JP5280292B2 - オリゴヌクレオチドの固定方法 - Google Patents

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドの固定方法に関するものである。

近年、オリゴDNAを固定した微粒子が、遺伝子診断などの分析試薬として、また、導電性ナノのワイヤーやプラズモニック素子といったナノ材料の原料として利用できることが報告されている。

微粒子表面にオリゴDNAを固定する方法としては、目的微粒子表面に反応もしくは吸着する官能基を有するオリゴDNAと、目的微粒子とを溶液中で混合し結合させる方法が知られている（非特許文献１）。

しかしながら、この方法では、オリゴDNAと微粒子との混合比や、反応（吸着）時間などを調節することで、微粒子一つあたりに固定されるオリゴDNAの数を確率論的に調節していた。従って、ある特定数のオリゴDNA分子が固定された微粒子を選択的に作ることはできなかった。また、一つの粒子あたりに、複数のオリゴDNA分子を固定する場合、固定された複数のオリゴDNA分子間の相対的位置を制御することはできなかった。

また、別の方法としては、あらかじめオリゴDNA分子が仮固定されている担体微粒子と、目的微粒子とを溶液中で混合し、接触反応させることで、担体微粒子と目的微粒子との接点位置だけに、オリゴDNA分子を固定する方法も知られている（非特許文献２）。
この方法では、目的微粒子上の狭い領域にオリゴDNA分子を単数、あるいは、不特定多数で固定している。従って、上記の方法と同様に、複数のオリゴDNA分子を固定する場合、微粒子一つ当たりに固定されるオリゴDNA分子の数を制御できず、また、固定された複数のオリゴDNA分子間の相対的位置関係を自由に設計することもできなかった。

なお、上記の２つの方法で作成した複合体混合物の中にも、目的とする構造の複合体は、ある確率で含まれていると考えられるが、それらを精製するためには、多くの手間がかかるだけでなく、多くの原材料（微粒子、オリゴDNA分子）が無駄になってしまう。

このように、微粒子一つあたりに固定されるオリゴDNAの数および、オリゴDNA同士の相対的位置関係を調整できないことで、例えば、以下のような問題が指摘されている。

ＤＮＡ固定化微粒子を用いた従来の簡易遺伝子診断技術について図６、図７の模式図を用いて説明する。

従来の簡易遺伝子診断技術では、まず、標的DNAの一端と相補的な配列を有するオリゴDNA（プローブDNA）の固定された微粒子と、標的DNAの反対側の一端と相補的な配列を有するオリゴDNA（別のプローブDNA）の固定された微粒子とを混ぜ合わせた分散溶液を用意し、この分散溶液と、サンプルとを混ぜ合わせると、サンプルに標的DNAが入っている場合には、プローブDNAと標的DNAとのハイブリダイゼーションによって微粒子間が架橋される。その結果、微粒子がバルク凝集体や沈殿となり、微粒子溶液の色や濁度が変化し、サンプルに標的DNAが含まれていたことが検出される。一方、もし、サンプルに標的DNAが入っていなかったり、入っているDNAに一塩基変異（SNP）などが存在たりすると、ハイブリダイゼーションによる架橋が起こらない。この様な原理に基づいて、従来から、DNA固定化微粒子を用いることで、サンプル内に、ある特定のDNAが入っているか入っていないかを簡単に検出できることが知られている。

しかし、従来法で用いていたDNA固定化微粒子は一つの微粒子上に不特定多数のオリゴDNA分子（数十〜数百）が固定されており、標的DNAの多くが、同一微粒子間の多重架橋に使われたり、微粒子間架橋に関与できない位置にあるプローブDNAに結合してしまったりして無駄になっている。このことは、本診断方法の検出限界を低下させる一つの要因になっていると考えられる。従って、検出限界を向上させる一つの方法は、バルク凝集が起こる限界量まで、1つの微粒子当りのプローブDNAの量を減らすことである。

ここで重要なことは、数少ないプローブDNAの位置を適切に設計することで、全てのプローブDNAが、重複することなく、微粒子間架橋に寄与できるようにプローブDNA配置することである。もし、所望の配置が実現できれば、微粒子がバルク凝集体となるためには、最低、１つの微粒子当り2つ以上のプローブDNAがあればよい（図７(a)）。しかし、従来の固定方法では、上記の通り、特定の数のオリゴDNAを微粒子上に選択的に固定することは出来なかった。従って、当然ながら2つのプローブDNAだけが選択的に固定された微粒子を得ることも出来なかった。また、仮に、従来固定法で作成したオリゴDNA固定化微粒子の中から、偶然２つのプローブDNAだけが固定された微粒子だけを精製して得ることができても、2つのプローブDNA間の距離までは完全に制御できない。その結果、2つのプローブDNA間の距離が近すぎる微粒子が、かなりの数含まれることになる。この様な微粒子は、ターゲットDNAとハイブリダイズしても、微粒子２量体になってしまったり（図７(b)）、図７(c)に示すように、微粒子凝集体の末端をキャップして大きなバルク集合体になるのを防いだりする可能性がある。従って、従来法で作成したDNA固定化微粒子を用いている限り、プローブDNAの量を限界まで減らして検出限界を向上させることは困難であった。

