KR20200012587A - ＰＴＤ―ｂＦＧＦ 또는 ＰＴＤ―ｂＦＧＦ에 의해 생성이 증가된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

ＰＴＤ―ｂＦＧＦ 또는 ＰＴＤ―ｂＦＧＦ에 의해 생성이 증가된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PTD-bFGF 또는 PTD-bFGF가 처리된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 처리된 포유류의 세포 또는 조직 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 및 포유류 유래 분리된 세포 또는 조직에 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료를 위한 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

Description

ＰＴＤ―ｂＦＧＦ 또는 ＰＴＤ―ｂＦＧＦ에 의해 생성이 증가된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of chronic obstructive pulmonary disease comprising PTD-bFGF or incresed exosome by PTD-bFGF}
본 발명은 PTD-bFGF 또는 PTD-bFGF에 의해 생성이 증가된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)은 폐의 비정상적인 염증반응으로 기도가 좁아지는 폐질환 중 하나이다. 만성폐쇄성 폐질환은 주로 유해입자나 가스의 흡입에 의해 발생하게 되며, 특히 흡연이 주요 원인으로 알려져 있다. 현재 우리나라의 40세 이상 만성폐쇄성 폐질환 유병률은 해마다 증가하는 추세이며, 또한 전 세계적으로도 만성폐쇄성 폐질환은 유일하게 유병률과 사망률이 증가하는 질환으로, 2020년에는 세계적으로 3번째 사망원인이 될 것으로 추정하고 있다. 흡연은 폐조직 내 강력한 자극물질로 작용하여, 다양한 전염증인자, 성장인자, 산화물질 및 화학주성인자들의 생성을 증가시키며, 염증성 신호전달체계를 활성화시켜 호중구 및 대식세포를 비롯한 많은 염증세포의 유주를 촉진시켜 폐염증을 더욱 악화시키게 된다. 담배연기 및 염증세포들에서 유래된 메탈로프로테나제(metalloproteinase)와 같은 단백분해 효소가 활성화되어 폐 간질조직 내 구성물을 파괴하게 된다. 이는 결국 폐조직의 비정상적인 변화, 이를테면 기도벽의 비후, 폐섬유화를 야기하여 폐기능을 저하시킨다.
따라서 만성폐쇄성 폐질환의 예방 및 치료를 위하여, 질병의 주요 원인인 폐 염증의 개선을 중점에 두고 다양한 물질들의 개발이 이뤄져 오고 있다. 그 중, 천식치료와 유사하게 만성폐쇄성 폐질환의 염증개선을 위한 스테로이드 제제 및 항생제의 치료는 매우 매력적인 치료방법이 될 수 있다. 그러나 스테로이드제제 및 항생제의 경우, 면역억제 및 면역관용 등으로 인한 많은 부작용이 발생할 수 있기 때문에 장기간 치료를 필요로 하는 만성폐쇄성 폐질환 환자에게는 적합하지 않다는 제한점이 있다. 그러므로 부작용이 없으면서도 보다 근본적으로 만성폐쇄성 폐질환에 대한 치료 효과가 우수한 새로운 치료제의 개발이 필요하다.
한편, 엑소좀(exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100nm인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다.
최근에는 이러한 엑소좀을 치료제로 사용하기 위한 연구가 개발되고 있는데, 대한민국 공개특허 제10-2017-0044999호에는 줄기세포 유래 엑소좀의 상처 치료, 피부 개선 및 탈모방지 용도가 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-1820264호에는 줄기세포 유래 엑소좀의 항암 용도를 개시하고 있다.
이에 본 발명자들은 만성 폐쇄성 폐질환의 치료제로서 엑소좀을 활용할 수 있는 방법을 연구하던 중, PTD-bFGF(protein transduction domian-basic fibroblast growth factor)을 만성폐쇄성 폐질환이 유발된 마우스 또는 폐 손상이 유발된 폐 세포에 처리할 경우, 만성폐쇄성 폐질환의 증상을 개선 또는 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 엑소좀의 분비를 조절하고 micro RNA을 조절하여 보다 효과적으로 만성폐쇄성 폐질환을 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2017-0044999호 대한민국 등록특허 제10-1820264호
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 처리된 포유류의 세포 또는 조직 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 목적은 포유류 유래 분리된 세포 또는 조직에 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료를 위한 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드는, 산화질소(NO) 생성억제; 전염증성 사이토카인의 생성억제; 활성산소종(ROS) 생성억제; 및 MAPK 신호전달 인자인 JNK1/2, ERK1/2 및 p38 MAPK 단백질의 인산화 억제; 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 