JP2007535326A - 多価ウイルスベクターおよびその作製のためのシステム - Google Patents
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Abstract
Description
少なくとも2個の異なる発現カセットを担持するウイルスベクターを生成するシステムが提供される。該システムは、挿入された発現カセットの効率的な検出および選択を可能とする独自の多価プラスミドバックボーンを利用する。
本発明は、標的に対する複数の発現カセットを担持するウイルスベクターを生成するシステムを提供する。本システムは、標識遺伝子を担持する可動クローニングカセットを含むウイルスゲノムを担持するDNA分子を利用する。このDNA分子は、ウイルスゲノム内の異なる座内に位置する複数の異種発現カセットを含むウイルスゲノムを担持するトランスファーベクターを生成するために使用される。異種発現カセットを担持するウイルスゲノムは、本発明のトランスファーベクターからレスキューされそして適切なウイルスキャプシドまたは発現タンパク質内にパッケージングされて、多価ウイルスベクターを作製する。
A.ウイルスゲノムおよび複数のレポーター遺伝子を担持するDNA分子
一つの態様では、本発明は、多価ウイルスベクター内にパッケージングされるウイルスの配列を担持するDNA分子を提供する。一つの態様では、かかるDNA分子はプラスミドである。しかし、上記のような他の適当な遺伝因子を選択してもよい。細胞内へのベクターの導入は、トランスフェクションを含む、当該技術分野で公知のいずれかの方法または本明細書中で開示の方法により達成できる。
末端反復(ITR)配列(複製の起点として機能する)および5’パッケージングエンハンサードメイン(E1プロモーターのための線型Adゲノムおよびエンハンサー因子をパッケージングするために必要な配列を含む)を含む。アデノウイルスゲノムの3’末端は、パッケージングおよびキャプシド化のために必要な3’シス因子(ITRを含む)を含む。
ラスミドからのそれらの選択的除去および異種発現カセットの容易な挿入を許容する制限酵素部位の独特な組が側面に接する。
1,〔〔lambda〕〕〔−〕,recA13,mcrA〔+〕,mcr〔−〕〔Raleigh and Wilson(1986)Proc,Natl,Acad,Sci,USA 83,9070−9074〕;JM101−supE,thi,〔〔Delta〕〕(lac−proAB),〔F’,traD36,proAB,lacIqZ〔〔Delta〕〕M15〕,制限:(rk〔+〕,mk〔+〕),mcrA+〔Yanisch−Perron et al,,(1985)Gene 33,103−119〕;XL−1 blue recA1,endA1,gyrA96,thi,hsdR17(rk〔+〕,mk〔+〕),supE44,relA1,〔〔lambda〕〕〔−〕,lac,〔F’,proAB,lacIqZ〔〔Delta〕〕M15,Tn10(tet〔R〕)〕〔−Bullock,et al,(1987)BioTechniques 5,376−379〕;GM2929〔B,Bachman,Yale E,coli Genetic Stock Center(CSGS#7080)より〕;M,Martins株;sexF〔−〕;(ara−14,leuB6,fhuA13,lacY1,tsx−78,supE44,〔glnV44〕,galK2,galT22,l〔−〕,mcrA,dcm−6,hisG4,〔Oc〕,rfbD1,rpsL136,dam−13::Tn9,xyl−5,mtl−1,recF143,thi−1,mcrB,hsdR2,);MC1000−(araD139,D〔ara−leu〕7679,galU,galK,D〔lac〕174,rpsL,thi−1);ED8767(F−,e14−〔mcrA〕,supE44,supF58,hsdS3〔rB〔−〕mB〔−〕〕,recA56,galK2,galT22,metB1,lac−3またはlac3Y1を含んでもよい。適合する真核宿主細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Cultute Collection,Manassas,VA,US)、その他の公的細胞寄託機関、および各種の学問的および商業的由来で入手できる。適合するクローニングシステムまたは細胞の選択は本発明を限定しない。
