JP2007506094A - サブストレート、製造方法、診断システム及び検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】分枝された部位の豊富な末端にサブストレートが結合されていて、線状の部位の末端は官能基化されている、分枝された部位及び線状の部位から構成された重合体からなる、均一なスペーサの分子の大きさが制御されたデンドリマー高分子の分子膜を含む、サブストレートの応用を開示する。
【選択図】図1
Description
詳しくは、前記巨大分子は、線状の部位の官能基間の間隔が約0.1nm乃至約100nmの規則的な間隔になるように分布する。
より詳しくは、前記巨大分子が約10nmの規則的な間隔で分布する。
図1は本発明の重合体の構造式Iを説明するための図である。多様なR、T、W、L、及びX基の変異体が図1に示されている。前記本発明の巨大分子の重合体は、分枝されたり、高度に分枝されたり、または対称か非対称の重合体を含む。前記重合体の分枝された末端は、好ましくは多数の末端を通してサブストレートに結合することができる。前記重合体の線状の末端は、保護基または標的特異的リガンドに結合することができる官能基を有することができる。前記サブストレート上の多数の重合体間のプローブ間の距離は、約0.1nm乃至約100nmであり、好ましくは約1nm乃至約100nm、より好ましくは約2nm乃至約70nm、より好ましくは約2nm乃至約60nm、最も好ましくは約2nm乃至約50nmである。
図1に記載された構造式Iによれば、前記重合体は、一般に分枝された部位を含み、多数の末端が官能基化されてサブストレートに結合する。前記分枝された部位内で、分枝の第1世代作用基Rx(R1、R2、R3)は、官能基Wによって分枝の第2世代作用基Rxx(R11、R12、R13、R21、R22、R23、R31、R32、R33)と連結されている。前記分枝の第2世代作用基は、官能基Wによって分枝の第3世代作用基Rxxx(R111、R112、R113、R121、R122、R123、R131、R132、R133、R211、R212、R213、R221、R222、R223、R231、R232、R233、R311、R312、R313、R321、R322、R323、R331、R332、R333)と連結されている。そして、追加的な第4世代作用基が同一な方式で分枝の第3世代作用基に連結されている。末端のR基は、サブストレートに結合することができるように官能基化されている。
末端基Tは、添加反応または置換反応が起こるようにするのに十分な反応性がある作用基である。このような作用基の例として、アミノ、ヒドロキシル、メルカプト、カルボキシル、アルケニル、アリル、ビニル、イミド、ハルロ、ウレア、オクシラニル、アジリジニル、オキサゾールリニール、イミダゾールリニール、スルホネート、ホスホネート、イソシアネート、イソチオシアネート、シラニル、及びハロゲニルなどを含むが、これに限定されない。
図1の構造式Iにおいて、Wは重合体を他のもの(または他の全ての2価有機モイアティ)に連結させることができる全ての作用基であり、エーテル、エステル、アミド、ケトン、ウレア、ウレタン、イミド、カルボネート、カルボン酸無水物、カルボジイミド、イミン、アゾ基、アミジン、チオカルボニル、有機スルフィド、ジスルフィド、ポリスルフィド、有機スルホキシド、サルファイト、有機スルホン、スルホンアミド、スルホン酸塩、有機スルフェート、アミン、有機ホスホロス基、アルキレン、アルキレンオキシド、アルキレンアミンなどを含むが、これに限定されない。
図1において、重合体の線状の部分は、任意に作用基が散在したリンカー部位を含むスペーサドメインを含む。リンカー部位は、多様な重合体から構成される。リンカーの長さは、多様な因子によって決定され、このような因子には、サブストレートに結合する分枝された作用基の数、サブストレートとの結合の長さ、使用されたR基の形態、特に使用された反復単位の形態、重合体の線状の部位の末端に結合する標的特異的リガンドまたは保護基の形態などがある。したがって、前記リンカーは、特定の類型の重合体または特定の長さに制限されないことが分かる。しかし、一般的な基準として、リンカーの長さは約0.5nm乃至約20nmであり、好ましくは約0.5nm乃至約10nm、最も好ましくは約0.5nm乃至約5nmである。
保護基の選択は、好ましい酸反応性または塩基反応性のような多数の因子によって異なる。したがって、本発明は、作用基が他の化学作用基と反応するのを防止する機能を提供し、所望の特定化された条件下で除去されるものである限り、いかなる特定の保護基にも限定されない。前記保護基は、容易に除去されるのが好ましい。本発明で使用されるこのような保護基の例として、下記のものを挙げることができるが、これに限定されない。
標的特異的リガンドは、プローブともいわれ、前記分枝型/線状の重合体の線状の末端に結合するようになる部分であって、化学物質、生化学物質、生活性化合物などの多様な化合物を含む。これと関連して、前記リガンドは、核酸、オリゴヌクレオチド、RNA、DNA、PNA、またはアプタマー(aptamer)である。前記オリゴヌクレオチドは、天然核酸またはその類似体である。したがって、前記リガンドは、天然アミノ酸または合成アミノ酸からなるポリペプチドである。前記リガンドは、核酸、アミノ酸、炭水化物、または分枝型/線状のポリマーの線状の部分に結合することができる他の全ての化学物質の組合わせである。特に、前記リガンドは、トリアジン骨格などに基づく化学物質であり、これは組合わせ的化学ライブラリー、特にトリアジン標識されたライブラリーの成分として使用されることができる。
サブストレートは、前記分枝型/線状の重合体が共有結合またはイオン結合によって結合することができる全ての固体表面を意味するものである。前記サブストレートは、前記分枝型/線状の重合体の分枝された末端間に結合が起こるように官能基化されたものである。前記サブストレートの表面は、本発明が属する技術分野における当業者の必要に応じて、多様な表面を有することができる。マイクロアレイまたはバイオチップフォーマットが要求される場合には、通常、酸化されたシリコンウエハー、融合シリカ、またはガラスをサブストレートとして使用することができる。前記サブストレートは、ガラススライドであるのが好ましい。サブストレートの他の例として、ニトロセルロースまたはナイロンのようなメンブレンフィルターを挙げることができるが、これに限定されない。前記サブストレートは、親水性または極性でありえ、コーティング前または後に負の電荷または正の電荷を帯びるものである。
DNAマイクロアレイの性能を向上させるために、プローブ設計、スポッティング間の反応条件、混成化及び洗浄条件、非特異的結合の抑制、生体分子(biomolecule)及び表面間の距離、及び固定化された生体分子間の空間などの因子が考慮されなければならない。これら因子の大部分は、マイクロアレイの表面の性質に関連するものであるため、マイクロアレイの研究において、表面最適化が主な目的になっている。Whitesell及びChangは、固定化されたオリゴペプチドのアルファ螺旋形成が空間制御された(space−controlled)金の表面で促進されることを示した[Whitesell et al.,Science 261,73−76(1993)]。
生物界で、p53腫よう抑制遺伝子は、細胞調節、遺伝子転写、ゲノム安定性、DNA修復、及び細胞死滅に重要な役割を果たす(Velculescu et al,1996,Clin.Chem.,42:858−868,Harris et al,1996,88:1442−1455、Sidransky et al,Annu,Rev.Med.,1996,47:285−301)。p53が本来の機能を喪失すると腫ようが誘導され、p53の変異は直腸癌及び肺癌のようなヒトの癌で最もありふれた遺伝的変異である(Greenblatt,1994,54:4855−4878)。
デンドロン改質サブストレートを使用して癌細胞株にあるp53腫よう抑制遺伝子の単一塩基変異を探知した。7つのホットスポットコドン(175、215、216、239、248、273、及び282)を含む標的DNAサンプル(200−400塩基対)をレンドンプライマ−法で腫よう細胞から抽出したDNAから増幅し、固定された7つのホットスポットに相応するキャプチャープローブ(オリゴヌクレオチド15〜25mer)と混成化した(図9a及び9b)。その結果、非常に優れたSNP区別効率を得た。
親和性クロマトグラフィーで幅広く利用されるクロマトグラフィー担体は、デキストリン及びアガロースのような天然ポリマーである。セファロース6B、4B、及び2Bは非常に低い非特異的結合率を有する架橋されたアガロースから構成されたクロマトグラフィー用物質である。前記物質が幅広く使用されるにもかかわらず、一般的なビーズ形態のアガロースゲルはいくつかの短所がある。例えば、前記物質の柔らかい性質によって流速(流出速度)が低く、著しく収縮して非可逆的であるため、凍結したり乾燥することができず、いくつかの有機溶媒に弱い(Cuatrecasas,P.J.Biol.Chem.1970,245、3059−3065;Kim et al.,Biochemistry2002,41,3414−3421)。これと比較して、調節された気孔を有するガラス(CPG)は、担体として多様な特別な特性を示す:1)機械的安定性、2)固定された3次元構造、つまり環境変化にも膨張したり収縮しない、3)pH1乃至pH14の条件で化学的安定性、4)広い範囲の親核性及び親電子性試薬に対する安定性、5)熱安定性、6)優れた流性(または溶出性)、7)容器表面に対する低い吸着性。追加的に、変型段階以降に洗浄を通して試薬及び副産物を迅速に除去することができる。このような全ての特性により、ゲル透過クロマトグラフィー、固体合成、親和性分離、その他の多様な分野で潜在的な有用性を提供する。
対照群として、サンプルAを製造した。デンドロンがないことを除いては、E1及びE3と実質的に同様な方法で、BUDGE、1,3−ジアミノプロパン、及びBUDGE提供表面物質に連続的に変型させた。エポキシド及びチオール間の開環反応を使用して、GSHを固定した。GMBSと呼ばれるヘテロバイオ官能性(heterobiofunctional)リンカーを使用して、また他の対照ビーズ(サンプルCL及びCS)を製造し、GSH及びAMCPGまたはLCAA−CPGと結合させた。AMPCPGは、表面にC3炭化水素から構成された短いアーム(arm)を有し、LCAA−CPGは、C15脂肪族鎖から構成された長いアームを有している。GMBSでアミドを形成した後に、ビーズをGSHで処理した。マレイミドグループにチオール基を添加することによって、炭素及び硫黄原子間に共有結合が形成された。前記二段階処理で共有結合を形成すれば、GSHが結合された、調節された気孔を有するガラスビーズ、つまりCS及びCLが得られた。
