JP5200069B2 - 三次元ｄｎａネットワーク - Google Patents
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Description
ＤＮＡから構成される三次元状に広がったネットワークに関する。
染色体は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とタンパク質でできており、ＤＮＡが遺伝子の本体であるといわれている。そこで、遺伝子工学などにおいてＤＮＡについて、広範な研究がなされている。
ここで、ＤＮＡは、その化学的、物理的な性質としても、特別なものを有しており、その性質を各種の装置に利用することも考えられている。例えば、ＤＮＡを基板上に固定し、このＤＮＡの電気的な性質や、特定物質の吸着機能を利用することなどが考えられている。
非特許文献１では、poly(dA-dT):poly(dA-dT)を水溶液に溶解する。この溶液を基板（マイカ、HOPG）上に滴下し、空気を吹き付けて乾燥させ、これによって基板上に二次元状に広がったＤＮＡのネットワークが形成している。
また、非特許文献２では、ＤＮＡとＭｇＣｌ2を混合した溶液をSiO2基板上に作用させ、二次元ネットワークを形成している。
T.Kanno, H.Tanaka, N.Miyoshi and T.Kawai : Jpn.J.Appl.Phys., 39, (2000), L269-L270
S.Tanaka, L.T.Cai, H.Tabata and T.Kawai : Jpn.J.Appl.Phys., 40(2001), 4217-4220
上記従来例では、二次元に広がるＤＮＡネットワークが形成され、このネットワークを利用して各種の利用が考えられる。
本発明は、三次元に広がるＤＮＡネットワークにより、より広範な機能を達成しようとするものである。
本発明に係る三次元ＤＮＡネットワークは、ＤＮＡと、ＤＮＡ固定化因子とを溶液中において混合して、ＤＮＡを不溶化し、この不溶化されたＤＮＡを含む溶液を２枚の基板間に支持させるとともに、溶液中にＤＮＡに配列非特異的に結合するとともに紐状のＤＮＡが絡みつく性状を持つネットワーク連結点構成因子を添加し、その状態に所定時間保持し、自己組織化させて、紐状のＤＮＡがネットワーク連結点構成因子のまわりに巻き付いた構造になることでネットワーク連結点構成因子を連結点として紐状のＤＮＡが三次元に広がった三次元ＤＮＡネットワークを構築させる、三次元ＤＮＡネットワークの構築方法によって構築される。
また、本発明に係る三次元ＤＮＡネットワークは、ＤＮＡと、ＤＮＡ固定化因子とを溶液中において混合して、ＤＮＡを不溶化し、この不溶化されたＤＮＡを含む溶液を１枚の基板上に支持させるとともに、溶液中にＤＮＡに配列非特異的に結合するとともに紐状のＤＮＡが絡みつく性状を持つネットワーク連結点構成因子を添加し、その状態に所定時間保持し、自己組織化させて、紐状のＤＮＡがネットワーク連結点構成因子のまわりに巻き付いた構造になることでネットワーク連結点構成因子を連結点として紐状のＤＮＡが三次元に広がった三次元ＤＮＡネットワークを構築させる、三次元ＤＮＡネットワークの構築方法によって構築される。
また、前記ＤＮＡ固定化因子は、溶液中で負に帯電したＤＮＡを電気的に中性化し、ＤＮＡを不溶化する因子であることが好適である。
また、前記ＤＮＡ固定化因子となる物資は、多価陽イオンを含む電解質であることが好適である。
また、本発明に係る三次元ＤＮＡネットワークは、ＤＮＡを含む溶液を、ＤＮＡを不溶化する表面を有する基板に支持させるとともに、溶液中にＤＮＡに配列非特異的に結合するとともに紐状のＤＮＡが絡みつく性状を持つネットワーク連結点構成因子を添加し、その状態に所定時間保持し、自己組織化させて、紐状のＤＮＡがネットワーク連結点構成因子のまわりに巻き付いた構造になることでネットワーク連結点構成因子を連結点として紐状のＤＮＡが三次元に広がった三次元ＤＮＡネットワークを構築させる、三次元ＤＮＡネットワークの構築方法によって構築される。
また、前記基板の表面は、吸着する特性を有することが好適である。
また、前記基板の表面は、疎水性または正電荷表面であることが好適である。
また、前記ネットワーク連結点構成因子は、ＤＮＡを凝縮する性質を持つ因子であることが好適である。
また、前記ネットワーク連結点構成因子は、ヒストンタンパク質であることが好適である。
また、前記ＤＮＡとして、特定のタンパク質を吸着する配列を繰り返したＤＮＡを採用することが好適である。
また、前記ＤＮＡは、λＤＮＡであることが好適である。
また、前記ＤＮＡは、目的とする機能性材料の順序や空間配列に対応した塩基配列を持つことが好適である。
また、前記不溶化されたＤＮＡを含む溶液を２枚の基板間または１枚の基板上に支持させた後に、ネットワーク連結点構成因子となる物質を添加することが好適である。
また、前記ネットワーク連結点構成因子となる物質の添加量を変更することで、ネットワークの網目の大きさを制御することが好適である。
また、前記基板として単結晶材料や配向性表面を持つ材料を用いることにより、その表面の特性に基づいて構築されることが好適である。
