KR20060132574A - 분자 크기 제어된 거대분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분지된 부위의 풍부한 말단에 서브스트레이트가 결합되어 있고 선형의 부위의 말단은 관능기화된(functionalized) 분지된 부위와 선형의 부위로 구성된 중합체로 이루어진 균일한 스페이서의 분자 크기 제어된 덴드리머(size-controlled dendrimers)고분자의 분자 막을 포함하는 서브스트레이트의 응용을 개시한다.

Description

분자 크기 제어된 거대분자{SIZE-CONTROLLED MACROMOLECULE}

본 발명은 고도로 분지된 거대분자(macromolecule)에 관한 것이다. 본 발명은 상기 거대분자들이 표면에 고정된 관능기화된 서브스트레이트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 덴드론(dendron)의 일측면에는 관능적인 서브스트레이트가 결합되어 있고 다른 면에는 표적 특이적 리간드가 붙어있는 분자 크기 제어된 덴드리머(size-controlled dendrimer)와 덴드론에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 프로브 생체분자가 결합되어 있는 고도로 분지된 고분자가 결합된 관능기화된 서브스트레이트를 이용한 조합화학(combinatorial chemistry) 분야, 특정 단백질 검출 방법, 특정 핵산 혼성화 또는 핵산/펩타이드 혼성화 검출 방법에 관한 것이다.

DNA 서열, 유전적 변이 및 유전자 발현에 대한 대량 분석을 가능하게 하기 때문에, DNA 마이크로어레이(DNA microarray)는 첫 번째 보고 [Fodor et al., Nature 364, 555-556 (1993); Saiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6230-6234 (1986)] 이래로 많은 관심을 받아왔다. 상기의 표준화 및 인간 유전자 분석으로의 응용을 위하여 필수적인 정확도, 재생산성 및 점 균질성(spot homogeneity)이란 측면에서의 개선이 필요한 것으로 알려져 있다 [Hackett et al., Nature Biotechnology 21, 742-743 (2003)]. 이러한 단점들은 주로 이상적인 모습 과는 다른 표면 및 분자 중간층 구조(molecular interlayer structure)의 성질에 기인한다. 유사하게, 대량 표적 검출 시스템 분야는 고정화된 생체 활성 분자 및 생체분자를 이용한 생물학적 분석을 포함한다.

본 명세서는 나노크기로 조절된 표면에 제작된 DNA 마이크로어레이는 용액상태의 DNA와 같은 정도로 단일 염기 잘못 짝지워진 쌍을 식별해낼 수 있다. 이러한 접근은 최소한의 입체 장애(steric hindrance)를 가지고 각각의 프로브 DNA가닥(probe DNA strand)에 표적 DNA와 상호작용할 수 있는 충분한 공간이 주어지는 이상적인 DNA 마이크로어레이를 제공한다. 현격하게 증가된 식별 효율(discrimination efficiency)에 의하여 매우 신뢰할만한 인간 유전자 분석을 제공할 수 있다. 게다가, 이러한 접근은 고정된 생체 활성 분자나 생체분자를 사용한 다양한 생물학적 분석에 응용할 만큼 일반적이다.

친화성 정제(Affinity purification)는 리간드 결합 단백질의 분리 및 동정을 위한 잘 알려진 기술이다 [Cuatrecasas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1968, 61, 636-643]. 불용성 서브스트레이트에 공유적으로 결합된 리간드와 상보적인 표적 단백질의 특이한 상호작용은 복잡한 혼합물로부터 생체분자를 분리하는데 요구되는 특이성을 공급한다. 그러나, 상기 기술의 다양한 이용은 전통적인 서브스트레이트의 제한적 선택과 불안정성 때문에 제한을 받고 있다. 많은 고체 지지체에 대한 단백질의 주목할 만한 비특이적 결합은 새로운 서브스트레이트를 확립하는데 계속적인 문제가 되어왔다. (Cuatrecasas, P. J. Biol. Chem. 1970, 245, 3059-3065). 따라서, 환경변화에 다른 안정성과 잘 정의되고 간편한 리간드 결합 을 보여주는 특이함이라는 관점에서 전통적인 서브스트레이트와 비교될 수 있는 새로운 서브스트레이트를 자는 것이 요구되어 왔다.

고체상 펩타이드 합성을 위해 전통적으로 사용되어온 AMPCPG(aminopropyl-controlled pore glass)는 많은 바람직한 점들을 가지고 있는 것으로 나타났다. 그러나, CPG(controlled pore glass)의 표면은 극성이고 코팅되었을 때 조차도 부분적인 음전하가 유지되었다(Hudson, D. J. Comb. Chem. 1999, 1, 403-457). 단백질의 주목할 만한 비특이적 결합과 관련하여 형태가 가장 중요한 역할을 한다. 따라서, 친화성 크로마토그래피 및 고체상 펩타이드 합성에 대한 응용은 제한되어 왔다. 이러한 단점들이 극복될 때, 상기 물질의 다양한 이용이 기대될 수 있을 것이다.

리간드의 접근성은 결합능력을 결정하는데 있어서 중요한 요소이다. 스페이서물질(spacer molecule)의 도입과 리간드의 농도를 증가하는 것이 표면에 리간드를 더 잘 노출시키기 위하여 사용하는 전통적인 방법이었다(Rusin, et al., Biosensors & Bioelectronics 1992, 7, 367-373; Suen et al., Ind. Eng. Chem. Res. 2000, 39, 478-487; Penzol et al., Biotechnol and Bioeng. 1998, 60, 518-523; Spinke et al., J. Chem. Phys. 1993, 99, 7012-7019). 상기 방법은 일정 정도 효력이 있으나, 리간드간의 부적절한 간격과 표면에 대한 포획 물질(capture molecule)의 무질서한 분포는 아직도 해결되지 못한 문제점이다(Hearn et al., J. Chromatogr. A. 1990, 512, 23-39; Murza et al., J. Chromatogr. B. 2000, 740, 211-218; Xiao et al., Langmuir 2002, 18, 7728-7739). 최근에 이러한 단점들을 개선하기 위한 두 가지 방법이 제공되어 왔다. 한 가지 방법은 위치고정을 위한 물질로 단백질과 같은 거대 물질을 이용하는 것이다. 상기의 단백질은 서브스트레이트에 결합되고, 상기 위치고정을 위한 물질이 제거되고 씻겨진다. 이러한 방식에서, 서브스트레이트 위에 남겨진 연결물질간의 특정 거리가 확보된다. 그럼에도 불구하고, 위치고정을 위한 물질의 선택과 이를 제거하기 위한 경로는 모든 다른상황에 대하여 정교하게 최적화되어야 한다(Hahn et al., Anal. Chem. 2003, 75, 543-548). 다른 방법으로는 잘 정렬된 자기 조립의 단일층(self-assembled monolayer)을 제공하고 덴드론의 최정점에 활성화된 기능기를 사용하는 원뿔형의 덴드론(cone-shape dendron)을 사용하는 것이다(Xiao et al., Langmuir 2002, 18, 7728-7739; Whitesell et al., Langmuir 2003, 19, 2357-2365).

본 발명은 덴드론을 사용한 AMPCPG의 개질, 덴드론의 최정점에 GSH의 추가적 부착 및 GST 단백질 결합에 의한 표면 물질의 특성을 제시한다. 말단에 3 내지 9개의 카르복시산과 최정점에 하나의 아민기를 가지는 덴드론을 매트릭스에 도입하였다. 상기의 카르복시산들은 고체표면에 공유적으로 결합되어 있다. GST(glutathione S-transferase) 유전자 융합 시스템에 대한 이해와 폭 넓은 사용에 의해서, 글루타티온(glutathione)을 덴드론으로 처리한 서브스트레이트에 대한 리간드로서 선택하였다. 상기 서브스트레이트의 리간드 결합 정도를 GST와 두 가지 융합 단백질 리간드(GST-PX^P47, GST-Munc-18)을 이용하여 측정하였다(Smith et al., Gene 1988, 67, 31-40; Sebastian et al., Chromatogr. B. 2003, 786, 343-355; Wu et al., Chromatogr. B. 2003, 786, 177-185; De Carlos et al., J. Chromatogr. B. 2003, 786, 7-15).

발명의 요약

본 발명은 리간드에 결합된 분자 크기가 제어된, 바람직하게는 원뿔형의 화합물이 결합된 서브스트레이트를 제공한다.

본 발명은 분지된 부위의 다수의 말단은 서브스트레이트에 결합되어 있고 선형의 부위의 말단에는 관능기화된 분지된 부위와 선형의 부위를 포함하는 중합체를 포함하는 규칙적으로 분포하는 분자 크기 제어된 거대분자의 분자층을 포함하는 서브스트레이트에 관한 것이다. 상기 거대분자들은 서브스트레이트 상에 규칙적인 간격으로 분포할 수 있다. 상세하게는, 상기 거대분자들은 선형 부위의 관능기들 간의 간격이 약 0.1 nm 내지 약 100 nm의 규칙적인 간격을 갖도록 분포될 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 거대분자는 약 10 nm 의 규칙적인 간격으로 분포될 수 있다.

상기 서브스트레이트에서, 분지된 부위의 말단은 -COZ, -NHR, -OR′ 또는 -PR"₃으로 이루어진 군 중에서 선택된 것으로 관능기화된 것일 수 있으며, 상기 Z는 유리기일 수 있고, 상기 R은 알킬기(alkyl)일 수 있으며, 상기 R’는 알킬기, 아릴기(aryl), 또는 에테르(ether)일 수 있고, 상기 R"는 수소, 알킬기, 알콕시기(alkoxy) 또는 산소일 수 있다. 특히, COZ는 에스테르, 활성화된 에스테르, 산 할라이드(acid halide), 활성화된 아마이드(amide) 또는 CO-이미다조일(imidazoyl)일 수 있고; R은 탄소수 1 내지 4인 알킬기일 수 있으며, R'는 탄소수 1 내지 4인 알킬기일 수 있다. 또한, 상기한 서브스트레이트에 있어서, 상기중합체는 덴드론(dendron)일 수 있다. 또한, 상기 중합체의 선형 부위는 스페이서 부위를 포함하는 것일 수 있고, 상기 스페이서 부위는 제1 관능기를 통하여 분지된 부위에 연결될 수 있다. 상기 제1 관능기는 -NH₂, -OH, -PH₃, -COOH, -CHO, 또는 -SH일 수 있지만, 이에 제한되지는 아니한다. 또한 상기 스페이서 부위는 제1 관능기에 공유적으로 연결된 연결 부위를 포함하는 것일 수 있다.

상기의 서브스트레이트에서 상기 연결 부위는 치환되거나 치환되지 아니한 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로 알킬기(cyclo alkyl), 아릴기, 에테르, 폴리에테르(polyether), 에스테르(ester) 또는 아미노 알킬기(amino alkyl)일 수 있다. 또한, 스페이서 부위는 제2 관능기를 포함할 수 있다. 제2 관능기는 -NH₂, -OH, -PH₃, -COOH, -CHO 또는 -SH일 수 있으며, 이에 제한되지 아니한다. 상기 제2 관능기는 선형의 부위의 말단에 위치할 수 있다. 또한, 보호기(protecting group)는 선형의 부위 말단에 결합되어 있을 수 있다. 상기의 보호기는 산반응성(acid labile) 또는 염기 반응성(base labile) 물질일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기한 바와 같은 서브스트레이트에 있어서, 표적 특이적 리간드를 상기 선형 부위의 말단에 결합시킬 수 있다. 상세하게는, 상기의 표적 특이적 리간드는 화합물, DNA, RNA, PNA, 앱타머(aptamer), 펩타이드, 폴리펩타이드, 탄수화물, 항체, 항원, 바이오미메틱스(biomimetics), 뉴클레오타이드 유사체(nucleotide analog), 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기의 거대분자들의 선형 부위에 결합된 표적 특이적 리간드 사이의 거리는 약 0.1 nm 내지 약 100 nm일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 서브스트레이트는 반도체(semiconductor), 합성 유기 금속(synthetic organic metal), 합성 반도체(synthetic semiconductor), 금속(metal), 합금(alloy), 플라스틱(plastic), 실리콘(silicon), 실리케이트(silicate), 유리(glass), 또는 세라믹(ceramic)일 수 있다. 상세하게는, 상기 서브스트레이트는 슬라이드(slide), 입자(particle), 비드(bead), 마이크로웰(micro-well) 또는 다공성 물질일 수 있으며, 이에 제한되지 아니한다. 상기 다공의 물질은 멤브레인, 젤라틴(gelatin) 또는 수화젤(hydrogel)일 수 있다. 더욱 상세하게는, 상기 비드 물질은 제어된 기공을 갖는 비드 (controlled pore bead)일 수 있다.

또한, 본 발명은 분지된 부위 및 선형 부위를 포함하는 중합체를 포함하는 규칙적으로 분포하는 분자 크기 제어된 거대분자의 분자층의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 분지된 부위의 다수의 말단은 기판에 결합되어 있고, 상기 선형 부위의 말단은 관능기화되어 있으며, 상기 방법은

(i)거대분자의 말단과 반응할 수 있도록 서브스트레이트를 관능기화시키는 단계; 및

(ii) 상기 거대분자를 서브스트레이트와 접촉시켜 상기 거대 분자의 말단과 상기 서브스트레이트 간의 결합을 형성시키는 단계를 포함한다.

상기 제조 방법에서 상기 서브스트레이트는 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체(synthetic semiconductor), 금속(metal), 합금(alloy), 플라스틱(plastic), 실리콘(silicon), 실리케이트(silicate), 유리(glass), 또는 세라믹(ceramic)으로 제작될 수 있으며, 이에 제한되지 아니한다. 상기 서브스트레이트는 슬라이드, 비드, 마이크로웰 또는 다공성 물질일 수 있다. 상기 다공성 물질은 수화젤, 젤라틴 또는 멤브레인일 수 있다. 상기 비드는 제어된 기공을 갖는 비드일 수 있다.

또한, 상기한 바와 같은 제조 방법에 있어서, 표적 특이적 리간드를 선형 부위의 말단에 결합시킬 수 있으며, 상기 방법은

i) 상기 서브스트레이트 상의 거대분자의 선형 부위의 말단으로부터 보호기를 제거하는 단계; 및

ii) 표적 특이적 리간드 또는 상기 리간드에 연결된 동형의 양작용성(homobifunctional) 링커 및 이형의 양작용성(heterobifunctional) 링커로 이루어진 군 중에서 선택된 링커 분자를 상기 서브스트레이트 상의 거대분자의 선형 부위의 말단과 접촉시켜 상기 리간드 또는 링커 분자와 상기 말단이 결합을 형성하도록 하는 단계를 포함한다.

상기 제조 방법에서, 상기 서브스트레이트 상에 존재하는 상기 거대분자에 의하여, 선형 부위의 말단과 표적-특이적 리간드 간의 결합에 있어서의 장애를 최소화시킬 수 있다. 또한, 상기 제조 방법에서, 상기 서브스트레이트 상에 존재하는 상기 거대분자에 의하여, 표적-특이적 리간드에 특이적인 표적을 검출하는데 있어서 장애를 최소화시킬 수 있다. 또한, 상기 제조 방법에서 상기 표적-특이적 리간드는 규칙적인 간격으로 분포할 수 있다. 또한, 상기 제조 방법에서 상기 표적-특이적 리간드는 낮은 밀도로 상기 서브스트레이트 상에 위치할 수 있다. 또한, 상기 제조 방법에서 표적-특이적 리간드는 화합물, DNA, RNA, PNA, 업타머, 펩타이드, 폴리펩타이드, 효소, 탄수화물, 폴리사카라이드, 항체, 항원, 바이오미메틱스, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 상기 서브스트레이트를 포함하는 유전자 변이를 검출하기 위한 진단 시스템에 관한 것으로, 상기 서브스트레이트는 선형 부위의 말단이 표적 특이적 올리고뉴클레오타이드와 고정되어 있는 것이다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 암 관련 유전자일 수 있다. 특히 상기 암 관련 유전자는 p53일 수 있다

본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명은 상기 서브스트레이트를 분석 대상 유전자 함유 시료와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 서브스트레이트는 선형 부위의 말단이 표적 특이적 올리고뉴클레오타이드와 고정되어 있는 것인, 유전자 변이 존재 여부의 검출 방법에 관한 것이다. 본 방법에 있어서, 상기 유전자는 암 관련 유전자일 수 있다. 또한 상기 유전자는 p53일 수 있다.

본 발명의 이러한 목적과 다른 목적들은 하기하는 발명의 상세한 설명, 첨부된 도면 및 첨부된 청구항에 의하여 보다 잘 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 하기에 기술한 도면의 상세한 설명과 도면으로부터 더 잘 이해될 수 있겠으나, 첨부된 도면은 단지 예시를 위한 것일 뿐이며, 본 발명이 이에 의하여 제한되는 것은 아니다.

도 1은 분지형/선형의 중합체 또는 분자 크기 제어된 거대분자를 나타내는 식Ⅰ을 보여주는 것이다.

도 2는 덴드론을 제조하는 반응 개략도이며, 여기서 X는 보호기를 나타댄다.

도 3 내지 5는 덴드론 개질된 표면의 검출을 보여주는 것으로, 도 3은 표면 개질 및 혼성화를 위한 개략도이고, 도 4는 본 발명에서 사용된 덴드론의 분자구조를 보여주는 것이며, 도 5는 프로브 DNA 서열 및 표적 DNA 가닥의 서열을 보여주는 것이다. 프로브 올리고뉴클레오타이드는 프로브 1: 5'-NH₂-C₆-CAT TCC GNG TGT CCA-3'(서열번호 1) 및 프로브 2: 5'-NH₂-C₆-(T)₃₀-CAT TCC GNG TGT CCA-3'(서열번호 2)를 포함한다. 표적 뉴클레오타이드는 표적 1: 5'-Cy3-TGG ACA CTC GGA ATG-3'(서열번호 3) 및 표적 2: 5'-Cy3-CCT ACG AAA TCT ACT GGA ACG AAA TCT ACT TGG ACA CTC GGA ATG-3'(서열번호 4)를 포함한다.

도 6는 자외선 스펙트로스코피 분석을 보여주는 것으로, 도 6a는 각각의 반응단계 후의 자외선 스펙트럼을 보여주는 것이다. EG/GPDS 및 덴드론은 에틸렌글리콜 개질된 서브스트레이트 상에 덴드론을 도입시키기 전과 후에 얻어지는 스펙트럼을 나타내는 것이고, 디블록(Deblock)은 탈보호 단계 후의 스펙트럼을 나타내는 것이다. 도 6b는 안정성 실험을 보여주는 것으로, 실온에서 1일 동안 DMF에서 교 반시킨 후 얻어지는 스펙트럼을 "세척 (Washing)"으로 표시되어 있다.

도 7는 덴드론 개질된 표면의 태핑 모드 원자 현미경(Tapping mode atomic force microscopy, TM-AFM) 이미지를 보여주는 것이다. "E" 타입 스캐너를 장착한 Nanoscope IIIa AFM (Digital Instruments)를 사용하였다. 스캐닝된 넓이는 1.0 x 1.0 μm²이다.

도 8는 혼성화 후의 형광 이미지를 보여주는 것이다. a 및 b는 덴드론 개질된 표면 상에서의 (a) 프로브 1 및 표적 1 또는 (b) 프로브 1 및 표적 2 간의 혼성화 후에 얻어지는 이미지를 보여주는 것이다. c 및 d는 APDES 개질된 표면 위에서의 (c) 표적 1과 프로브 1 또는 (d) 표적 1 및 프로브 2 간의 혼성화 후에 기록된 이미지를 보여주는 것이다.

도 9는 짝지은 올리고뉴클레오타이드 쌍 또는 내부적으로 잘못 짝지워진 올리고뉴클레오타이드 쌍 간의 강도 차이를 보여주는 것이다. 상위 이미지인 a 내지 c는 4x4 배열 형광 이미지와 하위 이미지인 도 d 내지 f는 16개의 스폿들로부터 추출된 하나의 스폿을 나타낸 이미지이다. a와 d는 DSC 링커를 갖는 덴드론 개질된 마이크로어레이에 관한 것이고, b와 e는 PDITC 링커를 갖는 APDES 개질된 마이크로어레이에 관한 것이며, c 및 f는 DSC 링커를 갖는 APDES 개질된 마이크로어레이에 관한 것이다. DSC 링커를 갖는 덴드론 개질된 마이크로어레이와, PDITC 링커를 갖는 APDES 개질된 마이크로어레이에 대한 형광 이미지는 10%보다 작은 변동계수(coefficient variance, CV)와 하나의 스폿에서 균일한 형광 신호를 나타냈다. 한편, DSC 링커를 갖는 APDES 개질된 마이크로어레이에 대한 형광 이미지는 훨씬 작은 스폿 크기, 20%를 넘는 변동계수(CV) 및 하나의 스폿에서 비균일한 형광 신호를 나타내었다. 각 화소의 크기는 10 x 10 μm²이다.

도 10는 p53의 단일변이(single mutation)를 검출하기 위한 표적 DNA 시료와 p53 특이적 올리고뉴클레오타이드 프로브의 혼성화 후에 얻어진 형광 이미지를 보여주는 것으로 a는 [9]-산 덴드론을 사용한 것이고, b는 [27]-산 덴드론을 사용한 것이다.

도 11 내지 12는 p53 유전자의 7개의 핫 스폿(hotspot)에 대한 동시 검출을 보여주는 것이다.

도 13은 AMPCPG 매트릭스 상에서 덴드론을 사용하여 시료 E1 (Fmoc-(3)산)과 시료 E3 (Fmoc-(9)산)를 제조하고, DMF에 용해된 20 %의 피페리딘(piperidine)으로 Fmoc기를 탈보호시키고, 글루타티온(glutathione)을 혼합하는 것을 보여주는 개략도이다.

도 14은 세 가지 형태의 비드를 이용하는 정제된 GST와 GST 용해물의 결합을 보여주는 것이다. M은 마커(marker)를 의미한다. 비교예로서, GST 용해질을 똑바로 흘려주었다 (레인 1). 대조구로서 정제된 GST의 매트릭스(A, E1 및 E3)에 대한 결합을 시험하였다 (레인 2, 3 및 4). 마지막으로 세포 용해물의 결합을 시험하여 매트릭스 (A, E1 및 E3)의 효율을 조사하였다 (레인 5, 6 및 7).

