 임의의 유전인자로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피솜 등을 포함한 임의의 적합한 유전 인자(또는 백본)은 선택할 수 있다. 한 구체예에서, 다른 클로닝 시스템도 이용할 수 있지만 유전인자가 원핵세포 발현에 적합하다.

본원에 사용된 용어 "상이한 유전자좌"는 첫 번째 선택된 표적 생성물에 대한 이종 발현 카세트가 두 번째 이종 발현 카세트와 인접하지 않은 부위의 바이러스 백본에 위치, 즉 바이러스 서열은 이종 발현 카세트들 사이에 위치한다는 것을 나타낸다. 이들 유전자좌는 상이한 유전자 영역 또는 단일 유전자 영역 내의 상이한 오픈 리딩 프레임에 있을 수 있다. 대안적으로, 다중 유전자좌는 단일 오픈 리딩 프레임 내에 있을 수 있지만, 서로 인접하지 않아서 예를 들면 스페이서, 천연 서열, 제한효소 부위 등에 의하여 분리될 수 있다.

본원에 사용된 "발현 카세트"는 숙주 세포에 전달하기 위한 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 생성물을 코딩하는 핵산 서열은 숙주 내에서 생성물의 발현을 지시하는 조절 통제 서열의 통제하에 있다. 적합하게는, 발현 카세트는 카세트 측면의 벡터 서열에 대하여 이종이다. 한 구체예에서, 각각의 이종 발현 카세트에서의 조절 통제 인자는 클로닝 과정 및 세포 내에서의 바이러스 조작 과정 동안에 이종 재조합의 위험성을 최소화(또는 제거)하기 위해서 다른 이종 발현 카세트에서의 조절 통제 인자와는 다르다. 한 구체예에서, 각각의 이종 발현 카세트는 상이한 프로모터 및/또는 인헨서 및/또는 폴리 A 서열을 구비한다. 그러나, 다른 구체예에서, 본 발명의 다가 벡터에서의 한 이종 발현 카세트는 다가 벡터에서의 다른 이종 발현 카세트와 공통인 하나 이상의 조절 통제 인자를 가질 수 있다. 이 구체예에서, 조절 통제 인자는 바람직하게는 짧은 서열이어서, 재조합이 가능하지 않다.

본원에서 설명하는 바와 같이, 코딩 생성물은 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하기 위해서 표적을 면역 시스템에 제공할 수 있고, 다른 코딩 생성물에 대한 보조제일 수 있으며, 면역 조절자 효과를 제공할 수 있고/있거나 치료 효과를 제공할 수 있다. 이러한 생성물의 조합은 본 발명에 따른 다가 바이러스 벡터에 전달될 수 있다.

용어 "기능적으로 결실된" 또는 "기능적 결실"은 충분한 양의 유전자 영역이 예를 들면 돌연변이 또는 변형에 의해서 제거되거나 그렇지 않으면 손상되어, 유전자 영역이 더 이상 유전자 발현의 기능적 생성물을 생산할 수 없는 것을 의미한다. 원한다면, 전체 유전자 영역이 제거될 수 있다. 유전자 파괴 또는 결실에 적합한 다른 부위는 본 출원의 다른 곳에서 논의한다.

I. 다가 바이러스 구성체

A. 바이러스 게놈 및 다중 리포터 유전자를 운반하는 DNA 분자

한 양태에서, 본 발명은 다가 바이러스 벡터 내로 패키지되는 바이러스의 서열을 운반하는 DNA 분자를 제공한다. 한 구체예에서, 이러한 DNA 분자는 플라스미드이다. 그러나, 상기에서 정의한 바와 같은 다른 적합한 유전인자를 선택할 수 있다. 벡터를 세포 내로 도입하는 것은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의하여, 또는 트랜스팩션을 포함한, 본원에 개시한 바대로 달성할 수 있다.

바이러스 서열은 전달 비히클로서 사용하기 위하여 의도되고, 다중 발현 카세트를 수용하는 데 충분한 공간을 가진 바이러스(들)의 유형 중에서 선택한다. 이들 바이러스 서열은 캡시드 단백질을 가지는 바이러스, 예를 들면 아데노바이러스 중에서 또는 외피 바이러스, 예를 들면 고양이 백혈병 바이러스(FeLV)와 같은 레트로바이러스, HTLVI 및 HTLVII 및, 렌티바이러스[예를 들면, 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 전염성 빈혈 바이러스 및 스푸마바이러스], 폭스바이러스(예를 들면, 카나리폭스), 다른 것들 중에서 용이하게 선택할 수 있다. 또 다른 바이러스는 당업자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.

한 구체예에서, 바이러스 서열은 아데노바이러스에서 얻어진다. 적합하게는, 다가 DNA 분자는 적어도 바이러스 게놈을 캡시드 내로 패키지하는 데 필요한 서열을 함유하는 아데노바이러스 게놈으로부터의 핵산 서열을 함유한다. 전형적으로, 다가 아데노바이러스 분자는 각각 아데노바이러스 게놈의 극단 5' 및 3' 말단에 있는 5' 아데노바이러스 시스-인자 및 3' 아데노바이러스 시스-인자를 함유할 것이다. 아데노바이러스 게놈의 5' 말단은 패키징과 복제에 필요한 5' 시스-인자, 즉 5' 역 말단 반복(ITR) 서열(복제기점으로 작용함) 및 5' 패키징 인핸서 도메인(E1 프로모터에 대한 선형 게놈 및 인핸서 인자를 패키징하는 데 필요한 서열을 함유함)을 함유한다. 아데노바이러스 게놈의 3' 말단은 패키징 및 단백질막으로 싸는 것에 필요한 3' 시스-인자(ITR을 포함하여)를 포함한다.

또한, 다가 DNA 분자는 추가적 아데노바이러스 서열을 함유할 수 있거나, 또는 하나 이상의 아데노바이러스 유전자 영역에서 적어도 기능적으로 결실될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명에 사용된 아데노바이러스 벡터는 E2 영역 또는 이들의 기능적 부분(예를 들면, E2a 및/또는 E2b를 코딩하는 영역) 및 하나 이상의 말기 유전자, 예를 들면, L1, L2, L3, L4 및 L5를 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명에 사용된 아데노바이러스 벡터는 E4 영역의 전부 또는 부분(예를 들면, E4 ORF6)을 함유할 수 있다.

예를 들면, 아데노바이러스 지연된 초기 유전자 E3의 전부 또는 부분은 벡터의 부분을 형성하는 아데노바이러스 서열에서 제거될 수 있다. 유인원 E3의 기능은 재조합 바이러스 입자의 기능 및 생산과 무관한 것으로 여겨진다.

예를 들면, E1-결실된 Ad 벡터는 적어도 E4 유전자의 ORF6 영역, 또는 이 영역의 기능의 과잉 때문에 E4 유전자 영역 전부의 결실이 있도록 구성할 수 있다. 본 발명의 또 다른 벡터는 지연된 초기 유전자 E2a에 결실을 함유한다. 적합하게는, 이들 벡터는 말기 유전자(즉, Ll, L2, L3, L4 및 L5) 및, 아데노바이러스 벡터를 바이러스 입자 내로 패키징하는 필수적인 다른 인자를 보유한다. 또한, 결실은 일부 목적을 위해서 중간 유전자 IX 및 IVa₂에서 이루어질 수 있다. 다른 결실은 다른 구조적 또는 비-구조적 아데노바이러스 유전자에서 이루어질 수 있다. 상기에서 논의된 결실은 개별적으로 사용될 수 있는데, 즉 본 발명에서 사용하기 위한 아데노바이러스 서열은 단일 영역에서만 결실을 함유할 수 있다. 대안적으로, 생물학적 활성을 파괴하는 데 효과적인 전체 유전자 또는 이들의 부분의 결실은 임의의 조합으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 한 대표적 벡터에서, 아데노바이러스 서열은 E3 등의 결실의 유무에 따라 E1 유전자 및 E4 유전자 또는 E1 유전자의 결실을 가질 수 있다.

다른 구체예에서, 렌티바이러스 게놈을 이용한다. 전형적으로, 렌티바이러스 벡터 플라스미드는 표적 세포를 감염시키는 벡터 및 이종 발현 카세트의 전달에 필요한 시스-작용하는 유전자 서열을 함유한다. 적합하게는, 원래의 외피 단백질 및 gag 서열 프로모터는 제거되었다.

플라스미드 백본 내의 바이러스 서열은 이들이 삽입된 캡시드 또는 외피의 유형에 의하여 서열에 제한될 필요가 없다. 따라서, 플라스미드 백본은 하나의 바이러스 공급원으로부터 바이러스 서열을 함유할 수 있어서, 다른 공급원으로부터 외피 내로 단백질막으로 싸여지거나 패키징된다. 예를 들면, 다가 HIV 벡터는 FIV 외피 내로 패키징될 수 있고; 다가 FIV 벡터는 HIV 외피 내로 패키징될 수 있으며; 다가 아데노바이러스 벡터는 다른 혈청형으로부터 캡시드 내로 패키징될 수 있다. 또 다른 모조형 바이러스 벡터는 당업자에게 용이하게 분명할 것이다.

바이러스 서열이 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 플라스미드 내로 클로닝되었을 때, 바이러스 게놈은 바이러스 게놈의 첫 번째 결실된 영역에 위치한 첫 번째 이동가능한 카세트 및 바이러스 게놈의 두 번째 결실된 영역에 위치한 두 번째 이동가능한 카세트를 함유하도록 변경된다. 선택적으로, 플라스미드는 바이러스 게놈의 별개 유전자좌에 각각 위치한, 다중 이동가능한 카세트를 함유할 수 있다. 이동가능한 카세트 각각은 플라스미드로부터 이들의 선택적 제거 및 이종 발현 카세트의 용이한 삽입을 허용하는 유일한 세트의 제한효소 부위에 의하여 양쪽에 인접하게 된다.

본 발명에 사용되는 각각의 이동가능한 카세트는 숙주 세포에서 이들의 발현을 지시하는 서열에 작동가능하게 연결된 검출가능한 리포터 유전자의 핵산 서열을 함유한다. 적합하게는, 이동가능한 카세트 각각은 플라스미드 백본에 의하여 운반되는 다른 이동가능한 카세트에 의하여 운반되는 리포터 유전자와 용이하게 구별가능한 유일한 리포터 유전자를 함유한다. 한 구체예에서, 리포터 유전자는 색깔에 의하여 서로 식별되는 생성물을 발현한다.

적합한 리포터 유전자는 본 발명의 다가 플라스미드 백본에 의하여 운반되는 다른 리포터 유전자와 구별될 수 있는 생성물을 코딩하는 것들을 포함한다. 예를 들면, 적색 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 푸른 형광 단백질, 청록 형광 단백질, 황록 형광 단백질을 포함한 형광 단백질은 적합한 빛의 파장으로 흥분시 색깔에 의하여 구별가능하다. 선택된 숙주 세포 유형에 대하여 사용하기에 적합한 형광 단백질은 예를 들면 ClonTech으로부터 상업적으로 입수가능하다. 색깔에 의하여 구별가능한 또 다른 적합한 리포터 유전자는 예를 들면 gusA(푸른색); DsRed(적색); 루시퍼라제(적색); 및 베타-갈락토시다제를 포함한다. 대안적으로, 당업자는 태그 또는 표지를 구비한 다른 리포터 유전자를 제공할 수 있는데, 이들 중 많은 수가 당업자에게 공지되어 있다.

적합한 리포터 유전자는 클로닝에 사용되는 숙주 세포 시스템의 관점으로 선 택된다. 숙주 세포 그 자체는 원핵(예를 들면, 박테리아) 세포 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포를 포함한 진핵 세포를 포함하는 임의의 생물학적 개체 중에서 선택할 수 있는데, 이들은 하기에서 더욱 상세하게 설명한다.

