JP2005525084A - オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法 - Google Patents

オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子とその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は核酸の検出方法を提供する。該方法は、核酸を、オリゴヌクレオチドを付着した１または複数種類の粒子と接触させることから成る。該方法の１実施形態では、オリゴヌクレオチドがナノ粒子に取り付けられ、核酸の配列の一部と相補的な配列を有する。ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが核酸に対してハイブリダイズした結果として、検出可能な変化（好ましくは色の変化）が生じる。本発明は粒子を含む組成物およびキットも提供する。本発明はさらに、独自のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の合成方法、該方法によって得られた共役体、該共役体の使用方法も提供する。その上、本発明はナノ粒子を含むナノ材料およびナノ構造とナノ粒子を使用したナノファブリケーションの方法を提供する。最後に、本発明は選択核酸を他の核酸から分離する方法を提供する。

Description

本発明は、天然または合成の、かつ修飾または非修飾の、核酸およびタンパク質を含む検体を検出する方法に関する。また、本発明は、核酸を検出するための材料およびそれらの材料を調製する方法にも関する。本発明はさらに、ナノファブリケーション法に関する。最後に、本発明は、選択核酸を他の核酸から分離する方法に関する。
核酸を検出し、スクリーニングする方法の開発は、遺伝的、細菌性およびウイルス性疾患の診断に重要である。非特許文献１参照。現在、特定の核酸配列の検出に使用されている方法には様々なものがある。同上。しかし、これらの方法は、複雑で、時間がかかり、かつ／または特殊化された高価な装置を必要とする。そのような装置を必要としない簡単で高速の核酸検出法が望ましいことは明らかである。
金コロイドタンパク質プローブは、免疫細胞化学における広い用途が見出されている［非特許文献２および非特許文献３］。これらのプローブは、注意深く定義した条件下で水溶液から金表面上に抗体を吸着することにより調製される。この方法で生産された複合体は、機能的であるが、いくつかの欠点を有している：例えば、そのようなタンパク質の一部は、放置すると脱着し、抗原標的に対する吸着抗体と競合する抗体を溶液中へ遊離する；吸着量が低く抗体の一部が吸着時に変性するため、活性が低い；およびそのようなタンパク質でコートされた粒子は、特にイオン強度の高い溶液中で自己集合する蛍光がある。ナノ粒子タンパク質プローブを調整するための別の手段が、Ｊ．Ｅ．Ｈａｉｎｆｅｌｄ、Ｒ．Ｄ．Ｌｅｏｎｅ、Ｆ．Ｒ．Ｆｕｒｕｙａ、およびＲ．Ｄ．Ｐｏｗｅｌｌにより説明されている（特許文献１）。典型的には、この方法は、反応置換基（Ｘ）を生じるトリアリルホスフィンまたはメルカプトアルキル誘導体を含む有機溶媒中で金の塩を還元し、Ａｕ−ＰまたはＡｕ−Ｓ結合を介して表面に結び付けられたリンカー上にＸ置換基を運ぶ小さなナノ粒子（５０〜７０の金の原子）を与えることを含む。続いて、コロイド溶液を、タンパク質Ｘと反応する置換基Ｙを有するタンパク質と反応させ、このタンパク質をナノ粒子に共有結合でリンクする。そのようなナノ粒子に関する作用は、多くのタンパク質の水への溶解度の低さによって制限され、これにより有効に利用できるタンパク質−ナノ粒子共役体の範囲が制限される。さらに、これらの粒子の表面にはほんの少数の金の原子しか存在しないため、ある所定粒子の表面に結び付けることが可能な「捕獲」鎖の数は非常に低い。
金属および半導体コロイドをナノ材料へと集合させるために様々な方法が開発されている。これらの方法は、対向する両端に対象コロイドに対して化学的親和性を持つ官能価を有する共有結合リンカー分子を使用することに焦点を合わせている。これまでに最も成功した方法の１つ、非特許文献４は、金コロイドと、十分に確立されたチオール吸着化学（非特許文献５および６）の使用を伴っている。この方法では、粒子リンカー分子として線状アルカンジチオールを用いる。リンカー分子の各末端のチオール基は、コロイド粒子に共有結合して凝集体構造を形成する。この方法の難点は、プロセスが制御しにくく、集合体が不可逆的に形成されることである。これらの構造の材料特性を十分に利用しようとするならば、集合プロセスを系統的に制御する方法が必要である。
医用生体材料の調製およびナノファブリケーション法におけるＤＮＡ利用の可能性が認識されている。この研究では、研究者らは、十分に決定された幾何学的形状およびサイズを有する印象的な構造を設計するために、オリゴヌクレオチドの配列特異的分子認識特性を用いることに焦点を当てている。非特許文献７〜１７。しかし、ＤＮＡ構造生成理論を
実験的に確認するのはまだまだ先のことである。非特許文献１８。
ＤＮＡ検出の分野で研究を行っている者にとっての大変な挑戦（非特許文献１９）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に依存しない方法またはそれに匹敵する標的増幅システムの開発に関する。ＰＣＲに基づいた方法では、費用が増す他に、さらなる器具の使用、熱サイクリング、および治療現場または現場での使用にふさわしくない試薬が必要となる。ほとんどのＤＮＡ検出システムにおける別の制限的な要件は、それがＰＣＲを必要とするかどうかにかかわらず、所望の分析物選択性を成すための熱的にストリンジェントな洗浄である。１９９７年に、オリゴヌクレオチドで修飾したＡｕナノ粒子が比色分析用のＤＮＡ検出プローブとして紹介された（非特許文献２０）。フルオロフォアや放射活性標識など他のプローブとは対照的に、ナノ粒子を、その大きさに依存する散乱性、触媒特性、吸光特性、およびラマン増幅特性を利用する様々な検出様式で用いて、その対照物である分子フルオロフォアより感度と選択性がかなり高いシステムを開発し得る（非特許文献２１〜２５）。さらに、オリゴヌクレオチドで高度に官能化された金粒子は並外れて鋭い融解プロファイルを示す結果、より高い標的選択性をもたらす（非特許文献２１〜２３）。これらのシステムの並外れた感度と選択性にもかかわらず、これらすべてが、ミスマッチを有する鎖から標的鎖を区別するために熱的にストリンジェントな洗浄に依存している。
米国特許第５，５２１，２８９号（１９９６年５月２８日）、「小さな有機金属プローブ（Ｓｍａｌｌ Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ）」 Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，第９巻，１４５−１５６ページ（１９９５年） Ｓ．ＧａｒｚｏｎとＭ．Ｂｅｎｄａｙａｎ、「免疫金電子顕微鏡（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｇｏｌｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の「金コロイドプローブ：および ウイルス細胞化学におけるその応用の概観（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ Ｐｒｏｂｅ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｉｔｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｖｉｒａｌ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、Ａ． Ｄ．ＨｙａｔｔおよびＢ．Ｔ．Ｅａｔｏｎ編、ＣｒＣ出版、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ（１９９３） Ｊ．Ｅ．Ｂｅｅｓｌｅｙ、金コロイド：細胞化学マーキングのための新しい展望（Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ：Ａ Ｎｅｗ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｆｏｒ Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｍａｒｋｉｎｇ）」、オックスフォード大学出版、オックスフォード（１９８９） Ｂｒｕｓｔら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第７巻，７９５−７９７ページ（１９９５年） Ｂａｉｎ ＆ Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，第２８巻，５０６−５１２ページ（１９８９年） Ｄｕｂｏｉｓ ＆ Ｎｕｚｚｏ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第４３巻，４３７−４６４ページ（１９９２年） Ｓｈｅｋｈｔｍａｎら，Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，第１７巻，７５７−７６３ページ（１９９３年） Ｓｈａｗ ＆ Ｗａｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６０巻，５３３−５３６ページ（１９９３年） Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１１巻，６４０２−６４０７ページ（１９８９年） Ｃｈｅｎ ＆ Ｓｅｅｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，第３５０巻，６３１−６３３ページ（１９９１年） Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｆｅｉｇｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，第３５６巻，１６４−１６８ページ（１９９２年） Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第３２巻，１８９９−１９０４ページ（１９９３年） Ｃｈｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第３３巻，１３５４０−１３５４６ページ（１９９４年） Ｍａｒｓｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２３巻，６９６−７００ページ（１９９５年） Ｍｉｒｋｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，第２３巻，５４１−５７６ページ（１９９４年） Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２６３巻，１０９５−１０９８ページ（１９８８年） Ｗａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第３０巻，５６６７−５６７４ページ（１９９１年） Ｓｅｅｍａｎら，Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，第１７巻，７３９−７５５ページ（１９９３年） ジー．エイチ．ケラー（Ｇ．Ｈ．Ｋｅｌｌｅｒ）、エム．エム．マナック（Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ）、「ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ」（Ｓｔｏｃｋｔｏｎｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９８９年 アール．エルガニアン（Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ）、ジェイ．ジェイ．ストルホッフ（Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ）、アール．シー．ミューシック（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７、１０７８−１０８１、１９９７年 ジェイ．ジェイ．ストルホッフ（Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ）、アール．エルガニアン（Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ）、アール．シー．ミューシック（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０、１９５９−１９６４、１９９８年 アール．エー．レイノルズ（Ｒ．Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２、３７９５−３７９６、２０００年 ティー．エー．タトン（Ｔ．Ａ．Ｔａｔｏｎ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９、１７５７、２０００年 ティー．エー．タトン（Ｔ．Ａ．Ｔａｔｏｎ）、エル．ギャング（Ｌ．Ｇａｎｇ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２３、５１６４、２００１年 エル．ホーら（Ｌ．Ｈｅ ｅｔ ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２２、９０７１、２０００年
したがって、塩基のミスマッチを識別するために熱的にストリンジェントな洗浄に依存しないＤＮＡ検出方法が必要とされている。
本発明は米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）助成番号ＧＭ１０２６５、陸軍研究所（ＡＲＯ）助成番号ＤＡＡＧ５５−０９６７−１−０１３３、ＡＦＳＯＲ（ＤＵＲＩＮＴ）、およびＤＡＲＰＡ（ＢＡＡ ０１−０７）の下で政府支援によって完成されたものである。政府は本発明に関し一定の権利を有する。
本願は、係属中の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号（１９９７年７月２１日出願）の一部継続出願である、出願番号第０９／２４０，７５５号（１９９９年１月２９
日出願、放棄）の一部継続出願である、出願番号第０９／３４４，６６７号（１９９９年６月２５日出願、現米国特許第６，３６１，９４４号）の一部継続出願である、出願番号第０９／６０３，８３０号（２０００年６月２６日出願）の一部継続出願である、出願番号第０９／７６０，５００号（２００１年１月１２日出願）の一部係属出願である、第０９／８２０，２７９号（２００１年３月２８日出願）の一部継続出願である、第０９／９２７，７７７号（２００１年８月１０日出願）の一部継続出願である、係属中の出願番号第１０／００８，９７８号（２００１年１２月７日出願）の一部継続出願である。上記の各文献は引用により本願に組み込まれる。仮出願番号第６０／０３１，８０９号（１９９６年７月２９日出願）、第６０／１７６，４０９号（２０００年１月１３日出願）、第６０／１９２，６９９号（２０００年３月２８日出願）、第６０／２００，１６１号（２０００年４月２６日出願）、第６０／２１３，９０６号（２０００年６月２６日出願）、第６０／２２４，６３１号（２０００年８月１１日出願）、第６０／２５４，３９２号（２０００年１２月８日出願）、第６０／２５４，４１８号（２０００年１２月８日出願）、第６０／２５５，２３５号（２０００年１２月１１日出願）、第６０／２５５，２３６号（２０００年１２月１１日出願）、第６０／２８２，６４０号（２００１年４月９日出願）、および第６０／３２７，８６４号（２００１年１０月８日出願）の利益も主張する。上記の各文献の開示は引用により本願に組み込まれる。
本発明は、核酸を検出する方法を提供する。１実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子（ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体）を核酸と接触させるステップを含む。核酸は少なくとも２つの部分を有し、各ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、該核酸の少なくとも２つの部分の配列に相補的な配列を有している。接触は、核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸のハイブリダイズによって、検出可能な変化が生じる。
別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を核酸と接触させるステップを含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。接触は、核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こり、このハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。
さらなる実施形態では、方法は、第１種類のナノ粒子を付着させた基板を提供するステップを含む。第１種類のナノ粒子にはオリゴヌクレオチドが付着しており、該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。基板を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸を有効にハイブリダイズさせる条件下で核酸と接触させる。その後、オリゴヌクレオチドが付着した第２種類のナノ粒子を提供する。該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の１または複数の他の部分に相補的な配列を有する。基板に結び付けられた核酸を、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で、第２種類のナノ粒子オリゴヌクレオチドと接触させる。検出可能な変化はこの時点で観察可能となる。方法は、少なくとも２つの部分を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドを提供するステップをさらに含む。該２つの部分の、第１部分は、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的である。結合オリゴヌクレオチドを、結合オリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に結び付けられた第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と接触させる。その後、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた第３種類のナノ粒子を、結合オリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に結び付けられた結合オリゴヌクレオチドと接触させる。最後に、そのようなハ
イブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。
さらに別の実施形態では、方法は、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させるステップを含む。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、基板に結び付けられた核酸を、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた第１種類のナノ粒子と接触させる。接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。次に、基板に結び付けられた第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、オリゴヌクレオチドを付着させた第２種類のナノ粒子と接触させる。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的な配列を有する。接触は、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。最後に、そのようなハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。
別の実施形態では、方法は、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させるステップを含む。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、基板に結び付けられた核酸を、核酸の配列の一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたリポソームと接触させる。接触は、リポソーム上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。次に、基板に結び付けられたリポソーム−オリゴヌクレオチド共役体を、少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドを付着させた第１種類のナノ粒子と接触させる。第１種類のオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない端部には、疎水基が付いている。接触は、疎水的相互作用の結果としてナノ粒子上のオリゴヌクレオチドがリポソームに有効に付着する条件下で起こる。検出可能な変化はこの時点で観察可能となる。方法は、リポソームに結び付けられた第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、オリゴヌクレオチドを付着させた第２種類のナノ粒子と接触させるステップをさらに含み得る。第１種類のナノ粒子には、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的な配列を有する第２種類のオリゴヌクレオチドが付着する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する。接触は、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、検出可能な変化を観察する。
別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と、検出する核酸を接触させるステップを含む。オリゴヌクレオチドは、該核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを該核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。次に、基板に結び付けられた核酸を、該核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子と接触させる。接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、基板を銀染料と接触させて検出可能な変化を生成し、その検出可能な変化を観察する。
さらに別の実施形態では、方法は、第１種類のナノ粒子を付着させた基板を提供するステップを含む。ナノ粒子には、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。その後、核酸を、該核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、基板に付けられたナノ粒子と接触させる。次に、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少な
くとも２種類のナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。最後に、基板に結び付けられた核酸を、該核酸と凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、凝集体プローブと接触させ、検出可能な変化を観察する。
さらなる実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドは、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類ナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するそれにオリゴヌクレオチドが付着している。核酸、基板および凝集体プローブを、凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドおよび基板上のオリゴヌクレオチドと核酸とを有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
さらなる実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類ナノ粒子の少なくとも１種類には、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子を提供する。第１種類のオリゴヌクレオチドは前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、第２種類のオリゴヌクレオチドは、基板に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する。核酸、凝集体プローブ、ナノ粒子および基板を、凝集体プローブ上およびナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸を有効にハイブリダイズさせ、かつナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを基板上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
別の実施形態では、方法は、検出する核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と接触させるステップを含む。オリゴヌクレオチドは、前記核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。基板に結び付けられた核酸を、前記核酸の配列の一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたリポソームと接触させる。接触は、リポソーム上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、ナノ粒子に付着しない端部に疎水基が付いたオリゴヌクレオチドが付着する。基板に結び付けられたリポソームを、疎水的相互作用の結果として凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドがリポソームに付着するのに有効な条件下で、凝集体プローブと接触させ、検出可能な変化を観察する。
さらに別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップを含む。該オリゴヌクレオチドは、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。少なくとも２種類のナノ粒子を含むコアプローブを提供する。各種類のナノ粒子には、他の種類のナノ粒子の少なくとも１つの上のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドが付着している。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。次に、２種類のオリゴヌクレオチドを付着したある種類のナノ粒子を提供する。第１種類のオリゴヌクレオ
チドは、該核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。第２種類のオリゴヌクレオチドは、コアプローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列を有する。核酸、ナノ粒子、基板およびコアプローブを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとおよび基板上のオリゴヌクレオチドと該核酸を有効にハイブリダイズさせ、かつコアプローブ上のオリゴヌクレオチドをナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
方法の別の実施形態は、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板を提供するステップを含む。少なくとも２種類のナノ粒子を含むコアプローブを提供する。各種類のナノ粒子には、少なくとも１つの他の種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドが付着している。凝集体プローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。前記核酸の配列の第２部分に相補的な配列と、コアプローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類に付着したオリゴヌクレオチドの配列の一部分に相補的な配列とを含む、ある種類の連結オリゴヌクレオチドを提供する。核酸、連結オリゴヌクレオチド、基板およびコアプローブを、連結オリゴヌクレオチドおよび基板上のオリゴヌクレオチドを前記核酸と有効にハイブリダイズさせ、かつコアプローブ上のオリゴヌクレオチドを連結オリゴヌクレオチド上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
さらに別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を提供するステップと、１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドを提供するステップを含む。各結合オリゴヌクレオチドは２つの部分を有しており、１つの部分の配列は、核酸の複数の部分の１つの配列に相補的である。また、もう１つの部分の配列は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的である。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と結合オリゴヌクレオチドを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを結合オリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。核酸と結合オリゴヌクレオチドを、結合オリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。その後、検出可能な変化を観察する。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、核酸との接触に先立って、結合オリゴヌクレオチドと接触させてもよいし、または３つすべてを同時に接触させてもよい。
別の実施形態では、方法は、核酸をオリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類の粒子と接触させるステップを含む。第１種類の粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、該粒子に付けられない端部にエネルギー供与体分子を有する。第２種類の粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、該粒子に付けられない端部にエネルギー受容体分子を有する。接触は、粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。また、そのようなハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察する。エネルギー供与体および受容体分子は蛍光分子であってよい。
さらなる実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させたある種類のマイクロスフェアを提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた、検出可能な変化を生成するある種類のナノ粒子を提供する。核酸を、ラテックスマイクロスフェア上およびナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせる条件下でマイクロスフェアおよびナノ粒子と接触させ、その後、蛍光の変化、別の検出可能な変化またはその両方を観察する。
別の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた第１種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。オリゴヌクレオチドを付着させた第２種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子も提供する。該オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で同様に標識される。核酸を、核酸と該２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、２種類のナノ粒子と接触させ、その後、蛍光の変化を観察する。
さらなる実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドを付着させたある種類の粒子を提供するステップを含む。該オリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有し、両部分は、核酸の配列の一部分に相補的である。第１部分と第２部分を含むある種類のプローブオリゴヌクレオチドも提供する。該第１部分は、粒子に付着させたオリゴヌクレオチドの該第１部分に相補的な配列を有し、また、両部分は核酸の配列の一部分に相補的である。またプローブオリゴヌクレオチドは、その一端を、リポーター分子で標識される。その後、粒子およびプローブオリゴヌクレオチドを、粒子上のオリゴヌクレオチドをプローブオリゴヌクレオチドと有効にハイブリダイズさせてサテライトプローブを生成する条件下で接触させる。その後、サテライトプローブを、プローブオリゴヌクレオチドと核酸を有効にハイブリダイズさせる条件下で核酸と接触させる。粒子は除去し、リポーター分子を検出する。
本発明の方法のさらに別の実施形態では、核酸を、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と核酸を接触させることにより検出する。該オリゴヌクレオチドは核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。該オリゴヌクレオチドは、基板に置かれた一対の電極の間に配置される。接触は、基板上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。その後、基板に結び付けられた核酸をある種類のナノ粒子と接触させる。ナノ粒子は、電気を伝導可能な材料で形成されている。ナノ粒子には１または複数の種類のオリゴヌクレオチドが付着しており、該１または複数の種類オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こる。核酸が存在する場合、導電率の変化を検出することが可能である。好ましい実施形態では、基板上には、１つの核酸中の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはその両方の検出を可能にするようアレイ状に複数対の電極が配置されている。アレイ中の各電極対は、２つの電極間に、基板に付着されたある種類のオリゴヌクレオチドを有するだろう。
本発明は、方法が基板上で行われる、核酸の検出方法をさらに提供する。該方法は、光学式スキャナで核酸の存在、量またはその両方を検出するステップを含む。
本発明は、核酸を検出するためのキットをさらに提供する。１実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を入れた少なくとも１つの容器を含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する。
代わりに、キットは少なくとも２つの容器を含んでもよい。第１容器には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着されたナノ粒子が入る。第２容器には、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子が入る。
さらなる実施形態では、キットは少なくとも１つの容器を含む。該容器には、オリゴヌクレオチドを付着させた金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子が入っている。オリゴヌクレオチドは核酸の一部分に相補的な配列を有し、ナノ粒子に付着されないオリゴヌクレオチ
ドの端部には蛍光分子が付いている。
さらに別の実施形態では、キットは基板を含む。基板にはナノ粒子が付着し、該ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはさらに、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた、第１容器も含む。キットは、少なくとも２つの部分を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドを入れた第２容器もさらに含む。２つの部分のうちの第１部分は、第１容器中のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的である。キットはさらに、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第３容器も含む。
別の実施形態では、キットは、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板と、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子を入れた第１容器と、第１容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着したナノ粒子を入れた第２容器とを含む。
さらに別の実施形態では、キットは、基板と、ナノ粒子を入れた第１容器と、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する第１種類のオリゴヌクレオチドを入れた第２容器と、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する第２種類のオリゴヌクレオチドを入れた第３容器と、第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する第３の種類のオリゴヌクレオチドを入れた第４容器とを含む。
さらなる実施形態では、キットは、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させた基板を含む。キットはまた、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着させたリポソームを入れた第１容器と、少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第２容器とを有する。第１種類のオリゴヌクレオチドは、疎水的相互作用によりナノ粒子をリポソームに付着できるように、そのナノ粒子に付着されない端部に疎水基を有する。キットは、第１種類のナノ粒子に付着された第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着された第２種類のナノ粒子を入れた第３容器をさらに含み得る。第１種類のナノ粒子に付着された第２種類のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。
別の実施形態では、キットは、ナノ粒子を付着させた基板を含む。ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはまた、凝集体プローブを入れた第１容器も含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
さらに別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた基板を含む。オリゴヌクレオチドは核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する。キットはさらに、凝集体プローブを入れた第１容器を含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
さらなる実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた基板と、凝集体プローブを入れた第１容器とを含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも１種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはまた、ナノ粒子を入れた第２容器も含む。該ナノ粒子には、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着している。第１種類のオリゴヌクレオチドは核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。第２種類のオリゴヌクレオチドは基板に付着したオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する。
別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドが付着した基板を含む。オリゴヌクレオチドは核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する。キットはまた、オリゴヌクレオチドが付着したリポソームを入れた第１容器も含む。オリゴヌクレオチドは核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着した少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを入れた、第２容器も含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、ナノ粒子に付着しない端部に疎水基を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
さらなる実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第１容器を含み得る。キットはまた、１または複数の追加の容器も含み、各容器には結合オリゴヌクレオチドを入れる。各結合オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する第１部分と、検出する核酸の一部分の配列に相補的な配列を有する第２部分とを有する。各配列が検出する核酸の配列の一部分に相補的である限り、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列は異なっていてもよい。別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた１種類のナノ粒子と、１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドとを入れた容器を含む。該１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも２つの部分を含む配列を有している。第１部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であり、そのため、容器内で結合オリゴヌクレオチドはナノ粒子上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。第２部分は、核酸の一部分の配列に相補的である。
別の実施形態では、キットは、２種類の粒子を入れた１または２つの容器を含み得る。第１種類の粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを付着している。オリゴヌクレオチドは、その粒子に付着しない端部が、エネルギー供与体で標識される。第２種類の粒子には、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。オリゴヌクレオチドは、その粒子に付着しない端部が、エネルギー受容体で標識される。エネルギー供与体と受容体は蛍光分子であってよい。
さらなる実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第１容器を含む。キットはまた、各容器に結合オリゴヌクレオチドを入れた、１または複数の追加の容器も含む。各結合オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部分に相補的な配列を有する第１部分と、検出する核酸の部分の配列に相補的な配列を有する第２部分とを有する。各配列が検出する核酸の配列の部分に相補的である限り、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列は異なっていてもよい。さらに別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた１種類のナノ粒子と、１または複数の種類の結合オリゴヌクレオチドとを入れた容器を含む。該１または複数の
種類の結合オリゴヌクレオチドの各々は、少なくとも２つの部分を含む配列を有する。その第１部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であり、そのため、容器内で結合オリゴヌクレオチドはナノ粒子上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。第２部分は、核酸の一部分の配列に相補的である。
別の代替実施形態では、キットは少なくとも３つの容器を含む。第１容器にはナノ粒子が入っている。第２容器は、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する第１のオリゴヌクレオチドが入っている。第３容器には、核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する第２のオリゴヌクレオチドが入っている。キットはさらに、少なくとも２つの部分（第１部分は第２のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも１つの部分に相補的）を有する選択配列を有する結合オリゴヌクレオチドを入れた第４容器と、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドを入れた第５の容器も含む。
別の実施形態では、キットは２種類の粒子を入れた１または２つの容器を含む。第１種類の粒子には、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、かつナノ粒子に付着しない端部にエネルギー供与体分子が付いた、オリゴヌクレオチドが付着している。第２種類の粒子には、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、かつナノ粒子に付着しない端部にエネルギー受容体分子が付いた、オリゴヌクレオチドが付着している。エネルギー供与体と受容体は蛍光分子であってよい。
さらなる実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させたある種類のマイクロスフェアを入れた第１容器を含む。該オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。オリゴヌクレオチドを付着させたある種類のナノ粒子を入れた第２容器を含む。該オリゴヌクレオチドは、キットは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。
別の実施形態では、キットは、オリゴヌクレオチドを付着させた第１種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を入れた第１容器を含む。該オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。キットはまた、オリゴヌクレオチドを付着させた第２種類の金属ナノ粒子または半導体ナノ粒子を入れた第２容器を含む。該オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有し、蛍光分子で標識される。
別の実施形態では、キットは、凝集体プローブを入れた容器を含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、核酸の配列の一部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
さらなる実施形態では、キットは、凝集体プローブを入れた容器を含む。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む。凝集体プローブのナノ粒子は、その各々に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの前記少なくとも２種類のナノ粒子の少なくとも１種類には、ナノ粒子に付着しない端部に疎水基が付いた、オリゴヌクレオチドが付着している。
さらなる実施形態では、キットは、サテライトプローブを入れた容器を含む。サテライトプローブは、オリゴヌクレオチドが付着した粒子を含む。オリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有し、両部分は核酸の配列の部分に相補的な配列を有する。サテライトプ
ローブは、ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプローブオリゴヌクレオチドも含む。プローブオリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有する。該第１部分は、粒子に付着したオリゴヌクレオチドの第１部分の配列に相補的な配列を有する。また、両部分は、核酸の配列の部分に相補的な配列を有する。プローブオリゴヌクレオチドはさらに、その一端にリポーター分子を有する。
別の実施形態では、キットはコアプローブを入れた容器を含む。コアプローブは、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む。コアプローブのナノ粒子は、該ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。
さらに別の実施形態では、キットは、少なくとも１対の電極が付着された基板であって、該電極間で基板に対してオリゴヌクレオチドが付着された基板を含む。オリゴヌクレオチドは、検出する核酸の配列の第１部分に相補的な配列を有する。
本発明はさらに、サテライトプローブ、凝集体プローブおよびコアプローブを提供する。
本発明はさらに、ナノ粒子を付着させた基板を提供する。該ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着され得る。
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを付着させた金属または半導体ナノ粒子を提供する。オリゴヌクレオチドはナノ粒子に付着しない端部が蛍光分子で標識される。
本発明はさらに、ナノファブリケーションの方法を提供する。方法は、選択配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチドを提供するステップであって、各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも２つの部分を有するステップを含む。方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた１または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが連結オリゴヌクレオチドの配列の部分に相補的な配列を有するステップをさらに含む。連結オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、所望のナノ材料かナノ構造が形成されるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを連結オリゴヌクレオチドに有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。
本発明は、ナノファブリケーションの別の方法を提供する。方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を提供するステップを含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。第１および第２種類のナノ粒子を、所望のナノ材料かナノ構造が形成されるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを互いに有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させる。
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子から構成されたナノ材料またはナノ構造であって、該ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタによって一緒に纏められたナノ材料またはナノ構造を提供する。
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子を含む組成物を提供する。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分か連結オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分か連結オリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第１容器とオリゴ
ヌクレオチドを付着させたナノ粒子を入れた第２容器を含む容器のアセンブリを提供する。第１容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第２容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。第２容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、第１容器中のナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。
本発明はさらに、複数の異なるオリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を提供する。
本発明は、少なくとも２つの部分を有する選択核酸を他の核酸から分離する方法をさらに提供する。方法は、オリゴヌクレオチドを付着させた１または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、該１または複数のナノ粒子の各々の上のオリゴヌクレオチドは選択核酸の前記少なくとも２つの部分のうちの１つの配列に相補的な配列を有するステップを含む。選択核酸および他の核酸を、選択核酸とハイブリダイズしたナノ粒子が凝集して沈降するように、選択核酸とナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを有効にハイブリダイズさせる条件下で、ナノ粒子と接触させる。
さらに、本発明は、ユニークなナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を作製する方法を提供する。第１のそのような方法は、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するために荷電ナノ粒子へオリゴヌクレオチドを結合させるステップを含む。そうするために、ナノ粒子に結合可能な官能基を有する部分が共有結合で結び付いているオリゴヌクレオチドを、少なくともオリゴヌクレオチドの一部が該官能基によってナノ粒子に結び付けられるのに十分な時間、ナノ粒子と水中で接触させる。次に、少なくとも１つの塩を水に加えて、塩溶液を作製する。塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチドの互いに対する静電斥力と、正に帯電したナノ粒子に対する負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電引力か、負に帯電したナノ粒子に対する正に帯電したオリゴヌクレオチドの静電引力かの一方とを少なくとも部分的に克服するのに十分な強度でなければならない、塩を加えた後、オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、追加オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合して安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに十分な追加期間、塩溶液中でインキュベートされる。本発明はさらに、安定したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、核酸を検出かつ分離するための該共役体の使用方法、該共役体を含むキット、該共役体を使用したナノファブリケーションの方法、ならびに、該共役体を含むナノ材料およびナノ構造を包含する。
本発明は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するためにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させる別の方法を提供する。方法は、ある種類の認識オリゴヌクレオチドとある種類の希釈剤オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供するステップを含む。オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、該ある種類のオリゴヌクレオチドの各々の少なくとも一部がナノ粒子と結合して共役体を生成するのに有効な条件下で接触させる。本発明はさらに、該方法によって生成されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、核酸を検出かつ分離するために該共役体を使用する方法、該共役体を含むキット、該共役体を使用したナノファブリケーションの方法、ならびに、該共役体を含むナノ材料およびナノ構造を包含する。「認識オリゴヌクレオチド」とは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも一部分に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。「希釈剤オリゴヌクレオチド」は、認識オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結び付けられる能力または、認識オリゴヌクレオチドがその標的に結び付く能力に干渉しない任意の配列を有し得る。
本発明は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するためにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるさらに別の方法を提供する。方法は、少なくとも１種類の認識オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを提供するステップを含む。認識オリゴヌクレオチドは認識部分とスペーサー部分を含む。認識オリゴヌクレオチドの認識部分は、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも１部分に相補的な配列を有する。認
識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、スペーサー部分がナノ粒子に結合可能であるように設計される。ナノ粒子に認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分が結合した結果、認識部分はナノ粒子の表面から離れ、その標的とのハイブリダイズのためによりアクセス可能とある。共役体を生成するために、少なくとも認識オリゴヌクレオチドの一部がナノ粒子に結合するのに有効な条件下で、認識オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドとナノ粒子を接触させる。本発明はさらに、この方法によって生成されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、核酸を検出かつ分離するために該共役体を使用する方法、該共役体を含むキット、該共役体を使用したナノファブリケーションの方法、ならびに、該共役体を含むナノ材料およびナノ構造を包含する。
本発明は、環式ジスルフィドを含むリンカーによって、ナノ粒子にオリゴヌクレオチドを付着させる方法を含む。適切な環式ジスルフィドは、その環内に２つの硫黄原子を含めた５つまたは６つの原子を有する。適切な環式ジスルフィドは市販されている。環式のジスルフィドの還元形も使用することが可能である。好ましくは、リンカーは、環式ジスルフィドに付着された炭化水素部分をさらに含む。適切な炭化水素は市販されており、（例えば付表に記述されるように）環式ジスルフィドに取り付けられる。好ましくは、炭化水素部分はステロイド残基である。リンカーがオリゴヌクレオチドに付けられ、オリゴヌクレオチドリンカーが本明細書に記載したようにナノ粒子に付着される。
本発明は、さらに、抗体抗原結合のような特異的結合相互作用を利用する新規なナノ粒子プローブ、そのようなプローブの調製方法および使用方法、ならびにそのようなプローブを含むキットに関する。
１実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子を検体と接触させることを含む、検体を検出する方法を提供する。ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、前記検体の特異的結合補体に結び付けられた第２のオリゴヌクレオチドに結合する。接触は、検体と、ナノ粒子共役体に結び付けられた特異的結合補体とを有効に特異的結合相互作用させる条件下で起こる。検体とプローブ間の特異的結合相互作用の結果、検出可能な変化が観察され得る。
本発明の別の実施形態では、検体を検出する方法は、オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子の検体との接触を提供することを含む。ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、リンカーオリゴヌクレオチドの第１部分に結合する。リンカーオリゴヌクレオチドの第２部分は、ハイブリダイゼーションの結果、前記検体の特異的結合補体に結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。接触は、検体とナノ粒子共役体とを有効に特異的結合相互作用させる条件下で起こり、検出可能な変化が観察され得る。
別の実施形態では、検体を検出する方法は、第１のオリゴヌクレオチドを結び付けた検体を提供し、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドを、第１種類のナノ粒子と接触させることを含む。接触は、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドが第１種類のナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、ナノ粒子検体共役体を形成するのに有効な条件下で起こる。上記方法はさらに、ナノ粒子検体を、オリゴヌクレオチドが結び付けられた第２種類のナノ粒子と接触させることを含む。第２種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、前記検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。検体に結合したオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有する。接触は、検体と、第２種類のナノ粒子共役体に結合された特異的結合補体とを有効に特異的結合相互作用させる条件下で起こり、検出可能な変化が、特異的結合相互作用の結果として観察され得る。
さらに別の実施形態では、検体を検出する方法は、オリゴヌクレオチドを結び付けた検体、２つの部分を有するオリゴヌクレオチドリンカー、およびオリゴヌクレオチドが取り付けられた第１種類のナノ粒子を提供することを含む。検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドはリンカーオリゴヌクレオチドの配列の第１部分に相補的な配列を有する。第１種類のナノ粒子に結合するオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、リンカーオリゴヌクレオチドの第２部分に相補的な配列を有する。検体に結び付けられたオリゴヌクレオチド、ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチド、およびリンカーオリゴヌクレオチドは、リンカーヌクレオチドと、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドおよび第１種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドとが有効にハイブリダイズしてナノ粒子検体共役体を生成する条件下で接触させる。上記方法はさらに、検体共役体を、オリゴヌクレオチドを結び付けた第２種類のナノ粒子共役体と接触させることを含む。第２種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。接触は、ナノ粒子検体共役体と、第２種類のナノ粒子の特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で起こる。特異的結合相互作用の結果として、検出可能な変化が観察され得る。
別の実施形態では、検体を検出する方法は、検体を結び付けた支持体を提供することを含む。上記方法はさらに、支持体に結び付けられた検体をナノ粒子と接触させることを含む。オリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられた第２のオリゴヌクレオチドに結合する。接触は、検体と、ナノ粒子共役体に結び付けられた特異的結合補体との特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で起こる。この時点で検出可能な変化が観察され得る。
別の実施形態では、検体を検出する方法は、オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体と、オリゴヌクレオチドを結び付けた検体とを提供することを含む。検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、支持体に結び付けられたリンカーオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する。方法はさらに、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとを、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと検体に結び付けられたオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させることを含む。その後、オリゴヌクレオチドを結び付けたある種類のナノ粒子が与えられる。ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられた第２のオリゴヌクレオチドに結合する。最後に、支持体に結び付けられた検体と、ナノ粒子共役体に結び付けられた特異的結合補体とを、支持体に結び付けられた検体とナノ粒子に結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
さらに別の実施形態では、検体を検出する方法は、オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体と、配列が少なくとも２つの部分を有するリンカーオリゴヌクレオチドとを提供することを含む。支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、リンカーオリゴヌクレオチドの第１部分に相補的な配列を有する。その後、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドを、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとリンカーオリゴヌクレオチドの第１部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下でリンカーオリゴヌクレオチドと接触させる。次に、オリゴヌクレオチドを結び付けた検体を提供する。検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、リンカーオリゴヌクレオチドの第２部分に相補的な配列を有する。その後、支持体に結び付けられたリンカーオリゴヌクレオチドを、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとリンカーオリゴヌクレオチドの第２部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに
有効な条件下で接触させる。その後、オリゴヌクレオチドを結び付けたある種類のナノ粒子共役体を提供する。ナノ粒子共役体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。その後、支持体に結び付けた検体を、支持体に結び付けた検体と、ナノ粒子に結び付けた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で接触させ、検出可能な変化を観察する。
さらに別の実施形態では、検体を検出する方法は、オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体を、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの配列は、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの配列と相補的である。接触は、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。その後、オリゴヌクレオチドを取り付けたある種類のナノ粒子を提供する。ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分が、ハイブリダイゼーションの結果、リンカーオリゴヌクレオチドの第１部分に結合する。さらにはリンカーオリゴヌクレオチドの第２部分が、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドに結合する。次に、支持体に結び付けられた検体を、支持体に結び付けられた検体とナノ粒子に結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下でナノ粒子で接触させる。その後、検出可能な変化を観察する。
別の実施形態では、検体を検出する方法は、検体を結び付けた支持体を提供することを含む。支持体を、オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブと接触させる。凝集体プローブのナノ粒子は、それらに付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの少なくとも２種類のナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、ハイブリダイゼーションの結果として検体の特異的結合補体が結び付けられる第２のオリゴヌクレオチドに結合するいくつかのオリゴヌクレオチドが取り付けられる。接触は、支持体に結び付けられた検体と、凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で起こる。この時点で検出可能な変化が観察され得る。
別の実施形態では、検体を検出する方法は、オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体を、オリゴヌクレオチドを結び付けた検体と接触させることを含む。検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。接触は、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。次に、オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、それらに付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの少なくとも２種類のナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、ハイブリダイゼーションの結果として検体の特異的結合補体が結び付けられた第２のオリゴヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドが取り付けられる。接触は、支持体に結び付けられた検体と凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で起こる。その後、検出可能な変化を観察する。
さらに別の実施形態では、検体を検出する方法は、オリゴヌクレオチドを結び付けた支持体を、第２のリンカーオリゴヌクレオチドの配列が少なくとも２つの部分を有するリンカーオリゴヌクレオチドと接触させることを提供することを含む。接触は、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとリンカーオリゴヌクレオチドの第１部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。その後、オリゴヌクレオチドを
結び付けた検体を提供する。検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、リンカーオリゴヌクレオチドの第２部分と相補的な配列を有する。次に、支持体に結び付けられたリンカーオリゴヌクレオチドを、支持体に結び付けられたリンカーオリゴヌクレオチドの第２部分と検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させる。次に、オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの少なくとも２種類のナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、ハイブリダイゼーションの結果として検体の特異的結合補体が結び付けられた第２のオリゴヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドが取り付けられる。次に支持体に結び付けられた検体を、支持体に結び付けられた検体と、凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で凝集体プローブと接触させる。この時点で検出可能な変化を観察し得る。
さらに別の実施形態では、検体を検出する方法は、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドを、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの配列に相補的な検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。接触は、検体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。次に、オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの少なくとも２種類のナノ粒子のうちの少なくとも１種類では、オリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイゼーションの結果としてリンカーオリゴヌクレオチドの第１部分に結び付けられる。第２リンカーオリゴヌクレオチドの第２部分が、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。その後、支持体に結び付けられた検体を、支持体に結び付けられた検体と、凝集体プローブに結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で凝集体プローブと接触させる。その後、検出可能な変化を観察する。