도 15는 보호된 제1세대 관능기화된 덴드론 (E1, Fmoc-(3)산)과 보호된 제2 세대 관능기화된 덴드론(E3, Fmoc-(9)산)을 보여주는 것이다.

도 18은 세포 용해질에서 얻은 GST의 두 개의 대조군 비드(CL 및 CS)에 대한 결합을 E1 및 E3와 비교하여 기록하였다. M은 마커를 나타내며, 레인 1은 CL, 레인 2는 CS, 레인 3은 E1, 레인 4는 E3을 의미한다.

도 17는 세가지 융합 GST 단백질인 GST (28 kDa), GST-PX^p47(41 kDa) 및 GST-Mucnc18(98 kDa)를 사용하여 결합력의 변화를 측정한 결과를 보여주는 것이다. 세 개의 매트릭스의 상대적인 결합력을 덴시티오미터(Densitiometer)로 측정하였다. 모든 매트릭스의 결합력은 GST에 대하여 100%이다. Sepharose-4B (채워진 원);E1 (채워진 사각형); E3(열린 삼각형).

발명의 상세한 설명

본 명세서에 있어서, "a"와 "an"은 단수 및 복수를 모두 의미하기 위하여 사용된다.

본 명세서에 있어서, 본 명세서에 있어서, "앱타머(aptamer)"란 왓슨-클릭 염기 쌍 형성 또는 삼중 가닥 형성 이외의 메카니즘에 의하여 선택된 비올리고타이드 분자 또는 분자 군을 특이적으로 인식할 수 있는 단일 가닥, 부분적으로 단일 가닥, 부분적으로 이중 가닥, 또는 이중 가닥 뉴클레오타이드 서열, 유리하게 복제 가능한 뉴클레오타이드 서열 들을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "이관능성 또는 이작용성(bifunctional)", "삼관능성 또는 삼작용성 (trifunctional)" 및 "다관능성 또는 다작용성(multifunctional)"이 합성 중합체 또는 다가 호모중합체 또는 헤테로중합체성 하이브리드 구조를 지칭하기 위하여 사용되는 경우, 이가, 삼가 또는 다가를 의미하거나, 두 개, 세 개 또는 다수 개의 특이적 인식 요소, 정의된 서열 단편 또는 부착 자리들을 포함하는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "바이오미메틱(biomimetic)"이란 생물학적 분자, 분자 그룹 또는 구조를 모방하는 분자, 그룹, 다분자 구조 또는 방법을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "덴드리틱 분자(dendritic molecule)"는 중심으로부터 또는 중심쪽으로의 분지된 층의 연속적 첨가 또는 세대 첨가에 의하여 형성된 규칙적인 덴드리틱 분지를 나타내는 분자를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "덴드리틱 중합체(dendritic polymer)"란 중심으로부터 또는 중심쪽으로의 분지된 층의 연속적 첨가 또는 세대 첨가에 의하여 형성된 규칙적인 덴드리틱 분지를 나타내는 중합체를 의미한다. 덴드리틱 중합체란 단어는 중심, 적어도 하나 이상의 내부 분지층, 및 표면 분지 층에 의하여 특징지어지는 "덴드리머(dendrimers)"를 포함한다 [see, e.g., Petar et al. Pages 641-645 In Chem. in Britain, (August 1994)]. "덴드론(dendron)"이란 초점으로부터 방사된 분지를 갖는 덴드리머의 일종으로, 중심에 연결되어 있거나 연결될 수 있고, 직접 또는 연결 모이어티를 통하여 덴드리머를 형성할 수 있는 것이다. 많은 덴드리머는 공통된 중심에 연결된 둘 또는 그 이상의 덴드론을 포함한다. 그러나, 덴드리머란 단어는 넓게는 하나의 덴드론을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.

덴드리틱 중합체는 대칭 또는 비대칭적인 분지형 덴드리머와 캐스캐이드 분자 및 아보롤(arborol) 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 구체예에서, 상기 분지된 가지는 같은 길이일 수 있다. 예를 들어, 상기 분기는 통상적으로 계속해서 생성되는 분지상에 위치한 말단 NH₂기의 수소 원자의 제한 없이 일어날 수 있다. 그러나, 비대칭적인 덴드리머 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 라이신(lysine) 기원의 덴드리머는 비대칭적이다. 즉, 상기 덴드리머의 분지된 가지는 그 길이가 다르다. 한 분지가 라이신 분자의 엡실론 질소(epsilon nitrogen)에서 일어나고, 다른 분지는 상기 분지를 이전 생상된 분지에 부착시키는 반응성 카르복시기에 인접한 알파 질소(alpha nitrogen)에서 일어날 수 있다.

또한, 규칙적인 연속적 분지층의 첨가에 의해 형성되지 않았다 할지라도, 고도로 분지된 중합체 예를 들어 고도로 분지된 폴리올류(polyols)는 덴드리머의 분지된 양식에 접근할 정도의 규칙성을 가지는 분지된 양식을 나타내는 덴드리틱 중합체와 동등한 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 거대분자 또는 덴드론 구조를 설명하기 위하여 사용되는 “고도로 분지된(hyperbranched)” 또는 “분지된(branched)”란 공유결합 또는 이온결합에 의해 서브스트레이트에 결합할 수 있는 다수의 말단을 가지고 있는 다수의 중합체를 의미한다. 한 구체예에서, 상기 분지된 또는 고도록 분지된 구조를 가지는 거대분자는 미리 제조되어("pre-made"), 서브스트레이트에 결합되어 있는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명의 거대분자에서 미국특허 제5,624,711호 (Sundberg et al.)에 기재된 바와 같은 중합체 교차 결합 방법은 제외된다.

본 명세서에 있어서, "고정된(immobilized)"이란 불용성화된 것을 의미하거나, 불용성, 부분적으로 불용성, 콜로이드, 미립자, 분산, 현탁 및/또는 탈수된 물질, 또는 고체 지지체에 부착되거나 이를 포함하는 분자 또는 고체상을 포함하거나, 여기에 부착되거나, 조작가능하게 관련된 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "라이브러리(library)"란 혼합물, 분자, 재료, 표면, 구조적 형태, 표면 특징 또는 선택적이고 제한없는 다양한 화학적 존재, 단량체, 중합체, 구조체, 전구체, 산물, 변이체, 유도체, 물질, 형태, 모양, 특징의 무작위적 또는 비무작위적 혼합, 집합 또는 분류(assortment)를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "리간드"는 상보적인 염기쌍 결합을 포함하는 친화성 기재의 인력에 의하여 다른 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 선택된 분자를 의미한다. 상기 리간드는 핵산, 다양한 합성 화합물, 수용체 작용물질(receptor agonist), 부분적 작용물질, 혼합 작용물질, 길항물질(antagonist), 반응 유발 분자(response-inducing molecule), 반응 촉진 분자(response-stimulus molecule), 약물, 호르몬, 페로몬, 신경전달물질(transmitter), 오타코이드(autacoid), 성장인자(growth factors), 사이토카인(cytokine), 보결 분자단(prosthetic group), 조효소(coenzyme), 보조인자(cofactors), 서브스트레이트, 전구체(precursors), 비타민, 독소(toxins), 조절인자(regulatory factor), 항원, 합텐(hapten), 탄수화물, 분자 모사체(molecular mimic), 구조적 분자(structural molecule), 작동 분자(effector molecule), 선택분자(selectable molecule), 바이오틴(biotin), 디곡 시제닌(digoxigenin), 교차반응물질(crossreactant), 유사체(analog), 경쟁제(competitor) 및 이들 분자의 유도체 뿐만 아니라 선택된 표적과 특이적인 결합을 수행할 수 있는 라이브러리-선택 비올리고뉴클레오타이드 분자 및 이러한 물질들이 2차 반응 물질(second molecule)과 결합시킴으로써 형성되는 콘쥬게이트를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, "링커 분자," 및 "링커"은 분지된/선형 중합체와 같은 분자 크기 제어된 거대분자의 분지된 부분을 보호기 또는 리간드에 결합시키는 분자를 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어, 링커는 리간드를 덴드론에 부착시킬 수 있는 선택된 분자, 스페이서 분자 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에 있어서, "저밀도(low density)"는 프로브의 개수가 약 0.01 내지 약 0.5 개/nm², 바람직하게는 약 0.05 내지 약 0.2개/nm², 더 바람직하게는 약 0.075 내지 약 0.15개/nm², 가장 바람직하게는 약 0.1개/nm²인 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "분자 모사체(molecular memics)" 및 "미메틱스(mimetics)"는, 예컨대 천연, 생물학적 또는 선별된 분자와 같은 다른 분자 또는 분자의 그룹의 구조 또는 기능과 동등하거나 유사한 구조 또는 기능을 갖도록 설계, 선택, 제작, 개질 또는 엔지니어링된 천연 또는 합성 뉴클레오타이드 또는 비뉴클레오타이드 분자 또는 분자의 그룹을 의미한다. 분자 모사체는 천연, 합성, 선택된 또는 생물학적 분자에 대한 대체제, 대안제, 기능향상제, 기능개선제, 구조 적 유사체 또는 기능적 유사체로서 작용할 수 있는 분자 또는 다분자 구조체를 포함한다.

본 명세서에 있어서, "뉴클레오타이드 유사체(nucleotide analog)"란 핵산합성 및 가공, 바람직하게는 화학적 합성 및 가공뿐만 아니라 효소적 합성 및 가공에서 자연적으로 존재하는 염기를 대신하여 사용될 수 있는 분자들, 특히 염기쌍을 형성가능한 변형된 뉴클레오타이드, 및 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 또는 소수 염기들을 포함하지 않는 임의로 합성된 염기들을 의미한다. 이러한 용어는 변형된 퓨린 및 피리미딘, 소수 염기, 전화가능한 뉴클레오시드, 퓨린 및 피리미딘과 구조적 유사체, 표지화(labeled), 유도체화 및 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오타이드, 컨주게이티드 뉴클레오시드 및 뉴클레오타이드, 서열 개질제(modifier), 말단 개질제, 스페이서 개질제, 및 골격이 변형된 뉴클레오타이드을 포함하며 이에한정되지 않으며, 또한 리보스-변형 뉴클레오타이드, 포스포아미데이트, 포스포로티오에이트, 포스폰아미디트, 메틸 포스페노이트, 메틸 포스포아미디트, 메틸포스토아미디트, 5'-β-시아노에틸 포스포아미디트, 메틸렌포스포네이트, 포스포디오티오에이트, 펩티드, 핵산, 비광학선택성(achiral) 및 중성 뉴클레오티드 연결(internucleotidic linkages)과 폴리에틸렌글리콜, 방향성 폴리아마이드 및 지방과 같은 비뉴클레오타이드 연결을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에 있어서, "중합체 또는 폴리머(polymer)" 또는 "분지된/선형 폴리머 또는 중합체"라 함은 분자의 일 말단에서 분지된 구조를 가지고, 다른 말단에는 선형 부분을 가져 분지된 영역이 서브스트레이트에 결합하고 선형 영역이 리 간드, 프로브 또는 보호기에 결합하는 분자를 의미한다.

본 명세서에 있어서, "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"이란, 아미노산 잔기로 구성된 중합체를 의미하는 것으로서 상호 혼용될 수 있다. 이 용어는 자연계에 존재하는 아미노산으로 구성된 중합체뿐만 아니라, 하나 이상의 잔기가 자연에 존재하는 아미노산에 상응하는 임위적으로 합성한 유사체인 경우에도 적용된다. 상기 단어는 또한 폴리펩티드를 만드는 아미노산을 연결하는 전형적인 펩티드 결합에 대한 다양한 변이체를 포함하는 것으로 사용된다.

본 명세서에 있어서, "보호기(protecting group)"란 분자의 반응기(예를 들어 하이드록실기 또는 아민기)에 결합된 그룹을 말한다. 상기 보호기란 하나 이상의 화학 반응에서 특정 라디칼의 반응을 저지하기 위해 선택된 것을 의미한다. 일반적으로, 특정 보호기는 분자에 존재하는 다른 반응기의 변화없이 특정 반응기를 회복하기 위해 나중에 제거되도록 하기 위하여 선택되는 것을 의미한다. 보호기의 선택은 보호대상 특정 라디칼의 기능과 그것이 제시될 화합물을 고려하여 이루어진다. 상기 보호기의 선택과 관련된 기술은 예를 들어, Greene등의 Protective Groups in Organic Synthesis[2판, John Wiley & Sons, Inc. Somerset, N.J. (1991)]등에 잘 알려져 있다.

본 명세서에 있어서, "보호화된 아민(protected amine)"이란 아미노 보호기와반응한 아민을 의미한다. 아미노 보호기는 선형 말단의 기능기가 아미노기인 경우에 분지된 말단이 고체 지지체에 결합되는 동안 아미드 반응이 이루어지는 것을 방지한다. 상기 아미노 보호기는 상기 분자에서 다른 반응기의 변화없이 아미노기 를 유지하여 다음 단계에서 제거될 수 있게 한다. 예를 들어, 상기 엑소사이클릭아민(exocyclic amine)은 디메틸아미노메틸렌아미노반응을 수행하기 위해, 디메틸포름아미드 디에틸아세탈과 반응할 수 있다. 아미노 보호기는 일반적으로 카바메이트(carbamate), 벤질 라디칼(benzyl radical), 이미데이트(imidate) 및 관련 분야의 당업자에게 알려진 다른 것들을 포함한다. 바람직한 아미노 보호기로는 p-니트로페닐에톡시카보닐(p-nitrophenylethoxycarbonyl)이나 디메틸아미노메틸렌아미노가 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 있어서, "규칙적인 간격(regular interval)"이라 용어는 상기 분자 크기 제어된 덴드리머(size-controlled dendrimers) 거대분자의 말단 사이의 공간이 규칙적인 것을 의미하며, 이들간의 거리가 실제적인 입체장애(steric hindrance)없이 표적 특이적 리간드와 표적 사이의 상호작용이 일어나기 위한 공간인 약 1 nm 내지 약 100 nm인 것을 의미한다. 따라서, 서브스트레이트상의 거대분자층은 특이적인 분자 상호작용이 일어날 수 있도록 지나치게 밀도가 높아서는 안된다.

본 명세서에 있어서, "고체 지지체(solid support)"는 고정화된 서브스트레이트로 이루어진 구조를 의미한다. 상기 고정화된 서브스트레이트란 불용성 물질, 고상, 표면, 서브스트레이트, 층, 코팅(coating), 직물 또는 부직포, 매트릭스, 결정, 멤브레인, 불용성 중합체, 플라스틱, 유리, 생물학적 또는 생물 양립성(biocompatible) 생물 부식성(bioerodible) 또는 생분해가 가능한 중합체 또는 서브스트레이트, 마이크로파티클(microparticle) 또는 나노파티클(nanoparticle)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 고체 지지체는 예를 들어, 단일층(monolayers), 이중층(bilayers), 상업적 멤브레인(commercial membranes), 수지(resins), 매트릭스, 섬유, 분리매질(separation media), 크로마토그래피 지지체(chromatography support), 중합체, 플라스틱, 유리, 운모, 금, 비드, 마이크로스피어, 나노스피어, 실리콘, 갈륨 비화물, 유기 및 무기금속, 반도체, 절연제, 마이크로 구조 및 나노 구조를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 마이크로구조 및 나노구조는 초소형화이고 나노미터규모이며 초분자크기인 프로브, 팁(tip), 바(bar), 쐐기, 마개, 막대(rod), 슬리브(sleeve), 선(wire), 필라멘트 및 튜브를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에 있어서, "스페이서 분자"란 두 뉴클레오타이드간 또는 뉴클레오타이드와 비튜클레오티드가 결합할 수 있게 선택되거나 고안된, 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 또는 비뉴클레오타이드 분자, 기능기, 스페이서 가지(arm)를 의미하며, 바람직하게는 뉴클레오타이드간 또는 뉴클레오타이드와 비튜클레오티드간의 거리를 변화 또는 조정할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에 있어서, "특이적 결합"이란 리간드 및 이의 특이적 결합 파트너사이, 또는 정의된 서열 단편 및 선택된 분자 또는 선택된 핵산 서열사이에, 측정가능하고 재현성 있는 정도의 인력을 의미한다. 인력의 정도는 최대일 필요는 없다. 약한, 중간, 또는 강한 인력이 여러 가지 적용에 적합할 수 있다. 이러한 상호작용에서 일어나는 특이적 결합은 본 기술분야의 전문가에게 잘 알려져 있다. 정의된 합성 서열 단편에 관하여 그것은 합성 앱타머, 합성 헤테로중합체에, 뉴클레 오타이드 리간드, 뉴클레오타이드 수용체, 형상 인식 요소 및 특이적으로 결합가능 한 표면일 수 있다. 상기 "특이적 결합"은 구조적 형상과 표면 특징을 특이적으로 인식하는 것을 포함한다. 특이적 결합은 화학적 동일성(identity)(즉, 하나 이상의 동일한 화학적 그룹) 또는 특이적 결합 파트너를 갖는 분자적 인식능(즉, 분자적 결합 특이성)을 공유하는 제3의 분자(즉, 경쟁자) 에 의해 경쟁적으로 저해될 수 있는 두 분자간(즉, 특이적 결합 파트너)의 특이적, 포화가능한(saturable), 비공유적 상호작용을 맹백히 의미한다. 상기 경쟁자는 예를 들어 교차반응물(cross reactant), 항체 또는 이의 항원 유사체, 리간드 또는 이의 수용체, 또는 앱타머 또는 이의 표적일 수 있다. 예를 들어, 항원 항체간의 특이적 결합은 교차반응하는 항체 또는 항원에 의해서 경쟁적으로 저해될 수 있다. 상기 "특이적 결합"이란 특이적 결합과 구조적 형상 인식을 모두 포함하는 특이적 인식의 부분 집합으로서 약자로 또는 근접한 의미로 편의상 사용될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "서브스트레이트"이란 물질(substance), 구조, 표면 또는 재료(material)에서 사용되는 경우에, 비생물학적, 합성적, 살아있지 않은(nonliving), 평편적, 구형의 또는 편평한 표면을 포함하는 조성물으로서, 표면, 구조, 또는 재료을 포함하는 다양한 분자종을 초월하는 다수의 인식 자리, 특이적 결합, 혼성화 또는 촉매적 인식 자리 또는 다수의 다양한 인식 자리를 포함한다. 상기 서브스트레이트는 예를 들어, 반도체, 합성(유기)금속, 합성 반도체, 절연제, 도판트(dopant); 금속, 합금, 원소, 화합물, 미네랄; 합성, 절단, 에칭, 리쏘그래피, 인쇄, 기계화되거나, 미세하게 제작된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적 중합체, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속과 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 모, 옷, 직물 또는 부직포, 재료(material), 파브릭; 분지된/선형 중합체를 이용하여 프로브 분자의 고정화에 의해 개질되지 않은 나노구조 또는 마이크로구조을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서에 있어서, "표적-프로브 결합(target-probe binding)"은 적어도 하나의 선택된 분자가 특이적 방식으로 다른 하나에 결합된 둘 이상 분자를 의미하는 것이다. 일반적으로, 첫 번째 선택된 분자는 두 번째 선택된 분자와 간접적으로 즉 예를 들어, 스페이서 가지(arm), 스페이서 그룹, 분자, 브릿지, 운반체, 또는 특이적 인식 파트너의 개입을 통하여, 또는 직접적으로 예를 들어, 스페이서 가지, 그룹, 분자, 브릿지, 운반체, 또는 특이적 인식 파트너 없이 결합할 수 있다. 다른 비공유적 결합은 뉴클레오타이드 및 비뉴클레오타이드 분자의 접합을 의미하며, 예를 들면, 이온결합, 소수성 상호작용, 리간드-뉴클레오타이드 결합, 킬레이팅제/금속 이온쌍 형성 또는 특이적 결합 쌍, 예컨대 아비딘/바이오틴, 스트렙타비딘/바이오틴, 안티-플루오레세인/플루오레세인, 안티-2,4-디니트로페놀(anti-2,4-dinitrophenol)/디니트로페놀(DNP), 항퍼옥시데이즈(peroxidase)/퍼옥시데이즈,항디곡시제닌(digoxigenin)/디곡시제닌 또는 더욱 일반적으로 수용체/리간드간의 결합을 포함한다. 예를 들어, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase), 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), β-갈락토시다아제, 우레아제(urease), 루시퍼라제(luciferase), 로다민(rhodamine), 플루오레세인 (fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 루미놀, 이소루미놀, 아크리디니윰 에스테르 또는 예를 들 어, 표지의 목적으로 사용된 형광 마이크로스피어 등의 리포터분자가 선택된 분자 또는 선택된 핵산 서열에 아비딘/비오틴(avidin/biotin), 스트렙타비딘/비오틴(streptavidin/biotin), 안티-플루오세인/플루오세인, 안티-퍼옥시데이즈(peroxidase)/퍼옥시데이즈 항-2,4-디니트로페놀(anti-2,4-dinitrophenol)/디니트로페놀(DNP), 항디곡시제닌(digoxigenin)/디곡시제닌 또는 수용체/리간드간의 결합을 통해(즉, 직접적 및 공유 결합을 통해) 선택된 분자 또는 선택된 핵산 서열에 특이적 결합쌍을 통해 접합할 수도 있다.

거대분자 중합체 제제(formulation)

도 1은 본 발명의 중합체를 설명하기 위한 도표이다. 다양한 R, T, W, L 및 X기의 변이체들이 도 1에 나타나있다. 상기 본 발명의 거대분자 중합체는 분지되거나 고도로 분지되거나, 또는 대칭이거나 비대칭인 중합체를 포함한다. 상기 중합체의 분지된 말단은 바람직하게는 다수의 말단을 통해 서브스트레이트에 결합할 수 있다. 상기 중합체의 선형 말단은 보호기 또는 표적 특이적 리간드에 결합할 수 있는 관능기를 가질 수 있다. 상기 서브스트레이트상의 다수의 중합체사이에 프로브간의 거리는 약 0.1 nm 내지 약 100 nm일 수 있으며, 바람직하게는 약 1 nm 내지 약 100 nm, 바람직하게는 약 2 nm 내지 약 70 nm, 더욱 바람직하게는 약 2 nm 내지 약 60 nm, 가장 바람직하게는 약 2 nm 내지 약 50 nm일 수 있다.

