KR20060087531A - 블런트-말단 및 3＇-변형체를 갖는 간섭 ｒｎａ 이중나선 - Google Patents

블런트-말단 및 3＇-변형체를 갖는 간섭 ｒｎａ 이중나선 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 하기 화학식 I의 3'-말단을 포함하는 하나 이상의 블런트 말단을 가지며, RNA 간섭을 매개하는 이중-가닥 RNA에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure 112006014259203-PCT00010
상기 식에서,
X는 O 또는 S이고,
R1 및 R2는 독립적으로 OH, NH2, SH, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자 및 관능기, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자 또는 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있거나; 또는
R1 및 R2는 화학식 Y-Z (여기서, Y는 O, N, S이고, Z는 H, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있음)일 수 있다. 바람직한 3'-말단 변형체는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 탈염기 리보뉴클레오시드, 히드록시포필 포스포디에스테르이다.
3'-말단, 블런트 말단, RNA 간섭, 이중-가닥 RNA

Description

블런트-말단 및 3＇-변형체를 갖는 간섭 ＲＮＡ 이중나선 {INTERFERING RNA DUPLEX HAVING BLUNT-ENDS AND 3'-MODIFICATIONS}
본 발명은 이중-가닥 RNA를 사용한 표적 유전자의 선택적 억제에 관한 것이며, 상기 목적에 유용한 화합물을 제공한다.
짧은 RNA 이중나선은 많은 시험관내 및 생체내 모델에서 RNA 간섭을 매개하는 효과적인 유도자인 것으로 나타났다 (문헌 [Hamilton et al. 1999], [Zamore et al., 2000], [Caplen et al., 2001], [Elbashir et al., 2001], [Yang et al., 2000]). 가장 일반적으로, 합성 siRNA 이중나선은 19개의 인접 리보튜클레오티드 염기쌍의 스트레치가 각각의 가닥의 3'-말단에서 2 내지 3개의 짝짓지 않은 뉴클레오티드 ("오버행(overhang)")와 플랭킹되도록 설계된다. 상기 21-nt siRNA 종은 포유동물 및 비-포유동물 시스템에서 긴 ds-RNA의 DICER-매개된 절단 동안 생성되는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Bernstein et al., 2001], [Ketting et al., 2001]). 상기 특정 21-mer siRNA 포맷은 최초로 초파리(Drosophila melanogaster) 모델로부터 선택되었고, 그 후 그의 효능에 대해 조명되었다 (문헌 [Elbashir et al. 2001]). 결과적으로, 유전자 억제제로서 합성 siRNA를 적용하는 대부분의 오늘날의 연구는 상기 "야생형" 21-mer siRNA 유도체에 의존하고 있다. 오버행용으로는 통상적으로 2'-데옥시뉴클레오티드가 특히 비용의 이유 뿐만이 아니라 세포내 뉴클레아제 활성에 대한 잠재적인 보호성에 관련되어 사용된다.
이제 본 발명은 이중-가닥 RNA ("dsRNA") 매개 RNAi에 대한 신규하고도 독창적인 포맷을 제공한다. 본 발명에 따른 블런트-말단화된 siRNA는 당업계에 현재 사용되는 3'-오버행을 갖는 합성 siRNA의 단점을 극복하고 있다.
발명의 요약
본 발명은 하나 이상의 하기 화학식 I의 3'-말단을 포함하는 하나 이상의 블런트 말단을 가지며, RNA 간섭을 매개하는 이중-가닥 RNA를 제공한다.
Figure 112006014259203-PCT00001
상기 식에서,
X는 O 또는 S이고,
R1 및 R2는 독립적으로 OH, NH2, SH, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자 및 관능기, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자 또는 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있거나; 또는
R1 및 R2는 화학식 Y-Z (여기서, Y는 O, N, S이고, Z는 H, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테 로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있음)일 수 있다.
본 발명은 특정 유형의 화학적 변형을 포함하는 하나 이상의 블런트 말단을 갖는 합성 이중-가닥 RNA (dsRNA) 분자가 RNA 간섭을 효율적으로 매개한다는 놀라운 발견에 기초한 것이다. 본 발명에 따른 dsRNA는 예를 들어 범용 고체 지지체의 사용과 같은 이들의 단순화된 합성 방법 때문에 siRNA를 사용한 고-처리량 접근법에 특히 유용하다.
일 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 하기 화학식 I의 3'-말단을 포함하는 하나 이상의 블런트 말단을 가지며, RNA 간섭을 매개하는 이중-가닥 RNA를 제공한다.
<화학식 I>
Figure 112006014259203-PCT00002
상기 식에서,
X는 O 또는 S이고,
R1 및 R2는 독립적으로 OH, NH2, SH, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자 및 관능기, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자 또는 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있고; 또한
R1 및 R2는 화학식 Y-Z (여기서, Y는 O, N, S이고, Z는 H, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있음)일 수 있다.
R1 및 R2는 또한 시클릭 구조, 예를 들어 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있으며, 상기 고리는 바람직하게는 3 내지 7개의 원을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, Z는 하나 이상의 탈염기(abasic) 뉴클레오시드, 바람직하게는 리보뉴클레오시드 잔기이다. 뉴클레오시드 잔기는 예를 들어 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 기에 의해 연결될 수 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서, R1은 OH이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, R1 및 R2는 함께 탄소 원자 1 내지 24개, 보다 바람직하게는 1 내지 12개 또는 2 내지 10개, 가장 바람직하게는 1 내지 8개 또는 2 내지 6개를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, R1 및 R2는 독립적으로 OH, 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬이며, 여기서, 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬은 상기 정의된 바와 같은 추가의 헤테로원자 및 관능기로 치환될 수 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서, R1 및 R2는 둘다 OH는 아니다.
유기 라디칼 또는 화합물과 관련된 "저급"이라는 용어는 탄소 원자 7개 이하, 바람직하게는 탄소 원자 1 내지 4개를 갖는 분지되거나 비분지될 수 있는 화합물 또는 라디칼을 의미한다. 저급 알킬은 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸 및 분지된 펜틸, n-헥실 및 분지된 헥실을 나타낸다.
관련된 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 하기 화학식 II의 3'-말단을 포함하는 하나 이상의 블런트 말단을 가지며, RNA 간섭을 매개하는 이중-가닥 RNA에 관한 것이다.
Figure 112006014259203-PCT00003
상기 식에서,
R3은 OH, NH2, SH, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있고, R4는 독립적으로 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있다. R3 및 R4는 또한 시클릭 구조, 예를 들어 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있으며, 상기 고리 구조는 바람직하게는 3 내지 7개의 원을 갖는다. R3 및 R4는 또한 추가의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자를 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, R3은 OH이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, R3 및 R4는, 각각 함께 탄소 원자 1 내지 24개, 보다 바람직하게는 1 내지 12개 또는 2 내지 10개, 가장 바람직하게는 1 내지 8개 또는 2 내지 6개를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, R3은 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬이며, 여기서, 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬은 상기 정의된 바와 같은 추가의 헤테로원자 및 관능기로 치환될 수 있고, R4는 독립적으로 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬이며, 여기서, 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬은 상기 정의된 바와 같은 추가의 헤테로원자 및 관능기로 치환될 수 있다.