このような方法で得られたリガンドの密度は、E1に対して8.3μ mol/gであり、E3に対して5.6μ mol/gであった。前記密度は、Fmoc(3)酸で変型した場合に11.1倍ほど減少し、前記数値はより大きいデンドロンを使用すると1.5倍ほど追加的に減少する。したがって、本発明の具体的な例で、より小さなデンドロンはより大きなデンドロンより高い密度を得るのにより効果的である。
図12で、本発明の一例において、エーテル及びアミドグループが構造の主要骨格を形成し、デンドロンの固定によって再びアミド結合が生成される。また、デンドロンの広い範囲も成功した重要な因子である。
E1のリガンドの密度はE3より1.48倍高い。言い換えれば、E1は148%のリガンド濃度を記録した(表3)。2種類のビーズの結合効率性を試験するために、各サンプルごとに同じ数のGSHを有するようにサンプル質量を調節した。密度測定器によれば、2種類の場合のリガンドの利用度は非常に近接した(29%、31%)。E3のより広い空間化は、GSTの結合効率性を向上させることができず、これは、恐らく実験対象蛋白質がE1及びE3の空間化より大きかったためであろう。
要約すれば、デンドロン改質マトリクスは、市販されるマトリクス(例:セファロース4B)程度の高い敏感度を示し、市販製品とほぼ同一な程度の分子量依存性を示す。AMPCPGマトリクスにデンドロンを導入することによって、非特異的結合を効果的に減少させるだけでなく、GSHの結合力を維持する。蛋白質分子量の増加に比例して、結合力が一定に減少することを観察し、このような現象は、固定化されたGSH間の規則的な間隔と一致すると考えられる。間隔の調節が容易であるだけでなく、機械的安定性、多様な化学的環境との広い両立性、及び予想される多様な応用が容易であるなど、多様な利点がある。
実施例1で、図2に示したように、名称(designations)I、II、III、IV、及びVは、図2に示した多様な化合物及び中間体化合物を指すものである。
シランカップリング剤である(3−グリシトキシプロピル)メチルジエトキシラン(GPDES)及び(3−アミノプロピル)ジエトキシメチルシラン(APDES)は、ゲレスト社(Gelest,Inc.)から購入し、他の化合物は、シグマ−アルドリッチ社から試薬級で購入した。シリル化(silylation)用反応溶媒は、アルドリッチ社から購入した無水物である(Sure/Seal bottles)。サブストレートに対する全ての洗浄溶媒は、マリンクロッド試薬製造会社(Mallinckrodt Laboratory Chemicals)からHPLC級で購入した。UV級ヒュームドシリカプレート(30mm×10mm×1.5mm)は、CVIレーザー有限会社(CVI Laser Corporation)から購入した。研磨された1級Siウエハー(100)(dopant,phosphorus;resistivity、1.5−2.1Ω.cm)は、MEMC電子材料会社(MEMC Electronic Materials,Inc)から購入した。ガラススライド(2.5×7.5cm)は、コーニング社(Corning Co)から購入した。オリゴヌクレオチドは、全てメタバイオン(Metabion)から購入した。超純水(Ultrapure water)(18MΩ.cm)は、Milli−Q精製システム(Millipore)から得た。
フィルムの厚さは、エリプソメータ(ellipsometer)分光器(J.A.Woollam Co.Model M−44)で測定した。UV−visスペクトルは、ヒューレットパッカード社の分光光度計(Hewlett−Packard diodearray 8453 spectrophotometer)で測定した。タッピングモードAFM実験(Tapping mode AFM experiments)は、‘E’類型スキャナーを有するナノスコープIIIa AFM(Digital Instruments)装備を使用して行った。
シリコンウエハー、ヒュームドシリカ、ガラススライドのようなサブストレートはピラニア溶液(Piranha solution、濃度H2SO4:30% H2O2=7:3(v/v))に浸して、前記溶液及びサブストレートを含む反応容器を1時間超音波処理した(注意事項:ピラニア溶液は爆発性の有機物質を酸化させることがある。したがって、酸化性物質の接触は避ける)。超音波処理した後、過量の脱イオン水を使用してプレートを洗浄してすすいだ。洗浄されたサブストレートは、次の段階のために30−40mTorrの真空チャンバで乾燥した。
前記洗浄されたサブストレートは、1.0mlの3−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン(GPDES)が溶解した160mlのトルエン溶液に10時間浸漬した。自己組立て(self−assembly)反応を行った後、サブストレートをトルエンで簡単に洗浄してから、オーブンに入れて110℃で30分間加熱した。プレートは、トルエン、トルエン−メタノール(1:1(v/v))、及びメタノールで順次に各洗浄段階で3分間超音波処理した。前記洗浄されたプレートは、真空チャンバ(30−40mTorr)で乾燥した。GPDES改質されたサブストレートは、95%の硫酸を2−3滴添加した純粋なエチレングリコール(EG)溶液に80乃至100℃で8時間浸漬した。冷却した後、前記サブストレートは、エタノール及びメタノールで順次に各々3分間超音波処理した。洗浄されたサブストレートは真空チャンバ(30−40mTorr)で乾燥した。
前記水酸化されたサブストレートは、4−ジメチルアミノピリジン(DMAP)(0.82mM)存在下でデンドロン(1.2mM)及びカップリング剤である1−[−3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカルボジイミドヒドロクロライド(EDC)または1,3−ジサイクルロヘキシルカルボジイミド(DCC)(11mM)を溶解したメチレンクロライド溶液に浸した。室温で3日後、前記プレートをメタノール、水、及びメタノールで順次に各々3分間超音波処理した。次の段階のために、前記洗浄されたプレートは真空チャンバ(30−40mTorr)で乾燥した。
前記デンドロン改質サブストレートは、1.0Mのトリフルオロ酢酸(TFA)が含まれているメチレンクロライド溶液に浸した。3時間後、20%(v/v)のジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)が含まれているメチレンクロライド溶液に10分間の浸漬した。前記プレートは、メチレンクロライド及びメタノールで各々3分間超音波処理した。その後、真空チャンバで乾燥して、非保護されたサブストレートをジ(N−スクシンイミジル)カーボネート(DSC)(25mM)及びDIPEA(1.0mM)が含まれているアセトニトリル溶液で反応させた。窒素雰囲気下で4時間反応させた後、前記プレートをジメチルホルムアミド溶液で30分間定置して、メタノールで簡単に洗浄した。洗浄されたプレートは、次の段階のために、真空チャンバ(30−40mTorr)で乾燥した。
50mMのNaHCO3緩衝溶液(pH8.5)に溶解されたプローブオリゴヌクレオチドは、NHS改質サブストレート上に4フォーマットによって4つに並べてスポットした。アミン化されたDNA(the amine−tethered DNA)に十分な反応時間を保障するために、マイクロアレイは、湿度チャンバ(80%湿度)で12時間反応させた。スライドは、混成化(hybridization)緩衝溶液(7.0mMのソジウムドデシルスルフェートを含む2×SSPE緩衝溶液(pH7.4))で37℃で1時間攪拌した後、5分間沸騰した水に攪拌して、非特異的に結合されたオリゴヌクレオチドを除去した。最終的に、DNA官能基化(DNA−functionalized)マイクロアレイは、次の段階のために、窒素雰囲気下で乾燥した。完全な比較のために、多様な種類のプローブを前記単一プレートにスポットした。
混成化は、GeneTACTM HybStation(Genomic Solutions,Inc.)を利用して、Cy3蛍光染料を使用した標的オリゴヌクレオチド(1.0nM)標識化を含む混成化緩衝溶液で50℃で1時間行った。マイクロアレイは、混成化緩衝溶液を使用してすすいで標的オリゴヌクレオチドを除去した後、窒素を使用して乾燥させた。各スポット上の蛍光信号はScanArray Lite(GSI Lumonics)を利用して測定し、Imagene4.0(Biodiscovery)で結果を分析した。
≪実施例1.9.1:9−アントリルメチルN−(3−カルボキシルプロピル)カバーメイト(I)(化合物I)の製造≫
4−アミノブチリクサン(0.50g、4.8mmol、1.0equiv)及びトリエチルアミン(TEA)(1.0ml、7.3mmol、1.5equiv)をN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解して、50℃で攪拌した。前記溶液に9−アントリルメチルp−ニトロフェニルカーボネート(1.81g、4.8mmol、1.0equiv)を攪拌しながら徐々に添加した。50℃で2時間攪拌した後、溶液を蒸発させて乾燥させて、0.50Nの水酸化ナトリウム溶液(NaOH)で塩基化させた。水溶液は、酢酸エチル(EA)で洗浄して、氷槽で攪拌した後、希薄な塩酸(HCI)で酸性化させた。生成物はEAで抽出し、有機溶液を無水MgSO4で乾燥させてろ過してから、溶媒を蒸発させた。最終の黄色粉末の総量は1.06gであり、収率は65%であった。
1H NMR(CDCl3)
δ 11.00-9.00(br, CH2COOH, 1 H), 8.41 (s, C14H9CH2, 1 H), 8.31 (d, C14H9CH2, 2H), 7.97 (d, C14H9CH2, 2H), 7.51 (t, C14H9CH2, 2H), 7.46(t, C14H9CH2, 2H), 6.08(s, C14H9CH2O, 2H), 5.01 (t, OCONHCH2,1 H), 3.23(q, NHCH2CH2, 2H), 2.34(t, CH2CH2COOH, 2H), 1.77(m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(CDCl3)
δ 178.5(CH2COOH), 157.9(OCONH), 132.1 (C14H9CH2), 131.7(C14H9CH2), 129.7(C14H9CH2), 129.7(C14H9CH2), 127.3(C14H9CH2), 126.8(C14H9CH2), 125.8( C14H9CH2), 124.6( C14H9CH2), 60.2(C14H9CH2), 41.0(NHCH2CH2), 31.7(CH2CH2COOH),25.6(CH2CH2CH2).
