CN110476880B - 一种矽肺病小鼠模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种一种矽肺病小鼠模型制备方法，其特征在于：实验准备后，模型组小鼠用异氟烷在麻醉机中进行麻醉，待小鼠由浅快呼吸转为深慢呼吸3秒时取出置于掌心，大拇指指尖抵住小鼠下颌，用微量移液器经鼻滴入SiO2微米级颗粒混悬液，滴于鼻翼吸入，胸外按摩2‑3分钟放入笼内，结束后立即将小鼠送回常温动物饲养室；对照组小鼠只给予等体积的生理盐水滴鼻；实验前后获取小鼠的体重指标，分别在第1周、2周、4周、8周、16周处死，取肺组织进行病理及生化对比鉴定，评价模型制备效果。该方法造模技术稳定高效，可多次重复，无创环保人性化，节约人力和时间。
Description
技术领域
本发明涉及实验技术领域，具体是一种矽肺病小鼠模型的制备方法。
背景技术
矽肺病是一种由长期暴露于粉尘环境中所引起的一种不可逆特发性肺纤维化职业性疾病。今年来，陶瓷、建筑材料、矿业开采等行业采取多种手段进行降尘和防护等预防措施，但矽肺病依然在职业人群中发生。现代能源与安全领域、矽尘职业病预防及临床治疗依然存在着众多亟待探索解决的重大临床疑难问题，迫切需要加强相关基础研究，如：矽肺病的病理变化机制、矽肺病治疗问题和矽肺病预防等。
临床和基础研究过程中，伦理和研究经费等问题一定程度制约了一些矽肺病方面的研究在患者或大型哺乳动物中的进行。因而，小鼠矽肺病模型的制备对于矽肺病的基础研究十分重要，并被广泛应用。
既往，小鼠矽肺病模型的制备主要是通过外科手术侵入的方法制备，感染风险难于控制，并且需要对小鼠进行深度注射麻醉，小鼠死亡率较高，实验的重复效果差。近年，有科研人员采用气管内滴注的方法制备，但该方法制作的矽肺模型存在以下缺点：①气道侵入会对小鼠的气道产生损伤环节，增加了诱发矽肺病产生的外部因素；②气道内的滴注不符合小鼠呼吸的节律，操作中会出现小鼠呼吸顺应性差的现象，增加死亡风险；③气道滴入存在误入食道的可能性，增加实验的失败率。到目前为止，尚未有一种操作安全、重复性好、损伤和纤维化结局均可以精确控制的小鼠矽肺病模型。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提供一种有效的矽肺病小鼠模型的制备方法；该矽肺病小鼠模型制备方法有如下优点：1、非创伤式造模，避免了感染隐患和小鼠的身心创伤；2、顺应小鼠的呼吸节律，利用麻醉后的深呼吸，将SiO2 混悬液吸入肺内；3、符合职业病患者通过呼吸道吸入肺内的疾病发生的实际环节；4、可重复性好，可以通过此方法多次给药，研究不同频率对矽肺病发生的影响；5、性价比高，小鼠容易获取、操作简便、一次可获得大量的观察指标和样本量；6、安全性高，按照本说明书的剂量和办法可以大大降低造模小鼠的死亡风险和人的安全隐患等。
本发明实现发明目的采用如下技术方案：
一种矽肺病小鼠模型的制备方法，将正常成年小鼠按完全随机的方法分为模型组和对照组，从常温动物饲养室中取出小鼠，模型组小鼠用异氟烷深麻醉，经鼻滴入SiO2微米级颗粒混悬液，胸外按摩2-3分钟，结束后立即将小鼠送回常温动物饲养室；对照组小鼠只给予生理盐水滴鼻，不滴SiO2混悬液，胸外按摩2-3分钟结束后立即送回常温动物饲养室；实验前后获取小鼠的体重指标，分别在第1周、2周、4周、8周、16周处死，取肺组织进行病理及生化对比鉴定，评价模型制备效果。