관련된 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 하기 화학식 III의 3'-말단을 포함하는 하나 이상의 블런트 말단을 가지며, RNA 간섭을 매개하는 이중-가닥 RNA에 관한 것이다.
Figure 112006014259203-PCT00004
상기 식에서,
R5 및 R6은 동일하거나 상이하고 H, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자 및 관능기, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자 또는 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있다. R5 및 R6은 또한 시클릭 구조, 예를 들어 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성할 수 있으며, 상기 고리 구조는 바람직하게는 3 내지 7개의 원을 갖는다.
R5 및 R6은 또한 추가의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자를 포함할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, R5 및 R6은, 각각 함께 탄소 원자 1 내지 24개, 보다 바람직하게는 1 내지 12개 또는 2 내지 10개, 가장 바람직하게는 1 내지 8개 또는 2 내지 6개를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, R5 및 R6은 독립적으로 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬이며, 여기서, 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬은 상기 정의된 바와 같은 추가의 헤테로원자 및 관능기로 치환될 수 있다. 또다른 실시양태에서, R5 및 R6은 둘다 H는 아니다.
본 발명의 RNA 분자는 화학식 I, II 또는 III의 3'-말단을 포함하는 하나 이상의 가닥을 가질 것이다. 바람직하게는, 이중-가닥 RNA의 가닥 둘다는 화학식 I, II 또는 III의 기를 포함하는 3'-말단을 포함한다. 본 발명의 RNA 분자는 또한 하 나 이상의 블런트 말단, 바람직하게는 2개의 블런트 말단을 가질 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 측면 둘다에서 블런트 말단화되어 있고, 말단 둘다는 화학식 I, II 또는 III의 3'-말단을 포함한다.
본 발명에 따른 RNA 분자는 적어도 부분적으로 이중-가닥 특성을 가질 것이다. 바람직한 실시양태에서, 이는 완전히 이중-가닥이다. 이는 2개의 별개의 가닥으로 이루어질 수 있지만, 또한 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 가닥으로 이루어질 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 하나 이상의, 바람직하게는 2개의 블런트 말단을 포함하는 완전히 이중-가닥인 2개의 별개의 가닥으로 이루어진다.
본 발명에 따른 RNA 분자는 RNA 간섭 ("RNAi")을 매개한다. "RNAi"라는 용어는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 표적 유전자에 상보성인 영역을 갖는 dsRNA에 의한 세포 내의 하나 이상의 표적 유전자의 억제를 의미하는 것으로 통상적으로 이해된다. dsRNA가 RNAi를 매개하는 능력에 대해 시험하는 다양한 검정법이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213] 참조). 본 발명에 따른 dsRNA의 유전자 발현에 대한 효과는 전형적으로 본 발명에 따른 RNA 분자로 처리하지 않은 세포와 비교시 10％ 이상, 33％ 이상, 50％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상 또는 99％ 이상으로 표적 유전자의 발현 억제를 초래할 것이다.
본 발명에 따른 RNA 분자는 표적 유전자의 mRNA의 영역과 실질적으로 동일한 이중-가닥 영역을 포함한다. 표적 유전자의 상응하는 서열과 100％ 동일성을 갖는 영역이 특히 바람직하다. 그러나, 상기 영역은 또한 표적 유전자의 상응하는 영역가 비교시 1개 또는 2개의 미스매치(mismatch)를 함유할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 유전자를 표적화하는 RNA 분자를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 하나의 주어진 유전자를 특이적으로 표적화한다. 목적 mRNA만을 표적화하기 위해, siRNA 시약은 표적 mRAN에 대해 100％ 상동성 및 세포 또는 유기체에 존재하는 모든 다른 유전자에 대해 2개 이상의 미스매치된 뉴클레오티드를 가져야 한다. 특이적 표적 서열의 발현을 효과적으로 억제하기 위한 충분한 서열 동일성을 갖는 dsRNA를 분석하고 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 서열 동일성은 당업계에 공지된 서열 비교 및 얼라인먼트 알고리듬 (문헌 [Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991] 및 그에 인용된 참고문헌 참조), 및 뉴클레오티드 서열 간의 차이도 ％를 계산함으로써, 예를 들어 디폴트 파라미터를 사용한 베스트핏(BESTFIT) 소프트웨어 프로그램에서 실시된 바와 같은 스미스-와터만(Smith-Waterman) 프로그램 (예를 들어 위스콘신 대학교 제네틱 컴퓨팅 그룹(University of Wisconsin Genetic Computing Group))에 의해 최적화될 수 있다. RNAi 시약의 효율성에 영향을 주는 또다른 요인은 표적 유전자의 표적 영역이다. RNAi 시약에 의한 억제에 효과적인 표적 유전자의 영역은 실험에 의해 결정될 수 있다. 가장 바람직한 mRNA 표적 영역은 코딩 영역일 것이다. 비해독된 영역, 특히 3'-UTR, 스플라이스 접합부가 또한 바람직하다. 예를 들어, 문헌 [Elbashir S. M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888]에 기재된 바와 같은 형질감염 검정법은 상기 목적용으로 수행될 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 수많은 다 른 적합한 검정법 및 방법이 당업계에 존재한다.
본 발명에 따른 RNA 분자의 상보성 영역의 길이는 바람직하게는 10 내지 100 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 15 내지 50 뉴클레오티드, 보다 더 바람직하게는 17 내지 30 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 19 내지 25 뉴클레오티드이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 RNA 분자는 15 내지 50 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 17 내지 30 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 19 내지 25 뉴클레오티드의 길이를 갖는 짧은 dsRNA 분자로 이루어진다.
본 발명에 따른 dsRNA의 3'-말단은 혈청에서 또는 세포 배양용 성장 배지에서 높은 생체내 안정성을 부여한다. 따라서, 본 발명에 따른 dsRNA는 예를 들어 2 또는 3 데옥시뉴클레오티드의 3'-오버행의 첨가에 의한 것과 같은, 당업계에 통상적인 바와 같은 뉴클레아제 분해에 대한 추가의 안정화를 필요로 하지 않는다. 그러나, 본 발명에 따른 dsRNA는 또한 하나 이상의 변형된 또는 비-천연 리보뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 바람직한 변형체에는 당 잔기의 2' 위치에서의 변형체, 예를 들어 2'-O--(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE) (문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]), 즉 알콕시알킬기가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 바람직한 변형체로는 예를 들어 인접한 리보뉴클레오티드에 연결된 포스포에스테르기를 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트로 대체하는 것을 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 주쇄 변형체를 들 수 있다. 변형된 또는 비-천연 리보뉴클레오티드의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자가 용이하게 이용가능하다.