また、２枚の基板間にスペーサを配置したり、溶液の表面張力と基板間に加える圧力のバランスを制御することにより基板間の間隔を制御することで、基板間に構築されるＤＮＡネットワークのネットワーク長を制御することが好適である。
また、前記ネットワーク連結点と、紐状のＤＮＡに色素をインターカレートすることが好適である。
また、本発明に係る三次元ＤＮＡネットワークは、三次元的に広がりをもって点在する、ＤＮＡに配列非特異的に結合するとともに紐状のＤＮＡが絡みつく性状を持つネットワーク連結点構成因子と、紐状のＤＮＡがネットワーク連結点構成因子のまわりに巻き付くことで、ネットワーク連結点構成因子を連結点として、三次元的に広がる紐状のＤＮＡと、を含むことを特徴とする。
また、前記ネットワークの紐状のＤＮＡは、引き延ばされた状態になっていることが好適である。
このように、本発明によれば、三次元空間に広がりを持つＤＮＡネットワークを構築することができる。
従って、二次元的なＤＮＡネットワークに比べ、他の物質との接触を容易に行うことができ、例えば特定物質吸着や、効率のよいＤＮＡチップとして利用することができる。
また、本発明に係る三次元ＤＮＡネットワークは、比較的容易な方法で構築が行える。
また、ＤＮＡネットワークが、ＤＮＡ紐の部分が引き延ばされた状態になっていることで、塩基対の方向とインターカレートさせた色素の方向が揃っている。この性質を利用して色素の励起光の変更面を制御することにより、三次元光スイッチング素子に利用することができる。
以下、本発明の実施形態について説明する。
「概要」
本実施形態では、ＤＮＡから構成される三次元上に広がったネットワークを構築する。特に、ＤＮＡと、ＤＮＡ固定化因子と、ネットワーク連結点構成因子の３要素を混合し、これを基板間において保持して、自己組織化により三次元ＤＮＡネットワークを構築させる。
本実施形態では、ＤＮＡから構成される三次元上に広がったネットワークを構築する。特に、ＤＮＡと、ＤＮＡ固定化因子と、ネットワーク連結点構成因子の３要素を混合し、これを基板間において保持して、自己組織化により三次元ＤＮＡネットワークを構築させる。
具体的には、図１に示すように、
（Ｓ１）２枚の基板を間隔をあけて向かい合わせに固定する
（Ｓ２）ＤＮＡにＤＮＡ固定化因子を混合して、ＤＮＡを不溶化する
（Ｓ３）不溶化したＤＮＡの分散液を基板間にしみ込ませる
（Ｓ４）ネットワーク連結点構成因子の溶液を基板間にしみ込ませる
（Ｓ５）自己組織化による、三次元ＤＮＡネットワークの構築完了まで放置する
という、５つの工程からなっている。
（Ｓ１）２枚の基板を間隔をあけて向かい合わせに固定する
（Ｓ２）ＤＮＡにＤＮＡ固定化因子を混合して、ＤＮＡを不溶化する
（Ｓ３）不溶化したＤＮＡの分散液を基板間にしみ込ませる
（Ｓ４）ネットワーク連結点構成因子の溶液を基板間にしみ込ませる
（Ｓ５）自己組織化による、三次元ＤＮＡネットワークの構築完了まで放置する
という、５つの工程からなっている。
「具体的説明」
上述のＳ１〜Ｓ５の手順について、以下に詳細に述べる。
上述のＳ１〜Ｓ５の手順について、以下に詳細に述べる。
（Ｓ１）２枚の基板を間隔をあけて向かい合わせに固定する
例えば、顕微鏡のカバーガラスを２枚の基板として利用する。この場合、２枚のカバーガラスをスペーサを挟み込んで重ねる。スペーサとしては、ガラス片などが利用できる。また、単にカバーガラスを重ねておき、その間に侵入させる溶液の量で２枚のカバーガラスの間隔を調整して固定することもできる。
例えば、顕微鏡のカバーガラスを２枚の基板として利用する。この場合、２枚のカバーガラスをスペーサを挟み込んで重ねる。スペーサとしては、ガラス片などが利用できる。また、単にカバーガラスを重ねておき、その間に侵入させる溶液の量で２枚のカバーガラスの間隔を調整して固定することもできる。
なお、基板はカバーガラスに限らず、安定した物質であればどのようなものでもよい。透明なものを利用することが観察などの観点から好ましいが、構築されたＤＮＡネットワークの利用から考えれば不透明なものでもよく、各種のセラミックなども利用可能である。また、表面は、平坦で、一定の間隔を維持できることが好適である。
（Ｓ２）ＤＮＡにＤＮＡ固定化因子を混合しＤＮＡを不溶化する
ＤＮＡを溶解した水溶液に対しＤＮＡ固定化因子を混合することで溶液内においてＤＮＡを不溶化する。例えば、ＤＮＡ固定化因子として多価陽イオンを含む電解質の溶液を加え、ＤＮＡを不溶化する。多価陽イオンを含む電解質としては、塩化カルシウムがあげられるが、これに限らず、各種の金属塩などが利用可能である。
ＤＮＡを溶解した水溶液に対しＤＮＡ固定化因子を混合することで溶液内においてＤＮＡを不溶化する。例えば、ＤＮＡ固定化因子として多価陽イオンを含む電解質の溶液を加え、ＤＮＡを不溶化する。多価陽イオンを含む電解質としては、塩化カルシウムがあげられるが、これに限らず、各種の金属塩などが利用可能である。
また、この段階で、予め色素を添加して、ＤＮＡに色素をインターカレートしておくと、色素で染色された三次元ＤＮＡネットワークを構築することができ、構築の検証などが容易に行える。
（Ｓ３）ＤＮＡを不溶化した水溶液を基板間に侵入させる
ＤＮＡを不溶化した水溶液をピペットを用いて、基板（カバーガラス）間の間隙に供給し、その表面張力を利用してしみ込ませ、ここに保持させる。