R - 작용기

도 1에 기재된 식 I에 따르면, 상기 중합체는 일반적으로 분지된 섹션을 포함하며, 다수의 말단이 관능기화되어 서브스트레이트에 결합한다. 상기 분지된 섹 션 내에서, 분지의 제1세대 작용기 R_x (R₁, R₂, R₃) 은 관능기 W에 의하여 분지의 제2세대 작용기 R_xx (R₁₁, R₁₂, R₁₃, R₂₁, R₂₂, R₂₃, R₃₁, R₃₂, R₃₃)와 연결되어 있다. 상기 분지의 제2세대 작용기는 관능기 W에 의하여 분지의 제3세대 작용기 R_xxx (R₁₁₁, R,₁₁₂, R₁₁₃, R₁₂₁, R₁₂₂, R₁₂₃, R₁₃₁, R₁₃₂, R₁₃₃, R₂₁₁, R₂₁₂, R₂₁₃, R₂₂₁, R₂₂₂, R₂₂₃, R₂₃₁, R₂₃₂, R₂₃₃, R₃₁₁, R₃₁₂, R₃₁₃, R₃₂₁, R₃₂₂, R₃₂₃, R₃₃₁, R₃₃₂, R₃₃₃)와 연결되어 있다. 그리고, 추가적인 제4세대가 동일한 방식으로 분지의 제3세대 작용기에 연결될 수 있다. 말단의 R기는 서브스트레이트에 결합할 수 있도록 관능기화되어 있다.

모든 세대의 R기는 동일하거나 상이한 것일 수 있다. 통상적으로, R기는 반복단위, 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴, 에테르, 폴리에테르, 에스테르, 아미노알킬 등과 같은 선형 또는 분지형 유기 모이어티일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러나, 모든 R기가 동일한 반복 단위이거나, R기의 모든 원자가 위치(valence position)가 반복 단위로 채워질 필요는 없다. 예컨대, 제1세대 분지 R_x, R₁, R₂, R₃ 에 있어서, 상기 분지 수준에서의 모든 R기는 동일한 반복단위일 수 있다. 또는, R₁은 반복단위이고, R₂와 R₃는 H 또는 다른 모든 화학 작용기(chemical entity)일 수 있다. 또는, R₂ 는 반복단위이고, R₁와 R₃는 H 또는 다른 모든 화학 작용기일 수 있다. 이와 유사하게, 제2세대 및 제3세대 분지의 경우에는, R기는 반복단위, H 또는 다른 모든 화학 작용기일 수 있다.

따라서, 이러한 방식으로 다양한 모양의 중합체를 제작할 수 있다. 예컨대, R₁, R₁₁, R₁₁₁, R₁₁₂ 및 R₁₁₃이 동일한 반복단위이고, 다른 모든 R기가 H' 또는 다른 많은 중성 소분자 또는 원자인 경우에는, R₁₁₁, R₁₁₂ 및 R₁₁₃에 대한 세 개의 관능기 말단(termini)을 갖는 분지를 갖는 상당히 길고 얇은 중합체가 만들어진다. 다양한 임의의 다른 화학적 배열이 가능하다. 따라서, 서브스트레이트에 결합 가능한 관능기를 갖는 약 3 내지 약 81 개의 말단을 얻을 수 있다. 바람직한 말단의 개수는 약 3개 내지 약 75개, 약 3개 내지 약 70개, 약 3개 내지 약 65개, 약 3개 내지 약 60개, 약 3개 내지 약 55개, 약 3개 내지 약 50개, 약 3개 내지 약 45개, 약 3개 내지 약 40개, 약 3개 내지 약 35개, 약 3개 내지 약 30개, 약 3개 내지 약 27개, 약 3개 내지 약 25개, 약 3개 내지 약 21개, 약 3개 내지 약 18개, 약 3개 내지 약 15개, 약 3개 내지 약 12개, 약 3개 내지 약 9개 또는 약 3개 내지 약 6개일 수 있다.

T - 말단기

말단기 T는 첨가 반응 또는 치환 반응이 일어나도록 하기에 충분히 반응성있는 작용기이다. 이러한 작용기의 예로서 아미노, 하이드록실, 머캅토, 카르복실, 알케닐, 알릴, 비닐, 이미도, 할로, 우레아, 옥시라닐, 아지리디닐, 옥사졸리닐, 이미다졸리닐, 설포네이토, 포스포네이토, 이소시아네이토, 이소티오시아네이토, 실라닐, 및 할로게닐 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

W - 작용기

도 1의 식 I에 있어서, W는 중합체를 다른 것 (또는 다른 모든 2가 유기 모 이어티)에 연결시킬 수 있는 모든 작용기일 수 있으며, 에테르, 에스테르, 아마이드, 케톤, 우레아, 우레탄, 이미드, 카르보네이트, 카르복실산 무수물, 카르보디이미드, 이민, 아조기, 아미딘, 티오카르보닐, 유기 설파이드, 디설파이드, 폴리설파이드, 유기 설폭사이드, 설파이트, 유기 설폰, 설폰아마이드, 설포네이트, 유기 설페이트, 아민, 유기 포스포러스기, 알킬렌, 알킬렌옥사이드, 알킬렌아민, 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

L - 스페이서 또는 링커

도 1에 있어서, 중합체의 선형 부분은 임의로 작용기가 산재된 링커 부위를 포함하는 스페이서 도메인을 포함할 수 있다. 링커 부위는 다양한 중합체로 구성될 수 있다. 링커의 길이는 다양한 인자들에 의하여 결정될 수 있으며, 이러한 인자들에는 서브스트레이트에 결합하는 분지된 작용기의 수, 서브스트레이트와의 결합 길이, 사용된 R기의 형태, 특히, 사용된 반복단위 형태, 중합체의 선형 부위의 끝에 부착될 표적 특이적 리간드 또는 보호기의 형태, 등이 있다. 따라서, 상기 링커는 특정 유형의 중합체 또는 특정 길이로 제한되지 않는 것으로 이해된다. 그러나, 일반적인 기준으로서, 링커의 길이는 약 0.5 nm 내지 약 20 nm일 수 있으며, 바람직하게는 약 0.5 nm 내지 약 10 nm, 가장 바람직하게는 약 0.5 nm 내지 약 5 nm인 것이 좋다.

링커의 화학적 구조체는 치환되거나 또는 비치환된 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아릴, 에테르, 폴리에테르, 에스테르, 아미노알킬, 폴리알케닐글리콜 등과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 선형 또는 분지형 유기 모 이어티를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기 링커는 상기한 바와 같은 것들과 같은 작용기를 추가로 포함할 수 있고, 상기한 바와 같이 어떠한 특정 구조에 제한되지 않는다.

끝부분에서 관능기화된 링커는 보호기를 포함할 수 있다. 따라서, 한 측면에 있어서, 본 발명은 보호기가 부착된 선형 끝부분을 포함하는 다수의 분지/선형 중합체가 부착된 서브스트레이트에 관한 것이다. 이러한 서브스트레이트는 화학적으로 반응하여 표적 특이적 리간드에 의하여 대체될 보호기를 제거할 수 있다. 따라서, 본 발명의 시스템의 기능적 용도에 있어서, 일단의 표적 특이적 리간드에 연결된 분지형/선형 중합체와 결합된 서브스트레이트가 제공된다.

X - 보호기

보호기의 선택은 바람직한 산-반응성 또는 염기-반응성과 같은 다수의 인자에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명은, 작용기가 다른 화학 작용기와 반응하는 것을 방지하는 기능을 제공하고, 소망하는 특정화된 조건 하에서 제거될 수 있는 것인 한, 어떠한 특정 보호기에도 한정되지 않는다. 상기 보호기는 용이하게 제거될 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용될 수 있는 이러한 보호기의 예로서 다음의 것을 들 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다:

아미노산 보호기: 메틸, 포르밀, 에틸, 아세틸, t-부틸, 아니실, 벤질, 트리플루오로아세틸, N-하이드록시숙신이미드, t-부틸옥시카르보닐, 벤조일, 4-메틸벤질, 티오아니질, 티오크레실, 벤질옥시메틸, 4-니트로페닐, 벤질옥시카르보닐,2-니트로벤조일, 2-니트로페닐설페닐, 4-톨루엔설포닐, 펜타플루오로페닐, 디페닐메틸 (Dpm), 2-클로로벤질옥시카르보닐, 2,4,5-트리클로로페닐, 2-브로모벤질옥시카르보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐, 트리페닐메틸, 2,2,5,7,8-펜타메틸-크로만-6-설포닐, 프탈로일, 3-니트로프탈로일, 4,5-디클로로프탈로일, 테트라브로모프탈로일, 테트라클로로프탈로일.

알코올에 대한 보호기: p-아니실옥시메틸 (p-AOM), 벤질옥시메틸 (BOM), t-부톡시메틸, 2-클로로테트라하이드로푸란 (THF), 구아이아콜메틸 (Guaiacolmethyl, GUM), (1R)-멘톡시메틸 (menthoxymethyl, MM), p-메톡시벤질옥시메틸 (PMBM), 메톡시에톡시메틸 (MEM), 메톡시메틸 (MOM), o-니트로벤질옥시메틸, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸 (SMOM), 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 (SEM).

DNA, RNA 보호 시약: 2'-OMe-Ac-C-CE 포스포라미다이트, 2'-OMe-Ac-RNA CPG, 2'-OMe-I-CE 포스포라미다이트, 2'-OMe-5-Me-C-CE 포스포라미다이트, Ac-C-CE 포스포라미다이트, Ac-C-RNA 500, dmf-dG-CE 포스포라미다이트, dmf-dG-CPG 500, 2-아미노-dA-CE 포스포라미다이트, (M.P. Reddy, N.B. Hanna, and F. Farooqui, tetrahedron Lett., 1994, 35, 4311-4314; B.P. Monia, et al., J. Biol. Chem., 1993, 268, 14514-14522).

유기 합성에 있어서의 일반적인 보호 시약: (디메틸-t-부틸실릴옥시)메틸 클로라이드 (SOMCl), 에톡시에틸 클로라이드 (EECl), -클로로 에테르류, o-니트로벤질옥시메틸 클로라이드, b,b,b-트리클로로에톡시메틸 클로라이드 (TCEMCl), (-)-멘틸(Menthyl) 에스테르, (P)-벤질 에스테르, 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-페닐-2-프로필 에테르, 1,1,3,3-테트라메틸-1,3,2-디실라잔, 1,2,4-디티아졸리딘-3,5-디온, 1,2-디브로마이드, 1,2-디클로라이드, 1,2-디올 모노-4-메톡시벤질 에테르, 1,2-디올 모노-t-부틸 에테르, 1,2-디올 모노아세테이트 에스테르, 1,2-디올 모노알릴 에테르, 1,2-디올 모노벤조에이트 에스테르, 1,2-디올 모노벤질 에테르, 1,2-디올 모노토실레이트, 1,3-벤조디티올란, 1,3-벤조디티올란-2-일 에테르, 1,3-디올 모노-4-메톡시벤질 에테르, 1,3-디올 모노벤조에이트 에스테르, 1,3-디올 모노벤질 에테르, 1,3-디옥산, 1-(2-(트리메톡시실릴)에톡시)에틸 에테르, 1-아다만틸 에스테르, 1-벤조일-1-프로펜-2-일 아민, 1-에톡시에틸 에테르, 1-메톡시에틸리덴 아세탈, 1-메틸-1-메톡시에틸 에테르, 1-페닐-3,5-디-t-부틸시클로헥사디엔-4-온일 아민, 1-페닐에틸 에스테르, 2,2,2-트리클로로에톡시메틸 에테르, 2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트, 2,2,2-트리클로로에틸 에스테르, 2,2,2-트리클로로에틸 포스페이트, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설폰아마이드, 2,2-디메틸-4-펜테노에이트 에스테르, 2,3,6-트리메틸-4-메톡시벤젠설폰아마이드, 2,4,6-트리메틸벤젠설폰아마이드, 2,4-DNP 하이드라존, 2,5-디클로로페닐 포스페이트, 2,5-디메틸피롤, 2-(2-메톡시에톡시)에틸 에스테르, 2-(4-니트로페닐)에틸 에테르, 2-(4-니트로페닐)에틸 포스페이트, 2-(4-톨루엔설포닐)에틸 에스테르, 2-(Di브로모메틸)벤조에이트 에스테르, 2-(트리메틸실릴)에틸 카르보네이트, 2-(트리메틸실릴)에틸 에스테르, 2-(트리메틸실릴)에틸 에테르, 2-벤젠설포닐에틸 티오에테르, 2-브로모에틸 에스테르, 2-클로로에틸 에스테르, 2-클로로페닐 포스페이트, 2-시아노에틸 포스페이트, 2-메톡시에틸 에스테르, 2-니트로벤젠설펜아마이드, 2-니트로벤젠설폰아마이드, 2-옥사졸린, 2-페닐에틸 에스테르, 2-피리딜 디설파이드, 2-테트라하이드로피라닐 아민, 4-클로로 벤조에이트 에스테르, 4-클로로부틸 에스테르, 4-메톡시벤즈아마이드, 4-메톡시벤조에이트 에스테르, 4-메톡시벤질 아민, 4-메톡시벤질 에스테르, 4-메톡시벤질옥시메틸 에테르, 4-니트로벤즈아마이드, 4-니트로벤조에이트 에스테르, 4-니트로벤질 에스테르, 4-니트로벤질 에테르, 4-니트로벤질 포스페이트, 4-니트로페닐 에스테르, 4-니트로페닐 하이드라존, 4-톨루엔설폰아마이드, 4-톨루엔설포네이트, 9-플루오레닐메틸 카르보네이트, 9-플루오레닐메틸 에스테르, 알릴 카르보네이트, 알릴 에스테르, 벤젠설폰아마이드, 벤젠설포네이트, 벤질 카르보네이트, 벤질 에스테르, BOM 에테르, DMTr 에테르, MEM 에테르, 메탄설폰아마이드, 메탄설포네이트, 에틸 카르보네이트, MMTr 에테르, MOM 카르보네이트, MOM 에스테르, MOM 에테르, MTHP 에테르, MTM 에스테르, MTM 에테르, N-4-메톡시벤질 아마이드, N-4-톨릴 아마이드, N-벤젠설포닐 아마이드, N-벤질 이민, n-부틸 에스테르, n-부틸 에테르, O-4-메톡시벤질 카바메이트, O-9-플루오레닐메틸 카바메이트, 페닐 티오에테르, 페닐 티올에스테르피페리딘아마이드, PMB 에테르, SEM 에스테르, SEM 에테르, 숙시네이트 에스테르, t-부틸 카르보네이트, t-부틸 에스테르, t-부틸 에테르,t-부틸 포스페이트, t-부틸 티오에테르, t-부틸 티올에스테르, TBDMS 에스테르, TBDMS 에테르, TBDPS 에테르, TES 에테르, THF 에테르, THP 에테르, TIPDS 디에테르, TIPS 에테르, TMS 에스테르, TMS 에테르, TMS 티오에테르, 토실 하이드라존, TPS 에테르, 트리플루오로아세트아마이드.

상업적으로 입수 가능한 보호기의 목록은 Sigma-Aldrich (2003) 카탈로그에서 찾을 수 있으며, 그 내용은 보호기의 기재와 관련있기 때문에 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.

일반적으로, 본 발명의 한 측면에 있어서, 본 발명에 사용된 보호기는 연속하는 하나 이상의 아미노산 또는 적절하게 보호된 아미노산의 성장중인 펩타이드 사슬에의 첨가에 사용되는 것들일 수 있다. 보통은, 제1 아미노산의 아미노기 또는 카르복실기는 적절한 보호기에 의하여 보호된 것이다.

특히 바람직한 방법에 있어서, 상기 아미노 작용기는 산 민감 또는 염기 민감 작용기에 의하여 보호된 것이다. 이러한 보호기들은 연결 형성 조건에 적합하면서, 성장중인 분지형/선형 중합체의 파괴 없이 용이하게 제거될 수 있는 특성을 가져야 한다. 이와 같은 적절한 보호기들에는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc), t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐 (Cbz), 비페닐이소프로필-옥시카르보닐, t-아밀옥시카르보닐, 이소보닐옥시카르보닐, (α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐, o-니트로페닐설페닐, 2-시아노-t-부틸옥시카르보닐, 등이 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

특히 바람직한 보호기의 예는 또한 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 (pmc), p-톨루엔설포닐, 4-메톡시벤젠설포닐, 아다만틸옥시카르보닐, 벤질, o-브로모벤질옥시카르보닐, 2,6-디클로로벤질, 이소프로필, t-부틸 (t-Bu), 시클로헥실, 시클로페닐 및 아세틸 (Ac), 1-부틸, 벤질 및 테트라하이드로피라닐, 벤질, p-톨루엔설포닐 및 2,4-디니트로페닐 등을 포함한다.

추가적인 방법에 있어서, 선형/분지형 중합체의 분지 말단을 적절한 고체 지지체에 부착시킨다. 상기 합성에 사용 가능한 적절한 고체 지지체는 사용되는 배 지에서 불용성일 뿐 아니라, 순차적인 축합-탈보호 반응의 조건 및 시약에 불활성인 물질들이다.

분지형/선형 중합체의 선형 말단부분으로부터의 Fmoc와 같은 보호기의 제거는 이차 아민, 바람직하게는 피페리딘으로 처리하여 수행할 수 있다. 상기 보호된 부분을 약 3배 과량의 몰수로 도입시킬 수 있고, DMF 내에서 커플링을 수행하는 것이 바람직할 수 있다. 커플링제는 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트 (HBTU, 1 당량) 및 1-하이드록시-벤조트리아졸 (HOBT, 1 당량)일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.

폴리머는 연속 조작 또는 단일 조작으로 탈보호시킬 수 있다. 폴리펩타이드의 제거 및 탈보호는 서브스트레이트 결합 폴리펩타이드를 절단 시약(cleavage reagent)으로 처리함으로써 단일 조작으로 수행할 수 있으며, 상기 절단 시약으로는 예컨대 티아니졸(thianisole), 물, 에탄디티올 및 트리플루오로아세트산 등을 사용할 수 있다.

아래의 표 1은 다향한 유형의 예시적 화합물을 열거한 것이다. 그러나, X, L, W, R 및 T의 변이들도 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다.

[표 1]

표적 특이적 (Target-Specific) 리간드 또는 프로브

표적 특이적 리간드는, 또한 프로브라고도 불리우며, 상기 분지형/선형 중합체의 선형 말단에 부착하게 될 부분으로서, 화학물질, 생화학물질, 생활성 화합물 등의 다양한 화합물을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 리간드는 핵산, 올리고뉴클레오타이드, RNA, DNA, PNA, 또는 압타머(aptamer)일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 천연 핵산 또는 그의 유사체일 수 있다. 따라서, 상기 리간드는 천연 아미노산 또는 합성 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 리간드는 핵산, 아미노산, 탄수화물, 또는 분지형/선형 폴리머의 선형 부분에 부착할 수 있는 다른 모든 화학 물질의 조합일 수 있다. 특히, 상기 리간드는 트리아진 골격 등에 기초하는 화학물질일 수 있으며, 이는 조합적 화학 라이브러리, 특히 트리아진 표지된 라이브러리의 성분으로서 사용될 수 있다..

서브스트레이트 (Substrate)

서브스트레이트는 상기 분지형/선형 중합체가 공유결합 또는 이온 결합에 의하여 결합할 수 있는 모든 고체 표면을 의미하는 것일 수 있다. 상기 서브스트레이트는 상기 분지형/선형 중합체의 분지된 말단 사이에 결합이 일어날 수 있도록 관능기화된 것일 수 있다. 상기 서브스트레이트의 표면은 이 발명이 속하는 기술 분야의 당업자의 필요에 따라서 다양한 표면을 가질 수 있다. 마이크로어레이 또는 바이오칩 포맷이 요구되는 경우에는, 통상적으로 산화된 실리콘 웨이퍼, 융합 실리카 또는 유리를 서브스트레이트으로 사용할 수 있다. 상기 서브스트레이트는 유리 슬라이드인 것이 바람직하다. 서브스트레이트의 다른 예로서 니트로셀룰로오스 또는 나일론과 같은 맴브레인 필터를 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상 기 서브스트레이트는 친수성 또는 극성인 것일 수 있으며, 코팅 전 또는 후에 음전하 또는 양전하를 띠는 것일 수 있다.

마이크로어레이 (microarray)

DNA 마이크로어레이의 성능을 향상시키기 위하여, 프로브 설계, 스포팅 동안의 반응 조건, 혼성화 및 세척 조건, 비특이적 결합의 억제, 생체분자(biomolecule)와 표면 간의 거리, 및 고정화된 생체분자들 간의 공간 등의 문제들이 고려되어야 한다. 이들 인자들의 대부분은 마이크로어레이 표면의 성질과 관련된 것이기 때문에, 마이크로어레이 연구에 있어서 표면 최적화가 주요한 목적이 되고있다. Whitesell과 Chang은 고정화된 올리고펩타이드의 알파-나선 형성이 공간-제어된(space-controlled) 금 표면에서 촉진됨을 보여주었다 [Whitesell et al., Science 261, 73-76 (1993)].

본 발명에서는 원뿔형 덴드론에 의하여 용해값 (1:0.01)에 가까운 단염기 다형성 (single nucleotide polymorphism, SNP) 식별 효율을 가지면서, DNA 비특이적 결합은 감소된 DNA 마이크로어레이가 제공될 수 있다.

도 2는 덴드론의 합성을 보여주는 개략도이다. 다양한 출발 물질, 중간체 화합물 및 덴드론 화합물들이 나타나 있으며, 도면 중 'X'는 안트라센메틸 (A), Boc, Fmoc, Ns 등과 같은 모든 보호기일 수 있다. 도 3는 덴드론 (도 4)으로 유리 표면을 개질시키는 것과, 형광물질(fluorophore) 표지된 표적 뉴클레오타이드를 적합한 올리고뉴클레오타이드 프로브와 선택적으로 혼성화시키면서, 단염기 잘못 짝지워진 쌍을 덴드론 개질된 표면에서 효과적으로 식별해낼 수 있음을 보여준다.