作为优选，本发明提供的一种矽肺病小鼠模型制备方法，所需造模基本条件有实验级别的常温动物饲养室及完整的配套用品，操作过程中所需的通风橱，小鼠定量麻醉机，高精度电子秤，200ul移液器，1μm-5μm左右的SiO2无菌晶体，无菌生理盐水；
作为优选，本发明提供的一种矽肺病小鼠模型制备方法，正常成年C57BL/6J 小鼠周龄应在7-8周左右，体重在18-23g，采用完全随机分组的方法分配实验组和对照组；
作为优选，本发明提供的一种矽肺病小鼠模型制备方法，小鼠滴鼻前麻醉采用的是气体麻醉，麻醉剂选用异氟烷，观察指标为小鼠的呼吸节律即呼吸节律由浅快变为深慢呼吸3秒；
作为优选，本发明提供的一种矽肺病小鼠模型制备方法，滴鼻操作前将小鼠横卧在持鼠手的掌横纹上，鼠头朝大拇指方向并枕靠在食指第二关节处，大拇指指尖轻轻抵住小鼠下颌，大拇指指腹抬起勿接触小鼠咽喉部，四指轻轻保定住小鼠，防止滑落或移位；
作为优选，本发明提供的一种矽肺病小鼠模型制备方法，滴鼻操作开始，将SiO2混悬液充分混匀后用移液器吸入50-80μl，待小鼠完全麻醉后取出滴鼻，移液器枪头对准小鼠一侧鼻翼而不是鼻尖，轻轻打出一滴，小鼠吸入后再打入下一滴，直至滴完，边滴边注意观察小鼠的呼吸状态，待完全滴完后进行胸外按摩和抚摸，确保生命体征恢复后放入笼内观察，实验全部结束后送回常温动物实验室饲养；
作为优选，本发明提供的一种矽肺病小鼠模型制备方法，矽肺病小鼠模型的评价指标包括体重和体重丢失率，免疫印迹生化指标，ELISA生化指标，肺病理指标如HE染色、马松染色、天狼猩红染色、免疫组化原位染色等，小鼠肺组织提取分别在第1周、2周、4周、8周、16周进行无痛处死后冰上操作；
作为优选，本发明提供的一种矽肺病小鼠模型制备方法，SiO2晶体颗粒大小在5um以下公认的呼吸性细颗粒物大小，经充分研磨灭菌过滤后使用；
作为优选，本发明提供的一种矽肺病小鼠模型制备方法，生理盐水采用原装保质期内医用级别的无菌生理盐水，作为载体将SiO2均匀分散在其中，保留多种浓度0mg/ml-300mg/ml的实验研究需求浓度；
有益效果：
本发明与现有技术相比，其有益效果体现在：
与外科和气管内滴入等侵入实验方法相比，该建模方法降低了对小鼠的直接伤害，避免了非实验因素的人为损伤，降低了实验干扰因素；经鼻吸入SiO2 混悬液的方法能够成功制备高效稳定的矽肺病模型，可重复性和安全性较高；经鼻途径进入销售肺内的矽尘侵染路径，符合职业者经上呼吸道吸入粉尘的实际，更符合医学模型的需求；推荐滴入体量为小鼠相对安全剂量，按照实验研究需求可进行调整；该技术方法简便高效，大大降低了动物的死亡风险，缩短了操作者的操作时间，节省人力，一次造模可满足动物实验的基本需求样本量，缩短了操作时辰，降低了“生物时钟”造成的实验误差；与此前科研人员为方便导管侵入气管，使用气道较粗的大鼠开展实验相比，小鼠大大降低了科研成本和实验操作者的危险系数，达到了实验预期的造模效果；综上所述，本矽肺病小鼠模型方法的制备极大的提高了该领域科研的效率，加速了人们对矽肺病疾病发生发展的认知，为早日攻克矽肺职业病提供有力工具，助力各行业又好又快发展。
附图说明
图1是矽肺病小鼠制备及评估流程图
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明做进一步解释说明。