ＤＮＡを不溶化した水溶液をピペットを用いて、基板（カバーガラス）間の間隙に供給し、その表面張力を利用してしみ込ませ、ここに保持させる。
（Ｓ４）ネットワーク連結点構成因子の溶液を基板間に保持された水溶液に加える
基板間に不溶化したＤＮＡの分散液が保持されている状態において、その基板間の水溶液にさらにネットワーク連結点構成因子の溶液を追加する。ネットワーク連結点構成因子としては、ヒストンタンパク質が採用される。このヒストンタンパク質としては、染色体にあるのと同様の、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４の４つ種類のタンパク質の結合した球状の構造物などが好適であるが、他のタンパク質でもＤＮＡがからみつきやすい性状を持ち、ＤＮＡの連結点になりうる性質を有すれば採用することができる。
基板間に不溶化したＤＮＡの分散液が保持されている状態において、その基板間の水溶液にさらにネットワーク連結点構成因子の溶液を追加する。ネットワーク連結点構成因子としては、ヒストンタンパク質が採用される。このヒストンタンパク質としては、染色体にあるのと同様の、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、Ｈ４の４つ種類のタンパク質の結合した球状の構造物などが好適であるが、他のタンパク質でもＤＮＡがからみつきやすい性状を持ち、ＤＮＡの連結点になりうる性質を有すれば採用することができる。
ここで、ネットワーク連結点構成因子の濃度を変更することにより、ネットワークの構造を制御することができる。例えば、ネットワーク連結点構成因子の濃度を高めるとネットワーク連結点の数が多くなるため、構築されるネットワークの網目が小さくなる。すなわち、三次元上に点在するネットワーク連結点構成因子間の距離が小さくなる。
なお、ＤＮＡを不溶化した水溶液にネットワーク連結点構成因子を添加混合した後、基板間にしみ込ませてもよい。しかし、ＤＮＡを不溶化したＤＮＡの分散液を基板間にしみ込ませた後、基板間にネットワーク連結点構成因子をしみ込ませた方が、三次元ＤＮＡネットワークを基板間に確実に構築できる。
（Ｓ５）自己組織化による三次元ＤＮＡネットワークが完了するまで放置する
Ｓ４において、ネットワーク連結点構成因子の溶液が添加された後、例えば、室温で数１０分間そのまま大気中で放置する。これによって、両基板表面で、二次元ＤＮＡネットワークが構築されると同時に基板と垂直方向のネットワークも構築され、これが基板表面の二次元ネットワークと連結され、三次元ＤＮＡネットワークが構築される。
Ｓ４において、ネットワーク連結点構成因子の溶液が添加された後、例えば、室温で数１０分間そのまま大気中で放置する。これによって、両基板表面で、二次元ＤＮＡネットワークが構築されると同時に基板と垂直方向のネットワークも構築され、これが基板表面の二次元ネットワークと連結され、三次元ＤＮＡネットワークが構築される。
ここで、基板として単結晶材料や配向性表面を持つ材料を用いること、その表面の特性に構築される三次元ＤＮＡネットワークの構造が影響される。そこで、基板として、所望の表面特性を有するものを選択することで、構築される三次元ＤＮＡネットワークの構造を制御することができる。
このような基板は、ＤＮＡ固定化因子として作用することができ、このような基板を用いた場合には、上述したようなＤＮＡ固定化因子の添加混合を省略することもできる。
また、２枚の基板間にスペーサを配置したり、溶液の表面張力と基板間に加える圧力のバランスを制御することにより基板間の間隔を制御することできる。そして、この基板間間隔を制御することによって、基板間に構築されるＤＮＡネットワークのネットワーク長を制御することができる。
例えば、基板間を広めにするなどによって、前記ネットワークの紐状のＤＮＡは、引き延ばされた状態になる。
特に、本実施形態では、ネットワークの紐状のＤＮＡを、引き延ばされた状態にしている。このように、ＤＮＡネットワークが、ＤＮＡ紐の部分が引き延ばされた状態になっていることで、塩基対の方向とインターカレートさせた色素の方向が揃っている。この性質を利用して色素の励起光の変更面を制御することにより、ＤＮＡネットワークを三次元光スイッチング素子などに利用することができる。
また、ネットワーク連結点と、紐状のＤＮＡに色素をインターカレートしていることで、所望の光学特性を付与することができる。
図２には、上述のようにして、構築される三次元ＤＮＡネットワークをチェックする装置の構成が示してある。
レーザ光源からの所定波長のレーザ光は、１／２波長板（λ／２plate）または偏光解消板（depolarizer）を介し、入射側の対物レンズ（Objective lens）に入力される。ここで、１／２波長板は、入射光の直線偏光の偏光角を制御するものであって、この１／２波長板をレーザ光の入射方向に直交する面内で回転させることで、入射光の偏光角を任意に制御する。また、偏光解消板は、偏光した入射光を非偏光にするものであって、三次元ＤＮＡネットワークを観察するときに使用する。なお、レーザ光の波長は、ＤＮＡにインターカレートする色素を励起するのに好ましいものが選択される。例えば、色素としてCyanine DyeであるTOTO-1（商標）を用いた場合には、励起光として５１４ｎｍ程度が採用される。また、色素として、ethidinium bromideやSyber Green Iを用いる場合には、３００，５２０ｎｍや、２９０、３８０、４９５ｎｍの励起光をそれぞれ採用する。