dsRNA 분자는
(i) 2개의 RNA 가닥을 예를 들어 실시예 1에 예시된 바와 같은 TOM 화학을 사용하여 각각 합성하는 단계 (RNA 가닥을 합성하는 다른 방법은 당업자에게 용이하게 명백하다. 반응은 용액 중에서, 또는 바람직하게는 고체상 상에서, 또는 중합체 지지된 시약을 사용하여 수행될 수 있다.),
(ii) 합성된 RNA 가닥을 RNA를 매개할 수 있는 dsRNA 분자가 형성되는 조건하에서 결합하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 RNAi에 의해 하나 이상의 표적 유전자를 억제할 수 있는 본 발명에 따른 dsRNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 억제 방법을 제공한다. 또한, 또다른 표적 영역에 대해 각각 특이적인 하나 이상의 dsRNA의 종은 동시에 또는 연속적으로 세포 내로 도입될 수 있다. 본 발명에 따른 dsRNA는 물리적 방법, 예를 들어 단순 확산, 핵산 함유 용액의 주입, 핵산에 의해 싸인 입자에 의한 충격법, 핵산 용액 중에서의 세포 또는 유기체의 흡입, 핵산의 존재하에서 세포막의 리포펙션 또는 전기천공을 비롯한, 유전 공학의 다양한 표준 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산을 전달하는 특히 바람직한 방법은 리포펙션을 사용하는 것이다. 이어서, 세포를 RNAi가 일어나는 조건하에서 유지한다. RNAi가 일어나도록 하기 위해 주어진 세포주를 어떤 조건하에서 유지해야 하는가는 당업자에게 용이하게 명백할 것이다. 표적 유전자를 억제하는 상기 방법은 치료학적으로 (예를 들어 특정 질환에서 과발현된 유전자를 넉다운시킴) 또 는 연구용으로 (예를 들어 유전자의 기능을 조사하거나 약물 전달용으로 표적을 확인함) 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 유전자 기능은 상기 방법에 의해 완전히 제거되며, 즉 상기 방법에 의해 특정 유전자에 대한 넉-아웃 세포가 생성될 수 있다.
세포는 식물 또는 동물 세포일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포이다. 세포의 종류 및 공급원은 본 발명에서 중요하지 않으며, 따라서 본 발명은 예를 들어 전능성 또는 다능성 세포, 분열중 또는 비-분열 세포, 실질 또는 상피 세포, 불멸화 또는 형질전환된 세포 등의 내부 세포 덩어리, 배아밖 내배엽 또는 배아 줄기 세포로부터의 세포를 포함한다. 세포는 줄기 세포 또는 분화된 세포일 수 있다. 분화된 세포 종류로는 지방세포, 섬유모세포, 근육세포, 심근세포, 내피세포, 수상돌기 세포, 뉴런, 아교 세포, 비만 세포, 혈구 및 백혈구 (예를 들어 적혈구, 거핵세포, B, T와 같은 림프구, 및 중성 킬러 세포, 대식세포, 중성구, 호산구, 호염기구, 혈소판, 과립구), 상피 세포, 각질세포, 연골세포, 골모세포, 파골세포, 간세포, 및 내분비선 또는 외분비선의 세포 및 감각 세포를 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또다른 측면에서, 본 발명에 따른 dsRNA는 기능이 아직 알려지지 않은 표적 유전자의 활성이 억제된 유기체에서의 유전자 기능의 확인용으로 사용된다. 전형적인 유전학 스크리닝에 의해 돌연변이체에 시간을 소비하고 수고스럽게 단리하는 대신, 기능학 게노믹스에서 본 발명에 따른 dsRNA를 사용하여 비특성화된 유전자의 기능의 결정을 고려함으로써 표적 유전자 활성의 양을 감소시키고(거나) 시간을 변 경하게 될 것이다. 본 발명에 따른 dsRNA는 약제용 잠재적 표적을 결정하고, 발달과 관련된 정상 및 병리학적 사건을 이해하고, 출생후 발달/노화를 담당하는 신호전달 경로를 결정하는 등에 사용될 수 있다. 인간 게놈을 비롯한 게놈 및 발현된 유전자 공급원으로부터 뉴클레오티드 서열 정보를 증가된 속도로 얻는 것을 본 발명과 결합시켜 포유동물 시스템, 특히 인간 세포 배양 시스템에서 유전자 기능을 측정할 수 있다.
표적 유전자를 함유하는 원상태 포유동물 세포 내로 RNA를 용이하게 도입할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 표적 유전자의 억제 방법은 고처리량 스크리닝 (HTS)에 사용할 수 있다. 예를 들어, 주어진 표적 유전자를 억제할 수 있는 본 발명에 따른 RNA 분자를 함유하는 용액을 정돈된 어레이로서 미량역가판 상에 위치된 개별 웰에 놓을 수 있다. 이어서, 각각의 웰 내의 원상태 세포를, 표적 유전자의 억제로 인한 또는 프로테오믹스, 게노믹스 및 표준 분자 생물학 기술에 의한 거동 또는 발달에 있어서의 임의의 변화 또는 변형에 대해 분석할 수 있다. 따라서, 표적 유전자가 유전자 활성이 억제될 경우 세포에 갖는 효과로부터, 표적 유전자의 기능을 검정할 수 있다.
본 발명은 어떠한 종류의 표적 유전자 또는 뉴클레오티드 서열에 제한되지 않는다. 예를 들어, 표적 유전자는 세포성 유전자, 내생 유전자, 병원체 관련 유전자, 바이러스 유전자 또는 발암유전자일 수 있다. 가능한 표적 유전자의 하기 분류군은 단지 설명의 목적으로서만 열거되며, 제한적인 것으로 해석되어서는 안 된다: 전사 인자 및 발달 유전자 (예를 들어 흡착 분자, 사이클린 키나제 억제제, Wnt 족 구성원, Pax 족 구성원, 윙드 헬릭스 족 구성원, Hox 족 구성원, 사이토킨/림포킨 및 이들의 수용체, 성장/분화 인자 및 이들의 수용체, 신경전달물질 및 이들의 수용체); 발암유전자 (예를 들어 ABLI, BCLI, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, ERBB2, ETSI, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI, MYCN, NRAS, PIMI, PML, RET, SKP2, SRC, TALI, TCL3, 및 YES); 종양 억제 유전자 (예를 들어 APC, BRAI, BRCA2, CTMP, MADH4, MCC, NFI, NF2, RBI, TP53, 및 WTI); 및 효소 (예를 들어 ACP 데새추라제 및 히드록실라제, ADP-글루코스 피로포릴라제, ATP아제, 알콜 데히드로게나제, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카탈라제, 시클로옥시게나제, 데카르복실라제, 덱스트리나제, DNA 및 RNA 폴리메라제, 갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, GTP아제, 헬리카제, 인테그라제, 인슐리나제, 인버타제, 이소메라제, 키나제, 락타제, 리파제, 리폭시게나제, 리소자임, 페록시다제, 포스파타제, 포스포리파제, 포스포릴라제, 프로테이나제 및 펩티다제, 재조합효소, 역전사효소, 텔로메라제, RNA 및(또는) 단백질 성분을 포함, 및 토포이소메라제).