특별히 바람직한 한 구체예에서, 원핵 시스템을 이용한다. 또한, 숙주 세포는 DNA의 트랜스팩션 및 트랜스팩션된 DNA의 발현 및 원하는 방식으로, 예를 들면 발색에 의하여 선택된 리포터 유전자를 발현할 수 있다.

박테리아 세포를 포함한 적합한 원핵 시스템의 예는 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 적합한 박테리아 균주는 예를 들면, 대장균(Escherichia coli) C600 -F-, e14, mcrA, thr-1 supE44, thi-1, leuB6, lacY1, tonA21, [[람다]] [-] [Huynh, Young 및 Davis (1985) DNA Cloning, Vol. 1, 56-110]; DHI - F[-], recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk[-], mk[+], supE44, relA1, [[람다]][-] [-Hanahan (1983) J. Mol. Biol. 166, 557-580; XL1Blue-MRF' - D(mcrA)182, D(mcrCB-hsdSMR-mrr)172, endA1, supE44, thi-1, recA, gyrA96, relA1, lac, 1-, [F'proAB, lac I[q]ZDM15, Tn10 (tet[r])]; SURE 세포[Stratagene]; e14(mcrA), D(mcrCB- hsdSMR-mrr)171, sbcC, recB, recJ, umuC::Tn5(kan[r]), uvrC, supE44, lac, gyrA96, relA1, thi-1, end A1[F'proAB, lacI[q]DM15, Tn10(tet[r])]; GM272 - F[-], hsdR544(rk[-], mk[-]), supE44, supF58, lacY1 또는 [[델타]]lacIZY6, galK2, galT22, metBlm, trpR55, [[람다]][-];HB101 - F[-], hsdS20 (rb[-], mb[-]), supE44, ara14, galK2, lacY1, proA2, rpsL20 (str[R]), xyl-5, mtl-1, [[람다]][-], recA13, mcrA(+), mcrB(-)[Raleigh and Wilson (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,9070-9074]; JM101 - supE, thi, [[델타]](lac-proAB), [F', traD36, proAB, lacIqZ[[델타]]M15], 제한:(rk[+], mk[+]), mcrA+[Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33,103-119]; XL-1 blue recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17(rk[+], mk[+]), supE44, relA1, [[람다]][-], lac, [F', proAB, lacIqZ[[델타]]M15, Tn10(tet[R])][-Bullock, et al. (1987) BioTechniques 5,376-379]; GM2929[B. Bachman, Yale E. coli Genetic Stock Center (CSGC#7080)]; M. 마리누스(M. Marinus) 균주; sex F[-];( ara -14, leuB6 , fhuA13 , lacY1 , tsx -78, supE44 , [glnV44], galK2 , galT22 , l[-], mcrA , dcm -6, hisG4 , [ Oc ], rfbD1 , rpsL136 , dam -13::Tn9, xyl -5, mtl -1, recF143 , thi -1, mcrB , hsdR2 .); MC1000 - ( araD139 , D[ara-leu]7679, galU , galK , D[ lac ]174, rpsL , thi -1); ED8767 (F-, e14 - [ mcrA ], supE44, supF58 , hsdS3 [ rB [-] mB [-]], recA56 , galK2 , galT22 , metB1 , lac -3 또는 lac3Y1을 포함할 수 있다. 적합한 원핵 숙주 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(the American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스 소재), 다른 공공 세포 기탁기관 및 다양한 학문적 및 상업적 공급처에서 구입가능하다. 적합한 클로닝 시스템 또는 세포의 선택이 본 발명의 제한은 아니다.

본 발명의 구성체에 사용된 이동가능한 카세트 각각은 희소 제한효소 부위의 유일한 세트에 의하여 양쪽에 인접하게 된다. 희소 제한효소 부위의 각 세트는 이동가능한 카세트의 5' 말단에 첫 번째 희소 제한효소 부위 및 이동가능한 카세트의 3' 말단에 두 번째 희소 제한효소 부위를 제공한다. 한 구체예에서, 희소 제한효소 부위의 세트는 발현 카세트를 유전자좌 내로 방향성 클로닝이 되도록 한다. 그러 나, 본 발명은 삽입물의 방향에 제한되지 않는다. 다시 말해서, 이동가능한 및/또는 이종 발현 카세트는 주변의 바이러스 게놈의 리딩 프레임의 방향에 관하여 5'에서 3'으로 또는 3'에서 5'으로 위치할 수 있다. 또한, 특정 구체예에서, 희소 제한효소 부위의 세트는 발현 카세트를 선택된 유전자좌 내로 비방향성 클로닝이 되도록 할 수 있다.

한 실시예에서, 희소 제한효소 I-SceI는 단일 세트를 구성하는 5' 및 3' 희소 제한효소 부위 모두에 대하여 선택될 수 있다. 이 효소는 카세트의 두 말단 양쪽에 인접하게 될 때조차도 방향성 클로닝을 허용한다. 한 구체예에서, I-SceI은 제한효소 부위의 세트를 형성하기 위해서 다른 희소 제한효소와 조합하여 사용될 수 있다. 적합하게는, 각 세트의 희소 제한효소는 유일하여, 오로지 단일 유전자좌의 분해 및 이종 발현 카세트의 선택된 표적 부위 내로 용이한 삽입을 가능케 한다.

다른 구체예에서, 희소 제한효소가 선택되어 바이러스 게놈에서 선택된 위치(들)만이 개열되는데, 즉 개열은 이동가능한 카세트 및/또는 이종 발현 카세트의 5' 및 3' 말단에서만 이루어지고, 바이러스 게놈을 운반하는 유전 인자나 바이러스 게놈의 다른 위치는 어떤 것도 절단되지 않는다.

본 출원에서, 이러한 제한효소를 희소 절단기로 일컫는다. 이러한 희소 절단기의 예는 예를 들면 I-Ceu I, PI-Sce I, TevII, BmoI, DmoI, FseI, PacI, PmeI, PsrI, BcgI, BglI, BsabI, BstXI, DrdI, EcoNI, FseI, MaM I, Msl I, Mwo I, Psha I, Sfi I, Swa I, Xcm I 및 Xmn I 등을 포함하여, 7개, 8개 또는 그 이상의 염기에 대한 인식 부위를 가진 것들을 포함한다. 적합한 희소 절단기는 문헌 및 다양한 온라인 데이터베이스, 예를 들면 REBASE^TM 데이터베이스에서 당업자에게 용이하게 입수가능한 정보를 사용하여 확인될 수 있다. 본 방법에 적합한 절단기는 다양한 컴퓨터 프로그램 및/또는 온라인 데이터베이스를 사용하여 용이하게 결정할 수 있다. 적합한 제한효소는 다른 것들 중에서 예를 들면 England Biolabs, Obiogene, Lift Technology, Roche, BB Clontech, Stratagene, Amersham Pharmacia를 포함한 다양한 상업적 공급처로부터 입수가능하다.

따라서, 본 발명의 다가 플라스미드는 2개 이상의 이동가능한 카세트를 함유하는데, 이들 각각은 이동가능한 카세트를 이종 발현 카세트로의 선택적 대체를 허용하는 유일한 세트의 희소 제한효소에 의하여 양쪽에 인접하게 된다. 이들 다가 플라스미드는 이동가능한 카세트에 의하여 운반된 마커의 발현을 허용하는 숙주 세포 내로 트랜스펙션된다.

B. 이종 발현 카세트를 운반하는 다가 전달 벡터

적합한 제한효소가 선택되면, 종래의 분해 및 재리게이션 기술을 이용한다. 통상적으로, 플라스미드 DNA는 제한효소(들)와 혼합되고 약 12 내지 48 시간 동안 인큐베이션된다. 그 후, 종래의 페놀/클로로포름 추출 단계가 수행된다. 예를 들면, 에탄올 침전 및 방법 단계의 나머지에 사용하기 위하여 침전물을 (예를 들면, TE 또는 다른 적합한 완충액에) 용해시키는 것을 수반하는 페놀/클로로포름 추출을 이용할 수 있다. 예를 들면, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., 5.28-5.32, Appendix E.3-E.4 (Cold Spring Harbor Press, 뉴욕주 콜드 스프링 하버 소재, 1989년)를 참조하라. 다른 적합한 방법은 이용된 또는 그렇지 않으면 당업자에게 공지된 제한효소의 제조업자 또는 벤더에 의하여 제공될 수 있다.

통상적으로, 이종 발현 카세트의 적합한 삽입을 확실시하기 위하여, 이종 발현 카세트는 이동가능한 카세트를 발현 카세트가 삽입된 부위에 대하여 양쪽에 인접하게 하는 제한효소의 세트에 상보적인 제한 효소 제한부위를 가진 5' 및 3' 말단의 양쪽에 인접하게 된다.

따라서, 통상적으로, 첫 번째 이종 발현 카세트는 절개된 이동가능한 카세트의 부위 내로 클로닝된다. 유리하게도, 본 발명의 방법은 첫 번째 이종 발현 카세트를 함유한 플라스미드의 신속한 확인을 가능하게 한다. 이러한 플라스미드는 첫 번째 마커 유전자의 발현이 결핍되지만, 존재하는 임의의 다른 마커 유전자 생성물뿐만 아니라 두 번째 마커 유전자 생성물을 발현할 것이다. 다시 말하면, 첫 번째 이동가능한 카세트가 녹색 형광 단백질을 발현했을 때, 분해 및 재리게이션한 후 녹색의 부재는 이동가능한 카세트를 첫 번째 마커 유전자 내로 성공적으로 제거한 것을 나타낼 것이다.

한 구체예에서, 분해 및 재리게이션 단계는 이동가능한 카세트 각각에 대하여 연속적으로 반복된다. 다시 말하면, 첫 번째 분해 단계는 이종 발현 카세트가 원하는 유전자좌 내로 삽입되는 것을 보장하기 위하여 단일 이동가능한 카세트를 제거하는 제한 효소의 첫 번째 세트를 사용하여 수행된다. 그 후, 두 번째 분해 단 계는 두 번째 이동가능한 카세트 양쪽에 인접해 있는 세트에 유일한 제한효소의 두 번째 세트를 사용하여 수행된다. 두 번째 이동가능한 카세트 양쪽에 인접해 있는 세트에 상응한 제한효소에 의하여 양쪽에 인접하게 된 두 번째 이종 발현 카세트는 플라스미드 백본 내로 리게이션되고, 두 번째 마커 유전자의 발현이 결핍된 클론이 선택된다. 선택적으로, 하나 이상의 다른 분해 단계는 하나 이상의 다른 이동가능한 카세트를 제거하기 위하여 수행된다.

따라서, 본 발명의 방법은 전염성 바이러스 입자의 생산에 유용한 다가 전달 벡터의 효율적인 생산을 가능케 한다.

II. 다가 바이러스 벡터의 생산방법

본 발명의 다가 전달 벡터는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 캡시드 또는 외피를 가지는 바이러스 입자를 발생하는 데 사용될 수 있다. 이러한 기술은 종래의 클로닝 기술, 예를 들면 텍스트[Sambrook et al, 상기 인용]에서 설명한 것들, 아데노바이러스 게놈의 중첩 올리고뉴클레오티드 서열의 사용, 중합효소 연쇄반응 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 임의의 적합한 방법을 포함한다. 표준 트랜스팩션 및 공동-트랜스팩션, 예를 들면 CaPO₄ 침전 기술이 도입된다. 도입되는 다른 종래의 방법은 바이러스 게놈의 상동 재조합, 아가 덮개에 바이러스의 플라크형성, 신호 발생을 측정하는 방법 등을 포함한다.