さらに別の実施形態では、検体を検出する方法は、検体を結び付けた支持体を、オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子共役体と接触させることを含む。ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体が結び付けられた第２のオリゴヌクレオチドに結合する。接触は、支持体に結び付けられた検体とナノ粒子共役体に結び付けられた特異的結合補体の間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で起こる。その後、基板を銀染料と接触させて検出可能を生成し、その検出可能な変化を観察する。
本発明のさらに別の実施形態では、検体を検出する方法は、多価検体を、オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子プローブと接触させることを含む。ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、ハイブリダイゼーションの結果、レポーターオリゴヌクレオチドの第１部分に結び付けられる。レポーターオリゴヌクレオチドの第２部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体に対する特異的結合補体が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。接触は、検体とナノ粒子プローブの間の特異的結合相互作用を許容し、ナノ粒子を凝集させるのに有効な条件下で起こる。その後、凝集物を分離し、凝集物をデハイブリダイズし、かつレポーターオリゴヌクレオチドを放出するのに有効な条件に供する。その後、レポーターオリゴヌクレオチドを分離する。検体の検出は、ＤＮＡチップのような従来の手段によりレポーターオリゴヌクレオチドの存在を確認することで起こる。
本発明は、（ｉ）核酸、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドを結び付けた１または複数の種類のナノ粒子、および（ｉｉｉ）各々にオリゴヌクレオチドが結び付けられた２つ以上のビオチン分子に対して、特異的結合相互作用により結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジンを含む複合体、を提供することを含む、核酸を検出する方法を提供する。核酸の配列は、少なくとも２つの部分を有する。ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分に相補的な配列を有する一方、ビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分に相補的な配列を有する。その後、核酸を、ナノ粒子、複合体および核酸のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下でナノ粒子共役体および複合体と接触させる。続く凝集より生じる検出可能な変化を観察する。
別の実施形態では、（ｉ）核酸、（ｉｉ）オリゴヌクレオチドを結び付けた１または複数の種類のナノ粒子、（ｉｉｉ）ビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチド、および（ｉｖ）ストレプトアビジンまたはアビジン、を提供することを含む、核酸を検出する方法を提供する。核酸の配列は少なくとも２つの部分を有する。ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分に相補的な配列を有する一方、ビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分に相補的な配列を有する。その後、核酸を、核酸とナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドおよびビオチンに取り付けられたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下でナノ粒子共役体およびビオチンに結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させる。続く凝集より生じる検出可能な変化を観察する。
別の実施形態では、核酸を検出する方法は、オリゴヌクレオチドを取り付けた第１種類のナノ粒子を核酸と接触させることを含む。核酸の配列は少なくとも２つの部分を有する。ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、核酸の第１部分に相補的な配列を有する。接触は、ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第１部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。その後、ｓｂｐメンバー（例えばビオチン）を結び付けたオリゴヌクレオチドを提供する。ｓｂｐメンバーに結び付けられるオリゴヌクレオチドの配列は、核酸の配列の第２部分に相補的な配列を有する。その後、ｓｂｐメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドを、ｓｂｐメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第２部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、第１種類のナノ粒子に結び付けられた核酸に接触させる。その後、オリゴヌクレオチドを結び付けた第２種類のナノ粒子共役体を提供する。第２種類のナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、検体の特異的結合補体（例えばストレプトアビジンまたはアビジン）が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。接触は、第１種類のナノ粒子に結び付けられたｓｂｐメンバー（例えばビオチン）と、第２種類のナノ粒子に結び付けられたｓｂｐ補体（例えばストレプトアビジンまたはアビジン）との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で起こる。検出可能な変化が生じ得る。
別の実施形態では、核酸を検出する方法は、オリゴヌクレオチドが結び付けられた支持体を、配列が少なくとも２つの部分を有する核酸と接触させることを含む。支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分に相補的な配列を有する。接触は、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第１部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。次に、ｓｂｐメンバー（例えばビオチン）が結び付けられたオリゴヌクレオチドを提供する。ｓｂｐメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分に相補的な配列を有する。次に、支持体に結び付けられた核酸を、ｓｂｐメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第２部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、ｓｂｐメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドと接触させる。その後、オリゴヌクレオチドを結び付けたある種類のナノ粒子共役体を提供する。ナノ粒子共役体に結び付けられたオリゴヌクレオチドの
少なくとも一部分は、ハイブリダイゼーションの結果、ｓｂｐメンバーの特異的結合補体（例えばストレプトアビジンまたはアビジン）が結び付けられたオリゴヌクレオチドに結合する。その後、支持体に結び付けられたｓｂｐメンバーを、支持体に結び付けられたｓｂｐメンバーとナノ粒子に結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子と接触させ、検出可能な変化を観察する。
別の実施形態では、核酸を検出する方法は、核酸を、オリゴヌクレオチドを取り付けたナノ粒子共役体と接触させることを含む。核酸の配列は少なくとも２つの部分を有する。ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、核酸の第１部分に相補的な配列を有する。接触は、ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドの核酸の第１部分とのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。その後、ｓｂｐメンバー（例えばストレプトアビジン）を有するオリゴヌクレオチドを提供する。ｓｂｐメンバーが結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分に相補的な配列を有する。その後、ｓｂｐメンバーを有するオリゴヌクレオチドを、ｓｂｐメンバーを有するオリゴヌクレオチドと核酸との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子に結び付けられた核酸と接触させる。次に、ｓｂｐメンバーに対する特異的結合補体（例えばビオチン）を結び付けた支持体を提供する。その後、支持体を、ｓｂｐメンバーとｓｂ補体の間に特異的結合相互作用が生じることを許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子を結び付けたｓｂｐメンバーと接触させる。検出可能な出来事を観察し得る。
別の実施形態では、核酸を検出する方法は、オリゴヌクレオチドが結び付けられた支持体と核酸を接触させることを提供することを含む。核酸の配列は少なくとも２つの部分を有し、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分と相補的な配列を有する。接触は、支持体に結び付けられたオリゴヌクレオチドと核酸の第１部分との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。その後、ｓｂｐメンバー（例えばビオチン）に結び付けられたオリゴヌクレオチドを提供する。ｓｂｐメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分と相補的な配列を有する。その後、支持体に結び付けられた核酸を、支持体に結び付けられた核酸の第２部分と、ｓｂｐメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、オリゴヌクレオチドと接触させる。次にオリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブを提供する。凝集体プローブのナノ粒子は、それらに取り付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの少なくとも２種類のナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、ハイブリダイゼーションの結果としてｓｂｐメンバーの補体（例えばストレプトアビジン）が結び付けられる第２のオリゴヌクレオチドに結合するオリゴヌクレオチドが取り付けられる。その後、支持体に結び付けられたｓｂｐメンバーを、支持体に結び付けられたｓｂｐメンバーと凝集体に結び付けられた特異的結合補体との間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で凝集体プローブと接触させる。この時点で検出可能な変化を観察し得る。
別の実施形態では、核酸を検出する方法は、核酸を、オリゴヌクレオチドを結び付けた少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブと接触させることを含む。核酸は２つの部分を有する。凝集体プローブのナノ粒子は、それらに付けられたオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果、互いに結び付けられる。凝集体プローブの少なくとも２種類のナノ粒子のうちの少なくとも１種類には、ハイブリダイゼーションの結果核酸の第１部分に結合されるいくつかのオリゴヌクレオチドが取り付けられる。その後、ｓｂｐメンバー（例えばストレプトアビジン）を有するオリゴヌクレオチドを提供する。ｓｂｐメンバーが結び付けられたオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分に相補的な配列を有する。その後、ｓｂｐメンバーを有するオリゴヌクレオチドを、ｓｂｐメンバーを有するオ
リゴヌクレオチドとプローブに取り付けられた核酸との間のハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブに結び付けられた核酸と接触させる。次に、ｓｂｐメンバーに対する特異的結合補体（例えばビオチン）を結び付けた支持体を提供する。その後、支持体を、凝集体プローブに結び付けられたｓｂｐメンバーと支持体に結び付けられたｓｂ補体との間に特異的結合相互作用が生じるのを許容するのに有効な条件下で、凝集体プローブに結び付けられたｓｂｐメンバーと接触させる。検出可能な出来事を観察し得る。
本発明はさらに、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ｓｂｐメンバー共役体（ナノ粒子ｓｂｐ共役体）および同共役体を含む組成物をさらに提供する。ナノ粒子ｓｂｐ共役体には、オリゴヌクレオチドが結び付けられ、同オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、共有結合によって特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーが結合された第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。ナノ粒子に付けられたオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有する。
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドが結び付けられたナノ粒子共役体と、ｓｂｐメンバーが結び付けられたオリゴヌクレオチドとを提供することと、ナノ粒子に取り付けたオリゴヌクレオチドを、ｓｂｐメンバーに結び付けたオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、ナノプローブｓｂｐ共役体の製造方法も提供する。ナノ粒子に結び付けられたオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、ｓｂｐメンバーに結び付けられたオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する。接触は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの第１のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で起こる。
本発明はさらに、検体を検出するためのキットを提供する。１実施形態では、キットは少なくとも１つの容器を備える。容器はオリゴヌクレオチドが結び付けられたナノ粒子を含むナノ粒子ｓｂｐ共役体を入れる。オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、共有結合により特異的結合対（ｓｂｐ）メンバーが結合された第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。ナノ粒子に取り付けられたオリゴヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的な配列を有する。キットは、検出可能な変化を観察するための基質をさらに備えてもよい。
本発明の別の実施形態では、キットは少なくとも２つの容器を備える。第１の容器は、オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子を含む。オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、第１のオリゴヌクレオチドの一部分に相補的な配列を有する。第２の容器は、ｓｂｐメンバーが共有結合された第１のオリゴヌクレオチドを含む。キットは、検出可能な変化を観察するための基質をさらに備えてもよい。
本発明のさらに別の実施形態では、キットは少なくとも２つの容器を備える。第１の容器は、オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子を含む。オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、第１のオリゴヌクレオチドの一部分に相補的な配列を有する。第２の容器は、ｓｂｐメンバーを共有結合するのに使用できる部分を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む。キットは、検出可能な変化を観察するための基質をさらに備えてもよい。
本発明のさらに別の実施形態では、キットは少なくとも３つの容器を備える。第１の容器は、オリゴヌクレオチドを結び付けたナノ粒子を含む。第２の容器は、少なくとも２つの部分を有するリンカーオリゴヌクレオチドを含む。第３の容器は、ｓｂｐメンバーを共有結合するのに使用できる部分を有する第１のオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分は、リンカーオリゴヌクレオチドの第１部分に相補的な配列を有する。第１のオリゴヌクレオチドは、リンカーオリゴヌクレオチドの少なくとも第２の
部分に相補的な配列を有する。キットは、検出可能な変化を観察するための基質をさらに備えてもよい。
本発明は、さらにナノファブリケーションの方法を提供する。この方法は、各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも２つの部分を有する、選択配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチドを提供することを含む。上記方法はさらに、各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが連結オリゴヌクレオチドの配列の第１部分に相補的な配列を有する、オリゴヌクレオチドが取り付けられた１または複数の種類のナノ粒子を提供することを含む。上記方法はさらに、各分子に第１のオリゴヌクレオチドが結び付けられ、該第１のオリゴヌクレオチドは連結オリゴヌクレオチドの配列の第２部分に相補的な配列を有する２つ以上のビオチン分子に結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジン境界より構成された複合体を提供することを含む。連結オリゴヌクレオチド、複合体およびナノ粒子を、所望のナノ材料またはナノ構造を形成するよう、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドおよびビオチンに結び付けられた第１のオリゴヌクレオチドの連結オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させる。
本発明は、別のナノファブリケーション方法を提供する。この方法は、（ａ）オリゴヌクレオチドを取り付けた少なくとも２種類のナノ粒子と、（ｂ）各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも２つの部分を有する、選択配列を有する少なくとも２種類の連結オリゴヌクレオチドと、（ｃ）各分子に第１のオリゴヌクレオチドが結び付けられた２以上のビオチン分子に結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジンより構成された複合体とを提供することを含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列と連結オリゴヌクレオチドの配列の第１部分に相補的な配列とを有する。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体上のオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列と連結オリゴヌクレオチドの配列の第２部分に相補的な配列とを有する。第１および第２種類のナノ粒子、連結オリゴヌクレオチド、および複合体を、所望のナノ材料またはナノ構造を形成するよう、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの互いに対するおよび連結オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションならびに連結オリゴヌクレオチドに対する複合体のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させる。
本発明はまた、さらに別のナノファブリケーション方法を提供する。この方法は、（ａ）各種類の連結オリゴヌクレオチドの配列が少なくとも２つの部分を有する、選択配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチド、（ｂ）各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが連結オリゴヌクレオチドの配列の第１部分に相補的な配列を有する、オリゴヌクレオチドが取り付けられた１または複数の種類のナノ粒子、（ｃ）連結オリゴヌクレオチドの配列の第２部分に相補的な配列を有する第１のオリゴヌクレオチドが結び付けられたビオチン、および（ｄ）ストレプトアビジンまたはアビジンを提供することを含む。連結オリゴヌクレオチド、ビオチン、共役体、ナノ粒子を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとビオチンに結び付けられた第１オリゴヌクレオチドの連結オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で接触させる。その後、生じた複合体を、所望のナノ材料またはナノ構造を形成するよう、ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンの間の特異的結合相互作用を許容するのに有効な条件下で、ストレプトアビジンまたはアビジンと接触させる。
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドコネクタとｓｂｐ相互作用によってナノ粒子がひとまとめにされた、オリゴヌクレオチドを取り付けたナノ粒子から構成されたナノ材料またはナノ構造を提供する。
本発明はさらに、少なくとも２つの部分を有する選択標的核酸を、他の核酸から分離する方法を提供する。この方法は、（ａ）各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが選択核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する、オリゴヌクレオチドを取り付けた１または複数の種類のナノ粒子、および（ｂ）各分子に第１のオリゴヌクレオチドが結び付けられ、第１のオリゴヌクレオチドが選択核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する、２つ以上のビオチン分子に結び付けられたストレプトアビジンまたはアビジンより構成された複合体、を提供することを含む。選択核酸および他の核酸を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドおよび複合体の第１のオリゴヌクレオチドの選択核酸とのハイブリダイゼーションして、選択核酸にハイブリダイズした選択核酸と複合体が凝集して沈降するのに有効な条件下でナノ粒子と接触させる。
本発明はさらに、少なくとも２つの部分を有する選択標的酸を、他の核酸から分離する方法を提供する。この方法は、（ａ）各種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが選択核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有する、オリゴヌクレオチドを取り付けた１または複数の種類のナノ粒子、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチドが選択核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有する、第１のオリゴヌクレオチドを結び付けたビオチン、および（ｃ）ストレプトアビジンまたはアビジンを提供することを含む。選択された核酸および他の核酸を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドおよびビオチン構築物の第１のオリゴヌクレオチドの選択核酸とのハイブリダイゼーションを許容するのに有効な条件下で、ナノ粒子およびビオチン構築物と接触させる。得られた複合体を、ビオチンとストレプトアビジンまたはアビジンとの間の特異的結合相互作用および得られた選択核酸複合体の後の凝集および沈降を許容するのに有効な条件下で、ストレプトアビジンまたはアビジンと接触させる。
本発明は、生体分子に結び付けられたナノ粒子プローブを、捕獲された標的分子を有する電極表面から／へ能動的に移動および濃縮する方法または捕獲された標的に溶液中で結び付けられているナノ粒子プローブのセットを、対象表面へ能動的に移動および濃縮する方法も提供する。
本発明の別の目的は、電極表面へのナノ粒子の移動を加速する方法であって、特異的結合対の荷電第１メンバーに結び付けられたナノ粒子と、特異的結合対の第２のメンバーを有する電極表面とを提供するステップと、ナノ粒子と電極表面を、特異的結合対の第１メンバーと第２メンバー間の結合を可能にするのに有効な条件下で接触させるステップと、電極表面へのナノ粒子の移動を加速し、結合対の第１メンバーと第２メンバー間の結合を促進するよう、ナノ粒子を電界にかけるステップと、から成る方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、電極表面に結び付けられた、少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、オリゴヌクレオチドを付着させた１または複数の種類のナノ粒子を提供するステップであって、１または複数の種類のナノ粒子の各々の上のオリゴヌクレオチドが核酸の少なくとも２つの部分のうちの１つの配列に相補的な配列を有するステップと、核酸とナノ粒子を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で接触させるステップと、ナノ粒子の電極表面への移動を加速するためにナノ粒子を電界にかけるステップと、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、表面に結び付けられた少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、核酸をオリゴヌクレオチドを付着させた少なくとも２種類のナノ粒子と接触させるステップであって、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは核酸の第１部分の配列に相補的な配列を有し、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチド
は核酸の第２部分の配列に相補的な配列を有し、接触が、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸と有効にハイブリダイズさせる条件下で起こるステップと、ナノ粒子の表面への移動を加速させるためにナノ粒子を電界にかけるステップと、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリダイゼーションによって生じた検出可能な変化を観察するステップと、から成る方法を提供することである。接触条件は凍結と解凍、ならびに加熱を含んでいてもよい。検出可能な変化は固体表面上で観察されてよく、肉眼で観察可能な色の変化を含み得る。
本発明はさらに、多色標識の方法について提供し、オリゴヌクレオチドで官能化した異なる大きさのナノ粒子プローブを使用するＤＮＡアレイの画像化について記載している。異なる大きさ（たとえば直径５０ｎｍおよび１００ｎｍ）の金ナノ粒子は（その表面プラズモン共鳴が異なるために）異なる色の光を散乱するので、同一のアレイにハイブリダイズした異なるＤＮＡ標的を標識するためにこれらを使用することが可能である。アレイの表面に結合している粒子のみを検出し、アレイ上方の溶液中に浮遊している粒子は検出しないエバネセント導波技法を使用して、温度の上昇とともに標的がアレイ要素から融解して離れる際に、ナノ粒子で標識したアレイから配列情報および融解プロファイルを実時間で得ることが可能である。ナノ粒子で標識したアレイの配列選択性が、フルオロフォアで標識したアレイの配列選択性より有意に高いことが観察された。ナノ粒子で標識したアレイのほうが選択性が高いのは、アレイ表面からナノ粒子プローブが解離する温度の範囲が本質的に狭いことに起因している。
この多色標識の発明の１態様では、試料中の、少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法が提供される。この方法は、（ａ）検出する核酸配列の第１の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着した基板を提供する工程と、（ｂ）前記核酸配列の第２の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した、散乱光で検出可能なナノ粒子プローブを提供する工程であって、（ｉ）オリゴヌクレオチドの一部がナノ粒子に結合するのに十分な時間、オリゴヌクレオチドを第１水溶液中でナノ粒子と接触させること、（ｉｉ）少なくとも１種の塩を該水溶液に加えて第２水溶液を作製すること、および（ｉｉｉ）追加のオリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合するのに十分な追加の時間、該オリゴヌクレオチドとナノ粒子を第２水溶液中で接触させることからなる段階的成熟プロセスで該オリゴヌクレオチドを該ナノ粒子に付着させることを特徴とする工程と、（ｃ）前記核酸、基板および凝集プローブを、前記核酸とナノ粒子プローブ上のオリゴヌクレオチド、ならびに前記核酸と基板上のオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズするのに有効な条件下で接触させて、基板に結合した光散乱複合体を形成させる工程と、（ｄ）前記複合体から散乱光を生じさせるのに有効な条件下で光散乱複合体に光を照射する工程と、（ｅ）前記条件下で、前記複合体によって散乱された光を核酸の存在の尺度として検出する工程とからなる。基板は、（ａ）流動性試料の屈折率より大きい屈折率を有する光透過性の要素、（ｂ）受光縁部、および（ｃ）オリゴヌクレオチドが結合した表面からなる導波路である。
本発明の多色標識の別の態様では、試料中の、それぞれ少なくとも２つの部分を有する２種以上の核酸を検出する方法が提供される。この方法は、（ａ）２つ以上のオリゴヌクレオチド種が付着した基板を提供する工程であって、それぞれのオリゴヌクレオチド種が基板上の異なる場所に付着し、それぞれのオリゴヌクレオチド種が、検出しようとする核酸のうちの１つの配列の第１の部分に相補的な配列を有することを特徴とする工程と、（ｂ）検出しようとする前記核酸のうち１つの配列の第２の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドがそれぞれ結合した、散乱光で検出可能な２種以上のナノ粒子プローブを提供する工程であって、（ｉ）オリゴヌクレオチドの一部がナノ粒子に結合するのに十分な時間、オリゴヌクレオチドを第１水溶液中でナノ粒子と接触させること、（ｉｉ）少なくとも１種の塩を水溶液に加えて第２水溶液を作製すること、および（ｉｉｉ）追加の
オリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合するのに十分な追加の時間、該オリゴヌクレオチドとナノ粒子を第２水溶液中で接触させることからなる段階的成熟プロセスで該オリゴヌクレオチドを該ナノ粒子に付着させることを特徴とする工程と、（ｃ）前記核酸、基板およびナノ粒子プローブを、前記核酸とナノ粒子プローブ上のオリゴヌクレオチド、ならびに前記核酸と基板上のオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズするのに有効な条件下で接触させて、基板に結合した光散乱複合体を形成させる工程と、（ｄ）前記複合体から散乱光を生じさせるのに有効な条件下で光散乱複合体に光を照射する工程と、（ｅ）前記条件下で、前記複合体によって散乱された光を１種または複数種の核酸の存在の尺度として検出する工程とからなる。基板は、（ａ）流動性試料の屈折率より大きい屈折率を有する光透過性の要素、（ｂ）受光縁部、および（ｃ）オリゴヌクレオチドが結合した表面からなる導波路である。
本発明はまた、本発明のナノ粒子共役体の、塩濃度依存的なハイブリダイゼーションの挙動を利用することによって、核酸検出の選択性を高める方法も提供する。ナノ粒子オリゴヌクレオチド共役体の融解特性の特異な塩依存性を使用して、ミスマッチの識別において熱的にストリンジェントな洗浄を省くことが可能であり、これは、手持ち型（ｈａｎｄ−ｈｅｌｄ）のＤＮＡ検出システムを開発することに向けての重要な１歩である。したがって、本発明の１実施形態では、核酸を検出する方法が提供される。この方法は、核酸配列の第１の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した基板を提供する工程と、少なくとも一部が該核酸の第２の部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した、ナノ粒子などの標識を提供する工程と、標識と複合体形成した試験基板を形成するために、該基板、核酸、および標識を、該基板に結合したオリゴヌクレオチドと該核酸との間、および該核酸と該標識に結合したオリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイズさせるのに有効な条件下で接触させる工程と、該試験基板を、非特異的に結合した標識を実質的に除去するのに有効な塩濃度を有する塩水溶液と接触させる工程と、検出可能な変化を観察する工程とからなる。
本発明の別の実施形態では、少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法は、（ａ）核酸を、オリゴヌクレオチドが付着した基板と、該基板上のオリゴヌクレオチドと前記核酸がハイブリダイズするのに有効な条件下で接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドが１対の電極の間に配置され、前記核酸の配列の第１の部分に相補的な配列を有することを特徴とする工程と、（ｂ）基板に結合した前記核酸をナノ粒子など第１のタイプの標識と接触させる工程であって、該標識が電気を通し得る材料から作製され、該標識に１種または複数種のオリゴヌクレオチドが付着しており、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが前記核酸の配列の第２の部分に相補的な配列を有するとともに、該標識上のオリゴヌクレオチドと前記核酸とがハイブリダイズするのに有効な条件下で実施して標識と複合体形成した試験基板を形成させることを特徴とする工程と、（ｃ）該試験基板を、非特異的に結合した標識を十分に除去するのに有効な塩濃度を有する塩水溶液と接触させる工程と、（ｄ）前記電極の電気特性の変化を検出する工程とからなる。
本明細書に使用する場合、「オリゴヌクレオチド種」とは、同じ配列を有する複数のオリゴヌクレオチド分子を表す。オリゴヌクレオチドが付着している、ある「種の」ナノ粒子、共役体、粒子、ラテックスミクロスフェアなどは、同種類のオリゴヌクレオチドが付着している複数の上記物質を指す。また、「オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子」は、「ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体」、または、本発明の検出法の場合には、「ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブ」、「ナノ粒子プローブ」もしくは単に「プローブ」と称されることもある。
用語「検体」とは、薬物、代謝産物、農薬、汚染物質およびその他同種のものを含む、検出すべき化合物または組成物のことを指す。被検体は、特異的結合対（ｓｂｐ）のメン
バーから構成することができ、通常は抗原またはハプテンである、一価（モノエピトープ）または多価（ポリエピトープ）リガンドであり、単一の化合物または少なくとも１つの共通エピトープまたは決定基を共有する複数の化合物である。検体は、最近のような細胞またはＡ、Ｂ、Ｄなどの血液群抗原またはＨＬＡ抗原を担持する細胞のような細胞の一部であってもよいし、微生物（例えば細菌、真菌類、原生動物、ウイルス）であってもよい。
多価リガンド検体は、通常、ポリ（アミノ酸）つまりポリペプチド、タンパク質、多糖、核酸、およびそれらの組み合わせである。そのような組み合わせには、細菌、ウイルス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜およびその他同種のものの構成要素が含まれる。
大部分は、本発明を適用することができるポリエピトープリガンド検体は、少なくとも約５，０００、より一般的には少なくとも約１０，０００の分子量を有する。ポリ（アミノ酸）の分類では、問題のポリ（アミノ酸）は一般に約５，０００〜５，０００，０００の分子量であり、より一般的には約２０，０００〜１，０００，０００の分子量であり、とりわけ問題のホルモンでは、分子量は一般に約５，０００〜６０，０００に及ぶ。
同様の構造的特徴を有するタンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパク質、特定の微生物に関する（特に疾病を引き起こす微生物）タンパク質等のファミリーに関して、様々のタンパク質を考慮することができる。そのようなタンパク質としては、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、酵素、ホルモン、癌抗原、栄養学的マーカー、組織特異抗原などが含まれる。
タンパク質、血液凝固因子、タンパク質ホルモン、抗原性多糖、微生物、および本発明で問題となる他の病原体が、特に米国特許第４，６５０，７７０号に開示されている。その開示全体が引用により本明細書に組み込まれる。
モノエピトープリガンド検体は、一般に約１００〜２，０００、より一般的には約１２５〜１，０００の分子量であろう。
そのような検体は、ホストからの体液等のサンプルに直接見出される分子であり得る。サンプルは、直接検査してもよいし、または検体をより容易に検出できるようにするために予め処理してもよい。更に、問題の検体は、問題の検体に相補的な特異的結合対メンバー等の、問題の検体の存在を証明する作用物質の検出により、決定することができる。作用物質の存在は、問題の検体がサンプル中に存在するときにのみ検出される。したがって、検体の存在を証明する作用物質は、アッセイで検出される検体となる。体液は、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、およびその他同種のものであってよい。
用語「特異的結合対（ｓｂｐ）メンバー」とは、２つの異なる分子の一方であって、他方の分子の特定の空間的および極性の組織に特異的に結合しそれゆえ該組織に相補的と定義されるある領域を表面上または空洞内に有する分子のことを指す。この特異的結合対メンバーは、リガンドおよび受容体（アンチリガンド）とも称される。これらは通常、抗原−抗体のような免疫学的な対であり、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモン受容体、核酸二本鎖、ＩｇＧ−プロテインＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ等のポリヌクレオチド対のような他の特異的結合は免疫学的な対ではないが、通常本発明およびｓｂｐメンバーの定義に含まれる。
用語「リガンド」は、それに対する受容体が当然存在するか、それに対する受容体を調製することができる、任意の有機化合物のことを指す。用語「リガンド」はさらに、通常
１００を超える分子量を有し、受容体に対する類似リガンドと競合できる修飾リガンドであり、通常は有機ラジカルまたは検体類似体である、リガンド類似体も含む。修飾により、リガンド類似体を別の分子とつなぐ手段が提供される。リガンド類似体は、通常、リガンドをハブまたは表漆器に連結する結合と水素の置換以上にリガンドとは異なるが、必ずしもその必要はない。リガンド類似体はリガンドと類似の様式で受容体に結合することができる。リガンド類似体は、例えば、抗体のイディオタイプに対してリガンドに向けられた抗体であり得る。
用語「受容体」または「アンチリガンド」とは、例えば、分子の特定の空間的および極性の組織（例えばエピトープまたは抗原決定基）を認識することができる任意の化合物または組成物のことを指す。例となる受容体には、天然受容体、例えばチロキシン結合性グロブリン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核酸、アビジン、プロテインＡ、バースター（ｂａｒｓｔａｒ）、補体成分Ｃｌｑ、およびその他同種のものが含まれる。アビジンには、卵白アビジンや、ストレプトアビジンのような他の供給源から得られたビオチン結合タンパク質が含まれる。
用語「特異的結合」とは、２つの異なる分子の１つが、他の分子の認識が本質的により少ないのに比べて、もう１つの分子を特異的に認識することを指す。一般に、分子は、分子間の特定の認識を生じさせる領域を、それらの表面上にまたは空洞内で有する。特異的結合の典型例は、抗体−抗原相互作用、酵素−基質相互作用、ポリヌクレオチド相互作用等である。
用語「非特異的結合」とは、特定の表面構造から比較的独立した、分子間の非共有結合のことを指す。非特異的結合は、分子間の疎水的相互作用を含むいくつかの要因によって起こり得る。
用語「抗体」とは、もう１つの分子の特定の空間的および極性の組織に特異的に結合し、それゆえ該組織に相補的と定義される、免疫グロブリンのことを指す。抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、ホストの免疫や血清の収集のような当該技術分野で周知の技術により（ポリクローナル）、または連続的なハイブリッド細胞系の調製と分泌タンパク質の収集により（モノクローナル）、または天然抗体の特異的結合に必要なアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその変異配列をクローニングおよび発現することにより、調製することができる。抗体には完全な免疫グロブリンまたはその断片が含まれ、免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３、ＩｇＭのような様々なクラスとアイソタイプが含まれる。その断片には、Ｆａｂ、Ｆｖ、およびＦ（ａｂ’）ｓｕｂ．２、Ｆａｂ’等が含まれる。さらに、免疫グロブリンまたはそのフラグメントの凝集体、ポリマー、および共役体も、特定の分子に対する結合親和性を維持する限り、適宜使用することができる。
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の実施に有用なナノ粒子としては、金属（例えば、金、銀、銅および白金）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＣｄＳまたはＺｎＳでコートしたＣｄＳｅ）ならびに磁性（例えば、強磁性）コロイド材料が挙げられる。本発明の実施に有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓが含まれる。ナノ粒子のサイズは、好ましくは約５〜約１５０ｎｍ（平均直径）、より好ましくは約５〜約５０ｎｍ、最も好ましくは約１０〜約３０ｎｍである。ナノ粒子はロッドであってもよい。
金属、半導体および磁気ナノ粒子の調製法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｇ．（編），Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ（ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９４年）；Ｈａｙａｔ，Ｍ．Ａ．（編），Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）；Ｍａｓｓａｒｔ，Ｒ．，ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ Ｏｎ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，第１７巻，１２４７ページ（１９８１年）；Ａｈｍａｄｉ，Ｔ．Ｓ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７２巻，１９２４ページ（１９９６年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９９巻，１４１２９ページ（１９９５年）；Ｃｕｒｔｉｓ，Ａ．Ｃ．ら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，第２７巻，１５３０ページ（１９８８年）参照。
ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、およびＧａＡｓナノ粒子の調製法も当該技術分野において公知である。例えば、Ｗｅｌｌｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，第３２巻，４１ページ（１９９３年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．，第１４３巻，１１３ページ（１９８８年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，第８９巻，１８６１ページ（１９８９年）；Ｂｒｕｓ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ａ．，第５３巻，４６５ページ（１９９１年）；Ｂａｈｎｃｍａｎｎ，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｓｏｌａｒ Ｅｎｅｒｇｙ（ＰｅｌｉｚｅｔｔｉおよびＳｃｈｉａｖｅｌｏ編、１９９１年），２５１ページ；ＷａｎｇおよびＨｅｒｒｏｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９５巻，５２５ページ（１９９１年）；Ｏｌｓｈａｖｓｋｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１２巻，９４３８ページ（１９９０年）；Ｕｓｈｉｄａら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９５巻，５３８２ページ（１９９２年）参照。
適当なナノ粒子は、例えば、テッド・ペラ社（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）（金）、アマーシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（金）およびナノプローブス社（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）（金）からも市販されている。
核酸の検出に用いるのに好ましいのは金ナノ粒子である。金コロイド粒子は、美しい色を発するバンドに対して高い吸光係数を有する。これらの印象的な色は、粒度、濃度、粒子間間隔や、凝集体の凝集度および形状（幾何学）に応じて変化し、それが、これらの材料を比色アッセイ用に特に魅力的なものとしている。例えば、金ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドおよび核酸とがハイブリダイズすると直ぐに、肉眼にも見える変色が生じる（例えば、実施例参照）。
金ナノ粒子は、上記に挙げたのと同じ理由で、また、それらの安定性、電子顕微鏡検査による画像化の容易さや、十分に特性決定されたチオール官能基による修飾（以下参照）などの理由から、ナノファブリケーションに用いるのにも特に好ましい。また、半導体ナノ粒子も、それらの固有の電子特性および発光特性のゆえにナノファブリケーション用に好ましい。
オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるために、ナノ粒子もしくはオリゴヌクレオチドまたは両者を官能化する。そのような方法は当該技術分野では公知である。例えば、３′末端または５′末端がアルカンチオールにより官能化されたオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子に容易に付着する。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｗｅｌｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ３９ｔｈ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎａｎｏｐｈａｓｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，１０９−１２１ページ（１９９５年）参照。さら
に、Ｍｕｃｉｃら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，５５５−５５７ページ（１９９６年）（平らな金表面に３′チオールＤＮＡを付着させる方法を記載している；この方法は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるのに用い得る）参照。アルカンチオール法は、オリゴヌクレオチドを、他の金属、半導体および磁性コロイドや、上記にリストした他のナノ粒子に付着させるのにも用い得る。オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるための他の官能基には、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートを金表面に結合させることに関しては、米国特許第５，４７２，８８１号参照）、置換アルキルシロキサン（例えば、シリカおよびガラス表面へのオリゴヌクレオチドの結合に関しては、Ｂｕｒｗｅｌｌ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，第４巻，３７０−３７７ページ（１９７４年）ならびにＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１０３巻，３１８５−３１９１ページ（１９８１年）、アミノアルキルシロキサンおよび類似のメルカプトアルキルシロキサンの結合に関しては、Ｇｒａｂａｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第６７巻，７３５−７４５ページ参照）が含まれる。オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるには、５′チオヌクレオシドまたは３′チオヌクレオシドを末端基とするオリゴヌクレオチドを用いてもよい。以下の参考文献はオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるのに用い得る他の方法を記載している：Ｎｕｚｚｏら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１０９巻，２３５８ページ（１９８７年）（金上のジスルフィド）；ＡｌｌａｒａおよびＮｕｚｚｏ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１巻，４５ページ（１９８５年）（アルミニウム上のカルボン酸）；ＡｌｌａｒａおよびＴｏｍｐｋｉｎｓ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．，第４９巻，４１０−４２１ページ（１９７４年）（銅上のカルボン酸）；Ｉｌｅｒ，Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｏｆ Ｓｉｉｃａ，第６章，（Ｗｉｌｅｙ，１９７９年）（シリカ上のカルボン酸）；Ｔｉｍｍｏｎｓ ａｎｄ Ｚｉｓｍａｎ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第６９巻，９８４−９９０ページ（１９６５年）（白金上のカルボン酸）；ＳｏｒｉａｇａおよびＨｕｂｂａｒｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１０４巻，３９３７ページ（１９８２年）（白金上の芳香環化合物）；Ｈｕｂｂａｒｄ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，第１３巻，１７７ページ（１９８０年）（白金上のスルホラン、スルホキシドおよび他の官能化溶剤）；Ｈｉｃｋｍａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１１巻，７２７１ページ（１９８９年）（白金上のイソニトリル）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第３巻，１０４５ページ（１９８７年）（シリカ上のシラン）；ＭａｏｚおよびＳａｇｉｖ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第３巻，１０３４ページ（１９８７年）（シリカ上のシラン）；Ｗａｓｓｅｒｍａｎら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第５巻，１０７４ページ（１９８９年）（シリカ上のシラン）；ＥｌｔｅｋｏｖａおよびＥｌｔｅｋｏｖ，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第３巻，９５１ページ（１９８７年）（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族カルボン酸、アルデヒド、アルコールおよびメトキシ基）；Ｌｅｃら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第９２巻，２５９７ページ（１９８８年）（金属上の硬質ホスフェート）。
環式ジスルフィドで官能化されたオリゴヌクレオチドは本発明の範囲内にある。環式ジスルフィドは、好ましくは、その環の中に２つの硫黄原子を含めて５または６つの原子を有している。適切な環式ジスルフィドは市販されているか、既知の方法によって合成される。環式ジスルフィドの還元形も使用することができる。
好ましくは、リンカーは、環式ジスルフィドに付けられた炭化水素部分をさらに含む。適切な炭化水素は市販されており、環式ジスルフィドに付けられる。好ましくは炭化水素部分はステロイド残基である。環式ジスルフィドに付けられたステロイド残基を含むリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体は、期せずしてアルカンチオールまたは非環式ジスルフィドをリンカーとして使用して調製した共役体と比較して、チオール（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）溶液中で使用されるジチオスレイトール）に対して著しく安定であることが分かった。確かに、本発明のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体は３００倍安定していることがわかった。この予期しなかった安定性は
、恐らく各オリゴヌクレオチドが、１つの硫黄原子ではなく、２つの硫黄原子によってナノ粒子に固定されているという事実による。詳しく説明すると、環式ジスルフィドの２つの隣接した硫黄原子が、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の安定化に有効なキレート化効果を有することが考えられる。リンカーの大きな疎水性ステロイド残基も、ナノ粒子の表面への水溶性分子の接近からナノ粒子を遮ることにより、共役体の安定性に寄与するように思われる。
以上を考慮すると、両方の硫黄原子がナノ粒子に同時にくっ付くことができるように、環式ジスルフィドの２つの硫黄原子は好ましくは十分に接近しなければならない。より好ましくは、２つの硫黄原子は互いに隣接する。また、炭化水素部分は、ナノ粒子の表面を遮る大きな疎水性表面を示すように大きくなくてはならない。
環式ジスルフィドリンカーを使用したオリゴヌクレオチド−環式ナノ粒子共役体は、核酸検出用の診断アッセイや本明細書に記載したナノファブリケーションの方法において、プローブとして使用され得る。本発明のそのような共役体は、それを使用した診断アッセイの感度を向上させることが期せずして分かった。特に、環式ジスルフィドに付けられたステロイド残基を含むリンカーを使用して調製されたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を使用したアッセイは、約１０倍アルカンチオールまたは非環式ジスルフィドをリンカーとして使用して調製された共役体を使用したアッセイよりも１０倍感度が高いと分かった。
上記のチオールに対する本発明のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の驚くべき安定性は、それらをＰＣＲ溶液中で直接使用することを可能にする。したがって、ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ標的に対してプローブとして加えられた本発明のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子は、３０または４０回のＰＣＲの加熱−冷却サイクルを受け、チューブを開かなくてもなおアンプリコンを検出することができる。ＰＣＲ後にプローブ追加のためにサンプルチューブを開くと、後のテストに使用する機器の汚染による深刻な問題が起こる可能性がある。
最後に、本発明は、本発明のある種類のオリゴヌクレオチド環式ジスルフィドリンカーが入った容器または本発明のある種類のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体が入った容器を含むキットを提供する。該キットは、核酸検出またはナノファブリケーションに有効な他の試薬や品目をさらに含んでもよい。
各ナノ粒子には多数のオリゴヌクレオチドが付着する。その結果、各ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、相補的配列を有する多数のオリゴヌクレオチドまたは核酸に結合し得る。
本発明の実施に際して、規定配列を有するオリゴヌクレオチドが様々な目的に使用される。予め決定した配列を有するオリゴヌクレオチドを調製する方法は周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）およびＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，第１版（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１年）参照。オリゴヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドの合成には、共に固相合成法が好ましい（周知のＤＮＡ合成法は、ＲＮＡの合成にも有用である）。オリゴリボヌクレオチドとオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。
本発明は核酸検出法を提供する。これらの方法はまた、どの種類の核酸をも検出し得るし、例えば、病気の診断や核酸の配列決定にも用い得る。本発明の方法により検出し得る
核酸の例としては、遺伝子（例えば、特定の疾患に関与する遺伝子）、ウイルスＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、菌類ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡフラグメント、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、一本鎖および二本鎖核酸、天然および合成核酸などがある。例えば、核酸検出法の用途例には、ウイルス性疾患（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルスおよびエプスタイン−バー・ウイルス）、細菌性疾患（例えば、結核、ライム病、Ｈ．ピロリ、大腸菌感染症、レジオネラ感染症、マイコプラズマ感染症、サルモネラ感染症）性的伝染病（例えば、淋病）、遺伝性疾患（例えば、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球貧血）、ならびにガン（例えば、ガン発症に関与する遺伝子）の診断および／またはモニター用；法医学用；ＤＮＡ配列決定用；親子鑑定テスト用；細胞系確認用；遺伝子療法のモニター用；ならびに他の多くの目的が含まれる。
肉眼による変色の観察に基づく核酸検出法は、安価、高速、簡単、強靭（試薬が安定している）であり、特殊化装置または高価な装置を必要とせず、かつ計器による計測がほとんど不要である。これらの点から、上記方法は、例えば、ＤＮＡ配列決定における研究および解析実験において、特定病原体の存在を検出する分野において、治療薬の処方を支援するために感染症の迅速な同定を必要とする医院において、また費用のかからない最前線のスクリーニングをするために家庭や保険センターにおいて用いるのに特に適している。
検出すべき核酸は、公知方法で単離することもできるし、細胞、組織試料、生物流体（例えば、唾液、尿、血液、血清）、ＰＣＲ成分を含有する溶液、大過剰量のオリゴヌクレオチドまたは高分子量ＤＮＡを含有する溶液、および当該技術分野においても既知の他の試料中で直接検出することもできる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）ならびにＢ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５年）参照。ハイブリダイズ用プローブを用いて検出するための核酸の調製法は当該技術分野では周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）ならびにＢ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編；Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５年）参照。
核酸が少量で存在する場合、当該技術分野において公知の方法を用い得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）ならびにＢ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５年）参照。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅が好ましい。
本発明の１つの核酸検出法は、核酸とオリゴヌクレオチドが付着している１つ以上の種類のナノ粒子とを接触させるステップを含む。検出すべき核酸は少なくとも２つの部分を有している。これらの部分の長さと、もしあれば、それらの間隔は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが核酸とハイブリダイズしたときに検出可能な変化が生じるように選択される。これらの長さと間隔は、経験的に決定可能であり、用いられる粒子の種類およびそのサイズ、ならびにアッセイに用いられる溶液中に存在する電解質の種類（当該技術分野では公知のように、ある種の電解質は、核酸のコンホメーションに影響を与える）に依存するであろう。
また、核酸を他の核酸の存在下に検出しようとする場合、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドが結合すべき核酸部分は、核酸の検出を特異的にするのに十分なユニーク配列を含む
ように選択しなければならない。そのようにするためのガイドラインは当該技術分野では周知である。
核酸は、１種類のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を用いればすむように互いに十分に近接した反復配列を含んでいることがあるが、このようなことはめったに起こらない。一般に、核酸の選択した複数の部分は異なる配列を有し、好ましくは異なるナノ粒子に付着している、該選択部分は、２つ以上の異なるオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子と接触することになろう。核酸を検出するための系の１つの例が図２に示されている。図で分るように、第１ナノ粒子に付着している第１オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ中の標的配列の第１部分に対して相補的な配列を有している。第２ナノ粒子に付着している第２オリゴヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ中の標的配列の第２部分に対して相補的な配列を有している。ＤＮＡの追加部分は対応ナノ粒子の標的となり得る。図１７参照。核酸のいくつかの部分を標的とすると、検出可能な変化の大きさが増大する。
ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と核酸との接触ステップは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸の標的配列とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。これらのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９年）参照。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を用いるのが好ましい。
検出すべき核酸とナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を含有する溶液を凍結解凍することにより、ハイブリダイゼーションをより高速にすることができる。溶液は、ドライアイス−アルコール浴中に凍結させるのに十分な時間（一般に、１００μｌの溶液の場合、約１分）入れる方法などの任意の慣用法で凍結し得る。溶液は、熱変性温度より低い温度で解凍しなければないが、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と核酸とのほとんどの組合せに対しては、室温が好都合であろう。溶液の解凍後、ハイブリダイゼーションが完了し、溶液解凍後に検出可能な変化が観察される。
検出すべき核酸およびナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を含有する溶液を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと標的核酸とで形成された複合体の解離温度（Ｔｍ）より低い温度まで温めて、ハイブリダイゼーション速度を増大させることもできる。あるいは、解離温度（Ｔｍ）以上に加熱し、溶液を冷却することにより、高速ハイブリダイゼーションを達成することもできる。
ハイブリダイゼーションの速度は、塩濃度を（例えば、０．１Ｍから０．３Ｍ ＮａＣｌに）高めることにより、増大させることも可能である。
ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とがハイブリダイズすると生じる検出可能な変化は、変色、ナノ粒子凝集体の形成、または凝集したナノ粒子の沈殿であり得る。変色は、肉眼または分光分析により観察し得る。ナノ粒子凝集体の形成は、電子顕微鏡検査または比濁分析によって観察し得る。凝集したナノ粒子の沈殿は、肉眼でも顕微鏡検査によっても観察し得る。好ましいのは、肉眼で観察し得る変化である。特に好ましいのは、肉眼で観察し得る変色である。
肉眼による変色の観察は、対照的な色を背景にするとより容易に実施し得る。例えば、金ナノ粒子を用いる場合、変色の観察は、（シリカまたはアルミナＴＬＣプレート、濾紙、セルロイドメンブレン、およびナイロンメンブレン、好ましくはＣ−１８シリカＴＬＣプレートなどの）固体白色表面上にハイブリダイゼーション溶液をスポットし、スポットを乾燥させることにより容易になる。初めは、スポットは、（ハイブリダイゼーション不在下のピンク／赤色から、ハイブリダイゼーション存在下の紫がかった赤／紫色の範囲の
）ハイブリダイゼーション溶液の色を呈する。室温下または８０℃（温度は重要ではない）下に乾燥させたとき、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体がスポットする前に標的核酸とハイブリダイズして結合していると、青色スポットが生じる。（例えば、標的核酸が存在しないために）ハイブリダイゼーションが起こらないと、スポットはピンク色である。青色スポットとピンク色スポットは安定であり、のちに冷却しても、加熱しても、経時的にも、変化しない。それらのスポットはテストの便利な永久記録を提供する。変色を観察するのに、（ハイブリダイズしたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とハイブリダイズしていないものの分離などの）他のステップは不要である。
アッセイ結果を容易に視覚化するための代替法は、液体を吸引してフィルターに通過させながら、標的核酸にハイブリダイズしたナノ粒子プローブ試料をガラス繊維フィルター（例えば、サイズが１３ｎｍの金ナノ粒子と共に用いる場合には、細孔サイズ０．７μｍ、グレードＦＧ７５のホウケイ酸塩ミクロファイバーフィルター）に対してスポットする方法である。その後、（フィルターの細孔より大きいために保持された）ナノ粒子プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションにより生成した凝集体を含む観察可能なスポットを残して、過剰なハイブリダイズしていないプローブをフィルターに通して水で洗い流す。この技術は、過剰なナノ粒子プローブを使用し得るので、高い感度を提供し得る。残念ながら、ナノ粒子プローブは、試みた他の多くの固体表面（シリカスライド、逆相プレート、ナイロン、ニトロセルロース、セルロースおよび他のメンブレン）には粘着するために、これらの表面は使用できない。
図２に示されている検出系の重要な側面は、検出可能な変化を得るステップが、２つの異なるオリゴヌクレオチドと核酸中の所与の標的配列との協同ハイブリダイゼーションによって決まることである。２つのオリゴヌクレオチドのいずれにおける誤対合も、粒子間の結合を不安定にするであろう。塩基対における誤対合が、長いオリゴヌクレオチドプローブの結合よりも短いオリゴヌクレオチドプローブの結合に対してはるかに大きな不安定化作用を及ぼすことは周知である。図２に示されている系の利点は、この系が、長い標的配列およびプローブ（図２に示されている実施例では１８塩基対）に関連する塩基識別を利用するにも拘わらず、短いオリゴヌクレオチドプローブ（図２に示されている実施例では９塩基対）に特徴的な感度を有することである。
核酸の標的配列は、図２のように連続的なこともあるし、図３に示されているように、標的配列の２つの部分がナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと相補的ではない第３部分によって分離されていることもある。後者の場合、溶液中で遊離すると共にこの第３部分の配列に対して相補的な配列を有する、フィラー（ｆｉｌｌｅｒ、充填）オリゴヌクレオチドを用いるというオプションもある（図３参照）。フィラーオリゴヌクレオチドが核酸の第３部分とハイブリダイズすると、二本鎖セグメントができ、それによってナノ粒子間の平均間隔が変化し、その結果、色が変わる。図３に示されている系は、検出法の感度を高め得る。
核酸検出法の実施態様のなかには基板を利用するものもある。基板を用いることにより、検出可能な変化（シグナル）を増幅し、アッセイの感度を高めることができる。
検出可能な変化を観察し得る任意の基板を用いてよい。適当な基板としては、透明固体表面（例えば、ガラス、石英、プラスチックおよび他のポリマー類）、不透明固体表面（例えば、ＴＬＣシリカプレート、濾紙、ガラス繊維フィルター、セルロイドメンブレン、ナイロンメンブレンなどの白色固体表面）、および導電性固体表面（例えば、インジウム−スズ−オキシド（ＩＴＯ））が挙げられる。基板は、任意の形状または厚さであってよいが、一般的には、平坦で薄い。好ましいのは、ガラス（例えば、ガラス製スライド）またはプラスチック（例えば、マイクロタイタープレートのウエル）などの透明な基板である。
１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドを基板に付着させる。オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２４巻，３０３１−３０３９ページ（１９９６年）；Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２４巻，３０４０−３０４７ページ（１９９６年）；Ｍｕｃｉｃら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第５５５巻（１９９６年）；ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎおよびＣｏｘ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２２巻，４９２ページ（１９９４年）；Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙら，Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａ，第１０巻，５９１ページ（１９９２年）；およびＨｅｇｎｅｒら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，第３３６巻，４５２ページ（１９９３年）に記載のように、基板に付着させることができる。
基板に付着しているオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。核酸と基板とを、基板上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、核酸は基板と結合した状態になる。結合しなかった核酸は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を加える前に基板から洗い流すのが好ましい。
次いで、基板に結合した核酸と、オリゴヌクレオチドが付着している第１種類のナノ粒子とを接触させる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有しており、接触ステップは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。このようにして、第１種類のナノ粒子は基板に結合した状態になる。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を基板に結合させた後、基板を洗浄して、結合していないナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体および核酸を除去する。
第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、すべて同じ配列を有してもよいし、検出すべき核酸の異なる部分とハイブリダイズする異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合、各ナノ粒子に、すべての異なるオリゴヌクレオチドが付着してもよいが、異なるオリゴヌクレオチドが異なるナノ粒子に付着するのが好ましい。図１７は、核酸の複数の部分にハイブリダイズするように設計されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の使用を示している。代わりに、各第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは複数の異なる配列を有していてもよいが、そのうちの少なくとも１つは、検出すべき核酸の一部とハイブリダイズしなければならない（図２５Ｂ参照）。
最後に、基板に結合した第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子とを接触させる。該オリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの少なくとも一部の配列に対して相補的な配列を有しており、接触ステップは、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。ナノ粒子を結合させ後、結合しなかったナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を除去するために基板を洗浄するのが好ましい。