対物レンズは、入射光をフォーカッシングするもので、その対物レンズからの射出光は、２枚のカバーガラス（Cover glass）間の所定の部位に照射される。なお、カバーガラスを移動することで、入射光の位置を調整する。
カバーガラス間には、上述のようにして得られる三次元ＤＮＡネットワークが形成されており、この三次元ＤＮＡネットワークの任意の場所に、任意の偏光角を持つ入射光がフォーカッシングされて照射される。
ここで、ＤＮＡには、上述のように色素をインターカレートしてあるため、照射光によって蛍光（fluorescence）が生じ、この蛍光は、検出側の対物レンズ（Objective lens）により、所定の平行光に直され、ダイクロイックミラー（Dichroic mirror）、フィルタ（Filter）を介し、色素によって決定される所定波長の蛍光（TOTO-1（商標）の場合の蛍光は、５３３ｎｍ程度）のみを取り出し、これがＣＣＤカメラ（ＣＣＤ）へ供給される。このように、この装置では、カバーガラス間の試料の蛍光顕微鏡による画像をＣＣＤカメラによって得ることができる。
そして、カバーガラスを二次元移動することによって、ＤＮＡネットワークにおける測定位置を二次元的に移動することができ、対物レンズの焦点位置によって、深さ方向の位置を調整でき、これによって三次元ＤＮＡネットワークの任意の位置の観察が行える。また、１／２波長板の回転によって、照射光の偏光角を調整することができる。
また、三次元ＤＮＡネットワークを構成（構築）する場として基板間以外に、基板上に構成することもできる。この場合、基板は三次元ＤＮＡネットワークの足場を提供し、この上部に三次元ネットワークが構成される。
手順は、次の通りである。
（１）ＤＮＡとＤＮＡ固定化因子を混合し、ＤＮＡを不溶化する。
例えば、多価陽イオンを含む電解質を加え、ＤＮＡを不溶化する。また、この段階で、予めＤＮＡに色素をインターカレートしておくと、色素で染色された三次元ＤＮＡネットワークを構築することもできる。
例えば、多価陽イオンを含む電解質を加え、ＤＮＡを不溶化する。また、この段階で、予めＤＮＡに色素をインターカレートしておくと、色素で染色された三次元ＤＮＡネットワークを構築することもできる。
（２）この基板上のＤＮＡを不溶化したＤＮＡの分散液を基板上に滴下する。
基板上にピペットを用いて、（１）の溶液を滴下する。
基板上にピペットを用いて、（１）の溶液を滴下する。
（３）基板上の溶液に、ネットワーク連結点構成因子を含む溶液をさらに滴下する。
ネットワーク連結点構成因子としては、例えばヒストンタンパク質がある。このヒストンタンパク質の溶液を、（２）と同様に基板上に滴下する。このとき、ネットワーク連結点構成因子の濃度を変えることにより、ネットワークの構造を制御することができる。例えば、ネットワーク連結点因子の濃度を高めるとネットワーク連結点の数が多くなるため、構築されるネットワークの網目が小さくなる。
ネットワーク連結点構成因子としては、例えばヒストンタンパク質がある。このヒストンタンパク質の溶液を、（２）と同様に基板上に滴下する。このとき、ネットワーク連結点構成因子の濃度を変えることにより、ネットワークの構造を制御することができる。例えば、ネットワーク連結点因子の濃度を高めるとネットワーク連結点の数が多くなるため、構築されるネットワークの網目が小さくなる。
（４）自己組織化による三次元ＤＮＡネットワークの構築が完了するまで放置する。
数十分間放置する。このとき、基板表面上で二次元ＤＮＡネットワークが構築されると同時に基板と垂直方向のネットワークも構築される。
数十分間放置する。このとき、基板表面上で二次元ＤＮＡネットワークが構築されると同時に基板と垂直方向のネットワークも構築される。
このような手順によっても、上述の基板間の場合と同様に、三次元ＤＮＡネットワークを構成することができる。
・実施例１
「三次元ＤＮＡネットワークの作製」
ＤＮＡとして、λＤＮＡ、ＤＮＡ固定因子として塩化カルシウムＣａＣｌ2、ネットワーク連結点構成因子としてヒストンタンパク質を用いて三次元ＤＮＡネットワークをガラス基板間に構築した。
「三次元ＤＮＡネットワークの作製」
ＤＮＡとして、λＤＮＡ、ＤＮＡ固定因子として塩化カルシウムＣａＣｌ2、ネットワーク連結点構成因子としてヒストンタンパク質を用いて三次元ＤＮＡネットワークをガラス基板間に構築した。
まず、色素（TOTO-1（商標）：Molecular Probes, Inc.）をインターカレートした濃度８．３ｎＭのλＤＮＡの溶液（TOTO-1：塩基=1:6, 3mM Tris-HCl (pH8.0), 0.1mM EDTAのバッファー）に多価陽イオンＣａＣｌ2を含む電解質を濃度が１７ｍＭになるように加えλＤＮＡを不溶化した。これを蛍光顕微鏡用の２枚のカバーガラス（ガラス基板）を重ねた隙間にしみ込ませた。次に、３×１０-6Ｍのヒストンタンパク質を含む溶液をカバーガラスの隙間にしみ込ませ、さらに自己組織化による三次元ＤＮＡネットワーク構築のため室温で３０分間放置した。
「観察結果」