적합한 생산 세포주는 당업자에 의하여 용이하게 선택된다. 예를 들면, 적합한 숙주 세포는 원핵(예를 들면, 박테리아) 세포 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유 동물 세포를 포함한 진핵 세포를 비롯한 임의의 생물학적 개체 중에서 선택될 수 있다. 숙주 세포는, 한정하는 것은 아니지만, 사람, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼 및 햄스터를 포함한 포유동물에서 유래된 A549, WEHI, 3T3, 10T1/2, HEK 293 세포 또는 PERC6(이들 모두 작용성 아데노바이러스 E1을 발현한다)[Fallaux, FJ et al, (1998), Hum Gene Ther, 9: 1909-1917], Saos, C2C12, L 세포, HT1080, HepG2 및 일차 섬유아세포, 간세포 및 근원세포를 포함하는 임의의 포유동물 종에서 선택될 수 있다. 세포를 제공하는 포유동물 종의 선택은 본 발명을 제한하는 것이 아니고; 포유동물 세포의 유형, 즉 섬유아세포, 간세포, 종양세포 등도 아니다.

대체로, 이종 발현 카세트를 포함한 다가 전달 벡터를 트랜스팩션에 의하여 숙주 세포로 전달할 때, 백본은 약 5 ㎍ 내지 약 100 ㎍ DNA, 또는 약 10 내지 약 50 ㎍ DNA의 양으로 약 1 x 10⁴ 세포 내지 약 1 x 10¹³ 세포, 또는 약 10⁵ 세포에 전달된다. 그러나, 숙주 세포에 대한 플라스미드 DNA의 상대적 양은 선택된 벡터, 전달 방법 및 선택된 숙주 세포와 같은 인자들을 고려하여 조절할 수 있다.

통상적으로, 다가 전달 벡터는 캡시드 단백질 및/또는 외피 단백질을 발현하는 숙주 세포에서 배양된다. 숙주 세포에서, 이종 발현 카세트를 발현하는 다가 바이러스 게놈은 구조되고 캡시드 단백질 또는 외피 단백질 내로 패키지되어 감염성 바이러스 바이러스 입자를 형성한다.

A. 캡시드 단백질을 가지는 바이러스 벡터

한 구체예에서, 본 발명은 다가 바이러스 게놈을 감염성 바이러스 캡시드 내 로 패키징하는 방법을 제공한다.

한 구체예에서, 바이러스 캡시드는 아데노바이러스에서 유래된다. 본 발명의 아데노바이러스 입자 또는 벡터는 2개 이상의 이종 발현 카세트를 함유한 다가 바이러스 게놈을 패키지한 감염성 아데노바이러스 단백질 캡시드로 구성되는데, 이들 카세트 각각은 숙주에 발현되는 생성물을 운반한다. 다른 구체예에서, 이러한 아데노바이러스 벡터는 복제-결핍이어서, 숙주 세포에서 복제를 회피한다.

벡터에 존재하는 아데노바이러스 서열의 혈청형의 선택은 본 발명을 제한하는 것이 아니다. 다양한 아데노바이러스 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(버지니아주 마나사스 소재)에서 입수가능하거나, 다양한 상업적 및 기관 공급처로부터 요청에 의하여 입수할 수 있다. 또한, 이러한 많은 균주의 서열은 예를 들면 PubMed^TM 및 GenBank^TM를 포함한 다양한 데이터베이스로부터 입수가능하다. 다른 유인원 또는 사람 아데노바이러스로부터 제조한 동종 아데노바이러스 벡터는 공개된 문헌에 설명된다[예를 들면, 미국 특허 제5,240,846호 참조]. 다수의 아데노바이러스 유형의 DNA 서열은 유형 Ad5[GenBank^TM 기탁번호 M73260]을 포함한 GenBank에서 입수할 수 있다. 아데노바이러스 서열은 혈청형 2, 3, 4, 7, 12 및 40과 같은 임의의 공지된 아데노바이러스 혈청형에서 유래되며, 현재 확인된 사람 유형 중 임의의 것을 더 포함한다. 유사하게 비-사람 동물(예를 들면, 유인원)을 감염시키는 것으로 공지된 아데노바이러스도 본 발명의 벡터 구성체에 도입될 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명에 사용된 아데노바이러스 중 적어도 하나는 비-사람 영장류에서 유래된다. 적합 한 비-사람 영장류 서열의 예는 유인원 아데노바이러스, 예를 들면 Pans(또한 C5), Pan6(또한 C6), Pan7(또한 C7), Pan 9(또한 C68) 및 C1을 포함한다. 분자를 숙주 세포로 전달하기 위한 재조합 아데노바이러스가 설명되었다. 두 침팬지 아데노바이러스, C1 및 C68(Pan 9라고도 함)에서 유래된 아데노바이러스 벡터를 제공하는 미국 특허 제6,083,716호 및 국제 특허공보 WO 02/33645호[Pan 5, Pan6, Pan7-유래 벡터]를 참조하라. 그러나, 본 발명은 그것에 한정되지 않는다.

아데노바이러스 입자에 대한 다양한 생산방법은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 생산방법의 선택이 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 예를 들면, 미국 특허 제6,083,716호; 국제 특허공보 WO 02/33645호; 및 미국 특허출원 제10/465,302호 및 그것의 국제 출원 WO 2005/001103호를 참조하라.

간단히 말하면, 임의의 필수적 아데노바이러스 유전자 생성물(예를 들면, E1a, Elb, E2a, E2b 및/또는 E4 ORF6)의 작용성 버전을 발현하는 능력이 결핍된 본 발명의 다가 아데노바이러스 전달 벡터는 바이러스 감염성 및 아데노바이러스 입자의 증식에 필요한 유실 아데노바이러스 유전자 생성물의 존재하에 배양될 수 있다. 이러한 조력 기능은 하나 이상의 조력 구성체(예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스) 또는 패키징 숙주 세포의 존재하에 백본을 배양함으로써 제공될 수 있다. 예를 들면, 1996년 5월 9일 공개된 국제 특허공보 W096/13597호에 있는 "최소" 사람 아데노바이러스(Ad) 벡터의 제조에 대하여 설명된 기술을 참조하라.

1. 조력 바이러스

따라서, 발현 카세트를 운반하도록 도입되는 다가 전달 벡터의 아데노바이러 스 유전자 함유물에 따라서, 조력 아데노바이러스 또는 비-복제 바이러스 단편은 발현 카세트를 함유하는 감염성 재조합 바이러스 입자를 생산하는 데 필요한 충분한 아데노바이러스 유전자 서열을 제공하기에 충분할 수 있다. 유용한 조력 바이러스는 아데노바이러스 벡터 구성체에 존재하지 않고/거나 벡터가 트랜스팩션되지 않은 패키징된 세포주에 의하여 발현되지 않는 선택된 아데노바이러스 유전자 서열을 함유한다. 한 구체예에서, 조력 바이러스는 복제-결핍이고, 전술한 서열뿐만 아니라 다양한 아데노바이러스 유전자를 함유한다. 이러한 조력 바이러스는 바람직하게는 E1-발현 세포주와 조합하여 사용된다.

또한, 조력 바이러스는 문헌(Wu et al, J Biol. Chem., 264:16985-16987 (1989년); K. J. Fisher and J. M. Wilson, Biochem. J., 299:49 (1994년 4월 1일))에 설명된 폴리-양이온 콘쥬게이트 내에 형성될 수 있다. 조력 바이러스는 선택적으로 두 번째 리포터 발현 카세트를 함유할 수 있다. 다수의 이러한 리포터 유전자는 당업계에 공지되어 있다. 아데노바이러스 벡터에 있는 유전자 생성물과는 다른 조력 바이러스에 있는 리포터 유전자의 존재는 Ad 백본 벡터 및 조력 바이러스 모두가 독립적으로 모니터되게 한다. 이 두 번째 리포터는 정제시 최종 재조합 바이러스와 조력 바이러스 간을 분리시키는 데 사용된다.

2. 상보 세포주

전술한 유전자 중 임의의 것에 결실된 재조합 아데노바이러스(Ad)를 발생시키기 위하여, 바이러스의 복제 및 감염성에 필수적이라면, 결실된 유전자 영역의 기능은 조력 바이러스 또는 세포주, 즉 상보 또는 패키징 세포주에 의하여 재조합 바이러스에 제공되어야 한다. 많은 상황에서, 사람 E1을 발현시키는 세포주는 침팬지 Ad 벡터를 트랜스보충하는 데 사용될 수 있다. 이것은 본 발명의 침팬지 Ad 서열과 현재 사용가능한 패키징 세포에서 발견된 사람 AdE1 서열 사이의 다양성에 기인하여, 현재 사람 E1-함유 세포의 사용은 복제 및 생산 과정 동안 복제 능력이 있는 아데노바이러스의 발생을 방지하기 때문에 특히 유리하다. 그러나, 특정 상황에서, E1 결실된 유인원 아데노바이러스의 생산을 위하여 E1 유전자 생성물을 발현시키는 세포주를 이용하는 것은 바람직할 것이다. 이러한 세포주는 설명되었다. 예를 들면, 미국 특허 제6,083,716호를 참조하라.

원한다면, 본원에 제공된 서열을 이용하여 선택된 모 세포주에서 발현시키기 위한 프로모터의 전사 통제 하에 최소한 아데노바이러스 E1 유전자를 발현시키는 패키징 세포 또는 세포주를 발생시킬 수 있다. 유도성 또는 구성성 프로모터는 이 목적을 위하여 도입될 수 있다. 이러한 프로모터의 예는 본 명세서의 다른 곳에서 상세하게 설명된다. 모 세포는 임의의 바라는 Ad 유전자를 발현시키는 신규한 세포주의 발생을 위하여 선택된다. 한정하는 것은 아니지만, 이러한 모 세포주는 다른 것들 중에서 HeLa [ATCC 기탁번호 CCL 2], A549 [ATCC 기탁번호 CCL 185], HEK 293, KB [CCL 17], Detroit [예를 들면, Detroit 510, CCL 72] 및 WI-38 [CCL 75]일 수 있다. 이들 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(버지니아주 20110-2209 마나사스 유니버시티 블러바드 10801 소재)에서 모두 입수할 수 있다. 다른 적합한 모 세포주는 다른 공급처에서 얻을 수 있다.

이러한 E1-발현 세포주는 재조합 아데노바이러스는 재조합 아데노바이러스 E1 결실 벡터의 발생에 유용하다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명은 하나 이상의 유인원 아데노바이러스 유전자 생성물을 발현시키는 세포주를 제공하는데, 예를 들면 E1a, E1b, E2a 및/또는 E4 ORF6는 필수적으로 재조합 유인원 바이러스 벡터의 발생에 사용하기 위한 동일한 과정을 사용하여 구성될 수 있다. 이러한 세포주는 이들 생성물을 코딩하는 필수 유전자에 결실된 아데노바이러스 벡터을 트랜스보충하는 데 이용될 수 있다. 본 발명에 따라서 숙주 세포의 제조는 선택된 DNA 서열의 어셈블리와 같은 기술을 포함한다. 이 어셈블리는 종래의 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 이러한 기술은 공지되고 상기 인용된 Sambrook et al.,에 설명된 cDNA 및 게놈의 클로닝, 중합효소 연쇄반응으로 결합된 아데노바이러스 게놈의 중첩 올리고뉴클레오티드 서열의 사용, 합성 방법 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 임의의 다른 적합한 방법을 포함한다.