ハイブリダイゼーションの組合せにより、検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は上述のものと同じであるが、但し、多重ハイブリダイゼーションにより、検出可能な変化が増幅される。特に、各第１種類のナノ粒子には、（同一または異なる配列を有する）複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、複数の第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体にハイブリダイズし得る。また、第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、検出すべき核酸の２つ以上の部分にハイブリダイズし得る。多重ハイブリダイゼーションにより得られる増幅は、変化を初めて検出し得るものとしたり、または検出可能な変化の大きさを増大させたりし得る。この増幅によって、アッセイの感度が高められ、少量の核酸の検出が可能になる
。
所望の場合には、第１および第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を連続付加して、追加のナノ粒子層を堆積することができる。この方法で、標的核酸１分子当たりの固定化ナノ粒子の数を増加させると同時に、対応するシグナル強度を増強させることができる。
また、互いに直接ハイブリダイズするように設計された第１および第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の代わりに、連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果としてナノ粒子を共に結合させる働きをするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子を用いてもよい。
ナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの調製法ならびにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる方法は上記に説明されている。ハイブリダイゼーション条件は当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る（上記参照）。
この核酸（検体ＤＮＡ）検出法の１つの実施例が図１３Ａに示されている。図に示されているように、ハイブリダイゼーションの組合せにより、ナノ粒子凝集体が検体ＤＮＡを介して基板に結合している暗色領域が生じる。これらの暗色領域は、周囲光を使って肉眼で、好ましくは白い背景を背に基板を見れば容易に観察し得る。図１３Ａから容易に分るように、この方法は、検出可能な変化を増幅させる手段を提供する。
この核酸検出法の別の実施例が図２５Ｂに示されている。図１３Ａに示されている実施例と同じように、ハイブリダイゼーションの組合せにより、ナノ粒子凝集体が検体ＤＮＡを介して基板に結合している暗色領域ができ、これは肉眼で観察することができる。
別の実施態様では、ナノ粒子を基板に付着させる。ナノ粒子は、例えば、Ｇｒａｂａｒら，Ａｎａｌｙｔ．Ｃｈｅｍ．，第６７巻，７３−７４３ページ（１９９５年）；Ｂｅｔｈｅｌｌら，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第４０９巻，１３７ページ（１９９６年）；Ｂａｒら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１２巻，１１７２ページ（１９９６年）；Ｃｏｌｖｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１４巻，５２２１ページ（１９９２年）に記載のように基板に付着させることができる。
ナノ粒子を基板に付着させた後、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる。これは、溶液中でオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させるための上記方法と同じ方法で達成し得る。ナノ粒子に付着したオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。
基板と核酸とを、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、核酸は基板に結合した状態になる。結合しなかった核酸は、さらにナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を加える前に基板から洗い流すのが好ましい。
次いで、オリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子を用意する。これらのオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有しており、基板に結合した核酸と第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とを、第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は基板と結合した状態になる。ナノ粒子を結合させた後、結合しなかったナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と核酸を基板から洗い流す。この時点で、ある変化（
例えば、変色）を検出し得る。
第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドはすべて同じ配列を有してもよいし、検出すべき核酸の異なる部分とハイブリダイズする異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合、各ナノ粒子に、すべての異なるオリゴヌクレオチドが付着してもよいが、異なるオリゴヌクレオチドが異なるナノ粒子に付着するのが好ましい。図１７を参照されたい。
次いで、第１部分が第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部の配列と相補的である少なくとも２つの部分を含む選択された配列を有する結合オリゴヌクレオチドと、基板に結合した第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とを、結合オリゴヌクレオチドとナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、結合オリゴヌクレオチドは基板と結合した状態になる。結合オリゴヌクレオチドを結合させた後、結合しなかった結合オリゴヌクレオチドを基板から洗い流す。
最後に、オリゴヌクレオチドが付着している第３種類のナノ粒子を用意する。これらのオリゴヌクレオチドは、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、基板に結合した結合オリゴヌクレオチドとを、結合オリゴヌクレオチドとナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。ナノ粒子を結合させた後、結合しなかったナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を基板から洗い流す。
ハイブリダイゼーションの組合せにより、検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は上述のものと同じであるが、但し、多重ハイブリダイゼーションにより、検出可能な変化が増幅される。特に、各第２種類のナノ粒子には、（同一または異なる配列を有する）多数のオリゴヌクレオチドが付着するので、各第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、（結合オリゴヌクレオチドを介して）複数の第３種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体にハイブリダイズし得る。また、第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、検出すべき核酸の２つ以上の部分にハイブリダイズし得る。多重ハイブリダイゼーションによりもたらされる増幅は、変化を初めて検出可能なものとしたり、または検出可能な変化の大きさを増大させたりし得る。この増幅により、アッセイの感度が高められ、少量の核酸の検出が可能になる。
所望の場合には、結合オリゴヌクレオチドと第２および第３種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とを連続付加して、追加のナノ粒子層を堆積することができる。このようにして、標的核酸１分子当たりの固定化ナノ粒子の数をさらに増強させると同時に、対応するシグナル強度を増強させることができる。
また、結合オリゴヌクレオチドの使用を排除することも可能であり、第２および第３種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、直接互いにハイブリダイズするように設計し得る。
ナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの調製法ならびにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる方法は上記に説明されている。ハイブリダイゼーション条件は当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る（上記参照）。
この核酸（検体ＤＮＡ）検出法の１つの実施例が図１３Ｂに示されている。その図に示されているように、ハイブリダイゼーションの組合せにより、ナノ粒子凝集体が検体ＤＮＡを介して基板に結合している暗色領域が生じる。これらの暗色領域は、上述したように
肉眼で容易に観察し得る。図１３Ｂから分るように、本発明の方法のこの実施態様は、検出可能な変化を増幅させる別の手段を提供する。
別の増幅計画はリポソームの使用である。この計画では、オリゴヌクレオチドを基板に付着させる。適当な基板は上述のものであり、オリゴヌクレオチドは上述のように基板に付着させることができる。例えば、基板がガラスの場合、これは、ホスホリルまたはカルボン酸基を介してオリゴヌクレオチドを基板表面上のアミノアルキル基に縮合させることにより達成し得る（関連化学に関しては、Ｇｒａｂａｒら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第６７巻，７３５−７４３ページ（１９９５年）参照）。
基板に付着したオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。核酸と基板とを、基板上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。このようにして、核酸は基板と結合した状態になる。結合しなかった核酸は、この系の追加成分を加える前に基板から洗い流すのが好ましい。
次いで、基板に結合した核酸をオリゴヌクレオチドが付着しているリポソームと接触させる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有しており、接触ステップは、リポソーム上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。このようにして、リポソームは基板と結合した状態になる。リポソームを基板に結合させた後、基板を洗浄して、結合しなかったリポソームと核酸を除去する。
リポソーム上のオリゴヌクレオチドはすべて同じ配列を有してもよいし、検出すべき核酸の異なる部分とハイブリダイズする異なる配列を有してもよい。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる場合、各リポソームに、すべての異なるオリゴヌクレオチドが付着するか、異なるオリゴヌクレオチドが異なるナノ粒子に付着し得る。
オリゴヌクレオチド−リポソーム共役体を調製するために、オリゴヌクレオチドを、コレステリルなどの疎水基に結合させ（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１５巻，７５３５−７５３６ページ（１９９３年）参照）、疎水基−オリゴヌクレオチド共役体をリポソーム溶液と混合して、疎水基−オリゴヌクレオチド共役体が膜に固定化された状態のリポソームを形成する（Ｚｈａｎｇら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，第３７巻，６２４３−６２４６ページ（１９９６年）参照）。リポソーム表面上での疎水基−オリゴヌクレオチド共役体の充填は、混合物中の疎水基−オリゴヌクレオチド共役体とリポソームの比率を調節することにより制御し得る。コレステリル側基の疎水性相互作用によって付着しているオリゴヌクレオチドを担持するリポソームは、ニトロセルロース膜上に固体化されたポリヌクレオチドを標的とするのに有効であることが認められた（同上）。リポソーム膜内に固定化されたフルオレセイン基をレポーター基として用いた。フルオレセイン基は効果的な働きをしたが、（例えば、リポソーム表面上の）高局所濃度領域のフルオレセイン由来のシグナルが自己消光により弱められるという事実により感度が制限される。
リポソームは当該技術分野で周知の方法により調製される。Ｚｈａｎｇら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，第３７巻，６２４３ページ（１９９６年）参照。一般にリポソームの大きさは、サイズ（直径）が、後続ステップで用いられるナノ粒子の約５〜５０倍である。例えば、直径約１３ｎｍのナノ粒子には、直径約１００ｎｍのリポソームを用いるのが好ましい。
基板に結合したリポソームと、少なくとも１つの第１種類のオリゴヌクレオチドが付着
している第１種類のナノ粒子とを接触させる。第１種類のオリゴヌクレオチドのナノ粒子に付着していない末端には疎水基が付着しており、接触ステップは、疎水性相互作用の結果として、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドをリポソームに付着させるのに有効な条件下に行う。この時点で、検出可能な変化を観察し得る。
この方法はさらに、リポソームに結合した第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とオリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子とを接触させるステップを含む。第１種類のナノ粒子には、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しており、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部の配列に対して相補的な配列を有している。接触ステップは、第１および第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。このハイブリダイゼーションは、一般に、穏和な温度（例えば、５〜６０℃）下に実施され、したがって、室温下にハイブリダイゼーションを導き得る条件（例えば、０．３〜１．０Ｍ ＮａＣｌ）が用いられる。ハイブリダイゼーション後、結合しなかったナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を基板から洗い流す。
ハイブリダイゼーションの組合せにより、検出可能な変化が生じる。検出可能な変化は上述のものと同じであるが、但し、多重ハイブリダイゼーションにより、検出可能な変化が増幅される。特に、各リポソームには、（同一または異なる配列を有する）複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各リポソームは、複数の第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体にハイブリダイズし得る。同様に、各第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体には、多重オリゴヌクレオチドが付着しているので、各第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、複数の第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とハイブリダイズし得る。また、リポソームは、検出すべき核酸の２つ以上の部分にハイブリダイズし得る。多重ハイブリダイゼーションによりもたらされる増幅は、変化を初めて検出し得るものとしたり、または検出可能な変化の大きさを増大させたりし得る。この増幅により、アッセイの感度が高められ、少量の核酸の検出が可能になる。
所望の場合には、第１および第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を連続付加して、追加のナノ粒子層を堆積することができる。この方法で、標的核酸１分子当たりの固定化ナノ粒子の数をさらに増加させると同時に、対応するシグナル強度を増強させることができる。
また、互いに直接ハイブリダイズするように設計された第２および第３種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の代わりに、結合オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの結果としてナノ粒子を結合させる働きをするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子を用いてもよい。
ナノ粒子およびオリゴヌクレオチドの調製法ならびにオリゴヌクレオチドをナノ粒子に付着させる方法は上記に説明されている。ナノ粒子と結合させるために一方の末端を官能化した、他方の末端に疎水基を有するかまたは有さないオリゴヌクレオチド混合物を、第１種類のナノ粒子上に用いてもよい。平均的なナノ粒子に結合したこれらのオリゴヌクレオチドの相対比は、混合物中の２種のオリゴヌクレオチドの濃度比によって制御される。ハイブリダイゼーション条件は当該技術分野では周知であり、用いられる特定の系に合わせて容易に最適化し得る（上記参照）。
この核酸検出法の１つの例が図１８に示されている。第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体とリポソームとのハイブリダイゼーションにより、検出可能な変化が生じ得る。金ナノ粒子の場合、ピンク／赤色が観察され得るし、ナノ粒子が互いに十分に近接
していれば、紫／青色が観察され得る。第２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と第１種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体がハイブリダイズすると、検出可能な変化が生じる。金ナノ粒子の場合、紫／青色が観察されるであろう。これらの変色はいずれも肉眼で観察し得る。
基板を利用するさらに他の実施態様では、「凝集体プローブ」を用い得る。凝集体プローブは、相補的オリゴヌクレオチド（ａおよびａ′）が付着している２種類のナノ粒子をハイブリダイズさせて（図２８Ａに示されている）コアを形成することにより調製し得る。各種類のナノ粒子には、複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各種類のナノ粒子は、複数の他の種類のナノ粒子にハイブリダイズし得る。ゆえに、コアは両種類の多数のナノ粒子を含む凝集体である。次いで、コアに、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着している第３種類のナノ粒子でキャップ形成する。第１種類のオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の一部の配列ｂ′に対して相補的な配列ｂを有している。第２種類のオリゴヌクレオチドは、第３種類のナノ粒子がコアの外側のナノ粒子にハイブリダイズするように配列ａまたはａ′を有している。凝集体プローブは、２つの種類のナノ粒子を利用して調製することもできる（図２８Ｂ参照）。各種類のナノ粒子には、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着している。２つの種類のナノ粒子それぞれの上に存在する第１種類のオリゴヌクレオチドは、検出すべき核酸の一部の配列ｂ′に対して相補的な配列ｂを有している。第１種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドは、２つの種類のナノ粒子が互いにハイブリダイズして凝集体プローブを形成するように第２種類のナノ粒子上の第２種類のオリゴヌクレオチドの配列ａ′に対して相補的な配列ａを有している（図２８Ｂ参照）。各種類のナノ粒子には、複数のオリゴヌクレオチドが付着しているので、各種類のナノ粒子は、複数の他の種類のナノ粒子とハイブリダイズして、両種類の多数のナノ粒子を含む凝集体を形成するであろう。
凝集体プローブは、基板上で実施される上記の任意のアッセイ形式における核酸の検出にも利用可能であり、それによって、検出可能な変化を得たり増強したりするために個別のナノ粒子層を堆積する必要がなくなる。検出可能な変化をさらにもっと増強するために、２つの種類の凝集体プローブを用いて凝集体プローブ層を堆積することができ、第１種類の凝集体プローブには、他方の種類の凝集体プローブ上のオリゴヌクレオチドと相補的なオリゴヌクレオチドが付着している。特に、凝集体プローブを図２８Ｂに示されているように調製すると、凝集体プローブは、互いにハイブリダイズして多重層を形成し得る。凝集体プローブを利用するいくつかの可能なアッセイ形式が図２８Ｃ−Ｄに示されている。例えば、配列ｃを含む１種類のオリゴヌクレオチドを基板に付着させる（図２８Ｃ参照）。配列ｃは、検出すべき核酸の一部の配列ｃ′と相補的である。標的核酸を加え、基板に付着しているオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた後、凝集体プローブを加え、配列ｂ′を有する標的核酸部分にハイブリダイズさせると、検出可能な変化が生じる。あるいは、先ず、溶液中で標的核酸を凝集体プローブとハイブリダイズさせ、その後、基板上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせてもよいし、標的核酸を凝集体プローブと基板上のオリゴヌクレオチドとに同時にハイブリダイズさせてもよい。別の実施態様では、溶液中で、標的核酸を凝集体プローブおよび別の種類のナノ粒子と反応させる（図２８Ｄ参照）。この追加種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのなかには、それらが標的核酸の配列ｃ′にハイブリダイズするように配列ｃを有しているものがあるし、この追加種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのなかには、それらが基板に付着している配列ｄ′を有するオリゴヌクレオチドにのちにハイブリダイズし得るように配列ｄを含んでいるものもある。
コア自体も核酸検出用のプローブとして用い得る。１つの可能なアッセイ形式が図２８Ｅに示されている。この図に示されているように、配列ｂを含む１種類のオリゴヌクレオチドを基板に付着させる。配列ｂは、検出すべき核酸の一部の配列ｂ′と相補的である。
標的核酸を基板と接触させ、基板に付着しているオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。次いで、別の種類のナノ粒子を加える。この追加種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのなかには、ナノ粒子が基板に結合している標的核酸とハイブリダイズするように標的核酸の配列ｃ′に対して相補的な配列ｃを有するものがある。また、追加種類のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのなかには、コアプローブ上の配列ａおよびａ′に対して相補的な配列ａまたはａ′を含むものがある。コアプローブを加え、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。各コアプローブは、コアを含むナノ粒子に付着している配列ａおよびａ′を有しているので、コアプローブは、互いにハイブリダイズして、基板に付着した多重層を形成して、検出可能な変化を大きく増強させることができる。代替実施態様では、標的核酸を基板と接触させる前に溶液中で追加種類のナノ粒子と接触させるか、標的核酸、ナノ粒子、および基板をすべて同時に接触させ得る。さらに別の実施態様では、追加種類のナノ粒子を、配列ｃと配列ａまたはａ′を共に含む連結オリゴヌクレオチドに置き換え得る。
基板を用いると、複数の初期種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体またはオリゴヌクレオチドを、１つの標的核酸中の複数の部分を検出するため、多数の異なる核酸を検出するため、またはその両方の目的のために、基板にアレイ状に付着させることができる。例えば、１つの基板に、各スポットが標的核酸の一部に結合するように設計された、異なる種類のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を含む幾列ものスポットを設け得る。１種以上の核酸を含有する試料を各スポットに加え、適切なオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体、オリゴヌクレオチド−リポソーム共役体、凝集体プローブ、コアプローブおよび結合オリゴヌクレオチドを用いて、上述の方法の１つでアッセイの残りの部分を実施する。
最後に、基板を用いると、検出可能な変化を生成させたり、銀染色法によって検出可能な変化を強化したりことができる。銀染色法は、銀の還元を触媒する任意の種類のナノ粒子と共に用い得る。好ましいのは、貴金属（例えば、金および銀）製ナノ粒子である。Ｂａｓｓｅｌｌら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，第１２６巻，８６３−８７６ページ（１９９４年）；Ｂｒａｕｎ−Ｈｏｗｌａｎｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第１３巻，９２８−９３１ページ（１９９２年）参照。核酸の検出に用いられているナノ粒子が銀の還元を触媒しない場合、還元を触媒させるために、銀イオンと核酸との複合体を形成させ得る。Ｂｒａｕｎら，Ｎａｔｕｒｅ，第３９１巻，７７５ページ（１９９８年）参照。また、核酸上のリン酸基と反応し得る銀染料は公知である。
銀染色法を用いて、上述のものを含めた基板上で実施される任意のアッセイにおける検出可能な変化を生成または増強することができる。特に、銀染色法は、図２５Ａに示されているものなどの単１種類のナノ粒子を用いるアッセイの感度を著しく増強させることが判明しており、そのために、ナノ粒子層、凝集体ブローブおよびコアプローブを使わなくてすむことが多い。
基板上で実施される核酸検出アッセイにおいて、検出可能な変化は、光学式スキャナを用いて観察し得る。適当なスキャナには、反射モードで操作し得るコンピュータに文書をスキャンするのに用いられるもの（例えば、平台型スキャナ）、この機能を果たし得るか、または同種類の光学を利用する他のデバイス、任意の種類のグレースケール感受性測定デバイス、および本発明にしたがって基板をスキャンするように改変された標準型スキャナ（例えば、基板用容器を含むように改変された平台型スキャナ）（現在までのところ、透過モードで操作するスキャナを用いるのは不可能であることが判明している）が含まれる。スキャナの解像度は、基板上の反応領域をスキャナの１ピクセルより大きくするのに十分大きくなければならない。スキャナは、任意の基板と共に用い得るが、但し、アッセイによって生じた検出可能な変化は、基板を背景にして観察しなければならない（例えば
、銀染色法によって生成したようなグレースポットは、白を背景にすると観察し得るが、灰色を背景にすると観察できない）。スキャナは、白黒スキャナでもよいが、カラースキャナが好ましい。スキャナは、文書をコンピュータにスキャンするのに使用されるタイプの標準型カラースキャナが最も好ましい。そのようなスキャナは安価であり、容易に購入し得る。例えば、Ｅｐｓｏｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ６３６（６００×６００ｄｐｉ）、ＵＭＡＸ Ａｓｔｒａ １２００（３００×３００ｄｐｉ）、またはＭｉｃｒｏｔｅｃ
１６００（１６００×１６００ｄｐｉ）を用い得る。スキャナは、基板をスキャンして得た画像をプロセスするためのソフトウエアをロードしたコンピュータにつなぐ。ソフトウエアは、容易に購入し得る、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．１およびＣｏｒｅｌ Ｐｈｏｔｏｐａｉｎｔ ８．０などの標準ソフトウエアであってよい。グレースケール測定値計算ソフトウエアを用いることにより、アッセイ結果の定量手段が得られる。このソフトウエアで、カラースポットの色数を得ることもできるし、核酸の存在、核酸の量、またはその両方を定量するために観察することができるスキャン画像（例えば、プリントアウト）を生成することができる。また、実施例５に記載したようなアッセイを初めとするアッセイの感度は、陰性結果を表す色（実施例５では赤色）を陽性結果を表す色（実施例５では青色）から減色して改良することができる。コンピュータは、容易に購入し得る標準パーソナルコンピュータであってよい。このように、標準ソフトウエアがロードされている標準コンピュータにつないだ標準スキャナを用いることにより、アッセイを基板上で実施する際に核酸を検出かつ定量する便利かつ容易で安価な手段が得られる。スキャン画像および計算結果は、その後の参照および使用のために結果の記録を維持するべくコンピュータに記憶させることができる。もちろん、所望の場合には、より精密な機器やソフトウエアを使用することが可能である。
任意の核酸用アッセイに用い得るナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が、図１７Ｄ−Ｅに示されている。この「万能プローブ」（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｏｂｅ）には、単一配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。これらのオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を含む配列を有する結合オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし得る。第１部分は、ナノ粒子上の少なくとも一部の配列と相補的である。第２部分は、検出すべき核酸の一部の配列と相補的である。同一の第１部分と異なる第２部分を有する複数の結合オリゴヌクレオチドを用いることができ、その場合、「万能プローブ」は、結合オリゴヌクレオチドとハイブリダイズした後、検出すべき核酸の多重部分または異なる核酸標的に結合し得る。
本発明の他の多くの実施態様において、検出可能な変化は、オリゴヌクレオチド、ナノ粒子、またはその両方を、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと標的核酸とがハイブリダイズすると検出可能な変化を生成する分子（例えば、蛍光分子および染料）で標識することにより生じる。例えば、金属および半導体ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの、ナノ粒子に付着していない末端には、蛍光分子が付着され得る。金属および半導体ナノ粒子は、公知の蛍光消光物質であり、その消光効果の大きさは、ナノ粒子と蛍光分子との間隔に依存する。ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズしていない状態では、ナノ粒子と相互作用し、その結果、有意な消光が観察される。蛍光分子は、標的核酸とハイブリダイズすると、ナノ粒子から間隔が離れた状態になり、それによって、蛍光の消光が減少する。図２０Ａ参照。オリゴヌクレオチドが長くなるにつれ、少なくとも変化の増大がもはや観察し得ない程遠くに蛍光基がナノ粒子表面から離れて移動するまで、蛍光の変化は大きくなる筈である。オリゴヌクレオチドの有用な長さは経験的に決定し得る。蛍光標識オリゴヌクレオチドが付着している金属および半導体ナノ粒子は、溶液中または基板上で実施されるものを含めた上述のいずれのアッセイ形式にも用い得る。
オリゴヌクレオチドを蛍光分子で標識する方法および蛍光を測定する方法は当該技術分
野では周知である。適当な蛍光分子も当該技術分野では周知であり、それにはフルオレセイン、ローダミンおよびテキサスレッドが含まれる。オリゴヌクレオチドは上述のようにナノ粒子に付着するであろう。
さらに別の実施態様においては、２つの異なる粒子に付着している２つの種類の蛍光標識オリゴヌクレオチドを用い得る。適当な粒子としては、（ポリスチレン粒子、ポリビニル粒子、アクリレートおよびメタクリレート粒子などの）ポリマー粒子、ガラス粒子、ラテックス粒子、セファロースビーズおよび当該技術分野では周知の他の同様な粒子が挙げられる。そのような粒子にオリゴヌクレオチドを付着させる方法は当該技術分野では周知である。Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２４巻，３０３１−３０３９ページ（１９９６年）（ガラス）およびＣｈａｒｒｅｙｒｅら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１３巻，３１０３−３１１０ページ（１９９７年），Ｆａｈｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２１巻，１８１９−１８２６ページ（１９９３年），Ｅｌａｉｓｓａｒｉら，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．，第２０２巻，２５１−２６０ページ（１９９８年），Ｋｏｌａｒｏｖａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２０巻，１９６−１９８ページ（１９９６年）およびＷｏｌｆら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１５巻，２９１１−２９２６ページ（１９８７年）（ポリマー／ラテックス）参照。特に、多様な官能基がこれらの粒子上に対して利用可能であり、そのような粒子に組み込むことができる。官能基には、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基などがある。金属および半導体ナノ粒子を含めたナノ粒子を用いてもよい。
２種の発蛍光団は、供与体および受容体としてｄおよびａと称される。そのような組合せに有用な種々の蛍光分子は当該技術分野では周知であり、例えば、モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）から入手できる。魅力的な組合せは、供与体としてのフルオレセインと、受容体としてのテキサスレッドである。ｄおよびａが付着している２つの種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を標的核酸と混合し、蛍光光度計で蛍光を測定する。ｄを励起する波長の光で混合物を励起させ、混合物をａ由来の蛍光についてモニターする。ハイブリダイズすると、ｄとａは近接するであろう（図２０Ｂ参照）。非金属、非半導体粒子の場合、ハイブリダイゼーションは、蛍光がｄのものからａのものにシフトすること、またはａの蛍光に加えてｄの蛍光が出現することによって示されるであろう。ハイブリダイゼーションがない場合、発蛍光団は離れ過ぎていて有意なエネルギー伝達が起こらず、ｄの蛍光のみが観察されるであろう。金属および半導体ナノ粒子の場合、ハイブリダイゼーションの欠如は、ｄまたはａに帰因する消光による蛍光の欠如によって示されるであろう（上記参照）。ハイブリダイゼーションはａに帰因する蛍光の増大により示される。
受容体および供与体蛍光分子で標識されたオリゴヌクレオチドが付着している上述の粒子およびナノ粒子は、溶液中および基板上で実施されるものを含めた上述のアッセイ形式に使用し得る。溶液形式の場合、オリゴヌクレオチド配列は、図１５Ａ−Ｇに示されているように標的核酸に結合するように好ましくは選択する。図１３Ａ−Ｂおよび図１８に示されている形式では、結合オリゴヌクレオチドを使って、２つのナノ粒子上の受容体および供与体蛍光分子を近接させ得る。また、図１３Ａに示されている形式では、基板に付着しているオリゴヌクレオチドはｄで標識し得る。さらに、蛍光分子以外の他の標識、例えば、ハイブリダイズすると検出可能なシグナルを生成するかまたは検出可能なシグナルに変化をもたらす化学発光分子を用いてもよい。
本発明の検出法の別の実施態様は、（図２１に示されている）蛍光および変色の検出を利用する極めて感度の高い系である。この系は、蛍光分子で標識したオリゴヌクレオチドを付着させたラテックスミクロスフェアと、オリゴヌクレオチドを付着させた金ナノ粒子
とを用いる。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体は、上述のように調製し得る。オリゴヌクレオチドをラテックスミクロスフェアに付着させる方法（例えば、Ｃｈａｒｒｅｙｒｅら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１３巻，３１０３−３１１０ページ（１９９７年）；Ｅｌａｉｓｓａｒｉら，Ｊ．Ｃｌｌｏｉｏｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．，第２０２巻，２５１−２６０ページ（１９９８年）参照）は、オリゴヌクレオチドを蛍光分子で標識する方法（上記参照）と同様に周知である。ラテックスミクロスフェア上のオリゴヌクレオチドと金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の配列の異なる部分とハイブリダイズし得るが互いにはハイブリダイズし得ない配列を有している。ラテックスミクロスフェアおよび金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を含む標的核酸と２つのプローブを接触させると、網目構造が形成される（図２１参照）。金ナノ粒子の消光特性のために、ラテックスミクロスフェアに付着しているオリゴヌクレオチドの蛍光は、この網目構造の一部の間で消光される。実際、金ナノ粒子は極めて大きい吸収係数を有しているために、１つの金ナノ粒子が多くの発蛍光団分子を消光し得る。したがって、核酸および２種の粒子を含有する溶液の蛍光をモニターして結果を検出することが可能であり、蛍光の減少または排除は陽性結果を示す。しかし、アッセイ結果は、溶液の小滴を微孔質材料上に並べて検出するのが好ましい（図２１参照）。微孔質材料は、金ナノ粒子のピンク／赤色を検出できる透明またはカラー（例えば、白）でなければならない。また、微孔質材料は、微孔質材料を洗浄したときに、金ナノ粒子が細孔を通過し得る程大きく、かつ微孔質材料表面上のラテックスミクロスフェアを保持するのに十分な程小さい細孔サイズをも有していなければならない。したがって、そのような微孔質材料を用いる場合、ラテックスミクロスフェアのサイズ（直径）は、金ナノ粒子のサイズ（直径）より大きくなければならない。また、微孔質材料は生物媒体に対して不活性でなければならない。多くの適当な微孔質材料は当該技術分野では公知であり、そのような材料としては、種々のフィルターや膜、例えば、改質ポリフッ化ビニリデン（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）から市販されているＤｕｒａｐｏｒｅＴＭメンブレンフィルターなどのＰＶＤＦ）や、（ミクロン・セパレーションズ社（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）から市販されているＡｃｅｔａｔｅＰｌｕｓＴＭメンブレンフィルターなどの）純粋酢酸セルロースが挙げられる。そのような微孔質材料は、標的核酸と２種のプローブからなる網目構造を保持し、陽性結果（標的核酸の存在）は、（金ナノ粒子の存在に帰する）赤／ピンク色と、（金ナノ粒子による蛍光の消光に帰する）蛍光の欠如によって証明される（図２１参照）。陰性結果（標的核酸の不在）は、微孔質材料を洗浄したときに金ナノ粒子が微孔質材料の細孔を通過し（したがって、蛍光の消光が起こらない）、かつ白色ラテックスミクロスフェアがその上に捕捉されるために、白色および蛍光によって証明される（図２１参照）。さらに、陽性結果の場合、蛍光および変色は温度の関数として観察し得る。例えば、温度を上昇させて行くと、デハイブリダイゼーション温度に達すると同時に蛍光が観察されるであろう。したがって、温度の関数として色または蛍光を見れば、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との相補性の程度についての情報を得ることができる。上述のように、この検出法は高感度を示す。長さ２４塩基の３ｆｍｏｌ（フェムトモル）の一本鎖標的核酸と、長さ２４塩基の２０ｆｍｏｌの二本鎖標的核酸という少量が、肉眼で検出された。この方法は、その使用法も極めて簡単である。蛍光は、ただＵＶランプで溶液または微孔質材料を照明するだけで生成させることができ、蛍光シグナルおよび比色シグナルは肉眼でモニターし得る。代わりに、より定量的な結果を得るために、蛍光光度計を前面モード（ｆｒｏｎｔ−ｆａｃｅ ｍｏｄｅ）を用いて、短経路長で溶液の蛍光を測定してもよい。
上記実施態様は、特に、ラテックスミクロスフェアおよび金ナノ粒子に関連して説明した。これらの粒子の代わりに、上述の他の特性を有すると共にオリゴヌクレオチドを付着させ得る任意の他のミクロスフェアまたはナノ粒子を用いてもよい。多くの適当な粒子およびナノ粒子が、それらにオリゴヌクレオチドを付着させる方法と共に上述されている。さらに、他の測定可能な特性を有するミクロスフェアおよびナノ粒子も用い得る。例えば
、ポリマーを蛍光、色または電気化学的活性などの任意の所望特性を有するように改質し得るポリマー改質粒子およびナノ粒子を用いてもよい。Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２１巻，４６２−４６３ページ（１９９９年）（ポリマー改質金ナノ粒子）。また、磁性粒子、ポリマーコート磁性粒子、および半導体粒子も使用し得る。Ｃｈａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１６ページ（１９９８年）；Ｂｒｕｃｈｅｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１３ページ（１９９８年）；Ｋｏｌａｒｏｖａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第２０巻，１９６−１９８ページ（１９９６年）参照。
さらに別の実施態様において、蛍光分子で標識したオリゴヌクレオチドが付着している金属または半導体ナノ粒子を含む２つのプローブを用いる（図２２に示されている）。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体は、上述のように調製しかつ蛍光分子で標識し得る。２つの種類のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体上のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の配列の異なる部分とハイブリダイズし得るが互いにはハイブリダイズし得ない配列を有している。ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を含む標的核酸を２つのプローブと接触させると、網目構造が形成される（図２２参照）。金属または半導体ナノ粒子の消光特性のために、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの蛍光は、この網目構造の一部の間で消光される。したがって、核酸および２つのプローブを含有する溶液の蛍光をモニターして結果を検出することが可能であり、蛍光の減少または排除は陽性結果を示す。しかし、アッセイ結果は、溶液の小滴を微孔質材料上に並べて検出するのが好ましい（図２２参照）。微孔質材料は、洗浄したときに、ナノ粒子がその細孔を通過し得る程大きくかつその表面上に網目構造を保持するのに十分な程小さい細孔サイズを有していなければならない（図２２参照）。多くの適当な微孔質材料が当該技術分野では公知であり、そのような材料には上述のものが含まれる。そのような微孔質材料は、標的核酸と２つのプローブとからなる網目構造を保持し、陽性結果（標的核酸の存在）は、（金属または半導体ナノ粒子による蛍光の消光に起因する）蛍光の欠如によって証明される（図２２参照）。陰性結果（標的核酸の不在）は、微孔質材料を洗浄したときにナノ粒子が微孔質材料の細孔を通過する（したがって、蛍光の消光が起こらない）ために、蛍光によって証明される（図２２参照）。結合しなかったプローブが検出領域から洗い流されるので、バックグラウンド蛍光は低い。さらに、陽性結果の場合、蛍光の変化は温度の関数として観察され得る。例えば、温度を上昇させて行くと、デハイブリダイゼーション温度に達すると同時に蛍光が観察されるであろう。したがって、温度の関数として蛍光を見れば、オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との相補性度についての情報を得ることができる。蛍光は、ＵＶランプで溶液または微孔質材料を照明するだけで生成させることができ、蛍光シグナルは肉眼でモニターし得る。代わりに、より定量的な結果を得るために、蛍光光度計を前面モードで用いて、短経路長で溶液の蛍光を測定してもよい。
さらに別の実施態様では、「サテライトプローブ」を用いる（図２４参照）。サテライトプローブは、核酸用アッセイにおける検出に用い得る１種または数種の物性（例えば、濃色、蛍光消光能、磁性）を有する中心粒子を含んでいる。適当な粒子としては、ナノ粒子や上述の他の粒子などがある。粒子には、オリゴヌクレオチド（すべて同じ配列を有する）が付着している（図２４参照）。粒子にオリゴヌクレオチドを付着させる方法は上記に説明されている。オリゴヌクレオチドは、少なくとも第１部分と第２部分を含んでおり、これらの部分はどちらも標的核酸の配列の部分と相補的である（図２４参照）。サテライトプローブはさらに、プローブオリゴヌクレオチドを含んでいる。各プローブオリゴヌクレオチドは、少なくとも第１部分と第２部分を有している（図２４参照）。プローブオリゴヌクレオチドの第１部分の配列は、中心粒子上に固定化されているオリゴヌクレオチドの第１部分の配列と相補的である（図２４参照）。その結果、中心粒子とプローブオリゴヌクレオチドとを接触させると、中心粒子上のオリゴヌクレオチドは、プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしてサテライトプローブを形成する（図２４参照）。プロ
ーブオリゴヌクレオチドの第１および第２部分は共に、標的核酸の配列の部分と相補的である（図２４参照）。各プローブオリゴヌクレオチドは、以下に詳細に説明するように、レポーター分子で標識されている（図２４参照）。プローブオリゴヌクレオチドと標的との間のハイブリダイゼーションオーバーラップの量（ハイブリダイズしている部分の長さ）は、プローブオリゴヌクレオチドと粒子に付着しているオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションオーバーラップと同じかそれより大きい（図２４参照）。したがって、デハイブリダイゼーションおよびリハイブリダイゼーションをもたらす温度循環により、プローブオリゴヌクレオチドの中心粒子から標的への移動が促進される。次いで、標的にハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチドから粒子を分離し、レポーター分子を検出する。
サテライトプローブは種々の検出法に用い得る。例えば、中心粒子が磁性コアを有し、かつ周囲のプローブオリゴヌクレオチドに付着している発蛍光団の蛍光を消光し得る材料で被覆されている場合、この系は、核酸用のｉｎ ｓｉｔｕ蛍光光度検出計画に用い得る。官能化ポリマーコート磁性粒子（Ｆｅ３Ｏ４）は、ディナール社（Ｄｙｎａｌ）（ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）およびバングス・ラボラトリーズ社（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＥｓｔａｐｏｒＴＭ）を含めたいくつかの調製業者から入手可能であり、シリカコート磁性Ｆｅ３Ｏ４ナノ粒子は、十分に開発されたシリカ表面化学（Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２４巻，３０３１−３０３９ページ（１９９６年））を用いて改質し（Ｌｉｕら，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，第１０巻，３９３６−３９４０ページ（１９９８年）、磁性プローブとしても用い得る。さらに、染料分子、４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）−アゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は、オリゴヌクレオチドに付加された多様な発蛍光団に対して有能な蛍光消光物質であることが証明されている（Ｔｙａｇｉら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，第１６巻，４９−５３ページ（１９９８年））。市販のＤＡＢＣＹＬスクシンイミジルエステル（分子プローブ）は、第一級アルキルアミノ基と反応すると極めて安定なアミド結合を形成する。このように、任意の磁性粒子または第一級アルキルアミノ基でポリマーコートされた磁性粒子は、両オリゴヌクレオチドに加えてこれらの消光物質分子を用いて改質し得る。あるいは、ＤＡＢＣＹＬ消光物質は、アルキルアミノ改質表面の代わりに、表面結合オリゴヌクレオチドに直接付着させてもよい。プローブオリゴヌクレオチドを含むサテライトプローブを標的と接触させる。デハイブリダイゼーションおよび再ハイブリダイゼーションを起こすように温度を循環させ、それによって、プローブオリゴヌクレオチドを中心粒子から標的に移動させる。磁場を印加、粒子を溶液から除去し、標的にハイブリダイズした溶液中に残留するプローブオリゴヌクレオチドの蛍光を測定することにより検出が達成される。
この方法は、染料コーティングを有する磁性粒子と共に、磁気ナノ粒子上の染料とは異なる光学特性を有するか、または磁気ナノ粒子上の染料の光学特性を摂動させる染料で標識したプローブオリゴヌクレオチドを用いて比色アッセイにも応用することができる。粒子およびプローブオリゴヌクレオチドが共に溶液中に存在する場合、この溶液は、２種の染料の組合せに由来する１つの色を呈するであろう。しかし、標的核酸の存在下に温度を循環させると、プローブオリゴヌクレオチドは、サテライトプローブから標的に移動するであろう。一旦これが起こると、磁場の印加により、標的にハイブリダイズした、単一染料で標識されたプローブオリゴヌクレオチドを残して、染料コート磁性粒子が溶液から除去される。この系は、標的レベルまたは色の濃さに応じて、比色計または肉眼で追うことができる。
また、この方法は、オリゴヌクレオチド−磁性粒子共役体と共に、レドックス活性分子が付着しているプローブオリゴヌクレオチドを用いることにより、電気化学アッセイにも応用することもできる。十分に研究が進んだレドックス活性フェロセン誘導体などの任意
の改質可能なレドックス活性種を用い得る。標準ホスホロアミダイト化学を用いて、フェロセン誘導体化ホスホロアミダイトを直接オリゴヌクレオチドに付着させることができる。Ｍｕｃｉｃら，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，第５５５巻（１９９６年）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，第１版，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９１年）。フェロセニルホスホロアミダイトは、６−ブロモヘキシルフェロセンから２段階合成法で調製する。通常の調製においては、６−ブロモヘキシルフェロセンを水性ＨＭＰＡ溶液中１２０℃で６時間攪拌して、６−ヒドロキシヘキシルフェロセンを生成する。精製後、６−ヒドロキシヘキシルフェロセンをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンおよびβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミドのＴＨＦ溶液に加えてフェロセニルホスホロアミダイトを生成する。ポリマーが電気化学活性フェロセン分子を含有するオリゴヌクレオチド改質ポリマーコート金ナノ粒子を利用してもよい。Ｗａｔｓｏｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２１巻，４６２−４６３ページ（１９９９年）。アミノ修飾オリゴヌクレオチドと反応させるために、このポリマーにアミノ反応性部位のコポリマー（例えば、無水物）を組み込んでもよい。Ｍｏｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，第６巻，１７４−１７８ページ（１９９５年）。標的の存在下に温度を循環させると、レドックス活性プローブオリゴヌクレオチドは、サテライトプローブから標的に移動するであろう。一旦これが起こると、磁場の印加により、標的核酸にハイブリダイズしたレドックス活性プローブオリゴヌクレオチドを残して、磁性粒子が溶液から除去されるであろう。次いで、レッドクス活性分子を調べることができるサイクリックボルタンメトリーまたは任意の電気化学的技術により標的の量を定量し得る。
本発明のさらに別の実施態様において、核酸は、核酸とオリゴヌクレオチドが付着している基板とを接触させて検出する。オリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。オリゴヌクレオチドは、基板上に配置されている１対の電極間に配置されている。基板は、導電体ではない材料（例えば、ガラス、石英、ポリマー、プラスチック）製でなければならない。電極は、任意の標準材料（例えば、金、白金、酸化スズなどの金属）製であってよい。電極は、慣用のミクロファブリケーション技術を用いて作製することができる。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ（Ｌ．Ｆ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎら編，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８３年）参照。基板の上には、単一の核酸の多重部分、複数の異なる核酸、またはその両方を検出できるように複数の電極対をアレイ状に配置し得る。電極アレイは、（例えば、アブテック・サイエンティフィック社、バージニア州リッチモンド所在（Ａｂｂｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から）購入することもできるし、慣用のミクロファブリケーション技術を用いて作製することもできる。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｏ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ（Ｌ．Ｆ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎら編，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９８３年）参照。アレイを作製するのに適したフォトマスクは、（例えば、フォトロニクス社、カリフォルニア州ミルピタス所在（Ｐｈｏｔｒｏｎｉｃｓ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）から）購入し得る。各アレイ電極対は、２つの電極間で基板に付着したある種類のオリゴヌクレオチドを有している。接触ステップは、基板上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。次いで、基板に結合した核酸をある種類のナノ粒子と接触させる。ナノ粒子は導電性でなければならない。そのようなナノ粒子としては、金ナノ粒子のように金属でできたナノ粒子や、半導体材料製でできたナノ粒子が含まれる。ナノ粒子には、少なくとも１種類のオリゴヌクレオチドが核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有する、１つ以上の種類のオリゴヌクレオチドが付着しているであろう。接触ステップは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。核酸が存在する場合、電極間の回路は、ナノ粒子が基板の電極間に付着するために閉鎖するはずであり、導電率の変化が検出される。１種類のナノ粒子が結合すると、回路の閉鎖は起こらず、この状況は、もっと狭い電極間間隔
を用いるか、もっと大きいナノ粒子を用いるか、または回路を閉鎖する別の材料を用いる（但し、ナノ粒子が基板の電極間に結合した場合のみ）ことにより対応し得る。例えば、金ナノ粒子を用いる場合、基板を（上述のように）銀染料と接触させて銀を電極間に堆積させることにより回路を閉鎖し、導電率の検出可能な変化を生成させる。１種類のナノ粒子の付加が十分ではない場合に回路を閉鎖させる別の方法は、基板に結合している第１種類のナノ粒子を、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子と接触させる方法である。接触ステップは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるのに有効な条件下に行う。必要または所望なら、回路の閉鎖に十分な数のナノ粒子が基板に付着するまで、第１および第２種類のナノ粒子を交互に加えて、追加のナノ粒子層を堆積することができる。個々のナノ粒子層を堆積する別の代替法は、凝集体プローブの使用である（上記参照）。
本明細書中で論じるように、回路を閉じることによって電極間の電気的接触を確立することが当分野で知られている任意の他の材料、例えば、銀、金、他の電導性材料、または電気を通しうる材料の局所的増大を触媒し得る任意のスキームもしくは材料などを使用してよい。閉回路の存在は、伝導率の検出可能な変化など、電極の電気特性の変化等の任意の適切な手段によって検出することが可能である。
本発明はさらに、核酸を検出するためのキットも提供する。キットは、１つの実施態様において、少なくとも１つの容器を含み、この容器は、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を保持している。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。容器はさらに、核酸の第３部分に対して相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドを含むこともあり、この第３部分は、第１部分と第２部分の間に配置されている。フィラーオリゴヌクレオチドは別個の容器中に入れておいてもよい。
第２の実施態様において、キットは少なくとも２つの容器を含む。第１容器は、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を保持している。第２容器は、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を保持している。キットはさらに、核酸の第３部分に対して相補的な配列を有するフィラーオリゴヌクレオチドが入った第３容器を含むこともあり、第３部分は第１部分と第２部分の間に配置されている。
別の代替実施態様において、キットは、別々の容器に入ったオリゴヌクレオチドとナノ粒子を有し、オリゴヌクレオチドは核酸検出アッセイの実施前にナノ粒子に付着させる必要がある。オリゴヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、オリゴヌクレオチドがナノ粒子に付着し得るように官能化させ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、キット中に官能基を有さない状態で供給してもよいが、その場合、オリゴヌクレオチドはアッセイの実施前に官能化しなければならない。
別の実施態様において、キットは、少なくとも１つの容器を含む。容器は、オリゴヌクレオチドが付着している金属または半導体ナノ粒子を保持している。オリゴヌクレオチドは核酸の一部に対して相補的な配列を有しており、オリゴヌクレオチドのナノ粒子には付着していない末端には蛍光分子が付着している。
さらに別の実施態様において、キットは基板を含み、基板にはナノ粒子が付着している。ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはさらに、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、同一または異なる配列を有していてよいが、各オリゴヌクレオチドは、核酸の一部に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、少なくとも２つの部分を含む選択された配列を有する結合オリゴヌクレオチドが入った第２容器を含んでおり、選択配列の第１部分は、第１容器中のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部と相補的である。また、キットは、結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第３容器を含む。
別の実施態様において、キットは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している基板を含んでいる。キットはさらに、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、同一または異なる配列を有していてよいが、各オリゴヌクレオチドは核酸の一部に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、第１容器中のナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第２容器を含んでいる。
さらに別の実施態様において、キットは、別々の容器に入った基板、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子を有していてよい。基板、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子は、核酸検出アッセイを実施する前に互いに適切に付着させなければならない。基板、オリゴヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、この付着を促進するために官能化し得る。あるいは、基板、オリゴヌクレオチドおよび／またはナノ粒子は、キット中に官能基を有さない状態で提供してもよいが、その場合、アッセイ実施前に官能化しなければならない。
さらなる実施態様において、キットは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している基板を含んでいる。また、キットは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着しているリポソームが入った第１容器と、少なくとも第１種類のオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第２容器を含んでおり、第１種類のオリゴヌクレオチドのナノ粒子に付着していない末端には、ナノ粒子が疎水性相互作用によりリポソームに付着し得るように、コレステリル基が付着されている。キットは、さらに、オリゴヌクレオチドが付着している第２種類のナノ粒子が入った第３容器を含んでおり、オリゴヌクレオチドは第１種類のナノ粒子に付着している第２種類のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を有している。第１種類のナノ粒子に付着している第２種類のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を有している。
別の実施態様において、キットは、ナノ粒子が付着している基板を含み得る。ナノ粒子には、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはさらに、凝集体プローブが入った第１容器を含んでいる。凝集したプローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
さらに別の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している基板を含み得る。オリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、凝集体プローブが入った第１容器を含んでいる。凝集体プローブは
、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
追加実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している基板と、凝集体プローブが入った第１容器とを含んでいる。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、核酸配列の第１部分に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。キットはさらに、ナノ粒子が入った第２容器を含んでいる。ナノ粒子には、少なくとも２種類のオリゴヌクレオチドが付着している。第１種類のオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。第２種類のオリゴヌクレオチドは、基板に付着しているオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を有している。
別の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している基板を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着しているリポソームが入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含む凝集体プローブが入った第２容器を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、ナノ粒子に付着していない末端に疎水基が付いたオリゴヌクレオチドが付着している。
さらなる実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子が入った第１容器を含み得る。キットはさらに、１つ以上の追加の容器を含んでおり、各容器は、結合オリゴヌクレオチドを保持している。各結合オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列の少なくとも一部に対して相補的な配列を有する第１部分と、検出すべき核酸の一部の配列に対して相補的な配列を有する第２部分とを有している。結合オリゴヌクレオチドの第２部分の配列は、各配列が検出すべき核酸の配列の一部と相補的である限り異なっていてもよい。別の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している１つの種類のナノ粒子と、１つ以上の種類の結合オリゴヌクレオチドとが入った容器を含んでいる。各種類の結合オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つの部分を含む配列を有している。第１部分は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列と相補的であり、それによって結合オリゴヌクレオチドは、容器中のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。第２部分は、核酸の一部の配列と相補的である。
別の実施態様において、キットは、２つの種類の粒子が入った１つ以上の容器を含み得る。第１種類の粒子には、核酸の第１部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。オリゴヌクレオチドの粒子に付着していない方の末端はエネルギー供与体で標識されている。第２種類の粒子には、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。オリゴヌクレオチドの粒子に付着していない方の末端はエネルギー受容体で標識されている。エネルギー供与体および受容体は蛍光分子であってよい。
さらなる実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着しているある種類のラテックスミクロスフェアが入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、核酸
の第１部分の配列に対して相補的な配列を有しており、蛍光分子で標識されている。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着しているある種類の金ナノ粒子が入った第２容器を含んでいる。これらのオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有している。
別の実施態様において、キットは、オリゴヌクレオチドが付着している第１種類の金属または半導体ナノ粒子が入った第１容器を含んでいる。オリゴヌクレオチドは、核酸の配列の第１部分に対して相補的な配列を有し、蛍光分子で標識されている。キットはさらに、オリゴヌクレオチドが付着している第２種類の金属または半導体ナノ粒子が入った第２容器を含んでいる。これらのオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分の配列に対して相補的な配列を有しており、蛍光分子で標識されている。
さらなる実施態様において、キットは、サテライトプローブが入った容器を含んでいる。サテライトプローブは、オリゴヌクレオチドが付着している粒子を含んでいる。オリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有しており、どちらの部分も核酸の配列の一部に対して相補的な配列を有している。サテライトプローブはさらに、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチドを含んでいる。プローブオリゴヌクレオチドは第１部分と第２部分を有している。第１部分は、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドの第１部分の配列に対して相補的な配列を有しており、両部分とも、核酸の配列の一部に対して相補的な配列を有している。また、プローブオリゴヌクレオチドの一方の末端には、レポーター分子が付着している。
別の実施態様において、キットは、凝集体プローブが入った容器を含んでいる。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、核酸の配列の一部に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している。
追加実施態様において、キットは、凝集体プローブが入った容器を含み得る。凝集体プローブは、オリゴヌクレオチドが付着している少なくとも２種類のナノ粒子を含んでいる。凝集体プローブのナノ粒子は、それぞれに付着しているオリゴヌクレオチドの一部がハイブリダイズした結果として互いに結合している。凝集体プローブの少なくとも１種類のナノ粒子には、ナノ粒子に付着していない方の末端に疎水基が付いたオリゴヌクレオチドが付着している。
さらに別の実施態様において、本発明は、基板の電極間にオリゴヌクレオチドが付着された、少なくとも１対の電極が配置されている基板を含む。好ましい実施態様において、基板には、単一核酸の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出またはその両方を可能にするように、複数の電極対がアレイ状に付着されている。
キットはさらに、核酸の検出に有用な他の試薬および品目を含み得る。試薬には、ＰＣＲ試薬、銀染色法用試薬、ハイブリダイゼーション試薬、緩衝剤などが含まれ得る。キットの一部として提供され得る他の品目には、ＴＬＣシリカプレートなどの（ハイブリダイゼーションを視覚化するための）固体表面、微孔質材料、シリンジ、ピペット、キュベット、容器、および（ハイブリダイゼーションおよびデハイブリダイゼーション温度を制御するための）サーモサイクラーが含まれる。キットには、ヌクレオチドまたはナノ粒子を官能化する試薬を含めてもよい。
凝集したナノ粒子の沈殿は、選択された核酸を他の核酸から分離する手段を提供する。
この分離は、核酸精製における１ステップとして用い得る。ハイブリダイゼーション条件は核酸検出に関して上述したとおりである。ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを核酸に結合させる温度がＴｍ（オリゴヌクレオチドの半分をその相補鎖に結合させる温度）より低い場合、凝集体を沈殿させるのに十分な時間が必要である。（例えば、Ｔｍにより測定した）ハイブリダイゼーション温度は、塩の種類（ＮａＣｌまたはＭｇＣｌ２）およびその濃度に応じて異なる。塩の組成および濃度は、核酸の不在下にコロイドの凝集を誘発させることなく都合の良い作業温度でナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブリダイゼーションを促進するように選択される。
本発明はさらに、ナノファブリケーション法を提供する。この方法は、選択された配列を有する少なくとも１種類の連結オリゴヌクレオチドを用意するステップを含む。ナノファブリケーションに用いられる連結オリゴヌクレオチドは、任意の所望配列を含んでいてよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。連結オリゴヌクレオチドはさらに、塩基、糖、または主鎖部分に化学修飾を含み得る。連結オリゴヌクレオチド用に選択される配列や、それらの長さおよび鎖の数は、得られるナノ材料もしくはナノ構造、またはナノ材料もしくはナノ構造の部分の剛性もしくは可撓性に寄与するであろう。単１種類の連結オリゴヌクレオチドに加えて、２つ以上の異なる種類の連結オリゴヌクレオチドを用いることも考えられる。異なる連結オリゴヌクレオチドの使用数およびそれらの長さは、得られるナノ材料およびナノ構造の形状、細孔サイズおよび他の構造的特徴に寄与するであろう。
連結オリゴヌクレオチドの配列は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに結合させるための第１部分と第２部分を有するであろう。連結オリゴヌクレオチドの第１、第２またはそれ以上の結合部分は、同一または異なる配列を有し得る。
連結オリゴヌクレオチドの結合部分がすべて同じ配列を有している場合、ナノ材料またはナノ構造の形成には、相補的配列を有するオリゴヌクレオチドが付着している単１種類のナノ粒子だけしか使わなくてよい。連結オリゴヌクレオチドの２つ以上の結合部分が異なる配列を有している場合、２つ以上のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を使わなければならない。例えば、図１７参照。各ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、連結オリゴヌクレオチドの配列の２つ以上の結合部分の１つに対して相補的な配列を有しているであろう。結合部分の数、配列および長さと、もしあれば、それらの間の間隔は、得られるナノ材料およびナノ構造の構造特性および物性に寄与するであろう。連結オリゴヌクレオチドが２つの以上の部分を含む場合、結合部分の配列は、結合ヌクレオチドの１つの部分を別の部分に結合するのを回避するために互いに対して相補的でないように選択する必要がある。
連結オリゴヌクレオチドとナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタを介して纏まっている所望のナノ材料またはナノ構造が形成されるように、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと連結オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。これらのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野では周知であり、特定のナノファブリケーション計画に合わせて最適化し得る（上記参照）。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が好ましい。