Zanchet, D.; Micheel, C. M.; Parak, W. J.; Gerion, D.; Alivisatos, A. P. Nano Lett., 2001, 1, 32. Xu, X.; Rosi, N. L.; Wang, Y.; Huo, F.; Mirkin, C. A. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 9286.

本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、担体上に、任意の数のオリゴヌクレオチドを、任意の間隔で固定することができるオリゴヌクレオチドの固定方法を提供することを課題としている。

本発明は、上記の課題を解決するため、以下のことを特徴としている。
＜１＞２以上の所定数の一本鎖オリゴヌクレオチドを所定間隔で担体上に固定する方法であって、以下の工程、
（１）担体と結合可能な官能基を有するオリゴヌクレオチドのそれぞれを、オリゴヌクレオチドの相補配列を所定数有するガイドＤＮＡとハイブリダイズする工程、
（２）オリゴヌクレオチドの官能基を担体に結合させる工程、
（３）脱ハイブリダイゼーションによって、オリゴヌクレオチドからガイドＤＮＡを取り除く工程、を含む。
＜２＞前記ガイドＤＮＡは、オリゴヌクレオチドの相補配列が所定数連続する一本鎖ＤＮＡである。
＜３＞前記ガイドＤＮＡは、２以上の一本鎖ガイドＤＮＡがハイブリダズして二本鎖領域と非二本鎖領域が形成された複合体であり、非二本鎖領域に、オリゴヌクレオチドの相補配列を有している。
＜４＞オリゴヌクレオチドは、それぞれ異なる配列を有する。
＜５＞官能基は、オリゴヌクレオチドの末端に結合している。
＜６＞オリゴヌクレオチドは、末端にスペーサー配列を有する。
＜７＞担体表面がコーティング処理されている。
＜８＞担体が微粒子である。
＜９＞担体が基板である。

本発明によれば、任意の数のオリゴヌクレオチドを担体上に固定することができるため、例えば、オリゴヌクレオチドが固定された微粒子間でのオリゴヌクレオチドを介した相互作用を、定量的に制御することができる。また、本発明は、オリゴヌクレオチドを任意の相対的位置関係で担体上に固定することができるため、例えば、複数のオリゴヌクレオチドを互いに相互作用できない距離に配置し独立に機能させたり、逆に、互いに相互作用できる距離に配置して協調的に機能させたりといった制御を行うことができる。

本発明の方法によって得られるオリゴヌクレオチド固定担体は、上記の幾何学的特性を備えており、様々な分野での応用が可能である。

本発明のオリゴヌクレオチドの固定方法の工程の概要を例示する模式図である。 様々な形態のガイドＤＮＡとオリゴヌクレオチとがハイブリダイズした状態を例示する説明図である。 オリゴＤＮＡが固定された金ナノ粒子分散液のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例２の概要を示す模式図である。 金ナノ粒子３量体の透過電子顕微鏡（TEM）写真＆構造パラメータθのヒストグラムである。 (a)ガイドＤＮＡを使わずにオリゴDNAを固定した金ナノ粒子と5 nmプローブ金ナノ粒子2つとから成る3量体、(b) ガイドＤＮＡを使ってオリゴDNAを固定した金ナノ粒子と5 nmプローブ金ナノ粒子2つとから成る3量体、(c) ガイドＤＮＡを使ってオリゴDNAを固定した金ナノ粒子と5nmプローブ金ナノ粒子、10 nmプローブ金ナノ粒子とから成る3量体。スケールバーは100 nmに相当する。 ＤＮＡ固定化微粒子を用いた従来の簡易遺伝子診断技術を示す模式図である。 ＤＮＡ固定化微粒子を用いた従来の簡易遺伝子診断技術を示す模式図である。

本発明のオリゴヌクレオチドの固定方法は、２以上の所定の数の一本鎖オリゴヌクレオチドを所定間隔で担体上に固定する方法であって、以下の＜１＞〜＜３＞の工程を含むものである。図１に、本発明のオリゴヌクレオチドの固定方法の工程の概要を例示する。