분지 말단에 표면 반응성 작용기를 갖는 제2세대 분지 덴드론을 사용할 수 있으며, 이는 자기 조립 가능하고, 이들 간 적절한 공간을 제공한다. 지금까지의 연구는 유리 서브스트레이트 상의 양이온과 덴드론 말단의 음이온 카르복실레이트 간의 다중 이온 결합 (multiple ionic attraction)에 의하여 양호한 거동의(well-behaved) 단일층을 성공적으로 생성하고, 리간드 간 간격을 24 Å이상으로 확보할 수 있음을 보여주었다 [Hong et al., Langmuir 19, 2357-2365 (2003)]. 탈보호를 용이하게하고, 탈보호된 끝부분 아민의 반응성을 증진시키기 위하여, 본 발명자들은 상기 구조를 도 4에 나타낸 바와 같이 변형시켰다. 또한, 본 발명자들은 덴드론의 카르복실산기와 표면의 히드록시기 간의 공유결합 형성이 이온 결합만큼이나 효과적이고, 또한 말단 안정성을 증진시킴을 관찰하였다. 더욱이, 올리고에테르 층간(oligoetheral interlayer) 이 비특이적 올리고뉴클레오타이드 결합을 억제하는데 효과적이었다.

기존에 보고된 방법을 이용하여 하이드록실화된 표면을 제작하였다 [Maskis et al., 핵산s Res. 20, 1679-1684 (1992)]. 산화된 실리콘 웨이퍼, 융합 실리카 및 유리 슬라이드를 포함하는 서브스트레이트를 (3-글리시드옥시프로필)메틸디에톡시실란 (GPDES) 및 에틸렌 글리콜 (EG)로 개질시켰다. 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP)의 존재하에 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카르보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 또는 1,3-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC)을 사용하여 덴드론의 카르복실산기와 서브스트레이트의 히드록시기 간의 결합 반응시킴으로써 덴드론을 서브스트레이트에 도입하였다 [Boden et al., J. Org. Chem. 50, 2394-2395 (1985); Dhaon et al., J. Org. Chem. 47, 1962-1965 (1982)]. 덴드론 도입 후 두께의 증가치는 11±2Å이었으며, 이는 이온 결합에서 관찰된 기존의 값에 필적하는 값이다 [Hong et al., Langmuir 19, 2357-2365 (2003)]. 고정화 후, 덴드론의 안트라센 모이어티에서 발생하는 흡수 피크는 257 nm에서 관찰되었다. 분자층은 안정하여 디메틸포름아마이드에서 1일 동안 교반시에도 두께와 흡착 특성에 변화를 보이지 않는다 (도 6). 태핑 모드 원자현미경 (tapping mode atomic force microscope, TM-AFM) 에 의하여 얻은 국소 이미지 또한 얻어진 층이 응집 또는 구멍 없이 매우 매끄럽고 균질하다는 것을 보여주었다 (도 7).

DNA 마이크로어레이를 준비하기 위하여, 고정화된 덴드론을 활성화시켜 탈보호 과정을 통하여 일차 아민기를 생성하였다. 1.0 M 트리플루오로아세트산 (TFA)에서 탈보호화 후 [Kornblum et al., J. Org. Chem. 42, 399-400 (1977)], 257 nm에서의 흡수 피크가 표면 특성의 다른 어떠한 해로운 변화 없이 사라졌다 (도 4a). 이러한 관찰결과는 보호기가 층에 화학적 손상 없이 성공적으로 제거되며, 상기 보호기의 제거에 의하여 두께가 약간 감소한다는 것을 보여주었다.

기존에 확립된 방법 (Beier et al., Nucleic Acids Res. 27, 1970-1977 (1999)]에 따라서, 디(N-숙신이미딜)카르보네이트 (DSC)를 사용하여 개질시킨 후, Microsys 5100 Microarrayer (Cartesian Technologies, Inc.)를 사용하여 클래스 10,000 클린룸에 적절한 아민-결합된 (amine-tethered) 올리고뉴클레오타이드 (20 μM)의 50 mM 소듐 비카르보네이트 버퍼 (10% 디메틸설폭사이드 (DMSO), pH 8.5) 용액을 스포팅함으로써 프로브 올리고뉴클레오타이드를 활성화된 유리 슬라이드 표 면에 고정화시켰다. 통상적으로, 반응성 아민기 표면을 갖는 서브스트레이트에, 티올-결합된(tethered) 올리고뉴클레오타이드, 및 숙신이미딜 4-말레이미도 부티레이트 (SMB) 또는 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SSMCC)와 같은 이형의 양작용성(heterobifunctional) 링커를 사용한다 [Oh et al., Langmuir 18, 1764-1769 (2002); Frutos et al., Langmuir 16, 2192-2197 (2000)]. 이와 대조적으로, 덴드론 개질된 표면에 의하여 아민 작용기 간의 소정의 거리가 확보되기 때문에, DSC와 같은 동형의 양작용성 (homobifunctional) 링커를 사용하여도 별 문제가 없다. 결과적으로, 아민-결합된(tethered) 올리고뉴클레오타이드를 스포팅에 사용할 수 있다. 비용 효율성은 별문제로 하고, 티올-결합된(tethered) 올리고뉴클레오타이드가 특정 조건하에서 유용할 수 있지만, 용이하게 산화되는 티올-결합된 올리고뉴클레오타이드의 사용을 회피할 수 있다.

상기의 DNA 마이크로어레이를 제작하여 상보적 쌍 (A:T)과 세 쌍의 내부 단염기 잘못 짝지워진 쌍 (T:T, G:T, C:T) 간의 식별 효율을 평가할 수 있다. 프로브 올리고뉴클레오타이드를 4/4 포맷에 나란히 스포팅한 후, 상기 마이크로어레이를 항습기 (습도 80%)에서 12시간동안 인큐베이팅하여 아민-결합된(tethered) DNA에 충분한 반응시간을 제공하였다. 그리고 나서, 슬라이드를 37℃에서 3시간동안 버퍼용액 (2x SSPE 버퍼 (pH 7.4), 7.0 mM 소듐 도데실설페이트 함유)에서 교반하고, 끊는 물에서 5 분동안 교반하여, 비특이적으로 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하였다. 마지막으로, 다음 단계를 위하여, DNA-기능화된 마이크로어레이를 질소 기류하에서 건조시켰다. 적절한 비교를 위하여, 다른 종류의 프로브를 하나의 플레이트상에 플로팅하였다.

혼성화시키기 위하여, 15-염기 올리고뉴클레오타이드 (표적 1) 또는 45-염기 올리고뉴클레오타이드 (표적 2)를 사용하였다 (도 5). Cy3 형광 염료로 표지된 표적 올리고뉴클레오타이드 (1.0 nM)를 함유하는 상기의 세척 버퍼 용액에서 50℃에서 1시간동안 GeneTAC^TM HybStation (Genomic Solution, Inc.)를 사용하여 혼성화를 수행하였다. 과량의 표적 올리고뉴클레오타이드를 제거하기 위하여 상기 마이크로어레이를 37℃에서 버퍼 용액으로 4번 세척하고, 질소로 건조하였다. 각각의 스포트 상의 형광 신호는 ScanArray Lite (GSI Lumonics)를 사용하여 측정하였으며, Imagene 4.0 (Biodiscovery)를 사용하여 분석하였다.

15-염기 표적 올리고뉴클레오타이드의 경우, 얻어진 이미지는 맞게 짝지워진 쌍과 내부 잘못 짝지워진 쌍 간의 강도에 현격한 차이가 있음을 보여준다 (도 8a). 표준화된 형광 신호 비율 (또는 완전하게 짝지워진 쌍에 대한 단염기 내부 잘못 짝지워진 쌍의 강도 비율, 즉 MM/PM)은 0.005, 0.008, 및 0.006 (T:T, G:T, 및 C:T 내부 잘못 짝지움) (도 8a 및 표 2)이었다. 관찰된 선택도는 기존의 통상적 방법보다 현저하게 향상되며, 일반적 표면 상에서의 마이크로어레이와 비교할 때 매우 큰 선택도의 증가 (20 내지 82배)가 기록되었다 (표 2). 이미, 본 발명자들은 또한 혼합된 자기 조립 단일층 (즉, 혼합 SAM)을 포함하는 다양한 아민 표면 상에 제작된 마이크로어레이의 선택도 비율이 1:0.19 내지 0.57인 것을 관찰하였다 [Oh et al., Langmuir 18, 1764-1769 (2002)]. 또한, 다른 연구자들에 의하여 표면을 개질시키고 보다 우수한 검출 방법을 개발하여 DNA 마이크로어레이의 성능을 개선시키는 것이 보고된 바 있으나, 형광 검출 방법이 관련되는 한 이들 중 어느 것도 이와 같은 개선된 비율을 보이지 못했다 [Zhao et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 12531-12540 (2003); Chakrabarti et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 12531-12540 (2003); Benters et al., Nucleic Acids Res. 30, e10 (2002); Guschin et al., Analytical Biochemistry 250, 203-211 (1997); Taton et al., Science 289, 1757-1760 (2000); Wang et al., Nucleic Acids Res. 30, e61 (2002)]. 예컨대, 삼성분 혼성화/검출 시스템 (포획자/표적/프로브)에 있어서, 성공적인 식별 비율인 1:0.07가 보고되었다 (Zhao et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 12531-12540 (2003)]. 선택도를 증가시킬 수 있는 펩타이드 핵산 (PNAs)을 사용하는 경우에도, 금 박막 및 금 나노입자 상에서의 선택도는 각각 1:0.14와 1:0.07이었다 [Chakrabarti et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 12531-12540 (2003)].

[표 2]

	표준화된 형광 신호 비율
	정상 짝 (A:T)	잘못 짝지움 (T:T)	잘못 짝지움 (G:T)	잘못 짝지움 (C:T)
덴드론-개질된 표면, 15-mer (표적 1 & 프로브 1)	1	0.005	0.008	0.006
덴드론-개질된 표면, 45-mer (표적 2 & 프로브 1)	1	0.006	0.009	0.009
APDES-개질된 표면, C6 스페이서 (표적 1 & 프로브 1)	1	0.41	0.38	0.26
APDES-개질된 표면, (T)30 스페이서 (Target 1 & Probe 2)	1	0.17	0.18	0.12

더욱 실제적인 시스템을 구현하기 위해서, 45-염기의 표적 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. T:T, G:T, 및 C:T 내부에 잘못 짝지워진 염기쌍에 대한 MM/PM 비율이0.006, 0.009, 및 0.009이었다 (도 8b 및 표 2). 이러한 결과는 표적 올리고뉴클레오타이드의 길이가 긴 경우 뚜렷한 선택성(selectivity)을 나타내는 것을 보여준다. 상기 DNA 마이크로어레이의 효율은 덴드론-개질 표면의 특수성, 즉 고정된 DNA-사슬간의 mesospacing 에서 비롯된 것으로 믿어진다.

비교를 위해서, (3-아미노프로필)디에톡시메틸실란(APDES)으로 변형시킨 서브스트레이트상에 DNA 마이크로어레이를 제작하였다 (Oh et al., Langmuir 18, 1764-1769 (2002)). 이는 DNA 또는 단백질 마이크로어레이용으로 사용되는 일반적인 서브스트레이트이다. 1,4-페닐렌디이소티오시아네이트 (PDITC) 링커를 사용하는 것을 제외하고는, 덴드론-개질 DNA 마이크로어레이의 경우와 같이 상기 선택성을 시험하였다. 아민-처리된 올리고뉴클레오타이드는 Guo et al., nucleic acids Res. 22, 2121-2125 (1994)에 기재된 방법대로 사용하였다. T:T, G:T, 및 C:T 경우, 측정된 MM/PM 비율은 0.41, 0.38, 및 0.26이었다(도 6c 및 표 2). APDES-개질 서브스트레이트상에 DSC 링커를 사용한 결과, 높은 변이계수 (CV) 값(> 20 %)이 나타났으며, 이는 스폿당 변이정도 및 각 스폿내에서 불균일한 형광을 보여주는 것이다. 반면에, DSC 링커가 있는 덴드론-개질 표면의 것과 같이, PDITC 링커는 좀더 좋은 변이계수값 (CV) (< 15 %) 및 단일 스폿내에 균일한 형광 강도를 나타냈다 (도 7).

추가적인 비교를 위해서, 올리고머의 5'말단에 추가적인 (T)₃₀ 스페이서를 갖는 프로브 2 올리고뉴클레오타이드를 SNP 구별 실험에 사용하였다. 이 경우, 추가 스페이서를 갖는 상기 프로브를 APDES-개질 표면상에 고정화시켰다. T:T, G:T, 및 C:T 경우에 대한 측정된 MM/PM 비율은 0.17, 0.18, 및 0.12이었다(도 8d 및 표2). C₆ 스페이서를 갖는 프로브 DNA에 비해, 상기 선택성이 상당히 향상되었으나, 여전히 덴드론-개질 DNA 마이크로어레이보다 낮았다.

표면 혼성화로 다양한 문제점을 가지며, 정확한 마이크로어레이 스크리닝 수행을 조절 및 예측을 어렵게 한다. 이중 가닥형성에 대한 Gibbs 자유에너지 및 이중가닥의 풀림온도(Tm, melting temperature)에 더하여, 세척단계에서, 비특이적 결합, 입체효과, 정전기적 효과 및 조건변화등을 고려해야 한다. 내부적으로 잘못 짝지어진 염기쌍(15-mer중 T:T, G:T, 및 C:T 내부적으로 잘못 짝지워진 결함)과 완전하게 짝지워진 염기쌍간의 Gibbs자유에너지 차이는 50 ℃에서2.67, 1.75, 및 3.05 kcal/mol이다. Gibbs 자유에너지는 H_YT_HER ^TM소프트웨어로 계산하였다(http://ozone2.chem.wayne.edu). 따라서, 이론적인 형광 비율 (MM/PM)은 각각 0.016, 0.065, 및 0.009 이었다. 또한, 분자 신호를 이용한 용액상 연구결과에 의하면, SNP 구별 비율은 1:0.01로 낮았다(Taton et al., Science 289, 1757-1760 (2000)). 이들 데이터는 본 발명의 덴드론-개질 DNA 마이크로어레이가 열역학적 한계에 도달하거나 이를 초월하는 이상적인 것임을 설명하고 있다. 특히, G:T의 경우, 마이크로어레이 방식에서 구별효율성은 용액상에서 계산한 수치보다 더욱 우수하다. 상기 선택도 증가의 주요한 인자는 아직까지 조사되지는 않았으나, 세척단계에서 엄격한 조건이 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.

p53 SNP 탐지

생물계에서, p53 종양-억제 유전자는 세포조절, 유전자 전사, 게놈 안정성, DNA 수복, 및 세포사멸에 중요한 역할을 수행한다(see Velculescu et al, 1996, Clin. Chem., 42: 858-868, Harris et al, 1996, 88: 1442-1455, Sidransky et al, Annu, Rev. Med., 1996, 47: 285-301). p53의 본래 기능을 상실하면 종양이 유도되고, p53의 변이는 직장암, 및 폐암과 같은 사람의 암에서 가장 흔한 유전적 변이다(Greenblatt, 1994, 54: 4855-4878).

[9]-산 덴드론-개질 서브스트레이트상의 DNA 마이크로어레이를 이용하여 암 세포주에서 p53 종양 억제 유전자의 단일 변이를 탐지하고자 하였다. 175 코돈을 포함하는 표적 DNA 샘플 (~200-400 염기)을 게좀 DNA 주형에 랜던 프라이머법으로 제조하고, 18개 염기로 구성된 프로브 올리고뉴클레오타이드가 고정된 덴드론-개질 표면에 혼성화시켰다. A:C, T:C, 및 C:C 내부 mismatches에 대한 MM/PM 비율은0.028, 0.031, 및 0.007이었다 (도 10a). 이러한 결과는 실제 표적 DNA에 대해서도 뚜렷한 선택성이 있음을 보여주는 것이다.

[27]-산 덴드론-개질 서브스트레이트상의 DNA 마이크로어레이를 상술한 [9]-산 덴드론과 같은 방법으로 제조하고, 53 종양 억제 유전자중 175 코돈의 단일염기 변이 탐지에 적용하였다. A:C, T:C, 및 C:C 내부 잘못 짝지워진 염기에 대한 MM/PM 비율은 0.066, 0.01, 및 0.005이었다 (도 10b). 이러한 결과는 [27]-산 덴드론-개질 서브스트레이트상의 DNA 마이크로어레이도 또한 실제 표적DNA의 단일염기 변이에 대한 뚜렷한 선택성이 있음을 나타냈다.

덴드론 -개질 표면을 이용한 p53 유전자의 7 핫 스폿(hot spot) 변이의 탐지

덴드론-개질 서브스트레이트를 사용하여 암세포주에 있는 p53 종양 억제 유전자의 단일 염기변이를 탐지하였다. 7개 핫스폿 코돈 (175, 215, 216, 239, 248, 273, 및 282)을 포함하는 표적 DNA 샘플 (200-400 염기쌍)를 랜던 프라이머법으로 종양세포로 부터 추출한 DNA로부터 증폭하고, 고정된 7개 핫 스폿에 상응하는 캡쳐 프로브 (올리고뉴클레오타이드 15~25 mer)와 혼성화하였다(도11a 및 11b). 그 결과, 매우 좋은 SNP 구별 효율을 얻었다.

발명자들은 프로브 DNA간의 공간조절(mesospacing)을 통해 최고의 재현성을 갖는 DNA 마이크로어레이를 성공적으로 제작할 수 있었고, SNP 구별 효율성은 용액수치보다 훨씬 능가하도록 향상할 수 있었다. 측정된 구별 효율성은 본 발명에 따른 방법이 유전자 진단에서 높은 신뢰성으로 이용 가능하게 하였다. 본 발명의 방법이 고정화 생분자를 이용하는 다양한 생물학적 분석에 적용할 수 있을 것으로 예상된다.

조절된 기공을 갖는 유리 비드

친화성 크로마토그래피에서 널리 이용되는 크로마토그래피 담체로는 덱스트란 및 아가로스와 같은 천연 폴리머이다. 세파로스 6B, 4B, 및 2B는 매우 낮은 비특이적 결합율을 갖는 가교된 아가로스로 구성된 크로마토그래피용 물질이다. 상기 물질이 널리 사용됨에도 불구하고, 일반적인 비드형태의 아가로스 겔은 몇 가지 단점을 가지고 있다. 예를 들면, 상기 물질의 부드러운 성질로 인해 유속(유출속 도)이 낮고, 심하게 수축되고 비가역적이기 때문에 동결하거나 건조할 수 없으며, 몇몇 유기용매에 약하다. (Cuatrecasas, P. J. Biol. Chem. 1970, 245, 3059-3065; Kim et al., Biochemistry 2002, 41, 3414-3421). 이와 비교하여, 조절된 기공을 갖는 유리 (CPG)는 담체로서 다양한 특별한 특성을 나타낸다: 1) 기계적 안정성, 2) 고정된 3차원 구조, 즉 환경변화에도 팽창하거나 수축되지 않음, 3) pH 1 내지 pH 14조건에서 화학적 안정성, 4) 넓은 범위의 친핵성 및 친전자성 시약에 대한 안정성, 4) 열 안정성, 5) 우수한 흐름성(또는 용출성), 6) 용기 표면에 대한 낮은 흡착성. 추가로, 변형단계 이후에, 세척을 통해 시약 및 부산물을 신속히 제거할 수 있다. 이런 모든 특성으로 인해 겔 투과 크로마토그래피, 고상 합성, 친화성 분리, 기타 등등의 다양한 분야에서 잠재적인 유용성을 제공한다.

기공 크기: 호스트 표면에 대한 게스트 접근성을 이용하여 흡착된 물질에 대한 CPG의 효과적인 기공성을 측정하였다. 첫 번째 접근법으로, 게스트에 대한 CPG 접근성은 게스트의 크기에 비해 호스트의 상대적인 크기에 상관성이 있는 기하학적 인자에 의존적이다. 만약 게스트가 내부 표면, 흡착 및 상호작용을 유도하는 기공보다 큰 분자크기는, 조사대상 기공물질의 내부 표면적보다 훨씬 더 작은 외부 표면을 가지는 경우만 가능하다. (Poschalko et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 13415-13426; Ottaviani et al., J. Phys Chem. B. 2003, 107, 2046-2053). 이러한 사실을 고려해보면, CPG상 게스트의 흡착력 및 흡착정도는 다음의 인자에 의존적일 것으로 생각된다: CPG의 기공크기, 호스트의 전체 표면적, 및 호스트의 접근가능한 표면의 화학적 조성. 본 발명에서, 세 가지 종류의 GST 융합 단백질 (GST (28 kDa), GST-PX^P47 (41 kDa), 및 GST-Munc18 단편 (98 kDa))을 사용하였다. 분자 차원의 GST-Munc1는 융합GST 100 kDa, GST-DREF의 것과 유사해야 한다 (140x40x93Å) (Hirose et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 3930-3937; Zhan et al., Gene 2001, 218, 1-9). 기공과 표면적간 균형에 이르기 위해서, 각 구체적 단백질에 맞도록 담체의 기공성을 최적화해야만 한다. 약 50nm의 기공을 갖는 CPG는 단백질에 일반적으로 존재하는 분자 서브유닛의 복합체를 포함하는 것은 알려진 사실이기 때문에, 50 nm CPG 를 사용하여 본 연구를 수행하였다. 동시에, 상기 단백질을 사용하는 한, 더 큰 크기의 기공(300 nm)을 갖는 CPG는 50 nm CPG의 효율성을 확인하였다. (Collins et al., Anal. Biochem. 1973, 54, 47-53; Haller, W. J. Chromatogr. 1973, 85, 129-131).