このようにして得た試料について、偏光解消板を用いて観察した結果を図３に示す。この例では、２枚のカバーガラス（Cover slip）間の間隔を１０２．５μｍとして、カバーガラス間で複数の異なった深度で画像を得ている。すなわち、図における下側のガラス基板（位置（ｆ）：０μｍ）に対物レンズの焦点をあわせ、ガラス基板上に二次元ＤＮＡネットワークが構成されていることを確認した。次に、対物レンズの位置をもう上側ガラス基板の方向に徐々に移動させることで、位置（ｅ）：下から２０．５μｍ、位置（ｄ）：下から４１．０μｍ、位置（ｃ）：下から６１．５μｍ、（ｂ）：下から８２．０μｍでの画像を得、ＤＮＡの紐が三次元に伸びていることが確認された。そして、図における上側のガラス基板（位置（ａ）：１０２．５μｍ）に対物レンズの焦点をあわせ、上側ガラス基板上にも二次元ＤＮＡネットワークが構成されていることを確認した。これによって、一対のガラス基板上にそれぞれ形成されている二次元ＤＮＡネットワーク間がＤＮＡの紐で連結されて、三次元ＤＮＡネットワークが形成されていることが確認された。
このようにして得た試料について、偏光解消板を用いて観察した結果を図３に示す。この例では、２枚のカバーガラス（Cover slip）間の間隔を１０２．５μｍとして、カバーガラス間で複数の異なった深度で画像を得ている。すなわち、図における下側のガラス基板（位置（ｆ）：０μｍ）に対物レンズの焦点をあわせ、ガラス基板上に二次元ＤＮＡネットワークが構成されていることを確認した。次に、対物レンズの位置をもう上側ガラス基板の方向に徐々に移動させることで、位置（ｅ）：下から２０．５μｍ、位置（ｄ）：下から４１．０μｍ、位置（ｃ）：下から６１．５μｍ、（ｂ）：下から８２．０μｍでの画像を得、ＤＮＡの紐が三次元に伸びていることが確認された。そして、図における上側のガラス基板（位置（ａ）：１０２．５μｍ）に対物レンズの焦点をあわせ、上側ガラス基板上にも二次元ＤＮＡネットワークが構成されていることを確認した。これによって、一対のガラス基板上にそれぞれ形成されている二次元ＤＮＡネットワーク間がＤＮＡの紐で連結されて、三次元ＤＮＡネットワークが形成されていることが確認された。
ここで、図における明るいスポット上の点がネットワークの連結点であり、この連結点同士をＤＮＡが結んでいることが分かる。すなわち、図４に示すように、ＤＮＡの紐（ＤＮＡ bundle）が球状のヒストンタンパク質の連結点に絡まり、ＤＮＡとヒストンタンパク質の複合体（Complexes of DNA and histone）を構成しながら、三次元的に広がっている。
「三次元ＤＮＡネットワークの構造解析」
次に、入射光（励起光）の偏光面の角度（偏光角）を変えながら、カバーガラス間に構築されたTOTO-1色素をインターカレートした三次元ＤＮＡネットワークにおけるカバーガラス表面部分の蛍光強度像を二次元検出器（ＣＣＤカメラ）で記録した。なお、偏光角の調整は、λ／２波長板を回転させることによって行った。
次に、入射光（励起光）の偏光面の角度（偏光角）を変えながら、カバーガラス間に構築されたTOTO-1色素をインターカレートした三次元ＤＮＡネットワークにおけるカバーガラス表面部分の蛍光強度像を二次元検出器（ＣＣＤカメラ）で記録した。なお、偏光角の調整は、λ／２波長板を回転させることによって行った。
図５の上に得られた蛍光像を示す。四角で囲んだ領域Ａ〜Ｄの蛍光強度の励起光偏光面角度（偏光角）依存性を、図５の下に示す。領域Ａ〜Ｃは、二次元ＤＮＡネットワークの紐の部分、領域Ｄは、ネットワーク連結点の部分である。領域Ａ〜Ｃでは、偏光角依存性があるが、領域Ｄでは、偏光角依存性が消失していることが分かる。領域Ａ〜Ｃの偏光角依存性を高分子化学的な方法で解析したところ、ＤＮＡの塩基の向きが分子レベルで揃っていることが分かった。領域Ｄの連結点は、ヒストンタンパク質にλＤＮＡが結合して、λＤＮＡが糸巻きのようにヒストンタンパク質の回りに巻き付いた構造になり、λＤＮＡの塩基の方向がバラバラになって偏光角依存性が消失したものと考えられる。
「三次元ＤＮＡネットワークの構造制御」
ネットワーク連結点構成因子であるヒストンタンパク質の濃度を変えることにより、ネットワークの構造を制御した。具体的には、ヒストンタンパク質の濃度を上述の実施例１で用いた濃度の５倍に高めると、ネットワーク連結点の数が大きくなり、ネットワークの網目を小さくすることができた。この場合のガラス基板上のネットワークの蛍光像を図６に示す。
ネットワーク連結点構成因子であるヒストンタンパク質の濃度を変えることにより、ネットワークの構造を制御した。具体的には、ヒストンタンパク質の濃度を上述の実施例１で用いた濃度の５倍に高めると、ネットワーク連結点の数が大きくなり、ネットワークの網目を小さくすることができた。この場合のガラス基板上のネットワークの蛍光像を図６に示す。
従って、ネットワーク連結点構成因子の濃度を変更することで三次元ＤＮＡネットワークの構成を制御することできる。
・実施例２
この実施例２では、ＤＮＡとしてλＤＮＡを、ＤＮＡ固定化因子として塩化マグネシウムＭｇＣｌ2を、ネットワーク連結点構成因子としてヒストンタンパク質を用い、３次元ＤＮＡネットワークをガラス基板間で構成した。
この実施例２では、ＤＮＡとしてλＤＮＡを、ＤＮＡ固定化因子として塩化マグネシウムＭｇＣｌ2を、ネットワーク連結点構成因子としてヒストンタンパク質を用い、３次元ＤＮＡネットワークをガラス基板間で構成した。