9−アントリルメチルN−(3−カルボキシルプロピル)カバーメイト(0.65g、1.93mmol、1.5equiv)、1−[3−(ジメチルアミノ)プロピル]−3−エチルカーボジイミドヒドロクロライド(EDC)(0.37g、1.93mmol、1.5equiv)、及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾールハイドレート(HOBT)(0.261g、1.93mmol、1.5equiv)をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。アセトニトリルに溶解されたトリス{[(メトキシカルボニル)エトキシ]メチル}アミノメタン(0.49g、1.29mmol、1.0equiv)を攪拌しながら前記溶液に添加した。室温で12時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。粗生成物(crude product)はEAに溶解して、1.0NのHCl及び飽和ソジウムバイカーボネート溶液で洗浄した。無水MgSO4で乾燥させてろ過した後、溶媒を蒸発させ、粗生成物をシリカゲルが充填されたコラムにローディングして、コラムクロマトグラフィー(展開溶媒:エチルアセテート:ヘキサン=5:1(v/v))で精製して、粘性の黄色液体を得た。黄色液体の総量は0.67gであった(収率74%)。
1H NMR(CDCl3)
δ 8.43(s, C14H9CH2, 1 H), 8.36(d, C14H9CH2, 2H), 7.99 (d, C14H9CH2, 2H), 7.53(t, C14H9CH2, 2H), 7.47(t, C14H9CH2, 2H), 6.15(s, CONHC, 1H), 6.08(s, C14H9CH2O, 2H), 5.44(t, OCONHCH2,1 H), 3.63-3.55(m, CH2OCH2CH2COOCH3, 21 H), 3.27(q, NHCH2CH2, 2H), 2.46(t, CH2CH2COOCH3, 6H), 2.46(t, CH2CH2CONH, 2H), 1.81 (m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(CDCl3)
δ173.2(CH2CONH), 172.7(CH2COOCH3), 157.4(OCONH), 132.9(C14H9CH2),
131.5(C14H9CH2), 129.5(C14H9CH2), 129.4(C14H9CH2}, 127.5(C14H9CH2), 127.0(C14H9CH2), 125.6(C14H9CH2), 124.7(C14H9CH2), 69.6(NHCCH2O), 67.2(C14H9CH2), 60.1 (OCH2CH2), 59.4(NHCCH2), 52.1(OCH3), 40.8(NHCH2CH2), 35.1 (OCH2CH2), 34.7(CH2CH2CONH), 26.3(CH2CH2CH2).
Anal. Calcd for C36H46N2O12 .0.5 H2O: C 61.18, H 6.65, N 4.03; Found: C61.09, H 6.69, N 3.96.
9−アントリルメチルN−{[(トリス{[2−(メトキシカルボニル)エトキシ]メチル}メチル)アミノ]カルボニル}プロピルカーボネート(0.67g、0.93mmol)をアセトン(30ml)及び0.20 NNaOH(30ml、6mmol)に溶解した。室温で1日攪拌した後に、アセトンを蒸発させた。得られた水溶液はEAを使用して洗浄して、氷槽で攪拌しながら希薄な塩酸で酸性化させた。生成物はEAを使用して抽出し、有機溶液は無水MgSO4で乾燥してろ過した後、溶媒を蒸発させた。生成物は−20℃でアセトン及びエーテルで固体化して、黄色粉末を得た。得られた薄い黄色粉末の最終量は0.54gであった(収率88%)。
1H NMR(CDCl3)
δ 11.00-9.00(br, CH2COOH, 3H}, 8.61(s, C14H9CH2, 1H}, 8.47(d, C14H9CH2, 2H), 8.11 (d, C14H9CH2, 2H), 7.60(t, C14H9CH2, 2H}, 7.52(t, C14H9CH2, 2H), 6.63(s, CONHC, 1 H), 6.36(t, OCONHCH2, 1 H), 6.12(s, C14H9CH2O, 2H). 3.40-363(m, CH2OCH2CH2COOH, 12H), 3.20(q, NHCH2CH2, 2H), 2.52(t, CH2CH2COOH, 6H), 2.17(t, CH2CH2CONH, 2H), 1.75(m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(CDCl3)
δ 172.2(CH2COOH), 172.0(CH2CONH), 156.7(OCONH), 131.2(C14H9CH2), 130.7(C14H9CH2), 128.6(C14H9CH2), 128.4(C14H9CH2), 127.3(C14H9CH2), 126.2(C14H9CH2), 124.8(C14H9CH2), 124.0(C14H9CH2), 68.6(NHCCH2O), 66.5(C14H9CH2), 59.5(OCH2CH2), 58.0(NHCCH2), 40.0(NHCH2CH2), 34.0(OCH2CH2), 33.5(CH2CH2CONH), 25.8(CH2CH2CH2).
Anal. Calcd for C33H40N2O12 .1.5 H2O: C 57.97, H 6.34, N 4.10; Found: C 57.89, H 6.21, N 4.09.