＜１＞担体（３）と結合可能な官能基を有するオリゴヌクレオチド（１）のそれぞれをオリゴヌクレオチドの相補配列を所定数有するガイドＤＮＡ（２）とハイブリダイズする工程。

「オリゴヌクレオチド」（１）は、オリゴＤＮＡ、オリゴＲＮＡをいい、その長さは、限定されないが、例えば、５〜１００塩基程度の範囲とすることができる。また、オリゴヌクレオチド（１）は、人工的に合成されたもの、自然界に存在するもののいずれでもよく、目的、用途に応じて、適宜選択することができ、具体的な配列は限定されない。さらに、ＤＮＡ、ＲＮＡと似た構造を持つペプチド核酸（ＰＮＡ）も本発明の方法によって、担体上に固定することができる。また、本発明の方法によれば、所定の数のオリゴヌクレオチド（１）を固定することができるが、オリゴヌクレオチド（１）同士は、互いに同じ配列であっても、異なる配列であってもよい。

また、「担体」（３）は、オリゴヌクレオチド（１）を担持するもので、例えば、金、プラチナ、シリカ、ケイ酸カルシウムなどの微粒子や、ガラス、プラスチック、シリコンなどの基板など、公知の材料を適宜採用することができる。そして、担体（３）の表面は、カルボキシル基、ヒドロキシル基などの親水基でコーティングされていることが好ましい。コーティングの方法は、公知の方法を採用すればよく、例えば、bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine dipotassium salt (BSPP)などによるコートが例示される。これにより、担体（３）とオリゴヌクレオチド（１）との非特異的な吸着を防ぎ、所望の数、位置でオリゴヌクレオチド（１）を担体（３）上に固定することができる。さらに、微粒子を使用する場合、微粒子の直径に制限はなく、例えば、１nm〜１０μm程度の範囲で、目的・用途に応じた大きさのものを使用することができる。

さらに、例えば、担体（３）の表面にアミノ基を結合させることもできる。従って、担体（３）としては、アミノ基を結合することのできるものを用いることも好ましい。担体（３）にアミノ基を結合する方法としては、特に制限はなく、従来公知の方法が挙げられ、例えば、シランカップリング剤で担体を浸漬等する方法が挙げられる。シランカップリング剤とは、樹脂等の有機化合物と反応し得る有機官能基と、ガラス等の無機化合物とを、シロキサン結合を介して結合し得る部分を併せ持つ化合物のことをいい、例えば、γ−アミノプロピルトキメトキシシランなどをいう。担体（３）表面をシランカップリング剤で処理する際には、担体（３）を予め、水、薬液などで洗浄しておくことが好ましい。

そして、前記「官能基」は、オリゴヌクレオチド（１）に導入可能で、担体（３）と結合可能なものを適宜選択することができる。例えば、図１に例示するように、担体（３）として金微粒子を使用する場合には、官能基として、チオール基を選択することができる。また、前記のように、担体（３）表面にアミノ基を結合させた場合には、官能基としてアミノ基（ＰＤＣ存在下）、アルデヒド基などを選択することができる。

また、官能基は、オリゴヌクレオチド（１）の末端に導入することが好ましく、５’末端、３’末端のいずれにも導入することができる。また、官能基を導入するオリゴヌクレオチド（１）の末端には、スペーサーを設けることが好ましい。スペーサーの具体的な配列、長さは特に限定されず、例えば、チミン（Ｔ）の繰り返し配列などとすることができる。スペーサーを設けることで、後述するオリゴヌクレオチド（１）とガイドＤＮＡ（２）の結合体から、官能基を適度に離すことができるため、担体（３）との反応性をさらに高めることができる。

以下、本発明におけるガイドＤＮＡ（２）について、図２に例示する模式図とともに詳しく説明する。図２は、様々な形態のガイドＤＮＡ（２）とオリゴヌクレオチド（１）とがハイブリダイズした状態を例示している。

「ガイドＤＮＡ」（２）は、所定の数および間隔でオリゴヌクレオチド（１）を固定するための鋳型の役割を果たすものであり、担体（３）上に固定するオリゴヌクレオチド（１）の配列、所定の数、オリゴヌクレオチド（１）同士の間隔に応じて様々に設計される。したがって、自動合成装置などで所望の配列に合成されたＤＮＡを使用することが好ましい。

ガイドＤＮＡ（２）の形態は、一本鎖ＤＮＡとすることができ、さらに好ましくは、２以上の一本鎖ＤＮＡがハイブリダイズして二本鎖領域と非二本鎖領域が形成された複合体とすることができる。

