KR20060047776A

KR20060047776A - Ｆｇｆ2를 유효성분으로 포함하는 천식 및 만성폐쇄성폐질환 예방 또는 치료제

Info

Publication number: KR20060047776A
Application number: KR1020050039405A
Authority: KR
Inventors: 김윤근; 강수형; 김병문; 손미원
Original assignee: 동아제약주식회사; 김윤근
Priority date: 2004-05-12
Filing date: 2005-05-11
Publication date: 2006-05-18
Also published as: AU2005239957B2; US20080172751A1; WO2005107794A1; CA2566400A1; CN1953765A; KR20090114341A; AU2005239957A1; MXPA06013025A; US8030274B2; RU2351356C2; BRPI0511030A2; EP1773374A1; JP2007537245A; NZ551950A; RU2006143763A; KR100785969B1; CN1953765B; JP4669512B2; KR20070112086A; EP1773374A4

Abstract

본 발명은 섬유모세포 성장인자 2(Fibroblast Growth Factor-2, FGF2 또는 basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)를 유효성분으로 포함하는 천식(喘息, Asthma) 및 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) 예방 또는 치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 난알부민(Ovalbumin, OA) 및 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의해 유도되는 Th1 천식 및 COPD 마우스 동물모델에 관한 것이다. 본 발명에 따른 FGF2를 유효성분으로 포함하는 치료제는 기도섬유화(fibrosis), 기도염증, 기도과민성, 기도개형, 천식 및 COPD의 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 난알부민 및 이중가닥 RNA를 이용해 개발된 천식 및 COPD 동물 모델은 천식 및 COPD 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

천식, 만성폐쇄성 폐질환, FGF2

Description

ＦＧＦ2를 유효성분으로 포함하는 천식 및 만성폐쇄성 폐질환 예방 또는 치료제{AN AGENT COMPRISING FGF2 AS AN EFFECTIVE INGREDIENT FOR TREATMENT OR PREVENTION OF ASTHMA AND CHRONIC OBSTRUCTIVE PULMONARY DISEASE}

도 1A는 IL-4 과발현 형질전환마우스군에서의 기도과민성을 나타낸 결과이다.

도 1B는 IL-9(-)/IL-13(+/+), IL-9(-)/IL-13(-/-), IL-9(+)/ IL-13(+/+) 및 IL-9(+)/IL-13(-/-) 형질전환마우스군에서의 기도과민성을 나타낸 결과이다.

도 2는 IL-13 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군의 기도과민성을 나타낸 결과이다.

도 3은 IL-13 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군 간의 기관지폐포세척액(BAL) 내 VEGF와 TGF-β1의 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 4는 IL-13 과발현 형질전환마우스군 및 정상마우스군에서 VEGF 수용체2의 억제제인 SU1498의 투여에 의한 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 5는 FGF2 결핍마우스군 및 정상마우스군 간의 기관지폐포세척액(BAL) 내 혈관내피성장인자(VEGF) 및 TGF-β1의 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 6은 FGF2 또는 FGF2 및 VEGF 차단 마우스 군의 기도과민성을 나타낸 그래 프이다.

도 7은 TGF-β1 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군의 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 8은 TGF-β1 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군의 시간에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 9는 정상 마우스 또는 FGF2 결핍된 마우스에 TGF-β1 투여 후 시간에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 10은 FGF2 결핍마우스군과 정상마우스군 간의 폐조직 내 콜라겐 양을 나타낸 그래프이다.

도 11은 IFN-γ 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군 간의 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 12는 IFN-γ 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군 간의 기관지폐포세척액(BAL) 내 VEGF, TGF-β1 및 IP-10의 발현 양상을 나타낸 그래프이다.

도 13은 IFN-γ 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군 간의 폐조직 내 FGF2의 발현을 나타낸 아가로스 겔 사진이다.

도 14A는 IFN-γ(-)/FGF2(+/+), IFN-γ(-)/FGF2(-/-), IFN-γ(+)/FGF2(+/+) 또는 IFN-γ(+)/FGF2(-/-) 형질전환마우스군에서 기관지폐포세척액 내 총세포(T), 대식세포(M), 림프구(L), 호중구(N), 호산구(E)세포수를 낸 그래프이다.

도 14B는 IFN-γ(-)/FGF2(+/+), IFN-γ(-)/FGF2(-/-), IFN-γ(+)/FGF2(+/+) 또는 IFN-γ(+)/FGF2(-/-) 형질전환마우스군에서 메타콜린양에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 14C는 IFN-γ(-)/FGF2(+/+), IFN-γ(-)/FGF2(-/-), IFN-γ(+)/FGF2(+/+) 또는 IFN-γ(+)/FGF2(-/-) 형질전환마우스군에서 기관지폐포세척액(BAL) 내 VEGF, TGF-β1 및 IP10의 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 15는 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여하였을 때 메타콜린 양에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 16은 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여하였을 때 기관지폐포세척액(BAL) 내 총세포, 대식세포, 림프구, 호중구, 호산구 세포수를 나타낸 그래프이다.

도 17은 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여하였을 때 기관지폐포세척액(BAL) 내 사이토카인들(VEGF, IL-5, IL-13 및 IP-10)의 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 18은 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여하였을 때 기관지폐포세척액(BAL) 내 IFN-γ 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 19는 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여되었을 때 혈청 내 알레르겐 특이 항체(IgG1 및 IgG2a) 생성량을 나타낸 그래프이다.

도 20은 Th2 천식 실험마우스군과 정상마우스군에 재조합 FGF2(rFGF2) 투여 후 메타콜린 농도에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 21은 Th2 천식 실험마우스군과 정상마우스군에서 재조합 FGF2(rFGF2) 투여한 후 기관지폐포세척액(BAL) 내 총세포, 대식세포, 림프구, 호중구, 호산구 세 포수를 낸 그래프이다.

도 22는 Th2 천식 실험마우스군과 정상마우스군에서 재조합 FGF2(rFGF2) 투여한 후 기관지폐포세척액 내 사이토카인(VEGF, IL-13, IL-5 및 IP-10)의 양을 나타낸 그래프이다.

도 23은 Th2 천식 실험마우스군과 정상마우스군에서 재조합 FGF2(rFGF2) 투여여부에 따른 폐조직의 병리학적 사진이다.

도 24는 중증 천식환자의 유도객담 내 호산구 양성군(Eosinophilic) 및 음성군(Non-eosinophilic)의 비율을 나타낸 그래프이다.

도 25는 천식환자의 중증도에 따른 유도객담 내 IL-4 및 IFN-γ의 발현양을 나타낸 그래프이다.

도 26은 조건적 IFN-γ 과발현 형질전환마우스 군 및 정상마우스 군에 있어서, 과발현 유도물질 독시사이클린(doxycycline) 투여 여부에 의한 기관지폐포세척액(BAL) 내 총세포, 대식세포, 림프구, 호중구, 호산구 세포수를 낸 그래프이다.

도 27은 IFN-γ(-)/FGF2(+/+), IFN-γ(-)/FGF2(-/-), IFN-γ(+) /FGF2(+/+) 또는 IFN-γ(+)/FGF2(-/-) 형질전환마우스군에서 메타콜린양에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 28은 IFN-γ 과발현 형질전환마우스에 있어서 FGF2의 존재 유무에 따른 폐의 크기를 나타낸 사진이다.

도 29는 IFN-γ 과발현 형질전환마우스에 있어서 FGF2의 존재 유무에 따른 폐의 부피 변화를 나타낸 그래프이다.

도 30은 IFN-γ 과발현 형질전환마우스에 있어서 FGF2의 존재 유무에 따른 폐의 섬유화 정도를 나타낸 그래프이다.

도 31은 IFN-γ 과발현 형질전환마우스에 있어서 FGF2의 존재 유무에 따른 폐실질 조직파괴 정도를 나타낸 폐조직병리학적 사진이다.

본 발명은 섬유모세포 성장인자 2(Fibroblast Growth Factor-2, FGF2 또는 basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)를 유효성분으로 포함하는 천식(喘息, Asthma) 및 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) 예방 또는 치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 난알부민(Ovalbumin, OA) 및 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의해 유도되는 Th1 천식 및 COPD 마우스 동물모델에 관한 것이다.

지난 20년 동안, 천식(喘息, Asthma)의 발병률은 두 배로 증가하고 오늘날 8%-10%의 세계 인구에 영향을 미치고 있다. 천식은 주로 기도의 만성 염증 질환에 의해 일어나며, 비특이적 자극에 대한 기도과민성(Airway HyperResponsiveness, AHR) 및 기도개형으로 특징 되며 후자는 섬유모세포(Fibroblast) 및 근섬유모세포(myofibroblasts)와 같은 관련된 구성성분의 구조 및 기능의 변화가 수반된다. 천식 종류에는 기관지천식, 심장성 천식 등이 있는데, 단순히 천식이라고 하면 기관 지 천식을 뜻한다.

천식과 함께 대표적인 폐질환의 하나인 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)은 비가역적인 기도의 폐색을 동반한다는 점에서 천식과 다르며 현재 세계 사망률 4위를 차지하고 있고, 10대 질환 중 유일하게 그 발병률이 증가하는 중요한 질환이다. COPD는 기도 및 폐실질 염증에 의한 세기관지 및 폐실질의 병리학적 변화에 의해 발생하는 병으로, 폐쇄성 세기관지염 및 폐기종(폐실질 파괴)을 특징으로 한다. 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)의 종류에는 만성폐쇄성기관지염(Chronic obstructive bronchitis), 만성세기관지염(Chronic bronchiolitis) 및 폐기종(Emphysema)이 있다.