또 다른 대안에서, 필수 아데노바이러스 유전자 생성물은 벡터 및/또는 조력 바이러스에 의하여 trans로 제공된다. 이러한 예에서, 적합한 숙주 세포는 원핵(예를 들면, 박테리아) 세포 및 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포를 포함한 진핵 세포를 비롯한 임의의 생물학적 개체 중에서 선택될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 본원에 확인된 것들뿐만 아니라 당업계에 공지된 것들을 포함한다.

3. 바이러스 입자의 어셈블리 및 세포주의 트랜스팩션

하나 이상의 유실 아데노바이러스 유전자는 숙주 세포의 게놈 내로 안정하게 통합되고, 에피솜으로 안정하게 발현되거나 또는 일시적으로 발현될 수 있다. 유전자 생성물은 모두 에피솜에 일시적으로 발현되거나, 또는 안정하게 통합되거나, 또 는 유전자 생성물 중 일부는 다른 것들이 일시적으로 발현되는 동안 안정하게 발현될 수 있다.

또한, 아데노바이러스 유전자 각각의 프로모터는 구성성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 천연 아데노바이러스 프로모터 중에서 독립적으로 선택될 수 있다. 프로모터는 예를 들면 개체 또는 세포의 특이적 생리학적 상태에 의해서(즉, 분화 상태에 의해서 또는 복제하는 또는 정지한 세포에서) 또는 외생적으로 첨가된 인자에 의해서 조절될 수 있다. 또한, (플라스미드 또는 바이러스)와 같은 분자를 숙주 세포로 도입하는 것은 숙련된 기술자에게 공지된 기술을 사용하여, 그리고 본 명세서 전반에 논의된 바와 같이 달성될 수 있다. 한 구체예에서, 직접 클로닝 기술을 이용한다. 이러한 기술들은 문헌[G. Gao et al, Gene Ther. (2003년 10월); 10 (22):1926-1930; 특허공보 제2003-0092161-A(2003년 5월 15일); 국제 특허출원 PCT/US03/12405]에 설명된다. 다른 구체예에서, 표준 트랜스팩션 기술, 예를 들면 CaPO₄ 트랜스팩션 또는 전기천공법을 사용한다. (생성물 및 다른 벡터 인자를 코딩하는 서열뿐만 아니라) 아데노바이러스의 선택된 DNA 서열의 다양한 중간 플라스미드 내로의 어셈블리 및 재조합 바이러스 입자를 생산하기 위한 플라스미드 및 벡터의 사용은 모두 종래 기술을 사용하여 달성된다. 예를 들면, 원하는 다가 바이러스 벡터의 구성 및 어셈블리 후, 벡터는 조력 바이러스의 존재 하에 시험관 내에서 패키징 세포주 내로 트랜스팩션된다. 상동 재조합은 조력자와 벡터 서열 사이에서 발생하는데, 이로서 벡터에 있는 아데노바이러스-유전자 서열이 복제되고 비리온 캡 시드 내로 패키지되어, 재조합 바이러스 벡터 입자가 된다. 이러한 바이러스 입자를 생산하기 위한 최근 방법은 트랜스팩션에 기초한다. 그러나, 본 발명은 이러한 방법에 제한되지 않는다.

생성된 재조합 아데노바이러스는 선택된 세포에 2개 이상의 선택된 이종 발현 카세트를 전달하는 데 유용하다.

B. 외피 단백질을 가진 바이러스 벡터

다른 구체예에서, 본 발명의 전달 벡터는 바이러스 벡터를 외피 단백질, 예를 들면 렌티바이러스 또는 폭스바이러스를 가진 바이러스의 감염성 입자 내로 패키지하는 데 사용된다. 적합한 렌티바이러스의 예는 예를 들면, 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 염소 관절염 및 뇌염 바이러스, 말 전염성 빈혈 바이러스, 소 면역결핍 바이러스, 비스나 바이러스 및 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)를 포함한다. 본원에 제공된 실시예는 HIV 및 FIV에서 유래된 미니유전자의 사용을 설명한다. 그러나, 사람 또는 비-사람 기원의 다른 렌티바이러스 또한 사용할 수 있다. 본 발명의 구성체에 사용된 서열은 렌티바이러스의 학문적, 비영리(예를 들면, 미국 표준균주, 버지니아주 마나사스 소재) 또는 상업적 공급처에서 얻을 수 있다. 이러한 바이러스 벡터를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법은 설명되어 있다. 예를 들면, 자기 비활성화 레티바이러스 벡터를 사용하여 HIV-1계 렌티바이러스 시스템의 생산을 설명하는 문헌(JE Coleman, et al., Physiol Genomics. 2003 Feb 6;12 (3):221-8)을 참조 하라. 한 실시예에서, 렌티바이러스 벡터는 세포주가 세 별개의 플라스미드 발현 시스템으로 트랜스팩션된 일시적 트랜스팩션 시스템에서 만들어진다. 이들은 본 발명에 따라서 생산되는 전달 벡터 플라스미드를 포함하고, 선택된 렌티바이러스 프로바이러스의 부분 및 이종 발현 카세트, 패키징 플라스미드 또는 구성체 및 동일한 렌티바이러스 또는 상이한 바이러스의 외피 단백질일 수 있는 렌테바이러스 외피 유전자(ENV)를 가진 벡터를 함유한다[Amado and Chen, Lentiviral Vectors-the Promise of Gene Therapy Within Reach? Science. 285 (5428): 674-76 (1999)]. 벡터의 세 가지 플라스미드 성분은 패키징 세포에 넣어지고, 그 후 렌티바이러스 껍질 내로 삽입된다.

한 구체예에서, 전달 벡터 플라스미드는 표적 세포를 감염시키는 벡터 및 치료(또는 리포터) 유전자의 전달에 필요한 시스-작용하는 유전자 서열을 함유하고, 원하는 유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위를 함유한다. 3' 및 5' LTR, 원래의 외피 단백질 및 gag 서열 프로모터는 제거되었다. 패키징 플라스미드는 구조 단백질, HIV 유전자(T 세포의 감염에 대하여 코딩하는 유전자 env를 제외하거나, 또는 벡터는 이들 세포를 감염시킬 수만 있다) 및 벡터 입자를 발생시키는 효소와 같은, 벡터 패키징에 필요한 인자를 함유한다. 통상적으로, 패키징 신호 및 이들 인접 신호가 제거되어, 바이러스 DNA의 패키징에 관여하는 부분들은 이들을 활성화하는 부분들로부터 분리되었다. 따라서, 패키징 서열은 바이러스 게놈 내로 혼입되지 않을 것이며, 바이러스는 숙주 세포를 감염시킨 후 재생하지 않을 것이다.

상이한 바이러스의 세 번째 플라스미드의 외피 유전자는 어떤 유형의 세포가 T 세포 대신에 예를 들면 다른 것들 중에서 VSV, MLV로 알려진 수포성 구내염 바이러스의 당단백질을 표적으로 삼고 감염시키는 지를 열거한다. 보통 HIV는 헬퍼 T 세포들만을 감염시킬 수 있는데, 이들이 CD4 수용체에 결합하는 이들의 gp120 단백질을 사용하기 때문이다. 그러나, CD4 수용체-결합 단백질을 유전자 치료가 수행될 상이한 세포 유형에 대하여 코딩하는 다른 단백질에 대하여 유전학적으로 교환하는 것은 가능하다. 이는 렌티바이러스 벡터에 가능한 표적 세포의 폭넓은 범위를 제공한다. 다른 렌티바이러스 생산방법 및 벡터 인자는 본원에서 참고 인용하는 국제 특허공보 WO 03/092582호에 설명된다.

또 다른 외피 바이러스 벡터는 본 발명의 다가 바이러스 백본 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들면, 문헌 ["The Uses of Poxviruses as Vectors", Current Gene Therapy, vol. 3, no. 6, pp. 583-595 (2003년 11월); M. E. Perkus, et al, "Poxvirus-based vaccine candidates for cancer, AIDS, and other infectious diseases", Journal of Leukocyte Biology, Vol 58, Issue 1 1-13, (1995)]을 참조하라.

III. 다가 바이러스 벡터의 사용

본 발명의 다가 바이러스 벡터는 생리학적으로 양립가능한 캐리어를 함유한 조성물로 제조된다. 이들 조성물은 다양한 치료 및 면역화 섭생에 유용하다. 유리하게, 다가 바이러스 벡터로부터 다중 유전자 생성물의 발현은 원하는 생물학적 효과를 달성하기 위하여 피험체에 전달하는 데 필요한 벡터 또는 다른 약물의 양을 감소시킬 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 다가 바이러스 벡터는 치료 생성물을 운반하는 이종 발현 카세트를 함유한다. 이러한 다가 바이러스 벡터는 하나 이상의 추가적 치료 생성물을 더 운반할 수 있다. 추가적 치료 생성물은 동일한 상태 또는 첫 번째 치료 생성물 또는 상이한 지표와 관련된 징후의 치료에 이용될 수 있다. 원하는 경우, 선택된 치료 유전자 생성물은 전달되어 다가 바이러스 벡터에 임의의 반응을 조절할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 다가 바이러스 벡터는 표적에 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유도하는 생성물을 운반하는 이종 발현 카세트를 함유한다. 이러한 다가 바이러스 벡터는 이러한 하나 이상의 추가적 면역성 생성물을 더 운반할 수 있다. 이 두 번째 생성물은 표적 또는 교차-반응 표적을 유도하도록 이용될 수 있다. 다른 구체예에서, 두 번째 생성물은 근원적 상태와 연관된 징후를 치료하도록 설계된 치료 생성물일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 두 번째 생성물은 다가 바이러스 벡터에 의하여 전달된 다른 유전자 생성물에 대한 보조제일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 두 번째 생성물은 다가 바이러스 벡터에 임의의 반응을 조절하도록 전달되는 치료 생성물이다.

본원에 사용된 면역 조절자는 예를 들면 바이러스 벡터에 면역 시스템의 반응을 변형하는 생성물을 포함한다. 면역 조절자의 예는 예를 들면 사이토킨 및 인터류킨을 포함한다.

본원에 사용된 적합한 면역조절 화합물은 예를 들면 CTLA4 면역글로불린; 항-CD4 항체; FK506; 및 IL1-21, 예를 들면, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12 및 IL- 18 중 임의의 것을 포함한 인터류킨(IL)을 포함한다. 예를 들면, IL-10은 국소 항-염증 반응을 하향 조절하는 데 유용할 수 있고; Fas 리간드는 아데노바이러스 매개 T 세포 반응을 하향 조절하는 데 유용할 수 있다.

본 발명의 다가 바이러스 벡터, 본 발명의 하나 이상의 다가 바이러스 벡터를 함유하는 칵테일 또는 본 발명의 하나 이상의 다가 바이러스 벡터의 전달을 함유하는 섭생에 전달되는 생성물의 또 다른 적합한 조합은 본 명세서로부터 당업자에게 명백할 것이다.

A. 치료 분자의 다가 바이러스 벡터 매개 전달

한 구체예에서, 다가 벡터는 유전자 치료를 위한 공개된 방법에 따라서 사람에게 투여된다. 다중 이종 발현 통제 카세트를 운반하는 바이러스 다가 벡터는 바람직하게는 생물학적으로 양립가능한 용액 또는 약학적으로 허용되는 전달 비히클에 현탁되어 환자에게 투여될 수 있다. 적합한 비히클은 멸균 식염수를 포함한다. 약학적으로 허용되는 캐리어로 공지되고 당업자에게 잘 공지된 다른 수성 및 비-수성 등장성 멸균 주사 용액 및 수성 및 비-수성 멸균 현탁액은 이 목적을 위해서 도입될 수 있다.