글루타치온 CPG의 변형 (샘플 E1, E3, A, CS, 및 CL): 친화성 매트릭스에서 가장 중요한 관심사는 비특이적 결합(또는 NSB)정도이다. 이는 친화성 분리 및 고상 합성에서 매우 독특한 문제이다. 일반적으로, 비특이적 결합을 억제하기 위한 가장 중요한 인자는 매트릭스에서 수소 결합 공여 그룹을 없애고 친수성을 높이는 것이다 (Sigal et al, J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3464-3473; Chapman et al., Langmuir 2000, 16, 6927-6936; Chapman et al., J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 8303-8304; Holmlin et al., Langmuir 2001, 17, 2841-2850; Ostuni et al., Langmuir 2001, 17, 6336-6343; Chapman et al., Langmuir 2001, 17, 1225-1233; Ostuni et al., Langmuir 2001, 17, 5605-5620). 비록 아미노알킬기로 변형시킨 경우일지라도, CPG 표면은 극성이고 부분적으로 음전하를 가지고 있다 (Hudson, D. J. Comb. Chem. 1999, 1, 403-457). 스페이서로 디에폭시드를 사용함으로써, 매트릭스의 친수성 및 비특이적 결합을 최소화할 수 있다고 보고되었다 (Suen et al., Ind. Eng. Chem. Res. 2000, 39, 478-487; Sundberg et al., J. Chromatogr. B. 1974, 90, 87-98; Shimizu et al., Nature Biotechnology 2000, 18, 877-881). 따라서, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (또는 BUDGE)으로 표면을 변형하여 샘플 E1 및 E3을 제조하였다. BUDGE 사용의 중요한 특성은 가수분해에 대해 매우 안정적인 에테르 결합을 생선하고, 긴 스페이서 암(arm)으로 인한 향상된 유연성(flexibility)을 가지며, 어느 정도 비특이적 결합을 억제한다는 것이다. 상기 마지막 장점은 폴리에틸렌 글리콜과 유사한 구조적 모티브로 설명될 수 있다. 디에폭시드(Diepoxide)를 사용하여 분자와 친핵성기(예, 아민 및 티올)를 갖는 표면과 연결할 수 있다. 개환과정에서, β-히드록시 그룹뿐만 아니라 안정한 탄소-헤테로원자간 결합을 형성한다. 덴드론 변형단계 전 및 후에서 링커를 사용함으로써 변형된 GSH의 유연성을 보장할 수 있다. 변형단계를 요약하여 도 10에 개괄적으로 표시하였다. 매트릭스 표면에 덴드론를 결합시키고자, EDC 및 NHS라 불리는 일반적인 시약을 사용하였다. 덴드론으로 서브스트레이트를 변형시킨 후에, 무수아세트산으로 도입하여 남아 있는 아민기를 모두 캡핑하였다. 마지막으로, 상기 매트릭스를 20% 피페리딘으로 30분간 처리하여 덴드론의 Fmoc 그룹의 추가적인 변형을 해제(deblock)시켰다. BUDGE로 한번 더 연장반응을 수행한 후에, 티올 및 에폭시드 사이의 결합을 이용하여 GSH를 고정시켰다.

대조군으로서, 샘플 A 를 제조하였다. 덴드론이 없는 것을 제외하고는E1 및 E3과 실질적으로 동일한 방법으로, BUDGE, 1,3-디아미노프로판, 및 BUDGE 제공 표면물질로 연속적으로 변형시켰다. 에폭시드와 티올간 개환반응을 사용하여 GSH를 고정하였다. GMBS라 불리는 헤테로바이오 관능성(heterobiofunctional) 링커를 사용하여 또 다른 대조 비드 (샘플 CL 및 CS)를 제조하고 GSH 및 AMCPG 또는 LCAA-CPG와 결합시켰다. AMPCPG는 표면에 C3 탄화수소로 구성된 짧은 팔(arm)을 가지고 있고, LCAA-CPG는 C15의 지방족 사슬로 구성된 긴 팔을 가지고 있다. GMBS로 아미드를 형성한 후에, 비드를 GSH로 처리하였다. 말레이미도 그룹에 티올기를 첨가함으로써 탄소와 황원자간에 공유결합이 생성되었다. 상기 두 단계 처리로 공유결합을 형성하면, GSH가 결합된, 조절된 기공을 갖는 유리비드, 즉 CS 및 CL가 얻어졌다.

리간드 밀도 측정: 고정화된 글루타치온의 양을 직접 측정하기는 어렵기 때문에, 탈보호화 단계에서 방출되는 디벤조풀벤의 양을 측정하여 리간드 밀도를 결정하는 간접적인 방법을 사용하였다. 덴드론의 정점에 결합된 9-플루오로메톡시카르보닐 (Fmoc) 보호기는 산에 안정하나, 다양한 염기에 의해서 쉽게 절단된다. 본 실시예에서는, DMF중20 % 피페리딘를 사용하여 Fmoc그룹을 탈보호화하였다. 피페리딘은 디벤조풀벤과 부가물을 생성하고, 상기 부가물을 301nm에서 흡광한다 (Фye et al., J. Phys. Chem. B. 2003, 107, 3496-3499). 반면에, 20% 피페리딘으로 탈보호화 단계 과정에서 얻어진 용액의 흡광도가 301nm에서 나타날 때, 이는 의도한 대로 탈보호가 일어나고 있음을 의미한다.

이러한 방법으로 얻어진 리간드 밀도는 E1에 대해 8.3 μmol/g이고, E3에 대해 5.6 μmol/g이었다. 상기 밀도는 F-moc(3)산으로 변형한 경우에 11.1배만큼 감소하며, 상기 수치는 더 큰 덴드론을 사용하면 1.5 배 만큼 추가로 감소한다. 따라서, 본 발명의 구체적인 예에서, 더 작은 덴드론은 더 큰 덴드론보다 높은 밀도를 얻는 데 더욱 효과적이다.

GST 결합 분석: 정제된GST 및 세포 용해물을 사용하여 샘플 A, E1, 및 E3의 결합 특성을 분석하였다 (도 14에서 레인 2, 3, 및 4). 레인 1은 성공적으로 용해물을 제조하였음을 보여준다. 세가지 매트릭스가 정제된 GST에 효과적으로 결합함이 명백하다. 세포 용행물을 비드에 도입한 경우에(레인 5, 6, 및 7), A 및 E1 또는 E3 샘플간에 상당한 차이가 관찰되었다. 샘플 A의 경우, BUDGE 링커를 도입하였음에도 불구하고, 심각한 비특이적 결합이 관찰되었다. 흥미롭게도, 매트릭스에 덴드론을 도입한 경우에, 비특이적 단백질 결합이 효과적으로 억제되었다. 1세대 덴드론 및 2세대 덴드론중 둘 중 하나의 자가 조립으로 고체 담체에 대한 비특이적 결합이 효과적으로 억제되었음은 주목할 만하다. 덴드론과 GSH 간의 연장된 스페이서는 결합된 트리펩티드의 활성을 유지하였다.

도15에서, 본 발명의 일예에서, 에테르 및 아미드 그룹이 구조의 주요골격을 형성하고, 덴드론의 고정으로 다시 아미드 결합이 생성된다. 또한 덴드론의 넓은 범위도 또한 성공한 중요한 인자이다.

E1에 대한 리간드 밀도는 E3보다 1.48배 높다. 바꾸어 말하면, E1에대해서는 148 %의 리간드 농도를 기록했다 (표 3). 두 가지 비드의 결합효율성을 시험하기 위해서, 각 샘플마다 같은 수의 GSH를 갖도록 샘플 질량을 조절하였다. 밀도 측정기에 의하면, 두 가지 경우 리간드 이용은 매우 근접하였다(29 %, 31 %). E3의 더 넓은 공간화는 GST의 결합 효율성을 향상시키지 못했으며, 이는 아마도 실험대상 단백질이 E1 및 E3공간화보다 더 컸기 때문일 것이다.

[표 3]

샘플 E1 및 E3의 리간드 농도 및 리간드 이용도

샘플	리간드 밀도(umol/g)	리간드 농도비 (%)	리간드 이용도 (%)
E1	8.3	148	29
E3	5.6	100	31

대조 실험: GSH밀도는 CS 에 대해 14.5 μmol/g, CL에 대해 11.9 μmol/g이었다. GST의 특이적 결합 관점에서 비드의 효율성을 비교하기 위해서, CS (5.7 mg) 및 CL (7.0 mg) 비드로 포획된 단백질을 E1 (10.0 mg) 및 E3 (14.8 mg) 비드로부터 샘플과 함께 분석하였다. 대충 GSH를 동일한 수로 이용도를 조절하였다. CS 및 CL 비드는 낮은 결합능을 나타낼 뿐만 아니라 좋지 않는 선택도를 나타냄이 크로마토그래피에 분명히 나타나 있다(도 13). 이러한 결과는 고정화 GST에 대한 GST의 접근성 향상뿐만 아니라 비특이적 결합의 효과적인 억제를 보장하기 위해서, 덴드론의 중요성을 강조적으로 보여주는 것이다.

분자량 의존성. 덴드론 변형으로 인해 고정화된 리간드간에 공간이 조절된 표면을 제공하기 때문에, 다양한 분자량을 갖는 단백질에 대한 결합능이 복합하다. 특히, 2세대 덴드론을 사용할 경우 24 Å이상의 공간을 보장할 수 있음이 알려져 있다 (Cardona et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 4023-4024). 구체적인 실험으로, GST 단백질 (28 kDa), GST-PX^p47 (41 kDa), 및 야생 용행물로부터 얻은 GST-munc-18 단편 (98 kDa) 를 제조하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 비드의 결합능 (E1, E3, 및 세파로스4B)는 단백질의 분자량이 증가할수록 급격히 감소한다. 상기 감소정도는 세가지 경우에 모두 동일하다. 흥미롭게도, 세가지 다른 경우에 있어서 감소의 정도가 동일하다는 것이다. E1 에 대한 결합능을 GST에 대해100 %으로 맞춘 경우에, GST-munc18에 대해 GST-PX^p47 는 상대적 결합능이 92% 및 22 % 이었다. E3 비드에 대해서, GST 에 대해서는 85 % 이었고, GST-munc18에 대해 23 % 이었다. 이는 단백질의 분자량에 대한 의존성을 또한 글루타치온 세파로스-4B로도 관측하였음을 나타냈다. 글루타치온 세파로스-4B에 대해, 결합능은 GST-PX^p47 에 대해 104 %이고, GST-munc18에 대해 17 %이었다. 유일한 차이점은 시판되는 매트릭스에 대해서 GST 및 GST-PX^p47에 대해 일정한 결합능을 나타내는 것이다. 상기 차이는 세파로스 4B에서 불균일한 간격을 반영하는 것일 수 있다. 이들 물질에서, GSH사이에 다양한 간격이 존재하며 그 결과 매트릭스는 융합 GST에 천연 GST 만큼 결합할 수 있다. 훨씬 큰 단백질, GST-munc18에 대해, 간격은 더욱 작아야 한다. 이러한 점에서, 덴드론으로 처리한 비드의 결합능이 일정하게 감소함은 표면상의 GSH의 일정한 간격을 뒷받침해준다.

요약하면, 덴드론-개질 매트릭스는 시판되는 매트릭스(예, 세파로스-4B)만큼 높은 민감도를 나타내고, 시판 제품과 거의 동일한 정도의 분자량 의존성을 나타낸다. AMPCPG 매트릭스에 덴드론을 도입함으로써 비특이적 결합을 효과적으로 감소시킬 뿐만 아니라 GSH의 결합력을 유지한다. 단백질 분자량 증간에 비례하여 결합력이 일정하게 감소함을 관찰하였고, 이러한 현상은 고정화된 GSH 사이에 규칙적인 간격과 일치하는 것으로 생각된다. 간격 조절이 용이할 뿐만 아니라, 기계적 안정성, 다양한 화학적 환경과의 넓은 양립성, 및 예상되는 다양한 응용이 용이함 등과 같은 여러 가지 이점이 있다.

본 발명의 보호범위는 본 명세서에 기재된 구체예에 한정되지 아니하면, 본 명세서에 기재된 구체예 이외에도 다양한 변경이 발명의 상세한 설명 및 첨부된 도면에 의해서 본 기술분야의 전문가에게 명백할 것이다. 그러한 변경도 또한 본 발명의 청구범위의 보호범위내에 속하는 의도이다. 이후 실시예은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 제한적인 의도는 아니다.

하기 실시예에서, 화합물의 번호체계(Numbering scheme)는 화합물 1, 화합물 2, I, II, III, IV, V 등과 같이 명명되었다. 그러나, 화합물의 번호체계는 인용되는 특정 실시예에서 한정되어 일관되게 사용되는 의도이다. 예를 들어, 실시예2에서 다시 인용된 화합물 1은 반드시 실시예3에서의 화합물1과 같을 필요는 없다.

실시예 1

크기 조절된 거대분사(Size-Controlled Macronolecule)를 사용한 마이크로어레이 제조방법

실시예 1에서, 도 2에 나타내 바와 같이, 명칭(designations) I, II, III, IV, 및 V는 도 2에 나타낸 여러 가지 화합물 및 중간체 화합물들을 말하는 것이다.

실시예 1.1: 재료

실란커플링제인 (3-글리시독시프로필)메틸디에톡시란(GPDES) 및 (3-아미노프로필)디에톡시메틸실란(APDES)은 겔레스트사(Gelest, Inc.)로부터 구입하였고, 나머지 화합물들은 시그마-알드리치사로부터 시약급으로 구입하였다. 실릴화(silylation)용 반응용매는 알드리치사로부터 구입한 무수물이다(Sure/Seal bottles). 서브스트레이트에 대한 모든 세척 용매는 말린크로트 시약 제조회사(Mallinckrodt Laboratory Chemicals)로부터 구입한 HPLC 급이다. UV 급 흄드 실리카 플레이트(30 mm x 10 mm x 1.5 mm)는 CVI레이저 유한회사(CVI Laser Corporation)로부터 구입하였다. 연마된 1급 Si 웨이퍼 (100)(dopant, phosphorus; resistivity, 1.5-2.1 Ω.cm)는 MEMC 전자재료회사(MEMC Electronic Materials, Inc)로부터 구입하였다. 글래스 슬라이드(2.5 x 7.5 cm)는 코닝사(Corning Co)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드는 모두 메타바이온(Metabion)으로부터 구입하였다. 초순수(Ultrapure water) (18 M Ω.cm)는 Milli-Q 정제시스템(Millipore)으로부터 얻었다.

실시예 1.2: 장치

필름 두께는 엘립소미터(ellipsometer) 분광기 (J. A. Woollam Co. Model M-44)를 사용하여 측정하였다. UV-vis 스펙트럼은 휴렛팩커드사의 분광광도계(Hewlett-Packard diodearray 8453 spectrophotometer)로 측정하였다. 태핑 모드 AFM 실험(Tapping mode AFM experiments)은 "E"유형 스캐너를 갖는 나노스코프 IIIa AFM (Digital Instruments) 장비를 사용하여 수행하였다.

실시예 1.3 : 서브스트레이트의 청정화

실리콘 웨이퍼, 흄드 실리카, 글래스 슬라이드와 같은 서브스트레이트는 피라냐용액(Piranha solution, 농도 H₂SO₄:30% H₂O₂ = 7:3 (v/v))에 담그고, 상기 용액과 서브스트레이트를 포함하는 반응용기를 1시간 동안 초음파 처리하였다(주의사항: 피라냐 용액은 폭발성의 유기물질을 산화시킬 수 있다. 따라서 산화성 물질의 접촉은 피한다). 초음파를 처리한 후, 과량의 탈이온수를 사용하여 플레이트를 세척하고 헹구었다. 세척된 서브스트레이트들은 다음 단계를 위해 30-40 mTorr의 진공챔버에서 건조시켰다.

실시예 1.4: 히드록실화서브스트레이트 제조

상기 청정화된 서브스트레이트은 1.0 ml (3-글리시독시프로필)메틸디에톡시실란(GPDES)이 용해된 160 ml의 톨루엔 용액에 10시간 동안 침지시켰다. 자가조립(self-assembly)반응을 수행한 후, 서브스트레이트를 톨루엔으로 간단히 세척한 다음, 오븐에 넣고, 110℃에서 30분 동안 가열하였다. 플레이트는 톨루엔, 톨루엔-메탄올(1: 1 (v/v)), 및 메탄올에서 순차적으로 각 세척 단계에서 3분 동안 초음파 처리하였다. 상기 세척된 플레이트는 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다. GPDES-개질된 서브스트레이트은 95% 황산을 2-3 방울 첨가한 순수한 에틸렌글리콜(EG) 용액에 80 - 100℃ 에서 8시간 동안 침지하였다. 냉각한 후, 상기 서브스 트레이트는 에탄올 및 메탄올에서 순차적으로 각각 3분 동안 초음파 처리하였다. 세척된 서브스트레이트은 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.

실시예 1.5: 덴드론-개질 서브스트레이트 제조

상기 수산화된 서브스트레이트는 4-디메틸아미노피리딘(DMAP) (0.82 mM) 존재하에 덴드론(1.2 mM) 및 커플링제인 1-[-3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 1,3-디사이클로헥실카보디이미드(DCC)(11 mM)를 용해한 메틸렌 클로라이드 용액에 담그었다. 실온에서 3일 후, 상기 플레이트를 메탄올, 물 및 메탄올에서 순차적으로 각각 3분 동안 초음파 처리하였다. 다음 단계를 위해서 상기 세척된 플레이트는 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.

실시예 1.6: NHS-개질 서브스트레이트의 제조

상기 덴드론-개질 서브스트레이트는 1.0 M 트리플루오로아세트산(TFA)이 포함된 메틸렌 클로라이드 용액에 담그었다. 3시간 후, 20% (v/v) 디이소프로필에틸아민(DIPEA)이 포함된 메틸렌 클로라이드 용액에 10분 동안 침지하였다. 상기 플레이트는 메틸렌 클로라이드 및 메탄올에서 각각 3분 동안 초음파 처리하였다. 이후, 진공 챔버에서 건조하고, 비보호된 서브스트레이트를 디(N-숙신이미딜)카보네이트(DSC)(25 mM) 및 DIPEA (1.0 mM)가 포함된 아세토니트릴 용액에서 반응시켰다. 질소 분위기에서 4시간 동안 반응시킨 후, 상기 플레이트를 디메틸포름아미드 용액에서 30분 동안 정치시키고, 메탄올로 간단히 세척하였다. 세척된 플레이트는 다음단계를 위해서 진공챔버(30-40 mTorr)에서 건조시켰다.

실시예 1.7: NHS-개질 서브스트레이트상에 올리고뉴클레오타이드 배열

50 mM NaHCO₃ 완충 용액(pH 8.5)에 용해된 프로브 올리고뉴클레오타이드는 NHS-개질 서브스트레이트상에 4 포맷에 의해 4개로 나란히 점을 찍었다. 아민화된 DNA(the amine-tethered DNA)에 충분한 반응시간을 보장하기 위해 마이크로어레이는 습도 챔버(80% 습도)에서 12시간 동안 반응시켰다. 슬라이드는 혼성화(hybridization) 완충 용액(7.0 mM 소듐 도데실설페이트를 포함하는 2x SSPE 완충 용액 (pH 7.4))에서 37℃, 1시간 동안 교반시킨 다음, 5분 동안 끓는 물에서 교반시켜 비특이적으로 결합된 올리고뉴클레오타이드를 제거하였다. 최종적으로, DNA-관능기화(DNA-functionalized) 마이크로어레이는 다음 단계를 위해 질소 분위기하에서 건조시켰다. 완전한 비교를 위해, 여러가지 종류의 프로브를 상기 단일 플레이트에 스팟하였다.

실시예 1.8: 혼성화

혼성화는 GeneTACTM HybStation (Genomic Solutions, Inc.)을 이용하여 Cy3 형광염료를 사용한 표적 올리고뉴클레오타이드(1.0 nM)표지화를 포함하는 혼성화 완충용액에서 50℃ 에서 1시간 동안 수행하였다. 마이크로어레이는 혼성화 완충용액을 사용하여 헹구어 표적 올리고뉴클레오타이드를 제거한 다음, 질소를 사용하여 건조시켰다. 각 스팟상에 형광 신호는 ScanArray Lite (GSI Lumonics)를 이용하여 측정하였고, Imagene 4.0 (Biodiscovery)으로 결과를 분석하였다.

실시예 1.9:덴드론(dendron)의 합성

실시예 1.9.1 - 9-안트릴메틸 N-(3-카르복실프로필)카바메이트(I)(화합물 I) 의 제조.

4-아미노부티릭산(0.50 g, 4.8 mmol, 1.0 equiv)과 트리에틸아민(TEA) (1.0 ml, 7.3 mmol, 1.5 equiv)을 N,N-디메틸포름아마이드(DMF)에 용해하고, 50℃ 에서 교반하였다. 상기 용액에 9-안트릴메틸 ρ-니트로페닐 카보네이트(1.81 g, 4.8 mmol, 1.0 equiv)를 교반하면서 서서히 첨가하였다. 50℃에서 2 시간 동안 교반한 후, 용액을 증발시켜 건조시키고, 0.50 N 수산화나트륨 용액 (NaOH)으로 염기화시켰다. 수용액은 에틸아세테이트(EA)로 세척하고, 얼음조에서 교반한 다음, 묽은 염산(HCI)으로 산성화시켰다. 생성물은 EA로 추출하고, 유기용액을 무수 MgSO₄로 건조시키고, 여과한 다음 용매를 증발시켰다. 최종의 노란색 분말의 총량은 1.06 g을 얻었으며, 수율은 65 %이었다.

실시예 1.9.2 - 9-안트릴메틸 N-{[(트리스{[2- (메톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸) 아미노]카보닐}프로필카보네이트(II)(화합물 II)의 제조.

9-안트릴메틸 N-(3-카르복실프로필)카바메이트(0.65 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv), 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) (0.37 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv), 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT) (0.261 g, 1.93 mmol, 1.5 equiv)는 아세토니트릴에 용해시키고, 실온에서 교반하였다. 아세토니트릴에 용해된 트리스{[(메톡시카보닐)에톡시]메틸} 아미노메탄(0.49 g, 1.29 mmol, 1.0 equiv)을 교반하면서 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 조생성물(crude product)은 EA에 용해하고, 1.0 N HCl및 포화 소듐 바이카보네이트 용액으로 세척하였다. 무수 MgSO₄로 건조하고 여과한 후 용매를 증발시켰으며, 조생성물을 실리카겔로 충진된 컬럼에 로딩하고 컬럼크로마토그래피(전개용매: 에틸 아세테이트: 헥산 = 5:1 (v/v))로 정제하여 점성의 노란색 액체를 얻었다. 노란색 액체의 총량은 0.67 g이었다(수율74 %).

실시예 1.9.3 :9-안트로메틸 N-[({트리스[(2- 카복시에톡시)메틸]메틸}아미노)카보닐]프로필카바메이트(III)(화합물 III)의 제조.