位を有するものを含み、例えばI−Ceu I、PI−Sce I、TevII、BmoI、DmoI、FseI、PacI、PmeI、PsrI、BcgI、BglI、BsabI、BstXI、DrdI、EcoNI、FseI、MaM I、Msl I、Mwo
I、Psha I、Sfi I、Swa I、Xcm IおよびXmn Iなどを含む。好適なレア・カッターは、文献中および各種のオンライン・データベース、例えばREBASETMデータベース内で当該技術分野の熟練者に容易に利用でき情報を用いて同定されてもよい。本方法の好適なカッターは、種々の計算機プログラムおよび/またはオンラインデータベースを用いて容易に決定できる。好適な制限酵素は、各種の商業的出所、例えばなかでもEngland Biolabs、Obiogene、Lift Technology、Roche、BB Clontech、Stratagene、Amersham Pharmaciaから利用できる。
適切な消化酵素が選択されると、従来の消化および再結合技術が利用される。典型的には、プラスミドDNAを制限酵素と混合しそして約12〜約48時間インキュベーションする。その後、従来のフェノール/クロロホルム抽出工程が行われる。例えば、フェノール/クロロホルム抽出が利用されてもよく、次いで本方法の工程の残りに使用するためにエタノールを用いる沈降、および沈降物の溶解が続く(例えばTEまたはその他の適切な緩衝液中)。例えばSambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、5.28−5.32,Appendix E.3−E.4(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)を参照されたい。その他の適合する方法は、使用する制限酵素の製造者または販売者により提供されるかまたは当該技術分野の熟練者には公知である。
の消化工程が行われる。
本発明の多価トランスファーベクターは、当該技術分野の熟練者には公知の方法を用いて、キャプシドまたはエンベロープを有するウイルス粒子を生成するために使用できる。かかる技術は、cDNAの従来のクローニング技術、例えば教科書〔Sambrook
et al,上記に引用〕中に記載の方法を含み、アデノウイルスゲノムの重複オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応、および所望のヌクレオチド配列をもたらすいずれかの適切な方法の使用である。標準的なトランスフェクションおよび同時−トランスフェクション技術、例えばCaPO4沈降技術が利用される。使用されるその他の従来の方法は、ウイルスゲノムの相同的組換え、アガー上層内のウイルスのプラク形成、シグナル生成測定方法などを含む。
一つの態様では、本発明は、感染性ウイルスキャプシド内へ多価ウイルスゲノムをパッケージングする方法を提供する。
従って、発現カセットを担持するために使用される多価トランスファーベクターのアデノウイルス遺伝子含有量に応じて、ヘルパーアデノウイルスまたは非反復ウイルスフラグメントが、発現カセットを含む感染性組換えウイルス粒子を産生するために必要な十分なアデノウイルスベクター遺伝子配列をもたらすために必要であろう。有用なヘルパーウイルスは、アデノウイルス構築物中に存在しないおよび/またはベクターがトランスフェクションされるパッケージング細胞株により発現しない選択されたアデノウイルス遺伝子配列を含む。一つの態様では、ヘルパーウイルスは複製能欠損でありそして上記の配列に加えて種々のアデノウイルスウイルス遺伝子を含む。かかるヘルパーウイルスは、E1発現細胞株と組み合わせて使用されることが望ましい。