임의의 병원체로부터 유래된 유전자가 억제용으로 표적화될 수 있다. 예를 들어, 유전자는 숙주의 면역억제를 직접적으로 유발할 수 있거나, 병원체의 복제, 병원체의 전달 또는 감염의 유지에 필수적일 수 있다. 병원체에 의한 감염 위험에 있는 세포 또는 이미 감염된 세포, 예를 들어 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염, 인플루엔자 감염, 말라리아, 간염, 열원충, 거대세포바이러스, 단순포진 바이러스, 및 발 및 입 질환 바이러스에 의해 감염된 세포는 치료용으로 본 발명에 따른 RNA 의 도입에 의해 표적화될 수 있다. 표적 유전자는 그의 숙주 내로의 병원체의 유입, 병원체 또는 숙주에 의한 약물 대사, 병원체 게놈의 복제 또는 삽입, 숙주에서의 감염의 확립 또는 확산, 또는 병원체의 다음 세대의 집합을 담당하는 병원체 또는 숙주 유전자일 수 있다. 예방 방법 (즉, 예방 또는 감염 위험의 감소) 및 감염과 관련된 증상의 빈도 또는 중증도의 감소가 고려될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 또한 관심 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 내생 유전자를 발현할 수 있는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포를, (a) 관심 단백질(들)을 코딩하는 유전자(들)의 발현을 억제할 수 있는 하나 이상의 본 발명에 따른 dsRNA 분자 및 (b) 약물학적 특성이 확인 및(또는) 특성화되어야 하는 시험 물질 또는 시험 물질의 수집체와 접촉시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 표적 단백질에 작용하는 약물학적 작용제의 확인 및(또는) 특성화 방법을 제공한다. 세포는 dsRNA 및 시험될 화합물(들)과 동시에 또는 연속적으로 접촉될 수 있으며, 세포가 dsRNA 및 화합물(들)과 접촉되는 순서는 중요하지 않다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 또한 관심 단백질(들)의 변이체 또는 돌연변이된 형태를 코딩하며, 그의 발현이 상기 dsRNA에 의해 덜 억제된 하나 이상의 외생 핵산을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 dsRNA를 포함하는, 세포 내의 표적 유전자의 발현 억제용 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 하나 이상의 본 발명에 따른 dsRNA를 시험 샘플 또는 대상체에 시험관내 또는 생체내 도입하는데 필요한 1종 이상의 시약을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이러 한 키트는 또한 키트 성분을 사용하는 방법을 상세화한 지시사항을 포함한다.
본 발명의 또다른 측면은 RNAi에 의해 하나 이상의 표적 유전자를 억제할 수 있는 본 발명에 따른 dsRNA를 포함하는 제약 조성물 및 제제를 제공한다. 상기 제약 조성물은 또한 또다른 표적 영역에 각각 특이적인 하나 이상의 dsRNA의 종을 함유할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료가 필요한지 여부, 그리고 치료될 영역에 따라 수많은 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (안과적 및 질 및 직장 전달을 비롯한 점막 포함), 폐, 예를 들어 분말 또는 에어로졸의, 네불라이저에 의한 것을 비롯한 흡입 또는 취입에 의해; 기관내, 비내, 상피 및 경피), 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여로는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들어 경막내 또는 뇌실내 투여를 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐제, 액체 시럽제, 연질 겔, 좌제 및 관장제와 같은 임의의 많은 가능한 투여 형태로 제제화될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비-수성 또는 혼합 매질 중의 현탁액으로서 제제화될 수 있다. 수성 현택액은 또한 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 소르비톨 및(또는) 덱스트란을 비롯한 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 포함할 수 있다. 제약 조성물은 염으로서 제공될 수 있으며, 염산, 황산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 말산, 숙신산 등을 비롯한, 그러나 이에 제한되지 않는 많은 산을 사용해 형성될 수 있다. 염은 상응하는 유리 염기 형태에 가용성인 것보다 수성 또는 다른 양성자성 용매에 더 가용성인 경향이 있다. 다른 경우에, 바람직한 제제는 하기 중 어느 하나 또는 전부를 함유할 수 있는 동결건조된 산제일 수 있다: 1 내지 50 mM 히스티딘, 0.1％ 내지 2％ 수크로스 및 2 내지 7％ 만니톨, pH 범위 4.5 내지 5.5, 사용 전에 완충액과 배합.
유효 투여량의 결정은 당업자의 능력 내에 있다. 치료 효능 및 독성은 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 방법, 예를 들어 ED50 (집단의 50％에서 치료학적으로 유효한 투여량) 및 LD50 (집단의 50％에 대한 치사 투여량)에 의해 측정할 수 있다. 독성과 치료 효과 간의 투여량 비율은 치료 지수이며, 이는 LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 제약 조성물이 바람직하다. 세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 얻어진 데이타는 인간에 사용하는 투여량 범위로 제제화하는데 사용된다. 이러한 조성물에 함유된 투여량은 바람직하게는 거의 독성이 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태, 환자의 감수성 및 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양하다. 통상적인 투여량은 투여 경로에 따라 0.1 내지 100,000 ㎍, 총 투여량 약 1 g 이하로 다양할 수 있다. 특정 투여량 및 전달 방법에 대한 지침은 문헌에 제공되어 있으며, 일반적으로 당업자에게 이용가능하다. 당업자는 단백질 또는 이들의 억제제에 대해서보다는 뉴클레오티드에 대해서 상이한 제제를 사용할 것이다. 유사하게, 폴리뉴크레오티드 또는 폴리펩티드의 전달은 특정 세포, 상태, 위치 등에 특이적일 것이다.
하기 실시예는 추가의 제한을 위해서가 아니라 본 발명을 설명을 위한 것이다.
실시예 1: 고체 지지체 LM-17의 합성 방법
3-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐-메톡시]-프로판-1-올 (LM-14)
Figure 112006014259203-PCT00005
무수 피리딘 (20 mL) 중 1,3-프로판디올 (20 mL, 268 mmol)의 용액에 아르곤 분위기하에서 4,4'-디메톡시트리페닐클로로메탄 (1.87 g, 5.4 mmol)을 첨가하였다. 실온에서 10분 동안 교반한 후, 혼합물을 얼음/물 혼합물에 붓고, 에틸 아세테이트 (2회)로 추출하였다. 합한 유기상을 물 (2회) 및 염수로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 수득한 갈색 액체를 컬럼 크로마토그래피 (실리카 겔, 용리액: 에틸 아세테이트/헥산 = 1:2)에 의해 정제하여 LM-14 1.56 g (77％)을 밝은 황색 오일로서 수득하였다.
숙신산 모노-3-[비스-(4-메톡시-페닐)-페닐)-메톡시]-프로필}에스테르 (LM-15)
Figure 112006014259203-PCT00006
무수 피리딘 (5 mL) 중 LM-14 (250 mg, 0.69 mmol)의 용액에 아르곤 분위기하에서 N,N-디메틸아미노피리딘 (45 mg, 0.37 mmol)을 첨가하였다. 숙신산 무수물 (57 mg, 0.57 mmol)을 첨가한 후, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 염수 (3회)로 세척하였다. 유기상을 황산나트 륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 조 LM-15 (536 mg)를 수득하고, 이를 추가의 정제 없이 후속 단계에 사용하였다.