9−アントリルメチルN−[({トリス[(2−カルボキシエトキシ)メチル]メチル}アミノ)カルボニル]プロピルカバーメイト(0.54g、0.82mmol、1.0equiv)、EDC(0.55g、2.87mmol、3.5equiv)、及びHOBT(0.39g、2.89mmol、3.5equiv)をアセトニトリルに溶解して、室温で攪拌した。その後、アセトニトリルに溶解したトリス{[(メトキシカルボニル)エトキシ]メチル}アミノメタン(0.96g、2.53mmol、3.1equiv)を攪拌しながら前記溶液に添加した。室温で36時間攪拌した後、アセトニトリルを蒸発させた。前記粗生成物をEAに溶解して、1.0NのHCLで洗浄して、重炭酸ナトリウム溶液で飽和させた。無水MgSO4で乾燥、ろ過、及び蒸発させた後に、前記粗生成物をシリカゲルが充填されたコラムにローディングした。コラムを利用して精製(展開溶媒:酢酸エチル:メタノール=20:1(v/v))した結果、粘性の黄色液体が得られた。前記黄色液体の総重量は1.26gであった(88%収率)。
1H NMR(CDCl3)
δ 8.47(s, C14H9CH2, 1 H), 8.39(d, C14H9CH2, 2H), 8.02 (d, C14H9CH2, 2H), 7.53(t, C14H9CH2, 2H), 7.47(t, C14H9CH2, 2H), 6.60(s, CH2CH2CH2CONHC, 1 H), 6.13(s, OCH2CH2CONHC, 3H), 6.11 (s, C14H9CH2O, 2H), 5.79(t, OCONHCH2,1 H), 3.65-3.60(m, CH2OCH2CH2CONH, CH2OCH2CH2COOCH3, 75H), 3.29(q, NHCH2CH2, 2H), 2.50(t, CH2CH2COOCH3, 18H), 2.36(t, OCH2CH2CONH, 6H), 2.27(t, CH2CH2CH2CONH, 2H), 1.85(m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(CDCl3)
δ 173.3(OCH2CH2CONH), 172.5(CH2CH2CH2CONH), 171.6(CH2COOCH3), 157.2(OCONH), 131.8(C14H9CH2), 131.5(C14H9CH2), 129.4(C14H9CH2), 129.3(C14H9CH2), 127 .6(C14H9CH2), 127.0(C14H9CH2), 125.6(C14H9CH2), 124.7(C14H9CH2), 69.5(NHCCH2OCH2CH2COOCH3), 67.9(NHCCH2OCH2CH2CONH), 67.2(C14H9CH2), 60.3(OCH2CH2CONH), 60.2(OCH2CH2COOCH3), 59.2(NHCCH2OCH2CH2COOCH3, NHCCH2OCH2CH2CONH), 52.1(OCH3), 41.0(NHCH2CH2), 37.6(OCH2CH2CONH), 35.1(OCH2CH2COOCH3), 34.7(CH2CH2CH2CONH), 26.3(CH2CH2CH2).
Anal. Calcd for C81H121N5O36 .H2O: C 55.31, H 7.05, N 3.98; Found: C 55.05, H 7.08, N 4.04.
MALDI- TOF-MS: 1763.2 (MNa+), 1779.2 (MK+).
9−アントリルメチルN−[({トリス[(2−{[(トリス{[2−(mエトキシカルボニル)エトキシ]メチル}メチル)アミノ]カルボニル}エトキシ)メチル]メチル}アミノ)カルボニル]プロピルカバーメイト(0.60g、0.34mmol)をアセトン(30ml)及び0.20NのNaOH(30ml)に溶解した。室温で1日攪拌した後、アセトンを蒸発させた。得られた水溶液はEAを使用して洗浄して、氷槽で攪拌しながら希薄な塩酸で酸性化させた。生成物はEAを使用して抽出し、有機溶液を無水MgSO4で乾燥してろ過した後、溶媒を蒸発させた。得られた黄色粉末の最終量は0.37gであった(収率68%)。
1H NMR(DMSO)
δ 13.00-11.00(br, CH2COOH, 9H), 8.66(s, C14H9CH2, 1 H), 8.42(d, C14H9CH2, 2H), 8.13 (d, C14H9CH2, 2H), 7.62(t, C14H9CH2, 2H), 7.54(t, C14H9CH2, 2H), 7.12(t, OCONHCH2, 1H), 7.10(s, OCH2CH2CONHC, 3H), 7.06(s, CH2CH2CH2CONHC, 1 H), 6.06(s, C14H9CH2O, 2H), 3.57-3.55(m, CH2OCH2CH2CONH, CH2OCH2CH2COOH,48H), 3.02(q, NHCH2CH2, 2H), 2.42(t, CH2CH2COOH, 18H), 2.32(t, OCH2CH2CONH, 6H), 2.11(t, CH2CH2CH2CONH, 2H), 1.60(m, CH2CH2CH2, 2H).
13C NMR(DMSO)
δ 172.8(CH2COOH), 172.2(CH2CH2CH2CONH), 170.5(OCH2CH2CONH), 156.5(OCONH), 131.0(C14H9CH2), 130.6(C14H9CH2), 129.0(C14H9CH2), 128.7(C14H9CH2), 127.6(C14H9CH2), 126.7(C14H9CH2), 125.4(C14H9CH2), 124.3(C14H9CH2), 68.3(NHCCH2OCH2CH2COOH), 67.4(NHCCH2OCH2CH2CONH), 66.8(C14H9CH2), 59.8(OCH2CH2COOH), 59.6(OCH2CH2CONH), 57.9(NHCCH2OCH2CH2CONH), 55.9(NHCCH2OCH2CH2COOH), 36.4(NHCH2CH2), 34.6(OCH2CH2COOH), 30.8(OCH2CH2CONH), 29.7(CH2CH2CH2CONH), 25.9(CH2CH2CH2).
実施例2で、多様な名称の化合物は、化合物1、2などと命名した。まず、スペーサである6−アジドヘクシルアミン(1)は、1,6−ジブロモヘキサンから下記に示す文献の方法(Lee,J.W.;Jun,S.I.;Kim,K.Tetrahedron Lett.,2001,42,2709)によって合成した。
トリホスジン(Triphosgene)(1.3g、4.3mmol)を無水CH2Cl2(20mL)に溶解した。無水CH2Cl2(35mL)に溶解された6−アジドヘキシルアミン(1)(1.6g、12mmol)及びN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA、2.4mL、13.8mmol)の混合物をシリンジポンプを利用して7時間以上の周期で前記撹拌されたトリホスジン溶液に滴下して添加した。2時間さらに攪拌した後、無水CH2Cl2(20mL)に溶解された前記化合物(2)(6.4g、13mmol)及びDIEA(2.7mL、15.2mmol)の溶液を添加した。反応混合物は窒素雰囲気下で室温で4時間攪拌して、0.5MのHCl及び塩を使用して洗浄した。有機層は無水MgSO4で乾燥した後、溶媒は蒸発させて除去した。コラムクロマトグラフィーを使用した精製(silica,1:1 EtOAc/hexane)で、無色オイルを得た(3.0g、40%)。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ1.45 (s, (CH3)3C, 27H); 1.36-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.46 (t, CH2CH2O, J = 6.4 Hz, 6H), 3.13 (m, CONHCH2, 2H), 3.26 (t, N3CH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.64-3.76 (m, CCH2O and CH2CH2O, 12H); 5.00 (t, CH2NHCO, J=6.7 Hz, 1H), 5.29 (s, CONHC, 1H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.52, 26.54, 28.81, 30.26 (CH2CH2CH2CH2); 28.14((CH3)3C); 36.20 (CH2CH2O); 39.86 (CONHCH2); 51.40 (N3CH2); 58.81 (CCH2O); 67.16 (CH2CH2O); 69.23 (CCH2O); 80.58 ((CH3)3C); 157.96 (NHCONH); 171.26 (COOt-Bu).
FAB-MS: 674.26 (M+).
N3−スペーサ−[3]エステル(3)(0.36g、0.56mmol)を24時間6.6mLの96%ホルム酸で攪拌した。ホルム酸は、50℃で減圧によって除去して、定量的な(quantitative)収率で無色オイルを製造した。
1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz): δ 1.34-1.60 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.53 (t, CH2CH2O, J = 6.4 Hz, 6H), 3.07 (t, CONHCH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.32 (t, N3CH2, J = 6.9 Hz, 2H), 3.67-3.73 (m, CCH2O and CH2CH2O, 12H).
13C NMR (CD3COCD3, 75 MHz): δ 27.21, 29.54, 31.02 (CH2CH2CH2CH2); 35.42 (CH2CH2O); 40.27 (CONHCH2); 52.00 (N3CH2); 59.74 (CCH2O); 67.85 (CH2CH2O); 70.96 (CCH2O); 158.96 (NHCONH); 173.42 (COOH).
FAB-MS: 506.19 (MH+).
HOBt(0.20g、1.5mmol)、DIEA(0.30mL、1.8mmol)、及びEDC(0.33g、1.8mmol)を乾燥アセトニトリル5.0mLに溶解した前記化合物(4)(0.25g、0.50mmol)に添加した。その後、乾燥アセトニトリル2.5mLに溶解したアミン(2)(1.14g、2.3mmol)を添加して、反応混合物を48時間N2下で攪拌した。溶媒を減圧で除去した後、残余物をMCに溶解して、0.5MのHCl及び塩で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥させた後、溶媒を真空で除去して、コラムクロマトグラフィー(SiO2、2:1EtOAc/hexane)で精製して、無色オイルを得た(0.67g、70%)。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ1.45 (s, (CH3)3C, 81H); 1.36-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.40-2.47 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H), 3.13 (m, CONHCH2, 2H), 3.26 (t, N3CH2, 6.9 Hz, 2H), 3.62-3.69 (m, CCH2O gen. 1 & 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 5.36 (t, CH2NHCO, J=6.7 Hz, 1H), 5.68 (br, CONHC, 1H), 6.28 (br, amide NH, 3H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.59, 26.69, 28.91, 30.54 (CH2CH2CH2CH2); 28.22 ((CH3)3C); 36.20 (CH2CH2O gen. 2); 37.43 (CH2CH2O gen. 1); 39.81 (CONHCH2); 51.47 (N3CH2); 58.93 (CCH2O gen. 1); 59.89 (CCH2O gen. 2); 67.15 (CH2CH2O gen. 2); 67.68 (CH2CH2O gen. 1); 69.23 (CCH2O gen. 2); 70.12 (CCH2O gen. 1); 80.57 ((CH3)3C); 158.25 (NHCONH); 171.01 (COOt-Bu) 171.41 (CONH amides).