5−16987(1989);K.J.Fisher and J.M.Wilson,Biochem.J.,299:49(1994年4月1日)に記載のようなポリカチオン接合体内に形成されてもよい。ヘルパーウイルスは、場合により第二レポーター発現カセットを含んでもよい。多数のかかるヘルパーウイルスが当該技術分野では公知である。アデノウイルスベクター上の遺伝子産物とは異なるヘルパーウイルス上のレポーター遺伝子の存在は、Adバックボーンベクターおよびヘルパーウイルスの両者を独立して監視することを可能とする。この第二リポーターは精製後に得られる組換えウイルスとヘルパーウイルスの間の分離を可能とするために使用される。
上記のいずれかの遺伝子を欠失された組換えアデノウイルス(Ad)を生成するために、ウイルスの複製および感染性に必須の場合には、欠損された遺伝子領域の機能は、ヘルパーウイルスまたは細胞株、すなわち相補性またはパッケージング細胞株により組換えウイルスへ供給されなければならない。多くの場合に、ヒトE1を発現する細胞株は、チンパンジーAdベクターをトランスコンプリメント(transcomplement)するために使用できる。これは、本発明のチンパンジーAd配列と現在利用できるパッケージング細胞内に見られるヒトAdE1配列の間の多様性に起因して、現在のヒトE1含有細胞の使用が複製および産生プロセスの間の複製適格アデノウイルスの生成を防止するために、これは特に有利である。しかし、ある場合には、E1欠失サルアデノウイルスの産生のためにE1遺伝子産物を発現する細胞株の使用が望ましいであろう。かかる細胞株は記載されている。例えば米国特許第6,083,716号明細書参照。
Boulevard,Manassas,Virginia 20110−2209)から入手できる。その他の適合する親細胞株は他の起源から入手されてもよい。
al.中に記載されている。
ヘルパーウイルスによりトランス的にもたらされる。かかる場合に、適合する宿主細胞は、原核(例えば細菌)細胞および昆虫細胞、酵母細胞および哺乳動物細胞を含む真核細胞を含むいずれかの生物学的生物体から選択できる。適合する宿主細胞は当該技術分野では公知でありそして本明細書中に同定されるものを含む。
1個もしくはそれ以上の欠損アデノウイルス遺伝子は、宿主細胞のゲノム内に安定に組み込まれるか、エピソームとして安定に発現されるか、または一時的に発現されてもよい。遺伝子産物は、一時的、エピソーム上または安定に組込まれてすべて発現されてもよいか、または一部の遺伝子産物が安定に発現され他のものが一時的に発現されてもよい。
別の態様では、本発明のトランスファーベクターはエンベロープタンパク質を有するウイルス、例えばレンチウイルスまたはポックスウイルスの感染性粒子内にウイルスベクターをパッケージングするために使用される。適切なレンチウイルスの例は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヤギ関節炎および脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、牛免疫不全ウイルス、ビスナウイルス、およびネコ免疫不全ウイルス(FIV)を含む。本明細書中で提示する実施例は、HIVおよびFIVから誘導されるミニ遺伝子の使用を例示する。しかし、ヒトまたはヒト以外由来の他のレンチウイルスを使用してもよい。本発明の構築物内に使用される配列は、学問的、非営利的(例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Manassas,Virginia)またはレンチウイルスの商業的出所からもたらされてもよい。かかるウイルスベクターを精製する方法は、当該技術分野の熟練者には公知である。