고체 지지체 LM-17
Figure 112006014259203-PCT00007
무수 DMF (5 mL)의 혼합물 중 조 LM-15 (0.69 mmol)의 용액에 피리딘 (0.13 mL), 4-니트로페놀 (143 mg, 1.0 mmol) 및 N,N-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 156 mg, 0.76 mmol)를 아르곤 분위기하에서 첨가하였다. 황색 용액을 실온에서 2일 동안 교반한 후, 황색 현탁액이 형성되었다. 셀라이트 상에서 여과한 후, 아미노-유도체화된 폴리스티렌 (457 mg)을 여액에 첨가하였다. 트리에틸아민 (0.046 mL)을 첨가하고, 혼합물을 기계식 병 진탕기를 사용하여 24시간 동안 진탕하였다. 혼합물을 여과하고, 고체 지지체를 DMF (5 mL), 메탄올 (5 mL) 및 디에틸 에테르 (5 mL)로 각각 2회 세척하여 LM-17 (453 mg)을 수득하였다. 아세토니트릴 (100 mL) 중 p-톨루엔술폰산 (1.9 g)의 용액 0.1 mL로 처리시 방출되는 트리틸기의 정량 (498 nm에서 흡수도)은 14 μmol/g 적하량을 나타냈다.
실시예 2
1. 올리고리보뉴클레오티드 (siRNA)의 합성
본 발명에 기재된 변형된 합성 올리고뉴클레오티드는 표준 TOM-포스포라미다이트 화학을 사용하여 ABI394 또는 엑스페디트/모스(Expedite/Moss) 합성기 (어플 라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)) 상에서 제조될 수 있다. 포스포라미다이트를 아세토니트릴에 0.05 M 농도 (올리고파일로트(OligoPilot) II 상의 0.2 M)로 용해시키고, 아세토니트릴 중 벤즈이미다졸륨 트리플레이트의 0.2 M 용액에 의한 포스포라미다이트의 활성화에 의해 커플링시켰다. 커플링 시간은 통상적으로 3 내지 6분으로 이루어진다. 제1 캡핑을 표준 캡핑 시약을 사용하여 수행하였다. 산화를 THF/피리딘/물 (77:20:3) 중 0.1 M 요오드 용액 또는 0.5 M t-부틸히드록시페록시드 (플루카(Fluka))에 의해 2분 동안 수행하였다. 제2 커플링을 산화 후에 수행하였다. 올리고뉴클레오티드 성장 사슬을 디클로로메탄 또는 디클로로에탄 중 2％ 디클로로아세트산에 의해 다음 커플링용으로 탈트리틸화시켰다. 서열 완성 후, 지지체-결합된 화합물을 절단하고, 메틸아민 용액 (41％ 수성 메틸아민/33％ 에탄올 메틸아민 1:1 v/v)에 의해 35℃에서 6시간 동안 "트리틸-온(Trityl-On)"으로서 탈보호하였다. 생성된 현탁액을 동결 건조시켰다. 2'-O-실릴기를 1 M 테트라부틸암모늄 플루오라이드로 50℃에서 10분 동안 및 35℃에서 6시간 동안 처리하여 제거하였다. 수득된 조 용액을 RP-HPLC에 의해 직접 정제하였다. 정제된 탈트리틸화된 화합물을 전기분사 질량 분광법 및 모세관 겔 전기영동에 의해 분석하고, 260 nM에서의 소광 계수에 따른 UV에 의해 정량하였다. 올리고뉴클레오티드 서열은 하기 표 1에 열거되어 있다.
Figure 112006014259203-PCT00008
N: RNA, n: 2'-메톡시에틸 리보뉴클레오시드, dN: 데옥시리보뉴클레오시드, ab: 탈염기 리보뉴클레오시드, p: 포스페이트, s: 포스포로티오에이트, C3: 히드록시프로필포스포디에스테르
실시예 3
3.1 재료 및 방법
재료: 올리고펙타민 및 다른 세포 배양 시약은 미국 메릴랜드주 게이터스버그에 소재하는 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 지브코(Gibco)BRL (현재 인비트로젠(Invitrogen))로부터 수득하였다. JetPEI는 폴리플러스-트랜스펙션(Polyplus-Transfection) (프랑스 일리키르쉬 소재)으로부터 구입하였다.
세포주: 재조합 래트 P2X3을 발현하는 안정하게 형질감염된 차이니스 햄스터 난소 세포 (CHO-K1) (ATCC CCL61, 미국 매릴랜드주 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection))를 기재된 바와 같이 생성하였다 (문헌 [Hemmings et al., NAR 31 (2003), 2117-2126]). CHO 세포를 10％ (v/v) FBS, 2 mM 글루타민이 보충된 최소 필수 배지 (MEM-α)에서 5％ CO2-습윤 챔버에서 배양하였다. HeLa 세포를 10％ (v/v) FBS, 2 mM 글루타민이 보충된 둘베코(Dubelco) 변형 필수 배지 (DMEM 41965)에서 5％ CO2-습윤 챔버에서 배양하였다.
올리고뉴클레오티드 합성: 올리고리보뉴클레오티드는 퀴아젠(Qiagen)에서 구입하거나, TOM-포스포라미다이트 화학을 사용하여 제조업자 (퀴아젠)에 의해 기재된 바와 같이 합성하고, RP-HPLC에 의해 정제하였다. 3'-히드록시프로필포스페이트 올리고리보뉴클레오티드를 고체 지지체 LM-17 (적하량: 14 μmol/g) 상에서 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 사슬 연장, 지지체로부터의 절단, 탈보호 및 정제는 3'-오버행과 같은 2개의 데옥시뉴클레오티드를 갖는 21-mer 올리고리보뉴클레오티드와 동일하였다. 모세관 겔 전기영동에 의해 순도를 평가하였다. 정량을 260 nM에서 소광 계수에 따른 UV에 의해 수행하였다. 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 어닐링은 다른 곳에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌 Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213]). 상기 보고에 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 표 1에 열거되어 있으며, 전기분사 질량 분광법에 의해 특성화하였다.
세포 형질감염: 양이온성 지질-올리고뉴클레오티드 (올리고펙타민) 및 중합체-올리고뉴클레오티드 (jetPEI) 혼합물을 이미 기재된 바와 같이 형질감염 직전에 제조하였다. 형질감염 18시간 전에, 4 x 104개의 세포를 CHO 세포에 대해 0.5 mL MEM-α 또는 HeLa 세포에 대해 0.5 mL DMEM (둘다 10％ (v/v) FBS, 2 mM 글루타민으로 보충됨)의 부피로 24-웰 플레이트 상에 웰당 플레이팅하였다. 형질감염 전에, 성장 배지를 세포로부터 제거하고, OptiMEM 500 ㎕ 및 형질감염 시약/올리고뉴클레오티드 혼합물 100 ㎕로 대체하였다. 플레이트를 37℃에서 습윤 5％ CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 4시간 후, FBS 60 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 인큐베이션을 20시간 동안 연장하였다.
RNA 수거 및 실시간 정량적 PCR mRNA 분석: 전체 RNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 RNeasy 96 키트 (미국 캘리포니아주 캐츠워쓰에 소재하는 퀴아젠 제품)로 올리고뉴클레오티드 형질감염 24시간 후에 단리하였다. RNA 샘플을 역전사효소 Q-PCR 마스타믹스 키트 (유로젠텍(Eurogentec))로부터의 시약과 혼합하고, 포함된 프로토콜에 따라 작동시켰다.