ガイドＤＮＡ（２）が一本鎖ＤＮＡの場合、例えば、図２（a）に例示するような直線状や、図２の（b）に例示するような環状とすることができる。

ガイドＤＮＡ（２）の具体的な配列は限定されないが、少なくとも、担体（３）上に固定するオリゴヌクレオチド（１）の相補配列を、所定の数有しているものとする。図２（a）（b）においては、ガイドＤＮＡ（２）が、オリゴヌクレオチド（１）の相補配列を、それぞれ、２個、３個有し、この相補配列の位置で、対応する数のオリゴヌクレオチド（１）がハイブリダイズした状態を例示しているが、ガイドＤＮＡ（２）におけるオリゴヌクレオチド（１）の相補配列の数を調整することで、任意の数のオリゴヌクレオチド（１）を担体（３）上に固定することができる。

また、ガイドＤＮＡ（２）とオリゴヌクレオチド（１）とがハイブリダイズして形成されたＤＮＡ（または、ＤＮＡ−ＲＮＡ）の二本鎖領域は、長さが一定の剛直な直線状分子であると考えることができるため、本発明においては、この二本鎖領域によって、オリゴヌクレオチド（１）同士の間隔を所定の間隔に制御することができる。したがって、ガイドＤＮＡ（２）が一本鎖ＤＮＡの場合、オリゴヌクレオチド（１）の相補配列が所定数連続していることが好ましい。これによって、オリゴヌクレオチド（１）自身の長さに応じた間隔で、担体上にオリゴヌクレオチド（１）を固定することができる。

逆に、例えば、図２（a）に例示するような直線状のガイドＤＮＡ（２）の場合において、２つのオリゴヌクレオチド（１）の相補配列の間に、その他の配列を有しているような場合、その領域は、二本鎖が形成されないため、構造が不安定となり、所定の間隔でオリゴヌクレオチド（１）を固定することが難しい。したがって、ガイドＤＮＡ（２）が一本鎖ＤＮＡの場合は、上記のとおり、オリゴヌクレオチド（１）の相補配列が所定数連続するように設計することが好ましい。

一方、ガイドＤＮＡ（２）は、例えば、二本鎖領域と非二本鎖領域が形成された複合体とすることができる。すなわち、複合体を構成する一本鎖ガイドＤＮＡは、少なくとも一部に、対応する一本鎖ガイドＤＮＡの相補配列を有している。

そして、これらの形態のガイドＤＮＡ（２）は、非二本鎖領域に、オリゴヌクレオチド（１）の相補配列を有しており、この非二本鎖領域にオリゴヌクレオチド（１）が結合している。これらの形態においても、ガイドＤＮＡ（２）におけるオリゴヌクレオチド（１）の相補配列の数（非二本鎖領域の数）を調整することで、任意の数のオリゴヌクレオチド（１）を担体（３）上に固定することができる。

さらに、この形態のガイドＤＮＡ（２）は、複合体に形成された二本鎖領域によって、固定されるオリゴヌクレオチド（１）同士の間隔を、所定の間隔に制御することができる。この場合も、二本鎖領域が、長さが一定の剛直な直線状分子であることに基づいている。すなわち、ガイドＤＮＡ（２）に形成される二本鎖領域の長さを調節することで、この二本鎖領域の長さに対応する間隔で、担体（３）上にオリゴヌクレオチド（１）を固定することができる。

ガイドＤＮＡ（２）は、具体的には、図２（c）（d）（e）（f）に例示するような、二本鎖領域と非二本鎖領域が形成された複合体とすることができる。

図２（c）に例示するガイドＤＮＡ（２）は、２つの一本鎖ガイドＤＮＡが、互いの端部で結合して二本鎖領域と非二本鎖領域が形成された形態であり、図２（d）に例示するガイドＤＮＡ（２）は、２つの一本鎖ガイドＤＮＡのうちの一方の一部に他方の一本鎖ガイドＤＮＡが結合して二本鎖領域と非二本鎖領域が形成された形態である。

その他、ガイドＤＮＡ（２）は、例えば、図２（e）に例示するように、分岐構造を有し、分岐部分において二本鎖領域が形成された形態や、図２（f）に例示するように、環状の一本鎖ガイドＤＮＡに、複数の一本鎖ガイドＤＮＡを結合させて二本鎖領域と非二本鎖領域が形成された形態とすることもできる。

さらに、図２（g）に例示するように、ガイドＤＮＡ（２）の一部は、化学リンカーで接続されたものを使用して、さらに複雑な形態のガイドＤＮＡ（２）を設計することもできる。