MALDI-MS: 1989.8 (MNa+), 2005.8 (MK+).
エタノール(20.0mL)に溶解されたノナ−tert−ブチルエステル(4.1)(0.37g、0.20mmol)を10%Pd/C(37.0mg)と共にH2下で室温で12時間攪拌した。TLCで反応の終了を確認した後、混合物を0.2mmのミリポア(Millipore)フィルターでろ過した。ろ過紙をCH2Cl2ですすいだ後、混合された溶媒を真空で除去して、無色オイルを得た。
アミン(4.2)(0.33g、0.17mmol)及びDIEA(33mL、0.19mmol)を5.0mLのCH2Cl2に溶解して、窒素雰囲気下で30分間攪拌した。2.0mLのCH2Cl2に溶解した9−フルオレニルメチルクロロホメイト(48mg、0.19mmol)を添加して、反応混合物を室温で3時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去して、0.5MのHCl及び塩で洗浄した(0.18g、64%)。残余物をコラムクロマトグラフィー(silica、EtOAc)で精製して、無色オイルを得た。
1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ 1.45(s, (CH3)3C, 81H); 1.23-1.58 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.37-2.47 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H); 3.10-3.22 (m, CONHCH2, 4H); 3.62- 3.70 (m, CCH2O gen. 1 & 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 4.22 (t, CH(fluorenyl)-CH2, J=7.1 Hz, 1H); 4.36 (d, fluorenyl-CH2, J=7.1 Hz, 2H); 5.27-5.35 (m, CH2NHCO, 2H); 5.67 (br, CONHC, 1H); 6.25 (br, amide, 3H); 7.28 -7.77 (fluorenyl, 8H).
13C NMR (CDCl3, 75 MHz): δ 26.85, 27.02, 30.27, 30.88 (CH2CH2CH2CH2); 28.49 ((CH3)3C); 36.48 (CH2CH2O gen. 2); 37.73 (CH2CH2O gen. 1); 40.03, 41.34 (CONHCH2); 47.68 (CH(fluorenyl)-CH2); 59.22 (CCH2O gen. 1); 60.16 (CCH2O gen. 2); 66.87 (fluorenyl-CH2); 67.43 (CH2CH2O gen. 2); 67.98 (CH2CH2O gen. 1); 69.52 (CCH2O gen. 2); 70.42 (CCH2O gen.1); 80.84 ((CH3)3C); 120.28, 125.52, 127.38, 127.98, 141.65, 144.48 (fluorenyl); 156.88 (OCONH); 158.52 (NHCONH); 171.27 (COOt-Bu) 171.65(amide CONH).
MALDI-MS : 2186.8 (MNa+), 2002.8 (MK+).
保護基を有するノナ−tert−ブチルエステル(4.3)(0.12g、72mmol)を18時間10mLの96%ホルム酸で攪拌した。ホルム酸は、50℃で減圧して除去して、定量的な(quantitative)収率で無色オイルを製造した。
1H NMR (CD3COCD3, 300 MHz): δ 1.23-1.51 (m, CH2CH2CH2CH2, 8H); 2.44-2.58 (m, CH2CH2O gen. 1 & 2, 24H); 3.15-3.18 (m, CONHCH2, 4H); 3.61-3.75 (m, CCH2O gen. 1 & 2, CH2CH2O gen. 1 & 2, 48H); 4.23 (t, CH(fluorenyl)-CH2, J=7.0 Hz, 1H); 4.35 (d, fluorenyl-CH2, J=7.0 Hz, 2H); 5.85, 6.09 (br, CH2NHCO, 2H); 6.57 (br, CONHC, 1H); 6.88 (br, amide NH, 3H); 7.31-7.88 (fluorenyl, 8H).
13C NMR (CD3COCD3, 75 MHz): δ 27.21, 27.33, 30.69, 30.98 (CH2CH2CH2CH2); 35.31 (CH2CH2O gen. 2); 37.83 (CH2CH2O gen. 1); 40.56, 41.54 (CONHCH2); 48.10 (CH(fluorenyl)-CH2); 59.93 (CCH2O gen. 1); 61.10 (CCH2O gen. 2); 66.86 (fluorenyl-CH2); 67.81 (CH2CH2O gen. 2); 68.37 (CH2CH2O gen. 1); 69.80 (CCH2O gen. 2); 70.83 (CCH2O gen.1); 120.84, 126.13, 127.98, 128.56, 142.10, 145.16 (fluorenyl); 157.50 (OCONH); 159.82 (NHCONH); 173.20 (amide CONH); 173.93 (COOH).
特定保護基を以下に示すが、前記化合物は限定されないことを周知しなければならない。また、多様な鎖及びスペーサが正確な分子構造を示して描写される限り、サブストレート表面上に調節された密度、好ましくは低密度の配列のための改質は容認された化学的改質方法(chemical modification methods)により可能であった。化合物のショートハンド技術(short−hand description)に対する参考として、以下に示す化合物の左側の大部分は保護基を示し;括弧(brackets)の数字は鎖の末端(branched termini)の数を示し;右側の大部分は化学的な本体(entity)の鎖の末端上の化学的作用(chemistry)を示す。
実施例において、‘A−[27]−酸’とは、アントリルメチル保護基;27末端、及び末端が酸性基のものを示す。
1.Boc−[2]−OMe(化合物3)
1.Boc−[2]−OH(化合物3)
化合物2をNaOHで加水分解した。1日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はEAで洗浄して、氷槽で攪拌した後、HClで酸性化させた。EAを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水MgSO4で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
化合物4をNaOHで加水分解した。1日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はEAで洗浄して、氷槽で攪拌した後、HClで酸性化させた。EAを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水MgSO4で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
化合物6をNaOHで加水分解した。1日室温で攪拌した後、有機溶液を蒸発させた。水溶液はEAで洗浄して、氷槽で攪拌した後、HClで酸性化させた。EAを使用して生成物を抽出した後に、有機溶液を無水MgSO4で乾燥してろ過して、溶媒を蒸発させた。
1.Boc−[2]−CN(化合物3)
1.A−[3]−アルケン(化合物3)
1.[1]−酸−[3]−トリオール(化合物3)
1.A−[9]−OH(化合物15)
1)[G1]−(OMe)2(化合物3)
これによる粗結果物に対してMeOH−EtOAcを溶出液(eluent)としてフラッシュクロマトグラフィー(flashchromatography)を利用して精製して、化合物4を得た。
APDESの代わりに、ガラス酸化物(oxide glass)上にTMAC(N−トリメトキシシリルプロピル−N,N,N−トリメチルアンモニウムクロライド)を自己組立てした。前記TMAC上のデンドリマー層のアミン残基をキャッピングする必要はなかった。
清潔なサブストレート(スライドガラス)をTMAC(2mL)及びアセトン(100mL)の混合溶液に5時間浸した。自己組立て後に、前記サブストレートをフラスコから取り出して、アセトンで洗浄した。前記サブストレートをオーブンに入れて110℃で40分間加熱した。アセトンに浸漬した後に、前記サブストレートを3分間超音波処理した。洗浄されたサブストレートをテフロン(登録商標)容器に入れ、O−フックに連結された大きなスクリューキャップを有するガラス容器に置いて、前記ガラス容器を真空処理して、前記TMACが自己組立てされたサブストレートを乾燥した。
TMACの化学式構造を以下に示す。
一定量のFmoc−スペーサ−[9]酸(化合物5)を混合溶媒(DMF:脱イオン水=1:1(v/v))に溶解して、20mLの溶液を製造した。テフロン(登録商標)容器に前記溶液を入れて、前記で製造したアミノシリル化されたスライドガラス片を溶液に浸した。フラスコを常温に置いて、自己組立てするようにして、1日後に各サブストレート片を溶液から取り出した。片を取り出した直後に前記プレートを脱イオン水で洗浄した。各々のサブストレートを脱イオン水、脱イオン水−メタノール混合溶媒(1:1(v/v))、及びメタノールで順次に3分間超音波処理した。超音波処理した後に、テフロン(登録商標)容器に前記サブストレートを浸して、再びO−フックが連結された大きなスクリューギキップを有するガラス容器に入れて、前記ガラス容器を真空にして(30−40mTorr)サブストレートを乾燥した。