다가 벡터는 표적 세포를 형질도입하고, 과도한 부작용 없이 또는 의학적으로 허용되는 생리학적 효과를 가진 치료 이점을 제공하는 유전자 전달 및 발현의 충분한 수준을 제공하기에 충분한 양으로 투여되는데, 이것은 의료 분야에 숙련된 이들에 의하여 결정될 수 있다. 투약의 종래 및 약학적으로 허용되는 경로는, 한정하는 것은 아니지만, 망막으로 직접 전달 및 다른 안구내 전달 방법, 간으로 직접 전달, 흡입, 비강내, 정맥내, 근육내, 기관내, 피하, 경피, 직장, 경구 및 투약의 다른 비경구 경로를 포함한다. 투약의 경로는 유전자 생성물 또는 상태에 따라서 원한다면 조합되거나 또는 조절될 수 있다. 일차적으로 투약의 경로는 치료하고자 하는 상태의 성질에 달려있을 것이다.

바이러스 벡터의 용량은 치료하고자 하는 상태, 연령, 체중 및 환자의 건강과 같은 인자에 일차적으로 의존할 것이며, 따라서 환자들 간에 다양할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 벡터의 치료적으로 유효한 성인 사람 또는 가축의 용량은 대체로 약 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10¹⁵ 입자, 약 1 x 10¹¹ 내지 1 x 10¹³ 입자 또는 약 1 x 10⁹ 내지 1 x 10¹² 입자 바이러스의 농도를 함유한 캐리어의 약 100 μL 내지 약 100 mL의 범위이다. 용량은 동물의 크기 및 투약 경로에 따른 범위일 것이다. 예를 들면, 근육내 주사를 위한 적합한 사람 또는 가축 용량(약 80 kg 동물의 경우)은 단일 부위에 대하여 mL 당 약 1 x 10⁹ 내지 약 5 x 10¹² 입자의 범위이다. 선택적으로, 투약의 복합 부위가 전달될 수 있다. 다른 구체예에서, 적합한 사람 또는 가축의 용량은 경구 제형의 경우 약 1 x 10¹¹ 내지 약 1 x 10¹⁵ 입자의 범위일 수 있다. 당업자는 투약 경로 및 치료적 또는 백신의 사용에 따라서 이들 투여량을 조절할 수 있으며, 이를 위해서 재조합 벡터가 도입된다. 치료적 생성물 또는 멱역원의 발현 수준, 순환하는 항체의 수준을 모니터하여 용량 투약의 빈도를 결정할 수 있다. 그러나, 투약 빈도의 타이밍을 결정하기 위한 다른 방법은 당업자에게 용이하게 명 백할 것이다.

한 구체예에서, 다가 바이러스 벡터는 치료 생성물을 코딩하는 이종 발현 카세트 및 면역 조절자를 코딩하는 이종 발현 카세트를 함유한다. 선택된 면역 조절자는 본 발명의 재조합 벡터에 대하여 향하게 된 중화하는 항체의 형성을 저해할 수 있거나 벡터의 세포용해 T 림프구(CTL) 제거를 저해할 수 있는 인자로 본원에서 정의한다. 면역 조절자는 항체 형성을 중화하는 것을 저해하기 위하여 T세포 서브세트(T_H1 또는 T_H2)와 B 세포 간의 상호작용을 방해할 수 있다. 대안적으로, 면역 조절자는 T 세포와 CTL 간의 상호작용을 저해하여 벡터의 CTL 제거의 발생을 감소시킬 수 있다. 다양한 유용한 면역 조절자 및 동일한 것의 사용을 위한 용량은 예를 들면 문헌(Yang et al., J. Virol., 70(9) (1996년 9월); 국제 특허공보 WO 96/12406호(1996년 5월 2일 공개); 및 국제 특허공보 WO96/26285호에 설명된다.

1. 치료 생성물

이종 발현 카세트에 의하여 코딩되는 유용한 치료 생성물은, 한정하는 것은 아니지만, 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬(GH), 부갑상선 호르몬(PTH), 성장 호르몬 방출 인자(GRF), 여포자극호르몬(FSH), 황체형성호르몬(LH), 사람 융모성생식선자극호르몬(hCG), 혈관내피성장인자(VEGF), 안지오포이에틴, 안지오스타틴, 과립구 콜로니 자극인자(GCSF), 적혈구생성인자(EPO), 연결조직 성장인자(CTGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 산성 섬유아세포 성장인자(aFGF), 표피성장인자(EGF), 변형성 성장인자 α(TGF α), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 인슐린 성장인자 I 및 II(IGF-I 및 IGF-II), TGF, 액티빈, 인히빈을 포함한 변형성 성장인자 상과 중의 임의의 하나, 또는 골형성단백질(BMP) BMP 1-15 중의 임의의 것, 성장인자의 헤레글루인/노이레글루인/ARIA/노이 분화 인자(NDF) 패밀리, 신경성장인자(NGF), 뇌 유래 향신경성 인자(BDNF), 뉴로트로핀 NT-3 및 NT-4/5, 섬모 향신경성 인자(CNTF), 신경아교세포주-유래 향신경성 인자(GDNF), 노이투린, 아그린, 세마포린/콜랩신의 패밀리 중 임의의 하나, 네트린-1 및 네트린-2, 간세포 성장인자(HGF), 에프린, 노긴, 소닉 헤지혹 및 티로신 히드록시라제를 포함하는 호르몬 및 성장인자 및 분화인자를 포함한다.

다른 유용한 유전자 생성물은, 한정하는 것은 아니지만, 혈소판생성인자(TPO), IL-25를 통한 인터류킨(IL) IL-1(예를 들면, IL-2, IL-4, IL-12 및 IL-18을 포함), 단핵구 화학유인물질 단백질, 백혈병 억제인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극인자, Fas 리간드, 종양 괴사 인자 및 인터페론 및 줄기세포인자, flk-2/flt3 리간드와 같은 사이토카인 및 림포카인을 포함한 면역 시스템을 조절하는 단백질을 포함한다. 또한 면역 시스템에 의하여 생산되는 유전자 생성물들은 본 발명에 유용하다. 이들은, 한정하는 것은 아니지만, 조작된 면역글로불린 및 MHC 분자뿐만 아니라 면역글로불린 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 키메라 면역글로불린, 사람화된 항체, 단일 사슬 항체, T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 단일 사슬 T 세포 수용체, 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자를 포함한다. 또한, 유용한 유전자 생성물은 보체 조절 단백질, 예를 들면 보체 조절 단백질, 막 보조인자 단백질(MCP), 부패가속화인자(DAF), CR1, CF2 및 CD59를 포함한다.

또 다른 유용한 유전자 생성물은 호르몬에 대한 수용체, 성장인자, 사이토카인, 림포카인, 조절 단백질 및 면역 시스템 단백질 중 임의의 하나를 포함한다. 본 발명은 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체, 고밀도 지질단백질(HDL) 수용체, 초저밀도 지질단백질(VLDL) 수용체 및 스캐빈저 수용체를 포함한, 콜레스테롤 조절을 위한 수용체를 포함한다. 또한, 본 발명은 글루코코르티코이드 수용체 및 에스트로겐 수용체, 비타민 D 수용체 및 다른 핵안의 수용체를 포함한 스테로이드 호르몬 수용체 상과의 멤버와 같은 유전자 생성물을 포함한다. 또한, 유용한 유전자 생성물은 전사인자, 예를 들면 jun, fos, max, mad, 혈청 반응 인자(SRF), AP-1, AP2, myb, MyoD 및 미오게닌, ETS-박스 함유 단백질, TFE3, E2F, ATF1, ATF2, ATF3, ATF4, ZF5, NFAT, CREB, HNF-4, C/EBP, SP1, CCAAT-박스 결합 단백질, 인터페론 조절 인자(IRF-1), 윌름 종양 단백질, ETS-결합 단백질, STAT, GATA-박스 결합 단백질, 예를 들면 GATA-3 및 날개있는 나선 단백질의 포크헤드 패밀리를 포함한다.

다른 유용한 유전자 생성물은 카바모일 합성효소 I, 오르니틴 트랜스카바밀라제, 아르기노숙신산 합성효소, 아르기노숙신산 리아제, 아르기나제, 푸마릴아세트아세테이트 가수분해효소, 페닐알라닌 수산화효소, 알파-1 항트립신, 글루코스-6-포스파타제, 포르포빌리노겐 디아미나제, 인자 VIII, 인자 IX, 시스타티온 베타-합성효소, 분지 사슬 케토산 디카르복실라제, 알부민, 이소발레릴-coA 탈수소효소, 프로피오닐 CoA 카르복실라제, 메틸 말로닐 CoA 뮤타제, 글루타릴 CoA 탈수소효소, 인슐린, 베타-글루코시다제, 피루브산 카르복실레이트, 간 포스포릴라제, 포스포릴라제 키나제, 글리신 디카르복실라제, H-단백질, T-단백질, 낭성 섬유증 막 조절 자(CFTR) 서열 및 디스토로핀 cDNA 서열을 포함한다.

다른 유용한 유전자 생성물은 비-자연적으로 발생하는 폴리펩티드, 예를 들면 삽입, 결실 또는 아미노산 치환을 함유한 비-자연적으로 발생하는 아미노산 서열을 가진 키메라 또는 하이브리드 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 단일 사슬 조작된 면역글로불린은 특정 면역이감염성 환자에게 유용할 수 있다. 비-자연적으로 발생한 유전자 서열 중 다른 유형은 안티센스 분자 및 리보자임과 같은 촉매 핵산을 포함하는데, 이들은 표적의 과발현을 감소시키는 데 사용될 수 있다. 유전자 발현의 감소 및/또는 조절은 암 및 건선과 같이 과증식 세포의 특징이 있는 과증식 상태의 치료에 특히 바람직하다. 표적 폴리펩티드는 정상 세포에 비교해서 과증식 세포에서 배타적으로 또는 고 수준으로 생산되는 폴리펩티드를 포함한다. 표적 항원은 암유전자, 예를 들면 myb, myc, fyn 및 전좌 유전자 bcr/abl, ras, src, P53, neu, trk 및 EGRF에 의하여 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 표적 항원과 같은 암유전자 생성물뿐만 아니라, 항-암 치료 및 보호 섭생을 위한 표적 폴리펩티드는 B 세포 림프종에 의하여 만들어지는 항체의 가변 영역 및 T 세포 림프종의 T 세포 수용체의 가변 영역을 포함하는데, 일부 구체예에서 이들은 자가면역 질환을 위한 표적 항원으로도 사용된다. 다른 종양 연관 폴리펩티드는 모노클론 항체 17-1A 및 엽산 결합 폴리펩티드에 의하여 인식되는 폴리펩티드를 포함하는 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발견되는 폴리펩티드와 같은 표적 폴리펩티드로 사용될 수 있다.

다른 적합한 치료 폴리펩티드는 자기-유도 항체를 생산하는 세포 수용체 및 세포를 포함하는 자가면역과 연관된 표적에 대하여 광범위 기초 보호 면역반응을 부여함으로써 자가면역 질환 및 장애로 고생하는 개체를 치료하는 데 유용할 수 있다. T 세포 매개 자가면역 질환은 류마티스 관절염(RA), 다발성 경화증(MS), 쇼그렌증후군, 유육종증, 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM), 자가면역성 갑상선염, 반응성 관절염, 강직성 척추염, 경피증, 다발성근염, 피부근염, 건선, 혈관염, 베게너육아종증, 코론씨병 및 궤양성 대장염을 포함한다. 이 각각의 질환은 내인성 항원에 결합하고 자가면역 질환과 연관된 염증 연속단계를 개시하는 T 세포 수용체(TCR)에 의하여 특성화된다.