さらに本発明は別のナノファブリケーション法を提供する。この方法は、少なくとも２種類のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を与えるステップを含む。第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を有している。第２種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、第１種類のナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの配列に対して相補的な配列を有している。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、ナノ粒子がオリゴヌクレオチドコネクタを介して纏まっ
ている所望のナノ材料またはナノ構造が形成されるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせるのに有効な条件下に接触させる。この場合も、これらのハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野では周知であり、特定のナノファブリケーション計画に合わせて最適化し得る。
本発明のどちらのナノファブリケーション法においても、１つ以上の異なる種類のオリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子の使用が想定される。ナノ粒子に付着している異なるオリゴヌクレオチドの数や、１つ以上のオリゴヌクレオチドの長さおよび配列は、得られるナノ材料およびナノ構造の剛性および構造特徴に寄与するであろう。
また、ナノ粒子のサイズ、形状および化学組成も、得られるナノ材料およびナノ構造の特性に寄与するであろう。これらの特性には、光学特性、光電子特性、電気化学特性、電子特性、種々の溶液中での安定性、細孔およびチャンネルサイズの変化、フィルターとしての役割を果たす間の生物活性分子の分離能などが含まれる。異なるサイズ、形状および／または化学組成を有するナノ粒子混合物の使用に加えて、均一なサイズ、形状および化学組成を有するナノ粒子の使用も想定される。
いずれのファブリケーション法においても、得られるナノ材料またはナノ構造中のナノ粒子は、オリゴヌクレオチドコネクタを介して結合する。オリゴヌクレオチドコネクタの配列、長さおよび鎖の数や、存在する異なるオリゴヌクレオチドコネクタの数は、ナノ材料またはナノ構造の剛性および構造特性に寄与するであろう。オリゴヌクレオチドコネクタが部分的に二本鎖である場合、その剛性は、核酸検出法に関連して上述したフィラーオリゴヌクレオチドを用いることによって増強し得る。完全二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタの剛性は、完全二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタに結合して三本鎖オリゴにコネクタを形成するように相補的配列を有する１つ以上の強化オリゴヌクレオチドを用いて増強し得る。デオキシクアノシン（ｄｅｏｘｙｑｕａｎｏｓｉｎｅ）またはデオキシシチジン四重鎖をベースとする四本鎖オリゴヌクレオチドコネクタの使用も想定される。
オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに基づいてナノ粒子を組織化するための様々な系のいくつかが図面に示されている。単純な系（図１）では、一方のナノ粒子セットは規定配列を有するオリゴヌクレオチドを有し、別のナノ粒子セットはそれに相補的配列を有するオリゴヌクレオチドを有している。２種のナノ粒子−オリゴヌクレオチドセットをハイブリダイゼーション条件下に混合すると、２つの種類のナノ粒子が、ナノ粒子を選択された間隔で配置するスペーサーとしての働きをする二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタを介して結合する。
ナノ粒子を間隔を置いて配置するための魅力的な系は、図２に示されているような１つの自由連結オリゴヌクレオチドの添加を伴う。この連結オリゴヌクレオチドの配列は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドに結合させるための少なくとも第１部分と第２部分を有するであろう。この系は、基本的には核酸検出法に利用されるものと同じであるが、但し、添加される連結オリゴヌクレオチドの長さは、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドを合わせた長さに等しくなるように選択し得る。図３に示されている関連系は、用いられるナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体セットを変更する必要なく、ナノ粒子間の間隔を要求通りに調節する便利な手段を提供する。
ナノ粒子間に規定間隔を創出するためのさらに精巧な計画が図４に示されている。この場合、オーバーハング末端を含むＤＮＡまたはＲＮＡの二本鎖セグメントが連結オリゴヌクレオチドとして用いられている。連結オリゴヌクレオチドの一本鎖オーバーハングセグメントとナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、ナノ粒子間に多重二本鎖オリゴヌクレオチド架橋が得られる。
より剛性のナノ材料およびナノ構造またはその部分は、ナノ粒子間に三本鎖オリゴヌクレオチドコネクタを用いることによって調製し得る。三本鎖を生成させる際には、ピリミジン：プリン：ピリミジンモチーフ（Ｍｏｓｅｒ，Ｈ．Ｅ．およびＤｅｒｖａｎ，Ｐ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２３８巻，６４５−６５０ページ（１９８７））またはプリン：プリン：ピリミジンモチーフ（Ｐｉｌｃｈ，Ｄ．Ｓ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３０巻，６０８１−６０８７ページ（１９９１年））のいずれかを利用し得る。ピリミジン：プリン：ピリミジンモチーフを用いた三本鎖コネクタの調製によるナノ粒子組織化の１つの例が図１０に示されている。図１０に示されている系において、１つのナノ粒子セットをピリミジンヌクレオチドを含む規定鎖と結合させ、他のセットをプリンヌクレオチドを含む相補的オリゴヌクレオチドと結合させる。オリゴヌクレオチドの付着は、ナノ粒子がハイブリダイゼーション時に形成された二本鎖オリゴヌクレオチドによって分離されるように設計する。次いで、この系に、ナノ粒子を混合する前、混合と同時、または混合直後に、ナノ粒子に結合しているピリミジン鎖の配向と反対配向の自由ピリミジンオリゴヌクレオチドを加える。この系中の第３の鎖は、フーグスティーン型塩基対を介して保持されているので、三本鎖は比較的熱に不安定である。二本鎖の幅にわたる共有結合架橋は三本鎖複合体を安定化することが知られている（Ｓａｌｕｎｋｅ，Ｍ．，Ｗｕ，Ｔ．，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１４巻，８７６８−８７７２ページ（１９９２年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．およびＷｕ，ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１７巻，７３２３−７３２８ページ（１９９５年）；Ｐｒａｋａｓｈ，Ｇ．およびＫｏｏｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１４巻，３５２３−３５２７ページ（１９９２年））。
ナノ材料およびナノ構造を構築するためには、オリゴヌクレオチド成分のハイブリダイゼーションによるナノ材料またはナノ構造の形成後に、集合体を共有結合架橋により適切な場所で「ロック」するのが望ましい場合がある。これは、オリゴヌクレオチドに、不可逆反応を始動させる官能基を組み込むことによって達成し得る。このための官能基の１つの例は、スチルベンジカルボン酸基である。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド内で整列している２つのスチルベンジカルボキサミド基に紫外光（３４０ｎｍ）を照射すると容易に架橋が達成されることが証明された（Ｌｅｗｉｓ，Ｆ．Ｄ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１７巻，８７８５−８７９２ページ（１９９５年））。
代わりに、メルカプトアルキル基を介してナノ粒子の３′位に保持されているオリゴヌクレオチドの５′−Ｏ−トシル基を、メルカプトアルキル基を介してナノ粒子に保持されているオリゴヌクレオチドの３′末端のチオホスホリル基で、置換する方法を用いてもよい。両オリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、それによってチオホスホリル基をトシル基に近接させるオリゴヌクレオチドの存在下では、トシル基はチオホスホリル基で置換され、両末端が２つの異なるナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドが生成する。この種類の置換反応に関しては、Ｈｅｒｒｌｅｉｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１７７巻，１０１５１−１０１５２ページ（１９９５年）を参照されたい。チオホスホリルオリゴヌクレオチドが、メルカプトアルキル−オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への付着に用いられる条件下では金ナノ粒子と反応しないという事実から、メルカプト基を介してナノ粒子に結合し、カップリング反応に利用できる末端チオホスホリル基を含む金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の調製が可能になる。
集合したナノ粒子系を適切な場所でロックするための関連カップリング反応は、ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１５巻，３８０８ページに記載のように、末端ブロモアセチルアミノヌクレオシドのブロミドの末端チオホスホリル−オリゴヌクレオチドによる置換を利用する。この反応は、上述のトシラートの置換と同じように進行するが、反応速度がもっと速い。チオホスホリル基を末端基
とするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子は上述のように調製する。ブロモアセチルアミノ基を末端基とするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子を調製するためには、先ず、一方の末端がアミノヌクレオシド（例えば、５′−アミノ−５′−デオキシチミジンまたは３′−アミノ−３′−デオキシチミジン）を末端基とし、他方の末端がメルカプトアルキル基を末端基とするオリゴヌクレオチドを作製する。次いで、このオリゴヌクレオチド分子をメルカプト基を介してナノ粒子に固定し、次いで、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体をブロモアセチルアシル化剤と反応させてＮ−ブロモアセチルアミノ誘導体に転化させる。
集合体を適切な場所でロックするための第４のカップリング計画は、チオホスホリル基を末端基とするオリゴヌクレオチドを担持するナノ粒子の酸化を利用する。三ヨウ化カリウム、フェリシアン化カリウム（ＧｒｙａｚｎｏｖおよびＬｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２１巻，１４０３ページ）または酸素などの穏和な酸化剤が好ましい。
さらに、ナノ材料およびナノ構造の特性は、連続オリゴヌクレオチド鎖に、オリゴヌクレオチド鎖に共有結合付加されて適切な場所に保持された有機および無機官能基を組み込むことにより変性させ得る。多様な主鎖、塩基および糖修飾が周知である（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．およびＰｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，第９０巻，５４４−５８４ページ（１９９０年）参照）。また、オリゴヌクレオチド鎖は、ヌクレオチド塩基がポリペプチド主鎖によって保持されている「ペプチド核酸」鎖（ＰＮＡ）で置換し得る（Ｗｉｔｔｕｎｇ，Ｐ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，第３６７巻，５６１−５６３ページ（１９９４年）参照）。
上記から分るように、本発明のナノファブリケーション法は極めて用途が広い。連結オリゴヌクレオチドの長さ、配列および鎖の数や、ナノ粒子に付着させるオリゴヌクレオチドの長さ、配列および数、ナノ粒子のサイズ、形状および化学組成、用いられる異なる連結オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子の数および種類、オリゴヌクレオチドコネクタの鎖の数を変えることにより、多岐にわたる構造および特性を有するナノ材料およびナノ構造を調製することができる。これらの構造および特性は、オリゴヌクレオチドコネクタを架橋したり、オリゴヌクレオチドを官能化したり、オリゴヌクレオチドの主鎖、塩基または糖を修飾したり、またはペプチド核酸を用いたりしてさらに変えることができる。
本発明のナノファブリケーション法によって調製し得るナノ材料およびナノ構造には、ナノスケール機械装置、分離膜、バイオフィルターおよびバイオチップなどがある。本発明のナノ材料およびナノ構造は、化学センサーとして、コンピュータに、薬剤送出用に、タンパク質工学用に、また、生合成／ナノ構造ファブリケーション／他の構造の指定集合体の鋳型として、使用可能であると想定される。他の可能な用途に関しては、一般に、Ｓｅｅｍａｎら，Ｎｅｗ Ｊ．Ｃｈｅｍ．，第１７巻，７３９ページ（１９９３年）を参照されたい。本発明のナノファブリケーション法によって調製し得るナノ材料およびナノ構造としてはさらに電子デバイスを挙げることができる。核酸が電子を移動させ得るかどうかについてはかなり議論されてきた。以下の実施例２１に示されているように、ＤＮＡを介して集合したナノ粒子は電気を伝導する（ＤＮＡコネクタは半導体として機能する）。
最後に、本発明は、いくつかの独特なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体調製法を提供する。最初のそのような方法において、オリゴヌクレオチドを荷電ナノ粒子に結合させて安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成する。荷電ナノ粒子には、金ナノ粒子などの金属製ナノ粒子が含まれる。
上記方法は、ナノ粒子に結合し得る官能基を含む部分が共有結合しているオリゴヌクレ
オチドを用意するステップを含む。そのような部分と官能基は、オリゴヌクレオチドとナノ粒子との結合（すなわち、化学吸着または共有結合）に関して上述したものである。例えば、５′または３′末端にアルカンチオール、アルカンジスルフィド、または環式ジスルフィドが共有結合しているオリゴヌクレオチドを、金ナノ粒子を含めた種々のナノ粒子に結合させることができる。
水中でオリゴヌクレオチドとナノ粒子とを、少なくとも一部のオリゴヌクレオチドを官能基を介してナノ粒子に結合させるのに十分な時間接触させる。そのような時間は経験的に決定し得る。例えば、約１２〜２４時間で良好な結果が得られることが判明した。他の適当なオリゴヌクレオチド結合条件も経験的に決定し得る。例えば、約１２〜２０ｎＭのナノ粒子濃度および室温下のインキュベーションによって良好な結果が得られる。
次いで、少なくとも１種の塩を水に添加して塩溶液をつくる。塩は任意の水溶性塩であってよい。例えば、塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、２種以上のこれらの塩の組合せ、またはリン酸緩衝液中のこれらの塩の１種であってよい。塩は、濃縮溶液として添加するのが好ましいが、固体として添加してもよい。塩は、水に一度に添加してもよいし、経時的に漸進的に添加してもよい。「経時的に漸進的に」とは、塩を少なくとも２つの部分に分けて一定の時間間隔を置いて添加することを意味する。適当な時間間隔は経験的に決定し得る。
塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチドの互いからの静電斥力と、正に帯電したナノ粒子に対する負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電引力、または負に帯電したナノ粒子からの負に帯電したオリゴヌクレオチドの静電斥力とを少なくとも部分的に克服するのに十分でなければならない。経時的に漸進的に塩を添加することにより静電引力および静電斥力を漸進的に減少させると、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が最も高くなることが判明した。各塩または塩の組合せに適したイオン強度は経験的に決定し得る。塩化ナトリウムの濃度は経時的に漸進的に増大させるのが好ましく、リン酸緩衝液中約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの塩化ナトリウム最終濃度が良好な結果を生じることが判明した。
塩を添加した後、塩溶液中で、オリゴヌクレオチドとナノ粒子を、追加のオリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させて安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を生成するのに十分な追加時間インキュベートする。以下に詳細に説明するように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が増加すると、共役体が安定化することが判明した。このインキュベーションの時間は経験的に決定し得る。合計約２４〜４８（好ましくは４０時間）のインキュベーション時間で良好な結果が得られることが分った（これは、合計インキュベーション時間である。上述のように、塩濃度は、この合計時間にわたって漸進的に増大させ得る）。塩溶液中でのこの第２インキュベーション時間は、本明細書では「熟成」ステップと称する。この「熟成」ステップに適した他の条件は経験的に決定し得る。例えば、室温下のインキュベーションおよびｐＨ７．０で良好な結果が得られる。
「熟成」ステップを用いて生成した共役体は、「熟成」ステップを用いずに生成したものよりかなり安定度が高いことが分った。上述のように、この安定性の向上は、「熟成」ステップによって達成されるナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチド密度の増加によるものである。「熟成」ステップにより達成される表面密度は、ナノ粒子のサイズおよび種類、ならびにオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存するであろう。ナノ粒子を安定化するのに適した表面密度および所望のナノ粒子とオリゴヌクレオチドの組合せを得るのに必要な条件は、経験的に決定し得る。一般に、安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を得るためには、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２の表面密度が適当であろう。表面密度は少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２が好ましい。共役体のオリゴヌクレオチドが核
酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする能力は表面密度が高すぎると低下するので、表面密度は約３５〜４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以下が好ましい。
本明細書に使用する場合、「安定な」とは、共役体生成後少なくとも６ヶ月間に、大多数のオリゴヌクレオチドがナノ粒子に付着したままであり、オリゴヌクレオチドが、核酸検出法およびナノファブリケーション法において遭遇する標準条件下に核酸およびオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズし得ることを意味する。
この方法で調製されたナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、それらの安定性の他に、他の優れた特性を示す。例えば、本願の実施例５、７および１９を参照されたい。特に、共役体の表面密度が高いため、共役体は、標的核酸またはオリゴヌクレオチドの存在下では、大きな凝集体として集合するであろう。凝集体が生成し、解離する温度範囲は予想外に極めて狭いことが判明したが、この固有の特徴は、重要な実用的成果をもたらす。特に、これは、本発明の検出法の選択性および感度を高める。この共役体を用いて、１塩基誤対合および２０ｆｍｏｌ程度の小さい標的を検出することができる。これらの特徴はもともとは溶液中で実施したアッセイで発見されたものであるが、これらの共役体を用いることの利点は、１種類のみの共役体しか使用しないアッセイを含めた、基板上で実施するアッセイにも及ぶことが判明した。
ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体のハイブリダイゼーション効率を、認識部分とスペーサー部分を含む認識オリゴヌクレオチドの使用によって劇的に増加させることができることがわかっている。「認識オリゴヌクレオチド」とは、核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列の少なくとも一部分に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドである。この実施形態では、認識オリゴヌクレオチドは認識部分およびスペーサー部分を含み、認識部分が核酸またはオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズする。認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分は、該スペーサー部分がナノ粒子に結合できるように設計される。例えば、スペーサー部分には、ナノ粒子に結合可能な官能基を含む部分が、共有結合によって結び付けられる。これらは上述したのと同じ部分および官能基である。ナノ粒子に対して認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分が結合した結果、認識部分はナノ粒子の表面から遠ざかり、その標的とのハイブリダイゼーションのためによりアクセス可能となる。認識部分のナノ粒子からのよい離間性を提供するスペーサー部分の長さと配列は、経験的に決定することが可能である。少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチドを含むスペーサー部分が、好結果を与えることがわかった。スペーサー部分は、認識オリゴヌクレオチドの、ナノ粒子への結合能もしくは核酸またはオリゴヌクレオチド標的への結合能に干渉しない、任意の配列を有してよい。例えば、スペーサー部分は、認識オリゴヌクレオチドの配列や認識オリゴヌクレオチドの核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列に対し、互い相補的な配列を有するべきではない。好ましくは、スペーサー部分のヌクレオチドの塩基は、すべてアデニン、すべてのチミン、すべてシチジン、またはすべてグアニンであり、そうでなければ上述のような問題が起こる可能性がある。より好ましくは、塩基はすべてアデニンまたはすべてのチミンである。好ましくは、塩基はすべてチミンである。
所望のレベルのハイブリダイゼーションを与えるために、認識オリゴヌクレオチドに加えての希釈剤オリゴヌクレオチドの使用が、共役体を要求に合わせて作製する（あつらえる）手段を提供することがさらに知られている。希釈剤オリゴヌクレオチドと認識オリゴヌクレオチドは、共役体を調製するためにナノ粒子に接触させた時の溶液中の比とほぼ同じ比率でナノ粒子に付くことが分かった。したがって、共役体が所望の数のハイブリダイゼーション事象に参与するように、ナノ粒子に結び付けられた希釈剤オリゴヌクレオチド対認識オリゴヌクレオチドの比を制御することができる。希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの、ナノ粒子への結合能もしくは核酸またはオリゴヌクレオチド
標的への結合能に干渉しない、任意の配列を有してよい。例えば、希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの配列や認識オリゴヌクレオチドの核酸またはオリゴヌクレオチド標的の配列に対し、互い相補的な配列を有するべきではない。希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドがその核酸またはオリゴヌクレオチド標的に結合できるように、認識オリゴヌクレオチドよりも短い長さを好ましくは有する。認識オリゴヌクレオチドがスペーサー部分を含む場合、希釈剤オリゴヌクレオチドは、最も好ましくはスペーサー部分とほぼ同じ長さである。このように、希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドの認識部分の核酸またはオリゴヌクレオチド標的とハイブリダイズする能力に干渉しない。さらにより好ましくは、希釈剤オリゴヌクレオチドは、認識オリゴヌクレオチドのスペーサー部分の配列と同じ配列を有する。
タンパク質受容体及びその他の特異的結合対メンバーは、オリゴヌクレオチドにより機能化し、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子に固定化されて、ＤＮＡよりむしろタンパク質受容体が指図する分子認識特性を備える以外に、オリゴヌクレオチド修飾粒子の高度安定性を呈する新しい分類のハイブリッド粒子（ナノ粒子−受容体共役体）を生成することができる。或いは、受容体修飾オリゴヌクレオチドを備えた多重受容体結合部位を有するタンパク質を機能化し、それにより先に論じた本来のナノ材料組立スキームにおいて、タンパク質受容体複合体を無機ナノ粒子の１つの代わりに部分構造の１つとして用いることができる。検体の検出戦略におけるこれらの新規なナノ粒子−受容体共役体の使用は、ターゲットの同定及びタンパク質−タンパク質相互作用のスクリーニングをはじめとする多数の方法で評価されてきた。
本発明の１つの実施形態において、広範囲の水性塩濃度で安定しており、長期の貯蔵寿命を有し、水溶性が低いタンパク質だけでなく水溶性が高いタンパク質の使用も可能な、新規なハイブリッド粒子又はナノ粒子受容体共役体が提供される。プローブシステム（図４７の代表的構造ＩＩを参照）を用いて、表面の別個の部位に固定化したタンパク質のアレイをスクリーニングすることができる（図４８）。タンパク質、ペプチド、炭水化物、糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、及び小分子（図４９では、Ａ及びＢがタンパク質、ペプチド、炭水化物、糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、合成ポリマー、合成オリゴマー、又は小分子、或いはそれらのいずれかの組み合わせ）など特異的結合対メンバーの組合わせを含む非常に様々な特異的結合反応を研究するために、プローブの構築及び適用のための同様の原理を適応することができる。基本的概念は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドに「受容体ユニット」（図４９ではＡ）を結合させることである。その後、ハイブリダイゼーションにより、そのシステムの水溶性を高め凝集に関わるコロイドを安定化させる作用があるナノ粒子マトリックス周辺のオリゴヌクレオチドのシースを含有するナノ粒子プローブが生成する。その後、プローブＩＩ’を用いて、固体表面に固定化したターゲット（Ｂ）にインターロゲートする。ＡのＢへの結合は、固体表面に結合したナノ粒子の検出によりモニタリングする（例えば比色法、蛍光法、銀染色などによる）。このスキームは、Ａをオリゴヌクレオチドに共役でき、Ｂを表面に固定化できるいずれの分子でも用いることができる。
本発明の実施例を図４７に示しており、ここではＩは、金表面に強固に連結した（例えば、硫黄−金結合による）多数のオリゴヌクレオチドを含む金ナノ粒子であり、１は、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を備えた側基オリゴヌクレオチドを含有するタンパク質である。表面密度の高いオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を構築するための手順は、本明細書に記載している。例えば、実施例３及びＣ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，第３８２巻，６０７−６０９ページ（１９９６年）；Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７７巻，１０７８−１０８１ページ（１９９７年）；Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２０巻，１９５９−１９６４ページ（１９９８年）を参照されたい。オリ
ゴヌクレオチドをタンパク質に共役させるための方法は周知であり、１つの方法の詳細は、Ｅ．Ｒ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２３巻，５２２−５２９ページ（１９９５年）に記載されている。ナノ粒子に共役したオリゴヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチド−タンパク質共役体を、共にハイブリダイゼーションの条件下におくと、１つ以上のオリゴヌクレオチド−タンパク質共役体分子が、ハイブリダイゼーションにより所定のナノ粒子に結合して、ナノ粒子タンパク質共役体を生成する。図４７及び５０（ａ）を参照されたい。ナノ粒子受容体共役体の別の実施形態は、図５０（ｂ）に示されており、そこでは連結オリゴヌクレオチドの使用を必要とし、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド構造物及びオリゴヌクレオチド−タンパク質共役体を共にハイブリダイゼーションの条件下におく。この実施形態において、リンカーオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチド（ａ）に相補的な１つのセグメント（ａ’）、及び受容体に結合したオリゴヌクレオチド（ｂ）に相補的な別のセグメント（ｂ’）を有する。
得られたナノ粒子−タンパク質複合体は、遠心分離又はゲル濾過により非結合のタンパク質から分離することができ、抗原などのターゲット検体のためのプローブとして用いることができる。図５１は、ナノ粒子−タンパク質共役体をプローブとして使用し得る複数の代表的検出スキームを示している。ナノ粒子−タンパク質共役体は、ターゲット検体を同定すること、支持体上に整列して固定化した薬物など分子のライブラリをスクリーニングすること（図５１（ａ））、又は組織化学的適用においては細胞若しくは組織内の検体の存在を同定すること、をはじめとする非常に様々な適用例を有する。そのプローブは、検体、例えばタンパク質又は薬物が多重結合部位を有する場合も、スポットテストにおいて用いることができる。
これらの検査から得られる金プローブ−受容体−リガンドターゲットの組み合わせは、視覚的（例えばスポットテスト、凝集体の形成、又は銀染色）、又はいずれか公知の手順により観察することができる。例えば、ナノ粒子−タンパク質共役体システムを用いて、ナノ粒子／ＤＮＡ／タンパク質複合材料の凝集特性に依存する、核酸のための比色テストを開発することができる（図５２（Ａ））。典型的実験において、ターゲット核酸（３）を含むか或いは含まない４種のビオチン−オリゴヌクレオチド共役体（１−ＳＴＶ）及び金ナノ粒子ＤＮＡ共役体（２−Ａｕ）に結合したストレプトアビジンを含む複合体の溶液を調製した。ターゲット核酸の配列は、２つの部分を有する。複合体に結合したオリゴヌクレオチドは、核酸の第１部分に相補的であるが、ナノ粒子の結合したオリゴヌクレオチドは、核酸の第２部分に相補的である。その溶液を、５３℃で３０分間加熱し、その後溶液の一部３ＬをＣ１８逆相薄層クロマトグラフィープレートにスポットした。ターゲット核酸を含む溶液は、青色のスポットを示し、ターゲットを含まない溶液は、赤色のスポットを示した。この結果及びシャープな融解曲線により、上記スポットテスト（図５２（Ｂ））中の金ナノ粒子プローブの１つを、金プローブよりも簡単に調製されるストレプトアビジン／ＤＮＡ共役体により置換し得ることを実証している。
５２（ａ）に示したシステムを用いて、先に論じた新規な３次元ナノ材料又はアセンブリを調製することもできる。図５２（ａ）の簡単な変形例において、図５２（ｃ）に示すように、連結オリゴヌクレオチドは用いられず、複合体に結合したオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドに相補的である。
これらの新しいナノ粒子−タンパク質プローブ（ＩＩ）は、独特の特徴を有しており、それにより過去に記載されたナノ粒子タンパク質共役体をしのぐ重要な利点が提供される。特に、ナノ粒子の表面の高密度オリゴヌクレオチドは、ポリアニオンのシースとして機能して、非常に広範囲の溶解度にわたって水中のナノ粒子−タンパク質共役体の溶解度及び安定性を高め、非常に広範囲の塩濃度にわたって水中のナノ粒子−タンパク質共役体の
安定性を高める。更に、オリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド結合の可逆性は、ターゲットと共に形成された複合体を特徴づけるための格別な手法を提供する。加えて、ナノ粒子−タンパク質は、非特異的結合に対してより抵抗性がある（図５３参照）。
好ましいナノ粒子−タンパク質複合体は、金ナノ粒子を基にしているが、非常に様々なその他の材料（例えば、銀、プラチナ、金及び銀の混合物、磁気粒子、半導体、量子点）を基にしたその他の粒子を用いてもよく、粒子サイズは、上記のように２〜１００ｎｍの範囲であってよい。米国特許出願第０９／３４４，６６７号明細書及びＰＣＴ出願ＷＯ第９８／０４７４０号は両者とも、引用により完全に本明細書に援用されており、適切なナノ粒子と、それらにオリゴヌクレオチドを結合させる方法とを記載している。
別の実施形態において、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−タンパク質複合体（ＩＩ）は、滑面に固定化したタンパク質など特異的ターゲット分子を検出する際のプローブとして使用される。例えば図４８、４９、５１、及び５４を参照されたい。この目的のために、多数の異なるタンパク質を、異なる別個のスポットにガラススライド上のアレイとして固定化してもよい。多数の連結方法が用いられてもよい。当該技術で周知の１つの方法は、そのガラスを３−アミノプロピルトリエトキシシランと、その後１，４−フェニレンジイソチオシアネートとで処理することである。この配列は、１つ以上のアミノ基を含有する物質に結合させるために用い得る側基のイソチオシアネート基を保持する表面を生成する。アミノ基を含有するターゲットは、この修飾した表面に直接固定化することができる。その他の物質では、アミノアルキル基をターゲットにつないで、必要な反応基を提供することができる。表面上のターゲットの固定化、残余のイソチオシアネート基の不活性化、及び洗浄の後、表面をＩＩのコロイド溶液に暴露する。タンパク質を固定化するための別の方法は、結合したアルデヒド基を有するガラススライド上にタンパク質を「プリント」して、タンパク質チップを生成することを含む。Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８９巻，１７６０−１７６３ページ（２０００年）；Ｎａｔｕｒｅ，２０００年，４０５巻，８３７ページ；及びＡｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第２７８巻，１２３ページは全て、引用により完全に援用されている。タンパク質上のアミノ基は、反応してタンパク質の３次構造を有意に破壊することなく共有結合を形成し、それによりタンパク質は、受容体及びその他のターゲット分子とも反応することができる。或いは、特異的ターゲット分子又は検体は、オリゴヌクレオチドに結合して、検体に結合したオリゴヌクレオチドが支持体に結合したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド−検体共役体を形成する。オリゴヌクレオチドにタンパク質及びその他の物質を共有結合させる方法は多数ある。１つの方法は、チオール修飾オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンとを結合させるためのＳＭＰＢ（スルホスクシンイミジル４−［ｐ−マレイミドフェニル］ブチレート）の使用を含む。Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４年，第２２巻，５５３０ページは、引用により完全に援用されている。支持体に結合したオリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーション条件下で検体に結合したオリゴヌクレオチドと接触させることにより、検体を支持体と結合させてもよい。
その後、プローブを支持体と接触させる。タンパク質−タンパク質特異的結合相互作用が生じるのに十分な時間を経た後、過剰のナノ粒子共役体を洗い流して、ナノ粒子を検出する。金属性ナノ粒子は、色により又は銀染色による灰色のスポットとして、直接検出してもよい。こうして、特異的タンパク質／受容体結合相互作用を、ガラススライド上でいずれか１つの存在を指示する方法として活用してもよい（図５４）。典型的な実験において、本明細書に記載した高ＤＮＡ密度金ナノ粒子プローブにハイブリダイズさせたビオチン化ＤＮＡに結合したストレプトアビジンを含有する溶液にガラススライドを暴露させることにより、ガラススライドの一部に、相補的ＤＮＡを含むハイブリダイズさせたビオチン化ＤＮＡをプローブし得る。プローブは、ビオチンを含むスライドの一部に結合する。複合化したプローブに関連するシグナルは、銀強化溶液で処理することにより更に発色す
ることができる（図５４参照）。
上に示したように、有用なＩＩ型のプローブは、機能的認識要素として非常に多様な物質を用いて作製することができる。図４９，５０に示すプローブの合成及び適用例のスキームは、タンパク質−タンパク質相互作用を研究するために図４８に表したものと全く類似している。図４９の一般例として、共役プローブをＩＩ’と呼称し、受容体ユニットをＡと呼称し、固体表面に固定化されたターゲットをＢと呼称する。図４８のシステム及び本明細書に記載の変形例は、図４９に示した一般的システムの特別な例である。
場合により、非金属ナノ粒子から構築されるＩＩ型のオリゴヌクレオチド−ナノ粒子プローブを用いることが好ましい場合もある。本来蛍光性のナノ粒子を基にしたＩＩ型プローブは、それらの蛍光により観察することができる。その他のナノ粒子は、オリゴヌクレオチドのシースが添加される前、又は後のいずれかに粒子に蛍光標識を付加することにより、蛍光性にしてもよい。
本発明の別の実施形態において、新規なタンパク質検出方法が提供される。連結ＤＮＡを特異的タンパク質のマーカとして用い得る場合には、タンパク質結合分子を、連結オリゴヌクレオチドにより、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体に接続する。図５５は、レポータＤＮＡとして連結オリゴヌクレオチドを利用するタンパク質検出方法を記載している。この方法において、オリゴヌクレオチドは、各タンパク質粒子が異なるオリゴヌクレオチド配列を有するような方法でタンパク質結合分子により修飾され、その後タンパク質−オリゴヌクレオチド共役体が、ハイブリダイゼーションの結果Ａｕ粒子上に固定化される。例えば、ビオチン化ＤＮＡは、金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体上に固定化されて、ビオチンナノ粒子共役体を生成することができる。ストレプトアビジンの存在において、ビオチン修飾ナノ粒子は、凝集体を形成し、その凝集体は、その他の粒子から容易に分離することができる。その凝集体は、その後ＤＮＡデハイブリダイゼーションにより解離され、レポータＤＮＡがＡｕ粒子及びタンパク質から単離される。各タンパク質結合分子は固有のＤＮＡ配列を有しているため、タンパク質は、ＤＮＡチップの使用など確立されたＤＮＡ検出方法により同定することができる。一旦レポータＤＮＡが単離されると、レポータＤＮＡはＰＣＲにより増幅され得るため、検出限界は非常に低くなり得る。
これらのナノ粒子−オリゴヌクレオチド−受容体共役体システムの全てに共通する特徴は、試験される成分、例えば図４９の受容体Ａ及びＢの相互作用のためのシグナルが、Ｂに結合するＡと、オリゴヌクレオチドａ’によるオリゴヌクレオチドａの相互作用の両者に基づいて決まることである。オリゴヌクレオチド二本鎖セグメントの解離温度は、相補鎖の長さ及び配列、並びに塩濃度を制御することにより変えることができるため、研究者の意図に従って、オリゴヌクレオチド二本鎖がテストされる成分よりも低温又は高温で解離されるようにシステムを設計することが多くの場合可能である。ここに論じたように、他のナノ粒子に、又はガラス表面に連結するオリゴヌクレオチドとのオリゴヌクレオチド金ナノ粒子プローブのハイブリダイゼーションにより形成した複合体は、通常は狭い温度範囲で解離する。我々の知る限りでは、そのようなシャープな融解推移は、このサイズのオリゴヌクレオチドに由来する複合体としては前例がない。この特性により、ナノ粒子及びオリゴヌクレオチドを基にしたその他のプローブをはじめとするその他のプローブシステムとは別の、図４７におけるこれらのナノ粒子オリゴヌクレオチドプローブが設定される。従って、観察されたシグナルがオリゴヌクレオチド二本鎖の解離を反映するようにＩＶ型（図４８）又はＶ型（図５４）のシステムを設計すれば、解離推移が極めてシャープになる。この特徴により、ＩＶ型及びＶ型の複合体を特徴づけるための特定の寸法が提供される。或いは、ＡとＢとの相互作用の強度に関する情報を得るために、Ａ−Ｂ複合体の初期解離を好適化するシステムを設計することもできる。
容易に理解できるように、非常に望ましいナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を、上述のすべての方法を用いて調製することができる。そうすることによって、要求に合わせたハイブリダイゼーション能力を有する安定した共役体を作製することが可能である。
上記の共役体の任意のものは、上述の核酸検出方法のいずれに使用してもよいし、好ましくは使用される。また、本発明は、上記共役体のうちの任意のものを入れた容器を含むキットも提供する。その上、該共役体は、本発明のナノファブリケーションの方法ならびに核酸分離方法のいずれに使用してもよいし、好ましくは使用される。
本発明はさらに、本発明のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の、電極表面上の相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを促進するための、電界の使用にも関する。ここで、上記に論じた塩、ｐＨ、温度、カオトロピック剤、および他の要因に加えて、電界強度（特に電流レベルと電流密度）が核酸相互作用の調節のための正確に制御可能で連続的に変化するパラメータを提供することができる。核酸ハイブリダイゼーションの相互作用の促進に加えて、電界は、特異的結合対相互作用、抗体／抗原反応、細胞分離、および関連の臨床診断法のような大半の分子生物学的方法を含むがそれらに限定されないナノ粒子−荷電分子共役体に関する他の相互作用を促進するために拡張することができる。電場の適用は、選択された生物学的反応の進行や発生をモニタ（または測定）するための様々なタイプのナノ粒子に基づくバイオセンサの設計、構築、および使用を促進する。バイオセンサについては、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９１）（８章）やＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら（１９９２）（５章）にかなり詳細に論じられている。米国特許第５，９６５，４５２号やそこに引用されている文献も参照されたい。
最近、Ｎａｎｏｇｅｎその他が、核酸相互作用の輸送、ハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシーを制御するための独立パラメータとして電場を使用する超小型電子技術の核酸アレイ方法および装置を開発した。それらは、マイクロファブリケーションだけでなく超小型電子技術も使用する点で、「能動的」なアレイ装置である。例えば、Ｅｄｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７年、第２５巻（２４）、４９０７−１４頁；米国特許第６，０５１，３８０号；第６，０６８，８１８号；第５，９２９，２０８号；第５，６３２，９５７号；第５，５６５，３２２号；第５，６０５，６６２号；第５，８４９，４８６号；第６，０４８，６９０号；第６，０１３，１６６；および第５，９６５，４５２号も参照されたい。これらのはその全体が引用により組み込まれる。これらの文献は、核酸相互作用の輸送、ハイブリダイゼーションおよびストリンジェンシーを制御する独立パラメータとして電場を使用する超小型電子技術に基づく核酸アレイについて説明している。そのような核酸アレイは、マイクロファブリケーション技術だけでなく超小型電子技術も使用する点で、「能動的」なアレイ装置である。しかしながら、本発明に先立って、本願出願人は、ナノ粒子−第１の特異的結合対メンバー共役体と、第２の結合対メンバーとの間の相互作用、例えばナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、表面に結び付けられた相補的ヌクレオチドとの間の相互作用を、電場によって促進できるということが、従来技術では説明も示唆もされていないと考えている。
コンビナトリアル・オリゴヌクレオチド・アレイ（または「遺伝子チップ」）技術は、相補的アレイ要素にハイブリダイズした標的ＤＮＡの定量的検出に依存している。本発明者らは最近、オリゴヌクレオチドで官能化した直径１３ｎｍの金ナノ粒子が、標的のチップへのハイブリダイゼーションの指標として役割を果たす、遺伝子アレイにハイブリダイズしたＤＮＡ標的を検出する「走査測定（ｓｃａｎｏｍｅｔｒｉｃ）」法を報告した［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］。該ナノ粒子は並外れて鋭い温度誘発性の解離（または「融解」）プロファイルでアレイ表面から解離するので、走査測定ＤＮＡ検出システムの選択性は、フルオロフォア・プローブに基づいた従来のアレイ・システムの選択性より本質的に高かった（４倍）。さらに、金に促進される銀（Ｉ）の還元によってアレイに結合したナノ粒子が大きくなることにより、フラットベッド型光学スキャナを用いて、フルオロフォアで標識した遺伝子チップの共焦点蛍光イメージングで通常観察される感度の１００倍の感度でアレイの白黒画像化が可能になった。この走査測定方法は、ＤＮＡミスマッチの同定における使用に優れ、１塩基多型分析［ワン、ディー．ジー．ら（Ｗａｎｇ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８年、第２８０巻、１０７７ページ］または遺伝子疾患の変異の同定［ハシア、ジェイ．ジー．（Ｈａｃｉａ，Ｊ．Ｇ．）、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９年、第２１巻、４２ページ］における使用が見込まれる。しかし、遺伝子発現の研究において遺伝子チップを使用することに興味を持っている研究者は、多くの場合、試験試料および参照試料中に発現されたｍＲＮＡの示差分析を行うために、さらにＤＮＡマイクロアレイを多色標識して画像化しうることを必要としている［ブラウン、ピー．オー．（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｏ．）；ボートスタイン、ディー．（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ，Ｄ．）、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９９年、第２１巻、３３ページ］。
大きさおよび組成が異なる金属ナノ粒子を、その特有の表面プラズモン共鳴に応じて異なる波長の光を散乱するように設計することが可能である［ミー、ジー．（Ｍｉｅ，Ｇ．）、Ａｎｎ．Ｐｈｙｓ．、１９０８年、第２５巻、３７７ページ］。異なる大きさのナノ粒子からの散乱光は組織化学的な画像化に使用されているが［シュルツ、エス．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓ．）；スミス、ディー．アール．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｒ．）；モック、ジェイ．ジェイ．（Ｍｏｃｋ，Ｊ．Ｊ．）；シュルツ、ディー．エー．（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｄ．Ａ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０００年、第９７巻、９９６ページ；イゲラビデ、ジェイ．（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｊ．）、イゲラビデ、イー．イー．（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｅ．Ｅ．）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９８年、第２６２巻、１５７ページ］、ナノ粒子標識はアレイに基づいた検出スキームにおける多色標識には使用されていない。密なオリゴヌクレオチド層で修飾されている様々な大きさと組成の粒子を、多色使用可能で、原理的には走査測定検出システムで観察されたものと同じ選択性の利点を備えたＤＮＡ検出システムをもたらすために使用可能である。本明細書中では、ＤＮＡアレイによって捕捉された標的にハイブリダイズした、オリゴヌクレオチドで官能化した直径５０および１００ｎｍのＡｕナノ粒子プローブによって散乱された光の画像化を使用して、１つの溶液中の２種の標的配列を同定することが可能なことを報告する。さらに、走査測定アレイ方法と同様、ナノ粒子プローブの固有の融解特性により、結合したナノ粒子からの散乱光によってＤＮＡアレイを画像化する場合に、配列選択性が増強されることを示す。
アレイ捕捉鎖、オリゴヌクレオチドで官能化したナノ粒子標識、および検出しようとする標的のＤＮＡ配列は、３成分間サンドイッチ・アッセイで同時ハイブリダイズするよう設計されている（図６１）［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］。試験オリゴヌクレオチド標的は自動固相合成によって合成し、オリゴヌクレオチド・アレイは文献の手順を使用してガラス製の顕微鏡スライド上に調製した［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ；クリシー、エル．エー．（Ｃｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．）；リー、ジー．ユー．（Ｌｅｅ，Ｇ．Ｕ．）；オフェラール、シー．イー．（Ｏ’Ｆｅｒｒａｌｌ，Ｃ．Ｅ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９６年、第２４巻、
３０３１ページ］。直径５０ｎｍおよび１００ｎｍの金ナノ粒子をジチアン末端のオリゴヌクレオチドで官能化し、文献の方法によって単離した［レイノルズ、アール エー三世（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｒ．Ａ．ＩＩＩ）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、３７９５ページ；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）；エルガニアン、アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）；ビスワナダム、ジー．（Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２０００年、第１１巻、２８９ページ］。典型的な実験では、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体およびオリゴヌクレオチド標的を、０．３Ｍ ＰＢＳのハイブリダイゼーション緩衝液［０．３ＭのＮａＣｌ、１０ｎＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７］中、室温で２時間、ＤＮＡアレイに同時ハイブリダイズさせた［以下の実施例３０および３１参照］。その後、ハイブリダイズしていない標的およびナノ粒子プローブを除去するために清浄な緩衝液でアレイを洗浄した。アレイ・スライドを顕微鏡のステージに取り付け、光ファイバー照明［Ｄａｒｋｌｉｔｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（Ｍｉｃｒｏ Ｖｉｄｅｏ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州エイボン所在）］によってスライドの平面に照射した。この配置では、スライドは平面導波路として役割を果たし、内部全反射によって顕微鏡の対物レンズに光がまったく届かないように阻止する。しかし、ナノ粒子プローブが該導波路の表面に付着している場所では、エバネセント結合した光［ミュラー、ジー．ジェイ．（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｊ．）、「Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ Ｉｍａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ」；タルミ、ワイ．（Ｔａｌｍｉ，Ｙ．）編、第１０２回ＡＣＳシンポジウム；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：ワシントンＤＣ、１９７９年；２３９−２６２ページ］が誘導面から散乱し、暗い背景上の明るい着色されたスポットとして画像化された。これらの実験では、５０ｎｍのＡｕ粒子が導波路に付着している場所では緑色の光（λｍａｘ＝５４２ｎｍ）が観察され、１００ｎｍの粒子が付着している場合は橙色の光（λｍａｘ＝５８３ｎｍ）が同様に観察された。平面導波路に付着した大きな（≧２００ｎｍ）セレニウム粒子からの散乱光を使用してＤＮＡアレイの画像化が行われてきたが［スティンプストン、ディー．アイ．（Ｓｔｉｍｐｓｔｏｎ，Ｄ．Ｉ．）；ホイヤー、ジェイ．ヴイ．（Ｈｏｉｊｅｒ，Ｊ．Ｖ．）；シェイ、ダブリュ．（Ｈｓｉｅｈ，Ｗ．）；ジョウ、シー．（Ｊｏｕ，Ｃ．）；ゴードン、ジェイ．（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．）；セリオー、ティー．（Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ，Ｔ．）；ギャンブル、アール．（Ｇａｍｂｌｅ，Ｒ．）；バルデシュヴィーラー、ジェイ．ディー．（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５年、第９２巻、６３７９ページ］、本発明者らが本明細書中に記載するシステムの２つの特徴により同システムは以前の研究とは区別される。すなわち、ｉ）密に官能化されたオリゴヌクレオチド−金ナノ粒子のハイブリッドに固有の鋭い融解プロファイルにより引き起こされる顕著な配列選択性、およびｉｉ）異なる粒子径および原理的には異なる粒子組成により、オリゴヌクレオチド・アレイの多色分析がもたらされるという観察である。
１つの溶液中の２種の異なるＤＮＡ標的の多色分析を行うこのシステムの潜在性を試験するために、ＤＮＡ配列ａで官能化した１０ｎＭの５０ｎｍ粒子、ＤＮＡ配列ｂで官能化した３．５ｎＭの１００ｎｍのＡｕ粒子、ならびに２００ｎＭの合成オリゴヌクレオチド標的ａ’ｃ’およびｂ’ｄ’の混合物を、配列ｃおよびｄでスポットしたスライド・ガラスに曝露した（図６１Ａ）［アレイ・ハイブリダイゼーション、画像化および感度のさらなる詳細は実施例３０および３１で見つけることが可能である］。標的ａ’ｃ’およびｂ’ｄ’の両方の存在下では、配列ａ’ｃ’の試験スポットで画像化された散乱緑色光および配列ｃ’ｄ’の試験スポットでの散乱橙色光（図６２Ａ）から実証されたように、２種の異なるナノ粒子プローブが首尾よくかつ独立して対応する相補的なスライド・スポットにハイブリダイズした。スポットから離れた場所で測定された散乱光強度が低いのは、ナ
ノ粒子のスライド表面上への非特異的結合が最小限であることを反映している。標的ａ’ｃ’またはｂ’ｄ’のみの存在下では、それぞれ緑色光または橙色光のみが観察される（図６２Ｂ、Ｃ）。いずれの場合でも、非相補的なスポットではバックグラウンドのシグナルはほとんど観察されない。わずか１ｐＭの標的の存在下でも、ハイブリダイズしたナノ粒子プローブによる散乱光をバックグラウンドのシグナルと識別することが可能であり［アレイ・ハイブリダイゼーション、画像化および感度のさらなる詳細は実施例３０および３１で見つけることが可能である］、これは、この方法が生物源由来のＤＮＡを分析するのに十分感度が高いことを示している。標的の非存在下では、ＤＮＡで官能化した顕微鏡スライドを２種の異なるナノ粒子プローブで処理しても散乱光がまったく観察されなかったことに注意されたい（図６２Ｄ）。
ナノ粒子プローブに基づいたこの新しい散乱検出システムの選択性を試験するために、本発明者らは、各要素が特定の配列部位に４種の可能なヌクレオチドのうち１種を有する捕捉鎖を備えた、４種の要素を含むモデルＤＮＡアレイを合成した。これらのアレイを室温で、４種の要素のうち１種に相補的な標的が２００ｎＭ（Ｘ＝Ａ、図６１Ｂ）であり、直径５０ｎｍのナノ粒子プローブが１０ｎＭである溶液と共にインキュベートした［アレイ・ハイブリダイゼーション、画像化および感度のさらなる詳細は実施例３０および３１で見つけることが可能である］。その後、ハイブリダイズしていない標的およびプローブを除去するためにアレイを洗浄し、清浄なハイブリダイゼーション緩衝液に再び浸した。その後、ハイブリダイズしたナノ粒子のアレイ表面からの解離を誘発し、緩衝液の温度を次第に上昇させることによって連続的に観察した。この温度が相補ＤＮＡ２重鎖またはミスマッチＤＮＡ２重鎖のどちらかの融解温度（Ｔｍ）を超えない限りは、４種のアレイ要素すべてで散乱光が観察され（図６３Ａ）、解離が起こらなかったことが示された。しかし、緩衝液の温度をさらに上昇させるにつれて、様々な塩基対の熱安定性の順にナノ粒子プローブがスライドから解離した（Ｔ：Ｔ≒Ｃ：Ｔ＜Ｇ：Ｔ＜Ａ：Ｔ、図６３Ａ）。ナノ粒子のスライドからの解離を実時間で観察したので、実験が進むにつれて、最適なストリンジェンシーの温度、選択性、および標的配列をすべて容易に視覚的に決定することが可能であった。さらに、すべてのアレイ要素について定量的な融解プロファイルを作成し、実時間で各要素でのシグナル強度を測定することによって同時に比較した（図６３Ｂ）。最適なストリンジェンシーの温度では（５５℃、図６３Ｂ中の縦線で示す）、相補的（Ｘ＝Ａ）要素におけるシグナルはＧ：Ｔの「ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）」ミスマッチを有する要素のシグナルより５倍高い。これは、分子フルオロフォア・プローブおよび同一の配列を有するアレイについて以前に観察された配列選択性よりも有意に高い配列選択性を表す［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］。白黒の走査測定手法によって小さな（直径１３ｎｍ）ナノ粒子で観察されたように［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］、フルオロフォアで標識したＤＮＡと比べて５０ｎｍ粒子プローブの選択性が高いことは、ナノ粒子がアレイ表面から解離する温度範囲が狭いことの直接の結果である。図６３Ｂに示す曲線の１次導関数における半値全幅は、フルオロフォアで標識した同一配列のＤＮＡでは１８℃であるのに対し、５℃である［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］。ここに提示する結果は、この選択性を、同一チップ上の複数のＤＮＡ標的の多色標識と組み合わせても使用し得ることを実証している。
オリゴヌクレオチドで官能化した比較的大きいナノ粒子の散乱光に基づく、本明細書中に記載したＤＮＡアレイ画像化法により、高感度で非常に選択性の高いＤＮＡアレイ多色
標識の機会がもたらされる。理論的には、記載した方法は様々な組成および大きさのナノ粒子を使用して、さらに別の色に拡張可能である［リンク、エス．（Ｌｉｎｋ，Ｓ．）；ワン、ゼット．エル．（Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｌ．）；エル・サイード、エム．エー．（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｍ．Ａ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、１９９９年、第１０３巻、３５２９ページ］。さらに、より高い散乱係数を有する粒子を使用することにより、このシステムはナノ粒子走査測定システム５および導波路に基づいた蛍光アレイに匹敵する高い感度を有し得る［ブダッハ、ダブリュ．（Ｂｕｄａｃｈ，Ｗ．）；アベル、エー．ピー．（Ａｂｅｌ，Ａ．Ｐ．）；ブルーノ、エー．イー．（Ｂｒｕｎｏ，Ａ．Ｅ．）；ニューシェーファー、ディー．（Ｎｅｕｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｄ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、第７１巻、３３４７ページ］。その開示の全体を本願明細書に援用する米国特許第５，５９９，６６８号は、結合事象を検出するための光学的光散乱導波方法（ｌｉｇｈｔ
ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｐｔｉｃａｌ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）を記載しているが、この特許は本発明のナノ粒子共役体の使用を開示も示唆もしていない。
本発明の方法は導波路に入射する光の散乱を検出することを含むが、この散乱は、本発明の光散乱ナノ粒子共役体がエバネセント波の侵入度の範囲内にある導波路に特異的に結合した結果である。導波路は透明なプラスチックもしくはガラスまたは任意の適切な材料でもよく、結合は一般にはオリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションによるもの、または所望する場合は上述のような免疫学的捕捉によるものである。光散乱の検出可能なナノ粒子プローブは、上述の本発明の成熟プロセスによって調製した、金を含めた、任意の新規金属または半導体のナノ粒子から調製し得る。実時間における結合と解離を、視覚的にまたはＣＣＤカメラおよびフレーム取り込みソフトウェアを用いるなどビデオ画像化によってモニターすることが可能である。実時間の融解曲線によって、わずか１塩基のハイブリダイゼーション・ミスマッチを識別することが可能である。
本発明を実施するにあたって、導波路は、ガラス、石英、プラスチック（ポリカーボネート、アクリル、またはポリスチレン等）などの光学的に透明な材料から作製されるべきである。導波路の反射率は、内部全反射をもたらすことが当分野で周知のように、試料流体の反射率より大きくなければならない。水性試料溶液では反射率ｎは約１．３３であるので、導波路は一般に１．３５より大きく、通常は約１．５以上である。導波路は図６４および６５Ｂに示すものなどの受光端部を含む。導波路は１片のプラスチックまたはガラスであってよく、たとえば標準的なガラス製顕微鏡スライドまたはカバー・ガラスを使用してもよい。導波路の表面を上述した任意の適切な方法によって処理し、好ましくは共有結合によってオリゴヌクレオチドを支持体に付着させてもよい。
入射光線を発生させるための光源は、可視スペクトル、紫外スペクトル、および近赤外スペクトルのエネルギーを含めたほぼ全ての電磁エネルギー源でありうる。したがって、用語「光」とは、かなり広範に解釈され、可視的に検出する実施形態以外では可視範囲に限定されない。当分野で周知のように、非可視波長はその特定の波長に最適化された検出器によって検出される。光は、単色または多色、平行または非平行、偏光または非偏光であり得る。好ましい光源には、レーザー、発光ダイオード、閃光電灯、アーク灯、白熱灯および蛍光放電灯が含まれる。導波路要素を照射するのに使用する光源は、低ワット数のヘリウム−ネオン・レーザーであり得る。以下の実施例１に記載のような携帯の使い捨て用には、光源は、ポケット懐中電灯などで使用されているものなど電池で作動する小さな白熱電球であり得る。好ましくは、光源は、光源の強度を変えるための分圧器の手段を含む。あるいは、強度を適切なレベルに調整するためにフィルタおよび／またはレンズを利用してもよい。
光散乱の程度を決定するための検出手段については以下に詳細に記載するが、手短に述べると、装置および視覚的手段の両方を含む。観察者の眼および脳によるものであれ、コ
ンピュータでデジタル化かつ処理される画像を形成するＣＣＤカメラを含めた光検出装置によるものであれ、導波路全体にわたる光散乱事象が本質的に同時にモニター可能であることが、本発明の重要な特徴である。いずれの場合にも、複数種に官能化された表面が１つだけ使用され、エバネセント波によって同時に照射される。
本発明はまた、検出方法において標的の選択性を強化するための、塩に基づくストリンジェントな洗浄にも関する。標的核酸分析物の選択性を高めるということには、一般に、ハイブリダイゼーション条件の調整、または塩基ミスマッチ鎖もしくは非相補的な鎖から核酸２重鎖を脱ハイブリダイゼーションさせる、ハイブリダイゼーション後の工程における融解温度での熱に基づいたストリンジェントな洗浄の使用が含まれる。一般に、後の洗浄工程のストリンジェンシーが高いほど、２重鎖構造内のミスマッチは、残るとしても少なくなる。本発明のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、ハイブリダイゼーション後の熱的にストリンジェントな洗浄を必要とせずに検出システムにおいて優れた標的選択性を達成するのに利用可能な、著しい塩濃度依存性のハイブリダイゼーションの挙動を示すことが判明した。たとえば、実施例３２では、本発明のオリゴヌクレオチドで修飾したナノ粒子が塩濃度勾配全体にわたって並外れて鋭い変性特性を示すことが実証されている。このような塩に基づくストリンジェントな洗浄を伴う検出システムは、手持ち型のＤＮＡ検出システムで有用であり、大量の多重鎖形成を受け入れることが可能であり、フルオロフォアに基づいたシステムと比較してより高い選択性を示すであろう。温度の代わりに塩濃度をストリンジェンシーの手段として使用することにより、ナノ粒子に基づいた検出システムにおいて熱サイクルの必要性を排除すること、およびナノ粒子プローブについては熱に基づいたストリンジェンシーよりも高い選択性をもたらすことなど、いくつかの驚くべきかつ予想外の利点がもたらされる。さらに、ストリンジェンシーの手段としての塩濃度の使用は、検出プローブが高温で不安定である場合に有用である。
したがって、本発明の１態様では、核酸を検出する方法が提供される。この方法は、核酸配列の第１の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した基板を提供する工程と、少なくとも一部が該核酸の第２の部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した、ナノ粒子などの標識を提供する工程と、標識と複合体形成した試験基板を形成させるために、該基板、核酸、および標識を、該基板に結合したオリゴヌクレオチドと該核酸との間、および該核酸と該標識に結合したオリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイズさせるのに有効な条件下で接触させる工程と、該試験基板を、非特異的に結合した標識を実質的に除去するのに有効な塩濃度の塩水溶液と接触させる工程と、検出可能な変化を観察する工程とからなる。固定化した捕捉プローブ、標的核酸、およびナノ粒子共役体をハイブリダイゼーション条件下で所定の時間接触させる際、適切な陽イオン強度の塩水溶液を用いたハイブリダイゼーション後の洗浄工程でストリンジェンシーを調整してもよい。
本発明の実施には、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）の「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年およびアウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）、「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第４版、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、１９９９年に記載されている洗浄溶液などの、任意の適切なストリンジェンシー洗浄溶液を利用することが可能である。代表的な塩水溶液は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これら塩の２種以上の組合せ、これら塩のうち１種をリン酸緩衝剤に含めたもの、およびこれら塩の２種以上の組合せをリン酸緩衝剤に含めたものからなる群から選択される塩からなる。リン酸緩衝剤が好ましいが、任意の他の緩衝剤または２種以上の適切な緩衝剤の組合せを使用してもよい。適切な緩衝剤の代表的な例には、それだけには限定されないが、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝剤およびＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝剤が含まれる。
ストリンジェンシー洗浄溶液には任意の適切な濃度の塩および緩衝剤成分を使用しうる。当分野の技術者は、適切な陽イオン濃度を得るための塩溶液の調整方法を知っているであろう。たとえば、当分野の技術者は、異なる陽イオン濃度の様々な溶液を評価し、さらに図６９Ｃに示したものと類似の解離曲線を作成してもよい（実施例３２）。
代表的なストリンジェンシー溶液を実施例３２に記載するが、これにはリン酸緩衝剤中の塩化ナトリウムが含まれる。塩化ナトリウム塩成分は一般に約０Ｍ〜約０．５Ｍ、好ましくは約０．００５Ｍ〜約０．１Ｍの範囲にある。リン酸緩衝剤成分は一般に約０．０１ｍＭ〜約１５ｍＭの範囲にあり、好ましくは約１０ｍＭである。ストリンジェンシー緩衝剤は任意の適切なｐＨ、一般的には約ｐＨ７を有する。ハイブリダイゼーション後の洗浄として塩に基づいた洗浄を用いた場合、少なくとも９０％以上、好ましくは少なくとも９５％または９７％のストリンジェンシー・レベルを達成し得る。
本発明のナノ粒子が好ましい標識であるが、塩に基づいたストリンジェンシー洗浄システムは、オリゴヌクレオチドを有する任意の他の適切に帯電した標識に拡大適用することが可能である。代表的な標識には、それだけには限定されないが、放射性同位元素、フルオレセインやテトラメチルローダミンなどの蛍光色素、アルカリペルオキシダーゼまたは西洋ワサビ・ペルオキシダーゼなどの酵素、ジゴキシゲニンのビオチンなどレポーター基、ポリアニオン・ポリマー、およびラマン色素などの分光学的標識が含まれる。
塩濃度依存性の、ハイブリダイゼーション後のストリンジェンシー条件は、溶液の陽イオン強度の調整に部分的に依存している。当分野の技術者には、オリゴヌクレオチド・プローブの長さ、使用する標識などの要因を適応させるために必要なｐＨや温度など他の要因を調整する方法が分かるであろう。
本発明の別の実施形態では、塩に基づいたストリンジェントな洗浄を使用して、（ａ）核酸を、１対の電極の間に位置し、前記核酸配列の第１の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが付着した基板と、該基板上のオリゴヌクレオチドと前記核酸とがハイブリダイズするのに有効な条件下で接触させる工程と、（ｂ）基板に結合した前記核酸をナノ粒子など第１のタイプの標識と接触させる工程であって、該標識が電気を通し得る材料から作製され、該標識に１種または複数種のオリゴヌクレオチドが付着しており、該オリゴヌクレオチドの少なくとも１種が前記核酸の配列の第２の部分に相補的な配列を有するとともに、該標識上のオリゴヌクレオチドと前記核酸とがハイブリダイズするのに有効な条件下で実施して標識と複合体形成した試験基板を形成させることを特徴とする工程と、（ｃ）該試験基板を、非特異的に結合した標識を十分に除去するのに有効な塩濃度の塩水溶液と接触させる工程と、（ｄ）前記電極の電気特性の変化を検出する工程とからなる方法において、少なくとも２つの部分を有する核酸を検出し得る。
本明細書中に記載するように、基板は、１つの核酸の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはその両方を可能にするために、アレイ内で基板上に配置された複数の電極対を含んでいてもよく、各電極対の間には基板に付着した１種類のオリゴヌクレオチドを備える。本発明のナノ粒子共役体プローブが用いられ、かつ標的核酸が存在する場合は、電極間の回路は閉じられるはずであり、あるいは銀、金、または金属など他の電導性材料、または炭素原子を含めた電気を通し得る材料の局所的強化を触媒し得る材料を含めた、本明細書中に記載する任意の適切な材料によって閉じることが可能である。閉回路の存在は、電極の電気特性の変化など任意の適切な手段によって検出することが可能である。このような変化は、それだけには限定されないが、導電率、抵抗率、電気容量、または
インピーダンスの変化を含めた任意の適切な手段によって検出することが可能である。
用語「ある」存在とは、「１つ以上の」その存在を表す。例えば、「ある特徴」とは、１つ以上の特徴または少なくとも１つの特徴を表す。したがって、本明細書においては、用語「ある」「１つ以上」および「少なくとも１つ」は互換的に用いられる。用語「含んでなる」「含む」および「有する」は互換的に用いられていることに留意されたい。
実施例１： オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子
Ａ： 金ナノ粒子の調製
Ｆｒｅｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．，第２４１巻，２０ページ（１９７３年）およびＧｒａｂａｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第６７巻，７３５ページ（１９９５年）に記載のように、ＨＡｕＣｌ４をクエン酸塩で還元して、金コロイド（直径１３ｎｍ）を調製した。簡単に説明すると、すべてのガラス器を王水（３部のＨＣｌ、１部のＨＮＯ３）で洗浄し、ＮａｎｏｐｕｒｅＨ２Ｏでリンス、次いで使用前にオーブンで乾燥させた。ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムはアルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。水性ＨＡｕＣｌ４（１ｍＭ、５００ｍｌ）を攪拌還流させた。次いで、３８．８ｍＭのクエン酸ナトリウム（５０ｍｌ）を素早く添加した。溶液の色は薄黄色から暗紅色に変わったが、還流を１５分間継続した。室温に冷ました後、赤色溶液をミクロン・セパレーションズ社（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．）の１ミクロンフィルターに通して濾過した。Ａｕコロイドを、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を用いたＵＶ−可視分光法および日立 ８１００透過型電子顕微鏡を用いた透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）により特性決定した。直径１３ｎｍの金粒子は、標的および１０〜３５ヌクレオチド範囲のプローブオリゴヌクレオチドと共に凝集させると目に見える変色を生じる。
Ｂ．オリゴヌクレオチドの合成
ホスホロアミダイト化学を用いる単カラムモードのＭｉｌｌｉｇｅｎｅ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡ合成機を用いて１μｍｏｌスケールでオリゴヌクレオチドを合成した。Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（編），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１年）。すべての溶液はミリジーン社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎｅ）（ＤＮＡ合成グレード）から購入した。平均カップリング効率は９８〜９９．８％の範囲であり、最終ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基は精製を支援するためにオリゴヌクレオチドから切断しなかった。