이러한 천식 및 만성폐쇄성 폐질환을 치료하는 종래의 방법은 항염증 작용을 갖는 치료제나 기관지확장 효과를 갖는 치료제를 이용하는 것이다. 상기 항염증 작용을 갖는 대표적인 치료제는 글루코콜티코이드(glucocorticoid), 루코트리엔 모디파이어(leukotriene modifiers), 데오필린(theophylline) 등이 있다.

그러나 상기 글루코콜티코이드(glucocorticoid)는 효과 면에서는 강력하나 약물부작용이 문제가 되어 흡입 치료를 시행하고 있고, 치료효과도 선택적으로 작용하는 것이 아니라 모든 면역반응과 항염증반응을 억제하기 때문에 경우에 따라서 필요한 면역반응까지 억제하는 문제점이 있다. 상기 루코트리엔 모디파이어(leukotriene modifiers)는 부작용은 적지만 효과 면에서 한계가 있어 단독으로 사용 시에는 천식을 조절할 수 없다. 따라서 대부분 보조적으로 사용하고 있는 문제 점이 있다. 상기 데오필린(theophylline)은 효과 면에서도 뛰어나지 못하며 부작용의 우려가 있는 문제점이 있다.

따라서, 효과가 뛰어나고 부작용이 적은 치료제의 개발이 절실히 요구되며 이를 위해서는 천식의 발생 기전에 대한 정확한 이해가 필요하다.

이와 관련하여 천식발생에 있어 타입 1의 헬퍼(helper) T 세포(type1 helper T cells, Th1) 또는 타입 2의 헬퍼 T 세포(type2 helper T cells, Th2)가 분비하는 사이토카인이 중요한 역할을 하며 Th1과 Th2에 의해 분비되는 사이토카인 간의 불균형에 의해 천식이 유발된다는 것이 종래의 일반적인 가설이나(Th1/Th2 가설)(Mosmann et al., J. Immunol., 136: 2348-57, 1986; Robinson et al., N. Engl. J. Med., 326: 298-304, 1992; Grunig et al., Science, 282: 2261-3, 1998; Richter et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 25: 385-91, 2001) 이에 관한 자세한 기전은 밝혀지지 않았다.

Th2 세포에 의해 생산되는 사이토카인 중 특히 인터루킨 13(Interleukin-13, IL-13)이 천식의 발생 기전에 있어 중요한 것으로 생각되고 있다(Grunig et al., Science, 282: 2261-3, 1998). 이러한 사실은 다음의 보고에 이해 뒷받침된다. 알레르기 천식동물모델에서 IL-13을 차단하였을 때 알레르겐에 의한 기도과민성이 억제되며, 다시 재조합 IL-13을 기도 내로 투여하였을 때 기도과민성이 유도되며(Marsha et al., Science, 282: 2258-2261, 1998), IL-13 과발현 형질전환마우스에서 보이는 조직 소견은 천식환자에게서 보이는 것과 유사하며, 과발현된 IL-13이 기도의 염증, 점액분비의 증가, 상피세포 섬유화 등을 유도한다(Zhu et al., J. Clin. Invest., 103:779-788, 1999).

한편, IL-13은 호산구 (eosinophils)와 같은 염증세포의 침윤을 증진시켜 AHR을 촉진한다고 알려졌었으나(Hargreave et al., J. Allergy clin. Immunol., 78: 825-32, 1986), 최근 들어서는 IL-13에 의한 기도과민성의 유도가 호산구의 침윤과 상관없이 일어날 수 있다는 증거들이 제시되고 있다(Venkayya et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 26: 202-8, 2002).

이러한 IL-13에 의한 천식은 전환성장인자-베타1(Transforming Growth Factor β1, TGF-β1) 또는 혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)를 통하여 발생하는 것으로 알려져 있다 (Lee et al., Nat. Med., 10: 1095-1103, 2004).

TGF-β1은 조직 손상 후 상처부위를 치료하는 가장 중요한 물질로서 기도개형의 중요한 병리학적 변화인 조직섬유화를 유도한다. 즉, 섬유모세포(fibroblasts)를 근섬유모세포(myofibroblasts)로 변화시키고, 근섬유모세포는 휴식중인 섬유모세포(resting fibroblasts) 보다 콜라겐을 더 많이 분비하여 조직섬유화를 통한 기도개형을 유발한다(Vignola et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 156: 591-599, 1997). 이는 IL-13 과발현 형질전환마우스가 주로 TGF-β1 의존적인 경로를 통해 폐의 섬유화를 유도한다는 보고와 일치하는 것이다(Lee et al., J. Exp. Med., 194: 809-21, 2001).

상기의 조직섬유화 과정에서 TGF-β1은 섬유모세포 성장인자 2(Fibroblast Growth Factor-2, FGF2 또는 basic Fibroblast Growth Factor, bFGF) 및 그의 수용체 FGF receptor-1 (FGFR-1) 또는 FGF receptor-2(FGFR-2)를 유도하는 것으로 알려졌다. 이러한 FGF2는 종전에 내피세포 또는 평활근세포의 증식을 담당하며, 혈관 신생에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 왔으나(Nugent et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 32: 115-20, 2000) 기도과민성과 천식의 발병에 있어서 FGF2의 역할에 대해서는 현재까지 전혀 알려지지 않은 상태이다.

혈관내피성장인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)는 모세혈관에서 혈장 단백질의 투과를 증가시키는 사이토카인의 일종으로 세포의 분열과 이동을 촉진하며 세포의 재구성을 일으키는 단백질 분해효소를 유도하는 기능을 한다. 또한, 세포사멸의 억제를 통해 새로 형성된 혈관의 생존을 유지시키며 신경세포의 항원 제공을 억제하여 면역조절을 담당하고 세포의 성장 및 분열을 유도한다. 본 발명자는 항원과 이물질에 대한 면역 반응에 있어서 IL-13과 VEGF가 서로 양성적 피드백 고리(Positive Feedback Loop)를 형성할 수 있음을 이미 밝힌바 있다(Lee et al., Nat. Med., 10: 1095-1103, 2004). VEGF를 통한 천식의 발생에 있어서도 FGF2의 역할은 현재까지 전혀 알려지지 않은 상태이다.

다음으로, 천식의 발생과 관련하여 논의되는 또 다른 기전은 사이토카인 Th1에서 분비하는 인터페론-감마(Interferon-γ, IFN-γ)에 의한 것이다. IFN-γ는 병원체에 대한 방어기전으로 Th1 세포에서 분비되는 물질로서(Fong et al., J. Imunol., 143: 2887-93, 1989), Th2에 의한 사이토카인의 생산을 저해하는 것으로 알려져 왔다(Mosann et al., J. Immunol., 136: 2348-57, 1986). 따라서 Th1/Th2 가설에 의하면, IFN-γ가 이에 의해 발생하는 천식을 억제할 수 있을 것으로 생각되었다. 그러나 이러한 이론에 대한 견해는 첨예하게 대립하며, 반대견해는 IFN-γ 과발현 형질전환마우스에서도 천식과 유사한 기도개형이 관찰되고(Wang et al., J. Exp. Med., 192: 1587-1600, 2000), 특히 천식 환자의 중증도와 IFN-γ의 증가가 유의한 상관관계를 갖는다는 여러 보고에 의해 뒷받침된다(Corrogan et al., Lancet 1: 1129-32, 1988; Mognan et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 161: 1790-6, 2000).

아울러, 상기 반대견해는 천식치료제로 현재 가장 널리 사용되고 있는 코르티코스테로이드(corticosteroids), 베타2-자극제(β2-adrenergic agonists) 및 메틸잔틴계 약물(Methylxanthine derivatives) 등의 약리작용이 면역학적 면에서는 Th2 면역반응을 억제하는 것보다 오히려 Th1 면역반응을 억제한다는 사실에 의해 또한 뒷받침된다. 따라서 Th1/Th2 가설에 따른 Th2의 면역반응의 증진으로 천식의 발병기전을 설명하는 것은 한계가 있다.

한편, COPD와 관련하여 현재까지 정확한 발생기전은 거의 알려져 있지 않으며, 여러 가지 치료방법이 사용되고 있으나 발병 및 경과 진행을 근본적으로 치료할 수 있는 약제는 없는 실정이다. 따라서 COPD의 병인 기전 연구 및 이에 근거한 근본적 약제 개발이 절실한 실정이다.

그러나 최근 형질전환마우스를 이용한 연구결과를 살펴보면, 천식의 발생에 관여하는 것으로 밝혀진 IFN-γ(Wang et al., J. Exp. Med., 192: 1587-600, 2000) 및 IL-13(Zheng et al., J. Clin. Invest., 106: 1081-93, 2000)이 사람의 COPD와 유사한 병리소견을 유도해낼 수 있는 물질로서 주목받고 있다. 언급한 바와 같이 이러한 사이토카인들은 주로 면역세포에서 분비되는 것으로서, COPD의 병인 기전에 있어 면역반응의 역할이 대단히 중요할 것임을 시사한다. 면역세포에서 분비되는 IFN-γ 및 IL-13은 COPD의 주요 증상인 기도 및 폐실질 염증 반응에서 공격인자로서 주요한 역할을 담당하며, 이러한 염증반응으로 인한 조직 손상 등을 치유하는 과정에서 방어인자로 기도 및 폐포 상피세포의 재생과정이 특히 중요한데(Lee et al., J. Exp. Med., 200: 377-89, 2004) 이 과정에서 공격인자가 지나치게 강하거나 이를 치유하는 방어인자가 지나치게 부족한 상황에서 COPD가 발생할 수 있을 것으로 생각되어 진다.