なお、図２は、本発明におけるガイドＤＮＡ（２）の形態を例示したものであり、ガイドＤＮＡ（２）は、担体（３）に固定するオリゴヌクレオチド（１）の長さ、数、間隔に応じて適宜設計し得るものである。

また、ガイドＤＮＡ（２）は、オリゴヌクレオチド（１）とハイブリダイズする前に予め複合体として形成しておくこともできるし、所望の配列に設計した一本鎖ガイドＤＮＡを、オリゴヌクレオチド（１）と混合してハイブリダイズさせることで、ガイドＤＮＡ（２）の形成と、ガイドＤＮＡ（２）とオリゴヌクレオチド（１）と結合を同時に行うこともできる。

なお、オリゴヌクレオチド（１）とハイブリダイズしたガイドＤＮＡ（２）は、電気泳動等の公知の方法で、分離、精製することができる。

＜２＞オリゴヌクレオチド（１）の官能基を担体（３）に結合させる工程。

上記＜１＞の工程で得た、オリゴヌクレオチド（１）とガイドＤＮＡ（２）との結合体と担体を混合し、所定の条件下で、オリゴヌクレオチド（１）の官能基を担体（３）に結合させる。反応条件は、オリゴヌクレオチド（１）の官能基、担体（３）によって異なるが、例えば、図１に例示するように、担体（３）が金微粒子、オリゴヌクレオチド（１）の官能基がチオール基の場合には、金微粒子の分散溶液に、オリゴヌクレオチド（１）とガイドＤＮＡ（２）との結合体を、適宜な割合で添加、混合し、室温で２４時間程度反応させることで、オリゴヌクレオチド（１）の官能基を担体（３）に結合させることができる。また、目的のオリゴヌクレオチド（１）とガイドＤＮＡ（２）との結合体は、例えば、遠心分離によって精製し、電気泳動溶出によって回収することができる。

＜３＞脱ハイブリダイゼーションによって、オリゴヌクレオチド（１）からガイドＤＮＡ（２）を取り除く工程。

脱ハイブリダイゼーションは、例えば、塩濃度を制御し、温度をＤＮＡ２重鎖の脱ハイブリダイゼーション温度（Ｔｍ）以上にする方法や、溶液をアルカリ雰囲気にする等の従来から知られている方法を用いることができる。脱ハイブリダイゼーション後は、遠心分離などにより、ガイドＤＮＡ（２）を取り除くことができる。

そして、脱ハイブリダイゼーションによって、担体（３）上に結合しているオリゴヌクレオチド（１）からガイドＤＮＡ（２）が除去されると、上述したように、所望の配列、形態に設計されたオリゴヌクレオチド（１）とガイドＤＮＡ（２）の結合体によって、任意の数、間隔でオリゴヌクレオチド（１）が固定された担体を得ることができる。

以上のとおり、本発明の方法によれば、担体上に固定されるオリゴDNAの数や、位置を適切に制御できるため、例えば、オリゴヌクレオチドが固定された微粒子間でのオリゴヌクレオチドを介した相互作用を、定量的に制御することができる。また、本発明は、オリゴヌクレオチドを任意の間隔（相対的位置関係）で担体上に固定することができるため、例えば、複数のオリゴヌクレオチドを互いに相互作用できない距離に配置し独立に機能させたり、逆に、互いに相互作用できる距離に配置して協調的に機能させたりといった制御を行うことができる。

さらに、具体的には、例えば、ＤＮＡ固定化微粒子を用いた簡易遺伝子診断技術において、よりバルク凝集体を作りやすく、最適なプローブDNAの固定化数、位置を設計することができる。

なお、本発明の方法によって得られる担体は、上記のとおりのこれまでにない幾何学的特性を備えており、様々な分野での応用が可能である。

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

(実施例1）
金ナノ粒子（直径5nm、10nm、30nm）の分散溶液はBBInternational社から購入した。金ナノ粒子の塩凝集に対する耐性を高めたり、金ナノ粒子表面へのオリゴDNAの非特異吸着を抑制したりするために、購入した金ナノ粒子表面を、Strem Chemical社から購入したbis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine dipotassium salt (BSPP)でコートした。具体的には、金ナノ粒子分散液500μｌを、100μｌのBSPPの溶液（50mg/ml）と混ぜ、５０℃で１時間インキュベートすることで、金ナノ粒子表面をBSPPでコートした。過剰なBSPPは、金ナノ粒子分散液を遠心分離したときに得られる上清とともに除去した。最後にBSPPでコートされた金ナノ粒子の沈澱は、少量のBSPP（1ｍｇ/ｍｌ）を含む0.5×TBEバッファーに再分散させ冷蔵庫に保管し２週間以内に使用した。