チウイルスベクターを用いるレンチウイルスシステムに基づくHIV−1の産生が記載されている。例えば自己複合体活性化レンチウイルスベクターを用いるHIVに基づくレンチウイルスシステムの産生を記載したJE Coleman,et al.,Physiol Genomics.2003年2月6日;12(3):221−8を参照のこと。一つの例では、レンチウイルスベクターは、細胞株が3種の別々のプラスミド発現系を用いてトランスフェクションされた一時的トランスフェクション系内で創成される。それらには、本発明により産生されそして選択されたレンチウイルスプロウイルスおよび異種発現カセットの部分を含むトランスファーベクタープラスミド、パッケージングプラスミドまたは構築物、および同一レンチウイルスまたは異なるウイルスのエンベロープタンパク質であってもよいレンチウイルスエンベロープ遺伝子(ENV)を有するプラスミドを含む〔Amado and Chen、「レンチウイルスベクター−遺伝子治療の約束が手の届く範囲に」Science.285(5428):674−76(1999)。ベクターの3種のプラスミド成分をパッケージング細胞内に入れ、それらは次にレンチウイルスシェル内に挿入する。
本発明の多価ウイルスベクターは、生理学的に適切な担体を含む組成物中に配合される。それらの組成物は各種の治療および免疫化方式として有用である。有利には、多価ウイルスベクターからの複数遺伝子産物の発現は、所望の生物学的効果を達成するために対象者に送達するために必要なベクターまたは他の薬剤の量を減少するであろう。
一つの態様では、多価ベクターは遺伝子治療の公開された方法に従ってヒトに投薬される。複数の異種発現制御カセットを担持するウイルス多価ベクターは、好ましくは生物学的に適合する溶液または製薬学的に許容できる送達ベヒクル内に懸濁して患者に投薬されてもよい。適切なベヒクルは滅菌食塩水を含む。製薬学的に許容できる担体として公知でありそして当該技術分野の熟練者には周知のその他の水性および非水性等張性滅菌注入溶液および水性および非水性滅菌懸濁液が、この目的に使用されてもよい。
ような因子に主として依存し、従って患者間で変化する。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効な成人または獣医的投与量は、一般に約1x106〜約1x1015粒子、約1x1011〜約1x1013粒子、または約1x109〜約1x1012ウイルス粒子の濃度を含む担体の約100μl〜約100mLの範囲内である。投与量は動物の大きさおよび投薬の経路に依存して調整される。例えば、筋肉内注入のために適合するヒトまたは獣医的投与量(動物約80kgに対して)は、一部位に対してmLあたりに約1x109〜約5x1012粒子の範囲内である。場合により、複数の投薬部位で送達してもよい。別の例では、適当なヒトまたは獣医的投与量は、経口製剤に対して約1x1011〜約1x1015粒子の範囲内であってもよい。当該技術分野の熟練者は、投薬経路、および組換えベクターが使用される治療またはワクチン適用に依存してそれらの投与量を調整してもよい。治療産物、または免疫原の発現のレベル、循環抗体のレベルは、投与される投薬の頻度を決定するために測定できる。投薬の時期および頻度を決定するためのさらに別の方法は、当該技術分野の熟練者には直ちに明らかであろう。
異種発現カセットによりコードされる有用な治療産物は、インスリン、グルカゴン、成長ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、濾胞刺激ホルモン(FSH)、黄体形成ホルモン(LH)、ヒト絨毛腺刺激ホルモン(hCG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポエチン(angiopoietin)、アンギオスタチン(angiostatin)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、結合組織増殖因子(CTGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮増殖因子(EGF)、形質転換成長因子α(TGFα)、血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン増殖因子IおよびII(IGF−IおよびIGF−II)、TGF、アクチビン、インヒビン、または骨形態形成タンパク質(BMP)BMP1〜15のいずれかを含む形質転換成長因子スーパーファミリーのいずれか、成長因子のヘレグルイン(heregluin)/ニューレグリン(neuregulin)/ARIA/neu分化因子(NDF)ファミリーのいずれか、神経成長因子(NGF)、脳由来神経向性因子(BDNF)、神経栄養因子NT−3およびNT−4/5、毛様体神経栄養因子(CNTF)、膠細胞系統由来神経栄養因子(GDNF)、ニュールツリン(neurturin)、アグリン、セマフォリン(semaphorin)/コラプシン(collapsin)のファミリーのいずれか、ネトリン(netrin)−1およびネトリン−2、肝細胞増殖因子(HGF)、エフリン(ephrin)、ノジン(noggin)、ソニックヘッジホッグおよびチロシン加水分解酵素を限定ではなく含むホルモンおよび増殖および分化因子を含む。
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Fasリガンド、腫瘍壊死因子および、インターフェロン、および、幹細胞因子、flk−2/flt3リガンドを限定ではなく含む免疫系を調節するタンパク質を含む。免疫系により産生される遺伝子産物も本発明に有用である。それらには、免疫グロブリンIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgE、キメラ免疫グロブリン、ヒト化抗体、一本鎖抗体、T細胞受容体、キメラT細胞受容体、一本鎖T細胞受容体、クラスIおよびクラスII MHC分子、ならびに操作された免疫グロブリンおよびMHC分子を限定ではなく含む。有用な遺伝子産物は、相補性調節タンパク質、例えば相補性調節タンパク質、膜共同因子タンパク質(MPC)、崩壊促進因子(DAF)、CR1,CR2およびCD59も含む。
リンパ種のT細胞受容体の可変領域を含む。その他の腫瘍関連ポリペプチドは、例えばモノクローナル抗体17−1Aにより認識されるポリペプチドおよび葉酸結合ポリペプチドを含む腫瘍細胞内で高いレベルで見られるポリペプチドのような標的ポリペプチドとして使用できる。
本発明の多価ウイルスベクターは免疫原性組成物として使用されてもよい。本明細書中に使用される場合に、免疫原性組成物とは、哺乳動物、そして好ましくは霊長類動物への送達に従う免疫原性組成物により送達される産物に体液性(例えば抗体)または細胞性(例えば細胞毒性T細胞)反応が乗せられた組成物である。本発明は、そのアデノウイルス配列のいずれかにおいて、所望の免疫原をコードする第一異種発現カセットの欠失を含むことができる多価ウイルスベクターを提供する。多価ウイルスベクターは、免疫原、追加の免疫原性産物、治療産物、または多価ウイルスベクターに対する免疫反応をダウンレギュレートする産物のためのアジュバントをコードする異種発現カセットをさらに含むことができる。
ンを用いて初回抗原刺激した場合に発生する免疫反応と比較して、抗原をコードする初回刺激DNAワクチンを用いて投薬して抗原特異性免疫反応を促進できる。
ス)、フレボウイルス(リフトヴァレー熱)、ハンタウイルス属(プレマラ(puremala)はヘマハジン(hemahagin)熱ウイルスである)、ナイロウイルス属(ナイロビヒツジ病)および種々の帰属されていないブニヤウイルス属を含む。アレナウイルス科は、LCMおよびラッサ熱ウイルスに対する抗原を提供する。レオウイルス科は、レオウイルス属、ロタウイルス属(これは小児に急性胃腸炎を起こす)、オルビウイルス属、およびクルチ(culti)ウイルス属(コロラドダニ熱ウイルス、レボンボ(Lebombo)(ヒト)、ウマ脳炎、ブルータング)を含む。
al,J.Virol.75(5):2462−2467(2001年3月)、およびR.R.Amara,et al.,Science,292:69−74(2001年4月)に記載のHIVおよびSIVタンパク質も参照のこと。別の例では、HIVおよび/またはSIV免疫原性タンパク質またはペプチドは、融合タンパク質またはその他の免疫原性分子を形成するために使用されてもよい。例えば、国際特許公開番号WO01/54719号明細書、2001年8月2日公開、および国際特許公開番号WO99/16884号明細書、1999年4月8日公開中に記載のHIV−1 Tatおよび/またはNefタンパク質および免疫化方式を参照のこと。本発明は、本明細書中に記載のHIVおよび/またはSIV免疫原性タンパク質またはペプチドに限定はされない。さらに、それらのタンパク質に対する種々の変性が記載されるかまたは当該技術分野の熟練者により容易に作製できる。例えば、米国特許第5,972,596号明細書に記載の変性gagタンパク質を参照のこと。さらに、いずれかの所望のHIVおよび/またはSIV免疫原は、単独又は組合せて送達されてもよい。かかる組合せは、単一ベクターからまたは複数ベクターからの発現を含んでもよい。