이에 본 발명자들은 FGF2의 천식발생 및 COPD 발생에 있어서 IL-13, TGF-β1, VEGF 및 IFN-γ와 관련된 새로운 역할을 규명하여, FGF2가 인터루킨-13에 의해 유도되는 혈관내피 성장인자에 의한 기도(氣道)의 기도과민성을 억제함으로써 기도과민성을 낮추고, 인터페론-감마에 의한 기도과민성, 기도 및 폐실질의 염증에 의한 폐기종을 억제함을 확인함으로써, FGF2가 천식 및 COPD를 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

또한, 난알부민 및 이중가닥 RNA를 이용하여 천식 및 COPD 모델을 개발하여 천식 및 COPD 치료제 개발에 있어서 효율적인 실험 수행을 가능케 하는 Th1 천식 및 COPD 동물모델을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 섬유모세포 성장인자 2(Fibroblast Growth Factor-2, FGF2 또는 basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)를 유효성분으로 포함하는 천식(喘息, Asthma) 및 만성폐쇄성폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD) 예방 또는 치료제를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 알레르겐으로서 난알부민(OAlbumin, OA) 및 이중가닥 RNA(dsRNA)에 의해 유도되는 Th1 천식 및 COPD 마우스 동물모델을 제공하는 것이다.

본 발명은 FGF2 (Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 천식 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 천식이 IL-13(Interleukin-13)의 과발현에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 천식이 IFN-γ(Interferon-γ)의 과발현에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 FGF2가 IL-13의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 FGF2가 혈관내피생성인자(VEGF)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 FGF2가 TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 FGF2(Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 만성폐쇄성 폐질환이 IFN-γ(Interferon-γ)의 과발현으로 유도되는 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명은 또한 난알부민을 포함하는 알레르겐 및 이중가닥 RNA를 기도 내로 직접 투여하는 것을 포함하는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 동물이 마우스인 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 (COPD) 동물모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 제조방법이 하기의 단계를 포함하는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법을 제공한다:

(1) BALB/c 마우스에 5-15㎍의 이중가닥 RNA인 polyinosinic-polycytidylic acid 및 50-100 ㎍의 난알부민을 4번 비강으로 투여하여 감작하는 단계;

(2) 10일 후 25-75 ㎍의 난알부민을 비강으로 감작하는 단계.

본 발명은 또한 상기 단계 (1)의 감작하는 이중가닥 RNA는 10㎍으로 사용되 는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 단계 (1)의 감작하는 난알부민은 75㎍의 난알부민이고, 단계 (2)의 10일 후 50㎍의 난알부민으로 사용되는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 천식은 비호산구성인 것을 특징으로 하는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 방법에 따라 제조된 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 (COPD) 동물모델을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 동물이 마우스인 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 (COPD) 동물모델을 제공한다.

본 발명은 또한 FGF2(Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 IL-13, VEGF 또는 TGF-β1 활성 억제제를 제공한다.

본 발명은 또한 FGF2(Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 기도섬유화(fibrosis), 기도염증, 기도과민성 또는 기도개형 억제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 FGF2를 유효성분으로 포함하는 천식의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다. 상기 천식은 IL-13(Interleukin-13) 또는 IFN-γ(Interferon-γ)의 과발현에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제를 제공한다. 상기 FGF2는 IL-13(Interleukin-13), 혈관내피생성인자(VEGF), 또는 TGF-β 1 (Transforming Growth Factor-β1)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제를 제공한다.

천식이란, 기관지천식, 심장성 천식 등을 포함하며 바람직하게는 기관지천식을 뜻한다. 천식의 특징적 증상은 기도과민성 및 기도개형이다.

기도 개형은 유전적 소인이 있는 사람에서 알레르기 항원, 감염, 또는 자극제 등으로 인해 면역반응이 증가하여 일어나게 되며, T세포가 세포 간의 정보교환물질인 사이토카인(cytokine)을 분비하게 되고, 분비된 사이토카인은 염증세포를 조직 내로 이동시켜 기도의 만성적인 염증을 반복적으로 유발하여 결국 기도가 재형성되는 것이다.

기도과민성은 천식 발생의 주요 인자라 생각되고 이것이 다른 호흡기 질환과 구별되는 점이다. 그러나 이러한 기도과민성증상은 기도 개형의 특징인 기도민무늬근증식증(airway smooth muscle hyperplasia), 수축성(contractility) 및 상피하 및 폐 유조직 섬유화 등이 수반된다. 따라서, 기도염증, 기도과민성 및 기도개형은 서로 밀접불가분의 관계를 갖으며, 한 증상의 치료가 다른 증상의 치료를 수반할 수 있으며, 하나의 치료제로 기도염증, 기도과민성 및 기도개형 모두를 치료할 수 있다.

이러한 특징을 갖는 천식의 경로와 관련하여 고전적으로 중요하게 알려진 대표적인 Th2 사이토카인 IL-4를 과발현하는 형질전환마우스(IL-4 TG(+))는 정상마우스(WT)와 비교하였을 때 기도과민성에 차이가 없었으나(도 1A), 반면 Th2 사이토카 인인 IL-9 과발현 형질전환마우스(IL-9(+)/IL-13(+/+))의 경우 정상 마우스에 비해 기도과민성이 증가되어 있지만, IL-13 유전자를 제거할 경우(IL-9(+)/IL-13(-/-)) 기도과민성이 사라지는 것으로 보아 IL-9 과발현에 의한 천식이 IL-13을 통해 매개됨을 알 수 있다는 사실에 의해 뒷받침된다(도 1B 참조).

이를 증명하기 위해 IL-13을 과발현하는 형질전환마우스를 제작하여 기도과민성, IL-13에 의해 과발현되는 것으로 알려진 TGF-β1과 VEGF 간의 관계를 평가하였을 때, 평균적으로 IL-13을 과발현하는 형질전환마우스에서 기도과민성이 정상마우스에 비해 증가하여 있음을 알 수 있다(도 2 참조).

또한, IL-13 과발현된 형질전환 마우스의 기관지 폐포세척액(bronchoalveolar lavage, BAL)에서 TGF-β1과 VEGF 생성이 증가(도 3 참조)하였으며 이러한 결과는 또한 IL-13에 의한 기도과민성이 하부 단계의 물질인 TGF-β1과 VEGF에 의해 조절됨을 의미한다.

나아가 IL-13 경로에 의한 기도과민성이 하부단계에서 VEGF에 의하여 조절된다는 것은 수용체2의 신호전달 차단제(signaling blocker)인 SU1498을 사용하여 IL-13에 의해 유도되는 기도과민성이 저해됨을 확인하여 증명되었다(도 4 참조).

나아가 상기와 같은 IL-13 경로에 의한 천식에 있어 FGF2의 역할은 규명되지 않은 상태로서 본 발명자들은 FGF2가 IL-13에 의해 유도되는 VEGF 및 TGF-β1을 통한 천식의 증상 치료에 효과적임을 확인하였다. FGF2 결핍마우스를 사용하여 FGF2가 차단되면 정상마우스에 비해 VEGF의 양이 증가함을 관찰하였고(도 5 참조), 따라서 기도과민성도 증가함을 확인하였다(도 6 참조). 이는 FGF2 결핍마우스에 VEGF를 동시에 차단할 경우 기도과민성이 억제된다는(도 6 참조) 실험결과와 일치하는 것이다.

이는 FGF2가 IL-13에서 VEGF로 이어지는 천식의 치료에 효과적일 수 있음을 나타내는 것으로 하기의 결과로부터 증명된다.

IL-13이 주요 매개체로 작용하는 Th2 천식모델에 있어서 FGF2를 투여한 후 이의 효과를 측정한 결과, FGF2는 메타콜린에 대한 기도과민성을 낮추고(도 20 참조), 기관지 폐포세척액에서 염증세포수를 감소시키며(도 21 참조), Th2 천식의 중요한 매개인자인 IL-13 및 VEGF의 발현을 억제함을 관찰하였다(도 22 참조). 또한, 조직학적 검사결과 FGF2에 의해 폐기관지벽의 비후 및 폐색이 감소하여 폐조직이 정상과 유사하게 됨을 확인하였다(도 23 참조). 상기 결과로부터 FGF2가 VEGF와 IL-13 생성을 억제하여 기도과민성과 염증을 저해하여 천식의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

IL-13 천식 경로의 또 다른 하부단계 물질인 TGF-β1과 관련하여, 종전에 TGF-β1으로 형질전환된 마우스에서 폐기관지의 기도개형이 관찰되었고(Lee et al., J. Exp. Med., 200: 377-389, 2004), IL-13으로 유도되는 폐기관지의 섬유화는 TGF-β1에 의존적임이 보고된바 있다(Lee et al., J. Exp. Med. 194: 809-821, 2001). TGF-β1으로 형질전환된 마우스에서 TGF-β1에 의해 기도의 저항력과 기도 폐색이 심각하게 유도되었으며(도 7 참조), 메타콜린에 의한 기도과민성은 억제됨을 관찰하였다(도 8 참조).