DMF中に5%のピペリジンを含むテフロン(登録商標)容器を容易した。前記自己組立てされたサブストレートを前記テフロン(登録商標)容器に浸して20分間攪拌した。各々のサブストレートをアセトン及びメタノールで順次に3分間超音波処理して、真空チャンバで(30−40mTorr)乾燥した。
非常に高い頻度で無意味な(missense)変異ホットスポットを有することが分かっている7つのコドン、つまり175、215、216、239、248、273、及び282を選択して、実験に利用した。7つのコドンのうち、コドン175、248、273、及び282は国際P53変異データベース(IARC、http//:www−p53.iarc.fr/p53DataBase.htm)から得て、残りの三つのコドン、つまり215、216、及び239は韓国p53変異ホットスポットデータベースから得た。前記6つのコドンに対するキャプチャープローブ序列(デンドロン改質表面に固定化されたDNA)をソフトウェアで製作し、これらの長さは15−23merと多様にして、Tmは約55℃に合わせた。
デンドロン改質サブストレートを使用して、癌細胞株のp53遺伝子の単一変異を探知した。7つのホットスポットコドン(175、215、216、239、248、273、及び282)を含む標的DNAサンプル(100−200mer)を、ランダムプライミング法を使用して癌細胞から抽出されたDNAを増幅して製造し(実施例5.8参照)、固定化された7つのホットスポットコドンに相応するキャプチャープローブ(オリゴヌクレオチドof15−25mer)と混成化させた。各々の混成化されたスポットの蛍光強度を共焦点レーザースキャナで測定し、SNP区別能を計算した。この実施例によれば、デンドロン改質表面を有するDNAマイクロアレイの品質は、実際に標的サンプルに存在する単一変異を探知することができることを示している。
SNP区別のためのキャプチャープローブの長さの影響をT30を有する多様な長さのキャプチャープローブを使用して試験した。T30を含んでコドン175及び239に相応するキャプチャーオリゴヌクレオチドを5´末端及びデンドロン改質表面の末端の1次アミノ基に連結することによって固定させた後に、p53標的DNAを混成化させて、蛍光強度を測定した。この実施例は、キャプチャープローブの長さに対するSNP区別能及び信号強度の依存性を示した。
キャプチャープローブの濃度に対する信号強度及びSNP区別能の依存性を調査した。デンドロン改質表面上のキャプチャープローブを多様な濃度にして標的DNAと混成化して、蛍光強度及びSNP区別能を測定した。p53に対するキャプチャープローブの最適濃度を決定した。
標的プローブの濃度に対する信号強度及びSNP区別能の依存性を調査した。標的DNAを多様な濃度にして混成化して、蛍光強度及びSNP区別能を測定した。この実施例により、デンドロン改質表面を有するDNAマイクロアレイの多様な範囲を提供した。
正常な序列に比べて変異した標的序列が小さい部分に存在する、点突然変異を有する標的サンプル(5または10%)を探知することができる。二種類の標的DNAを含む標的サンプルを異なるモル濃度で製造して混成化して、変異した標的DNAだけでなく、正常な序列の混合物において特定コドンで単一点突然変異を探知するようにした。この実施例は、初期段階の癌を診断するのに大変重要な臨床的意義がある。
癌細胞株の未知の変異を探知するために考案したシステムである。
直腸癌細胞株SNU−C1、SNU−C5、COLO 201、COLO 205、DLD−1、LS 513、HCT−15、LS 174T、HCT 116、及びSW 480をKCLB(韓国細胞株バンク、韓国、ソウル)から購入した。10%ウテア血清(FBS)、100μg/mlのストラプトマイシン、及び100Uのペニシリン(GibcoBRL,Carlsbad,CA)が補充されたRPMI 1640に細胞を接種して、5%のCO2、37℃で培養した。直腸癌細胞(2×106細胞)をInvisorb(登録商標)spin cell mini kit(Invitek,Berlin,Germany)の使用者マニュアルに従って得て、ゲノムDNA分析に使用した。これらゲノムDNAからp53標的DNAを製造し(実施例5.8.2参照)、DNAマイクロアレイ実験を前記方法と同様な方法で行った。
ランダムプライマ−法、PCR、Dnase分解などの多様な方法で多様な長さを有する標的DNAを製造し、混成化効率及びSNP区別に対する標的プローブの長さの影響を調査した。
≪実施例5.8.1:ゲノムDNAサンプル≫
SNU細胞株(SNU−61、216、475、563、601、668、761、及び1040)のゲノムDNAをソウル大学医学部の朴ジェガプ氏から得た。前記SNU細胞株は、韓国の患者から採取したヒト腫よう細胞株である。これら細胞株の特性は以前に記述したものと同一であり、多様な研究で使用された(Bae IS et al.,2000,Park JG et al.,1997,Kang MS et al.,1996,Yuan Y et al.,1997,378−87)。
各細胞株に対して、p53遺伝子、特にエクソン5及びエクソン8間に存在するp53遺伝子を2対の合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅した:エクソン5Fwd I、5´−CTG ACT TTC AAC TCT GTC TCC T−3´(SEQ ID NO:5);エクソン5Fwd II、5´−TAC TCC CCT GCC CTC AAC AA−3´(SEQ ID NO:6);エクソン8Rev I、5´−TGC ACC CTT GGT CTC CTC CAC−3´(SEQ ID NO:7);エクソン8Rev II、5´−CTC GCT TAG TGC TCC CGG G−3´(SEQ ID NO:8)(Kang MS et al.,1996)。下記条件により、Multiblock System(Hybaid,UK)全体の反応体積が20μlになるように、1×ThermoPol緩衝液(補充Taqポリメラーゼ)のうち、250μ M dNTPミックス、2.5U Taqポリメラーゼ(NEB)、10pmoleの最初のプライマー対(イントロは4及び8に相応するエクソン5Fwd I及びエクソン8Rev I)、250μ M dNTPミックス、2.5U Taqポリメラーゼ(NEB)にして、各ゲノムDNAを増幅した:ポリメラーゼ初期活性化、95℃で1分;20周期、95℃で30秒;58℃で30秒;72℃で90秒;72℃で5分最終延長した。最初のPCR産物を希釈して2番目のPCRのための鋳型として使用した。ゲノムDNAのPCR増幅産物を20倍に希釈して、PCRプライマ−を10pmolの2番目のプライマー対(エクソン5及び8に相応するエクソン5Fwd II及びエクソン8Rev II)を使用したことを除いては、前記段階と同一な条件下で2番目のnested PCRを行った。増幅周期は25周期に増加させた。最終のnested PCR産物をゲル抽出法で精製した。ゲノムDNAから得られたPCR産物をpGEM T−easyベクトル(Promega)に連結して、DH5a細胞に形質転換させた。サブクローニングされたプラスミドをQIAGEN Plasmid Min kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)で分離して、序列分析に使用した。pUC/M13正方向及び逆方向序列分析を次のプライマー対を使用して行った:M13 FWD 5´−GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG−3´(SEQ ID NO:9)及びM13 REV 5´−TGA GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG−3´(SEQ ID NO:10)。
SNPシートを含むDNA標的プローブをランダムプライマ−法及び標識化方法で50ngの鋳型DNA、50UのKlenow酵素(NEB)、1×EcoPol緩衝液(Klenow酵素補充)、6μgのランダムオクタマ(Bionics社合成)、低濃度dT dNTPミックス(100μM dA、G、CTP/50μM dTTP)、及び50Cyanine3−dUTP(NEN)を含むMultiblock System(Hybaid,UK)で体積全体を20μlにして、37℃、2時間行った。QIAGEN MinElute PCR purification kit(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)を使用して併合されないヌクレオチドを分離した。UV/Visスペクトロフォトメーターを使用して定量及び定性分析(特異的活性、結合された蛍光染料当たりのヌクレオタイスの数)を行った後に、分析された産物を混成化に利用した。
直腸癌細胞株SNU−C1、SNU−C5、COLO 201、COLO 205、DLD−1、LS 513、HCT−15、LS 174T、HCT 116、及びSW480をKCLBから購入した。ウテア血清(FBS)、100μg/mlのストラプトマイシン、及び100Uのペニシリン(GibcoBRL,Carlsbad,CA)が補充されたRPMI1640に細胞を接種して、5%のCO2、37℃で反応させた。Invisorb(trademark)spin cell mini kit(Invitek,Berlin,Germany)を使用して使用者マニュアルによる方法で前記直腸癌細胞株(2×106細胞)を収穫して、ゲノムDNA抽出に使用した。
<実施例6.1:デンドリマー改質スライドガラス上にNHSバイオチン固定化>