9-안트릴메틸 N-{[(트리스{[2- (메톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸) 아미노]카보닐}프로필카보네이트 (0.67 g, 0.93 mmol)는 아세톤 (30 ml)과 0.20 N NaOH (30 ml, 6 mmol)에 용해시켰다. 실온에서 1 d 동안 교반한 후에, 아세톤을 증발시켰다. 얻어진 수용액은 EA를 사용하여 세척하고, 얼음조에서 교반하면서 묽은 염산으로 산성화시켰다. 생성물은 EA를 사용하여 추출하고, 유기용액은 무수 MgSO₄로 건조하고, 여과한 후 용매를 증발시켰다. 생성물은 -20℃ 하에 아세톤 및 에테르에서 고체화하여 노란색 분말을 얻었다. 얻어진 엷은 노란색 분말의 최종량은 0.54 g이었다.(수율 88%).

실시예 1.9.4 - 9-안트릴메틸 N-[({트리스[(2-{[(트리스{[2-(메톡시카보닐)에톡시]메틸} (메틸)아미노]카보닐}에톡시)메틸]메틸}아미노)카보닐]프로필카바메이트 (IV) (화합물 IV)의 제조

9-안트릴메틸 N-[({트리스[(2-카복시에톡시)메틸]메틸}아미노)카보닐] 프로필카바메이트 (0.54 g, 0.82 mmol, 1.0 equiv), EDC (0.55 g, 2.87 mmol, 3.5 equiv), 및 HOBT (0.39 g, 2.89 mmol, 3.5 equiv)는 아세토니트릴에 용해하고, 실온에서 교반하였다. 이후, 아세토니트릴에 용해시킨 트리스{[(메톡시카보닐)에톡시]메틸} 아미노메탄(0.96 g, 2.53 mmol, 3.1 equiv)을 교반하면서 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 36시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 상기 조산물을 EA에 용해시키고, 1.0N HCL로 세척하고 중탄산나트륨 용액으로 포화시켰다. 무수 MgSO₄로 건조, 여과, 및 증발한 후에, 상 조 산물을 실라카 겔이 충진된 칼럼 에 로딩하였다. 칼럼을 이용한 정제(전개용매: 에틸아세테이트: 메탄올 = 20:1 (v/v))한 결과, 점성의 노란색 액체가 얻어졌다. 상기 노란색 액체의 총 중량은 1.26 g이었다(88 % 수율).

실시예 1.9.5: 9-안트릴메틸 N-({[트리스({2-[({트리스[(2-카복시에톡시)메틸]메틸} 아미노)카보닐]에톡시}메틸)메틸]아미노}카보닐)프로필카바메이트 (V) (화합물 V)의 제조

9-안트릴메틸 N-[({트리스[(2-{[(트리스{[2-(m에톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸)아미노]카보닐} 에톡시)메틸]메틸}아미노)카보닐]프로필카바메이트 (0.60 g, 0.34 mmol)는 아세톤(30 ml)과 0.20 N NaOH (30 ml)에 용해시켰다. 실온에서 1 d 동안 교반한 후, 아세톤을 증발시켰다. 얻어진 수용액은 EA를 사용하여 세척하고, 얼음조에서 교반하면서 묽은 염산으로 산성화시켰다. 생성물은 EA를 사용하여 추출하고, 유기용액을 무수 MgSO₄로 건조하고, 여과한 후 용매를 증발시켰다. 얻어진 노란색 분말의 최종량은 0.37 g이었다(수율 68%)

실시예 2

대체 출발물질인 덴드론 거대분자 생산방법(Fmoc-Spacer-[9]-산)

실시예 2에서, 여러 가지 명칭의 화합물들은 화합물 1, 2 등으로 명명하였 다. 먼저, 스페이서인 6-아지도헥실아민(1)은 1,6-디브로모헥산으로부터 문헌의 방법(Lee, J. W.; Jun, S. I.; Kim, K. Tetrahedron Lett., 2001, 42, 2709)에 따라 합성하였다.

상기 스페이서는 비대칭 우레아 형성(unsymmetric urea formation) 및 제작된 N₃-스페이서-[3]에스테르(3)를 통해 반복단위를 첨부시켰다. 상기 반복단위는 tert-부틸 아크릴레이트를 사용한 트리스의 축합으로 합성하였다.(which had been reported in Cardona, C. M.; Gawley, R. E. J. Org. Chem. 2002, 67, 141).

상기 트리에스테르는 펩타이드 커플링 조건하에 가수분해 및 트리에스테르(2)로 짝지음시킴을 통해 N₃-스페이서-[3]산(4)로 형질전환시켰다. 아지드의 아민기로의 환원반응, 및 Fmoc 기를 갖는 아민의 보호반응후, 노나에스테르(nona에스테르)의 가수분해는 Fmoc-spacer-[9]산 (5)를 제공하였다.

N -(6-아지도헥실)- N -트리스{[2-( tert- 부톡시카보닐)에톡시]메틸}-메틸우레아 (3). 트리포스진(Triphosgene) (1.3 g, 4.3 mmol)은 무수 CH₂Cl₂ (20 mL)에 용해하였다. 무수 CH₂Cl₂ (35 mL)에 용해된 6-아지도헥실아민(1) (1.6 g, 12 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(DIEA, 2.4 mL, 13.8 mmol)의 혼합물을 실린지 펌프를 이용하여 7시간 이상의 주기로 상기에서 교반된 트리포스진 용액으로 적하하여 첨가하였다. 2시간 동안 더 교반한 후, 무수 CH₂Cl₂ (20 mL)에 용해된 상기 용액(2) (6.4 g, 13 mmol) 및 DIEA (2.7 mL, 15.2 mmol)를 첨가하였다. 반응혼합물은 질소분위기 하에 실온에서 4시간 동안 교반하고, 0.5 M HCl 및 소금을 사용하여 세척하였다. 유기층은 무수 MgSO₄로 건조한 다음, 용매는 증발시켜 제거하였다. 컬럼 크 로마토그래피를 사용한 정제(silica, 1:1 EtOAc/hexane)로 무색 오일상을 얻었다(3.0 g, 40 %).

N -(6-아지도헥실)- N -트리스{[2-카복시에톡시]메틸}메틸우레아 (4). N₃-스페이서-[3]에스테르(3) (0.36 g, 0.56 mmol)를 24시간 동안 6.6mL의 96% 포름산에서 교반시켰다. 포름산은 50℃에서 감압으로 제거하여 정량적인(quantitative) 수율로 무색 오일을 제조하였다.

N -(6-아지도헥실)- N '-트리스[(2-{[(트리스{[2-( tert- 부톡시카보닐)에톡시]-메틸}메틸)아미노]카보닐}에톡시)메틸]메틸우레아 (4.1).

The HOBt (0.20 g, 1.5 mmol), DIEA (0.30 mL, 1.8 mmol), 및 EDC (0.33 g, 1.8 mmol)를 건조 아세토니트릴5.0 mL 에 용해된 상기 (4) (0.25 g, 0.50 mmol)으로 첨가하였다. 그런 다음, 건조 아세토니트릴 2.5 mL 에 용해된 아민(2) (1.14 g, 2.3 mmol)을 첨가하고, 반응혼합물을 48시간 동안 N₂ 하에 교반하였다. 용매를 감압으로 제거한 후, 잔여물을 MC에 용해하고, 0.5M HCl 및 소금으로 세척하였다. 유기층을 MgSO₄ 로 건조시킨 다음, 용매를 진공에서 제거하고, 컬럼 크로마토그래피(SiO₂, 2:1 EtOAc/hexane)하여 무색오일을 얻었다.(0.67 g, 70%).

N -(6-아미노헥실)- N' -트리스[(2-{[(트리스{[2-( tert- 부톡시카보닐)에톡시]-메틸}메틸)아미노]카보닐}에톡시)메틸]메틸우레아 (4.2).

에탄올(20.0 mL)에 용해된 노나-tert-부틸에스테르 (4.1) (0.37 g, 0.20 mmol)를 10% Pd/C (37.0 mg)와 함께 H₂ 하에 실온에서 12시간 동안 교반하였다. TLC로 반응의 종료를 확인한 후, 혼합물을 0.2 mm 필리포어(Millipore) 필터로 여과하였다. 여과지를 CH₂Cl₂로 헹군 다음, 혼합된 용매를 진공에서 제거하여 무색 오일을 회수하였다.

N -{6-(9-플루오레닐메톡시카보닐)아미노헥실}- N' -트리스[(2-{[(트리스{[2-( tert- 부톡시카보닐)에톡시]메틸}메틸)아미노]카보닐}에톡시)메틸]메틸우레아 (4.3).

아민(4.2) (0.33 g, 0.17 mmol) 및 DIEA (33 mL, 0.19 mmol)는 CH₂Cl₂ 5.0 mL에 용해하고, 질소 분위기하에서 30분 동안 교반하였다. CH₂Cl₂ 2.0 mL에 용해된 9-플루오레닐 메틸 클로로포메이트(48 mg, 0.19 mmol)를 첨가하고, 반응혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 0.5 M HCl 및 소금으로 세척하였다(0.18 g, 64 %). 잔여물을 컬럼 크로마토그래피(silica, EtOAc)로 정제하여, 무색 오일을 얻었다.

N -{6-(9-플루오레닐메톡시카보닐)아미노헥실}- N' -트리스[(2-{[(트리스{[2-카복시에톡시]메틸}메틸)아미노]카보닐}에톡시)메틸]-메틸우레아 (5).

보호기를 갖는 노나-tert-부틸 에스테르(4.3) (0.12 g, 72 mmol) 18시간 동안 10mL의 96% 포름산에서 교반시켰다. 포름산은 50 ℃ 에서 감압으로 제거하여 양적인(quantitative) 수율로 무색 오일을 제조하였다.

실시예 3

추가 덴드론 화합물

특정 보호기를 고분자로 나타낼 수 있지만, 상기 화합물이 한정되는 것은 아님을 주지해야 한다. 또한, 여러 사슬 및 스페이서가 정확한 분자구조를 가리켜 묘사하는한, 서브스트레이트 표면상에 조절된 밀도, 바람직하게는 저밀도의 배열을 위해 개질은 용인된 화학적 개질 방법(chemical modification methods)에 따라 가능하였다. 화합물의 숏-핸드 기술(short-hand description)에 대한 참고로서, 왼쪽 대부분의 글자들은 보호기를 가리키고; 괄호(brackets)에서 숫자는 쇄 말단(branched termini)의 수를 나타내며; 오른쪽 대부분의 화학적인 본체(entity)는 쇄 말단 상의 화학적 작용(chemistry)을 나타낸다.

실시예에 대해, "A-[27]-산"은 안트릴메틸 보호기; 27 말단, 및 말단의 산성기 나타내는 것이다.

A-[27]-산

Boc-[1]-산

Boc-[3]-에스테르

Boc-[3]-산

Boc-[9]-에스테르

Boc -[9]-산

Ns-[9]-에스테르

Ns-[9]-산

Fmoc-[9]-에스테르 (R= t -부틸)

Fmoc-[9]-산

AE-[1]-산

AE-[3]-산

AE-[9]-산

A-[6]-산

A-[8]-산

A-[12]-산

A-[16]-산

A-[18]-산

G. R. Newkome J. Org. Chem. 1985, 50 , 2003

J. -J. Lee Macromolecules 1994, 27, 4632

L. J. Twyman Tetrahedron Lett. 1994, 35 , 4423

D. A. Tomalia Polym. J. 1985, 17 , 117

E. Buhleier. Synthesis 1978, 155

A. W. van der Made J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1992, 1400

G. R. Newkome Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 1176

G. R. Newkome Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 1176

K. L. Wooley J. Chem. Soc., Perkin Trans.1 1991, 1059

실시예 3.1: 제조방법

1. A-[3]-OEt (3)

화합물 1는 NaC(CO₂Et)₃ 2 와 함께 80℃ 에서 반응시켰다.

2. A-[3]-OMe (5)

A-[3]-OEt 3은 에테르에 용해된 LiAlH₄ 또는 LiBH₄ 와 함께 반응시키고, t-BuOK/t-BUOH의 존재하에 클로로아세트산과 반응시키고, MeOH로 에스테르화하였다.

3. A-[3]-OTs (7)

화합물 7로 토실화된 트리올 화합물6은 에테르에서의 A-[3]-OMe 5 및 LiAlH₄ 의 반응으로 얻는다.

4. A-[9]-OEt (8)

목적화합물인 노나에스테르(화합물 8)는 A-[3]-OTs 7을C₆H₆-DMF에 용해된 NaC(CO₂Et)₃로 처리하여 제조한다.

5. A-[27]-OH (9)

A-[9]-OEt 8은 70℃ 에서 DMSO에 용해된 트리스(하이드로시메틸)아미노메탄 및 K₂CO₃ 으로 처리하였다.

실시예 3.2

1. Boc-[2]-OMe (3)

50℃ 이하의 온도에서 메탄올 용매하에 화합물 1 와 메틸 아크릴레이트 2 를 반응시켰다. 55℃ 이하의 고진공하에 과량의 시약과 용매를 제거하였다.

2. Boc-[4]-NH ₂ (5)

50℃ 이하 온도에서 메탄올 용매하에 Boc-[2]-OMe 3와 매우 과량의 에틸렌디아민(EDA) 4 을 반응시켰다. 55℃ 이하의 고진공하에 과량의 시약과 용매를 제거하였다.

3. Boc-[8]-OMe (6)

50℃ 이하의 온도에서 메탄올 용매하에 Boc-[4]-NH₂ 5와 메틸 아크릴레이트 2 를 반응시켰다. 55℃ 이하의 고진공하에 과량의 시약과 용매를 제거하였다.

실시예 3.3

1. Boc-[2]-OH (3)

화합물 1, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트 (HOBT)는 아세토니트릴에 용해하고, 실온에서 교반하였다. 아세토니트릴에 용해된 L-글루탐산-디에틸에틸 에스테르 (H₂NCH(CO₂Et)CH₂CH₂CO₂Et)를 교반하면서 상기 용액에 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 조생성물은 EA에 용해하고, 1.0 N HCl 및 포화 소듐 바이카보네이트 용액으로 세척하였다. 무수 MgSO₄로 건조한 후, 여과하고 용매를 증발시키고, 실리카겔로 충전된 컬럼에 조생성물을 넣었다. 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 에틸 아세테이트 : 헥산)로 정제하여 점성의 노란색 액체를 얻었다.

화합물 2 는 NaOH로 가수분해하였다. 1 d 동안 실온에서 교반한후, 유기용액을 증발시켰다. 수용액은 EA로 세척하고, 얼음조에서 교반한 후, HCl로 산성화시켰다. EA를 사용하여 생성물을 추출한 후에, 유기용액을 무수 MgSO₄로 건조하고, 여과하여 용매를 증발시켰다.

2. Boc-[4]-OH (3)

화합물 3, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT)를 아세토니트릴에 용해하고 실온에서 교반하였다. 교반하면서 상기 용액에 아세토니트릴에 용해된 L-글루탐산-디에틸 에스테르 (H₂NCH(CO₂Et)CH₂CH₂CO₂Et)를 첨가하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 조생성물은 EA에 용해하고, 1.0 N HCl 및 포화 소듐 바이카보네이트 용액으로 세척하였다. 무수 MgSO₄로 건조한 후, 여과하고 용매를 증발시키고, 실리카겔로 충전된 컬럼에 조생성물을 넣었다. 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 에틸 아세테이트 : 헥산)로 정제하여 점성의 노란색 액체를 얻었다.

화합물 4 는 NaOH로 가수분해하였다. 1 d 동안 실온에서 교반한후, 유기용액을 증발시켰다. 수용액은 EA로 세척하고, 얼음조에서 교반한 후, HCl로 산성화시켰다. EA를 사용하여 생성물을 추출한 후에, 유기용액을 무수 MgSO₄로 건조하고, 여과하여 용매를 증발시켰다.

3. Boc-[8]-OH (3)

화합물 5, 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) 및 1-하이드록시벤조트리아졸 하이드레이트(HOBT)를 아세토니트릴에 용해하고 실온에서 교반하였다. 교반하면서 상기 용액에 아세토니트릴에 용해된 L-글루탐산-디에틸 에스테르 (H₂NCH(CO₂Et)CH₂CH₂CO₂Et)를 첨가하였다. 실온에서 12시 간 동안 교반한 후, 아세토니트릴을 증발시켰다. 조생성물은 EA에 용해하고, 1.0 N HCl 및 포화 소듐 바이카보네이트 용액으로 세척하였다. 무수 MgSO₄로 건조한 후, 여과하고 용매를 증발시키고, 실리카겔로 충전된 컬럼에 조생성물을 넣었다. 컬럼 크로마토그래피(전개용매: 에틸 아세테이트 : 헥산)로 정제하여 점성의 노란색 액체를 얻었다.

화합물 6은 NaOH로 가수분해하였다. 1 d 동안 실온에서 교반한후, 유기용액을 증발시켰다. 수용액은 EA로 세척하고, 얼음조에서 교반한 후, HCl로 산성화시켰다. EA를 사용하여 생성물을 추출한 후에, 유기용액을 무수 MgSO₄로 건조하고, 여과하여 용매를 증발시켰다.

실시예 3.4

1. Boc-[2]-CN (3)

실온에서 화합물 1를 아세토니트릴에 용해하였다. 결정상 아세트산(Glacial acetic acid)를 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하에 가열하였다. 과량의 아세토니트릴을 진공하에 증류하여 제거하고, 잔여물을 클로로포름으로 추출한 후, 진한 암모니아 용액을 첨가하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.

2. Boc-[2]-NH ₂ (4)

Boc-[2]-CN 3 는 메탄올에 용해하고, 코발트(II) 클로라이드 헥사 하이드레이트를 첨가하였다. 소듐 보로하이드라이드를 분할하여 첨가하였다. 결과 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 진한 염산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 용매를 진공하에 제거하고 농축하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.

3. Boc-[4]-CN (5)

실온에서 Boc-[2]-NH₂ 4 를 아세토니트릴에 용해하였다. 결정상 아세트산(Glacial acetic acid)를 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하에 가열하였다. 과량의 아세토니트릴을 진공하에 증류하여 제거하고, 잔여물을 클로로포름으로 추출한 후, 진한 암모니아 용액을 첨가하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.

4. Boc-[4]-NH ₂ (6)

Boc-[4]-CN 5 는 메탄올에 용해하고, 코발트(II) 클로라이드 헥사 하이드레이트를 첨가하였다. 소듐 보로하이드라이드를 분할하여 첨가하였다. 결과 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 진한 염산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 용매를 진공하에 제거하고 농축하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.

5. Boc-[8]-CN (7)

실온에서 Boc-[4]-NH₂ 6 을 아세토니트릴에 용해하였다. 결정상 아세트산(Glacial acetic acid)를 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하에 가열하였다. 과량의 아세토니트릴을 진공하에 증류하여 제거하고, 잔여물을 클로로포름으로 추출한 후, 진한 암모니아 용액을 첨가하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.

6. Boc-[8]-NH ₂ (8)

Boc-[8]-CN 7 은 메탄올에 용해하고, 코발트(II) 클로라이드 헥사 하이드레이트를 첨가하였다. 소듐 보로하이드라이드를 분할하여 첨가하였다. 결과 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 진한 염산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 용매를 진공하에 제거하고 농축하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.

7. Boc-[16]-CN (9)

실온에서 Boc-[8]-NH₂ 8을 아세토니트릴에 용해하였다. 결정상 아세트산(Glacial acetic acid)를 첨가하고, 용액을 24시간 동안 환류하에 가열하였다. 과량의 아세토니트릴을 진공하에 증류하여 제거하고, 잔여물을 클로로포름으로 추출한 후, 진한 암모니아 용액을 첨가하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.

8. Boc-[16]-NH ₂ (10)

Boc-[16]-CN 9는 메탄올에 용해하고, 코발트(II) 클로라이드 헥사 하이드레이트를 첨가하였다. 소듐 보로하이드라이드를 분할하여 첨가하였다. 결과 혼합물을 2시간 동안 실온에서 교반한 후, 진한 염산으로 조심스럽게 산성화시켰다. 용매를 진공하에 제거하고 농축하였다. 유기상을 분리한 후, 물로 세척하고, 소듐 설페이트로 건조하였다.

실시예 3.5

1. A-[3]-알켄 (3)

A-[1]-SiCl₃ 1을 디에틸 에테르에 용해된 과량의 10% 알릴마그네슘 브롬화물을 이용하여 4시간 동안 환류시킨 후, 0℃에서 냉각시키고, 10 % NH₄Cl 수용액으로 가수분해하였다. 상기 유기층을 물로 세척하고 MgSO₄를 이용하여 건조하여 농축하였다.

2. A-[3]-SiCl ₃ (4)

A-[3]-Alkene 3, HSiCl₃, 및 통상적인 백금-기재의 하이드로실릴화 촉매 예를 들어, 프로판-2-올에 용해된 H₂PtC_l6(Speier의 촉매), 또는 백금 디비닐실록산 착화합물 (Karstedt의 촉매)의 혼합물을 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 종료되었을 때, 과량의 HSiCl₃를 진공으로 제거하였다.

3. A-[9]-알켄 (5)

A-[3]-SiCl₃ 4를 디에틸 에테르에 용해된 과량의 10% 알릴마그네슘 브롬화물을 이용하여 4시간 동안 환류시킨 후, 0℃에서 냉각하였다. 그 후, 10 % NH₄Cl 수용액으로 가수분해하였다. 상기 유기층을 물로 세척하고 MgSO₄를 이용하여 건조하여 농축하였다.

4. A-[9]-SiCl ₃ (6)

A-[9]-Alkene 5, HSiCl₃, 및 통상적인 백금-기재 하이드로실릴화 촉매, 예를 들어, 프로판-2-올에 용해된 H₂PtC_l6(Speier의 촉매) 또는 백금 디비닐실록산 착화 합물(Karstedt의 촉매)의 혼합물을 24시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 종료되었을 때, 과량의 HSiCl₃를 진공펌프를 이용하여 제거하였다.