이러한 TGF-β1을 통한 IL-13 경로에 의한 천식에 있어 FGF2의 역할은 규명을 위해 FGF2를 결핍시킨 마우스에서 기도과민성을 측정하여 비교한 결과, TGF-β1에 의한 기도과민성의 감소 효과가 FGF2 결핍마우스에서는 나타나지 않음을 확인할 수 있었다(도 9 참조). 상기 결과는 TGF-β1에 의한 기도과민성의 감소는 TGF-β1 자체에 의한 것이라기보다는 TGF-β1과 같이 발현되는 FGF2에 의해 기인한 것임을 나타낸다. 즉, FGF2가 존재하는 상태에서 TGF-β1의 증가는 기도과민성을 낮추지만, FGF2가 없는 상태에서는 TGF-β1에 관계없이 기도과민성이 증가하는 것을 알 수 있다.

이상의 실험 결과로부터 FGF2의 역할을 서술하면, 기도의 조직이 손상을 입으면 면역시스템이 작동되고 TGF-β1에 의해 기도평활근육세포 (Airway smooth muscle cell)와 섬유모세포(Fibroblast)가 근섬유모세포 (Myofibroblast)로 변환이 되어 변환된 근섬유모세포에 의해 섬유증 (Fibrosis)이 유발되며, 이 때 TGF-β1에 의해 감소한 기도평활근육세포 및 섬유모세포의 세포수를 보충하기 위하여 FGF2는 기도평활근육세포 및 섬유모세포의 증식시킴과 동시에, 상기 근섬유모세포의 기도평활근육세포 및 섬유모세포로의 변환을 유도한다. 따라서 FGF2는 근섬유모세포를 섬유모세포로 변화하여 근섬유모세포의 세포수를 줄여 기도개형을 줄이고 동시에 기도과민성을 낮추는 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

이러한 FGF2에 의한 기도개형의 억제를 설명하기 위해 FGF2 결핍마우스에서 콜라겐량과 기도과민성을 측정한 결과, FGF2 결핍마우스의 폐에서는 콜라겐을 분비하는 섬유모세포의 수가 정상 실험마우스에 비해 상대적으로 적었으며(도 10 참조), 이는 FGF2에 의한 섬유모세포의 증식이 이루어지지 않아 세포수가 적어지게 되고 이로 인해 섬유모세포에서 분비되는 콜라겐의 양이 적게 나타나는 것으로 표현되는 것이다. 또한, 메타콜린에 의한 기도과민성을 측정한 결과 FGF2가 정상적으로 존재하는 정상마우스는 기도과민성에 큰 영향을 받지 않는데 반해 FGF2가 결핍된 경우 기도과민성이 크게 높아짐을 관찰하였다(도 9 참조). 상기의 결과는 IL-13에서 TGF-β1로 이르는 경로에 있어 FGF2가 결핍되면 섬유모세포의 증식 및 근섬유세포에서 섬유모세포로의 변환이 이루어지지 않아 기도개형이 진행되며 메타콜린 반응에 강한 섬유모세포의 수가 감소하여 기도과민성이 증가하는 것으로 해석된다. 따라서, 이는 FGF2가 IL-13에서 TGF-β1 경로에 의한 천식의 치료에도 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

종전의 IL-13을 통한 천식의 경로 이외에 Th1 사이토카인인 IFN-γ 도 천식의 발생에 중요함이 대두되고 있다. Th1에서 분비되는 사이토카인 특히 IFN-γ는 천식과 높은 상관관계가 있음이 여러 연구에서 밝혀져 왔는데도, 이러한 Th1의 활성화로 인해 진행되는 천식모델은 아직까지 존재하지 않는다. 이것은 기존 천식연구의 대부분이 Th2의 활성화에 의해 천식이 발생한다는 Th1/Th2 이론에 초점을 맞추고 있었기 때문에, 호산구나 면역글로불린 E(Immunoglobulin E, IgE)가 과발현될 수 있는 천식모델만을 제조 사용했기 때문이다.

그러나 최근 호산구성 염증이 없이도 기도과민성이 유도될 수 있으며(Venkayya R, Am J Respir Cell Mol Biol 2002; 26: 202-8), 비호산구성 천식 환자가 전체 천식 환자의 과반수라는 연구결과 등이 보고되고 있다(Douwes et al., Thorax, 57: 643-8, 2002). 따라서 기존의 가설을 뛰어넘어 Th1 타입의 천식모델 제조 및 이를 이용한 연구가 시급한 실정이다.

이에 본 발명자들은 IFN-γ에 의해 유도된 Th1 천식 및 COPD 동물모델을 생산하고 이에서 FGF2의 역할을 규명하여 FGF2가 IFN-γ에 의한 천식 및 COPD의 치료에도 유용함을 발견하였다.

따라서 본 발명은 FGF2(Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 천식의 예방 또는 치료제이외에 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 예방 또는 치료제를 제공한다. 상기 만성폐쇄성 폐질환 (COPD)은 IFN-γ(Interferon-γ)의 과발현에 의해 유발될 수 있다.

우선, IFN-γ에 의한 천식에서 IFN-γ와 FGF2의 관계를 규명하기 위해 IFN-γ로 형질전환된 마우스의 폐로부터 FGF2의 발현을 RT-PCR을 이용하여 측정한 결과, 정상 마우스와 대조적으로 FGF2의 발현이 현저하게 저해됨을 관찰하였다(도 13 참조). 상기 결과로, FGF2는 IFN-γ의 신호전달체계에 의해 그 발현이 억제됨을 의미한다.

한편, IFN-γ에 의해 유도되는 기도염증 및 기도과민성에서 FGF2의 역할을 살펴보고자, IFN-γ 과발현 형질전환 마우스에 FGF2 유전자 결핍을 유도(IFN-γ (+)/FGF2(+/+))하여 기도과민성을 측정하였고, BAL내 염증세포수, 및 염증관련 사이토카인의 발현 양을 측정하였다. 그 결과, IFN-γ 과발현 형질전환 마우스에서 FGF2 유전자 결핍시(IFN-γ(+)/FGF2(+/+)) 기도과민성 및 염증이 현저히 증가함을 관찰하였다(도 14A, B 참조). 이러한 IFN-γ 과발현 형질전환 마우스에서 FGF2결핍에 의한 기도과민성 및 염증의 증가는 VEGF의 증가가 중요한 역할을 할 것으로 생각된다(도 14C 참조). 상기 결과는 FGF2가 IFN-γ에 의해 유도되는 기도염증 및 기도과민성 또한 FGF2로 유용하게 치료될 수 있음을 나타낸다.

IFN-γ가 주요 매개체로 작용하는 Th1 천식모델에 있어서 FGF2의 활성을 측정한 결과, FGF2는 메타콜린에 대한 기도과민성을 낮춘다(도 27 참조). 상기 결과로부터 FGF2가 IFN-γ 경로를 통하는 천식의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이어 FGF2를 상기 Th1 천식 및 COPD 마우스에 투여하여 치료 효과를 측정하였다.

FGF2 처리시 상기 마우스에서는 BAL내 염증세포수(도 26 참조) 및 메타콜린에 대한 기도과민성(도 36 참조) 감소하였다.

나아가 상기 마우스는 기도과민성 이외 COPD의 증상인 폐실질세포 사멸을 유발시킨다. 이러한 기도과민성과 폐실질세포의 사멸은 FGF2의 유무에 의해 영향을 받는다. IFN-γ가 과발현된 실험마우스에 FGF2 투여시 기도과민성이 감소하고 (도 27 참조), IFN-γ에 의해 유도되는 폐실질세포의 파괴 역시 FGF2의 투여에 의해 감 소한다(도 28 및 도 29 참조). 또한, IFN-γ에 의한 조직손상 및 폐포 파괴 또는 폐기종 역시 FGF2 투여에 의해 감소한다(도 30 및 도 31 참조).

이상에서 살펴본 바와 같이 천식 및 COPD에 있어서 성장인자로 알려진 FGF2가 오히려 기도과민성을 낮추고 폐포 파괴를 억제하여 천식 및 COPD의 치료 또는 예방제로서의 효과가 있음을 알 수 있다.

한편, 본 발명의 FGF2를 유효성분으로 포함하는 천식 또는 COPD의 예방 또는 치료제는 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 치료제는 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 치료제는, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 치료제의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내, 국소 또는 비강에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 비강투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.005 내지 10 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.05 내지 1 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 치료제는 암의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 FGF2를 마우스에 비강 내로 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다.

나아가, 본 발명은 난알부민을 포함하는 알레르겐 및 이중가닥 RNA를 기도 내로 직접 투여하는 것을 포함하는 Th1 천식 또는 COPD 동물모델의 제조방법을 제공한다.

상기의 방법은 하기의 단계를 포함한다:

(1) BALB/c 마우스에 5-15㎍의 이중가닥 RNA인 polyinosinic-polycytidylic acid 및 50-150 ㎍의 난알부민을 4번 비강으로 투여하여 감작 단계; 및

(2) 10일 후 25-75 ㎍의 난알부민을 비강으로 감작하는 단계.

상기 단계 (1)의 감작하는 이중가닥 RNA는 10㎍으로 사용되는 것이 바람직하다. 상기 단계 (1)의 난알부민은 75㎍으로 사용되는 것이 바람직하다. 상기 단계 (2)의 10일 후 사용되는 난알부민은 50㎍으로 사용되는 것이 바람직하다.