)を含むベータヘルペスウイルス亞科、およびリンホクリプトウイルス属、EBV(バーキットリンパ種)、感染性鼻気管炎、マレック病ウイルス、およびラジノウイルス(rhadinovirus)を含むガンマヘルベスウイルス亞科を含む。ポックスウイルス科は、オルトポックス属(痘瘡(天然痘)およびワクチニア(牛痘))、パラポックスウイルス属、アビポックスウイルス属、カプリポックスウイルス属、レポリポックスウイルス属、スイポックスウイルス属を包含するチョルドポックスウイルス亞科、およびエントモポックスウイルス亞科を含む。ヘパドナウイルス科は、B型肝炎ウイルスを含む。抗原の起源として適合するであろう一つの分類されていないウイルスは、デルタ型肝炎ウイルスである。さらの他のウイルス起源は、トリ感染性嚢性疾患ウイルスおよびブタ呼吸器および生殖器症候群ウイルスを含んでもよい。アルファウイルス科は、馬関節炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスを含む。
sinia pestis)(ペスト)、大痘瘡(重篤痘瘡)、フランシセラ ツラレンシス(Francisera tularensis)(ツラレミ菌)、およびウイルス性出血熱〔フィロウイルス(例えばエボラ、マーブルグ)〕、およびアレナウイルス〔例えばラサ、マチュポ〕、これらのすべは現在カテゴリーA薬剤に分類されている;コクシエラ ブルネチ(Coxiella burnetti)(Q熱);ブルセラ種(ブルセラ症)、ブルコルデリア マレイ(Brukholderia mallei)(鼻疽)、ブルコルデリア シュドマレイ(Brukholderia pseudomallei)(メロイドーシス(meloidosis))、ヒマ(Ricinus communis)およびその毒素(リシン毒素)、ウエルシュ菌(Clostridium perfringens)およびその毒素(イプシロン毒素)、ブドウ球菌(Staphylococcus)種およびそれらの毒素(腸毒素B)、オウム病クラミジア(Clamidia psittaci)(オウム病)、水の安全への脅威(例えばコレラ菌(Vibrio cholerae)、クリトスポルジウム パルブム(Crytosprodium parvum)、チフス熱(リッケチア ポワゼキ(Richettsia powazekii))、およびウイルス性脳炎(アルファウイルス、例えばベネズエラウマ脳炎、イースタンウマ脳炎、ウエスタンウマ脳炎);それらのすべては現在カテゴリーB薬剤に分類されている;およびナイパン(Nipan)ウイルスおよびハンタウイルス、それらは現在カテゴリーC薬剤に分類されている。さらに、そのように分類されているかまたは異なって分類されているその他の生物体は、将来同定されるかおよび/またはかかる目的に使用されるであろう。本明細書中に記載のウイルスベクターおよびその他の構築物は、それらの生物体、ウイルス、それらの毒素またはその他の副産物からの抗原を送達するために有用であり、それらはそれらの生物学的薬剤を用いる感染またはその他の不利益な反応を防止および/または処置するであろう。
図1を参照して、Pan9 E1遺伝子領域の部位中に変異緑色蛍光タンパク質標識(GFP)カセット、ウシ成長ホルモンpolyA、および部分形質転換E3欠失を有する
、チンパンジーアデノウイルスPan9ウイルスゲノムを担持するプラスミドバックボーンを選択した。このプラスミドは、国際特許公開番号WO2003/046124号明細書中に記載されている。
本発明の多価トランスファーベクターを構築するために、先に選択された異種発現カセットをシャットルベクター内の適切な部位内にクローニングする。