实施例1.小鼠造模前实验准备
1.小鼠适应环境
准备好饲养及实验的系统化体系、购置小鼠、适应环境一周、完全随机分成实验组和对照组、做好标记、周龄7-8周、体重达18-23g等，准备小鼠定量麻醉机，高精度电子秤，200ul移液器，配制实验所需浓度的无菌SiO2混悬液，异氟烷，无菌生理盐水等。
2.小鼠麻醉后保定掌中
从常温动物饲养室中取出小鼠，记录基础体重，模型组小鼠用异氟烷在麻醉机中进行麻醉，待小鼠由浅快呼吸转为深慢呼吸3S时取出置于掌心，滴鼻操作前将小鼠横卧在持鼠手的掌横纹上，鼠头朝大拇指方向并枕靠在食指第二关节处，大拇指指尖轻轻抵住小鼠下颌，大拇指指腹抬起勿接触小鼠咽喉部，四指轻轻保定住小鼠，防止滑落或移位(图1A,1B,1C)；
实施例2.滴鼻吸入SiO2制备小鼠矽肺病模型
滴鼻操作开始，将SiO2混悬液充分混匀后用移液器吸入50-80μl，移液器枪头对准小鼠一侧鼻翼而不是鼻尖，轻轻滴出一滴，小鼠吸入后再滴入下一滴，直至滴完，边滴边注意观察小鼠的呼吸状态，待完全滴完后进行胸外按摩和抚摸，确保生命体征恢复后放入笼内观察，实验全部结束后送回常温动物实验室饲养；大拇指指尖抵住小鼠下颌，用微量移液器经鼻滴入SiO2微米级颗粒混悬液，小鼠每吸入一滴，操作者滴下一滴，直至全部滴完后，胸外按摩2-3分钟放入笼内，结束后立即将小鼠送回常温动物饲养室；对照组小鼠只给予等体积的生理盐水滴鼻，胸外按摩2-3分钟结束后立即送回常温动物饲养室；实验前后获取小鼠的体重指标，分别在第1周、2周、4周、8周、16周麻醉后处死，取肺组织进行病理及生化对比鉴定，评价模型制备效果(图1F，1G)。
实施例3.加入伊文思蓝后的显色评估吸入分布
伊文思蓝是一种偶氮染料，有文献将其作为模拟示踪SiO2的显色剂用于小鼠矽肺造模，(具体方法参见文献：气管内滴入与雾化博来霉素致小鼠肺纤维化模型的比较研究)。我们在此将伊文思蓝应用于一种新的小鼠矽肺病模型的制备评估阶段，配制好合适浓度的染色剂后，分别给小鼠滴入不同体量的伊文思蓝溶液， 45分钟后将其麻醉后处死，取肺脏固定于10％中性甲醛，大体摆放和分解摆放于光照良好处对染液分布及各肺叶的着色进行统计分析。
实施例4.评估适用于造模的剂量
选用不同剂量的SiO2，统计分析小鼠对剂量的耐受性。结果显示50-80ul小鼠矽肺病造模死亡率较低，安全性较高，适用于实验推荐的剂量。
实施例5.制作小鼠矽肺病模型肺的大体拍照及病理表现
1.肺大体组织及病理切片的硅结节和纤维化
将固定好的肺组织左肺制作病理切片，正常肺作为对照，结果显示一次性滴入80ul SiO2可形成稳定的硅结节和肺纤维化。
2.天狼猩红染色评估肺纤维化程度
采用天狼猩红染色方法，对成纤维细胞分泌的I型胶原纤维进行染色，观察小鼠肺纤维化程度，按照改进后纤维化评分等级进行评分(参见文献：Standardizedquantification of pulmonary fibrosis in histological samples)结果显示不同时期的肺纤维化等级不同。
实验结果表明，本发明制作的小鼠矽肺病模型具有很好的稳定性和可重复性，模型制作安全，操作简单，可供小鼠多次吸入，可以精准的控制纤维化深度。另外，麻醉后滴鼻吸入方法，给小鼠带来得疼痛小，造模时间短，过程中不需要给小鼠外科手术，小鼠死亡率低。