본 발명의 다가 바이러스 벡터는 유전자 생성물의 다중 바이러스 매개 전달이 필요한 치료 섭생, 예를 들면 동일한 생성물의 재전달을 포함한 섭생 또는 다른 유전자 생성물의 전달을 포함한 조합 섭생에서 특히 잘 맞는다.

B. 면역성 유전자 생성물의 다가 바이러스 매개 전달

또한, 본 발명의 다가 바이러스 벡터는 면역 조성물로 도입될 수 있다. 본원에 사용된 면역 조성물은 체액성(예를 들면, 항체) 또는 세포성(예를 들면, 세포독성 T 세포) 반응이 면역 조성물에 의하여 전달된 생성물에 탑재된 후 포유동물, 바람직하게는 영장류에 전달되는 조성물이다. 본 발명은 다가 바이러스 벡터의 아데노바이러스 서열 중 임의의 것에 원하는 면역원을 코딩하는 첫 번째 이종 발현 카세트의 결실을 함유할 수 있는 다가 바이러스 벡터를 제공한다. 다가 바이러스 벡터는 면역원을 위한 보조제, 추가적 면역성 생성물, 치료 생성물 또는 다가 바이러스 벡터에 대한 면역반응을 하향조절하는 생성물을 코딩하는 이종 발현 카세트를 더 포함할 수 있다.

다가 바이러스 벡터는, 이러한 사용에 한정된 것은 아니지만, 사람 기원의 아데노바이러스에 비해서 다른 동물 종에서 살아있는 재조합 바이러스 백신으로 사용하기에 적합한 다가 아데노바이러스 벡터이다. 재조합 다가 바이러스는 임의의 병원체에 대하여 예방 또는 치료 백신으로 사용될 수 있는데, 이 때문에 면역 반응의 유도에 결정적이고 병원체의 확산을 제한할 수 있는 항원(들)이 동정되었으며 cDNA가 입수가능하다.

이러한 백신(또는 다른 면역성) 조성물은 전술한 바와 같이 적합한 전달 비히클로 제조된다. 일반적으로, 면역성 조성물의 용량은 치료 조성물에 대하여 상기 한정한 범위이다. 선택된 유전자의 면역 수준은 있다면 추가의 필요성을 결정하기 위하여 모니터될 수 있다. 혈청에서 항체 적정의 평가 후, 선택적 추가 면역화가 필요할 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 백신 조성물은 예를 들면 보조제, 안정제, pH 조절제, 방부제 등을 포함한 다른 성분을 함유하도록 제조될 수 있다. 이러한 성분은 백신 분야의 기술자들에게 잘 공지되어 있다. 적합한 보조제의 예는, 한정하는 것은 아니지만, 리포솜, 백반, 모노포스포릴 지질 A 및 임의의 생물학적 활성 인자, 예를 들면 사이토카인, 인터류킨, 케모카인, 리간드 및 선택적으로 이들의 조합을 포함한다. 이들의 생물학적 활성 인자 중 임의의 것은 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 통하여 생체 내에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 이러한 보조제는 항원을 코딩하는 시동 DNA 백신과 함께 투여되어 항원만을 코딩하는 DNA 백신으로 시동했을 때 발생하는 면역 반응에 비해서 항원-특이적 면역 반응을 증진시킬 수 있다.

다가 바이러스 벡터는 "면역성 양"으로 투여되는데, 즉 다가 바이러스 벡터의 양은 원하는 세포를 트랜스팩션하고, 면역 반응을 유도하기 위하여 선택된 유전자의 발현의 충분한 수준을 제공하는 투여의 경로에서 효과적이다. 보호 면역이 제공되는 곳에서, 다가 바이러스 벡터는 감염 및/또는 재발 질환을 예방하는 데 유용한 백신인 것으로 간주된다.

대안적으로, 또는 첨가해서, 본 발명의 벡터는 선택된 면역원에 면역 반응을 유도하는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 함유할 수 있다. 본 발명의 다가 아데노바이러스 벡터는 벡터에 의하여 발현된 삽입된 이종 항원성 단백질에 대하여 세포용해 T 세포 및 항체를 유도하는 데 높은 효능이 있는 것으로 예상된다.

예를 들면, 면역원은 다양한 바이러스 과 중에서 선택될 수 있다. 면역 반응이 바람직한 바이러스 과의 예는 일반적 감기 상태의 약 50%를 차지하는 리노바이러스 속; 폴리오바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스 및 간염 A 바이러스와 같은 사람 장내바이러스를 포함하는 장내바이러스 속; 및 일차적으로 비-사람 동물에서 발 및 입 질환에 관여하는 앱토바이러스 속을 포함하는 피코르나바이러스 과를 포함한다. 바이러스의 피코르나바이러스 과 내에, 표적 항원은 VP1, VP2, VP3, VP4 및 VPG를 포함한다. 다른 바이러스 과는 유행성 위장염의 중요한 원인 인자인 바이러스의 노르워크 그룹을 포함하는 칼시바이러스를 포함한다. 사람 및 비-사람 동물에 면역 반응을 유도하기 위한 항원을 표적화하는 데 사용하기에 바람직한 또 다른 바이러스 과는 신드비스 바이러스, 로스리버 바이러스, 및 베네수엘란, 동 & 서 말 뇌염 및 루벨라바이러스를 포함한 루비라이러스를 포함한 알파바이러스 속을 포함하는 토가바이러스 과이다. 플라비바이러스 과는 뎅기열, 황열, 일본 뇌염, 성 루이스 뇌염 및 진드기 매개 뇌염 바이러스를 포함한다. 다른 표적 항원은 C형 간염[예를 들면, 미국 공개 특허출원 US 2003/190606호(2003년 10월 9일); US 2002/081568호(2002년 6월 27일)를 참조] 또는 다수의 비-사람 바이러스, 예를 들면 점염성 기관지염 바이러스(가금), 돼지 전달가능한 위소장 바이러스(돼지), 돼지 혈구응집성 뇌염바이러스(돼지), 고양이 전염성 복막염 바이러스(고양이), 고양이 장관 코로나바이러스(고양이), 개과 코로나바이러스(개)를 포함하는 코로나바이러스 및 일반 감기 및/또는 비-A형, B형 또는 C형 간염 및 돌연 급성 호흡 증후군(SARS)의 후보 원인 인자를 야기시킬 수 있는 사람 호흡 코로나바이러스에서 발생할 수 있다. 코로나바이러스 과 내에서, 표적 항원은 El(M 또는 매트릭스 단백질이라고도 함), E2(S 또는 스파이크 단백질이라고도 함), E3(HE 또는 혈구응집-엘터로스라고도 함) 당단백질(모든 코로나바이러스에 존재하지 않음) 또는 N(뉴클레오캡시드)을 포함한다. 또 다른 항원은 베시큘로바이러스 속(예를 들면, 수포성 구내염 바이러스) 및 리사바이러스 속(예를 들면, 광견병)을 포함한 랍도바이러스 과에 대하여 표적화될 수 있다. 랍도바이러스 과 내에, 적합한 항원은 G 단백질 또는 N 단백질에서 유래될 수 있다. 마버그 및 에볼라 바이러스와 같은 출혈열 바이러스를 포함하는 필로바이러스 과는 항원의 적합한 공급원이 될 수 있다. 파라믹소 바이러스 과는 1형 파라인플루엔자 바이러스, 3형 파라인플루엔자 바이러스, 3형 소 파라인플루엔자 바이러스, 루불라바이러스(유행성 이하선염 바이러스), 2형 파라인플루 엔자 바이러스, 4형 파라인플루엔자 바이러스, 뉴캐슬 질환 바이러스(닭), 우역, 홍역 및 개 홍역을 포함한 모르비리바이러스, 및 호흡기 세포융합 바이러스를 포함한 뉴모바이러스를 포함한다. 인플루엔자 바이러스는 오르토믹소바이러스 과 내로 분류되며, 항원(예를 들면, HA 단백질, N1 단백질)의 적합한 공급원이다. 분야바이러스 과는 분야바이러스 속(캘리포니아 뇌염, 라 크로스), 플레보바이러스(리프트벨리열), 한타바이러스(프레말라는 헤마하긴 열 바이러스임), 나이로바이러스(나이로비 양 질환) 및 다양한 할당되지 않은 분가바이러스를 포함한다. 아레나바이러스 과는 NCM 및 라사열 바이러스에 대한 항원의 공급원을 제공한다. 레오바이러스 과는 레오바이러스 속, 로타바이러스(아이들의 급성 위장염을 야기함), 오르비바이러스 및 컬티바이러스(콜로라도 진드기열, 레봄보(사람), 말 뇌증, 청설병)를 포함한다.

레트로바이러스 과는 고양이 백혈병 바이러스, HTLVI 및 HTLVII, 렌티바이러스(사람 면역결핍 바이러스(HIV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 말 전염성 빈혈 바이러스 및 스푸마바이러스를 포함)와 같은 사람 및 가축 질환을 포함한 온코리바이러스 아과를 포함한다. 렌티바이러스 중에서, 많은 적합한 항원이 설명되었으며, 용이하게 선택될 수 있다. 적합한 HIV 및 SIV 항원의 예는, 한정하는 것은 아니지만, gag, pol, Vif, Vpx, VPR, Env, Tat, Nef 및 Rev 단백질뿐만 아니라 다양한 이들의 단편을 포함한다. 예를 들면, Env 단백질의 적합한 단편은 이들의 서브유닛, 예를 들면 gp 120, gp 160, gp41 또는 예를 들면 길이가 8개 이상의 아미노산의 이들의 더 작은 단편 중의 임의의 것을 포함할 수 있다. 유사하게, tat 단백질의 단편은 선택될 수 있다. [미국 특허 제5,891,994호 및 미국 특허 제6,193,981호 참조]. 또한, 문헌[D.H. Barouch et al, J. Virol., 75(5):2462-2467 (2001년 3월) 및 R.R. Amara, et al, Science, 292: 69-74 (2001년 4월 6일)]에 기재된 HIV 및 SIV 단백질을 참조하라. 다른 실시예에서, HIV 및/또는 SIV 면역성 단백질 또는 펩티드는 융합 단백질 또는 다른 면역성 분자를 형성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 국제 특허공보 WO 01/54719호(2001년 8월 2일 공개) 및 국제 특허공보 WO 99/16884호(1999년 4월 8일 공개)에 기재된 HIV-1 Tat 및/또는 Nef 융합 단백질 및 면역화 섭생을 참조하라. 또한, 이들 단백질에 대한 다양한 변형은 설명되었거나 당업자에 의하여 용이하게 만들어질 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,972,596호에 기재된 변형된 gag 단백질을 참조하라. 또한, 임의의 원하는 HIV 및/또는 SIV 면역원은 단독으로 또는 조합하여 전달될 수 있다. 이러한 조합은 단일 벡터 또는 다중 벡터로부터의 발현을 포함할 수 있다.

선택적으로, 다른 조합은 단백질 형태에서 하나 이상의 면역원의 전달과 함께 하나 이상의 발현된 면역원의 전달을 포함할 수 있다. 이러한 조합은 하기에서 더 상세하게 논의된다. 파포바바이러스 과는 폴리오마바이러스 아과(BKU 및 JCU 바이러스) 및 (암 또는 유두종의 악성 진행과 연관된) 유두종바이러스 아과를 포함한다. 예를 들면, 유두종바이러스 항원 및 이들의 조합은 설명되었다. 예를 들면, 미국 출원공개 제2003/129199호(2003년 7월 10일); 미국 출원공개 제2002/18221호(2002년 12월 15일); 미국 특허 제6,342,224호를 참조하라.