ており、しかしGFPを含む可動カセットは保存されているベクターの存在を示す。GFPおよびRFPに適合する波長の光で励起された後に白色に見えるコロニーは、双方の可動カセットが異種発現カセットで置換されたベクターを示す。従って、白色コロニーを選択して、本発明の多価トランスファーベクターを容易かつ正確に選択できる。
同一のCMV−hA1AT発現カセットを、E1欠失Pan9(C9とも呼ばれる)ベクターのE1座およびE1/E3欠失C9ベクターのE3座に別々にクローニングした。異なる座からA1ATを発現する組換えC9ウイルスが産生されそして1x1011pts/マウスの投与量でC57/L/6マウスに静脈内注入した。遺伝子転移の3および7日後に動物から採血しそして比較のために血清hA1ATレベルを測定した。そのデータは、E3座から発現されたhA1ATは、E1マウスからのものより実際に少なくとも2倍は高かったことを明らかにした。図3参照。
Claims (33)
- (a)ウイルスゲノムの第一の座内に位置する第一の可動カセットであって、該第一の可動カセットは、配列の発現を指令するその配列に作動可能に連結している第一の検出可能レポーター遺伝子を含む核酸配列を含んでなり、該可動カセットは2個のレア制限酵素部位から成るレア制限酵素部位の第一の組と側面を接しておる、上記第一の可動性カセット、および
(b)ウイルスゲノムの第二の座内に位置する第二の可動カセットであって、配列の発現を指令するその配列に作動可能に連結している第二の検出可能レポーター遺伝子を含む核酸配列を含んでなり、該可動カセットは2個のレア制限酵素部位から成るレア制限酵素部位の第二の組と側面を接しておる、上記第二の可動性カセット、
を含んでなり、ここで該第一の検出可能レポーター遺伝子および第二の検出可能レポーター遺伝子の産物は識別可能であり、そして
ここでレア制限酵素部位の第一のおよび第二の組が異なる、
多価プラスミドバックボーン。 - さらに3個またはそれを越える座を含んでなる、請求項1に記載の多価プラスミドバックボーン。
- 第一のおよび第二の座が、ウイルスゲノム内の異なる遺伝子領域内に位置する、請求項1に記載のプラスミドバックボーン。
- 第一のおよび第二の座が、ウイルスゲノムの単一遺伝子領域内の異なるオープンリーディングフレーム内に位置する、請求項1に記載のプラスミドバックボーン。
- 第一のおよび第二の座が、ウイルスゲノムの遺伝子領域の単一オープンリーディングフレーム内に位置しそして互いに隣接していない、請求項1に記載のプラスミドバックボーン。
- 検出可能なレポーター遺伝子が、産物の色により相互に区別される、請求項1に記載のプラスミドバックボーン。
- 検出可能なレポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、およびβーガラクトシダーゼから成る群から独立して選択される、請求項1に記載のプラスミドバックボーン。
- ウイルスゲノムが、アデノウイルスゲノムである、請求項1に記載のプラスミドバックボーン。
- ウイルスゲノムが、レンチウイルスゲノム、レトロウイルスゲノム、およびポックスウイルスゲノムから成る群から選択される、請求項1に記載のプラスミドバックボーン。
- 第一の組内の2個のレア制限酵素部位が、I−CeuI、PI−SceI、TevII、BmoI、およびDmoIから成る群から独立して選択され、そして互いに異なる、請求項1に記載のプラスミドバックボーン。
- 請求項1〜10のいずれかに従う多価プラスミドバックボーンを用いてトランスフェクションされた細胞を含んでなる細胞カルチャー。
- (a)酵素の第一の組の存在下で、請求項1〜10のいずれかに記載の多価プラスミドバ
ックボーンおよび標的産物の発現を制御する調節配列の制御下で標的産物をコードする核酸配列を含む第一の異種発現カセットを含んでなる第一の核酸分子を混合し、ここで該異種発現カセットは制限酵素部位の第一の組と側面を接しており、
(b)第一の検出可能レポーターの不在を選択して第一の異種発現カセットを含むプラスミドバックボーンを提供し、