ＣａＣｌ２を使用した場合と同様な手順でＭｇＣｌ２を用いて３次元ＤＮＡネットワークを基板間に構築し、これを蛍光顕微鏡により観察した（図７参照）。まず、１枚のガラス基板上に対物レンズの焦点を合わせ、基板上に２次元ＤＮＡネットワークが構成されていることを確認した（図７（ａ）参照）。対物レンズの位置をもう一枚のガラス基板の方向に徐々に移動させると、ガラス基板に対して垂直にＤＮＡの紐が構成され（図７（ｂ）参照）、もう一方のガラス基板上に構築された２次元ＤＮＡネットワーク（図７（ｃ）参照）までつながっていることを確認した（３次元ＤＮＡネットワーク）。明るいスポット状の点がネットワークの連結点で、その連結点同士をＤＮＡが結んでいる（図７において点線が連結点を結ぶＤＮＡであり、像が鮮明ではないのでアイガイドをつけた）。
・実施例３
この実施例３では、ＤＮＡとしてλＤＮＡを、ＤＮＡ固定化因子として塩化カルシウムＣａＣｌ2を、ネットワーク連結点因子としてヒストンタンパク質を用い、３次元ＤＮＡネットワークをガラス基板上で構成した。
この実施例３では、ＤＮＡとしてλＤＮＡを、ＤＮＡ固定化因子として塩化カルシウムＣａＣｌ2を、ネットワーク連結点因子としてヒストンタンパク質を用い、３次元ＤＮＡネットワークをガラス基板上で構成した。
まず、ＴＯＴＯ−１色素をインターカレートしたλＤＮＡの溶液（ＴＯＴＯ−１：塩基＝１：６）に多価陽イオンＣａＣｌ２を含む電解質を加えλＤＮＡを不溶化した。これを蛍光顕微鏡用のカバーガラス上にスポットした。次に、ヒストンタンパク質を含む溶液をＤＮＡの溶液をスポットした位置に上から滴下し、さらに自己組織化による３次元ＤＮＡネットワーク構築のため３０分間放置した。これを蛍光顕微鏡により観察した（図８参照）。まず、１枚のガラス基板上に対物レンズの焦点を合わせ、基板上に２次元ＤＮＡネットワークが構築されていることを確認した（図８（ａ）参照）。対物レンズの位置を上部に徐々に移動させると、ガラス基板に対して垂直にＤＮＡの紐が構成されていることを確認した（図８（ｂ）〜（ｅ）参照）（３次元ＤＮＡネットワーク）。明るいスポット状の点がネットワークの連結点で、その連結点同士をＤＮＡが結んでいる（図８（ａ）参照。連結点を結ぶＤＮＡの像が鮮明ではないのでアイガイドとして点線を付けた）。
「三次元ＤＮＡネットワークの利用」
上述のようにして得られる三次元ＤＮＡネットワークは、各種分野において利用が可能であるが、そのうちのいくつかを下に示す。
上述のようにして得られる三次元ＤＮＡネットワークは、各種分野において利用が可能であるが、そのうちのいくつかを下に示す。
（ｉ）電子デバイス：光スイッチングへの応用（電気伝導性の利用）
ＤＮＡは、塩基対の面がＤＮＡの軸に垂直になっており、それぞれの塩基対は隣りの塩基対とπ電子を重なり合わせている。この重なり合ったπ電子軌道を介してＤＮＡの軸方向の電子輸送が可能であり、ＤＮＡは半導体程度の電気伝導性を持つ。さらに、ＤＮＡに色素分子をインターカレートした場合、その色素を可視光などで電子励起するとＤＮＡの電気伝導性が高まるという報告がある。
ＤＮＡは、塩基対の面がＤＮＡの軸に垂直になっており、それぞれの塩基対は隣りの塩基対とπ電子を重なり合わせている。この重なり合ったπ電子軌道を介してＤＮＡの軸方向の電子輸送が可能であり、ＤＮＡは半導体程度の電気伝導性を持つ。さらに、ＤＮＡに色素分子をインターカレートした場合、その色素を可視光などで電子励起するとＤＮＡの電気伝導性が高まるという報告がある。
本実施形態の三次元ＤＮＡネットワークでは、上述したように、ネットワークの連結点から伸びるＤＮＡ紐の塩基対がＤＮＡ紐の伸びる方向と垂直に揃っている。ＤＮＡに色素をインターカレートし、偏光励起光を照射してある特定の方向に伸びたＤＮＡ紐にインターカレートした色素のみを電子励起することで、そのＤＮＡ紐の電気伝導性を高めることができる。この原理を利用して光スイッチングや電子輸送の制御がＤＮＡネットワーク上で可能になる。また、電子供与性、受容性化学種をそのネットワークにドープすることにより、その電気導電性を制御することもできる。
（ｉｉ）環境材料：遺伝子に作用する環境因子捕捉（ＤＮＡの吸着特性の利用）
遺伝子に作用する環境因子捕捉器として、ＤＮＡと脂質を混合し膜状に成形したＤＮＡフィルム、または二次元ＤＮＡネットワークを用いる方法が考案されている。これは、遺伝子に作用する環境因子がＤＮＡに吸着、インターカレートするものが多いことを利用したものである。ここで、フィルムも二次元ＤＮＡネットワークのいずれもＤＮＡが支持体に吸着した状態になっており、環境因子のＤＮＡ分子への接近が困難となり捕捉効率が悪くなるという欠点を有する。
遺伝子に作用する環境因子捕捉器として、ＤＮＡと脂質を混合し膜状に成形したＤＮＡフィルム、または二次元ＤＮＡネットワークを用いる方法が考案されている。これは、遺伝子に作用する環境因子がＤＮＡに吸着、インターカレートするものが多いことを利用したものである。ここで、フィルムも二次元ＤＮＡネットワークのいずれもＤＮＡが支持体に吸着した状態になっており、環境因子のＤＮＡ分子への接近が困難となり捕捉効率が悪くなるという欠点を有する。