３′−チオール−オリゴヌクレオチドを得るために、チオール修飾剤Ｃ３ Ｓ−Ｓ ＣＰＧ支持体をグレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入し、自動合成機に使用した。固相支持体からの通常の切断の間（５５℃で１６時間）に、ＮＨ４ＯＨ溶液に０．０５Ｍ ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加えて、３′ジスルフィドをチオールに還元した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製する前に、過剰なＤＴＴを酢酸エチルで抽出して除去した。
５′−チオールオリゴヌクレオチドを得るために、５′−チオール修飾剤Ｃ６−ホスホロアミダイト試薬をヴァージニア州 ２０１６６、スターリング、ファルコン・プレイス
４４９０１所在のグレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４４９０１ Ｆａｌｃｏｎ Ｐｌａｃｅ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖａ ２０１６６）から購入した。オリゴヌクレオチドを合成し、最終ＤＭＴ保護を除去した。次いで、１００μｍｏｌの５′チオール変性剤Ｃ６−ホスホロアミダイトに、１ｍｌの無水アセトニトリルを加えた。２００μｌのアミダイト溶液と２００μｌの（合成機から出来たばかりの）アクチベーターとを
混合し、まだ固相支持体上の合成オリゴヌクレオチドを含有するカラム上にシリンジで導入し、カラム中で１０分間往復運動させた。次いで、支持体を無水アセトニトリルで３０秒間洗浄（２×１ｍｌ）した。カラムに７００μｌの０．０１６Ｍ Ｉ２／Ｈ２Ｏ／ピリジン混合物（酸化剤溶液）を導入し、次いで、２つのシリンジを用いてカラム中で３０秒間往復運動させた。次いで、支持体をＣＨ３ＣＮ／ピリジンの１：１混合物（２×１ｍｌ）で１分間洗浄した後、無水アセトニトリル（２×１ｍｌ）で最終洗浄し、その後、カラムを窒素流で乾燥させた。精製を支援するために、トリチル保護基は除去しなかった。
０．０３Ｍ Ｅｔ３ＮＨ＋ＯＡｃ−緩衝液（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７と共に、１％／分勾配の９５％ＣＨ３ＣＮ／５％ＴＥＡＡを用いて、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＯＤＳ
ハイパーシル（ｈｙｐｅｒｓｉｌ）カラム（４．６×２００ｍｍ、５ｍｍ粒度）を具備したＤｉｏｎｅｘ ＤＸ５００システムで、逆相ＨＰＬＣを実施した。流速は１ｍｌ／分、ＵＶ検出は２６０ｎｍであった。ＤＭＴ保護非修飾オリゴヌクレオチドの精製には、分取ＨＰＬＣ（溶離時間２７分）を用いた。緩衝液を回収して蒸発させた後、８０％酢酸で室温下に３０分間処理してオリゴヌクレオチドからＤＭＴを切断した。次いで、溶液を蒸発させてほぼ乾固し、水を加え、酢酸エチルを用いて切断ＤＭＴをオリゴヌクレオチド水溶液から抽出した。オリゴヌクレオチドの量は、２６０ｎｍでの吸光度により定量し、最終純度を逆相ＨＰＬＣ（溶離時間１４．５分）で評価した。
３′−チオールオリゴヌクレオチドの精製には同じプロトコルを用いたが、但し、形成されるジスルフィドの量を減少させるためにＤＭＴを抽出した後でＤＴＴを加えた。４℃下に５時間後、酢酸エチルを用いてＤＴＴを抽出し、オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ（溶離時間１５分）で再精製した。
５′−チオール修飾オリゴヌクレオチドを精製するために、非修飾オリゴヌクレオチドの場合と同じ条件下に分取ＨＰＬＣを実施した。精製後、無水オリゴヌクレオチド試料に、１５０μｌの５０ｍＭ ＡｇＮＯ３溶液を加えて、トリチル保護基を除去した。試料は、切断が起こると同時に乳白色に変わった。２０分後、ＤＴＴの１０ｍｇ／ｍｌ溶液２００μｌを加えてＡｇを複合体化（反応時間５分）し、試料を遠心して黄色複合体を沈殿させた。次いで、オリゴヌクレオチド溶液（＜５０ ＯＤ）を、（１０塩基を超えるオリゴヌクレオチドの脱塩および緩衝液交換用のＤＮＡ Ｇｒａｄｅ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｄ−２５ Ｍｅｄｉｕｍを有する）精製用の脱塩ＮＡＰ−５カラム（スウェーデンのウプサラ所在ファルマシア・バイオテク社（Ｐｈａｒａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ））上に移した。５′−チオール修飾オリゴヌクレオチドの量を、ＵＶ−可視分光法により２６０ｎｍでの吸光度を測定して定量した。１０ｍＭ ＮａＯＨ溶液（ｐＨ１２）と共に、２％／分勾配の１０ｍＭ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ溶液を用いて、Ｄｉｏｎｅｘ Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ ＰＡ―１００（４×２５０）カラムでイオン交換ＨＰＬＣを実施して、最終純度を評価した。典型的には、約１９分および２５分の溶離時間で２つのピークを得た（溶離時間はオリゴヌクレオチド鎖長に依存する）。これらのピークはそれぞれチオールオリゴヌクレオチドおよびジスルフィドオリゴヌクレオチドに対応していた。
Ｃ．オリゴヌクレオチドの金ナノ粒子への付着
上記パートＡに記載のように調製した１７ｎＭ（１５０μｌ）Ａｕコロイドの水溶液を、パートＢに記載のように調製した３．７５μＭ（４６μｌ）３′−チオール−ＴＴＴＧＣＴＧＡと混合し、キャップをした１ｍｌ容量Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆバイアル中室温下に２４時間放置した。第２コロイド溶液を３．７５μＭ（４６μｌ）３′−チオール−ＴＡＣＣＧＴＴＧと反応させた。これらのオリゴヌクレオチドは非相補的であることに留意されたい。使用直前に、等量の２種のナノ粒子溶液を合わせた。オリゴヌクレオチドは非相補的であるから、反応は起こらなかった。
オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は高温（８０℃）および高塩濃度（１Ｍ ＮａＣｌ）下に何日も安定であり、粒子の成長は認められなかった。高塩濃度下に安定であることは、そのような条件が本発明の検出法およびナノファブリケーションの基礎を構成するハイブリダイゼーション反応に要求されるために重要である。
実施例２： ナノ粒子凝集体の形成
Ａ．連結オリゴヌクレオチドの作製
実施例１のパートＢに記載のように、２種（非チオール化）オリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは以下の配列を有していた：
３′ＡＴＡＴＧＣＧＣＧＡ ＴＣＴＣＡＧＣＡＡＡ（配列番号１）；および
３′ＧＡＴＣＧＣＧＣＡＴ ＡＴＣＡＡＣＧＧＴＡ（配列番号２）。
これら２種のオリゴヌクレオチドを１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝（ｐＨ７．０）溶液中で混合すると、ハイブリダイズして、１２塩基対オーバーラップおよび２つの８塩基対付着末端を有する二本鎖が形成された。付着末端はそれぞれ、実施例１のパートＣで調製したＡｕコロイドに付着しているオリゴヌクレオチドの１つの配列に対して相補的な配列を有していた。
Ｂ．ナノ粒子凝集体の形成
この実施例のパートＡで作製した連結オリゴヌクレオチド（ＮａＣｌで希釈後の最終濃度０．１７μＭ）を、室温下に、実施例１のパートＣで調製したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体（ＮａＣｌで希釈後の最終濃度５．１ｎＭ）に加えた。次いで、溶液をＮａＣｌ水溶液で（１Ｍの最終濃度に）希釈し、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適した条件である１０ｍＭ リン酸、ｐＨ７で緩衝した。その直後に赤から紫への変色が観察され、続いて沈殿反応が生じた。図６参照。数時間の間に、溶液は透明になり、反応容器の底にピンクがかった灰色の沈殿物が沈殿した。図６参照。
このプロセスがオリゴヌクレオチドとコロイドを共に含むことを確認するために、沈殿物を回収し、ｐＨ７で緩衝する１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中で（振とうして）再懸濁させた。このようにして、ナノ粒子にハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを除去する。次いで、ハイブリダイズしたオリゴデオキシリボヌクレオチドに特徴的な吸光度（２６０ｎｍ）および金粒子間の間隔を表す凝集コロイドに特徴的な吸光度（７００ｎｍ）をモニターして、温度／時間解離実験を行った。図７参照。
温度を０〜８０℃の間で１℃／分の速度で循環させながら、Ｐｅｌｔｉｅｒ ＰＴＰ−１ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｃｅｌｌ Ｈｏｌｄｅｒを用いるＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ２ＵＶ−可視分光光度計で２６０および７００ｎｍでの吸光度の変化を記録した。１０ｍＭ リン酸緩衝液を用いてｐＨ７で緩衝し、１Ｍ ＮａＣｌ濃度のＤＮＡ溶液は、約１吸光度単位（ＯＤ）であった。
その結果は図８Ａに示されている。温度を０℃〜（二本鎖の解離温度（Ｔｍ）（Ｔｍ＝４２℃）より３８℃高い）８０℃の間で循環させると、コロイドとオリゴヌクレオチドの両方の光学的シグナチャーの間に良好な相関が存在した。何も結合していないＡｕコロイドのＵＶ−可視スペクトルははるかに温度依存度が低かった（図８Ｂ）。
ポリマーオリゴヌクレオチド−コロイド沈殿物をその融解点より高い温度で加熱すると、肉眼で見える実質的な光学的変化があった。透明溶液は、ポリマー生体材料がデハイブリダイズして水溶液に可溶である非結合コロイドを生成すると、暗紅色に変わった。図８Ａの温度トレースにより証明されるように、このプロセスは可逆的であった。
対照実験において、１４−Ｔ：１４−Ａ二本鎖は、可逆的Ａｕコロイド粒子の凝集を誘発するには有効でないことが明らかにされた。別の対照実験で、付着末端に４塩基対誤対合がある連結オリゴヌクレオチド二本鎖は、（実施例１のＣ部に記載のように調製し、上記のように反応させた）オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子の可逆的粒子凝集を誘発しないことが判明した。第３の対照実験において、連結オリゴヌクレオチドの付着末端に対して相補的な配列を有し、ナノ粒子と反応させた非チオール化オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子を連結オリゴヌクレオチドと合わせたときに可逆凝集を生成しなかった。
重合／集合体プロセスについてのさらなる事実が沈殿物の透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）研究から明らかになった。ＴＥＭは、日立 ８１００透過型電子顕微鏡で実施した。孔の多い炭素格子上に１００μｌのコロイド溶液をスポットして典型的な試料を調製した。次いで、格子を真空乾燥させ、画像を形成した。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを介して結合したＡｕコロイドのＴＥＭ画像は、集合した大きなＡｕコロイド網目構造を示した（図９Ａ）。何も結合していないＡｕコロイドは、同等な条件下には凝集せずに、分散するか、または粒子成長反応を起こす。Ｈａｙａｔ，Ｃｏｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９１年）。今日までに実施された実験ではコロイド粒子の成長の事実は全く存在しないことに留意されたい；ハイブリダイズしたコロイドは、平均直径が１３ｎｍの著しく一定したサイズを有するようである。
ＴＥＭにより、三次元凝集体の秩序度の評価を困難にする層の重ね合わせが得られる。しかし、単層の二次元凝集体のもっと小規模の画像から、自己集合体プロセスに関するより多くの事実が得られた（図９Ｂ）。均一な粒子が約６０Å離れている密集凝集体集合体が見られる。この間隔は、用いられた配列を有する剛性オリゴヌクレオチドハイブリッドを介して結合したコロイドに関して予測された９５Å間隔よりいくらか短い。しかし、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと連結オリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせた後で得られた二本鎖中のニックのために、これらの凝集体は剛性ハイブリッドではなく、極めて可撓性であった。これは、系オーバーラップ鎖を４つから３つに減らす（それによってニックの数を減らす）か、または二本鎖の代わりに三本鎖を用いることにより制御し得る可変要素であることに留意されたい。
実施例３： オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
実施例１に記載のように金コロイド（直径１３ｎｍ）を調製した。チオール−オリゴヌクレオチド［ＨＳ（ＣＨ２）６ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）−オリゴヌクレオチド］も実施例１に記載のように調製した。
実施例１に記載のチオール−オリゴヌクレオチドを金ナノ粒子に付着させる方法は、満足すべき結果をもたらさない場合があることが判明した。特に、長いオリゴヌクレオチドを用いたとき、オリゴヌクレオチド−コロイド共役体は、診断系に通常存在するバックグラウンドＤＮＡ用のモデルとして用いられる大過剰の高分子量サケ精子ＤＮＡの存在下では安定でなかった。コロイドをチオール−オリゴヌクレオチドに長く暴露すると、サケ精子ＤＮＡに対して安定なオリゴヌクレオチド−コロイド共役体が生成したが、得られた共役体は、満足にハイブリダイズしていなかった。さらなる実験により、共役体が高分子ＤＮＡに対して安定でありかつ満足にハイブリダイズするように任意の長さのチオール−オリゴヌクレオチドを金コロイドに付着させる以下の手順を得た。
水中の金コロイド（１７ｎＭ）の１ｍｌ溶液を水中の過剰な（３．６８μＭ）チオール−オリゴヌクレオチド（２８塩基長）と混合し、混合物を室温下に１２〜２４時間放置した。次いで、１００μｌの０．１Ｍ リン酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０および１
００μｌの１．０Ｍ ＮａＣｌを予備混合して加えた。１０分後、１０μｌの１％水性ＮａＮ３を添加し、混合物をさらに４０時間放置した。この「熟成」ステップは、チオール−オリゴヌクレオチドにより表面被覆面積を増大させて、金表面からオリゴヌクレオチド塩基を置換させるように設計された。その後のアッセイで、４０時間のインキュベーション後に溶液をドライアイス浴中で凍結し、次いで室温下に解凍すると、いくらか透明度が増し、境界がよりはっきりした赤色スポットが得られた。どちらにしても、次ぎに、溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４１４にて１４，０００ｒｐｍで約１５分間遠心して、（２６０ｎｍでの吸光度によって示されている）ほとんどのオリゴヌクレオチドと共に、（５２０ｎｍでの吸光度により示されている）７〜１０％の金コロイドを含有する極めて薄いピンク色の上清と、管の底に密で暗色のゼラチン質残留物を得た。上清を除去し、残留物を約２００μｌの緩衝液（１０ｍＭ リン酸、１．０Ｍ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、再遠心した。上清溶液を除去した後、残留物を１．０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭ リン酸、０．１Ｍ ＮａＣｌ）および１０μｌの１％ＮａＮ３水溶液中に入れた。溶液をピペットで数回吸い込んだり、吐出したりして溶解を支援した。得られた赤色マスター溶液は、室温下に数ヶ月間放置し、シリカ薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート（実施例４参照）上に置き、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、または高濃度のサケ精子ＤＮＡ含有溶液を添加しても、安定であった（すなわち、赤色を保ち、凝集しなかった）。
実施例４： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体のハイブリダイゼーションの促進
実施例３に記載のように、図１１に示されているオリゴヌクレオチド−金コロイド共役体ＩおよびＩＩを調製した。これら２種の共役体のハイブリダイゼーションは極めて緩慢であった。特に、水性０．１Ｍ ＮａＣｌまたは１０ｍＭ ＭｇＣｌ２＋０．１Ｍ ＮａＣｌ中で共役体ＩおよびＩＩ試料を混合し、混合物を室温下に１日放置しても、変色はほとんどまたは全く生じなかった。
２つの方法がハイブリダイゼーションを改善することが分った。最初の方法では、共役体ＩおよびＩＩの混合物（０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液中に各１５ｎＭを含有）をドライアイス−イソプロピルアルコール浴中で５分間凍結し、次いで混合物を室温下に解凍すると、より高速の結果が得られた。解凍した溶液は、青みを帯びた色を示した。標準Ｃ−１８ＴＬＣシリカプレート（オールテク・アソシエイツ社（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ））上に溶液１μｌをスポットすると、直ぐに濃青色が見られた。ハイブリダイゼーションおよびその結果として起こる凍結−解凍手順により起こった変色は可逆的であった。ハイブリダイズした溶液を８０℃に加熱すると、溶液は赤色に変わり、ＴＬＣプレート上にピンク色のスポットを生成した。次いで、凍結、解凍すると、系は（青色の）ハイブリダイズ状態に戻った（Ｃ−１８ＴＬＣプレート上の溶液とスポット両方共）。溶液を凍結しなかった同様な実験では、Ｃ−１８ＴＬＣプレート上で得られたスポットはピンク色であった。
高速結果を得る第２の方法は、共役体と標的を温める方法である。例えば、別の実験では、０．１Ｍ ＮａＣｌ溶液中でオリゴヌクレオチド−金コロイド共役体とオリゴヌクレオチド標的配列とを急速に６５℃に温め、２０分かけて室温に冷ました。Ｃ−１８シリカプレート上にスポットして、乾燥させると、ハイブリダイゼーションを示す青いスポットが得られた。それに対し、共役体と標的を室温下に１時間０．１Ｍ ＮａＣｌ中でインキュベートしても、ハイブリダイゼーションを示す青色を生成しなかった。０．３Ｍ ＮａＣｌ中でのハイブリダイゼーションはさらに高速である。
実施例５： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図１２Ａ−Ｆに示されているオリゴヌクレオチド−金コロイド共役体１および２は実施例３に記載のように作製し、図１２Ａに示されているオリゴヌクレオチド標的３は、実施
例２に記載のように作製した。誤対合標的および欠失標的４、５、６および７は、イリノイ州シカゴ所在のノースウエスタン大学バイオテクノロジー施設（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から購入した。これらのオリゴヌクレオチドを４０ｎｍｏｌスケールで合成し、逆相Ｃ１８カートリッジ（ＯＰＣ）上で精製した。それらの純度は、イオン交換ＨＰＬＣを実施して定量した。
ストリンジェントな温度に、急速加熱し、次いで急速に冷却して、選択的ハイブリダイゼーションを達成した。例えば、１５ｎＭの各オリゴヌクレオチド−コロイド共役体１および２と、３ｎｍｏｌの標的オリゴヌクレオチド３、４、５、６または７を含有する１００μｌの０．１Ｍ ＮａＣｌ＋５ｍＭ ＭｇＣｌ２を、７４℃に加熱し、以下の表に示されている温度に冷却し、混合物をこの温度で１０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを実施した。次いで、各反応混合物の３μｌ試料をＣ−１８ＴＬＣシリカプレート上にスポットした。（５分間）乾燥させると、ハイブリダイゼーションが起こった場合には濃青色が現われた。
結果を以下の表１に示す。ピンク色のスポットは陰性テスト（すなわち、ナノ粒子がハイブリダイゼーションによって結合しなかったこと）を示し、青色のスポットは陽性テスト（すなわち、ナノ粒子が両オリゴヌクレオチド−コロイド共役体に関するハイブリダイゼーションにより近接させたこと）を示す。
表１から分るように、６０℃のハイブリダイゼーションでは、完全対合標的３の場合のみ青色スポットが得られた。５０℃のハイブリダイゼーションでは、標的３と６の両方で青色スポットを生成した。４５℃のハイブリダイゼーションでは、標的３、５および６で青色スポットが得られた。
関連シリーズにおいて、１誤対合Ｔヌクレオチドを含む標的は、５８℃で陽性テスト（青色）を生成し、共役体１および２は６４℃で陰性テスト（赤色）を生成した。同一条件下で、完全対合標的（３）は、どちらの温度下にも陽性テストを生成したが、これは、このテストが完全対合標的と、１誤対合塩基を含む標的とを識別し得ることを示している。
異なるハイブリダイゼーション法を用いても同様な結果が得られた。特に、凍結、解凍し、次いで急速にストリンジェントな温度に温めることにより、選択的ハイブリダイゼーションが達成された。例えば、１５ｎＭの各オリゴヌクレオチド−コロイド共役体１および２と、１０ｐｍｏｌの標的オリゴヌクレオチド３、４、５、６または７を含有する１００μｌの０．１Ｍ ＮａＣｌを、ドライアイス−イソプロピルアルコール浴中で５分間凍結し、室温下に解凍し、次いで、急速に以下の表２に示されている温度に冷却し、混合物をこの温度で１０分間インキュベートしてハイブリダイゼーションを実施した。次いで、各反応混合物の３μｌ試料をＣ−１８ＴＬＣシリカプレート上にスポットした。結果を表２に示す。
これらの系の重要な特徴は、温度変化に関連する変色が極めて急激であり、かつ約１℃の温度範囲にわたって発生することである。これは、コロイド共役体が関与する融解および会合プロセスにおける高い協同性を示しており、完全対合配列と１塩基対誤対合を含むオリゴヌクレオチド標的を容易に識別し得ることを示している。
高い識別度は２つの特徴によるものと考えられる。第１に、陽性シグナルを得るには、標的上の２つの比較的短いプローブオリゴヌクレオチドセグメント（１５ヌクレオチド）の整列が必要である。同等な２成分検出系において、どちらかのセグメント中に誤対合があると、もっと長いプローブ（例えば、３０塩基長のオリゴヌクレオチド）中の誤対合より不安定になる。第２に、溶液中の標的オリゴヌクレオチドとナノ粒子共役体とのハイブリダイゼーションで得られた２６０ｎｍでのシグナルは、ＤＮＡに基づくものではなく、ナノ粒子に基づいている。このシグナルは、多重オリゴヌクレオチド二本鎖によるポリマー網目構造として組織化されたナノ粒子集合体の解離に依存する。これによって、凝集体の解離に関して観察される温度範囲が、標準ＤＮＡ熱変性と比べて狭められる。簡単に説明すると、架橋凝集体中の一部の二本鎖は、ナノ粒子を溶液中に分散させることなく解離し得る。したがって、凝集体を融解させる温度範囲は、ナノ粒子を含まない同等な系の融解に関わる温度範囲（１２℃）に比べて極めて狭い（４℃）。この検出法のさらに顕著かつ有利な点は、Ｃ−１８シリカプレート上で観察される比色応答（＜１℃）の温度範囲である。原則的に、この３成分ナノ粒子をベースとする方法は、標的核酸とハイブリダイズしている一本鎖プローブをベースとする任意の２成分検出系よりも選択的であろう。
１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸、ｐＨ７）中で、１ｎｍｏｌの標的３を含有するマスター溶液を調製した。この溶液１μ
ｌは、標的オリゴヌクレオチド１０ｐｍｏｌに相当する。マスター溶液からアリコートを取り、ハイブリダイゼーション緩衝液で所望の濃度に希釈して、連続希釈を実施した。表３は、プローブ１および２と異なる量の標的３との混合物３μｌを用いて得た感度を示している。凍結−解凍条件を用いてハイブリダイゼーションを実施した後、これらの溶液の３μｌアリコートをＣ−１８ ＴＬＣプレート上にスポットして、色を定量した。以下の表３において、ピンク色は陰性テストを示し、青色は陽性テストを示す。
この実験は、１０ｆｍｏｌがこの特定の系の検出下限であることを示している。
実施例６： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図１３Ｂに示されているように、ＤＮＡ修飾ナノ粒子を修飾透明基板上に吸着させた。この方法は、ＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用を用いて、ＤＮＡ修飾ナノ粒子をガラス製基板に付着しているナノ粒子に結合させるステップから成る。
ガラス製顕微鏡スライドはフィッシャー・サイエンティフック社（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｆｉｔｉｃ）から購入した。先端にダイヤモンドが付いたけがきペンを用いて、スライドを約５×１５ｍｍの部片に切断した。スライドを、５０℃の４：１Ｈ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ溶液中に２０分間浸漬して清浄した。次いで、スライドを、多量の水、次いでエタノールでリンスし、乾燥窒素流下に乾燥させた。スライド表面をチオール末端シランで官能化するために、スライドを脱気エタノール１％（質量）メルカプトプロピル−トリメトキシシラン溶液に１２時間浸漬した。スライドをエタノール溶液から取り出し、エタノール、次いで水でリンスした。直径１３ｎｍの金ナノ粒子を含有する溶液（実施例１に記載の配合物）にナノ粒子を浸漬して、スライドのチオール末端表面上に吸着させた。コロイド溶液中で１２時間後、スライドを取り出し、水でリンスした。得られたスライドは、吸着されたナノ粒子に帰するピンク色を有し、水性金ナノ粒子コロイド溶液と同様なＵＶ−可視吸光度プロファイル（５２０ｎｍでの表面プラズモン吸光度ピーク）を示す。図１４Ａ参照。
ガラス製スライドを、新たに精製された３′チオールオリゴヌクレオチド（３′チオール ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ［配列番号３３］（実施例１および３に記載のように合成）を含有する０．２ＯＤ（１．７μＭ）溶液中に浸漬して、ＤＮＡをナノ粒子修飾表面に付着させた。１２時間浸漬させた後、スライドを取り出し、水でリンスした。
検体ＤＮＡ鎖がナノ粒子を修飾表面に結合させる能力を証明するために、連結オリゴヌクレオチドを調製した。（実施例２に記載のように調製した）連結オリゴヌクレオチドは、既に基板表面上に吸着されているＤＮＡ（配列番号３３）と相補的な１２ｂｐ末端を有する配列を含む２４ｂｐ長（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ）［配列番号３４］であった。次いで、基板を、連結オリゴヌクレオチド（０．４ＯＤ、１
．７μＭ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７）溶液中に１２時間浸漬した。基板を取り出し、類似緩衝液でリンスした後、基板を、基板に付着している連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていない部分と相補的なオリゴヌクレオチド（ＴＡＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣ５′チオール［配列番号３５］）（実施例３に記載のように調製）で修飾された直径１３ｎｍの金ナノ粒子を含有する溶液中に浸漬した。１２時間浸漬した後、基板を取り出し、ハイブリダイゼーション緩衝液でリンスした。基板の色は紫色に変わっており、５２０ｎｍでのＵＶ−可視吸光度はほぼ二倍になった（図１４Ａ）。
オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子が、連結オリゴヌクレオチドとのＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用によりオリゴヌクレオチド／ナノ粒子修飾表面に付着したことを確認するために、融解曲線を作成した。融解実験のために、基板を１ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液を含有するキュベットに入れ、実施例２のパートＢで用いたものと同じ装置を用いた。基板の温度を０．５℃／分の速度で増大させながら、ナノ粒子に帰する吸光度シグナル（５２０ｎｍ）をモニターした。温度が６０℃を越えたときに、ナノ粒子のシグナルは劇的に低下した。図１４Ｂ参照。シグナルの一次導関数は６２℃の融解温度を示したが、これは、ナノ粒子を含まない溶液中でハイブリダイズした３つのＤＮＡ配列に関して見られた温度と一致する。図１４Ｂ参照。
実施例７： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図１５Ａ−Ｇに示されている検出系は、２種のプローブ１および２が相補的標的４上に末端同士で整列するように設計した。これは、２つのプローブが標的鎖上に近接して整列している実施例５に記載の系とは異なる（図１２Ａ−Ｆ参照）。
図１５Ａ−Ｇに示されているオリゴヌクレオチド−金ナノ粒子共役体は、実施例３に記載のように調製したが、但し、ナノ粒子は、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸、ｐＨ７）に再分散させた。最終ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体濃度は、赤色のナノ粒子を生成する５２２ｎｍでの表面プラズモンバンド強度の低下を測定して、１３ｎＭであると予測した。図１５Ａ−Ｇに示されているオリゴヌクレオチド標的は、イリノイ州エバンストン所在のノースウエスタン大学バイオテクノロジー施設（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，ＩＬ）から購入した。
１３ｎＭ オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２を含有するハイブリダイゼーション緩衝液１５０μｌと、６０ｐｍｏｌ（６０μｌ）の標的４とを混合すると、溶液の色は直ぐに赤色から紫色に変化した。この変色は、金ナノ粒子の大きなオリゴヌクレオチド結合ポリマー網目構造の形成の結果として起こり、これは、ナノ粒子の表面プラズモン共鳴の赤色シフトをもたらす。溶液を２時間にわたって放置すると、大きな巨視的性質の凝集体の沈殿が観察された。懸濁凝集体を含む溶液の「融解分析」を実施した。「融解分析」を実施するために、溶液をハイブリダイゼーション緩衝液で１ｍｌに希釈し、温度を２５℃から７５℃まで上昇させながら、１分／１℃の保持時間で、２６０ｎｍでの凝集体の光学シグナチャーを１分間隔で記録した。５３．５℃の「融解温度」（Ｔｍ）で、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子ポリマーとしての凝集体の特性決定と一致する、特徴的な急激な転移（半値全幅、一次導関数のＦＷ１／２＝３．５℃）が観察された。これは、ナノ粒子を含まないオリゴヌクレオチドに関して観察されたもっと広幅の転移（Ｔｍ＝５４℃、ＦＷ１／２＝〜１３．５℃）に関連するＴｍに十分匹敵する。ナノ粒子を含む分析と類似の条件下に、ナノ粒子を含まないオリゴヌクレオチド溶液の「融解分析」を実施したが、但し、温度は１０℃から８０℃まで増大させた。また、溶液の各オリゴヌクレオチド成分は１．０４μＭであった。
系の選択性をテストするために、プローブ１と２の完全相補体４から形成された凝集体のＴｍを、１単塩基誤対合、欠失または挿入を含む標的から形成された凝集体のＴｍ′と比較した（図１５Ａ−Ｇ参照）。不完全標的を含むすべての金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド凝集体は、種々の凝集体のＴｍ値によって証明されているように、完全相補体から形成された凝集体と比べて、有意な測定可能不安定化を示した（図１５Ａ−Ｇ参照）。不完全標的を含有する溶液は、５２．５℃に保持された水浴に入れたときのそれらの色によって完全相補体を含有する溶液から容易に区別し得る。この温度は、誤対合ポリヌクレオチドのＴｍより高く、したがって、完全標的を含有する溶液のみがこの温度下に紫色を呈した。半相補的標的を含むプローブ溶液に関しても「融解分析」を実施した。２６０ｎｍでの吸光度は極くわずかに増大したことが観察された。
次いで、ハイブリダイゼーション緩衝液中に５０μｌの各プローブ（１３ｎＭ）を含有する溶液に、２μｌ（２０ｐｍｏｌ）の各オリゴヌクレオチド標的（図１５Ａ−Ｇ参照）を加えた。室温下に１５分間放置した後、溶液を、温度制御水浴に移し、以下の表４に示されている温度下に５分間インキュベートした。次いで、各反応混合物の３μｌ試料をＣ−１８シリカプレート上にスポットした。凝集、したがって変色を誘発させるためには両プローブを標的上で整列させる必要があることを証明するために、２回の対照実験を行った。１回目の対照実験は、標的が存在しないプローブ１とプローブ２とから構成した。２回目の対照実験は、一方のプローブ配列のみと相補的な標的３を含むプローブ１とプローブ２とから構成した（図１５Ｂ参照）。結果は以下の表４に示されている。ピンク色のスポットは陰性テストを示し、青色のスポットは陽性テストを示している。
注目すべきは、肉眼で検出し得る比色変化は、１℃未満にわたって発生し、それによって、完全標的４は、誤対合（５および６）、末端欠失（７）および２種のオリゴヌクレオチドプローブが出会う標的個所での１単塩基の挿入（８）を有する標的から容易に区別し得る（表４参照）ことである。比色変化Ｔｃは、Ｔｍと温度では近いが、同一ではない。どちらの対照の場合も、すべての温度下に観察されたピンクがかった赤色によって証明されるように、溶液中の粒子の凝集または不安定性の徴候はなく、すべての温度下のプレートテストで陰性スポット（ピンク色）を示した（表４）。
１単塩基挿入標的８が完全相補性標的４から区別し得るという観察結果は、２種のプローブ配列を有する挿入鎖の完全相補性を考えれば、本当に注目すべきことである。８およびナノ粒子プローブから形成された凝集体の不安定化は、２つの短いプローブの使用と、完全相補性標的にハイブリダイズしたときにプローブの末端が出会う２つのチミジン塩基間の塩基の積み重ねの喪失とによるようである。同等条件（Ｔｍ＝５１℃）下に３塩基対挿入（ＣＣＣ）を含む標的をプローブとハイブリダイズさせると、類似の結果が観察された。実施例５で上述した系において、塩基挿入を有する標的は、完全相補性標的から区別できなかった。したがって、この実施例に記載されている系は選択性の点で極めて好ましい。また、この系は、増幅技術を用いずにおよそ１０ｆｍｏｌの実施例５に記載の系と同じ感度を示した。
これらの結果は、標的鎖に沿った任意の１単塩基誤対合と共に、標的鎖への任意の挿入をも検出し得ることを示している。変色を検出し得る温度範囲は極めて急勾配であり、変化は極めて狭い温度範囲にわたって生じる。この急激な変化は、標的オリゴヌクレオチド鎖を介して結合された大きなコロイド網目構造が関与する融解プロセスに大きな協同度が存在することを示している。これは、データで示されているように顕著な選択性をもたらす。
実施例８： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
「充填」二本鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを含む１式の実験を行った。図１６Ａに示されているナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体１および２を、図１６Ａ−Ｃに示されているような種々の長さの標的（２４、４８および７２塩基長）および相補的フィラーオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。条件は、その他の点では、実施例７に記載の通りであった。また、オリゴヌクレオチドとナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は実施例７に記載のように調製した。
予測したように、異なる反応溶液は、ハイブリダイゼーション後に、金ナノ粒子の間隔依存性光学特性による顕著に異なる光学特性を有していた。以下の表５参照。しかし、これらの溶液をＣ−１８ ＴＬＣプレート上にスポットして、室温または８０℃で乾燥させると、標的オリゴヌクレオチドの長さや金ナノ粒子間の間隔とは無関係に、青色を呈色した。表５参照。これは、固相支持体がハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の凝集を促進するために起こると考えられる。これは、溶液をＴＬＣプレート上にスポットすることにより、金ナノ粒子間の間隔がかなり（少なくとも７２塩基）になるが、それでも比色検出が可能であることを証明している。
この実施例や他の実施例で観察された変色は、金ナノ粒子間の間隔（粒子間間隔）がナノ粒子の直径とほぼ同じかそれより小さいときに起こる。したがって、ナノ粒子のサイズ、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドのサイズ、およびナノ粒子を標的核酸にハイブリダイズさせるときのナノ粒子の間隔は、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体が核酸標的とハイブリダイズして凝集体を形成するときに変色が観察可能であるかどうかに影響を与える。例えば、１３ｎｍの直径を有する金ナノ粒子は、長さが１０〜３５ヌクレオチドの標的配列とハイブリダイズするように設計されたナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドを用いて凝集させると、変色を生じるであろう。ナノ粒子を標的核酸にハイブリダイズさせたときに変色を生じさせるのに適したナノ粒子間間隔は、結果が証明しているように、凝集の度合いに応じて異なるであろう。これらの結果はさらに、固体表面が既に凝集している試料の凝集をさらに促進し、金ナノ粒子をさらに近接させることを示している。
金ナノ粒子に関して観察された変色は、金の表面プラズモン共鳴のシフトや広がりによるものであり得る。この変色が直径が約４ｎｍ未満の金ナノ粒子に関して起こる可能性はありそうにない。というのは、核酸の特異的検出に必要なオリゴヌクレオチドの長さがナノ粒子の直径を超えるからである。
実施例９： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
それぞれプローブ１と２（図１２Ａ）から５μｌを緩衝液（１０ｍＭ リン酸、ｐＨ７）と合わせて０．１Ｍ ＮａＣｌの最終濃度とし、この溶液にヒト尿１μｌを添加した。この溶液を凍結、解凍し、次いでＣ−１８ ＴＬＣプレート上にスポットしたが、青色は発生しなかった。１２．５μｌの各プローブと、２．５μｌのヒト尿を含有する類似溶液に、０．２５μｌ（１０ｐｍｏｌ）の標的３（図１２Ａ）を加えた。溶液を凍結、解凍し、次いでＣ−１８ ＴＬＣプレート上にスポットすると、青色スポットが得られた。
ヒト唾液の存在下で類似実験を行った。１２．５μｌの各プローブ１および２と、２および２．５μｌの標的３を含有する溶液を７０℃に加熱した。室温に冷ました後、２．５μｌの唾液溶液（水で１：１０希釈したヒト唾液）を加えた。得られた溶液を凍結、解凍し、次いで、Ｃ−１８ ＴＬＣプレート上にスポットした後、プローブと標的のハイブリダイゼーションを示す青色スポットが得られた。標的を加えなかった対照実験では、青色スポットは観察されなかった。
実施例１０： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたアッセイ
図１３Ａに示されているようにアッセイを実施した。先ず、フィッシャー・サイエンティフィック社から購入したガラス製顕微鏡スライドを先端にダイヤモンドが付いたけがきペンで約５×１５ｍｍの部片に切断した。スライドを５０℃の４：１のＨ２ＳＯ４：Ｈ２Ｏ２溶液中に２０分間浸漬して清浄した。次いで、スライドを多量の水、次いでエタノールでリンスし、乾燥窒素流下に乾燥させた。改変した文献記載手順（Ｃｈｒｉｓｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２４巻，３０３１−３０３９ページ（１９９６年））を用いてチオール修飾ＤＮＡをスライド上に吸着させた。先ず、スライドを、室温下に、Ｎａｎｏｐｕｒｅ水中の１ｍＭ酢酸中のトリメトキシシリルプロピルジエチルトリアミン１％溶液（ＤＥＴＡ、ペンシルベニア州ブリストル所在のユナイテッド・ケミカル・テクノロジー社（Ｕｎｉｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＰＡ）から購入）中に２０分間浸漬した。スライドを水、次いでエタノールでリンスした。乾燥窒素流で乾燥させた後、温度制御加熱ブロックを用いて１２０℃で５分間焼成した。スライドを冷まし、次いで、室温下に２時間、８０：２０メタノール：ジメトキシスルホキシド中１ｍＭのスクシンイミジル−４−（マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ、シグマ・ケミカルズ社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から購入）中に浸漬した。ＳＭＰＢ溶液から取り出して、エタノールでリンスした後、ＳＭＰＢ架橋剤と結合しなかったアミン部位に以下のようにキャップ形成した。先ず、スライドを、１０％ １−メチルイミダゾールを含有する８：１ ＴＨＦ：ピリジン溶液中に５分間浸漬した。次いで、スライドを、９：１ ＴＨＦ：無水酢酸溶液中に５分間浸漬した。これらのキャッピング溶液は、ヴァージニア州スターリング所在のグレン・リサーチ社から購入した。スライドをＴＨＦ、次いでエタノール、最後に水でリンスした。
修飾ガラス製スライドを、新たに精製されたオリゴヌクレオチド（３′チオールＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ［配列番号３３］を含有する０．２ＯＤ（１．７μＭ）溶液中に浸漬して、ＤＮＡを表面に付着させた。１２時間浸漬した後、スライドを取り出し、水でリンスした。
検体ＤＮＡ鎖がナノ粒子を修飾基板表面に結合させる能力を証明するために、連結オリゴヌクレオチドを調製した。連結オリゴヌクレオチドは、既に基板表面上に吸着されているＤＮＡと相補的な１２ｂｐ末端を含む配列を有する２４ｂｐ長（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ）［配列番号３４］であった。次いで、基板を、連結オリゴヌクレオチド（０．４ＯＤ、１．７μＭ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ，１０ｍＭ リン酸緩衝液ｐＨ７）溶液中に１２時間浸漬した。基板を取り出し、類似緩衝液でリンスした後、基板を、基板に付着している連結オリゴヌクレオチドのハイブリダイズしていない部分と相補的なオリゴヌクレオチド（ＴＡＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣ５′チオール［配列番号３５］）で修飾されている直径１３ｎｍの金ナノ粒子を含有する溶液中に浸漬した。１２時間浸漬した後、基板を取り出し、ハイブリダイゼーション緩衝液でリンスした。ガラス製基板の色は透明な無色から透明なピンク色に変わっていた。図１９Ａ参照。
スライドを上記のような連結オリゴヌクレオチド溶液に浸漬し、次いで、オリゴヌクレオチド（３′チオールＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ［配列番号３３］）が付着している直径１３ｎｍの金ナノ粒子を含有する溶液に浸漬して、スライドに追加のナノ粒子層を加えた。１２時間浸漬した後、上記のように、スライドをナノ粒子溶液から取り出し、リンスして、ハイブリダイゼーション溶液中に浸漬した。スライドの色は、はっきり分るほど赤色が濃くなっていた。図１９Ａ参照。最終ナノ粒子層としてオリゴヌクレオチド（ＴＡＧＧＡＣＴＴＡＣＧＣ５′チオール［配列番号３５］）で修飾した１３ｎｍの金ナノ粒子を用いて連結オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子浸漬手順を繰り返して最終ナノ粒子層を加えた。この場合も、色は濃くなり、５２０ｎｍのＵＶ−可視吸光度は増大した。図１９Ａ参
照。
オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子が連結オリゴヌクレオチドとのＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用によりオリゴヌクレオチド修飾表面に付着したことを確認するために、融解曲線を作成した。融解実験のために、スライドを、１．５ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液を含有するキュベットに入れ、実施例２のパートＢで用いたものと類似の装置を用いた。基板の温度を２０℃から８０℃まで増大させながら、１℃／１分の保持時間で、ナノ粒子に帰する吸光度シグナル（５２０ｎｍ）をモニターした。温度が５２℃を越えたとき、ナノ粒子のシグナルは劇的に低下した。図１９Ｂ参照。シグナルの一次導関数は、５５℃の融解温度を示したが、これは、溶液中でハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体と連結オリゴヌクレオチドに関して見られた温度と一致する。図１９Ｂ参照。
実施例１１： プローブとしてナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いたポリリボヌクレオチドアッセイ
これまでの実施例は、アッセイにおける標的としてオリゴ−デオキシリボヌクレオチドを利用した。本実施例は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体をポリリボヌクレオチドアッセイにおけるプローブとして用い得ることを証明する。ポリ（ｒＡ）（０．００４２６０単位）の溶液１μｌを、５′末端のメルカプトアルキルリンカーを介してｄＴ２０（チミジレート残基を含有する２０ｍｅｒオリゴヌクレオチド）に結合している１００μＬの金ナノ粒子（粒子中〜１０ｎＭ）に加えて、実験を行った。結合手順は、実施例３に記載のものであった。実施例４に記載のように、ドライアイス／イソプロピルアルコール浴中で凍結し、室温下に解凍し、Ｃ１８ ＴＬＣプレート上にスポットした後、ハイブリダイゼーションによるナノ粒子の凝集の特徴を示す青色スポットが観察された。標的の不在下に実施した対照実験では、青色スポットではなく、ピンク色のスポットを得た。
実施例１２： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体を用いた炭疽菌保護抗原セグメントのアッセイ
多くの場合、ＰＣＲによる二本鎖ＤＮＡ標的の増幅にはアッセイに十分な材料を提供することが必要である。本実施例は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が、ＤＮＡ鎖をその相補体の存在下にアッセイする（すなわち、二本鎖標的の熱デハイブリダイゼーション後に一本鎖に関してアッセイする）ために使用し得、かつＰＣＲ反応から得られたアンプリコンを認識して、特異的に結合し得ることを証明する。
炭疽菌の保護抗原セグメントの１４１塩基対二本鎖アンプリコンを含有するＰＣＲ溶液は海軍省（Ｎａｖｙ）から提供された（図１２に示されている配列）。このアンプリコンのアッセイは、Ｑｉａｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（カリフォルニア州サンタ・クラリタ所在のキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ））およびこのキット用の標準プロトコルを用いて、１００μｌのＰＣＲ溶液からＤＮＡを単離して実施したが、但し、ＤＮＡの溶離は、キットで提供された緩衝液を用いるのではなく、ｐＨ８．５の１０ｍＭ リン酸緩衝液を用いて実施した。次いで、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ（サバント社（Ｓａｖａｎｔ））上で溶離液を蒸発乾固した。この残留物に、２種の異なるオリゴヌクレオチド−ナノ粒子プローブ（図２３参照）からなる２種の各溶液を等量混合して調製した５μｌのマスター混合物を添加した。各オリゴヌクレオチド−ナノ粒子プローブは、実施例３に記載のように調製した。マスター混合物を形成するために合わせたプローブ溶液は、１０μｌの２Ｍ ＮａＣｌおよび５μｌのオリゴヌクレオチドブロッカー溶液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸、ｐＨ７．０溶液中５０ｐｍｏｌの各ブロッカーオリゴヌクレオチド（図２３および以下参照））を、５μｌの全強度（約１０ｎＭ）のナノ粒子−オリゴヌクレオチド溶液に加えて調製した。アンプリコン−プローブ混合物を３分間で１００℃に加熱し、次いで、ドライアイ
ス／エタノール浴中で凍結し、室温に解凍した。小アリコート（２μｌ）をＣ１８ ＴＬＣプレート上にスポットし、乾燥させた。ハイブリダイゼーションを示す濃い青色のスポットを得た。
アンプリコン標的の不在下、プローブ１の不在下、プローブ２の不在下、または塩化ナトリウムの不在下に、同様な方法で対照テストを実施したが、すべて陰性、すなわち、ピンク色のスポットを得た。同様に、保護抗原セグメントの代わりに炭疽菌の致死因子セグメント由来のＰＣＲアンプリコンを含むプローブ１および２を用いて実施したテストは陰性（ピンク色のスポット）。これらの対照により、どちらのプローブも必要不可欠であり、ハイブリダイゼーションに適した塩条件が必要であり、かつテストは特定の標的配列特異的であることが確認された。
初期二本鎖標的の第２鎖（すなわち、標的鎖と相補的な鎖）がプローブに結合するセグメントの外側の標的核酸領域に結合するのを阻止するためにオリゴヌクレオチドブロッカーを付加した（配列に関しては図２３参照）。というのは、そのような結合はナノ粒子オリゴヌクレオチドプローブと標的鎖との結合に干渉するからである。この実施例では、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、プローブによって被覆されない領域の一本鎖標的と相補的であった。代替計画は、プローブオリゴヌクレオチドと競合する領域外のＰＣＲ相補鎖（標的鎖と相補的な鎖）と相補的なブロッカーオリゴヌクレオチドを用いるものである。
実施例１３： ＰＣＲ溶液からアンプリコンを単離しないＰＣＲアンプリコンの直接アッセイ
実施例１２に記載の手順は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブを付加する前にＰＣＲ溶液からＰＣＲアンプリコンを分離するステップを含むものであった。多くの目的のためには、前以てポリヌクレオチド産物を単離することなく、ＰＣＲ溶液中で直接アッセイを実施し得ることが望ましいであろう。そのようなアッセイ用のプロトコルが開発されており、それを以下に説明する。このプロトコルは、Ａｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含むＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用い、標準条件下に誘導されたいくつかのＰＣＲ産物を使って首尾良く実施されている。
５０μｌのＰＣＲ試料溶液に、２種の金ナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブ（それぞれ０．００８Ａ５２０単位）の混合物５μｌを添加し、次いで、１μｌのブロッカーオリゴヌクレオチド（各１０ｐｍｏｌ）と、５μｌの５Ｍ ＮａＣｌと、２μｌの１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２を加えた。この混合物を１００℃下に２分間加熱して二本鎖標的の鎖を分離し、管を直接冷浴（例えば、ドライアイス／エタノール）に２分間浸漬し、次いで、管を取り出して、溶液を室温下に解凍した（凍結−解凍サイクルにより、プローブと標的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが容易になる）。最後に、数μｌの溶液をプレート（例えば、Ｃ１８ ＲＰ ＴＬＣプレート、シリカプレート、ナイロン膜など）上にスポットした。例の通り、青色はＰＣＲ溶液中の標的核酸の存在を示し、ピンク色はこの標的に関して陰性である。
実施例１４： ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の集合体を用いた、デハイブリダイゼーションを行わない二本鎖オリゴヌクレオチドの直接認識
これ以前の実施例では、ナノ粒子に結合している一本鎖オリゴヌクレオチドプローブと相互作用させる一本鎖を生成するために、二本鎖標的を加熱してデハイブリダイズさせた。本実施例は、三本鎖複合体を形成し得る場合、前以て標的をデハイブリダイズさせなくても、二本鎖オリゴヌクレオチド配列がナノ粒子によって認識され得ることを証明する。
２種の異なる系、ポリＡ：ポリＵおよびｄＡ４０：ｄＴ４０を用い、１００μｌの緩衝液（０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸、ｐＨ７．０）中に０．８Ａ２６０単位の標
的二本鎖を含有する溶液１μｌを、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中のＡｕ−ｓｄＴ２０ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体（粒子中〜１０ｎＭ；実施例１１参照）のコロイド溶液１００μｌに加えて、テストを実施した。その後、管をドライアイス／イソプロピルアルコール浴中に浸漬して急速凍結し、管を浴から取り出して解凍して、室温（２２℃）下に放置し、次いで、３μｌの溶液をＣ１８ ＴＬＣプレート上にスポットして、ナノ粒子のハイブリダイゼーションおよび凝集の特徴を示す青色のスポットを得た。
このテストの原理は、（この実施例ではピリミジンオリゴヌクレオチドを担持する）ナノ粒子プローブが、配列特異的に、二本鎖標的に沿ったプリンオリゴヌクレオチド／ピリミジンオリゴヌクレオチド部位で結合することである。各二本鎖体上の多くの結合部位が利用可能なので、結合によって、ナノ粒子凝集体が形成される。これらの結果は、ナノ粒子プローブを含む三本鎖複合体をベースとするこのアッセイが、オリゴリボヌクレオチド二本鎖標的にも、オリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖標的にも機能することを示している。
実施例１５： 蛍光検出と比色検出とを用いるアッセイ
すべてのハイブリダイゼーション実験は、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸、ｐＨ７．０、緩衝液中で実施した。ＡｃｅｔａｔｅＰｌｕｓＴＭ濾過メンブレン（０．４５μｍ）は、マサチューセッツ州ウエストボロ所在のミクロン・セパレ−ションズ社（Ｍｉｃｒｏｎ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）から購入した。アルキルアミン官能化ラテックスミクロスフェア（３．１μｍ）は、インディアナ州フィッシャーズ所在のバングス・ラボラトリーズ社（Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）から購入した。Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ Ｃ７ ＣＰＧ固相支持体（グレン・リサーチ社）およびＥｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機上の５′−フルオロセインホスホロアミダイト（６−ＦＡＭ，グレン・リサーチ社）を使う標準ホスホロアミダイト化学（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，第１版，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９１年）を用いて、３′末端をアルキルアミノ基で官能化した発蛍光団標識オリゴヌクレオチドを合成し、逆相ＨＰＬＣで精製した。これらのオリゴヌクレオチドを、Ｃｈａｒｒｅｙｒｅら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１３巻，３１０３−３１１０ページ（１９９７年）に記載のようにジチオ尿素結合を生成するジイソチオシアネートカップリングを用いて、アミン官能化ラテックスミクロスフェアに付着させた。簡単に説明すると、１０００倍過剰の１，４−フェニレンジチオシアネートのＤＭＦ溶液を、アミノ修飾オリゴヌクレオチドの水性ホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．３）に加えた。数時間後、過剰な１，４−フェニレンジイソチオシアネートをブタノールで抽出し、水溶液を凍結乾燥した。活性化オリゴヌクレオチドをホウ酸緩衝液に再溶解させて、炭酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．３、１Ｍ ＮａＣｌ）中でアミノ官能化ラテックスミクロスフェアと反応させた。１２時間後、粒子を遠心分離し、緩衝塩類溶液（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
リン酸、ｐＨ７．０）で３回洗浄した。５′−オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子を実施例３に記載のように調製した。
標的オリゴヌクレオチド（１〜５μｌ、３ｎＭ）を、３μｌの発蛍光団で標識したオリゴヌクレオチド修飾ラテックスミクロスフェアプローブ溶液（３．１μｍ；１００ｆＭ）に添加した。５分後、３μｌの５′オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子プローブ溶液（１３ｎｍ；８ｎＭ）を、標的およびラテックスミクロスフェアプローブを含有する溶液に加えた。さらに１０分間放置した後、プローブと標的とを含有する溶液をＡｃｅｔａｔｅＰｌｕｓメンブレンに通じて真空濾過した。メンブレンは、比較的大きいラテックス粒子を保持し、ハイブリダイズしなかった金ナノ粒子プローブはすべて通過させた。十分な濃度の標的と、標的にハイブリダイズしたラテックスミクロスフェアおよび金ナノ粒子との存
在下、メンブレン上に赤色スポットが観察された（陽性結果）。標的オリゴヌクレオチドを含有する溶液のアリコートを等量の水に代えた対照実験を常に行った。この場合、メンブレン上には白色スポットが残された（陰性結果）。２４塩基対モデル系の場合、比色計で３ｆｍｏｌの標的オリゴヌクレオチドを肉眼検出できた。
二本鎖標的オリゴヌクレオチド（１〜５μｌ、２０ｎＭ）、３μｌの発蛍光団標識オリゴヌクレオチド−ラテックスミクロスフェア（３．１μｍ；１００ｆＭ）および３μｌの５′−オリゴヌクレオチド−金ナノ粒子（１３ｎｍ；８ｎＭ）を合わせ、３分間で１００℃に加熱した。次いで、直ぐに溶液を含有する反応容器を液体Ｎ２浴に３分間に浸漬して凍結した。次いで、この溶液を室温下に解凍し、上記のように濾過した。２４塩基対のモデル系に関して、比色計で、２０ｆｍｏｌの二本鎖オリゴヌクレオチドが肉眼検出できた。
蛍光によってモニターする場合、上記検出法はメンブレンからのバックグラウンド蛍光のために困難であることが証明された。この問題は、アリコートを逆相ＴＬＣプレート上にスポットする前に過剰な金ナノ粒子プローブを除去するためにラテックスミクロスフェアを遠心して「洗浄」することによって克服された。ハイブリダイゼーション実験を上述のように実施した。プローブと標的とのハイブリダイゼーションを実施した後、溶液に１０μｌの緩衝液を添加し、次いで、１０，０００×ｇで２分間遠心した。上清を除去し、沈殿物の再懸濁を支援するために５μｌの緩衝液を添加した。次いで、３μｌアリコートを逆相ＴＬＣプレート上にスポットした。一本鎖オリゴヌクレオチドと二本鎖標的オリゴヌクレオチドのどちらに関しても、比色計により２５ｆｍｏｌが肉眼検出できた。スポットの形成に用いた３μｌアリコート中の標的の量が５０ｆｍｏｌの低さになるまで、ハンドヘルドＵＶランプを用いて肉眼で蛍光スポットを視ることができた。この系を最適化することにより、もっと低量の標的核酸の検出も可能になるであろう。
実施例１６： 銀染色法を用いたアッセイ
溶液中の特定のＤＮＡ配列の存在を検出するためには、一般に、オリゴヌクレオチド修飾基板上のＤＮＡハイブリダイゼーションテストが用いられる。遺伝子情報を精査するための組合せＤＮＡ配列の有望性が増してきていることは、未来の科学に対するこれらの異種配列アッセイの重要性を物語っている。ほとんどのアッセイにおいて、発蛍光団標識標的と表面結合プローブとのハイブリダイゼーションは、蛍光顕微鏡検査またはデンシトメーター検査によりモニターされている。蛍光検出は極めて感度が良いが、その使用は、実験装置費用とほとんどの慣用基板からのバックグラウンド放射とにより制限される。さらに、１単塩基誤対合を有するものに比べ完全相補性プローブに対する標識オリゴヌクレオチド標的への選択性の方が低いために、一ヌクレオチド多形を検出するための表面ハイブリダイゼーションテストが使用できない。蛍光法の簡易性、感度および選択性が改良された検出計画によって、組合せ配列の全ての可能性を具現化することができる。本発明はそのような改良型検出計画を提供する。
例えば、３成分サンドイッチアッセイにおいて、オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子と非修飾ＤＮＡ標的を、ガラス基板に付着しているオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることができた（図２５Ａ−Ｂ参照）。ナノ粒子は、個別のもの（図２５Ａ参照）であっても、複数のナノ粒子の「ツリー」（ｔｒｅｅ）（図２５Ｂ参照）であってもよい。「ツリー」は、個別のナノ粒子に比べてシグナル感度を増大させ、ハイブリダイズした金ナノ粒子の「ツリー」は、ガラス基板上の暗色領域として肉眼で観察できることが多い。「ツリー」を用いない場合、または「ツリー」によって生成されたシグナルを増幅させるためには、ハイブリダイズした金ナノ粒子を銀染色溶液で処理し得る。「ツリー」は、染色プロセスを促進し、個別ナノ粒子に比べて標的核酸の検出をより高速にする。
以下は、（図２５Ａに例示されている）１つの特定の系の説明である。捕獲オリゴヌクレオチド（３′−ＨＳ（ＣＨ２）３−Ａ１０ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ；配列番号４３）を、実施例１０に記載のように、ガラス基板上に固定した。標的オリゴヌクレオチド（５′−ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ−３′、配列番号４４、各実験用に以下の表６に示されている濃度）と捕獲オリゴヌクレオチドとを、実施例１０に記載のように、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液中でハイブリダイズさせた。基板を同一緩衝液で２回リンスし、標的相補性ＤＮＡ（５′−ＨＳ（ＣＨ２）６Ａ１０ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ、配列番号４５）（実施例３に記載の配合物）で官能化した金ナノ粒子プローブを含有する溶液中に１２時間浸漬した。次いで、基板を０．３Ｍ ＮａＮＯ３で何回もリンスしてＣｌ−を除去した。次いで、基板を銀染色溶液（Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＡとＢの１：１混合物、シグマ・ケミカル社、＃Ｓ−５０２０および＃Ｓ−５１４５）で３分間現像した。グレースケール測定値を計算し得るソフトウエア（例えば、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）をロードしたコンピュータに連結した（通常、文書をコンピュータにスキャンするのに用いられる）平台型スキャナで基板をスキャンしてグレースケール測定を行った。結果を以下の表６に示す。
実施例１７： 量子ドットを含む集合体
この実施例は、半導体ナノ粒子量子ドット（ＱＤ）上の合成一本鎖ＤＮＡの固定化を説明する。天然ＣｄＳｅ／ＺｅＳコア／シェルＱＤ（〜４ｎｍ）は有機媒質にのみ可溶であるために、アルキルチオールを末端基とする一本鎖ＤＮＡと直接反応しにくい。この問題は、先ず、ＱＤに３−メルカプトプロピオン酸でキャップ形成することにより回避された。次いで、カルボン酸基を４−（ジメチルアミノ）ピリジンで脱保護して、粒子を水溶性とし、ＱＤと、３′−プロピルチオールまたは５′−ヘキシルチオール修飾オリゴヌクレオチド配列とを反応し易くした。ＤＮＡ修飾後、透析により、反応しなかったＤＮＡから粒子を分離した。次いで、「リンカー」ＤＮＡ鎖を表面結合配列とハイブリダイズさせて、長いナノ粒子集合体を生成した。ＴＥＭ、ＵＶ／可視分光法および蛍光顕微鏡検査により特性決定したＱＤ集合体は、溶液温度を制御することにより可逆的に集合させ得る。新規ＱＤ集合体およびＱＤと金ナノ粒子（〜１３ｎｍ）間に形成された複合凝集体の温度依存性ＵＶ−可視スペクトルを得た。
Ａ． 一般法
ＮＡＮＯｐｕｒｅ超純水精製系を用いて調製したナノピュア水（１８．１ＭΩ）を一貫
して用いた。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ ５０Ｂ蛍光分光計を用いて蛍光スペクトル得た。Ｈｐ ９０９０ａ Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを具備したＨＰ ８４５３ダイオードアレイ分光光度計を用いて融解分析を実施した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５遠心機またはＢｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ ３０遠心機を用いて遠心を行った。２００ｋＶで操作する日立 ＨＦ−２０００電界放出ＴＥＭを用いてＴＥＭ画像を得た。
Ｂ． オリゴヌクレオチド−ＱＤ共役体の調製
半導体量子ドット（ＱＤ）の合成法は最近の数年間に大きく改良されており、ある種の材料、最も注目すべきことにはＣｄＳｅに関して、今や予備決定サイズの単分散試料を比較的容易に調製し得る。Ｍｕｒｒａｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１５巻，８７０６ページ，１９９３年；Ｈｉｎｅｓら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第１００巻，４６８ページ，１９９６年。その結果、ＱＤを発光ダイオード（Ｓｃｈｌａｍｐら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，第８２巻，５８３７ページ，１９９７年；Ｄａｂｂｏｕｓｉら，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，第６６巻，１３１６ページ、１９９５年）および非放射性生物学的標識（Ｂｒｕｃｈｅｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１３ページ，１９９８年；Ｃｈａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１６ページ，１９９８年）などの多様なテクノロジーに用いるための道を開く可能性があるこれらの粒子の固有の電子特性および蛍光特性が広範囲に研究されている（Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓ，Ｊ．，Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第１００巻，１３２２６ページ，１９９６年、およびその中の参考文献；Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，６９９，１９９７年；Ｋｕｎｏら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，第１０６巻，９８６９ページ，１９９７年；Ｎｉｒｍａｌら，Ｎａｔｕｒｅ，第３８３巻，８０２ページ，１９９６年参照）。しかし、多くの用途では、これらの粒子は表面上に空間的に配列されるか、または三次元物質中に組織化されることが要求されるであろう（Ｖｏｓｓｍｅｙｅｒら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．，第８４巻，３６６４ページ，１９９８年）。さらに、１種以上のナノ粒子を超格子構造（Ｍｕｒｒａｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７０巻，１３３５ページ，１９９５年）中に組織化する能力があれば、新規かつ潜在的に興味深く有用な特性を有する完全に新しい種類のハイブリッド材料の構築が可能になるであろう。
ＤＮＡは、ナノスケールの構築ブロック集合体を周期的な二次元および三次元拡張構造中にプログラムするための理想的なシントンである。合成し易さ、非常に高い結合特異性およびヌクレオチド配列による実質的に無制限のプログラム可能性を含むＤＮＡの多くの特性をＱＤ集合体の使用に利用し得る。
ＤＮＡによるＱＤの修飾は、金ナノ粒子の場合よりも困難であることが証明された。高い蛍光ＣｄＳｅ ＱＤを調製するための一般法によって、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）とトリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）の混合物でコートされた材料が得られる。その結果、これらのＱＤは、非極性溶媒にのみ可溶になり、そのため、ＱＤを高荷電ＤＮＡ鎖で直接反応により官能化するのは難しい。この難点は、初めて半導体ナノ粒子を一本鎖ＤＮＡで修飾することに成功した以下に記載の方法により克服された。他の人々は、精密な研究において、ＱＤと二本鎖ＤＮＡとの相互作用を考えていたが、これらの研究は、拡張ＱＤ構造の集合体を誘導するＤＮＡの配列特異的結合特性を利用しなかったことに留意されたい。Ｃｏｆｆｅｒら，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．，第６９巻，３８５１ページ，１９９６年；Ｍａｈｔａｂら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１４８巻，７０２８ページ，１９９６年。
ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルＱＤの表面は有機チオールと結合するので、これらの半導体粒子を、置換反応により、アルキルチオールを末端基とするＤＮＡ鎖で修飾することが望ましかった。しかし、これらのＱＤは水溶性ではないので、そのような方法は妨げら
れた。最近、ＱＤを水溶性にして、ＱＤ表面上にタンパク質構造を固定化させるための２種の異なる方法が報告された。一方は、シリカ層でコア／シェル構造を封入するステップを含み（Ｂｒｕｃｈｅｚら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１３ページ，１９９８年）、他方は、粒子を安定させ、かつ水溶性とするためにメルカプト酢酸を利用する（Ｃｈａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８１巻，２０１６ページ，１９９８年）。ＤＮＡハイブリダイゼーション条件下に著しく安定したコロイドを生成する、この実施例に記載されている手順は、ＱＤ表面を不動態化するために３−メルカプトプロピオン酸を利用する。
１．０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ；オールドリッチ社）中の（Ｈｉｎｅｓら，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，第１００巻，４６８ページ，１９９６年に記載のように調製した）〜２０ｍｇのＴＯＰ／ＴＯＰＯ安定化ＣｄＳｅ／ＺｎＳ ＱＤの懸濁液に、シリンジを用いて、過剰な３−メルカプトプロピオン酸（０．１０ｍｌ、１．１５ｍｍｏｌ；オールドリッチ社）を添加して、３−メルカプトプロピオン酸官能化ＱＤを含有する透明な黒みがかったオレンジ色の溶液を生成した。反応は急速に起こった。後続反応のために、過剰な３−メルカプトプロピオン酸を除去せず、粒子を室温下にＤＭＦ中に保存した。
しかし、ＱＤの特性決定のために、試料の一部から反応しなかった３−メルカプトプロピオン酸を以下のように除去して精製した。０．５０ｍｌ試料を（３０，０００ｒｐｍで４時間）遠心し、上清を除去した。残りの溶液を〜０．３ｍｌのＤＭＦで洗浄し、再遠心した。このステップをさらに２回繰り返してから、ＦＴＩＲスペクトルを記録した。ＦＴＩＲ（ポリエチレンカード、３Ｍ社）：１７１０ｃｍ−１（ｓ）、１４７２ｃｍ−１（ｍ）、１２７８ｃｍ−１（ｗ）、１１８９ｃｍ−１（ｍ）、１０４５ｃｍ−１（ｗ）、９９３ｃｍ−１（ｍ）、９４６ｃｍ−１（ｗ）、７７６ｃｍ−１（ｍ）、６７１ｃｍ−１（ｍ）。ＴＯＰ／ＴＯＰＯ安定化天然ＱＤとは異なり、３−メルカプトプロピオン酸修飾ＱＤは、表面結合プロピオン酸に特徴的な１７１０ｃｍ−１のｖｃｏバンドを示した。
３−メルカプトプロピオン酸修飾ＱＤは水に実質的に不溶であるが、それらの溶解度は、以下のパラグラフに記載のように、表面結合メルカプトプロピオン酸部位を４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ；オールドリッチ社）で脱保護して有意に高めることができた。そうすると、ＱＤは水に容易に分散し、オレンジ色の溶液となり、この溶液は室温下に１週間まで安定であった。
オリゴヌクレオチドをＱＤに付着させるために、ＤＭＦ中の３−メルカプトプロピオン酸官能化粒子溶液１５０μｌ（５３０ｎｍでの光学密度＝２１．４）を、０．４ｍｌのＤＭＦ中のＤＭＡＰ（８．０ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。オレンジ色の沈殿物が形成された。これを、遠心（３，０００ｒｐｍで〜３０秒）により分離し、次いで、３′プロピルチオール−または５′ヘキシルチオール−を末端基とするオリゴヌクレオチド（１．０〜２．０ＯＤ／ｍｌ；実施例１に記載のように調製；配列は以下に記載）の溶液１．０ｍｌに溶解させた。（水に溶解した）沈殿物をＩＲスペクトロスコピー（ポリエチレンカード、３Ｍ社）によって特性決定した。ＩＲ（ｃｍ−１）： １６４７（ｍ）、１５５９（ｓ）、１４６２（ｍ）、１２１４（ｗ）、７１９（ｗ）、４７８（ｓ）。１２時間放置した後、オリゴヌクレオチド含有溶液を０．１５Ｍ ＮａＣｌに加え、粒子をさらに１２時間熟成させた。次いで、ＮａＣｌの濃度を０．３Ｍに高め、混合物をさらに２４〜４０時間放置してから、１００ｋＤａメンブレン（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｅｓｔｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ）を用いてＰＢＳ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７、０．０１％アジ化ナトリウム）で透析した。透析は４８時間にわたって実施し、その間に、透析浴を３回新しくした。
このようにして調製したオリゴヌクレオチド−ＱＤ共役体は、不定な水安定性を示した
。さらに、コロイドは、（〜３．２ｎｍ ＣｄＳｅコアを示す；Ｍｕｒｒａｙら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１５巻，８７０６ページ，１９９３年）５４６ｎｍでの急激な［半値全幅（ＦＷＨＭ）＝３３ｎｍ］対称発光を有し、強力に蛍光性のままであった。
このプロトコルにより、２種の異なるオリゴヌクレオチド−ＱＤ共役体を調製し、ＰＢＳ中に保存した。一方は、３′末端のプロピルチオール官能基と、１２ｍｅｒ捕獲配列と、介在１０塩基（すべてＡ）スペーサー：５′−ＴＣＴＣＡＡＣＴＣＧＴＡＡ１０−（ＣＨ２）３−ＳＨ［配列番号４６］とからなる２２ｍｅｒで修飾した。他方は、５′−ヘキシルチオールを末端基とする配列と、さらに１０塩基（すべてＡ）スペーサー、および３′−プロピルチオール配列とは非相補的な１２ｍｅｒ捕獲配列：５′−ＳＨ−（ＣＨ２）６−Ａ１０ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ−３′［配列番号４７］を用いた。
Ｃ． ＱＤ集合体の調製
ほぼ等量のこれら２種のオリゴヌクレオチド（それぞれ、２００μｌ、ＯＤ５３０＝０．２２４および０．２０６）を混合し、次いで、相補的な連結２４ｍｅｒ配列（５′−ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴ−ＧＡＡＴＧＣＧ−３′、配列番号４８）の溶液６μｌ（６０ｐｍｏｌ）と合わせて、室温下に２０〜３０分以内でＱＤ集合体を形成した（図２６）。混合物を凍結（−７８℃）し、ゆっくり室温まで温めると、連結が速く起こった。