(c)酵素の第二の組の存在下で、多価プラスミドバックボーンおよび標的産物の発現を制御する調節配列の制御下で標的産物をコードする核酸配列を含んでなる第二の異種発現カセットを含んでなる第二の核酸分子を混合し、ここで該異種発現カセットはレア制限酵素部位の第二の組と側面を接しており、そして
(d)第二の検出可能レポーターの不在を選択して第二の異種発現カセットを含むプラスミドバックボーンを提供し、
それにより、第一の座中に第一の発現カセットそして第二の座中に第二の発現カセットを含んでなる多価ウイルスゲノムを含んでなる多価トランスファーベクターを提供する
工程を含んでなる、多価トランスファーベクターの生成方法。 - 第一の検出可能レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質でありそして第二の検出可能レポーター遺伝子が赤色蛍光タンパク質である、請求項12記載の方法。
- 酵素の第一の組がI−CeuIおよびPI−SceIである、請求項12に記載の方法。
- 酵素の第二の組が酵素の第一の組とは異なる、請求項12に記載の方法。
- 多価トランスファーベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルスから成る群から選択されるウイルスゲノムからの配列を含んでなる、請求項12に記載の方法。
- 多価トランスファーベクターが、第一の発現カセットがアデノウイルスE1領域内に位置するアデノウイルス配列を含んでなる、請求項15に記載の方法。
- 多価トランスファーベクターが、第二の発現カセットがアデノウイルスE4領域内に位置するアデノウイルス配列を含んでなる、請求項15に記載の方法。
- 多価トランスファーベクターが、第二の発現カセットがアデノウイルスE3領域内に位置するアデノウイルス配列を含んでなる、請求項15に記載の方法。
- 請求項12〜19のいずれかの方法に従って産生される多価トランスファーベクター。
- 請求項20に記載の多価トランスファーベクターを含んでなる宿主細胞。
- 感染性ウイルスエンベロープ内への多価ウイルスゲノムのパッケージングを許容するために十分なウイルス配列の存在下で、請求項20に記載の多価トランスファーベクターを培養する工程を含んでなる多価ウイルスを生成する方法。
- 請求項22の方法に従って産生される多価ウイルス。
- 該ウイルスが、レンチウイルスエンベロープタンパク質、レトロウイルスエンベロープタンパク質、およびポックスウイルスエンベロープタンパク質を含んでなる感染性エンベロープ内にパッケージングされる、請求項23に記載の多価ウイルス。
- ポックスウイルスがカナリアポックスである、請求項24に記載の多価ウイルス。
- 感染性ウイルスキャプシド内への多価ウイルスバックボーンのパッケージングを許容するために十分なウイルス配列の存在下で、請求項12に記載の多価プラスミドバックボーンを培養する工程を含んでなる多価ウイルスを生成する方法。
- 請求項26の方法に従って産生される多価ウイルスベクター。
- アデノウイルスキャプシドタンパク質を含んでなる、請求項27に記載の多価ウイルスベクター。
- (a)下記を含んでなる多価ウイルスベクター;
(i)産物の発現を制御する調節配列の制御下で第一の標的産物をコードする核酸配列を含んでなる第一の異種発現カセット、および
(ii)産物の発現を制御する調節配列の制御下で第二の標的産物をコードする核酸配列を含んでなる第二の異種発現カセット、
を含んでなる多価ウイルスベクター、
ここで、該第一および第二の発現カセットはウイルスベクターゲノムの異なる座内に位置し、そして標的産物は独立して発現され、そして
(b)生理学的に許容できる担体
を含む組成物。 - 該第一のおよび第二の産物が抗原およびサイトカインから成る群から独立して選択される、請求項29に記載の組成物。
- 第一のまたは第二の産物が免疫モジュレーターである、請求項29に記載の組成物。
- 第二の産物が第一の産物のためのアジュバントである、請求項31に記載の組成物。
- 第一のまたは第二の産物が治療用遺伝子産物である、請求項31に記載の組成物。
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