아데노바이러스 과는 호흡 질환 및/또는 장염을 야기하는 바이러스(EX, AD7, ARD, O.B.)를 포함한다. 파보바이러스 과는 고양이 파보바이러스(고양이 장염), 고양이 판류코페니아바이러스, 개 파보바이러스 및 돼지 파보바이러스를 포함한다. 헤르페스바이러스 과는 단순포진 바이러스 속(HSVI, HSVII), 바리셀로바이러스(가성광견병, 수두-대상포진)을 포함하는 알파헤르페스바이러스 아과 및 사이토메갈로바이러스 속(HCMV, 무로메갈로바이러스)을 포함하는 베타헤르페스바이러스 아과 및 림포크립토바이러스 속, EBV(버키트 림프종), 전염성 비기관염, 머레크병 바이러스 및 랍디노바이러스를 포함하는 감마헤르페스바이러스 아과를 포함한다. 폭스바이러스 과는 오르토폭스바이러스 속(바리올라(천연두) 및 백시니아(우두)), 파라폭스바이러스, 아비폭스바이러스, 카프리폭스바이러스, 레포리폭스바이러스, 수이폭스바이러스를 포함하는 코르도폭스바이러스 아과 및 엔토모폭스바이러스 아과를 포함한다. 헤파드나바이러스 과는 B형 간염 바이러스를 포함한다. 항원의 적합한 공급원일 수 있는 한 미분류된 바이러스는 간염 델타 바이러스이다. 또 다른 바이러스 공급원은 조류 전염성 F 낭병 바이러스 및 돼지 호흡 및 생식 증후군 바이러스를 포함할 수 있다. 알파바이러스 과는 말 동맥염 바이러스 및 다양한 뇌염 바이러스를 포함한다.

또한, 본 발명은 박테리아, 균류, 기생 미생물 또는 사람 및 비-사람 척추동물을 감염시키는 다세포 기생충을 포함한 다른 병원체에 대하여 또는 암 세포 또는 종양 세포로부터 사람 또는 비-사람 동물을 면역화하는 데 유용한 면역원을 포함할 수 있다. 박테리아 병원체의 예로서, 병원성 그램-양성 구균은 뉴모코시(pneumococci); 포도상구균(staphylococci); 및 연쇄상구균(streptococci)을 포 함한다. 병원성 그램-음성 구균은 수막염균(meningococcus); 임균(gonococcus)을 포함한다. 병원성 장내 그램-음성 간균은 장내세균(enterobacteriaceae); 슈도모나스(pseudomonas), 아씨네토박테리아(acinetobacteria) 및 에이케넬라(eikenella); 유비저(melioidosis); 살모넬라(salmonella); 시겔라(shigella); 헤모필루스(haemophilus); 모락셀라(moraxella); H. 두크레이(H. ducreyi)(연성하감을 야기); 브루셀라(brucella); 프라니셀라 툴라렌시스(Franisella tularensis)(야토병을 야기); 에르시니아(yersinia)(페스트균); 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(streptobacillus moniliformis) 및 나선균(spirillum)을 포함하고; 그램-양성 간균은 리스테리아 모노사이토제네스(listeria monocytogenes); 돈단독균(erysipelothrix rhusiopathiae); 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria)(디프테리아); 콜레라; B. 안트라시스(B. anthracis)(탄저병); 도노바노시스(donovanosis)(서혜부육아종); 및 바르토넬로시스(bartonellosis)를 포함한다. 병원성 혐기성 박테리아에 의하여 야기되는 질환은 파상풍; 보툴리누스 중독; 다른 클로스트리디아; 결핵; 나병; 및 다른 마이코박테리아를 포함한다. 병원성 스피로헤타 질환은 매독(syphilis); 트레포네마증(treponematoses): 매종(yaws), 열대백반성피부병(pinta) 및 풍토병성 매독; 및 렙토스피라증(leptospirosis)을 포함한다. 상위 병원체 박테리아 및 병원성 균류에 의하여 야기되는 다른 감염들은 방선균증(actinomycosis); 노카르디아증(nocardiosis); 크립토코쿠스증(cryptococcosis), 분아균증(blastomycosis), 히스토플라스마증(histoplasmosis) 및 콕시디오이데스진균증(coccidioidomycosis); 칸디다증(candidiasis), 아스페르 길루스증(aspergillosis) 및 털곰팡이증(mucormycosis); 포자성모발증(sporotrichosis); 파라콕시디오도미코시스(paracoccidiodomycosis), 페트리엘리디오시스(petriellidiosis), 토룰롭시스(torulopsosis), 균종(mycetoma) 및 색소진균증(chromomycosis); 및 피부사상균증(dermatophytosis)을 포함한다. 리켓치아성 감염은 발진티푸스(Typhus fever), 로키산 홍반열(Rocky Mountain spotted fever), Q 열 및 리켓치아성 두창(Rickettsialpox)을 포함한다. 미코플라스마 및 클라미디아 감염의 예는 폐렴미코플라스마(mycoplasma pneumoniae); 성병성 림프육아종(lymphogranuloma venereum); 앵무병(psittacosis); 및 주생기의 클라미디아성 감염을 포함한다. 병원성 진핵세포는 병원성 원충 및 연충을 포함하고, 이들에 의하여 생성된 감염은 아메바증(amebiasis); 말라리아; 리슈만편모충증 (leishmaniasis); 트리파노소마증(trypanosomiasis); 주혈 원충병(toxoplasmosis); 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii); 트리찬스(Trichans); 톡소포자충(Toxoplasma gondii); 바베시아증(babesiosis); 지알디아증(giardiasis); 섬모충병(trichinosis); 필라리아증(filariasis); 주혈흡충증(schistosomiasis); 선충(nematodes); 흡충류(trematodes) 또는 흡충(fluke); 및 촌충류(cestode)(조충) 감염을 포함한다.

많은 수의 이러한 생물 및/또는 이들에 의하여 생성된 독소는 생물학적 공격에 사용하기 위한 잠재력을 가진 제제로서, 질병 대책 센터[(CDC), 미국 보건복지부]에 의해서 확인되었다. 예를 들면, 이러한 생물학적 제제의 일부는 탄저균(Bacillus anthracis)(탄저병), 클로트리디움 보툴리누스균(Clostridium botulinum) 및 이것의 독소(보툴리누스 중독), 에르시니아 페스트균(Yersinia pestis)(역병), 대두창(variola major)(천연두), 프랜시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)(야토병), 및 바이러스성 출혈열[필로바이러스(예를 들면, 에볼라, 마르버그)], 및 아레나바이러스[예를 들면, 라사, 마추포])을 포함하는데, 이들 모두는 현재 카테고리 A 제제로 분류되고; 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetti)(Q 열병); 브루셀라 종(브루셀라증), 버크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei)(마비저), 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei)(멜리오이도증), 리시누스 코뮤니스(Ricinus communis) 및 그것의 독소(리신 독소), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 및 그것의 독소(엡실론 독소), 포도상구균(Staphylococcus) 종 및 이들의 독소(엔테로톡신 B), 클라미디아 시타시(Chlamydia psittaci)(앵무병), 물 안전 위협(예를 들면, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 크리토스포리디움 파르붐(Crytosporidium parvum)), 발진티푸스(리켓치아 포와제키(Richettsia powazekii)) 및 바이러스성 뇌염(알파바이러스, 예를 들면 베네수엘라 말 뇌염; 동부 말 뇌염; 서부 말 뇌염)을 포함하는데, 이들 모두는 현재 카테고리 B 제제로 분류되며; 현재 카테고리 C 제제로 분류되는 니판 바이러스 및 한타바이러스를 포함한다. 또한, 동일하게 분류되거나 또는 상이하게 분류된 다른 생물들은 장래에 이러한 목적을 위하여 확인 및/또는 사용될 수 있다. 본원에 설명된 바이러스 벡터 및 다른 구성체는 이들 생물, 바이러스 이들의 독소 또는 다른 부산물로부터 항원을 전달하기에 유용하며, 이들은 감염 또는 이들 생물학적 제제와의 다른 역반응을 예방 및/또는 치료할 것이라는 것을 쉽게 이해할 것이다.

면역원을 T 세포의 가변 영역에 대하여 전달하기 위한 본 발명의 벡터의 투여는 세포독성 T 림프구(CTL)를 포함한 면역 반응을 유도하여 이들 T 세포를 제거한다. 류마티즘성 관절염(RA)에서, 질환에 관련된 T 세포 수용체(TCR)의 일부 특이적 가변 영역이 특성화되었다. 이들 TCR은 V-3, V-14, V-17 및 Vα-17을 포함한다. 따라서, 이들 폴리펩티드 중 적어도 하나를 코딩하는 핵산 서열의 전달은 RA에 관련된 T 세포를 표적화하는 면역반응을 유도할 것이다. 다발성 경화증(MS)에서, 질환에 관련된 TCR의 일부 특이적 가변 영역이 특성화되었다. 이들 TCR은 V-7 및 Vα-10을 포함한다. 따라서, 이들 폴리펩티드 중 적어도 하나를 코딩하는 핵산 서열의 전달은 MS에 관련된 T 세포를 표적화하는 면역반응을 유도할 것이다. 경피증에서, 질환에 관련된 TCR의 일부 특이적 가변 영역이 특성화되었다. 이들 TCR은 V-6, V-8, V-14 및 Vα-16, Vα-3C, Vα-7, Vα-14, Vα-15, Vα-16, Vα-28 및 Vα-12를 포함한다. 따라서, 이들 폴리펩티드 중 적어도 하나를 코딩하는 재조합 유인원 아네노바이러스의 전달은 경피증에 관련된 T 세포를 표적화하는 면역반응을 유도할 것이다.

하기 실시예는 다가 아데노바이러스의 클로닝 및 본 발명의 대표적 다가 아데노바이러스 벡터의 구성을 설명한다. 이들 실시예는 오직 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다.

도 1 및 2에서 도시된 바와 같이, 침팬지 아데노바이러스 Pan9 기제 벡터는 본 발명에 따라서 다가 전달 벡터로 구성된다.

A. 이동가능한 카세트를 가진 DNA 분자의 구성

도 1과 관련하여, Pan9 E1 유전자 영역, 소 성장 호르몬 폴리A 및 부분적 E3-결실의 부위에 돌연변이 녹색 형광 단백질 마커(GFP) 카세트를 가진, 침팬지 아데노바이러스 Pan9 바이러스 게놈을 운반하는 플라스미드 백본이 선택되었다. 이들 플라스미드는 국제 특허공보 WO 2003/046124호에 더 상세하게 설명된다.

pPan9-pkGFP는 AvrII(도 1A)로 분해하여 pSL1180[Pharmacia로부터 시중 구입] 내로 클로닝된 Pan 9의 E3 영역을 제거하고, 앰피실린 저항성 유전자를 함유한 pSL1180-Pan9-Avr(II)을 형성한다.

플라스미드 RSV-Red2는 RSV 프로모터, AsRed2 생성물을 유도하는 lac 프로모터(Lac-AsRed2)를 포함하는데, 이들은 I-SceI 및 PI-PspI 부위 양쪽에 인접해 있고, SV40 폴리A가 그 뒤에 있다. 이 pRSV-Red2 플라스미드는 RSV 프로모터를 pUC19 및 pkRFP(Clontech)로부터 구성된 플라스미드 내로 클로닝함으로써 구성되었다. pSL1180-Pan9-Avr(II) 플라스미드는 Nrul로 분해되어(도 1B) Pan9 E3 단편을 방출하고, pRSV-Red2는 PvuII 및 HpaI로 분해되어(도 1C) I-SceI-RSV-lac-AsRed2-PI-SceI 카세트를 방출하고 재리게이션되어 플라스미드 SL1180-Pan9-Avr(II)pkRFP를 형성하였으며, 이것은 앰피실린 저항성 유전자 및 E3 영역 부위에 I-SceI-RSV-lac-AsRed2-PI-SceI 카세트를 함유한다.