一方、本実施形態に係る三次元ＤＮＡネットワークでは、基板表面に固定されているＤＮＡの他に、基板間の空間に固定されているものがある。そして、この基板間のＤＮＡには、環境因子の接近が容易である。従って、本実施形態に係る三次元ＤＮＡネットワークを利用して環境因子の捕捉効率を高めることができる。
（ｉｉｉ）医療用生体分子材料：ＤＮＡチップ（ＤＮＡの相補鎖とのハイブリダイゼーションの利用）
ＤＮＡチップとは、一群の遺伝子をガラス基板上にスポットしたものを指す。別の細胞、例えば発ガン細胞から用意した蛍光ラベルされた一群のＤＮＡをこのＤＮＡチップにハイブリダイゼーションさせる。特定のＤＮＡは決まった場所にスポットされたＤＮＡにハイブリダイゼーションするするため、スポット全体の蛍光パターンを正常細胞のそれと比較することにより、発ガン細胞に特有に発現している遺伝子を特定できる。
ＤＮＡチップとは、一群の遺伝子をガラス基板上にスポットしたものを指す。別の細胞、例えば発ガン細胞から用意した蛍光ラベルされた一群のＤＮＡをこのＤＮＡチップにハイブリダイゼーションさせる。特定のＤＮＡは決まった場所にスポットされたＤＮＡにハイブリダイゼーションするするため、スポット全体の蛍光パターンを正常細胞のそれと比較することにより、発ガン細胞に特有に発現している遺伝子を特定できる。
上述の環境材料の項で述べたことと同様に、基板に吸着したＤＮＡに対して相補鎖のハイブリダイゼーションの効率が低下するという問題があり、現在のＤＮＡチップ産業において、ＤＮＡの基板への固定法の開発が大きなテーマになっている。これを解決する手段として、ＤＮＡの一端を基板に固定し、残りの部分は溶液中に浮遊されておく方向も提案されている。
本実施形態の三次元ＤＮＡネットワークでは、基板間の空間にＤＮＡが固定されている。このため、相補鎖のハイブリダイゼーション効率が高まり、ＤＮＡチップの新しい製造法として利用できる。
（ｉｖ）工学材料：機能性材料の三次元空間への集積（ＤＮＡ上の反応の配列特異性の利用）
まず、ある配列を持ったＤＮＡに機能性材料、例えば触媒活性を有する金属微粒子やタンパク質などを連結させる。得られた機能性材料付きＤＮＡを三次元ＤＮＡネットワーク上の特定配列部分にハイブリダイゼーションさせ、機能性材料を設計通りの位置に三次元的に集積することが可能である。ＤＮＡ上の反応の配列特異性の利用して機能性材料を三次元空間に集積することができる。
まず、ある配列を持ったＤＮＡに機能性材料、例えば触媒活性を有する金属微粒子やタンパク質などを連結させる。得られた機能性材料付きＤＮＡを三次元ＤＮＡネットワーク上の特定配列部分にハイブリダイゼーションさせ、機能性材料を設計通りの位置に三次元的に集積することが可能である。ＤＮＡ上の反応の配列特異性の利用して機能性材料を三次元空間に集積することができる。
「その他の使用の態様について」
（ｉ）基板間に三次元ＤＮＡネットワークを構築した場合において、三次元ＤＮＡネットワークを構築した基板間に流路を形成する。この流路に反応液を流すことにより、三次元ＤＮＡネットワークに作用させる。例えば、環境因子捕捉においては、環境因子を含む溶液、ＤＮＡチップにおいては、蛍光標識した一群のＤＮＡを含む溶液、機能性材料の三次元空間への配置においては、機能性材料付きＤＮＡを含む溶液を流路に流す。
（ｉ）基板間に三次元ＤＮＡネットワークを構築した場合において、三次元ＤＮＡネットワークを構築した基板間に流路を形成する。この流路に反応液を流すことにより、三次元ＤＮＡネットワークに作用させる。例えば、環境因子捕捉においては、環境因子を含む溶液、ＤＮＡチップにおいては、蛍光標識した一群のＤＮＡを含む溶液、機能性材料の三次元空間への配置においては、機能性材料付きＤＮＡを含む溶液を流路に流す。
（ｉｉ）また、基板上面に三次元ＤＮＡネットワークを構築した場合には、（ｉ）における各反応液を上部から滴下して直接三次元ＤＮＡネットワーク作用させることができる。
「他のＤＮＡ固定因子、ネットワーク連結点構成因子について」
（ｉ）ＤＮＡ固定化因子としては、溶液中で負に帯電したＤＮＡを電気的に中性化し、ＤＮＡを不溶化する因子が利用できる。具体的には、多価陽イオンがあり、例えばＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ポリアミンなどが利用できる。
（ｉ）ＤＮＡ固定化因子としては、溶液中で負に帯電したＤＮＡを電気的に中性化し、ＤＮＡを不溶化する因子が利用できる。具体的には、多価陽イオンがあり、例えばＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ポリアミンなどが利用できる。
（ｉｉ）また、ＤＮＡは、基板表面に二次元的に広がって固定化され、これの基板表面もＤＮＡ固定化因子といえる。そこで、上述したようなＤＮＡ固定化因子を省略し、基板表面をＤＮＡ吸着特性を有するものすることができる。このような方法によっても、基板上にＤＮＡが吸着固定化され、これをベースとして三次元ＤＮＡネットワークが構築される。この場合も、１枚の基板上に三次元ＤＮＡネットワークを構築してもよいし、２枚の基板間に三次元ＤＮＡネットワークを構築してもよい。このような基板表面としては、ＤＮＡ吸着特性を有するものが好適であり、例えば疎水化表面（シランコーティング、雲母表面、マイカ、ＨＯＰＧ、ＳｉＯ2など）、正電荷表面（ポリ−Ｌ−リジンなど）がある。なお、このようなＤＮＡ固定化因子として機能する基板を上述のようなＤＮＡ固定化因子を添加混合した後の溶液に適用してもよい。