全てのオリゴDNAはInvitrogen社から購入した。金ナノ粒子表面に固定されるオリゴDNAとして5′末端に、官能基としてチオール基を導入した50merオリゴDNA（HS-T₃-X-T₁₇、HS-T₃-Y-T₁₇）を用いた。それぞれのチオール基にはダイマー化を防ぐための保護基として、メルカプトヘキサノールがついている。ここで、チオール化オリゴDNAの配列はそれぞれ以下の［表１］の通りである。

上記の様に、それぞれのチオール化オリゴＤＮＡは、5′末端のT₃スペーサー配列と、3′末端のT₁₇タグ配列との間に、独自の30mer配列X、あるいは、Yを持っている。T₃スペーサー配列はチオール基を、後述するオリゴＤＮＡとガイドＤＮＡの結合体から適度に離すことで、金ナノ粒子表面と反応し易くしている。また、T₁₇タグ配列は、本発明の趣旨とは直接関係無いが、金ナノ粒子を、固定されたオリゴDNAの数に応じて電気泳動分析し易くするという目的で付け足している。

そして、上記2種類のチオール化オリゴＤＮＡと、2種類の一本鎖ガイドＤＮＡ（X′A′、Y′A）とを、100 mM NaClを含む10 ｍM Tris-HClバッファー（ｐH8）中でハイブリダイゼーションさせた。ガイドＤＮＡの配列を［表２］に示す。

この様に、ガイドＤＮＡ（X′A′）の5′側の30mer配列X′は、上記チオール化オリゴＤＮＡ（HS-T₃-X-T₁₇）の配列Xと相補的関係にあり、ガイドＤＮＡ（Y′A）の配列Y′は、上記チオール化オリゴＤＮＡ（HS-T₃-Y-T₁₇）の配列Yと相補的関係にある。また、ガイドＤＮＡ（X′A′）の3′側の15mer配列A′とガイドＤＮＡ（Y′A）の配列Aは、互いに相補的な関係にある。

従って、上記2種類のチオール化オリゴＤＮＡと、2種類の一本鎖ガイドＤＮＡをハイブリダイゼーションすることで、図１に例示したような、中央に二本鎖領域を有し、互いの端部に非二本鎖領域が形成されたガイドＤＮＡと、オリゴＤＮＡとの結合体が得られる。

ハイブリダイゼーション溶液に含まれる前記結合体は、12.5％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離精製し、ゲルからの電気泳動溶出によって回収した。BSPPでコートされた5nm金ナノ粒子と、精製した前記結合体とを、0.5×TBEバッファー（BSPPを1mg/ml、NaClを166mM含む）中で、 5：1、あるいは、5：2のモル比となるように混合し、室温（22℃）で24時間反応させて、前記結合体をチオール基を介して金ナノ粒子上に固定した。

反応溶液を遠心分離し、上清を捨てることで未反応の前記結合体を金ナノ粒子分散液から取り除いた。残った金ナノ粒子を、BSPPの希薄水溶液（0.25ｍｇ/ｍｌ）に再分散し４０℃で15分インキュベートすることで、ガイドＤＮＡを、金ナノ粒子上のチオール化オリゴＤＮＡから脱ハイブリダイゼーションした。金ナノ粒子分散液を遠心分離し、上清を捨てることで脱ハイブリダイゼーションした非チオール化オリゴＤＮＡを金ナノ粒子分散液から取り除いた。その後、同様の脱ハイブリダイゼーションプロセスを2回繰り返すことで、オリゴＤＮＡが固定された金ナノ粒子を含有する金ナノ粒子分散液を得た。

本発明の有効性を確認するための参照サンプルとして、チオール化オリゴＤＮＡを、ガイドＤＮＡを使わずに5nm金ナノ粒子と直接反応させて、金ナノ粒子にオリゴＤＮＡを固定した。具体的には、BSPPでコートされた5nm金ナノ粒子と、前記チオール化オリゴＤＮＡ（HS-T₃-X-T₁₇）とを、0.5×TBEバッファー（BSPPを1mg/ml、NaClを166mM含む）中で、5：2、あるいは、5：4のモル比となる様に混合し、50℃で1時間反応させて、金ナノ粒子にオリゴDNAを固定した。未反応のチオール化オリゴＤＮＡを取り除くために、得られた金ナノ粒子を、BSPPの希薄水溶液（0.25ｍｇ/ｍｌ）に分散し遠心分離後に上清を取り除く操作を3回繰り返した。