3.2 블런트 말단화된 siRNA 활성
래트 P2X3 퓨린-수용체를 발현하는 CHO 세포주를 사용하여 제1 및 제2 세대 올리고뉴클레오티드 (ASO) 및 짧은 간섭 RAN와 같은 여러가지 mRNA 억제제의 상대적 활성을 비교하였다. "범용" 형질감염 시약과 같은 선형 PEI를 사용하면 상기 다양한 유전자 발현 억제제 간의 헤드-투-헤드 비교를 수행할 수 있다. siRNA 서열은 이미 특성화된 최적 ASO 서열로부터 선택되었고 (문헌 [Dorn et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development 11 (2001): 165-174]), P2X3 코딩 서열을 표적화하도록 설계되었으며, Q-RT-PCR, 면역검출 및 기능 검정에 의해 입증된 바와 같이 P2X3 발현을 분자 수준에서 효율적으로 및 선택적으로 하향-조절하는 것으로 밝혀졌다. 양성 대조군으로서, 본 발명자들은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 통해 함께 연결된 2개의 표적-상보성 2'-MOE 변형된 오버행을 갖는 siRNA 서열을 사용하였다. 그 후 본 발명자들은, 고체 지지체로부터 암모니아 매개된 절단 후, 방출된 화합물이 그의 마지막 리보뉴클레오티드의 3'-위치에 히드록시프로필포스페이트 (hpp) 기를 유지하도록 상응하는 19-mer 블런트-말단화된 siRNA를 합성하였다.
21-mer siRNA (2개의 상보성 오버행) 및 블런트-말단화된 19-mer 사이의 중간체로서, 2개의 탈염기 뉴클레오시드 오버행을 갖는 서열 상동성 21-nt siRNA를 또한 합성하였다. 이러한 비-뉴클레오시드성 오버행을 사용하여 RNAi 경로에 관여하는 단계 중 하나가, 보다 특히 이중나선의 펴짐 동안 siRNA 상의 3'-신장을 절대적으로 필요로 할 것인지 여부를 평가할 수 있다.
siRNA를 JetPEI를 사용하여 N/P 비율 5로 CHO 세포 내로 형질감염시켰다. mRNA 수준을 형질감염 24시간 후 RT-Q-PCR에 의해 평가하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 모든 3가지 화합물에 대한 하향-조절의 수준에 필적할 만한 GAPDH mRNA 수준의 감소가 CHO 세포에서 검출되었다. 3'-히드록시프로필포스페이트 리보뉴클레오티드를 갖는 블런트-말단화된 19 bp siRNA는 P2X3 mRNA 억제에서 "야생형" 21-mer siRNA와 동일한 효능을 나타낸다.
이제 본 발명자들은 유사한 포맷 변형을 내생 유전자를 표적화하는 siRNA에 적용하여 차이니스 햄스터 GAPDH mRNA를 또한 인간 GAPDH 유전자에 특이적이고 완전히 상동성인 방식으로 표적화하는 siRNA 서열을 설계하였다. 21-mer siRNA (2개의 데옥시리보뉴클레오티드 오버행) 및 블런트-말단화된 3'-히드록시프로필포스페이트 siRNA (19-mer)를 25 내지 200 nM 범위의 농도에서 CHO 세포 내로 형질감염시킨 후, 차이니스 햄스터 GAPDH mRNA 수준을 RT-PCR 분석한 것은, 하향-조절이 "야생형" siRNA의 경우 약간 더 고농도에서 나타나긴 하지만, 2가지 화합물에 대한 동등한 mRNA 하향-조절을 나타낸다. 그러나, 양이온성 지질 올리고펙타민으로 동일한 농도에서 형질감염시켰을 때는, 화합물 둘다는 정확히 동일한 RNA 억제를 나타내었다.
함께 취합된 상기 데이타는 siRNA의 3'-말단 상의 올리고뉴클레오티드 오버행의 변형 또는 부재가 CHO 세포에서 이들의 간섭 활성에 대해 중요하지 않음을 나타낸다.
3.3 인간 세포에서의 블런트-말단화된 siRNA 활성
상기 제1 결과를 인간 세포에서 확인하기 위해, 인간 GAPDH mRNA 오픈 리딩 프레임을 표적화하는 siRNA 서열을 설계하였다. 블런트-말단화된 siRNA 및 야생형 siRNA 둘다는 HeLa 세포에서 인간 GAPDH를 표적 하향-조절에 대해 동일한 수준으로 침묵화시켰다 (도 3).
3.4 블런트-말단화된 siRNA의 3'-말단 기능 요건
2가지 상이한 포유동물 세포주에서 및 오버행의 결실이 생성된 블런트-말단화된 siRNA의 침묵화 활성을 손상시키지 않는 여러가지 표적에 대해 나타낸 후, 본 발명자들은 또한 블런트-말단화된 siRNA의 제1 3'-뉴클레오티드 상의 3'-리보노클레오티드 위치가 침묵화 과정에 최적인 특정 화학 잔기를 필요로 하는가 여부를 평가하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 블런트-말단화된 3'-히드록시 및 3'-포스페이트 siRNA 둘다는, HeLa 세포에서 3가지 nt 미스매치 대조군과 비교시 야생형 21-mer siRNA와 유사한 수준의 표적화된 GAPDH mRNA 하향-조절을 높은 선택도로 초래하였다.
<110> Novartis AG <120> Organic Compounds <130> 4-33332A <160> 30 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxyethyl ribonucleoside, phosphorothioate link <400> 1 acuccaucca gccgagugaa g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxyethyl ribonucleoside, phosphorothioate link <400> 2 ucacucggcu ggauggagut t 21 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 3 acuccaucca gccgaguga 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 4 ucacucggcu ggauggagu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> phosphate <400> 5 acuccaucca gccgaguga 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> phosphate <400> 6 ucacucggcu ggauggagu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> abasic-abasic <400> 7 acuccaucca gccgaguga 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> abasic-abasic <400> 8 ucacucggcu ggauggagu 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 9 ucgaaguacu cagcguaagt t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 10 cuuacgcuga guacuucgat t 21 <210> 11 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxyethyl ribonucleoside <400> 11 ggccauccac agucuucugg g 21 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 12 cagaagacug uggauggccu u 21 <210> 13 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxyethyl ribonucleoside <400> 13 ggccagccac auucgucuug g 21 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 14 aagacgaaug uggcuggccu u 21 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 15 ggccauccac agucuucug 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 16 cagaagacug uggauggcc 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 17 ggccagccac auucgucuu 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 18 aagacgaaug uggcuggcc 19 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxyethyl ribonucleoside <400> 19 cauguaguug aggucaauga a 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 20 cauugaccuc aacuacaugu u 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> 2'-methoxyethyl ribonucleoside <400> 21 cauguagaug augucgauga a 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 22 caucgacauc aucuacaugu u 21 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 23 cauguaguug aggucaaug 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 24 cauugaccuc aacuacaug 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 25 cauguagaug augucgaug 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> hydroxypropylphosphodiester <400> 26 caucgacauc aucuacaug 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 27 cauguagaug augucgaug 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <400> 28 cauugaccuc aacuacaug 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> phosphate <400> 29 cauguagaug augucgaug 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> Oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> phosphate <400> 30 cauugaccuc aacuacaug 19

Claims (13)

  1. 하나 이상의 하기 화학식 I의 3'-말단을 포함하는 하나 이상의 블런트 말단을 가지며, RNA 간섭을 매개하는 이중-가닥 RNA.