상기 천식은 비호산구성인 것일 수 있다.

나아가 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 Th1 천식 또는 COPD 동물을 제공한다.

상기의 동물은 실험용으로 사용되는 모든 포유류에 속하는 동물을 포함하며 바람직하게는 마우스이다.

Th1 천식 또는 COPD 동물모델의 제조와 관련하여, 바이러스의 복제단계에서 생성되는 이중가닥 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)는 생체 내에서 항바이러스 활성을 나타내는 제1형(typeⅠ) 인터페론(IFN)인 IFN-α, IFN-β를 강력하게 유도한다고 알려져 있다(Guidotti et al., Annu. Rev. Immunol., 19: 65-91, 2001). 그 리고 이러한 제1형 인터페론은 IL-12 및 IFN-γ의 생성을 촉진하는 한편, 수지상세포의 성숙과 T세포의 초회항원자극(priming)을 증진시켜 획득면역 반응을 유도할 수 있음이 알려져 있다(Londhe et al., FEBS Lett., 553: 33-8, 2003). 따라서 본 발명자들은 dsRNA를 처리하여 Th1 경로에 의해 천식이 유발된 동물모델을 제조하였다.

동물모델의 제조에 사용된 dsRNA의 구체적 서열 및 길이는 Th1 천식을 유도하는 한 제한이 없으며 시중의 것을 구입하여 사용할 수 있으며 바람직하게는 polyinosinic-polycytidylic acid(polyI:C)이다.

상기 Th1 경로에 의해 천식이 유발된 마우스는 기도과민성이 증가함을 확인하였고(도 15 참조), 림프구와 호중구, 대식세포와 같은 세포 수는 증가했지만 호산구 수는 증가하지 않음을 관찰하였으며 매개인자로는 Th1 반응과 관련 있는 IP-10만이 현격히 증가하였다(도면 16 및 도 17 참조). 상기 결과는 OA 및 dsRNA에 의해 비호산구성기도염증(non-eosinophilic airway inflammation)이 유도되었음을 의미한다. 또한, 폐기관지 세척액 내에 IFN-γ의 증가와 혈액 중 항원 특이 IgG1과 IgG2의 증가를 확인하였다(도 18 및 도 19 참조). 이로써, OA 및 dsRNA에 의한 기도 감작은 IFN-γ와 항원-특이적 IgG2a에 의한 것으로 항원-특이적 IgE와는 관련이 없는 것으로 보아 Th1 동물모델의 확립을 확인하였다.

아울러, 상기 동물모델은 COPD의 증상을 또한 나타내었는데, 즉 폐의 크기 및 용적 증가와 폐포의 사멸과 함께 콜라겐량의 증가로부터 심각한 섬유화(fibrosis)가 초래되었음을 확인할 수 있었다(도 28 내지 31 참조).

상기 결과로부터 Th1 천식모델 마우스가 또한 COPD의 병인 기전을 나타낼 수 있는 모델임을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 알레르겐(난알부민, OA) 및 이중가닥 RNA(dsRNA)를 기도 내로 직접 투여하여 만든 Th1 또는 비호산구성 천식 동물모델임을 확인하였고, 천식 및 COPD 모델을 개발하여 천식 및 COPD 치료제 개발에 있어서 효율적인 실험 수행에 유용하게 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> IL-13 과발현에 의한 천식의 발생 및 VEGF 및 TGF-β1과의 관련성

IL-13에 의한 천식의 발생을 조사하기 위해서 IL-13이 과발현된 형질전환 마우스를 제작하여 이 마우스에서의 기도과민성을 측정하고, 상기 마우스에서 IL-13의 과발현이 TGF-β1 및 VEGF의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.

<실시예 1-1> IL-13 형질전환 마우스 제작

IL-13을 과발현하는 형질전환 마우스는 종전에 기술된 대로 제작하였다(Zhou Zhu et al., J. Clin. Invest., 103: 779-788, 1999; Tang et al., J. Clin. Invest., 98: 2845-2853, 1996; Ray et al., J. Clin. Invest., l00: 2501-2511, 1997). 요약하면, IL-13의 후보유전자를 기도에 선택적으로 발현시키기 위해 항염 증호흡기 세포 중 하나인 클라라(Clara) 세포 10 kDa 단백질(CC10)의 발현을 유도하는 프로모터(University of Cincinnati의 B. Stripp 및 J. Whitsett)에 연결된 IL-13 후보유전자를 포함하는 컨스트럭트를 사용하였다. 마우스 내로 도입된 유전자 발현을 외부에서 조절할 수 있는 유도성 형질전환마우스의 제작을 위해 CC10 프로모터에 역방향의 테트라사이클린 전사조절자(reverse tetracycline transactivator, rtTA)와 인간 성장 호르몬(human growth hormone, hGH) 유전자를 작동가능하게 연결하여 pKS-CC10-rtTA-hGH를 준비하였다(Ray et al., J. Clin. Invest., 98: 2501-2511, 1997). Elutip-D 컬럼(Schleicher and Schuell Inc, USA)으로 상기 플라스미드 DNA를 정제하고 미세주입 버퍼(0.5 mM Trsi-HCl, 25 mM EDTA, pH7.5)로 투석하였다. 이어 상기 기재된 문헌에 따라 전핵내 주입 방법을 이용하여 CBA 마우스 및 C57BL/6 마우스를 교배하여 수득한 F2 난에 상기 플라스미드 DNA를 주입하여 상기 문헌에 기재된 방법에 따라 형질전환마우스를 제작하였다. 모든 형질전환마우스는 형질전환 마우스와 정상 마우스에 무작위로 0.5 mg/ml 독시사이클린(doxycycline, dox)이 포함된 물을 먹인 후 각각의 마우스에서 수득한 기관지폐포세척액에서 IL-13 단백질 수치를 평가하여 형질전환 여부를 평가하였다.

<실시예 1-2> IL-13이 과발현된 형질전환된 마우스에서의 기도과민성 측정

IL-13에 의해 형질전환된 마우스에서의 천식의 발생 여부를 확인하기 위해 천식의 대표적 증상인 기도과민성을 하기와 같이 측정하였다. 기도과민성은 통상적으로 당 업계의 공지된 방법에 따라 DRS(dose response slope)(Pediatric Allergy and Immunology, 14; 193, 2003) 및 Penh(Mckinley et al., Clinical & Experimental Immunology, 136: 224-231, 2004)로 측정될 수 있다. Penh(enhanced pause, Penh)는 최대호기압(peak expiratory pressure, PEP)를 최대흡기압(peak inspiratory pressure, PIP)으로 나눈 값에 포즈(pause)를 곱하여 얻은 값을 구하여 얻을 수 있다. 구체적으로 실시예 1-1의 형질전환된 마우스를 재감작 24시간과 48시간 후 메타콜린(methacholine)으로 3분간 분무(nebulization)하여 기도과민성을 유도하고 동물용 체용적 변동기록기(Whole body plethysmography)을 이용하여 3분간 최대호기압 및 최대흡기압을 10초 단위로 측정하여 3분간 평균하여 데이터로 나타내었다(도 2). 도 2는 IL-13 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군의 기도과민성을 나타낸 결과이다.

도 2에서 보듯이, 전반적으로 IL-13 과발현 형질전환마우스에서 기도과민성이 정상마우스에 비해 증가하였음을 알 수 있다.

<실시예 1-3> 형질전환 마우스에서의 IL-13의 과발현이 VEGF 및 TGF-β1의 발현에 미치는 영향

IL-13의 과발현에 의해 유도된 기도과민성과 IL-13 신호전달경로의 하부에 존재하는 것으로 알려진 VEGF 및 TGF-β1와 관련성을 조사하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 실시예 1-1에 의해 제조된 마우스의 기도에 SP45 관(tube)을 도관(cannulation)하여 0.1% BSA와 0.05mm EDTA를 함유한 멸균 생리 식염수로 세척하여 얻은 기관지폐포세척액(BAL)을 원심분리하였다. 수득한 BAL 상등액에서 ELISA 키트(CalBiotech, USA)를 사용하여 VEGF와 TGF-β1 단백질의 발현량을 측정하였다(도 3). 도 3는 IL-13 과발현 형질전환마우스군 및 정상마우스군에서 기관지폐포세척 액(BAL)에 존재하는 VEGF와 TGF-β1의 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 3에서 보듯이, IL-13의 과발현에 의해 기도과민성이 유발된 형질전환 마우스 유래의 BAL에서 TGF-β1 및 VEGF 생성이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과는 IL-13에 의한 기도과민성이 하부 단계의 물질인 TGF-β1과 VEGF에 의해 조절됨을 시사하며 이는 다음의 실시예 1-4의 결과에 의해 증명된다.

<실시예 1-4> VEGF의 차단제에 의한 기도과민성의 억제

상기 실시예 1-3의 효과를 확인하기 위하여, VEGF 수용체 2의 신호전달경로 차단제(signaling blocker)인 SU1498(EMD Biosciece, USA)를 상기 실시예 1-1에서 제조된 마우스의 복강에 매일 한 번씩 10 mg/kg의 양으로 주사하였다(도 4). 도 4는 IL-13 과발현 형질전환마우스군 및 정상마우스군에서 VEGF 수용체2의 억제제인 SU1498의 투여에 의한 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 4에서 보듯이, IL-13의 과발현에 의해 유도되는 기도과민성이 VEGF 수용체 2의 신호전달경로 차단제에 의해 억제되며 이는 IL-13에 의해 유도되는 기도과민성은 VEGF를 통한 신호전달에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

<실시예 2> IL-13에 의해 유발된 천식에서 FGF2의 역할규명

IL-13 및 이의 하부단계 물질인 TGF-β1과 VEGF의 조절에 의해 발생하는 천식에서의 FGF2 역할을 알아보기 위하여 FGF2 결핍 마우스에서의 기도과민성 및 기도개형 발생 여부를 조사하였다.