1mLの重炭酸ナトリウム緩衝液50mM及びDMSO(40%v/v)中にスクシンイミジルD−バイオチン(1.0mg)を含むスポッティング溶液を製造した。デンドリマー改質スライドガラス上にNHSバイオチンをMicrosys5100マイクロアレイヤー(Cartesian Technologies,Inc,USA)を使用してクラス10,000の清浄ルームで固定化した。固定化、及び湿潤チャンバー(75%の湿度)で1時間反応させた後に、バイオチンマイクロアレイをDMF(50℃)THF及びMBST(50mM MES、100mM NaCl、0.1% Tween−20、pH6.0)で順次に2時間洗浄した。前記スライドを蒸溜水ですすいで、乾燥させて、直ちに使用したり数日間常温で保存してから使用した。
この実施例は、Hergenrother,P.J.;Depew,K.M.;Schreiber,S.L.J.Am.Chem.Soc.2000,122,7849によって行った。Cy3標識ストラプタビチン溶液を添加する前に、3%ウテア血清補充MBSTで1時間遮断した。若干すすいだ後に、Cy3標識ストラプタビチン溶液に30分間、室温で前記スライドを露出させた。前記溶液は、適切な蛋白質のストック溶液を1%BSA補充MBSTで希釈して、1mg/mLにして製造した。前記反応後に、MBSTで1回スライドを洗浄して、12分間、MBSTを4回交換しながら弱く攪拌した。スライドを乾燥して共焦点スキャナScan Array(登録商標)Lite(GSI Lumonics)を使用してスキャニングした。マイクロアレイ定量分析ソフトウェアImaGene(BioDiscovery,Inc.)を使用してイメージ及び蛍光強度分析を行った。
アミノプロピル基が結合された、気孔が調節されたガラスビーズ(AMPCPG;80−120メッシュ;平均気孔直径、50nmまたは300nm)及び長い鎖状アミノアルキルグループで改質された気孔が調節されたガラスビーズ(LCAA−CPG;80−120mesh;mean pore diameter、50nm)をCPG,Incから購入した。1,4−ブタンジオールジグリジルエーテル、1,3−ジアミノプロパン、還元グルタチオン(GSH)、N−(3−メチルアミノプロピル)−N´−エチルカルボイミド(EDC)、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)、N−(9−フルオロメトキシカルボニルオキシ)クロライド(Fmoc−Cl)、ピペリジン、4−マレイミドブチル酸N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(GMBS)、リン酸緩衝食塩水(PBS)をSigma−Aldrichから購入した。他の化合物は、分析試薬級で購入し、追加精製なく使用した。Barnstead E−pure 3−Module systemで蒸溜水を処理して、脱イオン水(18MΩ.cm)を製造した。UV−visスペクトルはHewlett−Packard diode−array8453スペクトロフォトメーターで記録した。
(i)Fmoc−[3]−酸で改質:AMPCPG(乾燥重量0.70g)をガラスフィルターにアセトンを使用して洗浄した。真空乾燥した後に、1,4−ブタンジルジグリシジルエーテル(1.0mL)及び炭酸塩緩衝液(2.0mL、pH=11)の混合液をAMPCPG(表面能:91.8μ mol/g、表面積:47.9m2/g)に添加した。常温で24時間よく揺らして混ぜた後に、得られたビーズをろ過して脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した。前記サンプルが含まれているバイアル(vial)を1,3−ジアミノプロパン(1.0mL)及び炭酸塩緩衝液(pH=11)の混合液を添加して24時間常温で混ぜた。徹底的に洗浄した後に、2−モルカプトエタノール(1.0mL)及び水溶性重炭酸ナトリウム溶液(2.0mL、pH=8.5)の混合液で表面に残っているエポキシ基の反応を遮断させた。Fmoc−[3]−酸(14mg、21.3μ mol)が溶解されたジメチルホルムアミド(30%DMF(v/v))、N−(3−メチルアミノプロピル)−N´−エチルカルボイミド(15mg、77μ mol)、及びN−ヒドロキシスクシンイミド(9.0mg、77μ mol)をビーズを含むバイアルに添加した。室温で11時間揺らして混ぜた後に、脱イオン水及びアセトンで順次に徹底的に洗浄した。
(ii)遮断段階:無水メチレンクロライド(2.0mL)中に無水酢酸(1.0mL)を使用して常温で一晩残留するアミン基を遮断した。
(iii)脱保護化段階:メチレンクロライド及びアセトンで順次にビーズを洗浄して、DMF(3.0mL)中の20%のピペリジンをビーズを含むバイアルに添加して、30分間バイアルを揺らして混ぜた。
(iv)リガンド固定化段階:1,4−ブタンジルジグリシジルエーテル(1.0mL)及び炭酸塩緩衝液(2.0mL、pH=11)の混合液をバイアールに添加し、常温で24時間混ぜた。脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した後に、重炭酸ナトリウム溶液(3.0mL、pH8.5)及び還元グルタチオン(GSH、5.4mg、17.6μ mol)をビーズを含むバイアルに添加して、常温で24時間揺らして混ぜた。ビーズの洗浄後に、2−モルカプトエタノール(1.0mL)及び水溶性重炭酸ナトリウム溶液(2.0mL、pH=8.5)の混合液をビーズを含むバイアルに添加した。最後に、ビーズを分離して洗浄して、真空で乾燥して窒素雰囲気下で4℃で保管した。Fmoc−[3]−酸の代わりにFmoc−[9]−酸を使用することを除いては同一な段階を、サンプルE3を製造するために行った。
(i)サンプルCS及びCL:GSHをGMBSリンカーを使用してAMPCPG及びLCAA−CPGに直接固定させた。ビーズ(0.10g)をガラスフィルターを使用してアセトンで洗浄した。真空で乾燥した後に、DMF及び4−マレイミドブチル酸、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(GMBS、3.0mg、11μ mol)が溶解された重炭酸ナトリウム緩衝液(1.0mL、3:7(v/v)、pH=8.5)の混合液をビーズを含むバイアルに添加した。常温で4時間揺らして混ぜた後に、得られたビーズをろ過、及び脱イオン水、アセトン洗浄で分離した。最後に、無水メチレンクロライド(2.0mL)中の無水酢酸(1.0mL)でマトリクスに残っているアミン基を反応させた。洗浄後に、PBS緩衝液(1.0mL)中のGSH(3.4mg、11μ mol)をビーズを含むバイアルに添加して、常温で12時間揺らして混ぜた。2−モルカプトエタノール(1.0mL)に残っているマレイミド基を遮断し、ビーズを分離して、洗浄、真空乾燥を行った。
(ii)サンプルA:E1及びE3と同一な改質方法で、1,4−ブタンジルジグリシジルエーテル及び1,3−ジアミノプロパンでAMPCPGを改質した。2−モルカプトエタノールでキャッピングした後に、1,4−ブタンジルジグリシジルエーテルでエポキシ基を製造した。最後に、クリタチオンを固定させて、2−モルカプトエタノールでビーズ上に残っているエポキシ基の環を開環した。
E1またはE3の改質途中のビーズ、または対照実験用ビーズ(10mg)をeチューブに入れた。同時に、9−フルオロメチルクロロホルメート(Fmoc−Cl、1.75mg)及びNa2CO3(1.45mg)を別途のガラスバイアルに入れて、1,4−ジオキサン及び水の混合溶媒(2:1(v/v))を2.5mL添加して、試薬を溶解した。前記溶液中の1/5を取って、ビーズを含むeチューブに添加した。前記チューブをバイアルに入れて、バイアルを常温で12時間揺らして混ぜた。ガラスフィルターを利用してビーズを分離して、前記多孔性物質を脱イオン水及びアセトンで順次に洗浄した。真空で乾燥した後に、DMF(0.50mL)中の20%のピペリジンをビーズを含むeチューブに入れて、30分間ピペリジンと反応するようにした。残っている溶液をチューブから慎重に新たなeチューブに移動させて、ビーズをDMF(0.25mL)中の20%のピペリジンで二回洗浄した。前記溶液全体を前のeチューブに添加した。溶液を再びメタノールと混合して、最終吸光度を調節した。UV/Visスペクトロメーターを使用して310nmで吸光度を測定し、関連溶媒を背景誤差の訂正をするために使用した。信頼性向上のために、測定は5種類の異なるサンプルに対して行った。
測定のために、一連のDMF中の20%のピペリジン、及びN−Fmoc−エタノールアミン(または9−フルオロメチルN−(2−ヒドロキシエチル)カバーメイト)(30μM−70μ M)を製造した。30分間反応させた後に、ジベンゾフルベンを含む溶液を使用して吸光度を測定し、吸光係数を計算した。
GST−融合蛋白質を公知の文献で説明された通りに製造した(Kim,J.H.;Lee,S.;Kim,J.H.;Lee,T.G.;Hirata,M.;Suh,P.G.;Ryu,S.H.;Biochemistry 2002,41,3414−3421で、その全体を本明細書の参考文献として併合する)。大規模培養のためには、再組合わせpGEXプラスミドを含む単一コロニーを200ml 2X YTA培地で培養した。対数増殖期まで培養した後に、IPTGで6時間遺伝子発現を誘導した。次に、遠心分離で細胞を集めて、1X PBSで洗浄した。その後、0.50mM PMSFを含む10mL低浸透圧性緩衝液(20mM Tris、150mM NaCl、1.0mM MgCl2、1.0mM EGTA、pH7.4)でE.coliを超音波溶解した。前記不溶性物質を除去して蛋白質を得た。