（ｉｉｉ）ネットワーク連結点構成因子としては、ＤＮＡに配列非特異的に結合または吸着し、さらに凝縮する性質を持つものが採用される。このようなものとして、ＤＮＡ結合タンパク質があり、例えばヒストン、t4 gene 32 protein などが利用される。
（ｉｖ）ネットワーク連結点構成因子の中で、ＤＮＡに配列非特異的に結合または吸着し、さらに凝縮する性質を持つものとして、金属微粒子がある。この金属微粒子としては、界面活性剤が被覆されていない金微粒子、白金微粒子などがあげられる。
「λＤＮＡ以外のＤＮＡについて」
（ｉ）使用するＤＮＡとしては、数ミクロン以上の長さを有するＤＮＡ（１本鎖でも２本鎖でもよい）が望ましい。λＤＮＡ以外には、例えば、M13mp8 single strand DNA（１本鎖）、バクテリオファージ T4GT7 ＤＮＡ（２本鎖）などがあげられる。
（ｉ）使用するＤＮＡとしては、数ミクロン以上の長さを有するＤＮＡ（１本鎖でも２本鎖でもよい）が望ましい。λＤＮＡ以外には、例えば、M13mp8 single strand DNA（１本鎖）、バクテリオファージ T4GT7 ＤＮＡ（２本鎖）などがあげられる。
（ｉｉ）遺伝子に作用する環境因子捕捉に関して、例えば、発ガン作用を有するタンパク質などの捕捉では、そのタンパク質が配列特異的に吸着することが知られている場合、その配列を多数繰り返したＤＮＡを、例えばλＤＮＡの中に組み込んで三次元ネットワークに構築する。すなわち、吸着対象タンパク質を特異的に吸着する配列を繰り返すＤＮＡを組み込んで三次元ＤＮＡネットワークを構築することが好適である。
（ｉｉｉ）遺伝子に作用する環境因子捕捉に関して、例えば、発ガン作用を有するタンパク質などの捕捉では、そのタンパク質が配列特異的に吸着することが知られている場合、その配列を多数繰り返したＤＮＡを、例えばλＤＮＡの中に組み込んでスポット状に三次元ネットワークを構築する。ＤＮＡライブラリーの中の多種類のＤＮＡに対してこのスポットを多数構築する。
（ｉｖ）機能性材料の三次元空間への集積に関して
機能性材料を順序や空間配置を設計した位置に集積する場合には、１つの配列を持ってＤＮＡに１つの機能性材料を対応させて結合させ、機能性材料の順序や空間配列に対応した塩基配列をもつＤＮＡの三次元ネットワークを構成する。
機能性材料を順序や空間配置を設計した位置に集積する場合には、１つの配列を持ってＤＮＡに１つの機能性材料を対応させて結合させ、機能性材料の順序や空間配列に対応した塩基配列をもつＤＮＡの三次元ネットワークを構成する。
「インターカレートする色素について」
ＤＮＡなどにインターカレートする色素としては、TOTO-1以外に、
YOYO-1, YOYO-3, TOTO-3,yo-1,T0-1,YO-3,TO-3,SYBR GreenI, SYBR GreenII, POPO-1, POPO-3, BOBO-1, BOBO-3
などが使用することができる。
ＤＮＡなどにインターカレートする色素としては、TOTO-1以外に、
YOYO-1, YOYO-3, TOTO-3,yo-1,T0-1,YO-3,TO-3,SYBR GreenI, SYBR GreenII, POPO-1, POPO-3, BOBO-1, BOBO-3
などが使用することができる。
Claims (8)
- 三次元的に広がりをもって点在する、ＤＮＡに配列非特異的に結合するとともに紐状のＤＮＡが絡みつく性状を持つネットワーク連結点構成因子と、紐状のＤＮＡがネットワーク連結点構成因子のまわりに巻き付くことで、ネットワーク連結点構成因子を連結点として、三次元的に広がる紐状のＤＮＡと、
を含む、
三次元ＤＮＡネットワーク。 - 請求項１に記載の三次元ＤＮＡネットワークにおいて、
前記ネットワーク連結点構成因子は、
ＤＮＡを凝縮する性質を持つ因子であることを特徴とする三次元ＤＮＡネットワーク。 - 請求項２に記載の三次元ＤＮＡネットワークにおいて、
前記ネットワーク連結点構成因子は、ヒストンタンパク質であることを特徴とする三次元ＤＮＡネットワーク。 - 請求項１〜３のいずれか１つに記載の三次元ＤＮＡネットワークにおいて、
前記ＤＮＡは、特定のタンパク質を吸着する配列を繰り返したＤＮＡであることを特徴とする三次元ＤＮＡネットワーク。 - 請求項１〜４のいずれか１つに記載の三次元ＤＮＡネットワークにおいて、
前記ＤＮＡは、λＤＮＡであることを特徴とする三次元ＤＮＡネットワーク。 - 請求項１〜５のいずれか１つに記載の三次元ＤＮＡネットワークにおいて、
前記ＤＮＡは、目的とする機能性材料の順序や空間配列に対応した塩基配列を持つことを特徴とする三次元ＤＮＡネットワーク。 - 請求項１〜６のいずれか１つに記載の三次元ＤＮＡネットワークにおいて、
前記ネットワークの紐状のＤＮＡは、引き延ばされた状態になっていることを特徴とする三次元ＤＮＡネットワーク。 - 請求項１〜７のいずれか１つに記載の三次元ＤＮＡネットワークにおいて、
前記ネットワーク連結点と、紐状のＤＮＡに色素をインターカレートしていることを特徴とする三次元ＤＮＡネットワーク。
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