因此，利用滴鼻法制备小鼠矽肺病模型符合精准医疗的趋势，有望成为矽肺病基础研究中的一种重要的小鼠矽肺病模型。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种矽肺病小鼠模型制备方法，其特征在于：准备好实验所需的基本条件后，将正常成年 C57BL/6J 小鼠按完全随机的方法分为模型组和对照组，从常温动物饲养室中取出小鼠，模型组小鼠用异氟烷在麻醉机中进行麻醉，待小鼠由浅快呼吸转为深慢呼吸 3S 时取出置于掌心，大拇指指尖抵住小鼠下颌，用微量移液器经鼻滴入 SiO2 微米级颗粒混悬液，小鼠每吸入一滴，操作者滴下一滴， 直至全部滴完后，胸外按摩 2-3 分钟放入笼内，结束后立即将小鼠送回常温动物
饲养室；对照组小鼠只给予等体积的生理盐水滴鼻，胸外按摩 2-3 分钟结束后立即送回常温动物饲养室；实验前后获取小鼠的体重指标，分别在第 1 周、2 周、4 周、8 周、16周处死，取肺组织进行病理及生化对比鉴定，评价模型制备效果；
SiO2 晶体颗粒大小在 5um 以下公认的呼吸性细颗粒物大小，由华中科技大学提供，按照要求在实验前进行二次充分研磨后灭菌过滤使用；
生理盐水采用原装保质期内医用级别的无菌生理盐水，作为载体将 SiO2 晶体均匀分散在其中，保留多种浓度 0mg/ml-300mg/ml 的实验研究需求浓度。
2.根据权利要求 1 所述的一种矽肺病小鼠模型的制备方法，其特征在于： 所需造模基本条件有实验级别的常温动物饲养室及完整的配套用品，操作过程中所需的通风橱，小鼠定量麻醉机，高精度电子秤，200ul 移液器，1μm-5μm 左右的 SiO2 无菌晶体，无菌生理盐水。
3.根据权利要求 1 所述的一种矽肺病小鼠模型的制备方法，其特征在于： 正常成年C57BL/6J 小鼠周龄应在 7-8 周左右，体重在 18-23g，采用完全随机分组的方法分配实验组和对照组。
4.根据权利要求 1 所述的一种矽肺病小鼠模型的制备方法，其特征在于： 小鼠滴鼻前麻醉采用的是气体麻醉，麻醉剂选用异氟烷，观察指标为小鼠的呼吸节律即呼吸节律由浅快呼吸变为深慢呼吸 3 秒。
5.根据权利要求 1 所述的一种矽肺病小鼠模型的制备方法，其特征在于： 滴鼻操作前将小鼠横卧在持鼠手的掌横纹上，鼠头朝大拇指方向并枕靠在食指第二关节处，大拇指指尖轻轻抵住小鼠下颌，大拇指指腹抬起勿接触小鼠咽喉部， 四指轻轻保定住小鼠，防止滑落或移位。
6.根据权利要求 1 所述的一种矽肺病小鼠模型的制备方法，其特征在于： 滴鼻操作开始，将 SiO2 混悬液充分混匀后用移液器吸入 50-80μl，待小鼠完全
麻醉后取出滴鼻，移液器枪头对准小鼠一侧鼻翼而不是鼻尖，轻轻打出一滴，小鼠吸入后再打入下一滴，直至滴完，边滴边注意观察小鼠的呼吸状态，待完全滴完后进行胸外按摩和抚摸，确保生命体征恢复后放入笼内观察，实验全部结束后送回常温动物实验室饲养。
7.根据权利要求 1 所述的一种矽肺病小鼠模型的制备方法，其特征在于： 矽肺病小鼠模型的评价指标包括体重和体重丢失率，免疫印迹生化指标，ELISA 生化指标，肺病理指标如 HE 染色、马松染色、天狼猩红染色、免疫组化原位染色，小鼠肺组织提取分别在第 1周、2 周、4 周、8 周、16 周进行无痛处死后冰上操作。
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