실시예 3.6

1. [1]-산-[3]-트리올 (3)

(a)단계에서는 상기 트리올1을 시아노에틸화하여 상기 니트릴 화합물2를 제조하였다. 아크릴로니트릴, nBu₃SnH 및 아조비시소부티로니트릴을 상기 화합물 1이 포함된 PhCH₃에 110℃에서 첨가하였다. (b)단계에서는 상기 니트릴 화합물 2를 KOH, EtOH/H₂O, H₂O₂ 및 △과 같은 반응조건에서 가수분해하여 화합물 3과 카르복시산을 제조하였다.

2. A-[3]-트리올 (5)

(c)단계에서는 [1]-산-[3]-트리올을 1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸카보 디이마이드 하이드로클로라이드(EDC)와 1-하이드록시벤조트리아졸하이드레이트(HOBT)를 이용하여 아미드 커플링 반응을 통해서 화합물 4와 결합하였다.

3. A-[3]-트리브롬화물 (6)

(d)단계에서는 100 ℃ 에서 HBr/H₂SO₄으로 브롬화하여 트리브롬화물을 합성하기 위하여 상기 알콜을 사용하였다.

4. [1]-CN-[3]-OBzl (8)

(e)단계에서는 상기 트리올1을 Me₂SO 및 KOH를 사용하여 트리에테르를 제조하기 위하여 벤질클로라이드로 처리하였다. (f)단계에서는 상기 트리 에테르8을 시아노에틸화하여 상기 니트릴 화합물 9를 제조하였다. 아크릴로니트릴, nBu₃SnH 및 아조비스이소부티로니트릴을 상기 화합물 8을 포함하는 PhCH₃에 110℃에서 첨가 하였다.

5. [1]-OH-[3]-OBzl (11)

(g)단계에서는 상기 니트릴 화합물 9를 KOH, EtOH/H₂O, H₂O₂ 및 △. (h) 과 같은 환경에서 가수분해하여 화합물 10과 카르복시산을 제조하였다. 상기 카르복시산과 화합물 10을 산을 알코올로 전화시키기 위하여 1.0 M의 농도를 초과하는 BH₃ THF용액과 함께 반응시켰다.

6. [1]-알킨-[3]-OBzl (13)

(i)단계에서는 과량의 SOCl₂와 피리딘 촉매하에 알코올을 염화물(CH₂Cl₂)로 만들었다. (j)단계에서는 염화물을 디메틸설폭사이드(dimethylsulphoxide)하에서 리튬 아세틸라이드 에틸렌디아민 착화합물(lithium acetylide ethylenediamine complex )과 40℃에서 반응시켰다.

7. A-[3]-알킨-[9]-OBzl (14)

(k)단계에서는 4 량의 알킨 말단을 만드는 블록(block) 13, 헥사메틸 포스포릭 트리아미드(HMPA), 리튬 디이소프로필아미드(LDA) 및 테트라메틸에틸렌아민(TMED)으로 0 ℃ 내지 40 ℃ 에서 1.5시간 동안 반응시켜 상기 A-[3]-OBzl 6을 알킬화시켰다.

실시예 3.7

1. A-[9]-OH (15)

A-[3]-Alkyne-[9]-OBzl 14 는 A-[9]-OH 15를 제조하기 위해 EtOH와 THF 10% 용액 하에서 Pd-C/H으로 60℃ 에서 4 일동안 반응시켜 환원시키고 탈보호화시켰다.

2. A-[27]-COOH (17)

상기 알코올은 염화물(CH₂Cl₂)하에서 SOBr₂를 이용하여 40℃에서 12 시간 동안 천천히 비브롬화물(nonabromide)로 전환시켰다. 상기 과정 후에, 49%의 A-[9]-Alkyne-[27]- OBzl 16를 제조하기 위해 12가의 [1]-Alkyne-[3]-OBzl 13를 가지고 상기 비브롬화 화합물을 알킬화시켰다. A-[9]-Alkyne-[27]- OBzl 16 은 10% Pd-C/H가 포함된 EtOH 및 THF 용액하에서 Pd-C/H과 60℃에서 4시간 동안 반응시키는 한 단계를 통해 환원시키고 탈보호화시켜 89%의 A-[27]-OH가 생산하였다. A-[27]-OH를 NH₄OH 또는 (CH₃)₄NOH하에서 RuO₄로 산화시켜, 85% 의 A-[27]-COOH 17를 제조하였다.

실시예 3.8

1) [G1]-(OMe)₂ (3)

화합물 1(1.05 mol equiv.), 3,5-디메톡시벤질브롬화물(dimethoxybenzyl bromide)(1.00 mol equiv. 2), 탄산 칼륨(1.1 mol equiv.) 및 18-c-6(0.2 mol equiv.)의 혼합물을 탈수된 아세톤 하에서 48시간 동안 질소하에서 환류될 때까지 가열시켰다. 상기 혼합물을 냉각시킨 후, 건조될 때까지 증류하고 잔류물은 염화물(CH₂Cl₂)과 물 사이에서 분할시켰다. 상기 수용액 층은 염화물(CH₂Cl₂)(3×) 로 추출하고, 연결된 유기막층을 건조한 후 건조될 때까지 증발시켰다. 화합물 3을 얻기 위해 상기 조 결과물에 대해 EtOAc-CH₂Cl₂를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 이용하여 정제하였다.

2) [G1]-(OH) ₂ (4)

화합물 3의 메틸 에테르기를 EtOAc용액하에서 1시간 동안 BBr₃에 의해 탈리시켰다. 이에 의한 조 결과물에 대해 MeOH-EtOAc를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 이용하여 정제하여 화합물 4를 얻었다.

3) [G2]-(OMe) ₄ (5)

[G1]-(OH)₂(1.00 mol equiv. 4), 3,5-디메톡시벤질브롬화물(dimethoxybenzyl bromide)(2.00 mol equiv. 2), 탄산 칼륨 (2.1 mol equiv.)와 18-c-6(0.2 mol equiv.)의 혼합물을 탈수된 아세톤 하에서 48시간 동안 질소하에서 환류될 때까지 가열시켰다. 상기 혼합물을 냉각시킨 후, 건조될 때까지 증류하고 잔류물은 염화물(CH₂Cl₂)과 물 사이에서 분할하였다. 상기 수용액 층은 염화물(CH₂Cl₂)(3×)로 추출하고,, 연결된 유기막층을 건조한 후 건조될 때까지 증발시켰다. 화합물 5을 얻 기 위해 상기 조 결과물에 대해 EtOAc-CH₂Cl₂를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 이용하여 정제하였다.

4) [G2]-(OH) ₄ (6)

화합물 5의 메틸 에테르기를 EtOAc용액하에서 BBr₃에 의해 1시간 동안 탈리시켰다. 상기 조 결과물에 대해 MeOH-EtOAc를 용출액으로 플래쉬 크로마토그래피를 실시하여, 화합물 4를 얻었다.

5) [G3]-(OMe) ₈ (7)

[G2]-(OH)₄(1.00 mol equiv. 6), 3,5-디메톡시벤조 브롬화물(4.00 mol equiv. 2), 탄산칼륨(4.1 mol equiv.) 및 18-c-6(0.2 mol equiv.)의 혼합물을 탈수된 아세톤 하에서 48시간 동안 질소 하에서 환류될 때까지 가열하였다. 상기 혼합물을 냉각시킨 후, 건조될 때까지 증류하고 잔류물은 염화물(CH₂Cl₂)과 물 사이에서 분할하였다. 상기 수용액 층은 염화물(CH₂Cl₂)(3×)로 추출하고, 연결된 유기막층을 건조한 후 건조될 때까지 증발시켰다. 화합물 7을 얻기 위해 상기 조 결과물에 대해 EtOAc-CH₂Cl₂를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 이용하여 정제하였다.

6) [G3]-(OH) ₈ (8)

화합물 7의 메틸 에테르기는 1시간 동안 EtOAc용액 안에서 BBr₃에 의해 탈리시켰다. 화합물 8을 얻기 위해, 조 결과물에 대해 MeOH-EtOAc를 용출액(eluent)으로 플래쉬 크로마토그래피(flash chromatography)를 실시하였다.

실시예 4

서브스트레이트상에 덴드론의 조립

APDES 대신에, 유리산화물(oxide glass)상에 TMAC (N-트리메톡시실릴프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드)을 자가조립하였다. 상기 TMAC 상의 덴드리머층의 아민잔기를 캡핑할 필요는 없었다.

TMAC에 의한 아미노실릴화

깨끗한 서브스트레이트 (슬라이드 글라스)을 TMAC (2mL) 및 아세톤 (100mL) 의 혼합용액에 5시간 동안 담그었다. 자가조립후에, 상기 서브스트레이트를 플라 스크로부터 꺼내어 아세톤으로 세척하였다. 상기 서브스트레이트를 오븐에 넣고 110℃ 에서 40분간 가열하였다. 아세톤에 침지한 후에, 상기 서브스트레이트에 3분간 초음파 처리를 하였다. 세척된 서브스트레이트를 Teflon 용기에 담고, O-고리에 연결된 큰 스크류 캡을 갖는 유리 용기에 두고, 상기 용기에 진공으로 처리하여 상기 TMAC 가 자가조립된 서브스트레이트를 건조하였다.

TMAC의 화학식 구조

무수 아세트산으로 아민잔기를 캡핑하는 것을 제외하고는, Fmoc-스페이서-[9]산을 CBz-[9]산과 동일한 조건으로 자가 조립하였다.

Fmoc-스페이서-[9]산의 자가조립 (5).

일정량의 Fmoc-스페이서-[9]산 (5) 을 혼합용매 (DMF:탈이온수 = 1:1 (v/v))에 용해하여 20 mL용액을 제조하였다. 테플론 병에 상기 용액을 넣고, 상기에서 제조한 아미노실릴화된 슬라이드 글라스 조각을 용액에 담그었다. 플라스크를 상온에 두어 자가조립을 하도록 하고, 1일 후에 각 서브스트레이트조각을 용액으로부터 꺼내었다. 조각을 꺼낸 직후에, 상기 플레이트를 탈이온수로 세척하였다. 각각의 서브스트레이트를 탈이온수, 탈이온수-메탄올 혼합용매(1:1 (v/v)), 및 메탄올 순서 로 3분간 초음파로 처리하였다. 초음파 처리한 후에, 테플론 병에 상기 서브스트레이트를 담고, 다시 O-고리가 연결된 큰 스크류 캡이 있는 유기 용기에 담고, 상기 용기를 진공으로 하여(30-40 mTorr) 서브스트레이트를 건조하였다.　

Fmoc-스페이서-[9]산 (5)의 Fmoc 탈보호화

DMF중 5 % 피페리딘을 포함하는 테플론 병을 제조하였다. 상기 자가조립된 서브스트레이트를 상기 병에 담그고, 20분간 교반하였다. 각각의 서브스트레이트를 아세톤 및 메탄올에서 수차적으로 3분간 초음파처리하고, 진공챔버에서 (30-40 mTorr) 건조하였다.

실시예 5

덴드론(9-산 및 27-산) 개질 표면상의 p53 마이크로어레이

매우 높은 빈도로 무의미한(missense) 변이 핫스팟을 갖는 것으로 알려진, 7개 코돈, 즉 175, 215, 216, 239, 248, 273, 및 282을 선택하여 실험에 이용하였다. 7개 코돈중, 코돈 175, 248, 273, 및 282를 국제 TP53 변이 데이타베이스 (IARC, http//:www-p53.iarc.fr/p53데이타베이스.htm)에서 얻었고, 나머지3개 코돈, 즉 215, 216, 및 239는 한국 p53 변이 핫스팟 데이터베이스에서 얻었다. 상기 6개 코돈에 대한 캡쳐 프로브 서열 (덴드론-개질 표면에 고정화된 DNA)를 소프트웨어로 제작하였고, 이들의 길이는 15-23 mer로 다양하게 하였고, Tm은 약 55 ℃로 맞추었다.

실시예 5.1: 덴드론-개질 표면을 사용한 p53 유전자의 7개 핫스팟 변이의 탐지

덴드론-개질 서브스트레이트를 사용하여 암세포주의 p53유전자의 단일변이를 탐지하였다. 7 핫스팟 코돈 (175, 215, 216, 239, 248, 273, 및 282)을 포함하는 표적 DNA 샘플 (100-200 mer)을 랜덤 프라이밍법을 사용하여 암세포로부터 추출된 DNA을 증폭하여 제조하였고(실시예 5.8 참조), 고정화된 7개 핫스팟 코돈에 상응하는 캡쳐 프로브 (올리고뉴클레오타이드 of 15-25 mer)와 혼성화시켰다. 각각의 혼성화된 스팟의 형광강도를 공촛점 레이저 스캔너로 측정하였고, SNP 구별능을 계산하였다. 이 실시예에 의하면, 덴드론-개질 표면을 갖는 DNA 마이크로어레이의 품질은 실제 표적 샘플에 존재하는 단일변이를 탐지할 수 있음을 보여준다.

실시예 5.2:혼성화 효율 및 SNP 구별에 미치는 T30을 갖는 프로브 올리고뉴클레오타이드의 길이 영향

SNP 구별을 위한 캡쳐 프로브 길이 영향을 T30을 갖는 다양한 길이의 캡쳐 프로브를 사용하여 시험하였다. T30을 함유하고 코돈 175 및 239에 상응하는 캡쳐 올리고뉴클레오타이드를 5' 말단과 덴드론-개질 표면의 말단 1차 아미노기를 연결함으로써 고정시킨 후에, p53 표적 DNA를 혼성화시키고 형광강도를 측정하였다. 이 실시예는 캡쳐 프로브의 길이에 대한 SNP구별능과 신호강도의 의존성을 보여주었 다.

실시예 5.3:캡쳐 프로브 농도 vs. 강도(intensity); 및 캡쳐 프로브 vs. SNP 구별

캡쳐 프로브 농도에 대한 신호강도 및 SNP 구별능의 의존성을 조하였다. 덴드론-개질 표면상의 캡쳐 프로브를 다양한 농도로 하여 표적 DNA와 혼성화시키고, 형광강도 및 SNP구별능을 측정하였다. p53에 대한 캡쳐프로브의 최적 농도를 결정하였다.

실시예 5.4:프로브 농도vs. 강도; 및 표적 프로브 농도vs. SNP 구별

표적 프로브 농도에 대한 신호강도 및 SNP 구별능의 의존성을 조하였다. 표적 DNA를 다양한 농도로 하여 혼성화하고 형광강도와 SNP구별능을 측정하였다. 이 실시예에 의해서, 덴드론-개질 표면을 갖는 DNA 마이크로어레이의 다양한 범위를 제공하였다.

실시예 5.5:혼합 표적 샘플에 있는 변이의 탐지

정상적인 서열에 비해, 변이된 표적 서열이 작은 부분에 존재하는, 점돌연변이을 갖는 표적 샘플(5 or 10%)를 탐지할 수 있다. 두 종류의 표적 DNA을 포함하는 표적 샘플를 다른 몰농도로 제조하고 혼성화하여 변이된 표적 DNA뿐만 아니라 정상 서열의 혼합물에서 특정 코돈에서 단일 점돌연변이를 탐지하도록 하였다. 이 실시 예는 초기 단계의 암을 진단하는데 매우 중요한 임상적 의의를 가진다.

실시예 5.6:10개의 모르는 직장암 세포주의 변이 탐지

암세포주의 모르는 변이를 탐지하기 위해 고안한 시스템이다.

실시예 5.6.1:세포배양 및 게놈DNA 추출.

직장암 세포주 SNU-C1, SNU-C5, COLO 201, COLO 205, DLD-1, LS 513, HCT-15, LS 174T, HCT 116, 및 SW480를 KCLB (한국 세포주 은행, 한국, 서울)로부터 구입하였다. 10% 우태아 혈청(FBS), 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 U 페니실린 (GibcoBRL, Carlsbad, CA)에 보충된 RPMI 1640에서 세포를 접종하고, 5% CO_2, 37 ℃ 에서 배양하였다. 직장암 세포 (2x10⁶ 세포)를 Invisorb(상표명) spin cell mini kit (Invitek, Berlin, Germany)의 사용자 매뉴얼에 따라 수확하여 게놈 DNA분석에 사용하였다. 이들 게놈 DNA로부터 p53 표적 DNA를 제조하고(실시예 5.8.2 참조), DNA 마이크로어레이 실험을 상기 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

실시예 5.7:혼성화 효율 및 SNP 구별에 대한 표적 프로브 길이의 영향

랜덤 프라이머법, PCR, Dnase 분해 등 여러 가지 방법으로 여러 가지 길이를 갖는 표적 DNA를 제조하고, 혼성화 효율 및 SNP 구별에 대한 표적 프로브의 길이 영향을 조사하였다.

실시예 5.8: 실험방법

실시예 5.8.1: 게놈 DNA 샘플

SNU-세포주 (SNU-61, 216, 475, 563, 601, 668, 761, 및 1040)의 게놈 DNA를 서울대학교 의과대학의 박재갑으로부터 얻었다. 상기SNU-세포주는 한국 환자로부터 채취한 사람 종양 세포주이다. 이들 세포주의 특성은 이전에 기술한 바와 같으며, 다양한 연구에서 사용되었다(Bae IS et al., 2000, Park JG et al., 1997, Kang MS et al., 1996, Yuan Y et al., 1997, 378-87).

실시예 5.8.2: 서브클로닝 및 서열분석

각 세포주에 대해서, p53 유전자들, 특히 엑손 5 및 엑손8 사이에 존재하는 p53 유전자를 2쌍의 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭하였다: 엑손5 Fwd I, 5'-CTG ACT TTC AAC TCT GTC TCC T - 3'(SEQ ID NO:5); 엑손 5 Fwd II, 5'-TAC TCC CCT GCC CTC AAC AA - 3'(SEQ ID NO:6); 엑손 8 Rev I, 5'- TGC ACC CTT GGT CTC CTC CAC -3'(SEQ ID NO:7); 엑손 8 Rev II, 5'- CTC GCT TAG TGC TCC CGG G - 3'(SEQ ID NO:8) (Kang MS et al.,1996). 하기 조건에 따라 Multiblock System (Hybaid, UK)에서 전체 반응부피 20 ㎕이 되도록 1x ThermoPol 완충액 (보충 Taq 폴리머라제)중 250 μM dNTP 믹스, 2.5U Taq 폴리머라제 (NEB), 10 pmole 첫 번째 프라이머쌍 (인트론 4 및 8에 상응하는 엑손 5 Fwd I 및 엑손 8 Rev I), 250 μM dNTP 믹스, 2.5U Taq 폴리머라제 (NEB)로 하여 각 게놈 DNA를 증폭하였다: 폴리머라제 초기 활성화, 95℃ 1분; 20 주기, 95℃, 30초; 58℃ 30초; 72℃ 90초; 72℃ 5 분 최종연장. 첫 번째 PCR 산물을 희석하고 두 번째 PCR를 위한 주형으로 사용하였다. 게놈DNA 의 PCR 증폭산물을 20배로 희석하고, PCR 프라이머를 10pmol의 두 번째 프라미어쌍 (엑손 5 및 8에 상응하는 엑손 5 Fwd II 및 엑손 8 Rev II) 을 사용한 것을 제외하고는 이전 단계와 동일한 조건하에서 두 번째 nested PCR을 수행하였다. 증폭 주기는 25주기로 증가시켰다. 최종 nested PCR 산물을 겔 추출법으로 정제하였다. 게놈 DNA로부터 얻어진 PCR산물을 pGEM T-easy 벡터(Promega)에 연결하여 DH5a 세포로 형질전환시켰다. 서브클로닝된 플라스미드를 QIAGEN Plasmid Min kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 분리하여 서열분석에 사용하였다. pUC/M13 정방향 및 역방향 서열분석을 다음 프라이머쌍을 사용하여 수행하였다: M13 FWD 5'-GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG -3'(SEQ ID NO:9) 및 M13 REV 5'- TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG -3'(SEQ ID NO:10).

실시예 5.8.3: 표적프로브 제조

SNP자리를 포함하는 DNA 표적 프로브를 랜덤 프라이머법 및 표지화 방법으로 50 ng 주형 DNA, 50 U Klenow 효소 (NEB), 1x EcoPol 완충액(Klenow 효소 보충), 6㎍ 랜덤 옥타머(Bionics사 합성), 저농도 dT dNTP 믹스 (100μM dA,G,CTP / 50μM dTTP) 및 50 Cyanine3-dUTP (NEN)을 함유하는 Multiblock System (Hybaid, UK)에서 전체 부피 20㎕로 하여 37℃, 2 시간 동안 수행하였다. QIAGEN MinElute PCR purification kit (QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 사용하여 병합되지 않은 뉴클레오타이드를 분리하였다. UV/Vis 스펙트로포토미터를 사용하여 정량 및 정성분석(특이적 활성, 결합된 형광염료당 뉴클레오타이스의 수)을 수행한 후에, 분석된 산물을 혼성화에 이용하였다.

실시예 5.8.4: 세포배양 및 게놈D NA 추출

직장암 세포주 SNU-C1, SNU-C5, COLO 201, COLO 205, DLD-1, LS 513, HCT-15, LS 174T, HCT 116, 및 SW480를 KCLB로부터 구입하였다. 우태아혈청(FBS), 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 U 페니실린 (GibcoBRL, Carlsbad, CA)이 보충된 RPMI 1640에 세포를 접종하고 5% CO_2,37℃에서 반응시켰다. Invisorb(trademark) spin cell mini kit (Invitek, Berlin, Germany) 를 사용하여 사용자 매뉴얼에 따른 방법으로 상기 직장암 세포주 (2x10⁶ 세포)를 수확하고 게놈 DNA 추출에 사용하였다.

실시예 6

드론상에 고정된 단백질 프로브

실시예 6.1:덴드리머 개질 슬라이드 글라스상에 NHS-바이오틴 고정화. 1mL 중탄산나트륨 완충액 50 mM 및 DMSO (40 % v/v)중에 숙신이미딜 D-바이오틴(1.0mg)을 포함하는 스팟팅 용액을 제조하였다. 덴드리머 개질 슬라이드 글라스상에 NHS-바이오틴을 Microsys 5100 마이크로어레이어 (Cartesian Technologies, Inc, USA)를 사용하여 클래스 10,000의 청정룸에서 고정화시켰다. 고정화, 및 습윤챔버(~ 75 % 습도)에서 1시간 동안 반응시킨 후에, 바이오틴 마이크로어레이를 DMF (50^oC) THF 및 MBST (50 mM MES, 100 mM NaCl, 0.1% Tween- 20, pH 6.0)로 순차적으로 2시간 동안 세척하였다. 상기 슬라이드를 증류수로 헹구고, 건조하고, 즉시 사용하거나 며칠간 상온에서 저장하였다가 사용하였다.