<실시예 2-1> FGF2의 결핍에 의한 기도과민성

FGF2의 기도과민성과의 관련성을 조사하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. FGF2 결핍 마우스는 Jackson Lab(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 기도과민성은 메타콜린에 대한 AHR(DRS), 및 기도과민성 마우스에서 증가한 것으로 밝혀진 VEGF 및 TGF-β1 단백질의 BAL에서의 양을 각각 실시예 1-2 및 1-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 측정하였다(도 5 및 6). 도 5는 FGF2 결핍마우스군 및 정상마우스군 간의 BAL 내 VEGF 및 TGF-β1의 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 6은 FGF2 결핍 마우스, 및 실시예 1-4에 기재된 바와 같이 VEGF 차단제로 처리된 FGF2 결핍 마우스군의 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 5에서 보듯이, FGF2 결핍마우스는 정상마우스에 비해 VEGF의 양이 증가하였으며 이는 기도과민성의 증가를 시사하는 것으로 도 6의 결과와 일치하는 것이다.

도 6에서 보듯이, FGF2가 결핍된 마우스에서는 기도과민성이 증가하였고, 이러한 기도과민성은 VEGF 차단제의 투여에 의해 억제됨을 관찰하였다. 이로써 FGF2의 결핍에 의한 기도과민성은 VEGF의 발현에 의한 것으로 FGF2의 투여가 VEGF의 발현을 억제하여 VEGF 경로를 통한 천식의 예방 및 치료에 유용함을 나타낸다.

<실시예 2-2> FGF2의 결핍에 의한 기도개형

FGF2의 기도개형과의 관련성을 조사하기 위하여 기도개형에 수반되는 세포증식 및 변환을 측정할 수 있는 하기의 실험을 수행하였다.

FGF2 결핍마우스는 Jackson Lab(CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 상기 마우스에서 당 업계의 공지된 방법에 따라 폐조직을 추출하여 세포증식 및 변환을 측정할 수 있는 조직 내 콜라겐의 양을 Sircol Collagen assay kit(Biocolor assay, Northern Ireland)을 제조자의 권고대로 사용하여 분석하였다(도 10). 도 10는 FGF2 결핍마우스군과 정상마우스군 간의 폐조직 내 콜라겐 양을 나타낸 그래프이다.

도 10에서 보듯이, FGF2 결핍마우스에서 분비된 콜라겐량이 정상 실험마우스에 비해 상대적으로 적음을 확인하였다.

이러한 결과는 FGF2 결핍된 마우스 폐에서 콜라겐을 분비하는 섬유모세포의 세포수가 적어진 것을 의미하는 것으로 이는 FGF2의 결핍으로 폐에서 섬유모세포가 근섬유모세포(myofibroblasts)로 변화되어 이동하면서 섬유모세포의 수가 적어진 것이 원인으로 기도개형의 증가를 나타낸다.

따라서, 이러한 결과는 FGF2가 기도개형 및 기도과민성을 감소시켜 천식의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

<실시예 3> TGF-β1 에 의한 천식의 발생

IL-13에 의해 유도되는 것으로 알려진 TGF-β1의 발현에 의한 천식의 발생을 알아보기 위하여 상기 실시예 1-1에서와 동일한 방법으로 TGF-β1을 과발현하는 형질전환된 마우스를 제조하고 하기의 실험을 수행하였다.

<실시예 3-1> TGF-β1 에 의한 기도개형 발생

기도개형에 의한 기도과민성을 실시예 1-2에서와 동일한 방법으로 측정하였다(도 7). 도 7는 TGF-β1 과발현 형질전환마우스군 및 정상마우스군 간의 시간에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다. 도 8은 TGF-β1 과발현 형질전환마우스군 및 정상마우스군 간의 시간에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 7에서 보듯이, 기도과민성(Penh)을 측정한 결과, TGF-β1에 의해 기도의 저항력이 심각하게 유도되었다.

그러나, 도 8에서 보듯이, 메타콜린에 의한 기도과민성(AHR)은 억제됨을 확인하였다. 상기 결과로 TGF-β1의 과발현은 천식의 증상 중 기도개형에만 관여함을 알 수 있다.

<실시예 3-2> TGF-β1에 의한 기도과민성 감소에 있어 FGF2의 역할

상기 실시예 3-1에서 살펴본 바와 같이 TGF-β1에 의한 기도과민성 감소에 FGF2가 관여하는지를 알아보기 위해 FGF2를 제한한 마우스에서 기도과민성을 측정하여 비교하였다(도 9). 도 9는 정상 마우스 또는 FGF2 결핍된 마우스에 TGF-β1(R&D system, USA) 투여 후 시간에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 9에서 보듯이, TGF-β1에 의한 기도과민성의 감소는 FGF2의 결핍마우스에서 둔화하였다. 상기 결과는 TGF-β1에 의한 기도과민성의 감소는 TGF-β1 자체에 의한 것이라기보다는 TGF-β1과 같이 발현되는 FGF2에 의해 기인한 것임을 제시한다. TGF-β1의 증가에 의한 기도과민성의 감소는 FGF2가 관여함을 알 수 있다.

<실시예 4> IFN-γ 과발현에 의한 천식의 발생 및 FGF2의 역할

중증천식과 COPD의 주요한 매개체인 IFN-γ를 매개하는 천식모델을 제조하고 FGF2의 역할을 규명하기 위해 실시예 1과 동일한 방법으로 IFN-γ로 형질전환된 마 우스를 제조하고 하기의 실험을 수행하였다.

<실시예 4-1> IFN-γ 과발현에 의한 기도과민성의 증가

형질전환된 마우스에서의 기도과민성을 실시예 1-2에서와 동일한 방법을 측정하였다(도 11). 이어 실시예 1-3과 동일한 방법으로 AHR 및 BAL 내의 VEGF, TGF-β1, 및 IFN-γ에 의해 유도되는 것으로 알려진 IP10의 단백질 양을 측정하였다(도 12). 도 11은 IFN-γ 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군 간의 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 11에서 보듯이, IFN-γ로 형질전환된 마우스는 균질하게(homogeneously) 기도과민성이 높아짐을 확인할 수 있었다.

도 12에서 보듯이, 상기 마우스는 Th2에서 발현되는 IL-13에 의해 유도되는 VEGF나 TGF-β1의 양은 증가하지 않는 대신, Th2와는 관련 없는 IP-10(Interferon-inducible Protein 10)이 증가함을 확인하여 상기 마우스에서 유도된 기도과민성이 IFN-γ에 특이적인 것임을 시사한다.

<실시예 4-2> IFN-γ 과발현에 의한 기도과민성에서 FGF2의 역할

IFN-γ 과발현이 FGF2의 발현에 미치는 영향

IFN-γ 과발현에 의한 기도과민성에서 FGF2의 역할을 알아보기 위해 IFN-γ로 형질전환된 마우스에서 FGF2 전사수준에서의 발현량을 측정하였다(도 13). 정상 마우스 및 형질전환 마우스의 폐조직에서 공지된 방법에 따라 RNA를 추출하여 RT(reverse transcription)-PCR을 수행하였다. 요약하면, 정상 마우스 및 형질전환 마우스의 폐조직 1 g을 제조자의 권고대로 TRIzol Reagent(Life Technology, USA)를 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 이어 분리된 총 RNA를 주형으로 하여 제조자의 권고대로 RT-PCR 키트(Promega, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이어 합성된 cDNA 1㎍을 주형으로 하고 상위 프라이머(upper primer: 5'-ACT CAC ATT CGA AAC CCC AAA C-3') 및 하위 프라이머(lower primer: 5'-CGT CAG ATC GCC TGG AGA C-3')를 사용하여 하기의 조건으로 PCR을 수행하여 FGF2 특이적 cDNA를 증폭하였다: PCR은 95℃에서 8분 동안 예비변성 시킨 후, 95℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 35회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다. 도 13dms IFN-γ 과발현 형질전환마우스군과 정상마우스군 간의 폐조직 내 FGF2 특이적 cDNA의 증폭을 보여주는 아가로스겔 사진이다.

도 13에서 보듯이, IFN-γ로 형질전환된 마우스에서 FGF2의 발현이 저해됨을 확인할 수 있어, 이는 IFN-γ에 의해 FGF2 발현이 억제됨을 나타내는 것이다.