生成したクラスターは、溶液から沈殿するほど大きくはなかった。しかし、クラスターは、連結しなかった粒子（３０，０００ｒｐｍで２〜３時間）と比べて、比較的低速で遠心（１０，０００ｒｐｍで１０分間）することにより分離することができた。
ハイブリダイゼーション直後の蛍光の減少を、４対の試料の４７５ｎｍから６２５ｎｍまでの蛍光シグナル（励起波長３２０ｎｍ）の積分により定量した。各対は以下の方法で調製した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心管中で、３′プロピルチオールを末端基とするＤＮＡで修飾した粒子（３０μｌ、５３０ｎｍでの光学密度＝０．２２４）の溶液を、５′ヘキシルチオールを末端基とするＤＮＡで修飾したＱＤ（３０μｌ、５３０ｎｍでの光学密度＝０．２０６）と合わせ、次いで１４０μｌのＰＢＳで希釈した。次いで、混合物を２つの等量部分に分け、一方には相補的「リンカー」ＤＮＡ（３μｌ、３０ｐｍｏｌ）を、他方には、非相補的「リンカー」ＤＮＡ（５′−ＣＴＡＣＴＴＡＧＡＴＣＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＡＴ−３′、配列番号４９）（３μｌ、３０ｐｍｏｌ）を加えた。次いで、全８種の試料をドライアイス／アセトン浴（−７８℃）中で凍結し、その後、試料を浴から取り出し、ゆっくり室温まで温めた。ハイブリダイゼーション時の蛍光効率の変化を予測するために、「標的」（相補的「リンカー」）試料の蛍光強度を、非相補的「リンカー」を含む対応する対照試料由来の３２０ｎｍでの吸光度における差を明らかにするように調整した。
結果は、ＱＤ／ＱＤ集合体が、平均して２６．４±６．１％の積分蛍光強度の減少と、ＱＤ間の協同事象によると考えられる発光最大の〜２ｎｍのレッドシフトを伴うことを示した。興味深いことには、Ｂａｗｅｎｄｉらは、密集ＱＤと凍結マトリックス中で広く分離している隔離ドットの蛍光を比較したときに、類似ではあるが、わずかに大きなレッドシフトに気づいていた（Ｍｕｒｒａｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７０巻，１３３５ページ，１９９５年）。蛍光スペクトルにおけるこれらの変化は、ＱＤ間にエキシマが形成されたことを示しているのかもしれないが、そのような複合体の正確な性質は、大部分まだ類推の域を出ないものである。予測したように、「リンカー」が無いか、もしくは相補的でない場合、または２種の粒子のどちらかが不在の場合に、凝集は観察されなかった。
温度の関数として凝集体のＵＶ−可視スペクトルを観察して、ＤＮＡの「融解」挙動をモニターした。この「融解」分析のために、ＱＤ／ＱＤ集合体を含む沈殿物を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、７μｌのＰＢＳで洗浄、再遠心して、０．７ｍｌのＰＢＳに懸濁させた。温度を２５℃から７５℃まで上昇させながら、各測定の前に１分間の保持時間をとって、集合体のＵＶ／可視分光シグナチャーを２℃間隔で記録した。実験を通じて均一性を確実にするために、混合物を５００ｒｐｍの速度で攪拌した。次いで、６００ｎｍでの消光から温度対消光プロファイルを作製した。これらのプロファイルの一次導関数を用いて「融解」温度を決定した。
結果、図２７Ｂ（Ｔｍ＝５７℃）は、ＤＮＡがＱＤ表面上に固定化され、ハイブリダイゼーションが集合体プロセスに関与することを明確に証明した。ＤＮＡだけと比較したときの偏移は極めて急激（それぞれの一次導関数のＦＷＨＭ：４℃対９℃）であり、これは、１粒子当たり多重ＤＮＡ結合を有する凝集体構造の形成と一致する。変性により消光の増大が観察されたが、これは、集合体内の粒子がその周囲のＱＤによる光の吸収から防止されるスクリーニング効果のためである可能性が高い。
Ｄ． ＱＤ／金集合体の調製
ＤＮＡ官能化ＱＤが得られたので、多重種類のナノ粒子構築ブロックから作製したハイブリッド集合体の構成が実現可能になった。これらのハイブリッド集合体を作製するために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心管中で、〜１７ｎＭの３′−ヘキシルチオールで修飾した１３ｎｍの金ナノ粒子（３０μｌ、〜５ｆｍｏｌ；実施例３に記載のように調製）の溶液を、５′−ヘキシルチオールを末端基とするＤＮＡ修飾ＱＤ（１５μｌ、５３０ｎｍでの光学密度は０．２０６）と混合した。「リンカー」ＤＮＡ（５μｌ、５０ｐｍｏｌ）を加え、混合物を−７８℃に冷却し、次いで、ゆっくり室温まで温めると、赤みを帯びた紫色の沈殿物が生成した。両種類の粒子と相補的標的の不在下には、凝集挙動は観察されなかった。遠心（３，０００ｒｐｍで１分間）し、上清を除去した後、沈殿物を１００μｌのＰＢＳで洗浄し、再遠心した。
「融解」分析のために、洗浄した沈殿物を０．７ｍｌのＰＢＳに懸濁した。ＵＶ−可視分光法を用いて、金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴の変化を追跡して、５２５ｎｍでの温度対消光プロファイルを作製した。金ナノ粒子の表面プラズモン共鳴を用いると、ハイブリダイゼーションをモニターするために、ＱＤだけのＵＶ−可視分光シグナチャーを用いるよりも、はるかに高感度のプローブが得られる。したがって、「融解」実験は、はるかに小さい試料（ＱＤ溶液の〜１０％が必要）に関して実施し得るが、プラズモンバンドの強さによって、ＱＤ由来のＵＶ／可視シグナルが不鮮明になる。上記の純粋ＱＤ系と同様に、急激な（一次導関数のＦＷＨＭ＝４．５℃）融解転移は、５８℃で起こった（図２７Ｄ参照）。
これらの集合体の高解像度ＴＥＭ画像は、多重ＱＤにより相互連絡された金ナノ粒子網目構造を示した（図２７Ｃ）。ＴＥＭ画像では金ナノ粒子よりはるかにコントラストが弱いＱＤは、それらの格子干渉縞によって識別し得る。ＱＤは、高解像度ＴＥＭでかろうじて解像できるが、これらの複合体集合体の周期的構造やそれらの形成にＤＮＡが果たす役割を明瞭に示している。
Ｅ． 要約
この実施例に記載されている結果は、ＱＤ表面へのＤＮＡの固定化が達成され、かつ今やこれらの粒子をハイブリダイゼーション条件下にＤＮＡと組合せて使用し得ることを最も確実に立証している。ＤＮＡ官能化ＱＤを用いて、最初のＤＮＡ誘導ＱＤ形成および混合金／ＱＤナノ粒子構造が実証された。半導体ＱＤをＤＮＡで首尾良く修飾することは、材料研究にとって重要な意味を有しており、これらの固有の構築ブロックは新規かつ機能
的な多成分ナノ構造およびナノスケール材料に組み込まれるので、今や、これらのブロックの蛍光、電子、および化学特性の広範囲な研究への扉が開かれている。
実施例１８： オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の合成法およびそれらの方法により生成された共役体
Ａ． 一般法
ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏおよびクエン酸三ナトリウムは、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在のオールドリッチ・ケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入した。純度９９．９９９％の金ワイヤ、およびチタンワイヤは、イリノイ州エバンストン所在のゴールドスミス社（Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ Ｉｎｃ．，Ｅｖａｎｓｔｏｎ，ＩＬ）から購入した。厚さ１ミクロンの酸化物層を有するシリコンウェーハ（１００）は、カリフォルニア州サンタクララ所在のシリコン・クエスト・インターナショナル社（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｑｕｅｓｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から購入した。５′−チオール修飾剤Ｃ６−ホスホロアミダイト試薬、３′−プロピルチオール修飾剤ＣＰＧ、フルオレセインホスホロアミダイト、およびオリゴヌクレオチド合成に必要な他の試薬は、ヴァージニア州スターリング所在のグレン・リサーチ社から購入した。すべてのオリゴヌクレオチドは、標準ホスホロアミダイト化学（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ；第１版；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１年）を用いるＤＮＡ自動合成機（エキスペダイト社（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ））を使って調製した。５′ヘキシルチオール修飾体のみを含むオリゴヌクレオチドを実施例１に記載のように調製した。５−（および６−）−カルボキシフルオレセイン、スクシンイミジルエステルは、オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。ＮＡＰ−５カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＮＡグレード）は、ファルマシア・バイオテク社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）から購入した。すべての実験に、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ ＮＡＮＯｐｕｒｅ超純水系を用いて精製したナノピュアＨ２Ｏ（＞１８．０ＭΩ）を用いた。Ａｕナノ粒子溶液の遠心には、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５４１５ＣまたはＢｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ ３０遠心機を用いた。高速液体クロマトグラフィーは、ＨＰシリーズ１１００ＨＰＬＣを用いて実施した。
Ｂ． 物理測定
オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子溶液の電子吸収スペクトルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（ＨＰ）８４５２ａダイオードアレイ分光光度計を用いて記録した。蛍光分光法は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５０蛍光光度計を用いて実施した。透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）は、２００ｋＶで操作する日立８１００透過型電子顕微鏡で実施した。ナノ粒子溶液中の金の原子濃度の定量には、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）源を備えたＡｔｏｍＳｃａｎ２５原子分光計を用いた（金の発光は２４２．７９５ｎｍでモニターした）。
Ｃ． 蛍光標識したアルカンチオール修飾オリゴヌクレオチドの合成および精製
５′ヘキシルチオール部分および３′フルオレセイン部分を用いて、１２塩基を含むチオール修飾オリゴヌクレオチド鎖を調製した。１２ｍｅｒ（Ｓ１２Ｆ）の配列は、ＨＳ（ＣＨ２）６５−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ−３′−（ＣＨ２）６−Ｆ［配列番号５０］であり、３２ｍｅｒ（ＳＡ２０１２Ｆ）は同じ１２ｍｅｒ配列とさらなる２０ｄＡスペーサー配列を５′端に有していた［配列番号５１］。チオール修飾オリゴヌクレオチドは、Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻：１９５９−１９６４ページ（１９９８年）に記載のように調製した。自動合成にはアミノ修飾剤Ｃ７ ＣＰＧ固相支持体を用い、５′末端は、先に記載のように、ヘキシルチオールホスホロアミダイトで手で修飾した。３′アミノ、５′トリチルで保護したチオール修飾オリゴヌクレ
オチドを、２５４ｎｍでＤＮＡのＵＶシグナルをモニターしながら、０．０３Ｍ トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）、ｐＨ７および１％／分勾配の９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３Ｍ ＴＥＡＡを含むＨＰ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（５ｍｍ、２５０×４ｍｍ）を用いて、１ｍｌ／分の流速で逆相ＨＰＬＣにより精製した。５′−Ｓ−トリチル、３′アミノ修飾１２塩基および３２塩基オリゴヌクレオチドの保持時間はそれぞれ３６分、３２分であった。
凍結乾燥産物を１ｍｌの０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３に再分散させ、調製業者の指示（モレキュラー・プローブ社の文献）に従って、暗所で攪拌しながら、無水ＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌのフルオレセインスクシンイミジルエステル（５，６ＦＡＭ−ＳＥ、モレキュラー・プローブス社）１００μｌを１．５時間かけて加えた。溶液を室温下にさらに１５時間攪拌し、次いで、−２０℃下に１００％エタノールから沈殿させた。沈殿物を遠心して回収し、Ｈ２Ｏに溶解させ、イオン交換ＨＰＬＣにより、結合産物を反応しなかったアミノを末端基とするオリゴヌクレオチドから分離した。１０ｍＭ ＮａＯＨ水性溶離液および１％／分勾配の１Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭ ＮａＯＨを用いて、０．８ｍｌ／分の流速で、Ｄｉｏｎｅｘ Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ ＰＡ−１００カラム（２５０×４ｍｍ）を操作した。５′−Ｓ−トリチル、３′フルオレセイン修飾１２ｍｅｒおよび３２ｍｅｒの保持時間はそれぞれ５０分、４９分であった。オリゴヌクレオチド産物を逆相ＨＰＬＣで脱塩した。フルオレセインを末端基とするトリチルオリゴヌクレオチドのトリチル保護基の除去は、先に記載のように、（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻，１９５９−１９６４（１９９８年））、硝酸銀およびジチオトレイトール（ＤＴＴ）を用いて行った。オリゴヌクレオチドの収率および純度は、アルキルチオールオリゴヌクレオチドに関して先に記載した技術（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻：１９５９−１９６４ページ（１９９８年））を用いて評価した。オリゴヌクレオチドは、チオール基のトリチル除去処理直後に使用した。
３′がプロピルチオールで５′フルオレセイン部分（ＨＳ（ＣＨ２）３−３′− （Ｗ）２０−ＴＡＧ−ＧＡＣ−ＴＴＡ−ＣＧＣ−５′−（ＣＨ２）６−Ｆ、Ｗ＝ＡまたはＴ）である３２塩基を含むチオール修飾オリゴヌクレオチド［配列番号５２］を、３′チオール修飾剤ＣＰＧを使用して自動合成装置で合成した。各オリゴヌクレオチドの５′末端を、手作業で、フルオレセインホスホロアミダイト（６−ＦＡＭ（６−ＦＡＭ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）につないた。修飾オリゴヌクレオチドを、イオン交換ＨＰＬＣで精製した（１Ｍ ＮａＣｌの１％／分勾配、１０ｍＭ ＮａＯＨ；保持時間（Ｒｔ）〜４８分（Ｗ＝Ｔ）、Ｒｔ〜２９分（Ｗ＝Ａ））。精製後、オリゴヌクレオチド溶液を逆相ＨＰＬＣで脱塩した。３′チオール部分を、以前に記述された方法（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：１９５９−１９６４（１９９８））により、ジチオスレイトールで脱保護した。
Ｄ．フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの合成および精製
発蛍光団標識相補体（１２′Ｆ）は、Ｓ１２ＦおよびＳＡ２０１２Ｆの１２ｍｅｒ配列と相補的な１２塩基３′−ＧＣＧ−ＴＡＡ−ＧＴＣ−ＣＴＡ−５′−（ＣＨ２）６−Ｆ［配列番号５３］から構成した。標準法を用いてオリゴヌクレオチドを合成し、５′アルキルチオール修飾に関して上述した手順に類似のシリンジベース手順を用いて、フルオレセインホスホロアミダイト（６−ＦＡＭ、グレン・リサーチ社）とＣＰＧ連結オリゴヌクレオチドの５′末端とをカップリングした。上記のような逆相ＨＰＬＣを用いて精製を実施した。フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの保持時間は１８分であった。自動合成機用のアミノ修飾剤Ｃ７ ＣＰＧ固相支持体を用いて発蛍光団標識相補体、３′１２Ｆ（５′−ＡＴＣ−ＣＴＧ−ＡＡＴ−ＧＣＧ−Ｆ；［配列番号５４］）を調製し、次いで、上記手順を用いて、５−（６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルを３′アミンにカップリングした。
Ｅ．金ナノ粒子の調製および特性決定
金ナノ粒子は、実施例１に記載のように、ＨＡｕＣｌ４をクエン酸塩で還元して調製した。得られたナノ粒子のサイズ分布の定量には、日立８１００ＴＥＭを用いて実施する透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）を用いた。グラフィックソフトウエア（ＩａｍｇｅＴｏｏｌ）を用いてＴＥＭネガから少なくとも２５０粒子を分粒した。典型的な粒子配合物の平均直径は１５．７±１．２ｎｍであった。球状ナノ粒子と密度がバルク金の密度（１９．３０ｇ／ｃｍ２）と等しいと仮定して、粒子当たりの平均分子量を計算した（２．４×１０７ｇ／ｍｏｌ）。金ナノ粒子溶液中の金原子の濃度を、ＩＣＰ−ＡＥＳ（誘導結合プラズモン原子発光分光法）によって決定した。較正には、金原子吸着標準溶液（オールドリッチ社）を用いた。粒子溶液中の金原子濃度とＴＥＭ分析によって得た平均粒子質量とを比較して、所与の配合物中の金粒子のモル濃度、典型的には〜１０ｎＭを得た。表面プラズモン周波数（５２０ｎｍ）でのナノ粒子溶液のＵＶ−可視吸光度を測定して、粒子のモル消光係数（５２０ｎｍでのε）を計算すると、典型的には、直径１５．７±１．２ｎｍの粒子では４．２×１０８Ｍ−１ｃｍ−１であった。
Ｆ．金薄膜の調製
シリコンウェーハを〜１０ｍｍ×６ｍｍ部片に切断し、５０℃下にピラニア腐蝕溶液（４：１の濃Ｈ２ＳＯ４：３０％Ｈ２Ｏ２）で３０分清浄し、次いで、多量の水、次いでエタノールでリンスした。（警告：ピラニア腐蝕溶液は有機物質と激しく反応するので、取り扱いには厳重な注意が必要である。）Ｅｄｗａｒｄｓ ＦＴＭ６石英結晶微量天秤を具備したＥｄｗａｒｄｓ Ａｕｔｏ ３０６エバポレータ（３×１０−７ミリバールの基準圧力）を用いて０．２ｎｍ／秒の速度で金属を蒸着させた。シリコンの酸化された側面を、５ｎｍのＴｉ接着層、次いで２００ｎｍの金でコートした。
Ｇ．５′アルキルチオールオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
新たに脱保護したオリゴヌクレオチドをナノ粒子水溶液（粒子濃度〜１０ｎＭ）に３μＭの最終オリゴヌクレオチド濃度まで加えて、金ナノ粒子をフルオレセイン−アルキルチオールオリゴヌクレオチドで修飾した。２４時間後、溶液をｐＨ７（０．０１Ｍ リン酸）で緩衝し、ＮａＣｌ溶液を（０．１Ｍの最終濃度まで）加えた。これらの条件下にさらに４０時間、溶液を「熟成」させた。次いで、１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心して、過剰な試薬を除去した。上清を除去した後、赤色の油性沈殿物を、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７（ＰＢＳ）で２回洗浄し、連続遠心して、再分散させ、最後に新鮮な緩衝液中に再分散させた。洗浄手順中、常に、少量（ＵＶ−可視分光法により測定して〜１０％）のナノ粒子が上清と共に廃棄される。したがって、最終ナノ粒子濃度を、ＴＥＭ、ＩＣＰ−ＡＥＳ、およびＵＶ−可視分光法（上記参照）で測定した。消光係数および粒度分布は、オリゴヌクレオチド修飾の結果として有意には変化しなかった。
Ｈ．５′アルキルチオールオリゴヌクレオチド修飾金薄膜の調製
シリコン支持金薄膜を、金ナノ粒子の場合と同じ回数および同じ緩衝条件下に、脱保護したアルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドの蒸着溶液中に浸漬した。オリゴヌクレオチド蒸着の後、膜を０．３Ｍ ＰＢＳでよくリンスし、緩衝液中に保存した。不動態化されていないケイ素／酸化ケイ素面を残して、片面の金のみを蒸発させた。しかし、アルキルチオール修飾ＤＮＡは、ＰＢＳに浸漬した何も結合していない酸化ケイ素表面には有意に吸着しなかった。
Ｉ．ナノ粒子上に充填したアルキルチオールオリゴヌクレオチドの定量
オリゴヌクレオチドを置換するために、０．３Ｍ ＰＢＳ中の発蛍光団標識オリゴヌクレオチドで修飾したナノ粒子または薄膜に、メルカプトエタノール（ＭＥ）を（１２ｍＭの最終濃度まで）添加した。間欠的に振とうしながら、室温下に１８時間後、金ナノ粒子
を遠心するか、または金薄膜を除去して、置換オリゴヌクレオチドを含有する溶液を金から分離した。０．３Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７を添加して、上清のアリコートを２倍希釈した。試料および較正標準溶液のｐＨとイオン強度を、これらの条件に対するフルオレセインの光学的性質の感度によるすべての測定値に関して、同じに維持するように注意した（Ｚｈａｏら，Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，４５Ａ：１１１３−１１１６ページ（１９８９年））。（５２０ｎｍで測定した）最大蛍光を、標準線形較正曲線からの補間によりフルオレセイン−アルキルチオール修飾オリゴヌクレオチドのモル濃度に変換した。標準曲線は、同一の緩衝液および塩濃度を用いて発蛍光団標識オリゴヌクレオチドの既知濃度を用いて作製した。最後に、測定したオリゴヌクレオチドのモル濃度を元の金ナノ粒子濃度で割って、粒子当たりの平均オリゴヌクレオチド数を得た。次いで、ナノ粒子溶液中の（球状粒子を想定して）予測した粒子表面積で割って、正規表面被覆面積値を計算した。真円度の仮定条件は、計算した０．９３の平均真円度に基づく。真円度因数は、Ｂａｘｅｓ，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｄｉｇｉｔａｌ Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，１５７ページ（１９９４年）から引用した（４×ｐｉ×面積）（周長×２）として計算する。
Ｊ．ハイブリダイズされた標的表面密度の定量
付着したオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション活性を測定するために、蛍光発色団で標識したオリゴヌクレオチド（表面結合オリゴヌクレオチド（１２′Ｆ）に相補的）を、ハイブリダイゼーション条件（３μＭ 相補的オリゴヌクレオチド、０．３Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７、２４時間）下で、オリゴヌクレオチド修飾表面（金のナノ粒子または薄膜）と反応させた。ハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドは、上述したように緩衝塩溶液で２度リンスすることにより金から取り外した。その後、蛍光発色団で標識したオリゴヌクレオチドを、ＮａＯＨの添加（最終濃度〜５０ｍＭ、ｐＨ１１〜１２、４時間）により、デハイブリダイズした。遠心によってナノ粒子溶液から１２′Ｆ含有溶液を分離した後、１Ｍ ＨＣｌの追加によって溶液を中和し、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの濃度とそれに対応するハイブリダイズされた標的表面密度を、蛍光分光法により測定した。
Ｋ．表面被覆面積の定量とハイブリダイゼーション
クエン酸塩安定化金ナノ粒子を１２ｍｅｒフルオレセイン修飾アルキルチオールＤＮＡ（ＨＳ−（ＣＨ２）６５′−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ−（ＣＨ２）４−Ｆ［配列番号５０］）で官能化した。次いで、化学吸着していないオリゴヌクレオチドを完全に洗い流した後で、発蛍光団標識オリゴヌクレオチドを金表面から除去して表面被覆面積研究を実施し、（上記のような）蛍光分光法を用いてオリゴヌクレオチド濃度を定量した。
金表面からすべてのオリゴヌクレオチドを除去し、次いで溶液から金ナノ粒子を除去することは、いくつかの理由で、蛍光による正確な被覆面積データを得るために重要である。第１に、標識した表面結合ＤＮＡの蛍光シグナルは、金ナノ粒子への蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の結果として効率的に消光される。実際、フルオレセイン修飾オリゴヌクレオチド（１２〜３２ヌクレオチド鎖、配列は上記に記載）が１５．７±１．２ｎｍの金ナノ粒子上に固定化され、溶液中の残留オリゴヌクレオチドが洗い流された後では、フルオレセイン修飾オリゴヌクレオチドに関して測定可能なシグナルはほとんど存在しない。第２に、金ナノ粒子は、２００〜５３０ｎｍの間に有意な量の光を吸収し、そのために、蛍光測定時の溶液中の金ナノ粒子の存在は、フィルターとしての役割を果たし、利用可能な励起エネルギーだけでなく放出される放射線の強度をも低下させる。フルオレセインの最大放出時には、５２０ｎｍでの金表面プラズモンバンドが減少する。
メルカプトエタノール（ＭＥ）を用いて、交換反応により表面結合オリゴヌクレオチドを急速に置換させた。置換動力学を調べるために、遠心および蛍光測定の前に、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を、増加時間、ＭＥ（１２ｍＭ）に暴露した。ナノ粒子を含まな
い溶液に関連する蛍光の強さを用いて、ナノ粒子からどの位多くのオリゴヌクレオチドが放出されるかを測定することができる。ＭＥと交換に放出されたオリゴヌクレオチドの量は、約１０時間の暴露まで増大した（図２９）が、これは、完全なオリゴヌクレオチドの置換を示している。置換反応は高速であり、これは、オリゴヌクレオチド膜がＭＥの金表面へのアクセスをブロックし得ないためであると考えられる（Ｂｉｅｂｕｙｃｋら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第９巻，１７６６ページ（１９９３年））。
金ナノ粒子上のアルキルチオール修飾１２ｍｅｒオリゴヌクレオチド（Ｓ１２Ｆ）の平均オリゴヌクレオチド表面被覆面積は、３４±１ｐｍｏｌ／ｃｍ２（試料の１０回の個別測定値の平均）であった。直径１５．７±１．２ｎｍの粒子の場合、これは、金粒子１個当たりおよそ１５９チオール結合１２ｍｅｒ鎖に相当する。バッチ毎に粒径はわずかに異なるものの、面積が正規化された表面被覆面積は、異なるナノ粒子配合物に関して類似していた。
この方法が正確なオリゴヌクレオチド表面被覆面積を得るために有用であることを確認するために、金薄膜から発蛍光団標識オリゴヌクレオチドを置換する方法を用い、表面被覆面積データと類似の情報を得ることを目的とするが異なる技術を用いた実験と比較した。これらの実験では、金薄膜に対し、クエン酸塩安定化金ナノ粒子（上記参照）と類似のオリゴヌクレオチド修飾およびＭＥ置換手順を課した。金薄膜のオリゴヌクレオチド置換対時間曲線は、金ナノ粒子に関して測定したものと極めて類似している。これは、これらの薄膜に関して測定した典型的な表面被覆面積値が金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチド被覆面積よりいくらか低かったにも拘わらず、薄膜の置換速度は類似していることを示唆している。本発明者らの技術によって測定した金薄膜上のオリゴヌクレオチド表面被覆面積（１８±３ｐｍｏｌ／ｃｍ２）が、既に報告されたオリゴヌクレオチド薄膜上の被覆面積の範囲内（電気化学または表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲＳ）を用いて測定された金電極上の２５塩基オリゴヌクレオチドに関しては１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２（Ｓｔｅｅｌら，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第７０巻，４６７０−４６７７ページ（１９９８年））に含まれることは重要である。表面被覆面積の相違は、オリゴヌクレオチドの配列と長さの違いおよび薄膜の調整方法の違いによるものと考えられる。
表面結合ｌ２ｍｅｒオリゴヌクレオチドを備えたナノ粒子への相補的な蛍光発色団標識されたオリゴヌクレオチド（１２′Ｆ））のハイブリダイゼーションの範囲を、上述のように測定した。簡潔に説明すると、Ｓ１２Ｆ修飾ナノ粒子を、１２Ｆ′に３μＭの濃度でハイブリダイゼーション条件（０．３Ｍ ＰＢＳ、ｐＨ７）下で２４時間暴露し、次に、緩衝液で入念にリンスした。やはり、蛍光測定前に金からハイブリダイズした鎖を取り外すことが必要であった。これは、高ｐＨ溶液（ＮａＯＨ、ｐＨ１１）中で二重鎖ＤＮＡを変性させてから遠心にかけることにより遂行した。ハイブリダイズした１２′Ｆは、総計１．３±０．２ｐｍｏｌ／ｃｍ２（１５．７ｎｍ粒子当たり約６つの二本鎖；１粒子当たりの二本鎖の平均数は、正規化したハイブリダイズされた表面被覆範囲（ｐｍｏｌ／ｃｍ２）に、ＴＥＭによって測定した粒度分布から求められる平均粒子表面積を掛けることにより算出した。）に達した。非特異性吸着の程度を測定するために、Ｓ１２Ｆ修飾金ナノ粒子を、０．３Ｍ ＰＢＳ中で、蛍光発色団標識した非相補的な１２塩基オリゴヌクレオチド（１２Ｆ′）に暴露した。入念なリンス（連続する遠心／再分散ステップ）とそれに続く高ｐＨ処理後、ナノ粒子上の非特異的に吸着したオリゴヌクレオチドの被覆範囲は約０．１ｐｍｏｌ／ｃｍ２であるとわかった。金電極に関する報告値とハイブリダイゼーション結果を比較するために、類似の方法を使用して、Ｓ１２Ｆ修飾金薄膜へのハイブリダイゼーションを測定した。ハイブリダイゼーション６＋２ｐｍｏｌ／ｃｍ２の程度は、金電極上の混合塩基２５ｍｅｒに対して報告されているハイブリダイゼーション（２−６ｐｍｏｌ／ｃｍ２）（Ｓｔｅｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：４６７０−４６７７（１９９８）と一致していた。
ナノ粒子用システムおよび薄膜の両方に対するＳ１２Ｆ／１２Ｆ′系の表面被覆範囲およびハイブリダイゼーション値を、表７に要約する。最も顕著な結果は、ハイブリダイゼーション効率の低さである（ナノ粒子上の表面結合鎖の４％未満、薄膜上の鎖の３３％がハイブリダイズ）。以前の研究では、十分に密に充填されたオリゴヌクレオチド単分子層に対して、同様に低いハイブリダイゼーションが示されていた。これは、塩基の立体的密集性の組合せ（特に金表面付近の）と静電気反発相互作用とにより、入って来るハイブリダイズ鎖への接近容易性が低いことを反映している可能性がある。
Ｌ．表面被覆範囲とハイブリダイゼーションに対するオリゴヌクレオチドスペーサーの影響
Ｓ１２Ｆオリゴヌクレオチドの適用範囲が高いことは、ナノ粒子安定化の点から有利であるが、その低いハイブリダイゼーション効率により、本願発明者らは、ハイブリダイズする配列の周囲の立体的混雑を減少させる手段を考案するように促された。アルキルチオール基と最初の１２塩基認識配列との間に２０ｄＡスペーサー配列が挿入された、オリゴヌクレオチド（３２ｍｅｒ）を合成した。このストラテジーを、以下の２つの仮定に基づき選択した。すなわち、１）ナノ粒子表面付近の塩基は、含窒素塩基と金表面間の相互作用の弱さと、鎖間の立体密集との故に、立体的に接近不能であること、および、２）直径１５．７ｎｍの概ね球状の粒子では、概ねその表面に対して垂直な２０ｍｅｒスペーサーユニットの端部に付着された１２ｍｅｒ配列（Ｌｅｖｉｃｋｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０：９７８７−９７９２（１９９８））は、表面に直接結び付けられた同じ１２ｍｅｒから形成されたフィルムに比べてより大きな自由体積を有するフィルムにつながるだろう。
一本鎖ＳＡ２０１２Ｆ鎖の表面密度（１５±４ｐｍｏｌ／ｃｍ２）はＳｌ２Ｆ（３４の±１ｐｍｏｌ／ｃｍ２）よりも低いが、同一の表面修飾を使用して３２ｍｅｒで修飾した粒子は、１２ｍｅｒで修飾した粒子と比較して、かなりの安定性ｗｐ示した。予想されたように、ＳＡ２０１２Ｆ／１２Ｆ′系のハイブリダイゼーション効率」（６．６±０．２ｐｍｏｌ／ｃｍ２、４４％）は、元のＳ１２Ｆ／１２Ｆ′系のハイブリダイゼーション効率の約１０倍に増大した（表７）。
Ｍ．オリゴヌクレオチド付着時の電解質濃度の効果
Ｓ１２Ｆ配列を用いた研究において、塩熟成ステップが、安定したオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子を得るのに重要であることが判明した（実施例３参照）。純水中Ｓ１２Ｆで修飾した金ナノ粒子を不可逆的に融解し、遠心すると、黒色沈殿物が形成されたが、塩中で熟成させたものは、高イオン強度溶液中で遠心しても凝集しなかった。安定性の増大は、立体保護作用および静電保護作用をもたらす高いオリゴヌクレオチド表面被覆面積によるものと考えられる。ＳＡ２０１２Ｆ修飾粒子を用いて、オリゴヌクレオチド表面添加に及ぼす電解質条件の効果を調べた。図８に示すように、５′ヘキシルチオールおよび３′フルオレセイン部分を有するチオール修飾オリゴヌクレオチドを調製し、上記のように金ナノ粒子に付着させ、ナノ粒子上のこれらのオリゴヌクレオチドの表面被覆面積を上記のように定量した。結果は以下の表７に示されている。水中のオリゴヌクレオチドに４８時間暴露した金ナノ粒子の最終表面被覆面積は、塩で「熟成」させるか、または実験の最後の２４時間にわたって漸進的に塩濃度を増大させて（最終濃度は１．０Ｍ ＮａＣｌ）調製したものと比べると、はるかに低かった（７．９±０．２ｐｍｏｌ／ｃｍ２）（上記参照）。
合成された金ナノ粒子は、極めて低いイオン強度媒質中でさえ不可逆的に凝集することは注目に値する。確かに、金ナノ粒子は本来、塩、特にオリゴヌクレオチドなどのポリアニオンには不相溶である。安定したオリゴヌクレオチド粒子を調製するためには、この熟
成処理が必須である。したがって、粒子は、イオン強度を徐々に増大させる前に、先ず、水中のアルキルチオールオリゴヌクレオチドで修飾しなければならない。オリゴヌクレオチドは、初期には、窒素含有塩基と金との弱い相互作用を介して結合した状態で平らに横たわっていると思われる。類似の相互作用モードが薄膜に付けたオリゴヌクレオチドに関して提案されている（Ｈｅｒｎｅら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１９巻，８９１６−８９２０ページ（１９９７年））。しかし、オリゴヌクレオチドと正に帯電したナノ粒子表面との相互作用は、さらに強力であると予想される（Ｗｅｉｔｚら，Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．，第１５８巻，１４７−１６４ページ（１９８５年））。熟成ステップにおいて、高イオン強度媒質は、隣接するオリゴヌクレオチド間の電荷反発だけでなくポリアニオンオリゴヌクレオチドと正に帯電した金表面との間の引力をも効率的に遮蔽する。これにより、より多くのオリゴヌクレオチドがナノ粒子表面に結合し、それによってオリゴヌクレオチド表面被覆面積が増大する。
Ｎ．表面被覆範囲に対するオリゴヌクレオチドスペーサー配列の影響
スペーサーの配列がどのようにＡｕナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの被覆範囲に影響するかを調べるために、３′プロピルチオールとフルオレセイン標識１２ｍｅｒ配列の間に２０ｄＡスペーサーおよび２０ｄＴスペーサーが挿入されたフルオレセイン修飾３２ｍｅｒ鎖を、調製した。Ｓ３′Ｔ２０１２ＦとＳ３′Ａ２０１２Ｆで修飾したナノ粒子に関する表面被覆範囲とハイブリダイゼーションの研究で最も顕著な結果は、２０ｄＡスペーサー（２４±１ｐｍｏｌ／ｃｍ２）と比較して、２０ｄＴスペーサー（３５±１ｐｍｏｌ／ｃｍ２）でより大きな表面被覆範囲が達成されたことである。ハイブリダイズした表面結合鎖のパーセンテージはＳＴ２０ｌ２ｍｅｒナノ粒子（７９％）ではＳＡ２０１２ナノ粒子（「〜９４％」より低かったが、ハイブリダイズした鎖の数は匹敵していた。これらの結果は、ｄＴ豊富なオリゴヌクレオチド鎖が、ｄＡ豊富なオリゴヌクレオチドよりも低い程度でナノ粒子表面と非特異的に相互作用することを示唆している。従って、２０ｄＡスペーサーセグメントが粒子表面上で平坦に横渡ることにより金の部位をブロックする一方、２０ｄＴスペーサーセグメントは、金の表面から垂直に延びることができ、これはより高い表面被覆範囲を促す。
Ｏ．同時吸着された希釈剤オリゴヌクレオチドの影響
効率的なハイブリダイゼーションに加えて、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子の別の重要な特性は、ハイブリダイゼーション事象の総数を調節する可能性である。これは、認識鎖の表面密度の調節により最も容易に遂行される。他の研究者は、ハイブリダイゼーションを制御するために、金電極上の修飾オリゴヌクレオチドと共に、メルカプトヘキサノールのよう同時吸着される希釈剤アルキルチオールを使用した（Ｓｔｅｅｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：４６７０−４６７７（１９９８）；Ｈｅｒｎｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：８９１６−８９２０（１９９７））。しかしながら、保護されていない金ナノ粒子の固有の低い安定性は、希釈剤分子の選択に重大な制約を提起した。チオール修飾２０ｄＡ配列（ＳＡ２０）［配列番号５５］は、ハイブリダイゼーションに必要な高いイオン強度の緩衝液中での粒子安定性を維持し、かつ非特異的吸着から表面を保護する点で、適切していることがわかった。
ナノ粒子を、種々の認識鎖（ＳＡ２０１２Ｆ）対希釈剤（ＳＡ２０）鎖の分子比を有する溶液を用いて修飾した。得られた粒子を、ＳＡ２０１２Ｆ表面密度の測定のために上述の蛍光方法で分析し、次に、１２′Ｆとのハイブリダイゼーション効率に関してテストした。
ＳＡ２０１２Ｆ表面密度は、堆積溶液中のＳＡ２０１２Ｆ対ＳＡ２０の比率に関して直線的に増加した（図３０）。これは、ナノ粒子に付けられたＳＡ２０１２ＦとＳＡ２０の比が溶液の比を反映することを示唆しているので、面白い結果である。この結果は、溶解
度と鎖長が吸着動力学に重大な役割を果たす、短鎖アルキルまたはＴ官能化チオールの混合物に通常見られる結果と対照的である（Ｂａｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：７１５５−７１６４（１９８９）；Ｂａｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：７１６４−７１７５（１９８９）。
個々の異なるサンプルにハイブリダイズした相補的な１２Ｆオリゴヌクレオチドの量も、ＳＡ２０１２Ｆ表面被覆範囲の増加につれて直線的に増加した（図３１）。この関係が良好に定義されるという事実は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体のハイブリダイゼーションの程度を予測および制御できることを示す。これは１２Ｆ′のハイブリダイゼーションがより高いＳＡ２０１２Ｆ被覆範囲ではより困難になり、オリゴヌクレオチド間に立体的密集と静電気反発が起こる可能性が高いことを示唆している。
Ｐ．要約
本研究は、オリゴヌクレオチドを付着させたナノ粒子を安定化させる程度に高いが、高い割合の鎖が溶液中のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために接近できる程度に低く、オリゴヌクレオチド被覆範囲間のバランスを達成することが重要であることを示している。それは、オリゴヌクレオチドを、高いオリゴヌクレオチド表面被覆範囲を得るためにナノ粒子に付着させたり、静電相互作用を減らすためにオリゴヌクレオチドスペーサーセグメントに付着させたり、各ナノ粒子に対するハイブリダイゼーション事象の平均数を再現可能に制御するために同時吸着鎖を付着したりしている間に、塩条件を調節させることにより達成される。鎖（スペーサー）の配列の性質が、金ナノ粒子に装填されたオリゴヌクレオチド鎖の数に影響を及ぼすことも示された。この研究は、オリゴヌクレオチドとナノ粒子の間の相互作用の理解ならびにナノ粒子−オリゴヌクレオチド検出方法の感度の最良化に関して重要な意味合いを持つ。
実施例１９： 遺伝子チップアッセイ
この実施例では、オリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子を用いたコンビナトリアルＤＮＡアレイの選択的が非常に高くかつ非常に高感度な分析法を説明する。非常に狭いナノ粒子−標的複合体熱解離温度範囲により、ヌクレオチド誤対合を１つ有する標的から所与のオリゴヌクレオチド配列を、非常に高い選択性で識別することができる。さらに、銀（Ｉ）のナノ粒子触媒還元に基づくシグナル増幅法と組合せると、このナノ粒子配列検出系の感度は、慣用の類似発蛍光団系の感度よりも２桁の大きさだけ優れている。
科学者が病気の遺伝的根拠を明らかにし、この新規な情報を医学診断や治療の改良に用いるにつれ、配列選択的ＤＮＡ検出はますますその重要度を増している。サザンブロットやコンビナトリアルＤＮＡチップなどの一般に用いられている異種ＤＮＡ配列検出系は、標的ＤＮＡと相補的な表面結合一本鎖オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。これらのアッセイの特異性も感度も、全対合配列および誤対合配列にハイブリダイズした捕獲鎖の解離特性に依存する。以下に説明するように、驚くべきことには、基板にハイブリダイズした単１種類のナノ粒子が類似の発蛍光団ベース系や非標識ＤＮＡよりも実質的に急激な融解プロファイルを示すことが発見された。さらに、ナノ粒子二本鎖の融解温度は、同一配列を有する類似の発蛍光団系の場合より１１℃も高い。これら２つの観察結果を、銀（Ｉ）のナノ粒子触媒還元に基づく定量的シグナル増幅法の開発と合わせると、１単塩基誤対合選択性および類似の慣用発蛍光団ベースアッセイよりも２桁も高い感度を有する新規なチップベースＤＮＡ検出系の開発が可能になる。
３成分サンドイッチアッセイ形式（図３２参照）において、透明な基板にハイブリダイズした特定のＤＮＡ配列の存在を示すために、実施例３に記載のように調製したオリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子（直径１３ｎｍ）を用いた。典型的な実験では、基板は、実施例１０に記載のようなアミン修飾プローブオリゴヌクレオチドを用いて、フロートガラス製顕微鏡スライド（フィッシャー・サイエンティフック社）を官能化して作製した。この方法を用いて、スライドの表面全体に１種類のオリゴヌクレオチドかまたは市販のマイクロアレイヤーを用いてスポットした複数種類のオリゴヌクレオチドアレイで官能化したスライドを作製した。次いで、指示オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子および（炭疽菌保護抗原配列をベースとする）合成３０ｍｅｒオリゴヌクレオチド標的を
これらの基板に同時ハイブリダイズさせた（図３２参照）。したがって、表面のナノ粒子の存在によって、特定の３０塩基配列の検出が示された。標的濃度が高い（≧１ｎＭ）と、表面上のハイブリダイズした高密度のナノ粒子が、表面を明るいピンク色にした（図３３参照）。標的濃度が低い場合、付着しているナノ粒子は、（電界放出走査電子顕微鏡検査では画像が見られたが）肉眼で見ることはできなかった。基板表面にハイブリダイズしたナノ粒子の視覚化を容易にするために、銀イオンをヒドロキノンによって触媒的に還元してスライド表面上に銀金属を形成するシグナル増幅法を用いた。この方法は、組織化学顕微鏡検査研究において、タンパク質−および抗体−結合金ナノ粒子を拡大するために用いられている（Ｈａｃｋｅｒ，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８９年），第１巻，第１０章；Ｚｅｈｂｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，第１５０巻，１５５３ページ（１９９７年））が、その定量的ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイにおける使用は新規である（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１７１巻，２１７ページ（１９８８年））。この方法は、ナノ粒子プローブの極めて低い表面被覆面積を簡単な平台型スキャナや肉眼で視覚化し得た（図３３）だけでなく、染色面積の光学密度に基づく標的ハイブリダイゼーションの定量も可能になった（図３４）。重要なことには、標的の不在下、または非相補的標的の存在下には、表面の染色は観察されず、これは、ナノ粒子の表面への非特異的結合も、非特異的銀染色も起こらないことを証明している。この結果は、核酸の非常に高い感度かつ非常に選択的な検出を可能にするこれらのナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の優れた特徴である。
さらに、本発明のオリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子の固有のハイブリダイゼーション特性を、さらにコンビナトリアルオリゴヌクレオチドアレイ（または「遺伝子チップ」）の選択性を改良するために用い得ることが確認された（Ｆｏｄｏｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７巻，３９３ページ（１９９７年））。オリゴヌクレオチドアレイの異なる素子にハイブリダイズした標的の相対比は、標的配列決定時のアレイの正確性を決定するであろう。この比率は、異なる捕獲鎖とＤＮＡ標的との間で形成された二本鎖のハイブリダイゼーション特性に依存する。驚くべきことには、これらのハイブリダイゼーション特性は、発蛍光団標識の代わりにナノ粒子標的を用いることにより劇的に改良される。図３５に示されているように、ナノ粒子標識標的の表面結合捕獲鎖からのデハイブリダイゼーションは、同一配列を有する発蛍光団標識標的のものよりはるかに温度感受性である。発蛍光団標識標的は、極めて広範な温度範囲（一次導関数ＦＷＨＭ＝１６℃）にわたって表面捕獲鎖からデハイブリダイズしたが、同一ナノ粒子標識標的ははるかに急激に融解した（一次導関数ＦＷＨＭ＝３℃）。これらの急勾配の解離プロファイルは、通常、ハイブリダイゼーションストリンジェンシー洗浄によって影響を受ける、チップベースの配列分析のストリンジェンシーを改善すると予想された。確かに、相補的表面プローブにハイブリダイズした標的と、（図３５の水平線によって表される）特定温度下のストリンジェンシー洗浄後に、誤対合プローブにハイブリダイズした標的との比率は、発蛍光団標識よりナノ粒子標識の方がはるかに高い。これは、チップ検出形式における高選択性を意味する筈である。さらに、ナノ粒子標識は、それによって、それより低いと、二本鎖が室温下に自発融解する臨界濃度を低下させる表面二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を上昇させることによりアレイ感度を向上させるであろう。
オリゴヌクレオチドアレイの比色指示剤としてのナノ粒子の有効性を評価するために、テストチップを合成標的でプローブし、発蛍光団指示剤とナノ粒子指示剤とで標識した。テストアレイとオリゴヌクレオチド標的は、公開されているプロトコル（Ｇｕｏら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２２巻，５４５６ページ（１９９４年）；Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ４１７ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒを用いて、３７５μｍで分離された直径１７５μｍのスポットアレイをパターン化した）に従って作製した。
アレイは、標的の８位の４つの可能なヌクレオチド（Ｎ）それぞれに対応する４つの素子を含んでいた（図３２参照）。ハイブリダイゼーション緩衝液中で、合成標的と、蛍光標識またはナノ粒子標識プローブとを段階的にアレイにハイブリダイズさせたが、各ステップの後で、３５℃のストリンジェンシー緩衝液洗浄を行った。先ず、２×ＰＢＳ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２Ｈ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、ｐＨ７）中の１ｎＭ 合成標的溶液２０μｌとアレイとを、室温下に４時間、ハイブリダイゼーションチャンバ（Ｇｒａｃｅ Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ Ｃｏｖｅｒ Ｗｅｌｌ ＰＣ２０）中でハイブリダイズさせ、次いで、３５℃下に清浄な２×ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。次いで、２×ＰＢＳ中１００ｐＭ オリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子溶液２０μｌとアレイとを、室温下に４時間、新鮮なハイブリダイゼーションチャンバ中でハイブリダイズさせた。アレイを３５℃下に清浄な２×ＰＢＳで洗浄し、次いで、２×ＰＢＳ（０．３Ｍ ＮａＮＯ３、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液、ｐＨ７）で２回洗浄した。次いで、ナノ粒子アレイを銀増幅溶液（シグマ・ケミカル社、Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｅｒ
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に５分間浸漬し、水で洗浄した。銀増幅により、アレイ素子はかなり暗色化し、直径２００μｍの素子は平台型スキャナまたは肉眼でさえ容易に見ることができた。
モデル標的およびナノ粒子標識プローブで攻撃し、銀溶液で染色したアレイは、相補的アレイ素子への選択性の高いハイブリダイゼーションを明瞭に示した（図３６Ａ）。同じ捕獲配列の重複スポットは、再現性があってばらつきのないハイブリダイゼーションシグナルを示した。ナノ粒子または銀染料によるバックグラウンド吸着は全く観察されなかった。平台型スキャナによって記録された画像グレースケール値は、清浄な顕微鏡スライドに関して観察されたものと同じであった。８位のアデニン（Ｎ＝Ａ）に対応する暗いスポットは、オリゴヌクレオチド標的が、３：１を超える比率で、誤対合鎖よりも完全相補性捕獲鎖に選択的にハイブリダイズしたことを示している。さらに、各スポットセットの総合グレースケール値は、ワトソン・クリック型塩基対、Ａ：Ｔ＞Ｇ：Ｔ＞Ｃ：Ｔ＞Ｔ：Ｔ（Ａｌｌａｗｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３６巻，１０５８１ページ（１９８８年））の予測安定性に従う。通常、Ｇ：Ｔ誤対合をＡ：Ｔ相補体から識別するのは特に難しく（Ｓａｉｋｉら，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｃｏｔｔｏｎら編（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９８年），第７章；Ｓ．Ｉｋｕｔａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第１５巻，７９７ページ（１９８７年））、これら２種のアレイ素子の識別は、１つのヌクレオチド誤対合の検出におけるナノ粒子標識の驚異的な分解能を証明している。ナノ粒子ベースアレイの選択性は、発蛍光団指示アレイの選択性より高く（図３６Ｂ）、発蛍光団標識は８位のアデニンに対して２：１の選択性を提供したに過ぎない。
ナノ粒子標識プローブを利用するアッセイは、発蛍光団標識プローブを利用するものより感度が有意に高かった。ハイブリダイゼーションシグナルを、５０ｆＭ程度の低さ（または、２０μｌの溶液を含有するハイブリダイゼーションチャンバの場合は、１×１０６総コピー数）の標的濃度のＮ＝Ａ要素で分解することができた。これは、通常、１ｐＭ以上の標的濃度が要求される慣用のＣｙ３／Ｃ７５発蛍光団標識アレイに比べて劇的な感度の向上を示している。表面上に固定化されたナノ粒子−標的複合体に関して観察された高融解温度がアレイの感度に寄与していることは疑いもない。ナノ粒子系の場合に発蛍光団系に比べてプローブ／標的／表面−オリゴヌクレオチド複合体の安定性が増大すると、洗浄ステップ中に失われる標的およびプローブが少なくなると考えられる。
コンビナトリアルオリゴヌクレオチドアレイの比色性ナノ粒子標識は、誤対合１つの解像、感度、コスト、使用し易さが重要な要素である一ヌクレオチド多型分析などの用途に有用であろう。さらに、全体的に最適化する必要があるこの系の感度は、ポリメラーゼ連鎖反応などの標的増幅計画を必要とせずに、オリゴヌクレオチド標的を検出するための潜
在的な方法を示している。
実施例２０： ナノ粒子構造
ハイブリダイズしたＤＮＡリンカーを媒介としたガラス支持体上への超分子重層金ナノ粒子構造の可逆的集合体を説明する。オリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子を、相補的ＤＮＡリンカーの存在下、オリゴヌクレオチド官能化ガラス支持体に連続付着させる。ＤＮＡの独特な認識特性により、相補的リンカーの存在下にナノ粒子構造が選択的に集合する。さらに、これらの構造は、溶液の温度、ｐＨ、およびイオン強度を含めた連結二本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーションを媒介する外部刺激に応答して集合したり、離散したりし得る。この系は、固相支持体上にナノ粒子ベース構造を構築する極めて選択的かつ制御された方法を提供することに加えて、ＤＮＡによって連結されたナノ粒子網目構造の光学特性と融解特性とに影響を与える要素の研究を可能にする。
別の者は、いかにして、二官能価有機分子（Ｇｉｔｔｉｎｓら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第１１巻，７３７ページ（１９９９年）；Ｂｒｕｓｔら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１４巻：５４２５ページ（１９９８年）；Ｂｒｉｇｈｔら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１４巻：５６９６ページ（１９９８年）；Ｇｒａｂａｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１８巻：１１４８ページ（１９９６年）；Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２６７巻：１６２９ページ（１９９５年）；Ｓｃｈｍｉｄら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｅｌ．，第３９巻：１８１ページ（２０００年）；Ｍａｒｉｎａｋｏｓら，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，第１０巻：１２１４ページ（１９９８年））または高分子電解質（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻，１９５９ページ（１９９８年）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｃｉ．，第８巻：１７９ページ（１９９７年）；Ｅｌｇｈａｎｉａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７７巻：１０７８ページ（１９９７年）；Ｍｉｒｋｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ 第３８２巻，６０７ページ（１９９６年））を使用して平面構造から単層および多層ナノ粒子材料を制御可能に構築し得るかを証明した。ナノ粒子の相互連結体としてＤＮＡを用いることの魅力的な特徴は、ＤＮＡ配列を選択することにより、粒子間間隔、粒子周期性および粒子組成を合成的にプログラムし得ることである。さらに、オリゴヌクレオチドの可逆結合特性を利用して、動構造ではなく熱力学的構造を確実に形成し得る。この方法は、固相支持体からのナノ粒子ベース構造の成長を制御する新規かつ強力な方法を提供するだけでなく、ナノ粒子凝集体サイズと、凝集体ＤＮＡ相互連結構造の融解特性および光学特性との関係を評価することもできる。これら２つの物理的パラメータとそれらの材料構築物との関係は、特にバイオ検出分野におけるナノ粒子網目構造材料の利用に必須である。
多層集合体の構築に用いられる直径１３ｎｍのオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子を実施例１および３に記載のように調製した。これらのナノ粒子には、それぞれナノ粒子ａおよびｂを生成する、５′−ヘキシルチオール−キャップオリゴヌクレオチド１（５′−ＨＳ（ＣＨ２）６Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ−３′［配列番号５０］と、３′−プロパンチオール−キャップオリゴヌクレオチド２（３′−ＨＳ（ＣＨ２）３Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ−５′［配列番号５９］が付着していた（図３７参照）。実施例１０に記載のように、ガラス製スライドを１２ｍｅｒオリゴヌクレオチド２で官能化した。ナノ粒子層を構築するために、先ず、基板を２４ｍｅｒリンカー３（５′−ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ−３′［配列番号６０］）の１０ｎＭ溶液に浸漬し、室温下に４時間ハイブリダイズさせた（図３７参照）。支持体を清浄な緩衝液で洗浄し、次いで、第１ナノ粒子層を付着させるために室温下に４時間、粒子ａの２ｎＭ溶液とハイブリダイズさせた。同様に基板表面をリンカー３とナノ粒子ｂの溶液に暴露するだけで第２ナノ粒子層を第１ナノ粒子層に付着させることができた。これらのハイブリダイゼーションステップを繰り返して、各層がリンカー３を介して前の層に連結したナノ粒子ａとｂの多重交互層を付着させることができた。リンカーの不在下
、または非相補的オリゴヌクレオチドの存在下では、表面へのナノ粒子のハイブリダイゼーションは観察されなかった。さらに、ＤＮＡリンカーのハイブリダイゼーションを促進させる条件：中性ｐＨ、穏和な塩濃度（＞０．０５Ｍ ＮａＣｌ）および二本鎖融解温度（Ｔｍ）を下回る温度下にのみ多層集合体が観察された。
ハイブリダイズした各ナノ粒子層は、基板をより暗紅色とし、１０層がハイブリダイズした後の支持ガラス製スライドには、反射による金色が出現した。表面へのナノ粒子の連続ハイブリダイゼーションのモニターには、基板の透過ＵＶ−可視分光法を用いた（図３８Ａ）。初期ナノ粒子層の吸光度の低さは、この層がさらなる層の形成を促進するもととなったことを示唆しており、層を追加するに従って、プラズモンバンドの強度がほぼ線形に増大することが示された（各連続ナノ粒子層の形成に関して、リンカー３またはナノ粒子溶液の暴露時間を長くしたり、濃度を増大させたりしても、さらなる吸光度の増大は観察されなかった）。初期ナノ粒子層生成後に吸光度が線形に増大したことは、連続的に層を加えるに従って、表面がハイブリダイズしたナノ粒子で飽和されたことを示している（図３８Ｂ）。これは、１層の場合には低いナノ粒子被覆を示すが、２層の場合にはほぼ完全な被覆を示す表面上の１つ（図３９Ａ）および２つ（図３９Ｂ）のナノ粒子層の電界放出走査型電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）画像によって支持される。多層集合体のプラズモンバンドλｍａｘは、５層になった後でさえ、１０ｎｍ以下しかシフトしない。このシフトの検出は、金ナノ粒子凝集体の他の実験的処理（Ｇｒａｂａｒら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１８巻，１１４８ページ（１９９６年））および理論的処理（Ｑｕｉｎｔｅｎら，Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．，第１７２巻，５５７ページ（１９９６年）；Ｙａｎｇら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，第１０３巻：８６９ページ（１９９５年））と一致する。しかし、シフトの大きさは、λｍａｘ＞５７０ｎｍを示す、オリゴヌクレオチドに連結した金ナノ粒子網目構造の懸濁液に関して先に観察されたものと比較すると小さい（先の実施例参照）。これは、金ナノ粒子ベースのオリゴヌクレオチドプローブに関して観察された赤色から青色への劇的な変色を生成するには、恐らく何百または何千ものもっと多くのナノ粒子が連結する必要があることを示唆している。（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻，１９５９ページ（１９９８年）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｓｃｉ．，第８巻，１７９ページ（１９９７年）；Ｅｌｇｈａｎｉａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７７巻，１０７８ページ（１９９７年）；Ｍｉｒｋｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ，第３８２巻，６０７ページ（１９９６年））。凝集した金ナノ粒子の表面プラズモンシフトは、粒子間間隔に大きく依存することが明らかにされた（Ｑｕｉｎｔｅｎら，Ｓｕｒｆ．Ｓｃｉ．，第１７２巻：５５７ページ（１９８６年）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，前掲）。オリゴヌクレオチドリンカーにより提供される大きな間隔（この系の場合８．２ｎｍ）によって、金表面プラズモンバンドに及ぼすナノ粒子凝集の累積的効果が有意に低下する。
集合したナノ粒子多層の解離特性は、層の数に大きく依存していた。多層でコートされた基板を緩衝液に懸濁し、温度を連結オリゴヌクレオチドのＴｍより高い温度（５３℃）に上げると、ナノ粒子は、無色のガラス表面を残して、溶液中に解離した。緩衝懸濁液のｐＨを上下させたり（＞１１または＜３）、塩濃度を低下させたり（０．０１Ｍ ＮａＣｌ未満）しても、連結したＤＮＡをデハイブリダイズすることによりナノ粒子は解離した。多層集合体は完全に可逆性であり、ナノ粒子は、ガラス基板にハイブリダイズしたり、ガラス基板からデハイブリダイズしたりし得る（例えば、３つのサイクルは、検出可能な不可逆性ナノ粒子結合がないことが示された）。
重要なことには、表面結合ナノ粒子集合体はすべて連結オリゴヌクレオチドのＴｍを超える温度で解離したが、これらの転移の急激さは、支持されている凝集体のサイズに依存していた（図３９Ｄ−Ｆ）。驚くべきことには、支持体からの第１ナノ粒子層の解離は、溶液中にナノ粒子を含まない同じオリゴヌクレオチド（図３９Ｃ）のものより急激な転移
（図３９Ｄ、一次導関数のＦＷＨＭ＝５℃）を示した。基板にさらにナノ粒子層がハイブリダイズするにつれ、オリゴヌクレオチド連結ナノ粒子の融解転移は、溶液中に見出された大きなナノ粒子網目構造集合体の融解転移と同等になるまで連続的に急激さを増した（図３９Ｅ−Ｆ、一次導関数のＦＷＨＭ＝３℃）。（Ｇｉｔｔｉｎｓら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第１１巻：７３７ページ（１９９９年）；Ｂｒｕｓｔら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１４巻：５４２５ページ（１９９８年）。）これらの実験は、最適な急激融解曲線を得るためには、３つ以上のナノ粒子と多重ＤＮＡの相互連結体が必要であることを立証している。これらの実験はさらに、この系における光学的変化が融解特性から完全に切り離されている（すなわち、凝集が小さいと、急激な転移は生じ得るが、それでも変色は生じない）ことを示している。
実施例２１： 金ナノ粒子集合体の電気的性質
ＤＮＡを介した電子的移動は、過去数年にわたり化学の分野で最も広範囲に討議されている問題の１つである。（Ｋｅｌｌｅｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８３巻：３７５−３８１ページ（１９９９年）；Ｔｕｒｒｏら，ＪＢＩＣ、第３巻：２０１−２０９ページ（１９９８年）；Ｌｅｗｉｓら，ＪＢＩＣ，第３巻：２１５−２２１ページ（１９９８年）；Ｒａｔｎｅｒ，Ｍ．，Ｎａｔｕｒｅ，第３９７巻，４８０−４８１ページ（１９９９年）；Ｏｋａｈａｔａら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１２０巻，６１６５−６１６６ページ（１９９８年））。ＤＮＡは効率的に電子を移動させ得ると主張するものもいるが、ＤＮＡは絶縁体であると考えるものもいる。
表面上類似点の無い研究分野において、ナノ粒子をベースとした材料の電気的性質の研究に多大な努力が傾けられてきた（Ｔｅｒｒｉｌｌら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，第１１７巻，１２５３７−１２５４８ページ（１９９５年）；Ｂｒｕｓｔら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第７巻，７９５−７９７ページ（１９９５年）；Ｂｅｔｈｅｌｌら，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第４０９巻：１３７−１４３ページ（１９９６年）；Ｍｕｓｉｃｋら，Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，第９巻：１４９９−１５０１ページ（１９９７年）；Ｂｒｕｓｔら，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，第１４巻，５４２５−５４２９ページ（１９９８年）；Ｃｏｌｌｉｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２７７巻：１９７８−１９８１ページ（１９９７年））。確かに、多くのグループがナノ粒子を二次元および三次元網目構造に集合させる方法を探究し、そのような構造の電子特性を調査してきた。しかし、ＤＮＡと連結させたナノ粒子ベース材料の電気的性質については実質的に何も分っていない。
この研究において初めて、異なる長さのＤＮＡ相互連結体によって形成された金ナノ粒子集合体の電気的性質が調査された。以下に示されているように、これらのハイブリッド無機集合体は、２４〜７２ヌクレオチド範囲にわたるオリゴヌクレオチド粒子相互連結体長にも拘わらず、半導体として挙動する。本明細書に記載されている結果は、ＤＮＡ相互共役体が、金属ナノ粒子間の絶縁バリヤを形成不要で、このため粒子の電気的性質を破壊することのない、金属ナノ粒子用の化学的に特異的な足場材料として用い得ることを示している。これらの結果は、そのようなハイブリッド集合体を電子材料として利用し得る新規な方法を示している。
この主題の中心には以下の問題がある：ＤＮＡを介して集合したナノ粒子は、それでも電気を伝導し得るか、または各粒子上に重度に添加されたＤＮＡ相互共役体は絶縁シェルとして作用し得るか、ということである（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｕｉｓｎｇ ＤＮＡ，Ｔｈｅｓｉｓ Ｐｈ．Ｄ．，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９９年））。これらの材料の導電率を、温度、オリゴヌクレオチド長および相対湿度の関数として調べた。ＤＮＡによって連結されたナノ粒子構造を、電界放出走査型電子顕微鏡検査（ＦＥ−ＳＥＭ）、シンクロトロン小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ、ｓｙ
ｎｃｈｒｏｔｒｏｎ ｓｍａｌｌ ａｎｇｌｅ ｘ−ｒａｙ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）実験、熱変性プロファイル、およびＵＶ−可視分光法によって特性決定した。
典型的な実験（図４０参照）では、クエン酸塩で安定化した１３ｎｍ金ナノ粒子を、実施例１および３に記載のように、３′および５′アルカンチオールでキャップした１２ｍｅｒオリゴヌクレオチド１（３′ＳＨ（ＣＨ２）２Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ５′［配列番号５９］）および２（５′ＳＨ（ＣＨ２）６Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ３′［配列番号５０］）で修飾した。２４、４８または７２塩基長のＤＮＡ鎖３（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ３′［配列番号６０］）、４（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＣ−ＡＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ３′［配列番号６１］）、および５（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＡＴＡＴＴＧＧＡＣＧＣＴＴＴＡＣＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ３′［配列番号６２］）をリンカーとして用いた。充填剤６（３′ＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＡＣＧＴ５′［配列番号６３］）および７（３′ＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＡＣＧＴＡＴＡＴＡＡＣＣＴＧＣＧＡＡＡＴＧＣＣＴＧＴＴＧ５′［配列番号６４］）を４８塩基リンカーおよび７２塩基リンカーと共に用いた。ＤＮＡ修飾ナノ粒子とＤＮＡリンカーおよび充填剤は、使用前に、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸（ｐＨ７）緩衝液（０．３Ｍ ＰＢＳと称される）中に貯蔵した。ナノ粒子集合体を構築するために、１で修飾した金ナノ粒子（６５２μｌ、９．７ｎＭ）と２で修飾した金ナノ粒子（６５２μｌ、９．７μＭ）をリンカーＤＮＡ３、４、または５（３０μｌ、１０ｎＭ）に加えた。完全に沈殿させた後、凝集体を０．３Ｍ ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４溶液で洗浄して過剰なＤＮＡおよびＮａＣｌを除去した。
凝集体を凍結乾燥（１０−３〜１０−２トル）乾固してペレットを得、揮発性塩ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４を除去した。Ｆｒｅｎｓ法（Ｆｒｅｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．，第２４１巻：２０−２２ページ（１９７３年））により調製した官能化されていないクエン酸塩安定化粒子を膜として乾燥させ、比較用に用いた。得られた乾燥凝集体は曇った黄銅に似た色を有しており、非常に脆かった。ＦＥ−ＳＥＭ画像は、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は乾燥しても無傷のままであるが、クエン酸塩安定化ナノ粒子は互いに融合したことを示した。乾燥したＤＮＡを介して連結された凝集体が０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝液（１ｍｌ）に再分散し得、かつ優れた融解特性を示したことは重要である。そのような分散液を６０℃に加熱すると、ＤＮＡ相互共役体のハイブリダイゼーションが起こり、分散したナノ粒子の赤色溶液が得られた。これをＦＥ−ＳＥＭデータと合わせると、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子は、乾燥させると、不可逆的には凝集しないことが最終的に証明された。
コンピュータ制御４プローブ技術を用いて、３種の試料（それぞれ３、４および５を介して連結された乾燥凝集体）の導電率を測定した。電気接点は、金ペーストでペレットに付着させた細い金ワイヤ（直径２５および６０μｍ）から構成した。試料を中程度の真空（１０−３〜１０−２トル）下に冷却し、低圧のドライヘリウムガス下に温度を増大させながら導電率を測定した。起こり得る光電子事象を排除するために、試料チャンバを光から隔離した。励起電流を１００ｎＡ以下に維持し、試料全体にわたる圧力を最大２０Ｖに制限した。驚くべきことには、３種すべてのリンカーから形成された凝集体の導電率は、室温下に１０−５〜１０−４Ｓ／ｃｍの範囲であり、これらの凝集体は、類似した温度依存性挙動を示した。ＤＮＡ連結凝集体の導電率は、半導体材料の特徴を示す、約１９０°Ｋまでのアレニウス挙動を示した。これは、不連続金属島状膜に認められる活性化電子ホッピング挙動に似ている（Ｂａｒｗｉｎｓｋｉ，Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ，第１２８巻：１−９ページ（１９８５年））。アルカンジチオールを介して連結された金ナノ粒子の網目構造は類似の温度依存性を示した（Ｂｒｕｓｔら，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，第７巻：７９５−７９７ページ（１９９５年）；Ｂｅｔｈｅｌｌら．Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏ
ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，第４０９巻：１３７−１４３ページ（１９９６年））。電荷移動の活性化エネルギーは、方程式（１）
σ＝σｏｅｘｐ［−Ｅα／ｋＴ］］ （１）
を用いる１ｎσ対１／Ｔのプロットから得ることができる。３つの測定値から計算した平均活性化エネルギーは、それぞれ２４、４８および７２ｍｅｒリンカーに関して、７．４±０．２ｍｅＶ、７．５±０．３ｍｅＶ、７．６±０．４ｍｅＶであった。これらの計算には、５０°Ｋから１５０°Ｋまでの導電率を用いた。
これらの種類の材料の電気的性質は粒子間間隔に依存する筈なので、シンクロトロンＳＡＸＳ実験を用いて、分散した乾燥凝集体の粒子間間隔を測定した。ＳＡＸＳ実験は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｒｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ、Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｕｐｏｎｔ−Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ−Ｄｏｗ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅａｍ（ＤＮＤ−ＣＡＴ）Ｓｅｃｔｏｒ５で実施した。ＤＮＡ連結凝集体およびＤＮＡ修飾コロイドの希釈物試料を０．３ミクロンビームの１．５４Å放射線で照射し、散乱放射線をＣＣＤ検出器で回収した。２Ｄデータを循環的に平均し、散乱ベクトル量、ｓ＝２ｓｉｎ（θ）／λ（ここで、２θは散乱角、λは入射放射線の波長）の関数、Ｉ（ｓ）に変換した。すべてのデータをバックグラウンド散乱および試料吸収に対して補正した。３種すべての凝集体構造を乾燥させると、粒子間間隔感受性の第１ピーク位置は、それぞれ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒおよび７２ｍｅｒ連結凝集体の０．０６３ｎｍ−１、０．０４８ｎｍ−１、および０．０３７ｎｍ−１のｓ値から０．０８７ｎｍ−１のｓ値へ大きく変化した。これは、乾燥させると、粒子が殆ど接触するポイントまで粒子間間隔が有意に減少したこと、およびそのような間隔は実質的にはリンカー長とは無関係であるが、溶液中での粒子間隔はリンカー長に大きく依存していたことを示している。これによって、乾燥ペレットの導電率実験における３種の異なる系に関して何故類似の活性化エネルギーが観察されたかが分る。さらに、これによって、何故、ＤＮＡの電子特性の見方とは無関係に比較的高い導電率が観察されたかも明らかになる。ＤＮＡ連結材料とは異なり、乾燥させたクエン酸塩安定化金ナノ粒子膜は、金属様挙動を示した。これは、そのような粒子が互いに融合することを示したＳＥＭデータと一致する。
１９０°Ｋを超えると、測定したＤＮＡ連結試料の導電率は非常に急な低下挙動を示した。すべての試料について、導電率は約１９０°Ｋで急激に低下し始め、およそ２５０°Ｋまで低下し続け、そこから再度増大した。この挙動を詳細に調査するために、試料を繰返し冷却、加熱しながら導電率を測定した。興味深いことには、導電率の低下は、温度が増大方向にあるときにのみ起こった。ＤＮＡは親水性であり、かつ水は潜在的にハイブリッド構造の電気的性質に影響を与え得るので、金凝集体の導電率に及ぼす相対湿度の影響を調べた。湿度を１％から１０％に増大させると、抵抗が１０因数増大した。導電率測定前に、試料を真空（１０−６トル）下に４８時間維持したときには、特有な急低下が非常に弱かったことに留意されたい。これらの観察結果から、１９０°Ｋを超えたときの導電率の非常に急な低下およびその後の増大は、粒子間間隔を（蒸発が起こるまで）一時的に増大させた水の融解およびＤＮＡの吸湿性に関連すると推断した。この仮説と一致して、０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝液で湿らせた乾燥凝集体に関するＳＡＸＳ測定値は、粒子間間隔の２００％の増大（〜２ｎｍ）を示した。