실시예 6.2: 단백질/리간드 상호작용 탐지

이 실시예는 Hergenrother, P. J.; Depew, K. M.; Schreiber, S. L. J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 7849 에 따라 수행하였다. Cy3-표지 스트렙타비딘 용액을 첨가하기 전에, 3% 우태아 혈청 보충 MBST로 1시간 동안 차단시켰다. 잠깐 헹군 후 에, Cy3-표지 스트렙타비딘 용액에 30분간, 실온에서 상기 슬라이드를 노출시켰다. 상기 용액은 적합한 단백질의 스톡용액을 1% BSA 보충 MBST로 희석하여 1mg/mL로 하여 제조하였다. 상기 반응후에, MBST로 1회 슬라이드를 세척하고, 12분 동안 MBST를 4회 바꾸어가면 약하게 교반하였다. 슬라이드를 건조하고 공촛점 스캔너 ScanArray(상표명) Lite (GSI Lumonics)를 사용하여 스캐닝하였다. 마이크로어레이 정량분석 소프트웨어ImaGene (BioDiscovery, Inc.)를 사용하여 이미지와 형광강도 분석을 수행하였다.

실시예 7

공이 조절된 거대분자를 포함하는, 조절된 기공을 갖는 유리비드

아미노프로필기가 결합된, 기공이 조절된 유리비드 (AMPCPG; 80-120 메쉬; 평균 기공 직경, 50 nm 또는 300 nm) 및 긴 사슬형 아미노알킬 그룹으로 개질된 기공이 조절된 유리비드를 (LCAA-CPG; 80-120 mesh; mean pore diameter, 50 nm) CPG, Inc로부터 구입하였다. 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 1,3-디아미노프로판, 환원 글루타치온 (GSH), N-(3-메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보이미드 (EDC), N-히드록시숙신이미드 (NHS), N-(9-플루오로메톡시카르보닐옥시)클로라이드(Fmoc-Cl), 피페리딘, 4-말레이미도부티르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (GMBS), 인산 완충 식염수 (PBS)를 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 다른 화합물은 분석시약급으로 구입하였고, 추가 정제없이 사용하였다. Barnstead E-pure 3-Module system으로 증류수를 처리하여 탈이온수 (18 MΩ.cm) 를 제조하였다. UV-vis 스펙트럼은 Hewlett-Packard diode-array 8453 스펙트로포토미터로 기록하였다.

실시예 7.1:덴드론 개질 CPG (샘플 E1 및 E3)상에 글루타치온 고정화

(i) Fmoc-(3)산으로 개질: AMPCPG (건조중량 0.70 g)을 유리 필터로 아세톤을 사용하여 세척하였다. 진공건조한 후에, 1,4-부탄딜 디글리시딜 에테르 (1.0 mL) 및 탄산염 완충액 (2.0 mL, pH=11)의 혼합액을 AMPCPG (표면능: 91.8 μmol/g, 표면적:47.9 m²/g)에 첨가하였다. 상온에서 24시간 잘 흔든 후에, 얻어진 비드를 여과하고 탈이온수 및 아세톤으로 순차적으로 세척하여 얻었다. 상기 샘플이 포함된 바이알(vial)을 1,3-디아미노프로판 (1.0 mL) 및 탄산염 완충액(pH=11)의 혼합액을 첨가하고 24시간 동안 상온에서 흔들었다. 철저히 세척한 후에, 2-머르캅토에탄올(1.0 mL) 및 수용성 중탄산나트륨용액 (2.0 mL, pH=8.5)의 혼합액으로 표면에 남아있는 에폭시기의 반응을 차단시켰다. Fmoc-(3)산 (14 mg, 21.3 μmol)이 용해된 디메틸포름아미드30 % DMF (v/v), N-(3-메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보이미드(15 mg, 77 μmol) 및 N-히드록시숙신이미드 (9.0 mg, 77 μmol)를 비드를 함유하는 바이알에 첨가하였다. 실온에서 11시간 동안 흔든 후에, 탈이온수 및 아세톤으로 순차적으로 철저히 세척하였다.

(ii) 차단단계: 무수 메틸렌클로라이드(2.0 mL)중 무수 아세트산 (1.0 mL)를 사용하여 상온에서 하룻밤 동안 남아있는 아민기를 차단시켰다.

(iii) 탈보호화 단계: 메틸렌클로라이드 및 아세톤으로 순차적으로 비드를 세척하고, DMF (3.0 mL)중 20 % 피페리딘를 비드 포함 바이알에 첨가하고, 30분간 바이알을 흔들었다.

(iv) 리간드-고정화 단계: 1,4-부탄딜 디글리시딜 에테르 (1.0 mL) 및 탄산염 완충액 (2.0 mL, pH=11)의 혼합액을 바이알에 첨가하고, 상온에서 24시간 동안 흔들었다. 탈이온수 및 아세톤으로 순차적으로 세척한 후에, 중탄산나트륨 용액 (3.0 mL, pH 8.5) 및 환원 글루타치온 (GSH, 5.4 mg, 17.6 μmol)을 비드 함유 바이알에 첨가하고, 상온에서 24시간 동안 흔들었다. 비드 세척후에, 2-머르캅토에탄올(1.0 mL) 및 수용성 중탄산나트륨 용액 (2.0 mL, pH=8.5)의 혼합액을 비드 함유 바이알에 첨가하였다. 마지막으로, 비드를 분리하고 세척하고, 진공에서 건조하고 질소분위기하에서 4 ℃에 보관하였다. Fmoc-(3) 산 대신에 Fmoc-(9) 산을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 단계를 샘플 E3을 제조하기 위해 수행하였다.

실시예 7.2: 대조 실험을 위해서 다른 GSH 결합 매트릭스의 제조 (샘플 CS, CL, 및 A):

(i) 샘플 CS 및 CL: GSH를 GMBS 링커를 사용하여 AMPCPG 및 LCAA-CPG 에 직접 고정시켰다. 비드 (0.10 g)를 유리 필터를 사용하여 아세톤으로 세척하였다. 진공에서 건조한 후에, DMF 및 4-말레이미도부티르산, N-히드록시숙신이미드 에스테르 (GMBS, 3.0 mg, 11 μmol)가 용해된 중탄산나트륨 완충액 (1.0 mL, 3:7 (v/v), pH=8.5)의 혼합액을 비드 함유 바이알에 첨가하였다. 상온에서 4시간 동안 흔든 후에, 얻어진 비드를 여과 및 탈이온수, 아세톤 세척으로 분리하였다. 마지막으로, 무수 메틸렌클로라이드 (2.0 mL)중 무수 아세트산(1.0 mL)으로 매트릭스에 남아 있는 아민기를 반응시켰다. 세척후에, PBS 완충액 (1.0 mL)중 (GSH, 3.4 mg, 11 μ mol)을 비드 함유 바이알에 첨가하고, 상온에서 12시간 동안 흔들었다. 2-머르캅토에탄올 (1.0 mL)로 남아있는 말레이미도기를 차단하고, 비드를 분리하여, 세척, 진공 건조를 수행하였다.

(ii) 샘플 A: E1 및 E3와 동일한 개질방법으로 1,4-부탄딜 디글리시딜 에테르 및 1,3-디아미노프로판으로 AMPCPG를 개질하였다. 2-머르캅토에탄올로 캡핑한 후에, 1,4-부탄딜 디글리시딜 에테르로 에폭시기를 제조하였다. 마지막으로 글리타치온을 고정시키고, 2-머르캅토에탄올로 비드상에 남아있는 에폭시기의 고리를 개환하였다.

실시예 7.3: 개질 비드상 아민밀도 측정

E1 또는 E3 비드로 개질도중에 있는 비드, 또는 대조실험용 비드 (10 mg)를 e-튜브로 넣었다. 동시에, 9-플루오로메틸 클로로포르메이트 (Fmoc-Cl, 1.75 mg) 및 Na₂CO₃ (1.45 mg)을 별도 유리 바이알에 넣고 1,4-다이옥산 및 물(2.5 mL)의 혼합용매(2:1(v/v)를 첨가하여 시약을 용해시켰다. 상기 용액중 1/5을 취하여 비드 함유 e-튜브에 첨가하였다. 상기 튜브를 바이알에 넣고, 바이알을 상온에서 12시간 동안 흔들었다. 유리 필터를 이용하여 비드를 분리하고, 상기 다공성 물질을 탈이온수 및 아세톤으로 순차적으로 세척하였다. 진공에서 건조한 후에, DMF (0.50 mL)중 20 % 피페리딘을 비드 함유 e-튜브에 넣어 30분간 피페리딘과 반응하도록 하였다. 남아 있는 용액을 튜브로부터 조심스럽게 새로운 e-튜브로 이동시키고, 비드를 DMF (0.25 mL)중 20 % 피페리딘으로 두번 세척하였다. 상기 용액 전부를 이전 e-튜브로 첨가하였다. 용액을 다시 메탄올과 혼합하여 최종 흡광도를 조절하였다. UV/Vis 스펙트로미터를 사용하여 310 nm에서 흡광도를 측정하고 관련 용매를 사용하여 배경 오차 정정을 하기 위해서 사용하였다. 신뢰성 향상을 위해서, 측정은 5가지 다른 샘플에 대해서 수행하였다.

측정을 위해서, 일련의 DMF중 20 % 피페리딘, 및 N-Fmoc-에탄올 아민 (또는 9-플루오로메틸 N-(2-히드록시에틸)카바메이트)(30μM-70μM) 을 제조하였다. 30분간 반응한 후에, 디벤조풀벤 함유 용액을 사용하여 흡광도를 측정하고, 흡광 계수를 계산하였다.

실시예 7.4:GST 융합 단백질 용해물의 제조

GST-융합 단백질을 공지된 문헌에서 설명한 대로 제조하였다(Kim, J. H.; Lee, S.; Kim, J. H.; Lee, T. G.; Hirata, M.; Suh, P.-G.; Ryu, S. H.; Biochemistry 2002, 41, 3414-3421로서 그 전체로서 본 명세서의 참고문헌으로 병합함) 대규모 배양을 위해서는, 재조합pGEX 플라스미드를 함유하는 단일 콜로니를 200 ml 2X YTA 배지에서 배양하였다. 대수증식기까지 배양한 후에, IPTG로 6시간 동안 유전자 발현을 유도하였다. 이어서, 원심분리로 세포를 모으고, 1X PBS로 세척하였다. 그런 후에, 0.50 mM PMSF을 함유하는 10 mL 저삼투압성 완충액 (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 1.0 mM EGTA, pH 7.4) 에서 E. coli 을 초음파로 용해시켰다. 상기 불용성 물질을 제거하고 단백질을 얻었다.

실시예 7.5:결합분석

(i) 사슬 길이의 효과: 상기 제조된 비드 CL (5.72 mg), CS (6.97 mg), E1 (10.0 mg), 및 E3 (14.8 mg)를 0.8 mL 반응 완충액 (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1.0 mM MgCl₂, 1.0 mM EGTA, 1 % TX-100, 0.10 mM PMSF, pH 7.4, 0.50 mM PMSF)중 GST 용해물을 함유하는 혼합 용액과 별개로 1시간 동안, 4℃ 에서 반응시키고, 10 베드 부피의 반응 완충액으로 3회 세척하고, 100 μL SDS-샘플 완충액을 첨가하였다. 상기 튜브를 5 분간 95℃에 둔 후에, 20 μL 샘플을 채취하여 SDS-PAGE분석에 사용하였고, 얻어진 겔을 CBB G-250 염색용액으로 염색하였다.

(ii) 덴드론-처리 매트릭스의 선택도: 10 mg 샘플 A, E1, 및 E3이외에, 100 ㎍ 정제GST 또는 GST-융합 단백질 용해물을 실험에 사용하였다. 나머지 단계는 상기 단계와 동일하다.

실시예 7.6

글루타치온 세파로스-4B, E1 및 E3로부터 GST 융합 단백질 용출

글루타치온 세파로스-4B, E1, 및 E3를 상기 결합분석 항목에 기재된 방법대로 수행하였다. 비드에 결합된 단백질의 양을 Image gauge V3.12 (FUJI PHOTO FILM CO., LTD.)로 정량하였다. p47 ^phox 의 PX도메인 및 Munc-18 단편 용해물에 대해서도 동일한 단계를 수행하였다(도 16).

본 명세에서 언급된 모든 문헌은 그 전체로서 본 명세서에 병합된다. 본 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자는 단지 통상적인 실험으로도 본 발명의 구체적인 예에 등등한 많은 발명을 인식하고 도달할 수 있을 것이다. 상기 등가발명은 하기 청구범위의 보호범위에 포함되는 의도이다.

<110> POSCO POSTECH Foundation <120> SIZE-CONTROLLED MACROMOLECULE <130> opp20060853kr <150> PCT/KR03/01913 <151> 2003-09-18 <150> PCT/KR03/02261 <151> 2003-10-24 <150> US 60/567,844 <151> 2004-05-03 <150> US 60/571,052 <151> 2004-05-14 <150> US 10/917,601 <151> 2004-08-14 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n can be a, t, g or c. <400> 1 ccattccgng tgtcca 16 <210> 2 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <220> <221> misc_feature <222> (38) <223> n can be a, t, g, or c <400> 2 tttttttttt tttttttttt tttttttttt cattccgngt gtcca 45 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target <400> 3 tggacactcg gaatg 15 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target <400> 4 cctacgaaat ctactggaac gaaatctact tggacactcg gaatg 45 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctgactttca actctgtctc ct 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tactcccctg ccctcaacaa 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgcacccttg gtctcctcca c 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ctcgcttagt gctcccggg 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gttttcccag tcacgacgtt g 21 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgagcggata acaatttcac acag 24

Claims (42)

1. 분자 크기 제어된 거대분자들이 규칙적으로 분포하는 분자층을 포함하는 서브스트레이트(substrate)로서,

   상기 거대분자들은 분지된 부위와 선형 부위를 포함하는 중합체를 포함하며,

   상기 분지된 부위의 다수의 말단은 상기 서브스트레이트에 결합되어 있고, 상기 선형 부위의 말단은 관능기화되어 있는,

   서브스트레이트.
2. 제1항에 있어서, 상기 거대분자들이 규칙적인 간격으로 분포하는 것을 특징으로 하는 서브스트레이트.
3. 제2항에 있어서, 상기 거대분자들이 상기 거대분자들의 관능기화된 선형 부위의 작용기 간의 간격이 약 0.1 nm 내지 약 100 nm의 규칙적인 간격이 되도록 분포하는 것을 특징으로 하는 서브스트레이트.
4. 제3항에 있어서, 상기 거대분자들이 약 10 nm의 규칙적인 간격을 두고 분포하는 것을 특징으로 하는 서브스트레이트.
5. 제1항에 있어서, 상기 분지된 부위의 말단이 -COZ, -NHR, -OR' 및 -PR"₃로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 관능기화되어 있고, 상기 식 중, Z는 유리기이며, R은 알킬기이고, R'는 알킬기, 아릴기 및 에테르로 구성된 군으로부터 선택된 것이고, R"는 수소, 알킬기 및 알콕시기로 구성된 군으로부터 선택된 것인, 서브스트레이트.
6. 제5항에 있어서, 상기 COZ는 산, 에스테르, 활성화된 에스테르, 산 할라이드, 활성화된 아마이드 및 CO-이미다조일로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 서브스트레이트.
7. 제1항에 있어서, 상기 중합체가 덴드론인 서브스트레이트.
8. 제1항에 있어서, 상기 선형 부위는 스페이서 부위를 포함하는 것인 서브스트레이트.
9. 제8항에 있어서, 상기 스페이서 부위는 제1 관능기를 통하여 분지된 부위에 연결되어 있는 것인 서브스트레이트.
10. 제9항에 있어서, 상기 관능기는 -NH₂, -OH, -PH₃, -COOH, -CHO, 및 -SH로 구 성된 군으로부터 선택된 것인 서브스트레이트.
11. 제8항에 있어서, 상기 스페이서 부위는 상기 제1 관능기에 공유적으로 결합된 링커 부위를 포함하는 것인 서브스트레이트.
12. 제11항에 있어서, 상기 링커 부위는 치환되거나 치환되지 않은 알킬기, 알케닐기, 알키닐기, 시클로 알킬기, 아릴기, 에테르기, 폴리에테르기, 에스테르기 및 아미노 알킬기로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인 서브스트레이트.
13. 제8항에 있어서, 상기 스페이서 부위는 제2 관능기를 포함하는 것인 서브스트레이트.
14. 제13항에 있어서, 상기 제2 관능기는 -NH₂, -OH, -PH₃, -COOH, -CHO, 및 -SH로 구성된 군으로부터 선택된 것인 서브스트레이트.
15. 제13항에 있어서, 상기 제2 관능기가 상기 선형 부위의 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 서브스트레이트.
16. 제1항에 있어서, 상기 선형 부위의 말단에 보호기가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 서브스트레이트.
17. 제16항에 있어서, 상기 보호기는 산 반응성 물질 또는 염기 반응성 물질인 것을 특징으로 하는 서브스트레이트.
18. 제1항에 있어서, 상기 선형 부위 말단에 표적 특이적 리간드가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 서브스트레이트.
19. 제18항에 있어서, 상기 표적 특이적 리간드가 화합물, DNA, RNA, PNA, 압타머, 펩타이드, 폴리펩타이드, 탄수화물, 항체, 항원, 바이오미메틱스(biomimetics), 뉴클레오타이드 유사체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것인 서브스트레이트.
20. 제18항에 있어서, 상기 거대분자의 선형 부위에 결합되어 있는 표적 특이적 리간드 간의 거리가 약 0.1 내지 약 100 nm인 것을 특징으로 하는 서브스트레이트.
21. 제1항에 있어서, 상기 서브스트레이트는 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체, 금속, 합금, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 유리 및 세라믹으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 제작된 것인 서브스트레이트.
22. 제21항에 있어서, 상기 서브스트레이트는 슬라이드, 입자, 비드, 마이크로웰 및 다공성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 서브스트레이트.
23. 제22항에 있어서, 상기 다공성 물질은 멤브레인, 젤라틴 및 수화젤로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 서브스트레이트.
24. 제22항에 있어서, 상기 비드는 제어된 기공을 갖는 비드(controlled pore bead)인 서브스트레이트.
25. 분지된 부위와 선형 부위를 포함하는 중합체를 포함하는 크기 제어된 거대분자들이 규칙적으로 분포하는 분자층의 제조 방법으로서,

    상기 분지된 부위의 다수의 말단은 서브스트레이트에 결합되어 있고, 상기 선형 부위의 말단은 관능기화되어 있으며,

    (i) 서브스트레이트를 거대분자들의 말단과 반응할 수 있도록 관능기화시키는 단계; 및

    (ii) 상기 거대분자들을 상기 서브스트레이트에 접촉시켜 상기 거대분자 말단과 상기 서브스트레이트가 결합을 형성하도록 하는 단계를 포함하는,

    제조 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 서브스트레이트가 반도체, 합성 유기 금속, 합성 반도체, 금속, 합금, 플라스틱, 실리콘, 실리케이트, 유리 및 세라믹으로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 제작된 것인 제조 방법.
27. 제25항에 있어서, 상기 서브스트레이트는 슬라이드, 비드, 마이크로웰 물질 및 다공성 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제조 방법.
28. 제27항에 있어서, 상기 다공성 물질은 수화젤, 젤라틴 및 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 제조 방법.
29. 제27항에 있어서, 상기 비드는 제어된 기공을 갖는 비드(controlled pore bead)인 제조 방법.
30. 제25항에 있어서,

    i) 상기 서브스트레이트 상의 거대분자의 선형 부위의 말단으로부터 보호기를 제거하는 단계; 및

    ii) 표적 특이적 리간드, 또는 상기 표적 특이적 리간드에 연결된 동형의 양작용성(homobifunctional) 또는 이형의 양작용성(heterobifunctional)인 링커 분자를 상기 서브스트레이트 상의 거대 분자의 선형 부위의 말단과 접촉시켜, 상기 리간드 또는 링커 분자와 상기 말단이 결합을 형성하도록 하는 단계를 포함하는,

    표적 특이적 리간드를 선형 말단에 고정시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 서브스트레이트 상에 존재하는 거대분자가 상기 표적 특이적 리간드와 선형 말단과의 결합에 있어서의 장애(interference)를 최소화시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 서브스트레이트 상에 존재하는 거대 분자가 상기 표적 특이적 리간드에 특이적인 표적의 검출에 있어서의 장애를 최소화시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
33. 제30항에 있어서, 상기 표적 특이적 리간드를 규칙적인 간격으로 분포시키는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
34. 제30항에 있어서, 상기 서브스트레이트는 저밀도의 표적 특이적 리간드를 포함하는 것인 제조 방법.
35. 제34항에 있어서, 상기 저밀도의 표적 특이적 리간드의 밀도가 약 0.01 프로브/nm² 내지 약 0.5 프로브/nm² 범위인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
36. 제30항에 있어서, 상기 표적 특이적 리간드가 화합물, DNA, RNA, PNA, 앱타머, 펩타이드, 폴리펩타이드, 효소, 탄수화물, 폴리사카라이드, 항체, 항원, 바이오미메틱스(biomimetics), 뉴클레오타이드 유사체(nucleotide analog) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
37. 선형 부위의 말단이 표적 특이적 올리고뉴클레오타이드에 고정되어 있는 제1항에 따른 서브스트레이트를 포함하는, 유전자 내 변이 검출을 위한 진단 시스템.
38. 제37항에 있어서, 상기 서브스트레이트는 암 관련 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것인 진단 시스템.
39. 제38항에 있어서, 상기 암 관련 유전자는 p53인 것을 특징으로 하는 진단 시스템.
40. 선형 부위의 말단이 표적 특이적 올리고뉴클레오타이드에 고정되어 있는 제1항에 따른 서브스트레이트를 분석대상 유전자를 함유하는 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, 유전자 내의 변이 존재 여부 검출 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 유전자는 암 관련 유전자인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 유전자가 p53인 것을 특징으로 하는 검출 방법.

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