(i)鎖の長さの効果:前記製造されたビーズCL(5.72mg)、CS(6.97mg)、E1(10.0mg)、及びE3(14.8mg)を0.8mLの反応緩衝液(20mM Tris、150mM NaCl、1.0mM MgCl2、1.0mM EGTA、1%TX−100、0.10mM PMSF、pH7.4、0.50mM PMSF)中のGST溶解物を含む混合溶液と別個に1時間、4℃で反応させて、10ベッド体積の反応緩衝液で3回洗浄して、100μL SDSサンプル緩衝液を添加した。前記チューブを5分間95℃に置いた後に、20μLのサンプルを採取して、SDS−PAGE分析に使用し、得られたゲルをCBBG−250染色溶液で染めた。
(ii)デンドロン処理マトリクスの選択度:10mgのサンプルA、E1、及びE3以外に、100μgの精製GSTまたはGST融合蛋白質溶解物を実験に使用した。その他の段階は前記段階と同一である。
グルタチオンセファロース−4B、E1、及びE3を前記結合分析項目に記載された方法通りに行った。ビーズに結合された蛋白質の量をImage gauge V3.12(FUJI PHOTO FILM CO.,LTD.)で定量した。p47phoxのPXドメイン及びMunc−18断片溶解物に対しても同一な段階を行った(図13)。
Claims (42)
- 分子の大きさが制御された巨大分子が規則的に分布する分子層を含むサブストレートであって、
前記巨大分子は、分枝された部位及び線状の部位を含む重合体を含み、
前記分枝された部位の多数の末端は前記サブストレートに結合されていて、前記線状の部位の末端は官能基化されていることを特徴とするサブストレート。 - 前記巨大分子が規則的な間隔で分布することを特徴とする請求項1に記載のサブストレート。
- 前記巨大分子が、前記巨大分子の官能基化された線状の部位の作用基間の間隔が約0.1nm乃至約100nmの規則的な間隔になるように分布することを特徴とする請求項2に記載のサブストレート。
- 前記巨大分子が約10nmの規則的な間隔で分布することを特徴とする請求項3に記載のサブストレート。
- 前記分枝された部位の末端が−COZ、−NHR、−OR´、及び−PR´´3からなる群から選択されたいずれか一つで官能基化されていて、前記Zは離脱基であり、前記Rはアルキル基であり、前記R´はアルキル基、アリール基、及びエーテルからなる群から選択されたものであり、前記R´´は水素、アルキル基、及びアルコキシ基からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項1に記載のサブストレート。
- 前記COZは、酸、エステル、活性化されたエステル、酸ハロゲン化合物、活性化されたアミド、及びCO−イミダゾイルからなる群から選択されたいずれか一つからなることを特徴とする請求項5に記載のサブストレート。
- 前記重合体はデンドロンであることを特徴とする請求項1に記載のサブストレート。
- 前記線状の部位はスペーサ部位を含むことを特徴とする請求項1に記載のサブストレート。
- 前記スペーサ部位は、第1官能基によって分枝された部位に連結されていることを特徴とする請求項8に記載のサブストレート。
- 前記第1官能基は、−NH2、−OH、−PH3、−COOH、−CHO、及び−SHからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項9に記載のサブストレート。
- 前記スペーサ部位は、前記第1官能基に共有的に結合されたリンカー部位を含むことを特徴とする請求項8に記載のサブストレート。
- 前記リンカー部位は、置換されたり置換されていないアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、エーテル基、ポリエーテル基、エステル基、及びアミノアルキル基からなる群から選択されたものを含むことを特徴とする請求項11に記載のサブストレート。
- 前記スペーサ部位は第2官能基を含むことを特徴とする請求項8に記載のサブストレート。
- 前記第2官能基は、−NH2、−OH、−PH3、−COOH、−CHO、及び−SHからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項13に記載のサブストレート。
- 前記第2官能基は前記線状の部位の末端に位置することを特徴とする請求項13に記載のサブストレート。
- 前記線状の部位の末端に保護基が結合されていることを特徴とする請求項1に記載のサブストレート。
- 前記保護基は、酸反応性物質または塩基反応性物質であることを特徴とする請求項16に記載のサブストレート。
- 前記線状の部位の末端に標的特異的リガンドが結合されていることを特徴とする請求項1に記載のサブストレート。
- 前記標的特異的リガンドは、化合物、DNA、RNA、PNA、アプタマー、ペプチド、ポリペプチド、炭水化物、抗体、抗原、バイオミメティックス、ヌクレオチド類似体、及びこれらの混合物からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項18に記載のサブストレート。
- 前記巨大分子の線状の部位に結合されている標的特異的リガンド間の距離は、約0.1乃至約100nmであることを特徴とする請求項18に記載のサブストレート。
- 前記サブストレートは、半導体、合成有機金属、合成半導体、金属、合金、プラスチック、シリコン、シリケート、ガラス、及びセラミックからなる群から選択されたもので製作されることを特徴とする請求項1に記載のサブストレート。
- 前記サブストレートは、スライド、粒子、ビーズ、マイクロウェル、及び多孔性物質からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項21に記載のサブストレート。
- 前記多孔性物質は、メンブレイン、ゼラチン、及び水和ゲルからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項22に記載のサブストレート。
- 前記ビーズは、制御された気孔を有するビーズであることを特徴とする請求項22に記載のサブストレート。
- 分枝された部位及び線状の部位を含む重合体を含む、大きさが制御された巨大分子が規則的に分布する分子層の製造方法であって、
前記分枝された部位の多数の末端はサブストレートに結合されていて、前記線状の部位の末端は官能基化されていて、
(i)サブストレートを巨大分子の末端と反応することができるように官能基化する段階;及び
(ii)前記巨大分子を前記サブストレートと接触させて、前記巨大分子の末端及び前記サブストレートが結合を形成するようにする段階;を含むことを特徴とする製造方法。 - 前記サブストレートは、半導体、合成有機金属、合成半導体、金属、合金、プラスチック、シリコン、シリケート、ガラス、及びセラミックからなる群から選択されたもので製作されることを特徴とする請求項25に記載の製造方法。
- 前記サブストレートは、スライド、ビーズ、マイクロウェル物質、及び多孔性物質からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項25に記載の製造方法。
- 前記多孔性物質は、水和ゲル、ゼラチン、及びメンブレインからなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項27に記載の製造方法。
- 前記ビーズは、制御された気孔を有するビーズであることを特徴とする請求項27に記載の製造方法。
- (i)前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端から保護基を除去する段階;及び
(ii)標的特異的リガンド、または前記標的特異的リガンドに連結された同型の両作用性または異型の両作用性のリンカー分子を前記サブストレート上の巨大分子の線状の部位の末端と接触させて、前記リガンドまたはリンカー分子及び前記末端が結合を形成するようにする段階;を含んで、標的特異的リガンドを線状の部位の末端に固定させることを特徴とする請求項25に記載の製造方法。 - 前記サブストレート上の巨大分子が前記標的特異的リガンド及び線状の部位の末端の結合における障害を最少化させることを特徴とする請求項30に記載の製造方法。
- 前記サブストレート上の巨大分子が前記標的特異的リガンドの特異的な標的の検出における障害を最少化させることを特徴とする請求項30に記載の製造方法。
- 前記標的特異的リガンドを規則的な間隔で分布させることを特徴とする請求項30に記載の製造方法。
- 前記サブストレートは低密度の標的特異的リガンドを含むことを特徴とする請求項30に記載の製造方法。
- 前記低密度の標的特異的リガンドの密度は、約0.01プローブ/nm2乃至約0.5プローブ/nm2の範囲であることを特徴とする請求項34に記載の製造方法。
- 前記標的特異的リガンドは、化合物、DNA、RNA、PNA、アプタマー、ペプチド、ポリペプチド、酵素、炭水化物、ポリサッカライド、抗体、抗原、バイオミメティックス、ヌクレオチド類似体、またはこれらの混合物からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項30に記載の製造方法。
- 線状の部位の末端が標的特異的オリゴヌクレオチドに固定されている、請求項1に記載のサブストレートを含むことを特徴とする遺伝子内の変異の検出のための診断システム。
- 前記サブストレートは、癌関連遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項37に記載の診断システム。
- 前記癌関連遺伝子はp53であることを特徴とする請求項38に記載の診断システム。
- 線状の部位の末端が標的特異的オリゴヌクレオチドに固定されている、請求項1に記載のサブストレートを分析対象遺伝子を含む試料と接触させる段階を含むことを特徴とする遺伝子内の変異の存在有無の検出方法。
- 前記遺伝子は癌関連遺伝子であることを特徴とする請求項40に記載の検出方法。
- 前記遺伝子はp53であることを特徴とする請求項41に記載の検出方法。
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