図３に、前記の方法でオリゴＤＮＡが固定された金ナノ粒子分散液の3％アガロースゲル電気泳動の結果を示す。レーン1は、BSPPのコートされた5nm金ナノ粒子に対応する。また、レーン2、レーン3は、ガイドＤＮＡを使わずにオリゴＤＮＡを固定した金ナノ粒子に対応する。

上記［背景技術］で説明した非特許文献1で報告されているように、ガイドＤＮＡを使わずに、オリゴＤＮＡを金ナノ粒子に固定した場合には、オリゴDNAを1個だけ持っている金ナノ粒子（「1：1金ナノ粒子」という）、2個持っている金ナノ粒子（「1：2金ナノ粒子」という）、あるいは、3個持っている金ナノ粒子（「1：3金ナノ粒子」という）など様々なタイプの金ナノ粒子が混在していることが分かる(レーン2、レーン3参照)。

一方、ガイドＤＮＡを使ってオリゴＤＮＡを固定した金ナノ粒子は、1：2金ナノ粒子が優先的に生成していることが分かる（レーン4、レーン5を参照）。この結果から、本発明の方法によって、金ナノ粒子表面に固定するオリゴDNAの数を精密に制御できることが確認できた。さらに、この1：2金ナノ粒子の持つ2つのオリゴＤＮＡが、異なる配列（HS-T₃-X-T₁₇、HS-T₃-Y-T₁₇）であるか否かをチェックするために、プローブオリゴＤＮＡ（T50-X′、T50-Y′）を用いたハイブリダイゼーション試験を行った。ここで、プローブオリゴＤＮＡの配列を［表３］に示す。

上記ハイブリダイゼーションテストでは、レーン4と同じ金ナノ粒子分散液を、大過剰量のプローブオリゴＤＮＡと室温で24時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動した。その結果が、レーン6、レーン7、レーン8に対応する。プローブオリゴＤＮＡとハイブリダイズすることで1：2金ナノ粒子の移動度は低下している。低下の程度は、T50-X′のみ、あるいは、T50-Y′のみとインキュベーションした1：2金ナノ粒子よりも、T50-X′とT50-Y′との両方とインキュベーションした1：2金ナノ粒子の方が大きい。この結果から、ガイドＤＮＡを用いて作成した1：2金ナノ粒子の多くが、異なるオリゴDNA（HS-T₃-X-T₁₇、HS-T₃-Y-T₁₇）を一個ずつ持っていることが確認された。

（実施例2）
次に、図４の模式図に例示するように、ガイドＤＮＡを用いてオリゴＤＮＡを固定した金ナノ粒子に相補的なオリゴＤＮＡで被覆された金ナノ粒子をハイブリダイズさせ、得られた金ナノ粒子3量体を透過電子顕微鏡（TEM）観察することで、金ナノ粒子上に固定されたオリゴＤＮＡの位置を間接的に確認した。この実験では、TEM観察を容易にするために、実施例1で用いた5 nm金ナノ粒子を、30 nm金ナノ粒子に置き換えた。また、これに伴って、実施例1では15 mer配列A′とAとからできていたガイドＤＮＡの中心にある二重鎖アーム（二本鎖領域）を、35 mer配列B′とBからから成るより長い二重鎖アーム（二本鎖領域）に置き換えた。具体的には、T₁₇タグの無い2種類のチオール化オリゴＤＮＡ（HS-T₃-X、HS-T₃-Y）と、2種類の一本鎖ガイドＤＮＡ（X′B′、Y′B）とをハイブリダイズさせた。前記の様にアクリルアミド電気泳動によって精製した。一本鎖ガイドＤＮＡ配列を［表４］に示す。

次にBSPPでコートされた30 nm金ナノ粒子と、オリゴＤＮＡとガイドＤＮＡの結合体とを、0.5×TBEバッファー（BSPPを1 mg/ml、NaClを50 mM含む）中で、1：1のモル比となるように混合し、室温（22℃）で24時間反応させて、金ナノ粒子に前記結合体を固定した。そして、前記の脱ハイブリダイゼーションプロセスを3回繰り返すことで、ガイドＤＮＡをオリゴＤＮＡから外し、オリゴＤＮＡが固定された金ナノ粒子を含有する金ナノ粒子分散液を得た。

金ナノ粒子上に固定されたオリゴＤＮＡの位置を可視化するために、前記金ナノ粒子上のオリゴＤＮＡと相補的なチオール化オリゴDNAで被覆された２つのプローブ金ナノ粒子とをハイブリダイズさせ、金ナノ粒子3量体を含む金ナノ粒子分散液を得た。ここで、プローブ金ナノ粒子の直径は、5nm あるいは10nmである。