これらの研究は以下の理由から重要である。先ず、これらの研究は、ＤＮＡの分子認識特性を用いれば、ナノ粒子ベース材料を、不動態化したり、それらの離散構造または電気的性質を破壊せずに集合させ得ることを証明している。これらのＤＮＡ官能化粒子を用いて三次元巨視的集合体または、さらにリトグラフィーパターン化構造（Ｐｉｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２８３巻：６６１−６６３（１９９９年））における電気的移動を研究しようとする場合、それらの電気的移動特性を正確に叙述することが絶対に必要である。第２に、これらの研究は、かなり長いリンカー間隔（８〜２４ｎｍ）にわたって、乾燥集
合体の導電率がＤＮＡリンカー長には実質的に無関係であることを示している。これは、これらの実験において、水を除去したり、揮発性塩を用いたりした結果であると考えられる。確かに、溶媒および塩の除去によって創出された自由体積によって、ＤＮＡが表面に圧縮され、凝集体内の粒子が近接する。第３に、ＤＮＡ保護ナノ粒子を有する凝集体は半導体として挙動するが、クエン酸塩安定化粒子から形成された膜は、不可逆的粒子融合および金属様挙動を示す。最後に、これらの結果は、オリゴヌクレオチドで官能化されたナノ粒子と標的ＤＮＡとの間の配列特異的結合事象が回路の閉鎖および導電率の急激な増大（すなわち、絶縁体から半導体へ）を起こすＤＮＡ診断用途におけるこれらの材料の使用を示している（次ぎの実施例参照）。
実施例２２： 金電極を用いた核酸の検出
金電極を用いた核酸検出法が図３９に略図で示されている。Ｇｕｏら，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，第２２巻，５４５６−５４６５ページ（１９９４年）の方法に従って、２つの金電極の間のガラス表面を、標的ＤＮＡ３（５′ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ［配列番号６０］）と相補的な１２ｍｅｒオリゴヌクレオチド１（３′ＮＨ２（ＣＨ２）７Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＡＴＧ−ＣＴＣ−ＡＡＣ−ＴＣＴ［配列番号５９］）で修飾した。オリゴヌクレオチド２（５′ＳＨ（ＣＨ２）６Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ［配列番号５０］）を作製し、実施例１および１８に記載のように１３ｎｍ金ナノ粒子に付着させて、ナノ粒子ａを生成した。標的ＤＮＡ３とナノ粒子ａをデバイスに付加した。ガラス表面の色はピンク色に変わったが、これは、標的ＤＮＡ−金ナノ粒子集合体がガラス基板上に形成されたことを示している。次いで、デバイスを０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液中に浸漬し、４０℃で１時間加熱して、非特異的に結合したＤＮＡを除去し、次いで、実施例１９に記載のような銀染色溶液で５分間処理した。電極の抵抗は６７ｋΩであった。
比較のために、電極間に、オリゴヌクレオチド１の代わりにオリゴヌクレオチド４を付着させて対照デバイスを修飾した。オリゴヌクレオチド４は、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチド２と同じ配列（５′ＮＨ２（ＣＨ２）６Ｏ（ＰＯ２ −）Ｏ−ＣＧＣ−ＡＴＴ−ＣＡＧ−ＧＡＴ［配列番号５０］）を有しており、ナノ粒子の結合を阻止するように標的ＤＮＡ３に結合するであろう。その他の点では上記のようにテストを実施した。抵抗は、使用したマルチメーターの検出限度である４０ＭΩより高かった。
この実験は、相補的標的ＤＮＡ鎖のみがデバイスの２つの電極間にナノ粒子集合体を形成し、回路は、ナノ粒子のハイブリダイゼーションおよびその後の銀染色によって完成し得ることを示している。したがって、相補的ＤＮＡおよび非相補的ＤＮＡは、導電率を測定することにより識別し得る。この形式は、何千もの異なる核酸を同時にテストし得る何千対もの電極を用いた基板アレイ（チップ）にも適用範囲を広げ得る。
実施例２３：環式ジスルフィドリンカーを用いたオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
この実施例では、調製が簡単で、広く有用で、メルカプトヘキシルリンカーを使用して調製した金−オリゴヌクレオチド共役体よりもＤＴＴに対して大きな安定性を示す金−オリゴヌクレオチド共役体を与える、ステロイドジスルフィド１ａ（図４２）に基づく金表面にオリゴヌクレオチドを結合させる新しい環式ジスルフィドリンカーについて説明する。１，２−ジチアン−４，５−ジオールのエステル誘導体は金表面上で単分子層を形成することが知られているため（Ｎｕｚｚｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５，４４８１−４４８３）、環式ジスルフィドを、アンカーユニットの反応部位として選択した。環式ジスルフィドは、両方の硫黄原子を介して立とうに表面に結合し（Ｕｌｍａｎ，Ａ．、ＭＲＳ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、６月４６−５１）、向上した安定性を示し得るキレート構造を与えるだろう。リンク要素としては、入手が容易で、容易に誘導退化されるケトアル
コールであり、大きな疎水性表面を備えた置換体として、金の表面への水溶性分子の接近を選別するのに役立つよう期待されるため、エピアンドロステロンを選択した（Ｒｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５、７５３５−７５３６―Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．９、８２６−８３０）。
先の研究に使用していたオリゴヌクレオチド−金プローブを、水性緩衝液中で末端メルカプトヘキシル基を有するオリゴヌクレオチドを金ナノ粒子と反応させることによって調製した。該プローブは、驚くほど丈夫で、１００℃まで加熱した後や５℃で３年間保存した後でさえ良好に機能することが分かった。しかしながら、本願発明者らは、この共役体が、金の表面から誘導体化したオリゴヌクレオチドを取り外すことで作用するチオールを含む溶液に浸漬させた時に、ハイブリダイゼーションプローブとしての活性を失うことを見出した。この特徴は、ナノ粒子プローブが、チオールを含む溶液（例えばポリメラーゼ酵素の安定化剤としてジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含むＰＣＲ溶液）中で使用される場合に、問題を提起する。
（ａ）一般法
ＮＭＲスペクトルを、溶媒としてＣＤＣｌ３、内部（Ｈ）標準としてＴＭＳ、外部（３１Ｐ）標準としてＨ３ＰＯ４を使用して、５００ＭＨｚ（１Ｈ）および４００ＭＨｚ（３１Ｐ；１６１．９ＭＨｚの獲得）Ｖａｒｉａｎ分光計により記録した。化学シフトはδユニットで表される。ＭＳデータをＱｕａｔｔｒｏ ＩＩ三重四極子質量分析計により得た。自動オリゴヌクレオチド合成を、ミリジーンＥｘｐｅｄｉｔｅ ＤＮＡＤＮＡ合成装置で行った。Ｓの分析は、Ｏｎｅｉｄａ研究サービスによって行われた。
（ｂ）ステロイド−ジスルフィドケタール（１ａ）の調製
合成スキームは図４３に示される。エピアンドロステロン（０．５ｇ）、１，２−ジチアン−４，５ジオール（０．２８ｇ）およびｐ−トルエンスルホン酸（１５ｍｇ）をトルエン（３０ｍＬ）に溶かした溶液を、脱水条件下で７時間環流した（Ｄｅａｎ Ｓｔａｒｋ装置）。その後、トルエンを、減圧下で除去し、残留物を酢酸エチルに溶解した。この溶液を水で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥し、シロップ条の残留物に濃縮した。これをペンタン／エーテル中に一晩静置すると、白色固体（４００ｍｇ）として化合物ｌａが得られた。Ｒｆ値（ＴＬＣ、シリカプレート、溶離液としてエーテル）は０．５であった。比較として、同じ条件下でのエピアンドロステロンおよびの１，２−ジチアン−４、５−ジオールのＲｆ値は、それぞれ０．４および０．３である。ペンタン／エーテルからの再結晶により、白い粉末（融点１１０〜１１２℃）を生じた。１Ｈ ＮＭＲ、δ３．６、（１Ｈ，Ｃ３ＯＨ）３．５４−３．３９（２Ｈ，ｍ ジチアン環の２ＯＣＨ）、３．２−３．０（４Ｈ，ｍ ２ＣＨ２Ｓ）、２．１−０．７（２９Ｈ，ｍ ステロイドのＨ）；質量スペクトル（ＥＳ＋） Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３Ｓ２（Ｍ＋Ｈ）に対する計算値４２５．２１７９、実測値４２５．２１５１ （Ｃ２３Ｈ３７Ｏ３Ｓ２）分析 計算値１５．１２、実測値１５．２６。
（ｃ）ステロイド−ジスルフィドケタールホスホロアミダイト誘導体（１ｂ）の調製
化合物１ａ（１００ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、ドライアイスアルコール浴で冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８０μＬ）およびβ−シアノエチルクロロジイソプロピルホスホルアミダイト（８０μＬ）を連続して加えた。その後、混合物を室温まで温め、２時間撹拌し、酢酸エチル（１００ｍＬ）と混ぜ、５％ＮａＨＣＯ３水溶液で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、干し上がるまで濃縮した。残留物を最小量のジクロロメタンに溶かし、ヘキサンを加えて−７０℃で沈降させ、真空下で乾燥させ、１００ｍｇを生成した。；３１Ｐ ＮＭＲ １４６．０２。
（ｄ）５′修飾オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体の調製
最後の亜リン酸化工程で化合物１ｂ（図４２）を使用した以外には、従来のホスホロアミダイト化学機構を使用して５′修飾オリゴヌクレオチドＩｃ１および１ｃ２をＣＰＧ支持体上に構築した。生成物を、濃縮ＮＨ４ＯＨで１６時間、５５℃で処理することにより支持体から外した。オリゴヌクレオチドを、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（４．６×２００ｎｍ、５μｍ粒径）を備えたＤｉｏｎｅｘ ＤＸ５００システムで、ＴＥＡＡ緩衝液（ｐＨ７．０）と１％／分勾配の９５％ＣＨ３ＣＮ／５％０．０３ＴＥＡＡを１ｍＬ／分の流量で使用して、逆相ＨＰＬＣにより精製した。疎水性ステロイド基の優れた特徴は、キャップされた誘導体が、キャップが外されたオリゴマーから楽に分離されることである。硫黄で誘導体化したオリゴヌクレオチドＩＩａ、ＩＩｃ１，およびＩＩｃ２（図４３）を、市販の「５′−チオール−修飾試薬」（Ｃ６Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と、以前に説明されたような（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ、Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１９５９−１９６４）硝酸銀によるトリチル保護基の解離とを使用して調製した。ジスルフィドＩＩｃ１の調製に関しては、「チオール−修飾Ｃ６ Ｓ−Ｓ」（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を最後の亜リン酸化に使用し、末端のジメトキシトリチル基を８０％酢酸水溶液中で解離させた。
各修飾オリゴヌクレオチドを、固定されたメルカプトヘキシル基を介したオリゴヌクレオチドの固定に使用された方法（Ｓｔｏｒｈｏｆｆら（１９９８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１９５９−１９６４）により、〜１３ｎｍの金ナノ粒子に固定化した。これは、クエン酸塩で安定化ナノ粒子（直径〜１３ｎｍ）を５６時間末端硫黄置換基（ＨＳ−または非環式または環式ジスルフィド）を有するオリゴヌクレオチドを含む緩衝塩溶液に浸漬してから、０．１ＭまでのＮａＣＬを添加し、２４時間静置することを含んでいた。ナノ粒子を遠心によってペレットにし、上澄溶液を除去した。ナノ粒子を洗浄し、緩衝液に再懸濁し、再び遠心し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩に懸濁した。この方法により、装填プロセスに使用される過剰な硫化オリゴヌクレオチドのない、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が得られた。
（ｅ）ハイブリダイゼーション
ジスルフィド−ステロイドアンカーを含むナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブの一体性を評価するために、金ナノ粒子上の修飾オリゴヌクレオチドの固定により、プローブＩｃ１、Ｉｃ２、ＩＩｃ１、ＩＩｃ２、およびＩＩＩｃ１を作製した。与えたシリーズ中のオリゴマーは同じヌクレオチド配列を有するが、５′先端基Ｙの構造が異なっている。Ｉｃ１とＩｃ２はステロイド−ジスルフィド先端基を有し；ＩＩｃ１、ＩＩｃ２はメルカプトヘキシル先端基を有し、ＩＩＩｃ１は非環式ジスルフィド先端基を有する。（ｄＡ）２０鎖はハイブリダイゼーションを促進するための、金とオリゴヌクレオチド認識部分との間のスペーサーとして機能する。硫黄で誘導体化されたオリゴマーの多くは各ナノ粒子に結合する。標的オリゴヌクレオチドとのナノ粒子プローブ対のハイブリダイゼーションは３次元のネットワークの生成と、および赤から青灰色への色の変化につながる（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１２６７４−１２６７５）。
プローブのハイブリダイゼーションを、プローブに相補的な配列を含む７９ｍｅｒオリゴヌクレオチド標的を用いて調べた。（図４３）。その反応は、０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）で、プローブ対Ｉｃ１、Ｉｃ２、およびＩＩｃ１、ＩＩｃ２、およびＩＩＩｃ１、ＩＩＩｃ２のコロイド溶液（各ナノ粒子プローブに関して５０μＬおよび１．０Ａ５２０ユニット）に１μＬの標的溶液（１０ｐｍｏｌのＩＶ）を加えることにより、室温で行った。１０秒、５分、および１０分目に、アリコート（３μＬ）を取り、Ｃ−１８逆相ＴＬＣプレート上にスポットした。様々なプローブ対はすべて同じに作用した。すなわち、１０秒間の反応のスポットは赤くなり（ナノ粒子が自由であること示す）；１０分間の反応のスポットは紺青灰色となり（ナノ粒子の凝集物の特徴）；５分間の反応は、赤茶けた青色のスポットを与えた（非結合ナノ粒子と結合ナノ粒子の混合物
を示す）。オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって達成されるナノ粒子の凝集に関する以前の観察と一致して（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１９５９−１９６４；Ｅｌｇｈａｎｉａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７７、１０７８−１０８１；Ｍｕｃｉｃ Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１２６７４−１２６７５；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｇ．Ｐ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１、８１２２−８１２３）、反応は可逆的だった。凝集物を９０℃（ナノ粒子を一緒にリンクするオリゴマーの解離温度を超える温度）に温め、熱いうちにスポットすると、赤いスポットが得られた。オリゴヌクレオチド標的を省略したかオリゴヌクレオチド標的がプローブに相補的でない対照実験では、すべての条件下で色が赤かった。
本願発明者が結論づけるのは、ステロイド−ジスルフィドアンカーによって生成されたナノ粒子共役体が、ハイブリダイゼーションプローブとして有効に機能することである。さらに、スポット試験によって判断されるように、様々なアンカーユニットを備えた共役体が、かなりの割合で標的オリゴヌクレオチドと反応する。この特徴は、プローブが、ナノ粒子の表面にかなりの密度のオリゴヌクレオチドを有し、５′先端基から比較的遠くに離れているヌクレオチド認識部分を有するという予想と一致している。
（ｆ）ナノ粒子プローブとジチオスレイトールの反応
金ナノ粒子かメルカプトヘキシル−オリゴヌクレオチドを装填した金ナノ粒子のコロイド溶液へのチオールの追加は、ナノ粒子の凝集につながる。色は赤から紺青まで変化し、静置すると、暗色沈澱物が沈着する。蛍光標識したオリゴヌクレオチドを有するナノ粒子の実験で実証されるように、チオールは、金表面に結び付けられたメルカプトアルキル−オリゴヌクレオチドを置換する（Ｍｕｃｉｃ、Ｒ．Ｃ．（１９９９） Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ＰｈＤ論文、ノースウェスタン大学）。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体のハイブリダイゼーションによって起こった凝集とは対照的に、そのような反応は不可逆であり、加熱しても、ＮａＯＨを加えても、凝集物を分解することはできない。
本願発明者らは、この色を、ステロイド環式ジスルフィド先端基、メルカプトヘキシル先端基、および非環式ジスルフィド先端基を用いて作製したプローブとＤＴＴとの反応をモニタするために使用した。実験は、１μＬの１Ｍ ＤＴＴ溶液を、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．０）の１００μＬのナノ粒子−オリゴヌクレオチドプローブ溶液（ナノ粒子の２Ａ５２０ユニット）に加え、次に、様々な時間に３μＬのアリコートをＴＬＣプレート上にスポットし、色を観察するにより行った。表１に示されるように、メルカプトヘキシル（ＩＩｃ１とＩＩｃ２）と非環式オリゴヌクレオチド先端基（ＩＩＩｃ１）を備えたオリゴヌクレオチドに由来するコロイドプローブは、急速に反応した。赤青色のスポットが２０秒で得られ、強い青色のスポットが５分以内に得られた。１００分までに、ほとんどの金は沈殿した。対照的に、ステロイド環式ジスルフィド先端基（Ｉｃ１、Ｉｃ２）を用いて作製したプローブの反応では、４０分以内に、色の変化が観察されなかった。ＩＩｃ１、ＩＩｃ２を用いて作製したプローブで得られたのと同じ色に達するには１００分かかった。ＩＩＩｃ１では２０秒かかった。これに基づいて、本願発明者らは、ステロイドジスルフィドプローブのＤＴＴとの反応速度は、他のプローブの反応速度の約３００分の１であると推測する、非環式ジスルフィドアンカー３ｃから作製したプローブは、メルカプトヘキシルアンカーから作製したプローブとほぼ同じ速度で反応する。この後者の結果は、非環式ジスルフィドの金との反応がＳ−Ｓ結合の開裂に関与しているという証拠を考慮すれば、驚くことではない（Ｚｈｏｎｇ、Ｃ．Ｊ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１５、５１８−５２５）。従って、非環式先端基を備えたオリゴヌクレオチドは、メルカプトヘキシル−オリゴヌクレオチド誘導体の場合のように、１つの硫黄原子によって恐らく金にリンクされるだろう。
ＤＴＴの存在下で静置した後に、ＩｃｌおよびＩｃ２から作製したプローブが実際にハイブリダイゼーションプローブとして依然として機能するかどうか確かめるために、本願発明者らは、表１の反応に使用した条件下でプローブ混合物の２つのサンプルをＤＴＴで処理した。３０分後に、１μＬの７９ｍｅｒ標的オリゴヌクレオチド溶液（１０ｐｍｏｌ）を加えた。サンプルを急速凍結し、解凍し、スポット試験によって測定した。標的を含むサンプルのスポットは青く、標的を欠く対照のスポットは赤かった。これは、ナノ粒子共役体が安定しているだけでなく、メルカプトヘキシルか線形ジスルフィドアンカー基に由来するプローブの凝集を生じさせる条件下でＤＴＴに暴露した後でプローブとして有効であることを実証した。
（ｇ）結論
この環式ジスルフィドリンカーを用いて作られた金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、特定のオリゴヌクレオチド配列を検出するのに有効なプローブとして機能し、従来のメルカプトヘキシル基または非環式ジスルフィドユニットを用いて作製された対応する共役体よりも、ジチオスレイトールへのはるかに大きな安定性を示す。チオール不活性化に対する高い安定性は、少なくとも一部では、２つの硫黄原子によって各オリゴヌクレオチドを金に固定することに因ると考えられる。
実施例２４：単純な環式ジスルフィドリンカーを使用したオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
この実施例では、本願発明者らは非ステロイド環式ジスルフィドリンカーと、このリンカーからオリゴヌクレオチド−ナノ粒子プローブとを調製し、ステロイド環式ジスルフィドとアルキルチオールリンカーにより調製されたプローブに対する、チオール含有溶液の存在下でのプローブ安定性を評価した。アルキルチオールアンカー基Ｉ（図４４）［Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３８２、６０７（１９９６）；Ｓｔｏｒｈｏｆｆら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０、１９５９年（１９９８）］またはステロイド環式ジスルフィドアンカー基ＩＩ（図４４）［Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１、２８９（２０００）］を使用して金ナノ粒子にオリゴヌクレオチドを結合することにより、ＤＮＡまたはＲＮＡの配列を検出するためのプローブの調製方法が記載されている。プローブとしてステロイド環式ジスルフィドリンカーを使用して調製した共役体は、メルカプトエタノールやジチオスレイトール（ＤＴＴ）のようなチオール化合物の存在下ではるかにより安定している点でアルキルチオールアンカーを使用して調製した共役体よりも遊離であることがわかった。検出するＤＮＡサンプルを増幅するのに使用されるＰＣＲ溶液は、酵素を保護するために少量のＤＴＴを含んでいるため、この特徴は重要である。ＰＣＲ産物の単純かつ迅速な検出の場合、最初に増幅されたＤＮＡを分離せずにＰＣＲ溶液中で直接試験を行えるように、ＤＴＴへの高い安定性を有するプローブを使用することが望ましい。
２つの特徴がステロイド環式アンカー（化合物１、図４２）を際だたせている。すなわち、（１）環式ジスルフィド（金表面で所与オリゴヌクレオチドを保持するのに共同的に作用する２つの結合部位を原則的に与えることができる）と、（２）疎水的相互作用により金上の隣接鎖を安定させることが可能なステロイドユニット（例えばＲ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５，７５３５（１９９３）参照）である。それらの寄与の重要性を評価するために、本願発明者らは、ステロイド基を欠く環式ジスルフィド化合物ＩＩＩｃ（図４４）によって固定された金共役体を調製し、調べた。
トランス−１，２−ジチアン−４，５−ジチオールを、トルエン中でアセトールと加熱することにより調製した化合物２ａを、シアノエチルＮ，Ｎ−ジ−ｉ−プロピルホスホロアミダイト試薬２ｂに変換した。該試薬２ｂは、修飾オリゴヌクレオチド２ｃ１および２ｃ２の合成の最終結合ステップに使用した。１つの金共役体プローブを、２ｃ１および等モル量の２ｄで金コロイド溶液を処理することにより調製した。２ｄは金表面上の希釈剤として機能する。コンパニオンプローブを、２ｃ２および２ｄから同様に作製した。これらのナノ粒子共役体は、静置と、凍結・融解との両方に関して、塩化ナトリウム溶液の０．１、０．３、０．５、０．７Ｍの範囲で安定していた。
（ａ）化合物２ａ、２ｂ、２ｃ１、２ｃ２の調製
実施例２３に記述したように化合物２ａを調製した。２ａの亜リン酸化とオリゴヌクレオチド２ｃ１および２ｃ２の合成を、実施例２３や他の箇所でステロイド環式ジスルフィド誘導体に関して先に述べたように行った［Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１、２８９（２０００）、この文献の開示は引用によりその全体が組み込まれる］。ＣＰＧ支持体上のオリゴマーにＩＩＩｂを縮合することに関与するステップの反応時間は、１０分であった。
（ｂ）金−オリゴヌクレオチド共役体の調製
１．７μモル／ｍＬの各オリゴヌクレオチドを含む溶液を提供するために、等モル量のオリゴヌクレオチド２ｃ１および２ｄまたは２ｃ２および２ｄを１３ｎｍの金コロイド（〜１０ｎＭ）に加えた。該溶液を暗所で２４時間保存し、その後、塩類を加えて、該溶液を０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸塩（ｐＨ７．０）、０．０１％アジ化ナトリウムとなるようにした。２４時間後に、ＮａＣｌ濃度を０．８Ｍに増大し、溶液をさらに２４時間静置した。その後、凝集物を除去するためにコロイドをろ過し、溶液を遠心してナノ粒子を集める。ペレットを、ナノピュア水で洗浄し、再び遠心し、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．０１％アジ化ナトリウムに再分散した。
（ｃ）ナノ粒子プローブとジチオスレイトールの反応
置換の研究は、２０μＬの２ｃ１と２ｃ２から得たコロイド共役体の等量混合物に、２μＬの０．１Ｍ ＤＴＴを加えることにより、室温（２２℃）で行った。アリコート（３μＬ）を定期的に取り、白いナイロン膜上にスポットした。最初、スポットは赤かった。ＤＴＴによる金からのオリゴヌクレオチド硫黄誘導体の置換により、スポット試験で青灰色のスポットを与える混合物が生じた。ＤＴＴによる置換の時間を、混合物がスポット試験で強い青灰色を与える時間として採用した。２ｃ１および２ｃ２に由来する共役体の混合物の場合、この時は１０時間だった。
比較のために、オリゴヌクレオチド共役体を、同様にメルカプトヘキシルアンカー（化合物２、図４２）およびステロイド環式ジスルフィドアンカー（化合物１、図４２）を使用して、オリゴヌクレオチド配列ｃ１およびｃ２（図４４）から調製した。青灰色のスポットを与える時間によって測定される、単チオール誘導体（２および図４２）およびステロイド環式ジスルフィドから調製した共役体の反応時間は、それぞれ５分と５３時間であった。これらの値は、メルカプトアルキル誘導体、非ステロイド環式ジスルフィドおよび
ステロイド環式ジスルフィドに由来するナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体に対する相対安定性の１、〜６０、〜３００に対応する。結果は、環式ジスルフィドアンカーユニット自体が、これらの系でメルカプトアルキル基に対して高い安定性を与えるのに十分であることを示す。化合物１に由来するナノ粒子共役体中の大きな疎水基も、オリゴヌクレオチドのチオール置換に対して安定性を増強するのに役割を果たしているように思われる。
実施例２５：オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子の調製
この実施例では、本願発明者らは、チオール含有溶液の存在下での、アルキルチオールおよびステロイド環式ジスルフィドリンカーと比較した、新しい非環式ジスルフィドリンカーであるトリチオールの安定性を評価した。比較のために、メルカプトヘキシルアンカー（化合物５、図４５）およびステロイド環式ジスルフィドアンカー（化合物６、図４５）を備えたオリゴヌクレオチドを調製した。
（ａ）５′−トリメルカプトアルキルオリゴヌクレオチドの合成および特徴付け
図４７に示したように、５′−トリメルカプトアルキルチオールオリゴヌクレオチドを合成した。Ｔｒｅｍｂｌｅｒホスホロアミダイト７（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、バージニア州スターリング）（図４５）およびチオール修飾剤Ｃ６ Ｓ−Ｓホスホロアミダイトを、ＣＰＧ支持体に結合された保護オリゴマーの５′端に逐次結合した。生成物をＣＰＧから解離し、上述のように精製した。３つのＤＭＴ基を備えたトリチオールオリゴヌクレオチドに対する保持時間は、約６４分である。続いて、５′−ＤＭＴ基を、８０％酢酸に３０分間オリゴヌクレオチドを溶解し、その後蒸発により取り外した。オリゴヌクレオチドを５００μＬのナノピュア水に再溶解した、溶液を酢酸エチル（３×３００μＬ）で抽出した。溶媒の蒸発後、オリゴヌクレオチドを白色固体として得られた。ＤＭＴ基がないこの５′−トリ−ジスルフィドオリゴヌクレオチドの保持時間は、逆相カラムで約３５分であり、イオン交換カラムでは２４分であった。これらのピークはいずれもスペクトル面積の９７％以上であり、オリゴヌクレオチドが高純度であることを示している。オリゴヌクレオチド８（図４５）の式量を、エレクトロスプレーＭＳ（計算値１２２４２．８５、実測値１２２４４．１）により得た。ＤＮＡ鎖上の３つのジスルフィド基を５′モノチオールＤＮＡに対して上述したようにトリチオール基に還元し、その後、ＮＡＰ−５カラムでオリゴヌクレオチドを精製した。
（ｂ）５′−チオールまたはジスルフィドＤＮＡ修飾金ナノ粒子の調製
ベクター研究所（カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）より購入した金のナノ粒子を使用した。１０ｍＬの３０ｎｍ金コロイドに、５ＯＤのチオール修飾ＤＮＡを添加した。溶液を、徐々に０．３Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）（ＰＢＳ）にした。その後、ナノ粒子を遠心によって沈降させた。無色の上清を除去した後、赤色の油状沈殿物を１０ｍＬの新しいＰＢＳ緩衝液に再分散した。このプロセスを繰り返すことにより、コロイドを１０ｍＬの新しいＰＢＳ緩衝液を用いて２回洗浄した。
（ｃ）チオール−ＤＮＡ修飾金ナノ粒子の安定性試験
固体のＤＴＴを、ＤＴＴ濃度が０．０１７Ｍとなるまで、様々な種類のチオールまたはジスルフィドＤＮＡで修飾した３０ｎｍ金ナノ粒子コロイドの６００μＬ溶液に加えた。ＤＴＴがオリゴヌクレオチドを置換するにつれて、コロイドの色は赤から青に代わる。ＵＶ／ＶＩＳスペクトルを時間の関数として取った。分散した３０ｎｍ金粒子に関連する〜５２８ｎｍの吸光度は減少し始め、７００ｎｍの広幅のバンドが伸び始めた。７００ｎｍのバンドはコロイドの凝集に関連している。図４８に示されるように、１つのチオールオリゴヌクレオチド（１）で修飾した３０ｎｍ金の粒子は、０．０１７Ｍ ＤＴＴで迅速に凝集物を形成し、１．５時間後にはコロイドが完全に青くなる。ジスルフィドオリゴヌクレオチド（４）で修飾したナノ粒子を含む溶液は、同一条件下では２０時間後に青くなる。トリチオール−オリゴヌクレオチド（開裂した６）で修飾したナノ粒子では、溶液が青
くなるのに４０時間かかった。
実施例２６：ナノ粒子−核酸−ｓｆｐメンバー共役体を用いた検体の検出
この実施例では、ナノ粒子−ストレプトアビジンプローブを用いて検体（ビオチン）の検出を実証する（図５４，５６）。
（ａ）ナノ粒子−核酸−タンパク質共役体の調製
ナノ粒子−核酸共役体を、実施例３に記載したように調製する。これらの共役体を調製するために用いたオリゴヌクレオチド修飾因子は、以下の配列を有する：５’ＳＨ（ＣＨ2 ）6 −Ａ10−ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ３’（２）。図５６に示すように、ビオチン標識オリゴヌクレオチド（１）［３’−ビオチン−ＴＥＧ−Ａ10−ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ５’］を、ビオチン ＴＥＧ ＣＰＧ支持体（グレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；カタログ番号２０−２９５５−０１）を用いて文献の手順により調製する。ストレプトアビジン／ＤＮＡ共役体を作製するために、ストレプトアビジンを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中の１当量のビオチン修飾オリゴヌクレオチドと、攪拌器にて室温で２時間反応させた。異なる数のオリゴヌクレオチドと複合化したストレプトアビジンを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）及び０．５％／分 勾配の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌによる流速１ｍＬ／分のイオン交換ＨＰＬＣで分離しながら、ＤＮＡのＵＶシグナルを２６０ｎＭ及び２８０ｎＭでモニタリングした。ストレプトアビジン／ビオチン修飾オリゴヌクレオチド混合物は、４５分、５６分、６７分、及び７１分に、それぞれ１：１、２：１、３：１、及び４：１オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体に対応する４つのピークを示した。ストレプトアビジン／オリゴヌクレオチドの１：１複合体（１０μＭ、５μＬ）を単離して、０．３Ｍ ＰＢＳ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７）中のリンカーＤＮＡ［５’ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣＧ３’］（３）（１０μＭ、５μＬ）と予備混合し、その後その混合物を０．３Ｍ ＰＢＳ中のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体（１０ｎＭ、１３０μＬ）に添加して、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体を調製した。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体、ストレプトアビジン／オリゴヌクレオチド、及びリンカーＤＮＡを含有する溶液を、ドライアイス中で１０分間凍結させ、解凍してＤＮＡハイブリダイゼーションを促進させた。１２時間後に、その溶液を１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、上清を除去した。ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体の赤色油状沈殿物を、０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝液に再分散させた。
その後、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体を使用して、ターゲット検体、つまりガラス表面に固定化したビオチンの存在を検出した。
（ｂ）ビオチンの検出
ビオチンは、以下の手順に従ってガラススライドに固定化した：オリゴヌクレオチド修飾ガラススライドを、過去に報告された方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年，第２８９巻，１７５７−１７６０ページ）により調製し、その後ビオチン修飾オリゴヌクレオチドを表面ＤＮＡにハイブリダイズさせた。（ビオチン修飾ガラススライドは、様々な方法により調製することができる。１つの例は、アミン修飾ガラススライドを調製し、その後表面のアミンを、アミンと反応する様々な市販のビオチン化試薬と反応させることである。）図５４に示すように、固定化ビオチンガラススライドは、その後ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジンを含有する媒体（０．３Ｍ ＰＢＳ中に２ｎＭ）で処理した。洗浄し銀強化溶液で処理した後、灰色又は光沢のある銀色のスポットの発現により、捕獲したプローブの存在が実証された［銀強化溶液Ａ（カタログ番号Ｓ５０２０，シグマ社（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ），米国ミズーリ州セントルイス）、及び銀強化溶液Ｂ（カタログ番号Ｓ５１４５，シグマ社（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ））、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００年，第２８９巻、１７５７ページも参照］。所望なら、オリゴヌクレオチドに
連結する蛍光標識した特異的結合対メンバーを用いて、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ｓｐｆプローブを調製してもよい。その後、この発蛍光団標識プローブを用いて、検体の存在を検出してもよい。
実施例２７：金コロイドストレプトアビジン共役体の特異的結合の比較
この実施例において、実施例２６に従って調製したナノ粒子ストレプトアビジンプローブ、及び市販のＡｕコロイド（２０ｎｍ）／ストレプトアビジン共役体（フルネーム：金標識ストレプトアビジン標識）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ Ｃｏｍｐａｎｙ），米国ミズーリ州セントルイスから購入，カタログ番号Ｓ６５１４）の非特異的結合を評価した。共役体を含有する市販の溶液及び本発明のプローブ（０．３Ｍ ＰＢＳ中に２ｎＭ）を含有する溶液各５μｌを、ガラススライド上にスポットした。２０時間後に、スライドを水で洗浄して、銀強化溶液［実施例２６参照］で処理した。市販の共役体は、発色の５分後に灰色のスポットを示しており、ガラス表面にＡｕコロイドが存在することが示されたが、実施例３のナノ粒子ストレプトアビジンプローブでは、認識できる銀色染色は示されなかった（図５３）。シグナルの差は、銀色染色したスライドに第２のＤＮＡ修飾ナノ粒子を載せてそれを再染色することにより高めることができた。これにより、本発明のナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ｓｂｐ共役体が、市販のＡｕコロイド／ストレプトアビジン共役体よりも非特異的結合に対して抵抗性があることが実証される。
実施例２８：ナノ粒子アセンブリの調製
本明細書に論じたように、特異的結合対メンバー、例えば受容体又はリガンドは、オリゴヌクレオチドにより機能化され、オリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子に固定化されて、ＤＮＡよりむしろ特異的結合対メンバーが指向する分子認識特性を備える以外に、オリゴヌクレオチド修飾粒子の高度安定性を呈する新しい分類のハイブリッド粒子を生成することができる。或いは、受容体修飾オリゴヌクレオチドを備えた多重受容体結合部位を有するタンパク質を機能化し、それにより我々の本来の材料の組立スキームにおいて、タンパク質受容体複合体を無機ナノ粒子の１つの代わりに部分構造の１つとして用いることができる。この実施例において、我々は、１３ｎｍ金ナノ粒子、ストレプトアビジン、及びビオチン化ＤＮＡを用いて、新しいナノ粒子アセンブリ（図５２）を調製して、得られた新しい生物無機材料の物理的及び化学的特性の幾つかを研究する。
（ａ）実験
オリゴヌクレオチド修飾１３ｎｍ Ａｕ粒子（２−Ａｕ）及びリンカーＤＮＡ（３）を調製するための方法は、他の文献で報告されている。これらの共役体を調製するために用いるオリゴヌクレオチド修飾因子は、以下の配列を有する：５’ＳＨ（ＣＨ2 ）6 −Ａ10−ＣＧＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴ３’。リンカーＤＮＡ（３）は、以下の配列を有する：［５’ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＣＧ３’］。Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８年，第１２０巻，１９５９ページを参照されたい。Ａｕ粒子（２−Ａｕ）及びリンカーＤＮＡ（３）は、使用の前に０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７、０．３Ｍ ＰＢＳ）に保存した。ビオチン修飾ＤＮＡ（２）は、ビオチン ＴＥＧ ＣＰＧ支持体（グレン・リサーチ社（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を用いて合成し、文献の方法により精製した。Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８年，第１２０巻，１９５９ページ；Ｔ．Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ，ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｉｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編集），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１年を参照されたい。ストレプトアビジンは、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）から購入し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（３０Ｍ、ｐＨ７．２）に溶解した。ストレプトアビジン／ＤＮＡ共役体（１−
ＳＴＶ）を作製するために、ストレプトアビジンを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液中の８当量のビオチン−オリゴヌクレオチド共役体１と攪拌器にて室温で２時間反応させた。ビオチン−オリゴヌクレオチド共役体は、配列［３−ビオチン−ＴＥＧ−Ａ10−ＡＴＧＣＴＣＡＡＣＴＣＴ５’］を有している。ＤＮＡに対するストレプトアビジンの割合が異なる混合物（１：０．４、１：１、１：４）も、ＨＰＬＣ分析のために調製した。ストレプトアビジン／ＤＮＡ共役体は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）及び０．５％／分 勾配の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌによる流速１ｍＬ／分のイオン交換ＨＰＬＣで過剰のＤＮＡから分離しながら、２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでＤＮＡのＵＶシグナルをモニタリングした。１：０．４ストレプトアビジン／ＤＮＡ混合物は、４５分，５６分に２つのピークを、１：１混合物は４５分、５６分、６７分、及び７１分に、それぞれ１：１、２：１、３：１、及び４：１オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体に対応する４つのピークを示した。１：４混合物は、３番目のピーク（６７分）及び４番目のピーク（７１分）の強度が増大することを除けば、同様の位置に４つのピークを示した。１：８ストレプトアビジン／ＤＮＡ混合物のＨＰＬＣスペクトルは、２つの主なピーク、つまり１つは５９分の未反応のＤＮＡのもの、もう一方は７１分の４：１オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン複合体のものを示した。加えて、３：１複合体にあたる６７分のショルダーも存在した。精製したストレプトアビジン−ビオチン化ＤＮＡ共役体は、濃縮して、限外濾過（セントリコン３０）により０．３Ｍ ＰＢＳに分散させた。ＴＥＭ、熱変性実験、及びＳＡＸＳ測定用の凝集体は、ストレプトアビジン−オリゴヌクレオチド共役体（１−ＳＴＶ）、金ナノ粒子ＤＮＡ共役体（２−Ａｕ）、及びリンカーＤＮＡ（３）を含有する溶液をドライアイス中で１０分間凍結することにより調製し、測定する前に解凍して、ハイブリダイゼーションを促進させた。
（ｂ）結果
本明細書に報告したナノ粒子／タンパク質アセンブリ（図５２）は、３つの部分構造：４つのビオチン化オリゴヌクレオチドに複合化したストレプトアビジン（１−ＳＴＶ）と、オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子（２−Ａｕ）と、１に相補的な配列の半分及び２に相補的なもう半分を有するリンカーオリゴヌクレオチド（３）とに依存する（図５２参照）。典型的な実験において、リンカーＤＮＡ３（１０μＭ、２１μＬ）を、２−Ａｕ（９．７ｎＭ、２６０μＬ）と１−ＳＴＶ（１．８μＭ、２７μＬ）の混合物に導入するか、或いはリンカーＤＮＡ３（１０μＭ、２１μＬ）を、１−ＳＴＶ（１．８μＭ、２７μＬ）と予備混合し、その後混合物を０．３Ｍ ＰＢＳ中の２−Ａｕ（９．７ｎＭ、２６０μＬ）に添加した。同等の特性を備えた凝集体が、両方の方法から形成し得るが、３及び１−ＳＴＶの予備混合は、凝集体の形成を促進する。１３ｎｍ金ナノ粒子は、ストレプトアビジン（４ｎｍｘ４ｎｍｘ５ｎｍ）よりも実質的に大きいため［Ｐ．Ｃ．Ｗｅｂｅｒ，Ｄ．Ｈ．Ｏｈｌｅｎｄｏｒｆ，Ｊ．Ｊ．Ｗｅｎｄｏｌｏｓｋｉ，Ｆ．Ｒ．Ｓａｌｅｍｍｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９年，第２４３巻，８５ページ；Ｎ．Ｍ．Ｇｒｅｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９０年，第１８４巻，５１ページ］、ストレプトアビジンに対するＡｕナノ粒子のモル比１：２０を利用して、数個のナノ粒子を含む小さな凝集体より、又はストレプトアビジンのハイブリダイズされた層に機能化された単一の金ナノ粒子からなる構造よりどちらかといえば伸長した高分子構造の形成を好適化した。
興味深いことに、室温では、１−ＳＴＶ、２−Ａｕ、及び３を混合した場合、１−ＳＴＶ、２−Ａｕ、及び３を含有する溶液のＵＶ−ｖｉｓスペクトルが安定していることが示すように、３日後でも観察可能な粒子の凝集は起こらない。しかし、溶液の温度（５３℃）をＤＮＡ相互連結の融点（Ｔｍ）未満で２、３℃上昇させると、ミリサイズの凝集体の成長（図５７Ａ）と、粒子アセンブリに関連するＡｕプラズモン共鳴の特徴的な赤色のシフト及び低下とがもたらされた。Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｎａｔｕｒｅ １９９６年，第３８２巻，６０７ページを参照されたい。透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（図５７Ｂ）は、凝集体
内の粒子がアニーリングの前後にその物理的形状を保持していることを示していることから、粒子の融合がないことが示され、更に表面オリゴヌクレオチド層の安定した影響が実証される。粒子アセンブリを開始するための熱活性化の要件は、過去に研究されたシステム（図５２ｂ）とは相反しており、過去のシステムは、非常に類似した条件下でオリゴヌクレオチド修飾金粒子が室温でリンカーＤＮＡを加えると数分以内に凝集体内に組込まれる２つの金ナノ粒子共役体を含んでいる。Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｎａｔｕｒｅ １９９６年，第３８２巻，６０７ページを参照されたい。この特徴は、：（１）Ａｕナノ粒子上のＤＮＡ被覆（ＤＮＡ：粒子＝〜１１０：１）に比べストレプトアビジン上のもの（ＤＮＡ：ストレプトアビジン＝４：１）が比較的少ないことによる、Ａｕ−ＳＴＶアセンブリシステム内の低い衝突確率［Ｌ．Ｍ．Ｄｅｍｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｇ．Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年，第７２巻，５５３５ページを参照］、又は（２）単一ストレプトアビジン上のＤＮＡのほとんど又は全てが単一粒子上のＤＮＡに結合する動力学的構造の初期形成、を原因とする可能性がある。凝集体形成は、溶液の凍結だけでなく加熱により促進することができる。Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７年，第２７７巻，１０７８ページを参照されたい。
ＵＶ−ｖｉｓ分光学に基づいた融解実験を、ストレプトアビジン／ナノ粒子凝集体で実施し、それらがＤＮＡハイブリダイゼーションにより形成されることが確認された（図５８Ａ）。加熱すると、５２０ｎｍでの吸光度が最初に低下し、その結果融解曲線が一時的に下降し、その後ＤＮＡ融解が起こり粒子が分散すると、その吸光度が急激に上昇する。この一時的下降という挙動は、純粋な金ナノ粒子システムで観察され、融解の前の凝集体成長、つまりある種の凝集体の「熟成」に起因させた。Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ａ．Ａ．Ｌａｚａｒｉｄｅｓ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｇ．Ｃ．Ｓｃｈａｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０００年，第１２２巻，４６４０ページを参照されたい。融解の後、Ａｕプラズモン共鳴が５２０ｎｍに集中し、それは分散した１３ｎｍナノ粒子の特徴である。これらの実験により、結果的に、非特異的相互作用よりむしろ配列特異性ハイブリダイゼーションが、粒子／タンパク質アセンブリを実行すること、及びその工程が完全に可逆的であることが実証される。
Ａｕナノ粒子／タンパク質アセンブリは、ハイブリダイゼーション誘導性アセンブリとは逆に、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用によっても形成することができる。例えば、典型的な実験において、１（０．２４ｍＭ、１．３μＬ）、３（１０μＭ、３２μＬ）、及び２−修飾ナノ粒子（Ａｕナノ粒子濃度：９．７ｎＭ、２６０μＬ）を、０．３Ｍ
ＰＢＳ緩衝液中で混合して、ビオチン修飾Ａｕ粒子を生成した。この混合物を６０℃に１０分間加熱し、その後室温に冷却して、ハイブリダイゼーションを促進させた。２４時間後に、１、３、及び２−修飾Ａｕナノ粒子を含有する溶液を、０．３Ｍ ＰＢＳ中のストレプトアビジン（１０μＭ、４．２μＬ）に添加し、５０℃に加熱して、ナノ粒子凝集体を形成した。溶液の色は、凝集体の形成を示す紫色に変化し、溶液温度をＴｍ（６５℃）を超えて上昇させることにより、凝集体を２−修飾Ａｕ粒子、１−修飾ストレプトアビジン、及び３に解体することができた。小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）［Ｓ．Ｊ．Ｐａｒｋ，Ａ．Ａ．Ｌａｚａｒｉｄｅｓ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｐ．Ｗ．Ｂｒａｚｉｓ，Ｃ．Ｒ．Ｋａｎｎｅｗｕｒｆ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０００年，第３９巻，３８４５ページ；Ａ．Ｇｕｉｎｉｅｒ、Ｆ．Ｇ．，Ｓｍａｌｌ Ａｎｇｌｅ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｘ−ｒａｙｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５年；Ｂ．Ａ．Ｋｏｒｇｅｌ，Ｄ．Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅ，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｂ １９９９年，第５９巻，１４１９１ページ］のデータを、Ａｕ及びストレプ
トアビジン部分構造（１−ＳＴＶ、２−Ａｕ）と２つの異なる長さのＤＮＡリンカー（２４量体（３）及び４８量体）とから形成した凝集体について回収し、Ａｕ−Ａｕアセンブリ及び同様の連結オリゴヌクレオチド（２−Ａｕ、４−Ａｕ、２４量体リンカー（３）、４８量体リンカー）を基にした凝集体のものと比較した（図５９）。４８量体リンカーは、：１及び２に相補的な１２量体の付着末端を含有する５’ＴＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＴＴＡＡＧＡＣＧＡＧＧＣＡＡＴＣＡＴＧＣＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＣＧ及び３’ＧＧＣＡＡＴＴＣＴＧＣＴＣＣＧＴＴＡＧＴＡＣＧＴからなる２本鎖であった（２本鎖領域は下線で示す）。ＳＡＸＳ実験を設計するために、上記実験で用いられ、ＤＮＡハイブリダイゼーションでより高い接近容易性を提供した１，２，及び４のＡ10スペーサ［Ｌ．Ｍ．Ｄｅｍｅｒ，Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ，Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ａ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｇ．Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０００年，第７２巻，５５３５ページを参照］を除去して、より強固なシステムを生成した。ＤＮＡにより連結された凝集体は、比較的明確な回折ピークを示し、Ａｕ−ＳＴＶ凝集体は、同じリンカーから形成されたＡｕ−Ａｕ凝集体よりも小さなｓ値で回折ピークを呈した。これは、Ａｕ−ＳＴＶシステムでのＡｕ粒子間距離がより大きいことを示唆している。その上、Ａｕ−Ａｕ及びＡｕ−ＳＴＶアセンブリの両者でリンカーとして２４量体 ＤＮＡの代わりに４８量体 ＤＮＡを用いた場合、回折ピークはより小さなｓ値にシフトする（図５９）。
対距離分布関数（pair distance distribution function ）（ＰＤＤＦ）であるｇ（ｒ）を、方程式（１）（式中、ｑ＝（４π／λ）ｓｉｎ（θ／２）で、ρは粒子数密度である）を用いて、ＳＡＸＳパターンから計算した［Ａ．Ｇｕｉｎｉｅｒ，Ｆ．Ｇ．，Ｓｍａｌｌ Ａｎｇｌｅ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｘ−ｒａｙｓ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５５年；Ｂ．Ａ．Ｋｏｒｇｅｌ，Ｄ．Ｆｉｔｚｍａｕｒｉｃｅ，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｂ １９９９年，第５９巻，１４１９１ページ］。
ｇ（ｒ）＝１＋（１／２Ｂ2 Δｒ）Ｉｑ（ｓ（ｑ）−１）ｓｉｎ（ｑｒ）ｄｑ 方程式（１）
ここで、ｇ（ｒ）は、第２の粒子を選択された粒子からの距離ｒの関数として見出す確率を示している。ＰＤＤＦから得られた最も近い近接Ａｕ粒子間距離（中心から中心までの距離）は、２４量体連結Ａｕ−Ａｕ、４８量体連結Ａｕ−Ａｕ、２４量体連結Ａｕ−ＳＴＶ、及び４８量体連結Ａｕ−ＳＴＶアセンブリで、それぞれ１９．３ｎｍ、２５．４ｎｍ、２８．７ｎｍ、及び４０．０ｎｍである。Ａｕ−ＳＴＶシステムとＡｕ−Ａｕシステムの粒子間距離を比較すると、Ａｕ−ＳＴＶアセンブリが予測されたＡｕナノ粒子／ストレプトアビジン周期性を有し、２つの成分（Ａｕナノ粒子及びストレプトアビジン）が、強固なＤＮＡ２本鎖リンカーにより十分に分離されることが明瞭に示される。
（ｃ）結論
この研究は、以下の理由により重要である。１）ＤＮＡ依存性ナノ粒子アセンブリ（組立）法（DNA-directed nanoparticle assembly method ）が、これまで研究された無機ナノ粒子に加えて、タンパク質の構造にまで拡張できることが実証される。実際にこれは、Ａｕナノ粒子の可逆的なＤＮＡ依存性アセンブリと、ＤＮＡにより機能化されたタンパク質性構造とを実証する最初の報告である。２）ストレプトアビジンをはじめとする多くのタンパク質が、コロイド金の表面に吸着し、強力に結合した複合体を形成することは周知である。我々の実験は、ナノ粒子表面の高密度ＤＮＡ層の安定した影響と、ハイブリダイゼーションを行わない場合のストレプトアビジン吸着への抵抗性を実証している。それ故、それらは、タンパク質の活性を実質的に乱さないような方法で、非常に特異的な相互作用によりナノ粒子表面のタンパク質構造を特異的に固定化する方法に向かうものである。表面に吸着されたタンパク質を備えた粒子は、免疫化学において重要な役割を演じ［Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ，Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｇｏｌｄ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，１９９１年］、タンパク質がナノ粒子表面と直接相互作用する安定したタンパク質／粒子共役体の開発により、組織化学的研究及び免疫検査のための改良ナノ粒子プローブが誘導され得る。
実施例２９：電場を横切ってのナノ粒子の加速
本発明は、クエン酸で安定化されたナノ粒子や、荷電生体分子で被覆されたナノ粒子を、電場の中で移動させる方法について説明する。ナノ粒子と核酸を検出するためのナノ粒子の使用については、いずれもその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＷＯ９８／０４７４０号（ノースウエスタン大学）や第ＷＯ００／３３０７９号（ナノスフェア エルエルシー）に詳細に説明されている。生体分子で官能化したナノ粒子プローブを利用する検出技術は、プローブ分子が固定化標的を見つける能力やオリゴヌクレオチド鎖を捕獲する能力（チップの場合）に基づいている。このプロセスは、プローブの「捕獲された標的」を備えた電極表面への移動や、捕獲された標的を溶液中で有するプローブのセットのプローブの対象表面への移動を加速することができる。本発明の方法は、ナノ粒子に基づくプローブを使用する重要な生体診断用途を有する。例えば、本発明の方法は、ナノ粒子プローブまたはプローブのセットの、相補的ＤＮＡまたは相補的抗原／抗体で官能化された表面へのハイブリダイゼーションを加速するために使用することができる。
蛍光ハイブリダイゼーション検出システムにおいて、ＤＮＡなどの生体分子の電場中での標的部位に向かう能動的移動を促進するために、電場を適用するという考え方は、例えば米国特許第５，８４９，４８６号に記されている。しかしながら、そのような特許はいずれも、生体分子に結び付けられたナノ粒子の標的部位への移動を加速するために電場を適用することについては記していない。
ＤＮＡ修飾ナノ粒子の輸送に対する電場の影響を調べるために、１３ｎｍ金ナノ粒子を３’プロパンチオールでキャップした２２ｍｅｒ ＤＮＡで修飾し、この修飾粒子を水中に分散した。ケースレー（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ）４８７ピコアンメータ／電圧源（Ｋｅｉｔｈｌｅｙ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、アメリカ合衆国オハイオ州クリーヴランドオーロラロード２８７７５所在、カタログ番号４８７ピコアンメータ）を使用して、２つのインジウム−スズ酸化物（ＩＴＯ）電極を横切ってＤＣ電場を適用し、電流を測定した。電極とナノ粒子の移動を例示した図式１を参照されたい。ＩＴＯ被覆ガラス（Ｄｅｌｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、アメリカ合衆国ミネソタ州スチルウォーター所在（番号ＣＤ−５０ＩＮ−ＣＵＶ））を０．８×１ｃｍに切断した。２つのインジウム−スズ酸化物被覆ガラス基板を、カソード（陰極）およびアノード（陽極）として使用した。電極をＤＮＡ修飾ナノ粒子の溶液に浸漬し、３Ｖの直流電場を１５分間適用した（４μＡ）。電場の適用後、電極を水で洗浄した。正バイアスした電極（アノード）上にはピンク色が観察され、カソード上には肉眼で見える変化はなかった。アノード上でのナノ粒子の捕獲が、Ａｇ（Ｉ）とヒドロキノンの溶液による銀を用いたシグナルの増強により確認された。いずれの電極も銀染色溶液に３分間浸漬した。アノードは黒色になり、カソードには実質的な変化はなかった。この観察は、ＤＮＡ修飾粒子が、粒子上の高い負電荷のために電場によって輸送され得ることを示す。またこのことは、ＤＮＡ修飾粒子の電極表面上の相補的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを促進するために電場を利用することができることを示している。それはさらに、そのことが荷電粒子が関与する他の生体認識プロセスにまで拡張し得ることを示唆している。
実施例３０： ナノ粒子プローブのサイズ選択的散乱によるオリゴヌクレオチド・アレイの２色標識
本実施例では、水性試料中の２種の異なる標的核酸配列を検出するための、本発明の２種の異なる大きさのナノ粒子オリゴヌクレオチド共役体を使用したオリゴヌクレオチド・アレイの２色標識について記載する。アレイ捕捉鎖、オリゴヌクレオチドで官能化したナ
ノ粒子標識、および検出しようとする標的のＤＮＡ配列を、３成分間サンドイッチ・アッセイで同時ハイブリダイズするよう設計した（図６１）［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］。試験用オリゴヌクレオチド標的を自動固相合成によって合成し、オリゴヌクレオチド・アレイを文献の手順を使用してガラス製の顕微鏡スライド上に調製した［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ；クリシー、エル．エー．（Ｃｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．）；リー、ジー．ユー．（Ｌｅｅ，Ｇ．Ｕ．）；オフェラール、シー．イー．（Ｏ’Ｆｅｒｒａｌｌ，Ｃ．Ｅ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９６年、第２４巻、３０３１ページ］。直径５０ｎｍおよび１００ｎｍの金ナノ粒子をジチアン末端のオリゴヌクレオチドで官能化し、文献の方法によって単離した［レイノルズ、アール．エー．三世（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｒ．Ａ．ＩＩＩ）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、３７９５ページ；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）；エルガニアン、アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）；ビスワナダム、ジー．（Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２０００年、第１１巻、２８９ページ］。典型的な実験では、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体およびオリゴヌクレオチド標的を、０．３Ｍ ＰＢＳのハイブリダイゼーション緩衝液［０．３ＭのＮａＣｌ、１０ｎＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７］中、室温で２時間、ＤＮＡアレイに同時ハイブリダイズさせた［実施例３０および以下の実施例３１参照］。その後、ハイブリダイズしていない標的およびナノ粒子プローブを除去するために清浄な緩衝液でアレイを洗浄した。アレイ・スライドを顕微鏡のステージに取り付け、光ファイバー照明［Ｄａｒｋｌｉｔｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ（Ｍｉｃｒｏ Ｖｉｄｅｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州エイボン所在）］によってスライドの平面に光を照射した。この構成では、スライドは平面導波路として役割を果たし、内部全反射によって顕微鏡の対物レンズに光がまったく届かないように阻止する。しかし、ナノ粒子プローブが該導波路の表面に付着している場所では、エバネセント結合した光［ミュラー、ジー．ジェイ．（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｊ．）、「Ｍｕｌｔｉｃｈａｎｎｅｌ Ｉｍａｇｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒｓ」；タルミ、ワイ．（Ｔａｌｍｉ，Ｙ．）編、第１０２回ＡＣＳシンポジウム；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ：ワシントンＤＣ、１９７９年；２３９−２６２ページ］が誘導面から散乱し、暗い背景上の明るい着色されたスポットとして画像化された。これらの実験では、５０ｎｍのＡｕ粒子が導波路に付着している場所では緑色の光（λｍａｘ＝５４２ｎｍ）が観察され、１００ｎｍの粒子が付着している場合は橙色の光（λｍａｘ＝５８３ｎｍ）が同様に観察された。平面導波路に付着した大きな（≧２００ｎｍ）セレニウム粒子からの散乱光を使用してＤＮＡアレイの画像化が行われてきたが［スティンプストン、ディー．アイ．（Ｓｔｉｍｐｓｔｏｎ，Ｄ．Ｉ．）；ホイヤー、ジェイ．ヴイ．（Ｈｏｉｊｅｒ，Ｊ．Ｖ．）；シェイ、ダブリュ．（Ｈｓｉｅｈ，Ｗ．）；ジョウ、シー．（Ｊｏｕ，Ｃ．）；ゴードン、ジェイ．（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．）；セリオー、ティー．（Ｔｈｅｒｉａｕｌｔ，Ｔ．）；ギャンブル、アール．（Ｇａｍｂｌｅ，Ｒ．）；バルデシュヴィーラー、ジェイ．ディー．（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｉｅｌｅｒ，Ｊ．Ｄ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５年、第９２巻、６３７９ページ］、本発明者らが本明細書中に記載するシステムの２つの特徴により同システムは以前の研究とは区別される。すなわち、ｉ）密に官能化されたオリゴヌクレオチド−金ナノ粒子のハイブリッドに固有の鋭い融解プロファイルにより引き起こされる顕著な配列選択性、およびｉｉ）異なる粒子径および原理的には異なる粒子組成により、オリゴヌクレオチド・アレイの多色分析がもたらされるという観察である。
Ａ．全般的な実験方法
自動オリゴヌクレオチド合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９核酸合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスター・シティー所在）で、標準的なホスホルアミダイト化学を使用して行った。オリゴヌクレオチドの合成に必要な試薬はすべてバージニア州スターリング（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ）所在のグレン・リサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から購入した。すべての実験で、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（アイオワ州ドゥビューク（Ｄｕｂｕｑｕｅ）所在）のＮＡＮＯｐｕｒｅ（登録商標）ｗａｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍで精製したナノピュア水（１８．１ＭΩ）を用いた。ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ（カリフォルニア州パロ・アルト所在）の８４５２Ａダイオード・アレイ分光光度計で測定した。ＨＰＬＣは、ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）のＳｅｒｉｅｓ １１００ＨＰＬＣを使用して行った。
Ｂ．５’−ステロイド・ジスルフィド・オリゴヌクレオチドで修飾したＡｕナノ粒子の調製
直径５０ｎｍおよび１００ｎｍの金ナノ粒子の水溶液（英国所在のＢｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、受け取ったままの状態で使用した（製品データ、５０ｎｍ Ａｕ：７０ｆＭ；１００ｎｍ Ａｕ：９．３ｆＭ）。１０ｍＬの金コロイド溶液に、文献の手順［レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）；エルガニアン、アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）；ビスワナダム、ジー．（Ｖｉｓｗａｎａｄｈａｍ，Ｇ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、２０００年、第１１巻、２８９ページ］を使用して水中に調製した５’−ステロイド・ジスルフィドで修飾したオリゴヌクレオチド１．５ｎｍｏｌを加えた。一定分量の２ＭのＮａＣｌ溶液および０．１ＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７緩衝溶液を４時間毎に加えることによって、溶液を徐々に０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７緩衝液（０．３ＭのＰＢＳ）にした。４８時間後、該粒子溶液を超遠心機（Ａｖａｎｔｉ（登録商標）３０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）所在）で遠心分離し（５０ｎｍの金ナノ粒子は５０００ｒｐｍで１０分間、１００ｎｍの金ナノ粒子は２５００ｒｐｍで１０分間）、暗赤色の油状沈殿物の上に無色の上清を得た。無色の上清を取り除き、暗赤色の油状沈殿物を新しい０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝液（５０ｎｍおよび１００ｎｍの金コロイドに７ｍＬおよび４ｍＬ）に再分散させた。遠心分離および再分散を２回繰り返した。生成したナノ粒子溶液の最終濃度は、測定した５２０ｎｍでのその可視吸光度および非修飾粒子について発表されている吸光係数の値［イグエラビデ、ジェイ．（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｊ．）およびイグエラビデ、イー．イー．（Ｙｇｕｅｒａｂｉｄｅ，Ｅ．Ｅ．）、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９８年、第２６２巻、１３７ページ］（５０ｎｍのＡｕナノ粒子：ε５２０＝４．４×１０１０Ｍ−１ｃｍ−１；１００ｎｍのＡｕナノ粒子：ε５２０１．６×１０１１Ｍ−１ｃｍ−１）から推定した。以下に記載する実験では、直径５０ｎｍおよび１００ｎｍの、ステロイド・ジスルフィド・オリゴヌクレオチドで修飾したＡｕナノ粒子の濃度はそれぞれ３０ｎＭおよび３．５ｎＭとした。
Ｃ．ＤＮＡマイクロアレイの製作
クリシーら［クリシー、エル．エー．（Ｃｈｒｉｓｅｙ，Ｌ．Ａ．）；リー、ジー．ユー．（Ｌｅｅ，Ｇ．Ｕ．）；オフェラール、シー．イー．（Ｏ’Ｆｅｒｒａｌｌ，Ｃ．Ｅ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９９６年、第２４巻、３０３１ページ］が発表した手順を改変した手順を使用して、ガラス製顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州スプリングフィールド所在）を、チオール修飾したオリゴヌクレオチドを結合する能力を有する反応性マレイミド基で官能化した。まずスラ
イドをピラニア溶液（３：１の濃Ｈ２ＳＯ４：３０％Ｈ２Ｏ２）で１５分間洗浄し、大量のナノピュア水ですすいだ。注意：ピラニア溶液は反応性が高く、慎重に使用すべきである。その後、スライドを１ｍＭの酢酸中の３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）の１％（ｖ／ｖ）溶液に３０分間浸した。ＡＰＳで修飾したスライドをナノピュア水およびエタノールで十分にすすぎ、Ｎ２下で乾燥させ、１２０〜１３０℃で２０分間焼いた。冷却後、シラン化されたスライドをすぐに４：１のエタノール：ＤＭＳＯ中のスクシンイミジル４−［マレミドフェニル］−ブチレート（ＳＭＰＢ）の２ｍＭ溶液で処理した。スライドを終夜ＳＭＰＢ溶液に浸し、エタノールですすぎ、Ｎ２下で乾燥させた。次いでスライドを１：１：４の無水酢酸：ピリジン：ＤＭＦに２時間浸し、水で洗浄してＮ２下で乾燥させた。その後、ＳＭＰＢで修飾したスライドをロボット・マイクロアレイヤー（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）（ＧＭＳ４１７、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、マサチューセッツ州ウォバーン（Ｗｏｂｕｒｎ）所在）に装填し、直径１５０μｍのスポット用ピンを使用して、３’−チオール修飾された捕捉オリゴヌクレオチドの１ｍＭ溶液（文献［ストルホッフ、ジェイ．ジェイ．（Ｓｔｏｒｈｏｆｆ，Ｊ．Ｊ．）；エルガニアン、アール．（Ｅｌｇｈａｎｉａｎ，Ｒ．）；ミューシック、アール．シー．（Ｍｕｃｉｃ，Ｒ．Ｃ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９８年、第１２０巻、１９５９ページ］の手順により合成）をスポットした。スポットした後、スライドを湿潤チャンバ（Ｈｙｂａｉｄ ＵＳ、マサチューセッツ州フランクリン（Ｆｒａｎｋｌｉｎ）所在）に入れ、一晩静置した。スライドを水ですすぎ、Ｎ２下で乾燥させた後、エタノール中の２％（ｗ／ｖ）メルカプトヘキサンに１時間浸した。スライドを溶液から取り出し、大量のエタノールですすぎ、Ｎ２下で乾燥させた。
Ｄ．ナノ粒子プローブを用いた２種のオリゴヌクレオチド標的の２色標識
１００μＬのハイブリダイゼーション・ウェル（Ｇｒａｃｅ ＢｉｏＬａｂｓ、オレゴン州ベンド（Ｂｅｎｄ）所在）を、チオールで修飾した配列ｃおよびｄのオリゴヌクレオチドをスポットしたオリゴヌクレオチド・アレイに取り付けた（配列は図６２の説明を参照）。該ウェルを、０．３ＭのＰＢＳ緩衝溶液（０．３ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７）で調製した１０ｎＭのオリゴヌクレオチド配列ａで官能化した直径５０ｎｍの金ナノ粒子、３．５ｎＭのオリゴヌクレオチド配列ｂで官能化した直径１００ｎｍの金ナノ粒子、ならびに２００ｎＭのオリゴヌクレオチド標的ａ’ｃ’および／またはｂ’ｄ’で満たした。ウェルをカバー・ガラスで覆った後、スライド・アセンブリを２時間室温で振盪し、ハイブリダイゼーション・ウェルを取り外し、アレイを清浄な０．１５ＭのＰＢＳ緩衝液（０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７）で３回洗浄した。新しいハイブリダイゼーション・ウェルをスライドに取り付けて新しい０．１５Ｍ ＰＢＳ緩衝液を満たし、該スライド・アセンブリを画像化するために図６４に示すように倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ（登録商標）１００Ａ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ国イェナ所在）上の光ファイバー照明（Ｄａｒｋｌｉｔｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ、Ｍｉｃｒｏ Ｖｉｄｅｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州エイボン所在）に装着した。強度４０％に設定した２００Ｗのハロゲン光源（Ｆｉｂｅｒ−Ｌｉｔｅ（登録商標）ＰＬ−７５０、Ｄｏｌａｎ−Ｊｅｎｎｅｒ、マサチューセッツ州ローレンス所在）を照射し、画像化の前に少なくとも１５分間平衡化させた。画像はＰｅｎｇｕｉｎ６００ＣＬデジタルカメラ（Ｐｉｘｅｒａ、カリフォルニア州ロス・ガトス所在）で取り込んだ。
Ｅ．オリゴヌクレオチドで官能化した表面に結合した粒子の分光分析
まず、アレイをスポットするかわりにスライド全体を１ｍＭの３’−チオール修飾された捕捉オリゴヌクレオチドｃまたはｄに浸す以外はＤＮＡマイクロアレイの製作について上述した方法を用いて、スライド・ガラスの表面全体をＤＮＡ配列ｃまたはｄのどちらか
で官能化した。その後、上記の２色アレイ画像化実験で記載したように、捕捉鎖ｃを有するスライドを、１００μＬの０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液で調製した１０ｎＭのオリゴヌクレオチド配列ａで官能化した直径５０ｎｍの金ナノ粒子および２００ｎＭのオリゴヌクレオチド標的ａ’ｃ’に曝露した。同様に、次いで捕捉鎖ｄを有するスライドを、１００μＬの０．３Ｍ ＰＢＳ緩衝溶液で調製した３．５ｎＭのオリゴヌクレオチド配列ｂで官能化した直径１００ｎｍの金ナノ粒子および２００ｎＭのオリゴヌクレオチド標的ｂ’ｄ’に曝露した。これらのスライドを新しい緩衝液で洗浄し、上述のように光ファイバー照明に装着した。顕微鏡の対物レンズを光ファイバー分光器（ＵＳＢ２０００、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、フロリダ州デューンディン（Ｄｕｎｅｄｉｎ）所在）への入力に置き換え、スライドに結合した５０ｎｍおよび１００ｎｍのＡｕ粒子についてスペクトルを記録した。これらのスペクトルを図６６に示す。５０ｎｍの粒子では、λｍａｘ＝５４２ｎｍ、散乱ピークの半値全幅（ＦＷＨＭ）は８６ｎｍであり、１００ｎｍの粒子では、λｍａｘ＝５８３ｎｍ、ＦＷＨＭ＝１１４ｎｍである。
Ｆ．結論