IFN-γ 과발현에 의한 기도과민성에서 FGF2의 역할

IFN-γ의해 유도되는 기도염증 및 기도과민성에서 구체적 FGF2의 역할을 살펴보고자, 하기의 유전자 조합을 갖는 마우스에서 기도과민성, BAL내 염증세포수 및 염증관련 단백질량을 측정하였다(도 14). 상기 마우스는 종전에 기술된 대로 제작하였다(Zhou Zhu et al., J. Clin. Invest., 103: 779-788, 1999; Tang et al., J. Clin. Invest., 98: 2845-2853, 1996; Ray et al., J. Clin. Invest., l00: 2501-2511, 1997). 도 14에서 +는 해당유전자 과발현된 마우스를 나타내며, -는 해당유전자가 결핍된 마우스를 나타낸다. 도 14A는 IFN-γ(-)/FGF2(+/+), IFN-γ(-)/FGF2(-/-), IFN-γ(+)/FGF2(+/+) 또는 IFN-γ(+)/FGF2(-/-) 형질전환마 우스군에서 기관지폐포세척액 내 총세포(Total), 대식세포(M), 림프구(L), 호중구(N), 호산구(E)세포수를 낸 그래프이다. 도 14B는 IFN-γ(-)/FGF2(+/+), IFN-γ(-)/FGF2(-/-), IFN-γ(+)/FGF2(+/+) 또는 IFN-γ(+)/FGF2(-/-) 형질전환마우스군에서 메타콜린양에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다. 도 14C는 IFN-γ(-)/FGF2(+/+), IFN-γ(-)/FGF2(-/-), IFN-γ(+)/FGF2(+/+) 또는 IFN-γ(+)/FGF2(-/-) 형질전환마우스군에서 기관지폐포세척액(BAL) 내 VEGF, TGF-β1 및 IP10의 발현양을 나타낸 그래프이다.

도 14에서 보듯이, IFN-γ 과발현 형질전환마우스에서 FGF2 유전자를 없애면 IFN-γ에 의해 유도되는 기도과민성이 더욱 증가하였고, 염증세포수가 증가함을 관찰하여 기도염증이 더욱 심해짐을 확인할 수 있었다. 이는 FGF2가 또한 IFN-γ에 의해 유발되는 천식에도 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

<실시예 5> FGF2 투여에 의한 IL-13에 의해 유도된 Th2 천식의 억제

IL-13에 의한 Th2 천식에 있어서 FGF2 단백질에 의한 구체적 천식억제 활성을 측정하고자 하기의 실험을 수행하였다.

재조합 FGF 단백질(rFGF2)은 Phamacia-Upjohn(Italy)사에서 구입하여 사용하였다.

기도과민성이 유발된 마우스의 제작을 위해, 75㎍ 난알부민(OA)과 2mg 백반을 BALB/c 마우스(Jackson Lab, USA)의 복강에 두 번 주사하여 감작시키고, 10일 후 50㎍ 난알부민을 비강으로 재감작시켜 Th2 천식을 유발하였다. 상기 Th2 천식 이 유발된 마우스를 Th2 천식 실험마우스이라 명명하였다.

이어 상기 마우스 및 정상마우스에 각각 rFGF2를 4일간 1일 1회 10㎍/head 용량으로 비강으로 투여 또는 비투여(생리식염수) 후 메타콜린에 대한 기도과민성(도 20), 폐기관지세척액(BAL)에서의 염증세포(도 21) 및 매개인자로서 VEGF, IL-13, IL-5 및 IP-10(도 22)의 양을 실시예 1-2 및 1-3에 기재된 방법으로 측정하였다.

도20은 Th2 천식 실험마우스군과 정상마우스군에 재조합 FGF2 투여 후 메타콜린 농도에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다. 도 21은 Th2 천식 실험마우스군과 정상마우스군에서 rFGF2 투여한 후 기관지폐포세척액(BAL) 내 총세포, 대식세포, 림프구, 호중구, 호산구 세포수를 낸 그래프이다. 도 22는 Th2 천식 실험마우스군과 정상마우스군에서 rFGF2 투여한 후 기관지폐포세척액 내의 VEGF, IL-13, IL-5 및 IP-10의 양을 나타낸 그래프이다.

도 20에서 보듯이, rFGF2로 처리되지 않은 Th2 천식이 유발된 마우스에 비하여 rFGF2로 처리된 마우스에서 메타콜린에 대한 기도과민성이 낮음을 확인하였다.

도 21에서 보듯이, rFGF2로 처리되지 않은 Th2 천식이 유발된 마우스에 비하여 rFGF2로 처리된 마우스에서 기관지폐포 세척액에서 염증세포수를 감소시킴을 확인하였다.

도 22에서 보듯이, rFGF2로 처리되지 않은 Th2 천식이 유발된 마우스에 비하여 rFGF2로 처리된 마우스에서 Th2 천식에서 중요한 매개인자인 IL-13과 VEGF의 농도를 감소시킴을 확인하였다. 반면 Th 2천식과 관련성이 없는 것을 알려진 IL-5 및 IP-10의 발현은 변화가 없음을 확인하였다.

또한 천식이 유발된 마우스를 rFGF2로 처리 후 폐기관지벽의 조직학적 검사결과를 시행하였다(도 23). 도 23은 Th2 천식 실험마우스(A)에 rFGF2 투여 후(B) 이에 따른 폐조직의 병리학적 사진이다.

도 23에서 보듯이, rFGF2로 처리된 마우스의 폐기관지벽의 조직학적 검사 결과(B) FGF2의 투여에 의해 폐기관지벽의 비후 및 폐색이 감소하여 정상(C)과 유사하게 됨을 확인하였다.

상기 결과로부터 FGF2가 VEGF와 IL-13 생산을 억제하여 Th2 기도과민성 및 염증을 저해하여 천식의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 6> FGF2의 투여에 의한 IFN-γ에 의한 Th1 천식 및 COPD의 억제

IFN-γ에 의한 Th1 천식에 있어서 FGF2 단백질에 의한 구체적 천식억제 활성을 측정하고자 하기의 실험을 수행하였다.

rFGF2 단백질은 Phamacia-Upjohn(Italy)사에서 구입하여 사용하였다. IFN-γ에 의한 Th1 천식이 유발된 마우스의 제작을 위해 하기의 실험을 수행하였다.

<실시예 6-1> 난알부민과 이중가닥 RNA를 사용한 Th1 천식 및 COPD 동물모델 확립

BALB/c 마우스(Jackson Lab, USA)를 사용하여 10㎍의 합성한 dsRNA인 polyinosinic-polycytidylic acid(PolyIC, Sigma, USA), 75㎍의 난알부민(OAlbumin, OA)을 각각 또는 함께 네 번 비강으로 투여하여 감작시키고, 10일 후 50㎍ OA를 비강으로 재감작시켜 천식을 유발하였다. 상기 마우스를 Th1 천식 마우 스라 명명하였다. 음성 대조군 마우스에는 인산완충식염수(PBS, Phospho Buffered Saline)만을 투여하였다.

(1) Th1 천식의 특성 확인

이어 상기 마우스에서 실제로 Th1 천식의 유발여부를 확인하기 위하여 실시예 1-2 및 1-3에 기재된 방법과 같이 메타콜린에 의한 기도과민성(도 15), BAL내의 염증세포수(도 16) 및 매개인자로서 VEGF, IL-13, IL-5 및 IP-10(도 17)의 양을 실시예 1-2 및 1-3에 기재된 방법으로 측정하였다.

도 15는 알레르겐(난알부민 OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여하였을 때 메타콜린양에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다. 도 16은 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여하였을 때 기관지폐포세척액(BAL) 내 총세포, 대식세포, 림프구, 호중구, 호산구 세포수를 낸 그래프이다. 도 17은 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여하였을 때 기관지폐포세척액(BAL) 내 사이토카인들(VEGF, IL-5, IL-13 및 IP-10)의 발현양을 나타낸 그래프이다.

도 15에서 보듯이, OA 및 dsRNA에 의해 유도된 마우스에서 메타콜린(methacholine) 기도과민성이 증가함을 확인하였다.

도 16에서 보듯이, 상기 마우스에서 림프구와 호중구, 대식세포(macrophage)와 같은 세포들의 수는 증가했지만 호산구의 수는 증가하지 않음을 확인하였다.

도 17에서 보듯이, 상기 마우스에서 매개인자로는 Th1 반응과 관련 있는 IP-10만이 현격히 증가하였다.

상기 결과로부터 난알부민과 dsRNA에 의해 비호산구적 기도 염증(non- eosinophilic airway inflammation)이 일어남을 확인하였다.

또한 상기 Th1 천식이 IFN-γ에 의한 것임을 확인하기 위하여 폐기관지세척액내의 IFN-γ 및 IgG1과 IgG2a의 양을 측정하였다(도 18 및 도 19). 도 18은 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여하였을 때 기관지폐포세척액(BAL) 내 IFN-γ 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 19는 알레르겐(OA) 및 dsRNA를 단독 또는 함께 투여되었을 때 혈청 내 알레르겐 특이 항체(IgG1 및 IgG2a) 생성량을 나타낸 그래프이다.

도 18 및 도 19에서 보듯이, 폐기관지세척액내에서 IFN-γ가 3배 이상의 증가 하였고, 혈액중의 IgG1과 IgG2의 증가도 확인하였다. 상기 결과로부터 난알부민 항원과 dsRNA에 의해 유발된 천식은 IFN-γ 및 항원-특이적 IgG2a에 의한 것으로 Th2 천식에서 나타나는 것으로 알려진 IgE와는 관련이 없는 것임을 확인하는 것이다.