さらに、本発明の有効性を確認するための参照サンプルとして、ガイドＤＮＡを使わずに前記チオール化オリゴＤＮＡ（HS-T₃-X、HS-T₃-Y）を、30nm金ナノ粒子表面に固定し、金ナノ粒子分散液を得た。ここで得られた金ナノ粒子も、プローブ金ナノ粒子とハイブリダイズさせ、金ナノ粒子3量体を含む金ナノ粒子分散液を得た。

上記2つの方法で得られた金ナノ粒子3量体を含む分散液を、それぞれ2％アガロースゲル上で電気泳動し、金ナノ粒子3量体を精製した。精製された金ナノ粒子3量体をTEM観察した結果を図５に示す。

図５ (a)の上図は、ガイドＤＮＡを用いずにオリゴＤＮＡを固定した金ナノ粒子と、2つの5nmプローブ金ナノ粒子とをハイブリダイズさせて作った金ナノ粒子3量体のTEM写真である。観察された160個の3量体に対して、30nm金ナノ粒子からそれぞれのプローブ金ナノ粒子に向かう2つのベクトルを求め、それらのなす角を、下図のヒストグラムとしてまとめた。

同様に、ガイドＤＮＡを用いてオリゴＤＮＡを固定した金ナノ粒子と、2つの5nmプローブ金ナノ粒子とをハイブリダイズさせて作った金ナノ粒子3量体のTEM写真とヒストグラムを図５(b)、(c)に示す。ここで、(b)は5nmのプローブ金ナノ粒子2つとハイブリダイズさせて作成した金ナノ粒子3量体（136個）、(c)は5nmと10nmのプローブ金ナノ粒子とハイブリダイズさせて作成した金ナノ粒子3量体（87個）に対応するデータである。

それぞれのヒストグラムを比較すると、ガイドＤＮＡを使わずに作った金ナノ粒子3量体では、ヒストグラムに明確なピークは認められない（図５(a)）。一方、ガイドＤＮＡを用いて作成した金ナノ粒子3量体には、プローブ金ナノ粒子の大きさに関わらず、20°〜40°の範囲に明確なピークが存在する（図５(b)、(c)）。このピーク位置は、用いたオリゴＤＮＡとガイドＤＮＡの結合体のサイズから予想される値43°と一致している。

以上の結果から、ガイドＤＮＡを用いる本発明によって、金ナノ粒子上でのオリゴDNA分子間の間隔、すなわち相対的位置関係を制御することが可能であることが示された。

Claims (9)

1. ２以上の所定数の一本鎖オリゴヌクレオチドを所定間隔で担体上に固定する方法であって、以下の工程、
   （１）担体と結合可能な官能基を有するオリゴヌクレオチドのそれぞれを、オリゴヌクレオチドの相補配列を所定数有するガイドＤＮＡとハイブリダイズする工程、
   （２）オリゴヌクレオチドの官能基を担体に結合させる工程、
   （３）脱ハイブリダイゼーションによって、オリゴヌクレオチドからガイドＤＮＡを取り除く工程、
   を含むことを特徴とするオリゴヌクレオチド固定方法。
2. 前記ガイドＤＮＡは、オリゴヌクレオチドの相補配列が所定数連続する一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする請求項１のオリゴヌクレオチド固定方法。
3. 前記ガイドＤＮＡは、２以上の一本鎖ガイドＤＮＡがハイブリダイズして二本鎖領域と非二本鎖領域が形成された複合体であり、非二本鎖領域に、オリゴヌクレオチドの相補配列を有していることを特徴とする請求項１のオリゴヌクレオチド固定方法。
4. オリゴヌクレオチドは、それぞれ異なる配列を有することを特徴とする請求項１から３のいずれかのオリゴヌクレオチド固定方法。
5. 官能基は、オリゴヌクレオチドの末端に結合していることを特徴とする請求項１から４のいずれかのオリゴヌクレオチド固定方法。
6. オリゴヌクレオチドは、末端にスペーサー配列を有することを特徴とする請求項５のオリゴヌクレオチド固定方法。
7. 担体表面がコーティング処理されていることを特徴とする請求項１から６のいずれかのオリゴヌクレオチド固定方法。
8. 担体が微粒子であることを特徴とする請求項１から７のいずれかのオリゴヌクレオチド固定方法。
9. 担体が基板であることを特徴とする請求項１から７のいずれかのオリゴヌクレオチド固定方法。