    <화학식 I>
    Figure 112006014259203-PCT00009
    상기 식에서,
    X는 O 또는 S이고,
    R1 및 R2는 독립적으로 OH, NH2, SH, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자 및 관능기, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자 또는 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있거나; 또는
    R1 및 R2는 화학식 Y-Z (여기서, Y는 O, N, S이고, Z는 H, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있음)일 수 있다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 OH인 이중-가닥 RNA.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 유전자에 상보적인 15 내지 30개의 뉴클레오티드의 영역을 포함하는 이중-가닥 RNA.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1 및 R2가 독립적으로 OH, NH2, SH, 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬이며, 여기서, 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자 및 관능기, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자 또는 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있거나 또는 R1 및 R2는 화학식 Y-Z (여기서, Y는 O, N, S, B이고, Z는 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 여기서, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가의 헤테로원자, 바람직하게는 N, O 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있음)일 수 있되, 단 R1 및 R2 둘다가 OH는 아닌 것인 이중-가닥 RNA.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 OH이고, R2가 탄소 원자 1 내지 24개를 포함하는 것인 이중-가닥 RNA.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 블런트 말단을 포함하는 이중-가닥 RNA.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Z가 하나 이상의 탈염기 뉴클레오시드인 이중-가닥 RNA.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 억제 방법.
  9. 제7항에 있어서, 표적 유전자가 병원체-관련 유전자, 바이러스 유전자 또는 발암유전자인 방법.
  10. 세포 내에 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA 및 dsRNA를 표적 유전자의 발현 억제에 충분한 양으로 세포 내로 도입하는 수단을 포함하는, 세포 내의 표적 유전자 발현 억제용 시약을 포함하는 키트.
  11. 유효량의 하나 이상의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 dsRNA를 포함하는, 표적 유전자 억제용 제약 조성물.
  12. 관심 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 내생 유전자를 발현할 수 있는 진 핵 세포를 (a) 관심 단백질(들)을 코딩하는 유전자(들)의 발현을 억제할 수 있는 하나 이상의 본 발명에 따른 dsRNA 분자 및 (b) 약물학적 특성이 확인 및(또는) 특성화되어야 하는 시험 물질 또는 시험 물질의 수집체와 접촉시키는 것을 포함하는, 하나 이상의 표적 단백질에 작용하는 약물학적 작용제의 확인 및(또는) 특성화 방법.
  13. 표적 유전자 억제를 위한 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 이중-가닥 RNA의 용도.
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Families Citing this family (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0413146A (pt) 2003-08-28 2006-10-03 Novartis Ag dúplex rna interferindo tendo extremidades-embotadas e modificações-3
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds
JP5876637B2 (ja) * 2006-10-18 2016-03-02 マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド ニックまたはギャップの入った核酸分子およびそれらの使用
JP4900943B2 (ja) * 2006-12-25 2012-03-21 独立行政法人産業技術総合研究所 ヌクレアーゼ耐性及びｒｎａ干渉効果に優れた修飾型二本鎖ｒｎａ
EP2164966A2 (en) 2007-07-05 2010-03-24 Novartis Ag Dsrna for treating viral infection
EP2260102A1 (en) 2008-03-25 2010-12-15 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Treating cancer by down-regulating frizzled-4 and/or frizzled-1
US20110311521A1 (en) 2009-03-06 2011-12-22 Pico Caroni Novel therapy for anxiety
EP2241323A1 (en) 2009-04-14 2010-10-20 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Tenascin-W and brain cancers
EP2292266A1 (en) 2009-08-27 2011-03-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Treating cancer by modulating copine III
EP2480573A1 (en) 2009-09-22 2012-08-01 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Treating cancer by modulating mex-3
WO2011045352A2 (en) 2009-10-15 2011-04-21 Novartis Forschungsstiftung Spleen tyrosine kinase and brain cancers
KR101692063B1 (ko) * 2009-12-09 2017-01-03 닛토덴코 가부시키가이샤 hsp47 발현의 조절
US8293718B2 (en) 2009-12-18 2012-10-23 Novartis Ag Organic compositions to treat HSF1-related diseases
CN102905763B (zh) 2009-12-23 2015-06-17 诺华股份有限公司 脂质、脂质组合物和使用它们的方法
CN102770767A (zh) 2010-02-10 2012-11-07 诺瓦提斯公司 用于肌肉生长的方法和组合物
EP2542578A1 (en) 2010-03-05 2013-01-09 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Smoc1, tenascin-c and brain cancers
EP2561076A1 (en) 2010-04-19 2013-02-27 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Modulating xrn1
US10913767B2 (en) * 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
EP2561077B1 (en) 2010-04-23 2016-04-13 Arrowhead Research Corporation ORGANIC COMPOSITIONS TO TREAT BETA-ENaC-RELATED DISEASES
EP2580239A1 (en) 2010-06-10 2013-04-17 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Treating cancer by modulating mammalian sterile 20-like kinase 3
EP2717911A1 (en) 2011-06-06 2014-04-16 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11 (ptpn11) and triple-negative breast cancer
MX368573B (es) * 2011-07-18 2019-10-08 Devgen Nv Regulacion hacia abajo de la expresion de genes en plagas de insectos.