또한, E3 영역에 결실이 있는 Pan9 바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드(도 1D)는 전술한 pPan9-pkGFP의 AvrII 분해로부터 기인하며; 재리게이션 후, 최종 플 라스미드를 pPan9-pkGFP-Avr(II)라고 부른다. 이 플라스미드 및 pSL1180-Pan9-Avr(II)pkRFP 플라스미드를 AvrII으로 분해하고(도 1E) 재리게이션하여 E1 유전자좌에 GFP 리포터 유전자 및 E3 유전자좌에 RFP 리포터 유전자를 함유하는 단일 플라스미드를 형성한다. 최종 플라스미드를 pPan9-(El)-pkGFP-(E3)pkRFP라고 부른다. 노란색을 발현하는 콜로니를 선택함으로써, 녹색 및 적색 형광 단백질 모두를 발현하는 벡터를 선택한다.

이 설계는 항원 발현 카세트에서 용이한 왕복 및 재조합의 편리한 색깔 기반 콜로니 선택을 가능케 하며, 고 처리율 벡터 제조에 적합할 것이다.

B. 다가 전달 벡터의 구성

본 발명의 다가 전달 벡터를 구성하기 위하여, 첫 번째 선택된 이종 발현 카세트를 셔틀 벡터의 적합한 부위 내에 클로닝한다.

도 2와 관련하여, 이는 "안티젠(antigene) 1"을 다중 클로닝 부위를 가진 플라스미드 내에 클로닝하고, 상기 부분 A에 따라서 생성된 DNA 분자의 원하는 영역에 있는 것들에 상응하는 제한효소 부위 양쪽에 인접해 있는, 즉 I-Ceul 및 PI-SceI 부위 양쪽에 인접해 있는 부위를 선택하는 것을 설명한다.

두 번째 이종 발현 카세트(안티젠 2)는 I-SceI 부위 사이에 적합한 벡터 (예를 들면, pUC19-RSV) 내로 클로닝된다.

적합한 효소로 분해한 후, 원하는 이종 발현 카세트를 함유한 벡터를 발색 수단에 의하여 선택할 수 있다. 보다 특히, 빛의 적합한 파장으로 흥분시 적색을 나타내는 콜로니는 GFP를 함유하는 이동가능한 카세트는 안티젠 1로 대체되지만, RFP를 함유하는 이동가능한 카세트는 유지되는 벡터의 존재를 나타낸다. 빛의 적합한 파장으로 흥분시 녹색을 나타내는 콜로니는 RFP를 함유하는 이동가능한 카세트는 안티젠 1로 대체되지만, GFP를 함유하는 이동가능한 카세트는 유지되는 벡터의 존재를 나타낸다. GFP 및 RFP에 대하여 적합한 파장의 빛으로 흥분시킨 후 흰색을 나타내는 콜로니는 두 이동가능한 카세트가 이종 발현 카세트로 대체된 벡터를 나타낸다. 따라서, 흰색 콜로니를 선택함으로써, 본 발명의 다가 전달 벡터를 신속하고 정확하게 선택할 수 있다.

C. 항원 발현시 트렌스젠 카세트의 위치(E1 또는 E3) 및 배향의 영향의 연구

동일한 CMV-hAIAT 발현 카세트를 El-결실 Pan9(C9이라고도 함)의 E1 유전자좌 및 El/E3-결실 C9 벡터의 E3 유전자좌 내에 별개로 클로닝하였다. 상이한 유전자좌로부터 A1AT를 발현하는 재조합 C9을 생산하여 C57BL/6 마우스 내에 1 x 10¹¹ pts/마우스의 용량으로 정맥내 주사하였다. 동물을 유전자 전달 후 3일 및 7일에 출혈시키고, 비교를 위하여 혈청 hA1AT 수준을 측정하였다. 데이터는 E3 유전자좌에서 발현된 hA1AT가 E1 유전자좌의 것보다 실질적으로 2배 이상 더 높다는 것을 나타내었다. 도 3을 참조하라.

본 발명의 클로닝 과정은 모노- 또는 다가 벡터의 재조합에 대한 편리한 이중 색깔 선택 시스템을 가진다. 또한, 이 데이터는 유인원 아데노바이러스 벡터에서 트랜스젠 발현에 대한 음성 유전자좌 의존적 효과가 없다는 것을 입증한다.

이 명세서에 인용된 모든 공보 및 서열 목록은 본원에 참고 인용된다. 본 발 명이 특정 구체예에 관련하여 설명되는 동안, 본 발명의 사상을 떠나지 않고 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구의 범위의 범주 내에 있도록 의도된다.

Claims

(a) 바이러스 게놈의 첫 번째 유전자좌에 위치하고, 그것의 발현을 지시하는 서열에 작동가능하게 연결된 첫 번째 검출가능한 리포터 유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하며, 두 개의 희소 제한효소 부위로 구성된 희소 제한효소 부위 중 첫 번째 세트 양쪽에 인접해 있는 첫 번째 이동가능한 카세트; 및

(b) 바이러스 게놈의 두 번째 유전자좌에 위치하고, 그것의 발현을 지시하는 서열에 작동가능하게 연결된 두 번째 검출가능한 리포터 유전자를 포함하는 핵산 서열을 포함하며, 두 개의 희소 제한효소 부위로 구성된 희소 제한효소 부위 중 두 번째 세트 양쪽에 인접해 있는 두 번째 이동가능한 카세트

를 포함한 다가 플라스미드 백본으로서,

상기 첫 번째 검출가능한 리포터 유전자 및 두 번째 검출가능한 리포터 유전자의 생성물은 구별가능하고,

희소 제한효소 부위의 첫 번째 및 두 번째 세트는 다른 것을 특징으로 하는 다가 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 세 개 이상의 유전자좌를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 첫 번째 및 두 번째 유전자좌는 바이러스 게놈 내에 상이한 유전자 영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 첫 번째 및 두 번째 유전자좌는 바이러스 게놈의 단일 유전자 영역 내에 상이한 오픈 리딩 프레임에 위치하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 첫 번째 및 두 번째 유전자좌는 바이러스 게놈의 유전자 영역의 단일 오픈 리딩 프레임 내에 위치하고 서로 인접하지 않는 것을 특징으로 하는 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 검출가능한 리포터 유전자는 생성물 색깔에 의하여 서로 구별되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 검출가능한 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질 및 베타-갈락토시다제로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈인 것을 특징으로 하는 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 바이러스 게놈은 렌티바이러스 게놈, 레트로바이러스 게놈 및 폭스바이러스 게놈으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 백본.
제1항에 있어서, 첫 번째 세트의 두 개의 희소 제한효소 부위는 I-Ceu I, PI-Sce I, TevII, BmoI 및 DmoI으로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택되고, 서로 다르다는 것을 특징으로 하는 플라스미드 백본.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 다가 플라스미드 백본으로 트랜스팩션된 세포를 포함하는 세포 배양물.
다가 전달 벡터를 생성하기 위한 방법으로서,

(a) 첫 번째 세트의 효소의 존재 하에서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 다가 플라스미드 백본과, 생성물의 발현을 통제하는 조절 서열의 통제 하에 표적 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 첫 번째 세트의 제한효소 부위 양쪽에 인접해 있는 첫 번째 이종 발현 카세트를 포함하는 첫 번째 핵산 분자를 혼합하는 단계;

(b) 첫 번째 이종 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 백본을 제공하는 첫 번째 검출가능한 리포터의 부재를 선택하는 단계;

(c) 두 번째 세트의 효소의 존재 하에서, 다가 플라스미드 백본과 생성물의 발현을 통제하는 조절 서열의 통제 하에 표적 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 두 번째 세트의 제한효소 부위 양쪽에 인접해 있는 두 번째 이종 발현 카세트를 포함하는 두 번째 핵산 분자를 혼합하는 단계; 및

(d) 두 번째 이종 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 백본을 제공하는 두 번째 검출가능한 리포터의 부재를 선택하는 단계;

그럼으로써 첫 번째 유전자좌에 첫 번째 발현 카세트 및 두 번째 유전자좌에 두 번째 발현 카세트를 포함하는 다가 바이러스 게놈을 함유하는 다가 전달 벡터를 제공하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 첫 번째 검출가능한 리포터 유전자는 녹색 형광 단백질이고, 두 번째 검출가능한 리포터 유전자는 적색 형광 단백질인 것을 특징으로 방법.
제12항에 있어서, 첫 번째 세트의 효소는 I-Ceu I 및 PI-Sce I인 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 두 번째 세트의 효소는 첫 번째 세트의 효소와 다른 것을 특징으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 다가 전달 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 폭스바이러스로 구성된 군 중에서 선택된 바이러스 게놈의 서열을 포함 하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 다가 전달 벡터는 아데노바이러스 E1 영역에서 첫 번째 발현 카세트가 위치한 아데노바이러스 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 다가 전달 벡터는 아데노바이러스 E4 영역에서 두 번째 발현 카세트가 위치한 아데노바이러스 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제15항에 있어서, 다가 전달 벡터는 아데노바이러스 E3 영역에서 두 번째 발현 카세트가 위치한 아데노바이러스 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제12항 내지 제19항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 생산된 다가 전달 벡터.
제20항에 따른 다가 전달 벡터를 포함하는 숙주 세포.
전염성 바이러스 외피 내에 다가 바이러스 게놈을 패키징하는 데 충분한 바이러스 서열의 존재 하에 제20항에 따른 다가 전달 벡터를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 바이러스를 생성하는 방법.
제22항의 방법에 따라서 생성된 다가 바이러스.
제23항에 있어서, 상기 바이러스는 렌티바이러스 외피 단백질, 레트로바이러스 외피 단백질 및 폭스바이러스 외피 단백질을 포함한 전염성 외피에 패키지되는 것을 특징으로 하는 다가 바이러스.
제24항에 있어서, 폭스바이러스는 카나리폭스인 것을 특징으로 하는 다가 바이러스.
전염성 바이러스 캡시드 내에 다가 바이러스 백본을 패키징하는 데 충분한 바이러스 서열의 존재 하에 제12항에 따른 다가 전달 벡터를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 바이러스를 생성하는 방법.
제26항의 방법에 따라서 생성된 다가 바이러스 벡터.
제27항에 있어서, 아데노바이러스 캡시드 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 다가 바이러스 벡터.
(a)(i) 생성물의 발현을 통제하는 조절 서열의 통제 하에 첫 번째 표적 생성물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 첫 번째 이종 발현 카세트; 및

(ii) 생성물의 발현을 통제하는 조절 서열의 통제 하에 두 번째 표적 생성 물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 두 번째 이종 발현 카세트를 포함하고,

상기 첫 번째 및 두 번째 발현 카세트는 바이러스 벡터 게놈의 별개 유전자좌에 위치하고, 표적 생성물은 독립적으로 발현되는 다가 바이러스 벡터; 및

(b) 생리학적으로 양립가능한 캐리어

를 함유하는 조성물.
제29항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 생성물은 항원 및 사이토카인으로 구성된 군 중에서 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제29항에 있어서, 첫 번째 또는 두 번째 생성물은 면역 조절자인 것을 특징으로 하는 조성물.
제31항에 있어서, 두 번째 생성물은 첫 번째 생성물의 보조제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제31항에 있어서, 첫 번째 또는 두 번째 생성물은 치료 유전자 생성물인 것을 특징으로 하는 조성물.