１溶液中の２種の異なるＤＮＡ標的の多色分析を行うこのシステムの潜在性を試験するために、ＤＮＡ配列ａで官能化した１０ｎＭの５０ｎｍ粒子、ＤＮＡ配列ｂで官能化した３．５ｎＭの１００ｎｍのＡｕ粒子、ならびに２００ｎＭの合成オリゴヌクレオチド標的ａ’ｃ’およびｂ’ｄ’の混合物を、配列ｃおよびｄをスポットしたスライド・ガラスに曝露した（図６１Ａ）［アレイ・ハイブリダイゼーション、画像化および感度のさらなる詳細は実施例３０および３１で見つけることが可能である］。標的ａ’ｃ’およびｂ’ｄ’の両方の存在下では、配列ａ’ｃ’の試験スポットで画像化された散乱緑色光および配列ｃ’ｄ’の試験スポットの散乱橙色光（図６２Ａ）から実証されたように、２種の異なるナノ粒子プローブが首尾よくかつ独立して対応する相補的なスライド・スポットにハイブリダイズした。スポットから離れた場所で測定された散乱光強度が低いのは、ナノ粒子のスライド表面上への非特異的結合が最小限であることを反映している。標的ａ’ｃ’またはｂ’ｄ’のみの存在下では、それぞれ緑色光または橙色光のみが観察される（図６２Ｂ、Ｃ）。どちらの場合も、非相補的なスポットではバックグラウンドシグナルはほとんど観察されない。わずか１ｐＭの標的の存在下でも、ハイブリダイズしたナノ粒子プローブによる散乱光をバックグラウンドのシグナルと識別することが可能であり［アレイ・ハイブリダイゼーション、画像化および感度のさらなる詳細は実施例３０および３１で見つけることが可能である］、これは、この方法が生物源由来のＤＮＡを分析するのに十分感度が高いことを示している。標的の非存在下では、ＤＮＡで官能化した顕微鏡スライドを２種の異なるナノ粒子プローブで処理しても散乱光がまったく観察されなかったことに注意されたい（図６２Ｄ）。
実施例３１： アレイ配列の選択性／融解実験
この実施例では、実施例３０に記載した本発明の散乱検出方法の選択性を評価するためにモデルＤＮＡアレイを調製した。ナノ粒子プローブに基づいたこの新しい散乱検出システムの選択性を試験するために、本発明者らは、各要素が特定の配列部位に４種の可能なヌクレオチドのうち１種を有する捕捉鎖を備えた、４種の要素を含むモデルＤＮＡアレイを合成した。これらのアレイを室温で、４種の要素のうち１種に相補的な標的が２００ｎＭ（Ｘ＝Ａ、図６１Ｂ）であり、直径５０ｎｍのナノ粒子プローブが１０ｎＭである溶液と共にインキュベートした。その後、ハイブリダイズしていない標的およびプローブを除去するためにアレイを洗浄し、清浄なハイブリダイゼーション緩衝液に再び浸した。その後、ハイブリダイズしたナノ粒子のアレイ表面からの解離を誘発し、緩衝液の温度を次第に上昇させることによって連続的に観察した。この温度が相補ＤＮＡ２重鎖またはミスマッチＤＮＡ２重鎖のどちらかの融解温度（Ｔｍ）を超えない限りは、４種のアレイ要素すべてで散乱光が観察され（図６３Ａ）、解離が起こらなかったことが示された。しかし、緩衝液の温度をさらに上昇させるにつれて、様々な塩基対の熱安定性の順にナノ粒子プロ
ーブがスライドから解離した（Ｔ：Ｔ≒Ｃ：Ｔ＜Ｇ：Ｔ＜Ａ：Ｔ、図６３Ａ）。ナノ粒子のスライドからの解離を実時間で観察したので、実験が進むにつれて、最適なストリンジェンシーの温度、選択性、および標的配列をすべて容易に視覚的に決定することが可能であった。さらに、すべてのアレイ要素について定量的な融解プロファイルを作成し、実時間で各要素でのシグナル強度を測定することによって同時に比較した（図６３Ｂ）。最適なストリンジェンシーの温度では（５５℃、図６３Ｂ中の縦線で示す）、相補的（Ｘ＝Ａ）要素におけるシグナルはＧ：Ｔの「ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）」ミスマッチを有する要素のシグナルより５倍高い。これは、分子フルオロフォア・プローブおよび同一の配列を有するアレイについて以前に観察された配列選択性よりも有意に高い配列選択性を表す［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］。白黒の走査測定手法によって小さな（直径１３ｎｍ）ナノ粒子で観察されたように［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］、フルオロフォアで標識したＤＮＡと比べて５０ｎｍ粒子プローブの選択性が高いことは、ナノ粒子がアレイ表面から解離する温度範囲が狭いことの直接の結果である。図６３Ｂに示す曲線の１次導関数における半値全幅は、フルオロフォアで標識した同一配列のＤＮＡでは１８℃であるのに対し、５℃である［タトン、ティー．エー．（Ｔａｔｏｎ，Ｔ．Ａ．）；ミルキン、シー．エー．（Ｍｉｒｋｉｎ，Ｃ．Ａ．）；レツィンガー、アール．エル．（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００、第２８９巻、１７５７ページ］。ここに提示する結果は、この選択性を、同一チップ上の複数のＤＮＡ標的の多色標識と組み合わせても使用し得ることを実証している。
Ａ．アレイの選択性の測定
まず、図６１Ｂに示す４種のチオール修飾オリゴヌクレオチド配列でスポットすることによってオリゴヌクレオチド・アレイを製作した。１００μＬ容のハイブリダイゼーション・ウェルをアレイに取り付けて、０．３ＭのＰＢＳ緩衝液で調製した、１０ｎＭのオリゴヌクレオチドで官能化した直径５０ｎｍの金ナノ粒子プローブおよび２００ｎＭの８位にチミジンを有する３０塩基長のオリゴヌクレオチド標的（Ｘ＝Ａのチップ配列に相補的、図６１Ｂ）で満たした。このスライド・アセンブリを２時間室温で震盪し、ハイブリダイゼーション・ウェルを取り外し、アレイを清浄な０．１５ＭのＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。新しいハイブリダイゼーション・ウェルをスライドに取り付けて、新しい０．１５ＭのＰＢＳ緩衝液および小さな攪拌子（２ｍｍ×７ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を入れた。図６５Ａ（上面図）およびＳ２Ｂ（側面図）に示すように、スライドを温度制御ステージ台（ＢＳ６０、Ｉｎｓｔｅｃ Ｉｎｃ．、コロラド州ボールダー所在）および小型磁気攪拌機（Ｔｅｌｅｍｏｄｕｌ Ｍｉｎｉ、Ｈ＋Ｐ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ国ミュンヘン所在）を備えた倒立顕微鏡上に装着した。該アセンブリを０．５℃／分の速度で２５℃から７５℃までの温度傾斜に供し、各温度で３分間維持した。上述のように画像を取り込み、画像処理ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）５．０、Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンノゼ所在）を使用して解析した。各アレイ要素のシグナル強度は、アレイ・スポット内の円形領域を選択し、選択されたピクセルについてＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）により与えられる光度値を平均することによって定量した。
Ｂ．アレイの感度の測定
選択性の実験で上述したように、アレイを調製して５０ｎｍのナノ粒子プローブ（０．３ＭのＰＢＳ中１０ｎＭ）およびオリゴヌクレオチド標的と共にインキュベートしたが、ただし標的濃度を１μＭから１０ｆＭまで変化させた。スライド・アセンブリを２時間室温で震盪し、ハイブリダイゼーション・ウェルを取り外し、アレイを清浄な０．１５Ｍの
ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した。新しいハイブリダイゼーション・ウェルをスライドに取り付けて、新しい０．１５ＭのＰＢＳ緩衝液で満たし、このスライド・アセンブリをシグナルの定量のために光ファイバー照明に装着した。得られたデータを図６７に示す。バックグラウンドから統計的に（＞２σ）識別することが可能な最も低い濃度は１ｐＭである。
Ｃ．結論
オリゴヌクレオチドで官能化した比較的大きいナノ粒子の散乱光に基づく、本実施例および上記実施例３０に記載したＤＮＡアレイ画像化技法により、高感度で非常に選択性の高いＤＮＡアレイ多色標識の機会がもたらされる。理論的には、記載した方法は様々な組成および大きさのナノ粒子を使用して、さらに別の色に拡張可能である［リンク、エス．（Ｌｉｎｋ，Ｓ．）；ワン、ゼット．エル．（Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｌ．）；エル・サイード、エム．エー．（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｍ．Ａ．）、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、１９９９年、第１０３巻、３５２９ページ］。さらに、より高い散乱係数を有する粒子を使用することにより、このシステムはナノ粒子走査測定システム５および導波路に基づいた蛍光アレイに匹敵する高い感度を有し得る［ブダッハ、ダブリュ．（Ｂｕｄａｃｈ，Ｗ．）；アベル、エー．ピー．（Ａｂｅｌ，Ａ．Ｐ．）；ブルーノ、エー．イー．（Ｂｒｕｎｏ，Ａ．Ｅ．）；ニューシェーファー、ディー．（Ｎｅｕｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｄ．）、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、第７１巻、３３４７ページ］。
実施例３２： ナノ粒子プローブおよび塩に基づくストリンジェントな洗浄を使用したアッセイに基づくＤＮＡの電気的検出
この実施例では、ミスマッチ鎖が関与する結合事象を完全に相補的な認識要素に基づく結合事象から区別するため、ハイブリダイズした粒子の融解特性についての特異な塩依存性と、熱的にストリンジェントな洗浄の代わりに塩に基づくストリンジェントな洗浄を使用することとを評価するために、モデルＤＮＡアレイを調製した。
Ａ．微小電極の調製
典型的な実験では、２０μｍの間隙を有する微小電極（５ｎｍ Ｔｉ上の６０ｎｍ Ａｕ）を、１０００オングストロームのＳｉＯ２コーティングを有するＳｉウェハの標準的なフォトリソグラフィーによって調製した（図６８Ｃ）。文献の方法を使用して（ティー．エー．タトン（Ｔ．Ａ．Ｔａｔｏｎ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８９巻、１７５７ページ、２０００年；エル．エー．クリシー（Ｌ．Ａ．Ｃｈｒｉｓｅｙ）、ジー．ユー．リー（Ｇ．Ｕ．Ｌｅｅ）、シー．イー．オフェラール（Ｃ．Ｅ．Ｏ’Ｆｅｒｒａｌｌ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第２４巻、３０３１−３０３９ページ、１９９６年）、スクシンイミジル４−［マレミドフェニル］−ブチレート（ＳＭＰＢ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス所在）を用いてチップ全体の露出しているＳｉＯ２を修飾した。０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）（０．３ＭのＰＢＳ）溶液で調製した適切なアルキルチオール修飾オリゴヌクレオチド（１ｍＭ）を手動ピペット操作により電極の間隙にスポットすることによって、活性化した表面に捕捉オリゴヌクレオチド鎖を固定化した。本研究で使用したすべてのオリゴヌクレオチドは自動固相合成（ジェイ．ジェイ．ストルホッフ（Ｊ．Ｊ．Ｓｔｏｒｈｏｆｆ）、アール．エルガニアン（Ｒ．Ｅｌｇｈａｎｉａｎ）、アール．シー．ミューシック（Ｒ．Ｃ．Ｍｕｃｉｃ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、第１２０巻、１９５９−１９６４ページ、１９９８年；エフ．エックスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」（ニューヨーク所在のＯｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、第１版、１９９１年））によって調製したが、捕捉ＤＮＡ鎖、標的ＤＮＡ鎖、およびプローブＤＮＡ鎖の配列を図６８Ｂに示す。このＤＮＡチップ・アレイは、合成２７塩基オリゴヌクレオチド
標的（炭疽菌致死因子の配列に基づく）において、相補的な対Ａ：Ｔ（Ｘ＝Ａ）と、３種の一塩基ミスマッチＴ：Ｔ（Ｘ＝Ｔ）、Ｃ：Ｔ（Ｘ＝Ｃ）、またはＧ：Ｔ（Ｘ＝Ｇ）との識別を評価するために設計された（エス．イクタ（Ｓ．Ｉｋｕｔａ）、ケー．タカギ（Ｋ．Ｔａｋａｇｉ）、アール．ビー．ウォリス（Ｒ．Ｂ．Ｗａｌｌａｃｅ）、ケー．イタクラ（Ｋ．Ｉｔａｋｕｒａ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、第１５巻、７９７ページ、１９８７年）。捕捉オリゴヌクレオチドを電極の間隙にスポットした後、チップを湿潤チャンバに２４時間保管し、ＳＭＰＢとアルキルチオールでキャップされたＤＮＡとの結合反応を行わせた。その後、チップを水で洗浄し、エタノール中の２％メルカプトヘキサノールに２時間浸して、Ａｕ電極を含めたチップを不動態化させた。最後に、ＤＮＡで官能化したチップをエタノールおよび水で洗浄し、その後、Ｎ２流下で乾燥させた。
Ｂ．塩ストリンジェンシー洗浄後のアレイの選択性の測定
アレイの検出能力を評価するために、チップを０．３Ｍ ＰＢＳに溶解した標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）で４時間処理し、その後、０．３Ｍ ＰＢＳ溶液ですすいだ。その後、チップを０．３Ｍ ＰＢＳに溶解したナノ粒子プローブ（２ｎＭ）で２時間処理した。塩化物イオンを除去するためにＤＮＡチップを１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に溶解した０．３ＭのＮａＮＯ３ですすぎ、次いでＡｇＮＯ３およびハイドロキノンから成る銀染色増感溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ミズーリ州セントルイス所在）で処理した。溶液中に銀の粒状物が形成されるのを避けるために、銀染色増感溶液を２または３分間毎に交換した。チップを銀染色増感溶液で処理する毎に、チップを水ですすぎ、Ｎ２で乾燥させ、Ｆｌｕｋｅ１８９マルチメーター（Ｆｌｕｋｅ、ワシントン州エバレット（Ｅｖｅｒｅｔｔ）所在）を使用して電極の間隙の抵抗値を測定した。銀染色増感溶液で３分間処理した後、４種の異なるオリゴヌクレオチド捕捉鎖を有する間隙は５００ＭΩより大きい間隙の抵抗を示すが、この値は実験に使用したマルチメーターの限界である（図６９Ａ）。ストリンジェンシー洗浄なしでは、銀染色増感溶液への曝露時間の増加とともに間隙の抵抗が低下する。別の実験で、電極の間隙と同じ方法で処理したインジウム・スズ酸化物（ＩＴＯ）表面の、銀の堆積前後における電界放射型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）画像により、銀染色増感溶液への曝露時間の増加とともに銀の堆積が増加することが示される（図７０Ａ〜Ｄ）。興味深いことに、粒子はすべて異なる増大速度を示す。実際、増感溶液に９分間曝露した後でさえ、一部の粒子は大きさおよび形状に関して影響を受けずにいる。これは、ナノ粒子が銀の堆積を開始させるが、堆積した銀は、粒子を均一に増大させて該粒子を結果的に電気的に短絡させるプロセスよりも、むしろ銀の還元をさらに触媒して最終的に回路の閉鎖を引き起こすことを示している。粒子は複合物質であり、個別に考慮した場合、わずかに異なるレベルでオリゴヌクレオチドが官能化されているはずであり、したがって、ハイドロキノンによるＡｇ＋からＡｇへの還元を促進するその能力に関して異なる活性を有しているに違いない。標的ＤＮＡが存在しない場合、４０分間の銀染色増感の後でさえも検出可能なシグナルがなかった。この検出方法を使用して、システムを最適化する労力を伴わずに５００ｆＭの濃度の標的が検出された。共焦点顕微鏡、上記のオリゴヌクレオチド鎖、およびＣｙ３で修飾したプローブを利用する、蛍光に基づいた従来のシステムの検出限界は〜５ｐＭである（ティー．エー．タトン（Ｔ．Ａ．Ｔａｔｏｎ、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８９巻、１７５７ページ、２０００年）。
標的の選択性を高める従来の方法は、非相補的な鎖から形成されたＤＮＡ２重鎖の脱ハイブリダイゼーションをもたらす温度の緩衝溶液で、ＤＮＡチップ・アレイを洗浄することである（ジー．エイチ．ケラー（Ｇ．Ｈ．Ｋｅｌｌｅｒ）、エム．エム．マナック（Ｍ．Ｍ．Ｍａｎａｋ）、ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ（ニューヨーク所在のＳｔｏｃｋｔｏｎｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年））。ナノ粒子に基づいた他のＤＮＡ検出方法が、オリゴヌクレオチドで修飾したプローブと相補的オリゴヌクレオチドとから形成された２重鎖構造
に関連する鋭い融解転移によって並外れて高い特異性を示すことが既に示されている（ティー．エー．タトン（Ｔ．Ａ．Ｔａｔｏｎ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９、１７５７、２０００年。したがって、本明細書中で報告したシステムでは、適切な温度のストリンジェンシー溶液で洗浄した場合、完全に相補的な捕捉鎖で修飾した間隙と非相補的な鎖で修飾した間隙との間に抵抗の差があることが期待できるかもしれない。実際、銀染色増感溶液で処理する前にチップを５０℃の０．３Ｍ ＰＢＳで洗浄した場合、相補的な捕捉鎖を有する間隙の抵抗は３〜１５分間の範囲のＡｇ染色増感時間に伴って減少するが、単一塩基のミスマッチを有する３つの間隙すべてが、２０分間の増感時間の後でさえも５００ＭΩより大きい抵抗を示す。言い換えると、本実験において相補的な鎖は非相補的な鎖より少なくとも１０５倍大きいシグナルをもたらす。この値は、比較対象とする蛍光に基づいた手法で観察される選択性の比（２．６：１）、また以前に報告された走査測定手法（１１：１）（ティー．エー．タトン（Ｔ．Ａ．Ｔａｔｏｎ）、シー．エー．ミルキン（Ｃ．Ａ．Ｍｉｒｋｉｎ）、アール．エル．レツィンガー（Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８９巻、１７５７ページ、２０００年）と比べた場合でも、優れた選択性のレベルである。
注目すべきは、オリゴヌクレオチドで修飾したナノ粒子が塩濃度勾配全体にわたって並外れて鋭い変性特性を示すことが判明したことである（図６９Ｃ）。実際、相補的な捕捉鎖／標的鎖／プローブ複合体およびＧ−Ｔミスマッチを有する捕捉鎖／標的／プローブ複合体でそれぞれ官能化した２つのガラス製キュベットの５２０ｎｍでの吸光度を溶液のＮａ＋濃度の関数として調査することによって、ミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを相補的な標的から容易に区別することが可能である。注目すべきは、温度の変化を使用する場合（図６９Ｃ、差込図）に対し、塩濃度の変化を使用するほうがより良好に２本の鎖の識別が得られる。したがって、チップを適切な陽イオン濃度の緩衝溶液で洗浄することによって、ミスマッチを有するＤＮＡ上のナノ粒子プローブを選択的に脱ハイブリダイズさせることが可能である。室温の０．０１Ｍ ＰＢＳを用いてチップをストリンジェンシー洗浄した後、完全に相補的なＤＮＡ（Ｘ＝Ａ）を有する間隙の抵抗は銀の堆積に伴って有意に低下するが、ミスマッチ鎖（Ｘ＝Ｔ、Ｇ、またはＣ）で官能化した３種すべての間隙では、２０分間の増感時間の後でさえも絶縁状態のままである。２重鎖のすべてを変性させるためにＤＮＡチップを水で洗浄する対照実験では、４０分間の銀染色増感の後に４種のＤＮＡ鎖すべてについて検出可能なシグナルは存在しなかった。
Ｃ．結論
結論として、高感度でかつ特異性が非常に高い、電気的アレイに基づいた新しいＤＮＡ検出方法が発見され、該方法により、洗浄緩衝溶液の塩濃度の調整に基づくストリンジェンシーがこの新規な検出様式において温度に基づいたストリンジェンシー様式に置き換わり得るだけでなく、ナノ粒子プローブを用いる場合は、より優れていることが実証された。実際、温度の代わりに塩濃度をストリンジェンシー手段として使用することは、少なくとも次のような理由で重要である。すなわち、塩濃度の使用はナノ粒子に基づいた検出システムにおいて熱サイクルの必要性を排除するという全般的な方法を示していること；塩濃度の使用はナノ粒子プローブにおいて熱に基づいたストリンジェンシーより高い選択性をもたらすこと；および塩濃度の使用は検出プローブが高い温度で不安定である場合に有用であることである。最後に、このシステムは従来の微小電極に基づいているので、本実施例で使用した４対より多い電極対のアレイを使用することによる大量の多重鎖形成に有用である。これらをまとめると、本発明は、単一ヌクレオチド多型をスクリーニングするための、携帯可能な、現場（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｓｉｔｅ）でのＤＮＡ検出方法に有用である。またこのシステムの感度は完全に最適化されてはいないが、既に共焦点蛍光顕微鏡に基づいた蛍光を用いる類似の手法より優れている。間隙の大きさを小さくすれば回路を閉じるのに必要な粒子の数が少なくなり、このシステムの感度は劇的に向上するであろう
。
本明細書に引用した特許、特許出願および参考文献はすべて、引用によりその全体が組み込まれる。
相補的オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を結合させることによるナノ粒子凝集体の形成を示す略図。ナノ粒子は、相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果として凝集体をなして結合している。Ｘは、（−Ｓ（ＣＨ２）３ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）−（ここで、Ｓは金ナノ粒子に接合している）などの）任意の共有結合アンカーを表す。図１および後続のいくつかの図面では、分かり易くするために、各ナノ粒子には単一のオリゴヌクレオチドしか付着していないように示されているが、実際には、各ナノ粒子には、いくつかのオリゴヌクレオチドが付着している。また、図１および後続図面において、金ナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの相対サイズは正確な縮尺率では描かれていない点に留意することが重要である。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いて核酸を検出する系を示す略図。２つのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、示されている一本鎖ＤＮＡの２つの異なる部分に対して相補的な配列を有している。その結果、これらのオリゴヌクレオチドがＤＮＡとハイブリダイズすると、（凝集体を形成し、変色を起こす）検出可能な変化が生じる。 図２に示されている系の変型の略図。２つのナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、示されているナノ粒子上のオリゴヌクレオチドとは相補的でない第３部分によって分離された一本鎖ＤＮＡの２つの異なる部分に対して相補的な配列を有している。一本鎖ＤＮＡの非相補的部分とのハイブリダイズに用い得る任意のフィラーオリゴヌクレオチドも示されている。ＤＮＡ、ナノ粒子およびフィラーオリゴヌクレオチドを合わせると、ナノ粒子は、切れ目が入った（nicked）二本鎖オリゴヌクレオチドコネクタを形成して凝集する。 連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションおよびデハイブリダイゼーションの結果としての、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子の可逆的凝集を示す略図。例示されている連結オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと相補的なオーバーハング末端（付着末端）を有する二本鎖ＤＮＡである。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子とナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を有する連結オリゴヌクレオチドとを合わせることによるナノ粒子凝集体の形成を示す略図。 それぞれ異なるオリゴヌクレオチドが付着している２つの種類の金コロイドと、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと相補的な付着末端を有する連結二本鎖オリゴヌクレオチドとが入ったキュベット（図４参照）。キュベットＡ−連結ＤＮＡのＴｍを超える８０℃；デハイブリダイズ（熱変性）した。色は暗赤色。 それぞれ異なるオリゴヌクレオチドが付着している２つの種類の金コロイドと、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと相補的な付着末端を有する連結二本鎖オリゴヌクレオチドとが入ったキュベット（図４参照）。キュベットＢ−リンカーＤＮＡのＴｍより低い室温に冷却後。ハイブリダイゼーションが起って、ナノ粒子は凝集したが、凝集体は沈殿しなかった。色は紫色。 それぞれ異なるオリゴヌクレオチドが付着している２つの種類の金コロイドと、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドと相補的な付着末端を有する連結二本鎖オリゴヌクレオチドとが入ったキュベット（図４参照）。キュベットＣ−室温下に数時間後、凝集したナノ粒子はキュベットの底に沈殿した。溶液は清澄で、沈殿物はピンクがかった灰色。ＢまたはＣを加熱するとＡが生じる。 図４に示されているように、オリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子が温度を下げると連結オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたために凝集するときの吸光度の変化を示す吸光度対波長（ｎｍ）のグラフ。 図４に示されている系に関する吸光度対温度／時間の変化のグラフである。低温下、オリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子は、連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより凝集する（図４参照）。高温（８０℃）下で、ナノ粒子はデハイブリダイズする。経時的な温度の変化は、これが可逆的プロセスであることを示している。 修飾していない金ナノ粒子の水溶液を用いて図８Ａと同じ方法で実施した吸光度対温度／時間における変化のグラフである。図８Ａに見られた可逆的変化は観測されない。 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドと連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより結合した凝集金ナノ粒子のＴＥＭ画像である。 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。結合したナノ粒子の順序づけ（ｏｒｄｅｒｉｎｇ）を示す二次元凝集体のＴＥＭ画像である。 ピリミジン：プリン：ピリミジンモチーフを有するナノ粒子間の熱安定性三本鎖オリゴヌクレオチドコネクタの形成を示す略図。このような三本鎖コネクタは、二本鎖コネクタより剛性が大きい。図１０において、一方のナノ粒子には、全てがプリンからなるオリゴヌクレオチドが付着しており、他方のナノ粒子には、全てがピリミジンからなるオリゴヌクレオチドが付着している。（ナノ粒子には付着していない）三本鎖コネクタを形成するための第３オリゴヌクレオチドはピリミジンからなる。 相補的オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を合わせることによるナノ粒子凝集体の形成を示す略図であり、ナノ粒子は、相補的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの結果として凝集体をなして結合している。図１１において、丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、ｓはチオ−アルキルリンカーである。２種類のナノ粒子上の多数のオリゴヌクレオチドは、互いにハイブリダイズして凝集体構造を形成し得る。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的３が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的４が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的５が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的６が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的７が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、点線および破線は、ヌクレオチドを連結するつなぎ目を表す。 ナノ粒子および透明基板を用いたＤＮＡ（検体ＤＮＡ）検出系を示す略図である。 ナノ粒子および透明基板を用いたＤＮＡ（検体ＤＮＡ）検出系を示す略図である。 オリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子（その１つの集団は溶液中にあり、１つの集団は図１３Ｂに示されているような透明基板に付着している）が連結オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより凝集したときの吸光度の変化を示す吸光度対波長（ｎｍ）のグラフである。 温度の増大（融解する）に従った、図１４Ａに示されているハイブリダイズした系に関する吸光度の変化のグラフである。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的３が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的４が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的５が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的６が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的７が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を示す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、一本鎖オリゴヌクレオチド標的８が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を表す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、長さが異なる複数の一本鎖オリゴヌクレオチド標的が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を表す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、長さが異なる複数の一本鎖オリゴヌクレオチド標的が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系を表す略図。オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体１および２と、長さが異なる複数の一本鎖オリゴヌクレオチド標的が示されている。丸はナノ粒子を表し、式はオリゴヌクレオチド配列であり、Ｓはチオ−アルキルリンカーを表す。 ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。 ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。 ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。 ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。 ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子を用いた核酸検出系とを示す略図。丸はナノ粒子を表し、直線はオリゴヌクレオチド鎖（塩基は示さず）を表し、間隔の狭い２本の平行線は二本鎖分子セグメントを表し、小文字は特異的ヌクレオチド配列（ａはａ′と相補的、ｂはｂ′の相補的である、など）を示す。 リポソーム（大きい二重丸）、ナノ粒子（小さい白丸）および透明基板を用いた核酸検出系を示す略図。黒い四角はコレステリル基を表し、ねじれ線はオリゴヌクレオチドを表し、梯子は二本鎖（ハイブリダイズした）オリゴヌクレオチドを表す。 金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体が図１３Ａに示されているような透明基板上の多重層として集合したときの吸光度の変化を示す吸光度対波長（ｎｍ）のグラフである。 温度の増大（融解）に従った図１９Ａに示されているハイブリダイズした系に関する吸光度の変化のグラフである。 金属もしくは半導体消光ナノ粒子（図２０Ａ）に付着している蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた計画の略図。 非金属、非半導体粒子（図２０Ｂ）に付着している蛍光標識オリゴヌクレオチドを用いた計画の略図。 オリゴヌクレオチドが付着している金ナノ粒子および蛍光標識オリゴヌクレオチドが付着しているラテックスミクロスフェアを用いた標的核酸検出系を示す略図。小さい黒丸はナノ粒子を表し、大きい白丸はラテックスミクロスフェアを表し、大きい楕円は微孔質膜を表す。 ２つの種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体を用いた標的核酸検出系を示す略図。黒丸はナノ粒子を表し、大きな楕円は微孔質膜を表す。 炭疽菌保護抗原（実施例１２参照）用アッセイに利用される材料の配列。 オリゴヌクレオチド（直線）が付着している磁気ナノ粒子（黒球）、ナノ粒子に付着しているオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブオリゴヌクレオチド（直線）を含む「サテライトプローブ」を用いた標的核酸検出系を示す略図であり、プローブオリゴヌクレオチドはレポーター基（白四角）で標識されている。Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ′、Ｂ′、およびＣ′は、特異的ヌクレオチド配列を表し、Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、Ａ′、Ｂ′およびＣ′と相補的である。 ナノ粒子と透明基板を用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂおよびｃは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′およびｃ′は、それぞれａ、ｂおよびｃと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。 ナノ粒子と透明基板を用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂおよびｃは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′およびｃ′は、それぞれａ、ｂおよびｃと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。 ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル量子ドット（ＱＤ）の集合体を形成する系を示す略図。 ４００ｎｍでの励起で、分散ＱＤと凝集ＱＤを比較する蛍光スペクトルを示している。試料は同じように調製したが、但し、一方には相補的「リンカー」ＤＮＡを付加し、他方には等量、等濃度の非相補的ＤＮＡを付加した。 「融解」の前、間および後の異なる温度下のＱＤ／ＱＤ集合体のＵＶ−可視スペクトルを示している。図中の挿入図は、集合体の熱変性に関する温度対消光プロファイルを示している。変性実験は、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．０１％アジ化ナトリウム中、１３ｎｍの金ナノ粒子および／または〜４ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルＱＤを用いて実施した。 ハイブリッド金／ＱＤ集合体の一部の高解像度ＴＥＭ画像を示している。指紋に似たＱＤの格子干渉縞が各金ナノ粒子の近くに見える。 「融解」の前、間および後の異なる温度下のハイブリッド金／ＱＤ集合体のＵＶ−可視スペクトルを示している。図中の挿入図は、集合体の熱変性に関する温度対消光プロファイルを示している。変性実験は、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）、０．０１％アジ化ナトリウム中、１３ｎｍの金ナノ粒子および／または〜４ｎｍのＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェルＱＤを用いて実施した。 コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。 コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。 コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。 コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。 コアプローブ、凝集体プローブの作製およびこれらのプローブを用いたＤＮＡ検出系を示す略図。これらの図面において、ａ、ｂ、ｃおよびｄは、異なるオリゴヌクレオチド配列を表し、ａ′、ｂ′、ｃ′およびｄ′はそれぞれ、ａ、ｂ、ｃおよびｄと相補的なオリゴヌクレオチド配列を表す。 メルカプトエタノールによる、オリゴヌクレオチドが付着しているナノ粒子（黒丸）または金薄膜（白四角）からのオリゴヌクレオチドの置換分率のグラフ。 ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体の調製に使用される、様々な認識オリゴヌクレオチド：希釈剤オリゴヌクレオチド比に対して得られた、ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの表面被覆範囲のグラフ。 ナノ粒子上の認識オリゴヌクレオチドの様々な表面被覆範囲に対する、ハイブリダイズした相補的なオリゴヌクレオチドの表面被覆範囲のグラフ。 ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体および銀染色法による増幅を用いた基板上の４素子アレイ中の標的ＤＮＡを検出する系を示す略図。 平台型スキャナを用いて得た、７ｍｍ×１３ｍｍのオリゴヌクレオチド官能化フロートガラススライドの画像。（Ａ）ＤＮＡ標的と金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体とがハイブリダイズする前のスライド。（Ｂ）１０ｎＭの標的ＤＮＡと５ｎＭのナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体とがハイブリダイズした後のスライドＡ。ピンク色は赤い直径１３ｎｍ金ナノ粒子が付着したためである。（Ｃ）銀増幅溶液に５分間暴露した後のスライドＢ。（Ｄ）（Ａ）と同じ。（Ｅ）１００ｐＭの標的と５ｎＭのナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体とがハイブリダイズした後のスライドＤ。ナノ粒子層の吸光度は低過ぎて肉眼または平台型スキャナで観測できなかった。（Ｆ）銀増幅溶液に５分間暴露した後のスライドＥ。スライドＦはスライドＣよりはるかに明るく、これは、標的濃度が低いことを示している。（Ｇ）５ｎＭのナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体に暴露し、かつ銀増幅溶液に５分間暴露した対照スライド。スライドの黒ずみは観測されなかった。 種々の濃度の標的ＤＮＡに暴露した後、５ｎＭの金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド指示共役体に暴露し、銀増幅溶液に５分間暴露した、オリゴヌクレオチド官能化ガラス表面のグレースケール（光学密度）のグラフ。 発蛍光団で標識した標的のオリゴヌクレオチド官能化ガラス表面からの解離を示すハイブリダイズ標的％対温度のグラフ。 ナノ粒子で標識した標的（図３５Ｂ）のオリゴヌクレオチド官能化ガラス表面からの解離を示すハイブリダイズ標的％対温度のグラフ。図３５ＡおよびＢにおいて、測定は、ガラス表面上の溶液中の解離した標識の蛍光（図３５Ａ）および吸光度（図３５Ｂ）を測定して実施した。「ｂ」と標示された線は、ガラス上の完全対合オリゴヌクレオチドの解離曲線を示し、「ｒ」と標示されている線は、ガラス上の誤対合オリゴヌクレオチド（１塩基誤対合）の曲線を示している。グラフ中の垂線は、各測定に関して所与の温度（各曲線の融解温度Ｔｍの中間）で解離した標的分画および発蛍光団およびナノ粒子ベース遺伝子チップに関する予測された配列同定選択率を示している。蛍光（図３５Ａ）：相補体（６９％）／誤対合（３８％）＝１．８：１。吸光度（図３５Ｂ）：相補体（８５％）／誤対合（１４％）＝６：１。発蛍光団標識曲線（図３５Ａ）の幅は、発蛍光団標識標的の遺伝子チップからの解離に特徴的なものである（Ｆｏｒｍａｎら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｌｅｏｎｔｉｓら編（ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６８２，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９８年），２０６−２２８ページ）。 合成標的および蛍光標識ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体プローブで攻撃したモデルオリゴヌクレオチド配列の画像。 ナノ粒子標識ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体プローブで攻撃したモデルオリゴヌクレオチド配列の画像。図３６ＡおよびＢにおいて、Ｃ、Ａ、ＴおよびＧは、基板に付着しているオリゴヌクレオチドに１単塩基変化が起こって標的との完全対合（塩基Ａ）または１塩基誤対合（塩基Ａとの完全対合の代わりに塩基Ｃ、ＴまたはＧ）をもたらした配列上のスポット（要素）を表している。要素Ｃ：Ａ：Ｔ：Ｇのグレースケール比は、図３６Ａに関しては９：３７：９：１１、図３６Ｂに関しては３：６２：７：３４である。 連結核酸（３）を介して結合したナノ粒子（ａおよびｂ）の凝集体（Ａ）または層（Ｂ）を形成する系を示す略図。 相補的リンカー３を介してオリゴヌクレオチド官能化ガラス製顕微鏡スライドにハイブリダイズした金ナノ粒子のａとｂの交互層（図３７参照）のＵＶ−可視スペクトル。これらのスペクトルは、１（ａ、λｍａｘ＝５２４ｎｍ）、２（ｂ、λｍａｘ＝５２９ｎｍ）、３（ｃ、λｍａｘ＝５３２ｎｍ）、４（ｄ、λｍａｘ＝５３４ｎｍ）または５（ｅ、λｍａｘ＝５３４ｎｍ）層を有する集合体に関する。これらのスペクトルは、スライドを介して直接測定した。 層の数の増大に伴うナノ粒子集合体（図３８Ａ参照）のλｍａｘでの吸光度のグラフ。 ＤＮＡリンカーと共にオリゴヌクレオチド官能化導電性インジウム−スズ−オキシド（ＩＴＯ）スライド（オリゴヌクレオチド官能化ガラススライドと同じ方法で作製）に同時ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子の１つの層のＦＥ−ＳＥＭ。このスライドの可視吸光度スペクトルは、図３８Ａと同一であったが、これは、ＩＴＯ上の官能化およびナノ粒子被覆面積がガラス上のものと類似であることを示している。１０枚のそのような画像から計数したナノ粒子の平均密度は約８００ナノ粒子／μｍ２であった。 ＩＴＯスライド上の２つのナノ粒子層のＦＥ−ＳＥＭ画像。１０枚のそのような画像から計数したナノ粒子の平均密度は約２８００ナノ粒子／μｍ２であった。 ０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７）中の一本鎖とのオリゴヌクレオチド二本鎖分子（１＋２＋３；図３５Ａ参照）の０．５μＭ溶液の解離を示す２６０ｎｍ（Ａ２６０）の吸光度。 ０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ 燐酸緩衝液に浸漬したガラススライドからの１層のオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子の解離を示す２６０ｎｍ（Ａ２６０）の吸光度。 ０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ 燐酸緩衝液に浸漬したガラススライドからの４層のオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子の解離を示す２６０ｎｍ（Ａ２６０）の吸光度。 ０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ 燐酸緩衝液に浸漬したガラススライドからの１０層のオリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子の解離を示す２６０ｎｍ（Ａ２６０）の吸光度。図Ｄ〜Ｆに関して、温度の増大に従って減少するスライドを介した５２０ｎｍ（Ａ５２０）での吸光度を測定して融解プロファイルを得た。図３９Ｄ−Ｆそれぞれの挿入図は、測定した解離曲線の一次導関数を示している。これらの曲線のＦＷＨＭは、（図３９Ｃの挿入図）１３．２℃、（図３９Ｄの挿入図）５．６℃、（図３９Ｅの挿入図）３．２℃、（図３９Ｆの挿入図）２．９℃であった。 ＤＮＡを介して結合している金ナノ粒子集合体の電気的性質の測定に用いられる系を示す略図。分かり易くするために、単一のハイブリダイゼーション事象のみが描かれている。 金電極および金ナノ粒子を用いた核酸検出法を示す略図。 オリゴヌクレオチドをナノ粒子に連結する際に使用されるステロイド部分を有する好ましい化合物１を含む、環式ジスルフィド１の構造を例証する略図。ステロイドジスルフィド分子は、４，５−ジヒドロキシ−１，２−ジチアンをエピアンドロステロンと縮合することにより得られる。金のナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体は、ステロイドジスルフィドにより修飾したオリゴヌクレオチドを使用して調製され、その調製用にオリゴヌクレオチド−メルカプトヘキシルリンカーを使用したナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と比べて、ＤＴＴに対するより大きな安定性を示す。 ステロイド環式スルフィドアンカー基に対する合成と化学式を示す略図。 実施例２４に説明したオリゴヌクレオチド環式ジスルフィドリンカーの調製に使用される化学式２の環式ジスルフィドと、アンカー基として使用される同様な関連環式ジスルフィドを示す略図。 実施例２５に記述した構造を示す略図。図４５（ａ）は、５′−モノチオール−修飾オリゴヌクレオチド５、３５塩基５′−ステロイドジスルフィドオリゴマー６、Ｔｒｅｍｂｌｅｒホスホルアミド７、および５−トリ−メルカプトアルキルオリゴヌクレオチド８を示す。 新規トリチオールオリゴヌクレオチドを作製する化学的機構を示す略図。 高密度オリゴヌクレオチドナノ粒子共役体Ｉ、オリゴヌクレオチドタンパク質共役体１、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−タンパク質共役体ＩＩ、及びプローブ−ターゲット複合体ＩＩＩの略図。オリゴヌクレオチド共役体Ｉは、共役体Ｉに結合したオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有している。プローブＩＩは、タンパク質のための代表的プローブである。複合体ＩＩＩは、タンパク質ターゲットとプローブに結合したタンパク質との特異的結合相互作用からもたらされる。 特異的タンパク質を、ガラス表面に固定化した異なるタンパク質のアレイ中ので検出する際のプローブＩＩの適用例の略図。金ナノ粒子は、視覚的に、或いは銀染色により認識することができる。蛍光ナノ粒子は、それらの蛍光により認識することができる。この図に示すように、ガラスプレートは、表面に固定化した３種の異なるタンパク質を示しており、そのうち１種は、プローブＩＩでタンパク質に結合する。段階１において、そのプレートをプローブＩＩを含有する溶液に暴露する。段階２において、非結合のプローブＩＩを洗い流す。段階３において、その一連のタンパク質のうち第１のタンパク質が占める部位の結合したナノ粒子（ＩＶ）の存在を観察する。 ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−受容体プローブ（ＩＩ’）の略図、及び特異的ターゲットを、滑面に固定化した物質のアレイで検出する際の適用例の略図。認識受容体ユニット（ターゲットに相補的な特異的結合）は、Ａと呼称し、ターゲットはＢと称する。 （ａ）受容体（Ｒ）に連結したオリゴヌクレオチドが、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドに相補的であり、ナノ粒子共役体が、受容体に結合したオリゴヌクレオチドに、ハイブリダイゼーションにより結合することを示すナノ粒子−オリゴヌクレオチド−受容体プローブ（ＩＩ）の略図、及び（ｂ）受容体（Ｒ）に連結するオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの結果、連結オリゴヌクレオチドの第１部分に結合し、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの結果、連結オリゴヌクレオチドの第２部分に結合することを示すナノ粒子−オリゴヌクレオチド−受容体プローブ（ＩＩ）の略図。簡略化のために、オリゴヌクレオチド−ナノ粒子共役体に結合したオリゴヌクレオチド−タンパク質共役体を１種のみ示しているが、実際の数はもっと多い可能性がある。 特異的ターゲット、例えば薬物又はタンパク質を、ガラス表面に固定化した異なる薬物又はタンパク質のアレイで検出する際のプローブ（図５０ｂ）の適用例の略図。 特異的ターゲットを、異なる分子の混合物を有する細胞で検出する際のプローブ図５０ｂの適用例の略図。図５１Ａ，Ｂにおいて、プローブは、検体、例えばタンパク質又は薬物が多重結合部位を有する場合も、スポットテストにおいて用いることができる。 結合したオリゴヌクレオチド１、ナノ粒子オリゴヌクレオチド共役体２、及びターゲット核酸３を有するビオチン分子に結合したストレプトアビジンの複合体のハイブリダイゼーション。 ある種のナノ粒子のオリゴヌクレオチドを第２の種のナノ粒子とハイブリダイゼーションさせることによる金ナノ粒子アセンブリ。 ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに各ビオチン分子が結合するような４種のビオチン分子に特異的に結合したアビジンの複合体のハイブリダイゼーションによる金ナノ粒子アセンブリ、の結果形成した３次元金ナノ粒子−ストレプトアビジンアセンブリ又は凝集体の略図。図５２Ａ〜Ｂの３例全てにおいて、凝集体が形成すると、溶液の色が赤色から紫色又は青灰色に変化した。 本発明の金ナノ粒子／オリゴヌクレオチド／ストレプトアビジン共役体（左）及び市販の金コロイド／ストレプトアビジン共役体（右）の非特異的結合テスト（実施例２７）を示す写真。市販の共役体は、灰色のスポットを示し、その共役体がガラス表面に接着していることが示されたが、本発明の共役体は、有意な銀染色を示さなかった。 表面に結合したビオチンへの金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体の結合の略図。ビオチンは、支持体表面に結合したオリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに連結し、オリゴヌクレオチド−ビオチン共役体は、表面に結合したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。 リンカーをタンパク質のためのＤＮＡ受容体として用いるタンパク質検出方法の略図。図示するように、結合した受容体ＤＮＡを有するナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ビオチン共役体は、ストレプトアビジンを付加すると、３次元ナノ粒子アセンブリを形成する。その凝集体は、その後単離され、デハイブリダイゼーションに付されて、ナノ粒子−オリゴヌクレオチド共役体と、結合するオリゴヌクレオチドを有するビオチン分子に結合するストレプトアビジンの複合体と、その受容体とを遊離する。そのタンパク質は、ＤＮＡチップの使用をはじめとする従来法での受容体ＤＮＡの同定により検出される。 （ａ）オリゴヌクレオチドに連結した単一のビオチンに結合するストレプトアビジン（ビオチンに結合したオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの結果、リンカーオリゴヌクレオチドの第１部分に更に結合する）、及び（ｂ）結合するオリゴヌクレオチドを有する金ナノ粒子（ナノ粒子に結合したそのオリゴヌクレオチドは、リンカーオリゴヌクレオチドの第２部分に相補的な配列を有する）、からの金ナノ粒子−オリゴヌクレオチド−ストレプトアビジン共役体の調製（実施例２６）を示す略図。 （ａ）ストレプトアビジン−オリゴヌクレオチド共役体（１−ＳＴＶ）、１３ｎｍの金粒子（２−Ａｕ）、及びリンカーＤＮＡ（３）の溶液を５３℃に加熱すると凝集体を形成すること、及び（ｂ）アニーリングの前後に凝集体内の粒子がそれらの物理的形状を残していること、を示す透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像（実施例２８）は、粒子の融合がないことを示しており、更に表面オリゴヌクレオチド層の安定した影響を実証している。 温度の関数としての融解曲線により、ストレプトアビジン−ナノ粒子凝集体が非特異的相互作用ではなくＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用により形成し、その工程が可逆的であることが確認される。実施例２８を参照されたい。 波長の関数としての融解曲線により、ストレプトアビジン−ナノ粒子凝集体が非特異的相互作用ではなくＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用により形成し、その工程が可逆的であることが確認される。実施例２８を参照されたい。 実施例２８に記載するような様々な凝集体の様々な粒子間距離を示す小角Ｘ線散乱回折パターン。 実施例２９で説明されているＩＴＯ電極装置一式の例示図。 アレイ捕捉鎖、オリゴヌクレオチドで官能化したナノ粒子標識、および検出する標的のＤＮＡ配列が、３成分間サンドイッチ・アッセイ（ｔｈｒｅｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｓａｎｄｗｈｉｃｈ ａｓｓａｙ）において同時にハイブリダイズするように設計されることを示す図。 モデルＤＮＡアレイをオリゴヌクレオチド配列ｃ（左）およびｄ（右）で官能化し、配列ａで官能化した直径５０ｎｍのＡｕナノ粒子（１０ｎＭ）、配列ｂで官能化した直径１００ｎｍのＡｕナノ粒子（３．５ｎＭ）、ならびにオリゴヌクレオチド標的ａ’ｃ’および／またはｂ’ｄ’（２００ｎＭ）の溶液と共にインキュベートした顕微鏡画像を示す図１１。（Ａ）アレイおよびナノ粒子を標的ａ’ｃ’およびｂ’ｄ’の両方とハイブリダイズさせた。（Ｂ）アレイおよびナノ粒子を標的ｂ’ｄ’のみとハイブリダイズさせた。（Ｃ）アレイおよびナノ粒子を標的ａ’ｃ’のみとハイブリダイズさせた。（Ｄ）アレイおよびナノ粒子を、標的を存在させずにインキュベートした。使用したＤＮＡの配列は、ａ：３’ＴＴＡ ＴＡＡ ＣＴＡ ＴＴＣ ＣＴＡ Ａ２０５’−ステロイド・ジスルフィド（配列番号７７）、ｂ：３’ＣＴＣ ＣＣＴ ＡＡＴ ＡＡＣ ＡＡＴ Ａ２０５’−ステロイド・ジスルフィド（配列番号７８）、ｃ：３’Ａ２０ＴＡＴ ＴＣＴ ＴＣＣ ＴＡＴ ＡＡＴ５’（配列番号７９）、ｄ：３’Ａ２０ＴＣＣ ＣＡＡ ＴＡＴ ＡＡＣ ＡＴＣ５’（配列番号８０）、ａ’ｃ’：３’ＴＡＧ ＧＡＡ ＴＡＧ ＴＴＡ ＴＡＡ ＡＴＴ ＡＴＡ ＧＧＡ ＡＧＡ ＡＴＡ５’（配列番号８１）、ｂ’ｄ’：３’ＡＴＴ ＧＴＴ ＡＴＴ ＡＧＧ ＧＡＧ ＧＡＴ ＧＴＴ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＧＡ５’（配列番号８２）である。詳細は、実施例３０を参照のこと。 直径５０ｎｍのＡｕナノ粒子プローブで標識した１塩基多型（ＳＮＰ）アレイの顕微鏡画像を示す図。図６１Ｂに示す配列で官能化したアレイを、オリゴヌクレオチドで官能化した粒子（１０ｎＭ）および４種のアレイ配列のうち１種（Ｘ＝Ａ）のみに相補的な合成オリゴヌクレオチド標的（２００ｎＭ）と共にインキュベートした。アレイを洗浄して清浄なハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した後、緩衝液を次第に加熱して攪拌する間に、示した温度で画像を撮影した１１。 要素がＸ＝ＡおよびＸ＝Ｇの場合の、５０ｎｍのＡｕナノ粒子プローブがＤＮＡアレイ表面から融解するプロファイルを示す図。融解実験中に得られたアレイ画像（図６３Ａのものなど）の定量分析によって決定した１７。Ｔ＝５５℃（縦線で示す）では、図６３Ａ中の対応する画像から見ると、ハイブリダイズした状態で残存している粒子標識の割合は、Ｘ＝Ａでは０．３８、Ｘ＝Ｇでは０．０８である。詳細は、実施例３１を参照のこと。 画像化のために倒立顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ（登録商標）１００Ａ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、ドイツ国イェナ所在）上の光ファイバー照明（Ｄａｒｋｌｉｔｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ、Ｍｉｃｒｏ Ｖｉｄｅｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、マサチューセッツ州エイボン所在）に取り付けたスライド・アセンブリの図。光の照射は、強度４０％に設定した２００Ｗのハロゲン光源（Ｆｉｂｅｒ−Ｌｉｔｅ（登録商標）ＰＬ−７５０、Ｄｏｌａｎ−Ｊｅｎｎｅｒ、マサチューセッツ州ローレンス所在）によって提供し、画像化の前に少なくとも１５分間平衡化させた。画像は、デジタルカメラＰｅｎｇｕｉｎ６００ＣＬ（Ｐｉｘｅｒａ、カリフォルニア州ロス・ガトス所在）を用いて取り込んだ。実施例３０参照。 温度制御ステージ台（ＢＳ６０、Ｉｎｓｔｅｃ Ｉｎｃ．、コロラド州ボールダー所在）および小型磁気撹拌機（Ｔｅｌｅｍｏｄｕｌ Ｍｉｎｉ、Ｈ＋Ｐ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ国ミュンヘン所在）を備えた倒立顕微鏡上に取り付けたスライドの上面図（図６５Ａ）および側面図（図Ｓ２Ｂ）。該アセンブリを０．５℃／分の速度で２５℃から７５℃までの温度傾斜に供し、各温度で３分間維持した。上述のように画像を取り込み、画像処理ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）５．０、Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州サンノゼ所在）を使用して解析した。実施例３１参照。 緑色の曲線：オリゴヌクレオチド配列ｃで官能化したスライド・ガラスを、配列ａで官能化した直径５０ｎｍのＡｕナノ粒子（１０ｎＭ）およびオリゴヌクレオチド標的ａ’ｃ’（２００ｎＭ）の溶液と共にインキュベートし、該スライド・ガラスから散乱された光の可視スペクトルを示す図（ハイブリダイゼーション手順およびデータ収集の詳細を実施例３０および３１に示す）。橙色の曲線：オリゴヌクレオチド配列ｄで官能化したスライド・ガラスを、配列ｂで官能化した直径１００ｎｍのＡｕナノ粒子（３．５ｎＭ）およびオリゴヌクレオチド標的ｂ’ｄ’（２００ｎＭ）の溶液と共にインキュベートし、該スライド・ガラスから散乱された光の可視スペクトルを示す図。 オリゴヌクレオチド配列ｃをスポットし、配列ａで官能化した直径５０ｎｍのＡｕナノ粒子（１０ｎＭ）およびオリゴヌクレオチド標的ａ’ｃ’の溶液と共にインキュベートしたアレイにおける、標的オリゴヌクレオチドの濃度に対する散乱光の強度の関係を示す図。強度値は、実施例３０および３１に示すように、各標的濃度で撮影した顕微鏡画像の解析によって決定した。グラフの各点は、４つのアレイ・スポットで測定された平均強度を表す。 検出スキームを示す図。（Ａ）２つの電極の間に位置する捕捉オリゴヌクレオチド鎖と溶液中の標的オリゴヌクレオチドとの間の選択的結合事象。標的オリゴヌクレオチドは、それぞれ捕捉鎖およびナノ粒子プローブに相補的な隣接する複数の認識要素を有している。したがって、１対の電極を備えたデバイスを、適切なプローブおよび標的を含む溶液に浸すと、粒子が間隙を埋める。原理的には、電気容量または導電率を測定して粒子の数を、したがって間隙を埋める標的分子の数を、決定することが可能である。しかし、対象とするデバイスの構成要素を銀染色、たとえばＡｇ（Ｉ）およびハイドロキノンの溶液（写真現像液）に曝すことによって、このデバイスの感度を劇的に高めることが可能である。（Ｂ）２０μｍの間隙を有する微小電極（５ｎｍ Ｔｉ上の６０ｎｍ Ａｕ）を、実施例３２に記載のように１０００オングストロームのＳｉＯ２コーティングを有するＳｉウェハの標準的フォトリソグラフィーによって調製した。（Ｃ）実施例３２に記載の実験における捕捉ＤＮＡ鎖、標的ＤＮＡ鎖、およびプローブＤＮＡ鎖の配列。 増加する銀染色増感時間の関数として測定した、電極間隙の抵抗を示す図。 増感時間の関数として電極間隙の抵抗を示す図。銀染色増感の前に、アレイを５０℃の０．３ＭのＰＢＳで洗浄した。 完全に相補的なオリゴヌクレオチド（Ｘ＝Ａ）およびゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）ミスマッチを有する鎖（Ｘ＝Ｇ）における、Ｎａ＋濃度の関数としてのＤＮＡ２重鎖の変性曲線を示す図。これらの実験では、ガラス製キュベット（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルベニア州ピッツバーグ所在）の内壁を適切な捕捉鎖オリゴヌクレオチドで官能化し、その後、標的ＤＮＡ（１０ｎＭ）の０．３Ｍ ＰＢＳ溶液を用いて１０時間、次いでナノ粒子プローブを用いて５時間処理した。様々なＮａＣｌ濃度の一連の緩衝溶液で洗浄した後、５２０ｎｍにおける消光をモニターした。差込図：完全に一致したＤＮＡ（Ｘ＝Ａ）およびゆらぎミスマッチを有するＤＮＡ（Ｘ＝Ｇ）の熱変性曲線。 銀染色の増感の前に室温の０．０１Ｍ ＰＢＳで洗浄した電極アレイの抵抗を示す図。 ＩＴＯでコーティングしたガラス表面上のナノ粒子プローブのＦＥ−ＳＥＭ画像を示す図。（Ａ）銀堆積前、（Ｂ）増感溶液で３分間処理した後、（Ｃ）増感溶液で６分間処理した後、（Ｄ）銀染色増感溶液で９分間処理した後。ＩＴＯでコーティングしたガラス基板（Ｄｅｌｔａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ミネソタ州スティルウォーター（Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ）所在）を相補的な捕捉ＤＮＡ鎖で修飾し、標的ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドで修飾したナノ粒子を、ＤＮＡ検出で使用した手順と同じ手順に従って基板上で会合させた。 ナノ粒子の会合および銀堆積工程の後の、ＤＮＡスポットの縁部のＦＥ−ＳＥＭ画像を示す図。比較的高い濃度のナノ粒子（１０ｎＭ）を用いて基板を処理してあるので、捕捉ＤＮＡ鎖がない領域（矢印より下）へのナノ粒子の非特異的結合も含まれる。矢印より下にはかなりの量の非特異的に結合したナノ粒子が存在するにもかかわらず、有意な銀の堆積がないことに注意されたい。これは、粒子が均一に大きくなるのではなく、堆積した銀に触媒される銀の還元が間隙を閉鎖していることをさらに実証している。

Claims (51)

  1. 少なくとも２つの部分を有する配列の核酸を検出する方法であって、
    核酸の配列の第１の部分に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した基板を提供する工程と、
    少なくとも一部が該核酸の第２の部分の配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが結合した標識を提供する工程と、
    標識と複合体形成した試験基板を形成するために、該基板、核酸、および標識を、該基板に結合した該オリゴヌクレオチドと該核酸との間、および該核酸と該標識に結合した該オリゴヌクレオチドとの間でハイブリダイズさせるのに有効な条件下で接触させる工程と、
    該試験基板を、非特異的に結合した標識を実質的に除去するのに有効な塩濃度を有する塩水溶液と接触させる工程と、
    検出可能な変化を観察する工程と
    を含む方法。
  2. 前記核酸を、前記標識と接触させる前に（ａ）で提供される前記基板と接触させる請求項１に記載の方法。
  3. 前記核酸を、前記基板と接触させる前に（ｂ）で提供される前記標識と接触させる請求項１に記載の方法。
  4. 銀染色を用いて前記標識を検出する請求項１に記載の方法。
  5. 前記核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである請求項１に記載の方法。
  6. 前記核酸がヒト、細菌、ウイルスもしくは真菌由来である請求項１に記載の方法。
  7. 前記核酸が疾病に関連する遺伝子である請求項１に記載の方法。
  8. 前記核酸が合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、構造的に改変された天然もしくは合成のＲＮＡ、または構造的に改変された天然もしくは合成のＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記核酸がポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物である請求項１に記載の方法。
  10. 前記標識が金属から作製される請求項１に記載の方法。
  11. 前記標識がナノ粒子からなる請求項１に記載の方法。
  12. 前記標識が金属または半導体のナノ粒子からなる請求項１に記載の方法。
  13. 前記標識が金ナノ粒子からなる請求項１２に記載の方法。
  14. １つの核酸の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはいずれも可能にするために、前記基板に複数種のオリゴヌクレオチドがアレイ状に結合している請求項１に記載の方法。
  15. 検出可能な変化を生じさせるために前記基板を銀染色液と接触させる請求項１に記載の方法。
  16. 前記基板に結合しているオリゴヌクレオチドが２つの電極の間に位置しており、共役体の標識は電導性の材料から作製されており、前記検出可能な変化が該電極の電気特性の変化である、請求項１に記載の方法。
  17. 電極の電気特性の変化が導電率、抵抗率、電気容量、またはインピーダンスの変化を含む、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記電極が金で作製され、前記標識が金で作製される、請求項１６に記載の方法。
  19. 導電率の変化を生じさせるために前記試験基板を銀染色液と接触させる、請求項１６に記載の方法。
  20. 電極間に電気特性の変化を生じさせるために前記試験基板を物質と接触させる、請求項１６に記載の方法。
  21. 前記塩水溶液が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これら塩の２種以上の組合せ、これら塩の１種をリン酸緩衝剤中に含めたもの、およびこれら塩の２種以上の組合せをリン酸緩衝剤中に含めたものからなる群から選択される塩を含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記塩溶液がリン酸緩衝液に溶解した塩化ナトリウムである請求項２１に記載の方法。
  23. 前記塩水溶液が約０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウムおよび約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液からなる、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記塩水溶液が約０．００５〜０．１Ｍの塩化ナトリウムおよび約１０ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液からなる、請求項２２に記載の方法。
  25. 少なくとも２つの部分を有する核酸を検出する方法であって、
    （ａ）核酸を、オリゴヌクレオチドが付着した基板と、該基板上のオリゴヌクレオチドと前記核酸がハイブリダイズするのに有効な条件下で接触させる工程であって、該オリゴヌクレオチドが１対の電極の間に配置され、前記核酸の配列の第１の部分に相補的な配列を有することを特徴とする工程と、
    （ｂ）基板に結合した前記核酸を第１のタイプの標識と接触させる工程であって、該標識が電気を通し得る材料から作製され、該標識に１種または複数種のオリゴヌクレオチドが付着しており、該オリゴヌクレオチド種の少なくとも１種が前記核酸の配列の第２の部分に相補的な配列を有するとともに、該標識上の該オリゴヌクレオチドと前記核酸とがハイブリダイズするのに有効な条件下で実施して標識と複合体形成した試験基板を形成させることを特徴とする工程と、
    （ｃ）該試験基板を、非特異的に結合した標識を十分に除去するのに有効な塩濃度を有する塩水溶液と接触させる工程と、
    （ｄ）観察可能な変化を検出する工程と
    からなる方法。
  26. 観察可能な変化を検出する工程が前記電極間の電気特性の変化を検出することを含み、電極の電気特性の変化が導電率、抵抗率、電気容量、またはインピーダンスの変化を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. １つの核酸の複数の部分の検出、複数の異なる核酸の検出、またはいずれも可能にするために、前記基板がアレイ状に配置された複数の電極対を有し、各電極対がその間に基板
    上に付着した１種のオリゴヌクレオチドを有する、請求項２５に記載の方法。
  28. 前記標識が金属から作製される請求項２５に記載の方法。
  29. 前記標識がナノ粒子からなる請求項２５に記載の方法。
  30. 前記標識が金属または半導体ナノ粒子からなる請求項２５に記載の方法。
  31. 前記標識が金ナノ粒子からなる請求項２５に記載の方法。
  32. 導電率の変化を生じさせるために基板を銀染色液と接触させる、請求項２５に記載の方法。
  33. （ｄ）基板に結合した前記第１のタイプの標識を第２のタイプの標識と接触させる工程であって、前記第２のタイプの標識が電気を通し得る材料から作製され、かつ該標識にオリゴヌクレオチドが付着しており、該第２のタイプの標識上の少なくとも１種のオリゴヌクレオチド種が、前記第１のタイプの標識上のオリゴヌクレオチド種のうち１種の配列に相補的な配列からなるとともに、第１および第２のタイプの標識上のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするのに有効な条件下で実施されることを特徴とする工程と、
    （ｅ）前記電極の電気特性の変化を検出する工程と
    からさらになる、請求項２５に記載の方法。
  34. 前記電極の電気特性の変化が導電率、抵抗率、電気容量、またはインピーダンスの変化を含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記第１のタイプの標識上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種が、前記第２のタイプの標識上のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種の配列に相補的な配列を有し、
    （ｆ）第１および第２のタイプの標識上のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするのに有効な条件下で、前記基板に結合した第２のタイプの標識を第１のタイプの標識と接触させる工程と、
    （ｇ）前記電極の電気特性の変化を検出する工程と
    からさらになる、請求項３３に記載の方法。
  36. 前記電極の電気特性の変化が導電率、抵抗率、電気容量、またはインピーダンスの変化を含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 工程（ｄ）、または工程（ｄ）および（ｆ）を１回もしくは複数回繰り返して導電率の変化を検出する、請求項３５に記載の方法。
  38. （ｄ）前記基板に結合した第１のタイプの標識をオリゴヌクレオチドが付着した凝集プローブと接触させる工程であって、前記凝集プローブの標識が電気を通し得る材料から作製されており、該凝集プローブ上のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１種が前記第１のタイプの標識上のオリゴヌクレオチドのうち１種の配列に相補的な配列からなるとともに、該凝集プローブ上のオリゴヌクレオチドと該第１のタイプの標識上のオリゴヌクレオチドとがハイブリダイズするのに有効な条件下で実施することを特徴とする工程と、
    （ｅ）前記電極の電気特性の変化を検出する工程と
    からさらになる、請求項２５に記載の方法。
  39. 前記電極の電気特性の変化が導電率、抵抗率、電気容量、またはインピーダンスの変化を含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記塩水溶液が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これら塩の２種以上の組合せ、これら塩の１種をリン酸緩衝剤中に含めたもの、およびこれら塩の２種以上の組合せをリン酸緩衝剤中に含めたものからなる群から選択される塩を含む、請求項２５に記載の方法。
  41. 前記塩溶液がリン酸緩衝液中の塩化ナトリウムである請求項４０に記載の方法。
  42. 前記塩水溶液が約０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウムおよび約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液からなる、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記塩水溶液が約０．００５〜０．１Ｍの塩化ナトリウムおよび約１０ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液からなる、請求項４１に記載の方法。
  44. ミスマッチ塩基を有する核酸を含む試料中の１種または複数種の標的核酸をハイブリダイゼーションの相互作用によって捕捉し検出するための、捕捉オリゴヌクレオチド・プローブが結合した基板および標識したオリゴヌクレオチド検出プローブを利用するハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを高める方法において、捕捉プローブ、標的核酸、および検出プローブをハイブリダイズさせた複合体を有する前記基板を塩水溶液で洗浄する工程を含むことからなる改良方法。
  45. 前記塩水溶液が塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これら塩の２種以上の組合せ、これら塩の１種をリン酸緩衝剤中に含めたもの、およびこれら塩の２種以上の組合せをリン酸緩衝剤中に含めたものからなる群から選択される塩を含む、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記塩溶液がリン酸緩衝液中の塩化ナトリウムである請求項４５に記載の方法。
  47. 前記塩水溶液が約０Ｍ〜０．５Ｍの塩化ナトリウムおよび約０．０１ｍＭ〜１５ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液からなる、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記塩水溶液が約０．００５〜０．１Ｍの塩化ナトリウムおよび約１０ｍＭのｐＨ７のリン酸緩衝液からなる、請求項４５に記載の方法。
  49. 前記検出プローブがナノ粒子−オリゴヌクレオチドの共役体からなる請求項４４に記載の方法。
  50. 前記共役体が金ナノ粒子−オリゴヌクレオチドの共役体である請求項４４に記載の方法。
  51. 検出可能な変化を観察する工程が、ハイブリダイゼーションが起こったかどうかを決定することからなる、請求項２５に記載の方法。
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