(2) COPD의 특성 확인

이어 상기 마우스에서의 COPD의 유발 여부를 확인하기 위하여 폐의 크기, 용적 및 콜라겐량을 측정하였다(도 28, 도 29 및 도 30). 도 28D는 상기 제조된 마우스에 있어서 폐의 크기를 나타낸다. 도 29D는 상기 제조된 마우스에 있어서 폐의 부피 변화를 나타낸 그래프이다. 도 30D는 상기 제조된 마우스에 있어서 폐의 섬유화 정도를 나타낸 그래프이다.

도 28D, 도 29D 및 도 30D에서 보듯이, Th1 천식모델 마우스에서 각각 폐의 크기, 용적 및 콜라겐의 양이 현저히 증가하여 COPD의 특성을 함께 가지고 있는 것 을 확인하였다. 이러한 폐의 크기, 용적, 콜라겐량이 증가하였으며 이는 폐의 조직손상, 폐포파괴, 폐기종을 수반하는 것으로 전형적인 COPD의 특성이며 이는 도 31에 의해 확인된다.

도 31A는 Th1 천식모델 마우스에서 폐실질 조직파괴 정도를 나타낸 폐조직병리학적 사진이다. 도 31에서 보듯이, IFN-γ 과발현 형질전환마우스의 폐는 전형적인 COPD 환자에게서 관찰되는 폐실질 세포의 사멸로 인한 폐포 면적 확대를 확인할 수 있었다.

상기 폐의 크기 및 용적 증가와 폐포의 사멸과 함께 콜라겐량의 증가로부터 미루어 심각한 섬유화(fibrosis)가 초래되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 6-2> FGF2의 투여에 의한 Th1 천식의 억제

IFN-γ에 의한 Th1 천식에 있어서 FGF2 단백질에 의한 구체적 천식억제 활성을 측정하고자 하기의 실험을 수행하였다. 상기 실시예 6-1에 의해 제작된 마우스를 Th1 천식 실험마우스군이라 명명하였다. 실시예 6-1에서 제작된 Th1 천식 실험마우스 및 정상마우스에 실시예 5와 동일한 방법으로 rFGF2를 투여하였다. 이어 상기 마우스에서 메타콜린에 대한 기도과민성을 실시예 1-2에 기재된 방법에 따라 측정하였다.

도 27은 Th1 천식 실험마우스군과 정상마우스군에 rFGF2 투여 후 메타콜린 농도에 따른 기도과민성을 나타낸 그래프이다.

도 27에서 보듯이, rFGF2로 처리되지 않은 Th1 천식이 유발된 마우스에 비하여 rFGF2로 처리된 마우스에서 메타콜린에 대한 기도과민성이 낮음을 확인하였다.

도 28은 Th1 천식이 유발된 마우스에 있어서 FGF2처리 및 처리되지 않은 마우스에 따른 폐의 크기를 나타낸 사진이다.

도 28에서 보듯이, rFGF2로 처리되지 않은 Th1 천식이 유발된 마우스에 비하여 rFGF2로 처리된 마우스에서 폐의 크기는 감소함을 확인하였다.

상기 결과는 FGF2는 IFN-γ로 형질전환된 마우스의 천식 증상을 감소시킴으로써 IFN-γ에 의해 유도된 천식의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.

<실시예 6-3> FGF2의 투여에 의한 COPD 억제

FGF2 단백질의 CDPD 억제 활성을 측정하고자 하기의 실험을 수행하였다. 실시예 6-1에서 제작된 마우스 및 정상마우스에 실시예 5와 동일한 방법으로 rFGF2를 투여하였다. 이어서 상기 마우스에서 COPD의 특징인 폐의 크기, 용적 및 콜라겐량을 측정하였다(도 28, 도 29 및 도 30). 도 28A, B, C 및 D는 각각 정상폐 및 COPD 마우스모델에서 rFGF 투여 및 비투여된 폐를 나타낸다. 도 29는 도 28의 폐의 부피를 측정한 그래프이다. 도 30A, B, C 및 D는 각각 정상폐 및 COPD 마우스모델에서 rFGF 투여 및 비투여된 폐의 섬유화 정도를 나타낸 그래프이다. 도 31은 COPD 천식모델 마우스에서 rFGF 투여 전 후의 폐실질 조직파괴 정도를 나타낸 폐조직병리학적 사진이다.

도 28C 및 D 그리고 39C 및 D에서 보듯이, rFGF2의 투여로 폐의 부피가 투여하기전과 비교하여 현저하게 감소함을 알 수 있다. 도 30 C 및 D에서 보듯이, rFGF2 투여 후 COPD 마우스에서 콜라겐의 양이 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 폐의 크기, 용적, 콜라겐 양의 감소는 rFGF2가 COPD의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 나타내는 것이며, 이는 도 31에 의해 확인된다.

도 31은 COPD 마우스에서 폐실질 조직파괴 정도를 나타낸 폐조직병리학적 사진이다. 도 31 A에서 보듯이 처리하지 않은 폐(B)의 경우, 처리한 것(A)과 비교하여 전형적인 COPD 환자에게서 관찰되는 폐실질 세포의 사멸로 인한 폐포 면적 확대를 확인할 수 있어, rFGF2의 투여가 COPD의 치료에 효과적임을 알 수 있다.

상기 결과는 COPD 마우스에서 폐의 크기 및 용적 증가와 폐포의 사멸과 함께 콜라겐량이 심각한 섬유화(fibrosis)가 초래되었으며 이는 FGF2로 치료될 수 있음을 나타내는 것이다.

<실시예 7> 인간의 천식에서 IFN-γ의 과발현 여부

인간의 천식에서 IFN-γ의 과발현 여부와 비호산구성 세포에 의한 것인지의 여부를 확인하기 위하여 하기의 실험을 수행하였다. 215명의 가역적인 기도폐색을 나타내는 성인 천식환자로부터 첫날 객담을 분리하고, 공지된 방법에 따라 폐활량 측정기(sprimetry)를 사용하여 폐활량을 측정하였고, 메타콜린 유발검사(methacholin bronchial challenge)를 수행하여 폐기능 검사를 수행하였다(도 24). 도 24는 중증 천식환자의 유도객담 내 호산구양성군(Eosinophilic) 및 음성군(Non-eosinophilic)의 비율을 나타낸 그래프이다. 도 24에서 보듯이, 성인 천식환자의 절반 이상은 호산구보다는 비호산구적인 임상 소견임을 확인하였다.

이러한 천식을 매개하는 인자를 확인하기 위하여 IL-4와 IFN-γ 유전자의 양을 조사하였다(도 25). 도 25는 천식환자의 중증도에 따른 유도객담 내 IL-4 및 IFN-γ의 발현량을 나타낸 그래프이다.

도 25에서 보듯이, 중증천식 환자에서 Th1 천식과 관련이 있는 IFN-γ의 발현 양을 증가하였으나, Th2 천식과 관련이 있는 IL-4는 변화가 없음을 확인하였다. 상기 결과로부터 인간, 특히 중증의 천식을 갖는 환자에서 IFN-γ 경로에 의한 비호산구성 Th1 천식이 발생할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명에 따른 FGF2를 유효성분으로 포함하는 치료제는 기도섬유화(fibrosis), 기도염증, 기도과민성, 기도개형, 천식 및 COPD의 치료 또는 예방에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 난알부민 및 이중가닥 RNA를 이용해 개발된 천식 및 COPD 동물 모델은 천식 및 COPD 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

FGF2(Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 천식 예방 또는 치료제.
제 1항에 있어서, 천식은 IL-13(Interleukin-13)의 과발현에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제.
제 1항에 있어서, 천식은 IFN-γ(Interferon-γ)의 과발현에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제.
제 1항에 있어서, FGF2는 IL-13의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제.
제 1항에 있어서, FGF2는 혈관내피생성인자(VEGF)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제.
제 1항에 있어서, FGF2는 TGF-β1 (Transforming Growth Factor-β1)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 천식 예방 또는 치료제.
FGF2(Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 예방 또는 치료제.
제 7항에 있어서, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)은 IFN-γ(Interferon-γ)의 과발현에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 예방 또는 치료제.
난알부민을 포함하는 알레르겐 및 이중가닥 RNA를 기도 내로 직접 투여하는 것을 포함하는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법.
제 9항에 있어서, 동물은 마우스인 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 (COPD) 동물모델의 제조방법.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 하기의 단계를 포함하는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법:

(1) BALB/c 마우스에 5-15㎍의 이중가닥 RNA인 polyinosinic-polycytidylic acid 및 50-100 ㎍의 난알부민을 4번 비강으로 투여하여 감작하는 단계; 및

(2) 10일 후 25-75 ㎍의 난알부민을 비강으로 감작하는 단계.
제 11항에 있어서, 단계 (1)의 감작하는 이중가닥 RNA는 10㎍으로 사용되는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법.
제 11항에 있어서, 단계 (1)의 감작하는 난알부민은 75㎍의 난알부민이고, 단계 (2)의 10일 후 50㎍의 난알부민으로 사용되는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법.
제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 천식은 비호산구성인 것을 특징으로 하는 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델의 제조방법.
제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따라 제조된 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환(COPD) 동물모델.
제 15항에 있어서, 동물은 마우스인 Th1 천식 또는 만성폐쇄성 폐질환 (COPD) 동물모델.
FGF2 (Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 IL-13 활성 억제제.
FGF2 (Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 VEGF 활성 억제제.
FGF2 (Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 TGF-β1 활성 억제제.
FGF2(Fibroblast Growth Factor-2)를 유효성분으로 포함하는 기도섬유화(fibrosis), 기도염증, 기도과민성 또는 기도개형 억제제.