EP2751272A2 (en) 2011-09-02 2014-07-09 Novartis AG Organic compositions to treat hsf1-related diseases
US20140294732A1 (en) 2011-11-08 2014-10-02 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute Early diagnostic of neurodegenerative diseases
US20140314787A1 (en) 2011-11-08 2014-10-23 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Friedrich Miescher Institute Treatment for neurodegenerative diseases
CN103945850A (zh) 2011-11-15 2014-07-23 诺华股份有限公司 磷酸肌醇-3-激酶抑制剂与Janus激酶2-信号转导和转录激活因子5通路的调节剂的组合
US20140363448A1 (en) 2012-01-02 2014-12-11 Novartis Ag Cdcp1 and breast cancer
CN104302768A (zh) 2012-01-09 2015-01-21 诺华股份有限公司 治疗β-联蛋白相关疾病的有机组合物
US20150266961A1 (en) 2012-03-29 2015-09-24 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung, Fridrich Miescher Institute Inhibition of interleukin-8 and/or its receptor cxcr1 in the treatment of her2/her3-overexpressing breast cancer
EP3272868A1 (en) 2012-05-02 2018-01-24 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Organic compositions to treat kras-related diseases
JP6139671B2 (ja) * 2012-05-22 2017-05-31 オリックス ファーマシューティカルズ インコーポレイテッドＯｌｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ． 細胞内貫通能を持ってｒｎａ干渉を誘導する核酸分子およびその用途
US20150218238A1 (en) 2012-06-29 2015-08-06 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Resear Treating diseases by modulating a specific isoform of mkl1
US20150184154A1 (en) 2012-07-05 2015-07-02 Novartis Forschungsstiftung, Zweigniederlassung Friedrich Miescher Institute For Biomedical Resear New treatment for neurodegenerative diseases
EP2869818A1 (en) 2012-07-06 2015-05-13 Novartis AG Combination of a phosphoinositide 3-kinase inhibitor and an inhibitor of the il-8/cxcr interaction
EP2961843A2 (en) 2013-02-28 2016-01-06 Arrowhead Research Corporation Organic compositions to treat epas1-related diseases
KR102144777B1 (ko) * 2013-06-19 2020-08-18 제이더블유중외제약 주식회사 결정형 메로페넴 삼수화물의 제조방법
US20160178610A1 (en) 2013-08-07 2016-06-23 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research New screening method for the treatment Friedreich's ataxia
EP3052464B1 (en) 2013-10-04 2020-04-15 Novartis AG 3'end caps for rna-interferring agents for use in rna interference
WO2015050871A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag Organic compounds to treat hepatitis b virus
WO2015051135A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag Organic compositions to treat hepcidin-related diseases
WO2015051044A2 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Novartis Ag Novel formats for organic compounds for use in rna interference
US9988627B2 (en) 2013-10-04 2018-06-05 Novartis Ag Formats for organic compounds for use in RNA interference
KR101696704B1 (ko) * 2013-12-17 2017-01-16 주식회사 인코드젠 오프-타겟을 막기 위해 변형된 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도
EP3154579A1 (en) 2014-06-13 2017-04-19 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research New treatment against influenza virus
EP3164129A1 (en) 2014-07-01 2017-05-10 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Combination of a brafv600e inhibitor and mertk inhibitor to treat melanoma
WO2016011123A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Arrowhead Research Corporation Organic compositions to treat apoc3-related diseases
JP6778175B2 (ja) 2014-07-16 2020-10-28 ノバルティス アーゲー 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法
US20180010132A1 (en) 2014-09-11 2018-01-11 Novartis Ag Inhibition of prmt5 to treat mtap-deficiency-related diseases
EP3197557A1 (en) 2014-09-24 2017-08-02 Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research Lats and breast cancer
EP3227446A1 (en) 2014-12-01 2017-10-11 Novartis AG Compositions and methods for diagnosis and treatment of prostate cancer
US20180296537A1 (en) 2015-06-05 2018-10-18 Novartis Ag Methods and compositions for diagnosing, treating, and monitoring treatment of shank3 deficiency associated disorders
WO2017072669A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Friedrich Miescher Institute For Biomedical Research Tenascin-w and biliary tract cancers
JOP20200228A1 (ar) 2015-12-21 2017-06-16 Novartis Ag تركيبات وطرق لخفض تعبير البروتين tau
US9721645B1 (en) 2016-01-29 2017-08-01 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. SRAM arrays and methods of manufacturing same
WO2018047148A1 (en) 2016-09-12 2018-03-15 Novartis Ag Compounds for the inhibition of mirna
EP3535396A1 (en) 2016-11-01 2019-09-11 Novartis AG Methods and compositions for enhancing gene editing
WO2019016772A2 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Novartis Ag COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING CANCER
SG11201912178VA (en) 2017-09-11 2020-01-30 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Rnai agents and compositions for inhibiting expression of apolipoprotein c-iii (apoc3)
EP3788138A1 (en) 2018-05-02 2021-03-10 Novartis AG Regulators of human pluripotent stem cells and uses thereof

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE269870T1 (de) 1989-10-24 2004-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte oligonukleotide
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US6399754B1 (en) 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US6033909A (en) 1992-01-22 2000-03-07 Hoechst Aktiengesellschaft Oligonucleotide analogs, their preparation and use
KR930016437A (ko) 1992-01-22 1993-08-26 귀틀라인, 슈미트 올리고뉴클레오티드 유사체, 이의 제조방법 및 용도
EP1489184A1 (en) 1995-06-07 2004-12-22 Inex Pharmaceutical Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5998203A (en) * 1996-04-16 1999-12-07 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic nucleic acids containing 5'-and/or 3'-cap structures
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
JP4656675B2 (ja) 1997-05-14 2011-03-23 ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア 脂質小胞への荷電した治療剤の高率封入
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6211349B1 (en) 1998-12-30 2001-04-03 Oligos Etc., Inc. Protonated/acidified nucleic acids and methods of use
AU776150B2 (en) 1999-01-28 2004-08-26 Medical College Of Georgia Research Institute, Inc. Composition and method for (in vivo) and (in vitro) attenuation of gene expression using double stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
GB9927444D0 (en) 1999-11-19 2000-01-19 Cancer Res Campaign Tech Inhibiting gene expression
DE10160151A1 (de) 2001-01-09 2003-06-26 Ribopharma Ag Verfahren zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Zielgens
US8202979B2 (en) 2002-02-20 2012-06-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid
US20050233329A1 (en) 2002-02-20 2005-10-20 Sirna Therapeutics, Inc. Inhibition of gene expression using duplex forming oligonucleotides
US20070026394A1 (en) 2000-02-11 2007-02-01 Lawrence Blatt Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth using nucleic acid based technologies
WO2003070918A2 (en) * 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
CA2404890C (en) 2000-03-30 2013-11-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
US20030190635A1 (en) 2002-02-20 2003-10-09 Mcswiggen James A. RNA interference mediated treatment of Alzheimer's disease using short interfering RNA
BRPI0115814B8 (pt) 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
US20030175950A1 (en) 2001-05-29 2003-09-18 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of HIV gene expression using short interfering RNA
US20070032441A1 (en) 2001-05-18 2007-02-08 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (sina)
EP1627061B1 (en) 2001-05-18 2009-08-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING CHEMICALLY MODIFIED SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
US20040019001A1 (en) 2002-02-20 2004-01-29 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of protein typrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering RNA
CA2448320A1 (en) * 2001-05-29 2002-12-05 Sirna Therapeutics, Inc. Ribozyme based treatment of female reproductive diseases
US20090247606A1 (en) 2001-08-28 2009-10-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA Interference Mediated Inhibition of Adenosine A1 Receptor (ADORA1) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid (siNA)
US8258288B2 (en) 2002-02-20 2012-09-04 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of respiratory syncytial virus (RSV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003207708A1 (en) 2002-02-20 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Rna interference mediated inhibition of map kinase genes
DK1389637T3 (da) * 2002-08-05 2012-09-03 Silence Therapeutics Ag Interfererende RNA-molekyler med stumpe ender
SI3222724T1 (sl) * 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
JP4605799B2 (ja) * 2003-04-02 2011-01-05 ダーマコン， インコーポレイテッド Ｒｎａ干渉において使用するための修飾ポリヌクレオチド
US20070270360A1 (en) * 2003-04-15 2007-11-22 Sirna Therapeutics, Inc. Rna Interference Mediated Inhibition of Severe Acute Respiratory Syndrome (Sars) Gene Expression Using Short Interfering Nucleic Acid
EP2664672A1 (en) 2003-04-17 2013-11-20 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
EP1636385A4 (en) 2003-06-24 2010-06-02 Mirus Bio Corp INHIBITION OF GENE FUNCTION BY IN VIVO DISTRIBUTION OF GENE EXPRESSION INHIBITORS BASED ON POLYNUCLEOTIDES IN MAMMALIAN CELLS
BRPI0413146A (pt) 2003-08-28 2006-10-03 Novartis Ag dúplex rna interferindo tendo extremidades-embotadas e modificações-3
AU2005247509C1 (en) 2004-05-27 2012-09-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant double-stranded ribonucleic acid
GB0608838D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Novartis Ag Organic compounds

Also Published As

Publication number Publication date
AU2004269150C1 (en) 2010-11-18
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US8097716B2 (en) 2012-01-17
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