전염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 만성폐쇄성 폐질환(COPD)은 만성폐쇄성기관지염, 만성세기관지염 또는 폐기종(Emphysema)일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 처리된 포유류의 세포 또는 조직 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 폐 상피세포주인 MLE-12 세포이고, 상기 조직은 폐 조직일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀 내에는 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드 처리에 의해 let-7c의 microRNA가 증가되어 있고, microRNA-155 및 microRNA-9는 감소되어 있는 것일 수 있다.
나아가 본 발명은, 포유류 유래 분리된 세포 또는 조직에 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료를 위한 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포는 폐 상피세포주인 MLE-12 세포이고, 상기 조직은 폐 조직일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 엑소좀은 let-7c의 microRNA가 증가되어 있고, microRNA-155 및 microRNA-9는 감소되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 PTD-bFGF을 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물은 폐 손상이 유발된 세포 및 조직에서 산화질소(NO) 생성억제, 전염증성 사이토카인의 생성억제, 활성산소종(ROS) 생성억제 및 MAPK 신호전달 인자인 JNK1/2, ERK1/2 및 p38 MAPK 단백질의 인산화 억제 활성을 유도할 수 있고, 폐 세포 및 폐 조직의 손상을 억제 또는 감소시키는 효과가 우수하여 만성폐쇄성 폐질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있으며, 나아가 본 발명의 PTD-bFGF은 엑소좀의 생성 및 분비를 조절하는 활성과 microRNA를 조절하는 활성이 있어 엑소좀을 이용한 만성폐쇄성 폐질환의 치료제 개발에도 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 CSE에 의해 손상된 폐 세포주에 대한 PTD-bFGF의 폐 세포 보호 효과를 확인한 것으로, a는 MTT 분석으로 세포 생존율을 분석한 것이고, b는 griess 분석으로 산화질소 생성정도를 측정한 것이며, c~e는 각각 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현수준을 ELISA 분석을 통해 확인한 것이고, f는 ROS 생성정도를 DCF-DA fluorescence를 이용한 유세포 분석으로 확인한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 CSE로 세포 손상된 MLE-12 폐 세포주를 대상으로 PTD-bFGF 처리에 따른 MAPKs 신호전달 관련 인자들인 JNK1/2, ERK1/2 및 p38 MAPK 단백질들의 인산화 정도를 웨스턴블럿으로 확인하고(왼쪽), 이미지 J를 이용하여 인산화된 단백질의 농도 측정결과(오른쪽 그래프)를 나타낸 것이다.
도 3은 PPE로 폐기종이 유발된 마우스 모델에서 PTD-bFGF에 의한 치료 효과를 확인한 것으로, a는 폐기종 마우스 모델 제조 및 PTD-bFGF 투여에 따른 실험 스케줄을 나타낸 것이고, b는 마우스 유래 폐 조직에 대한 H&E 염색 결과를 현미경으로 관찰한 사진이며, c는 평균 선형절편(Lm) 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 PPE로 폐기종이 유발된 마우스 모델에서 PTD-bFGF에 의한 염증반응 억제 효과를 확인한 것으로, a는 수득한 BALF에 함유된 총 면역세포를 giemsa 염색하여 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이고, b는 총 면역세포수를 그래프로 나타낸 것이며, c~e는 BALF에 함유된 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현수준을 각각 ELISA 분석을 통해 확인한 그래프이다.
도 5는 PE로 폐기종이 유발된 마우스 모델에서 PTD-bFGF 처리에 따른 MAPKs 신호전달 관련 인자들인 JNK1/2, ERK1/2 및 p38 MAPK 단백질의 활성에 미치는 영향을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 MLE-12 세포주에서 PTD-bFGF의 세포 내 위치를 his 프로브를 이용하여 형광 형미경을 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 마우스 폐 조직에서 PTD-bFGF의 위치를 his 프로브를 이용하여 형광 현미경을 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 MLE-12 세포주 유래 엑소좀 및 PTD-bFGF과의 관련성을 분석한 것으로서 MLE-12 세포주로부터 엑소좀을 분리하여 qRT-PCR을 통해 분리된 엑소좀을 확인한 것으로, a는 HSP70 (exosome marker), TSG101 (exosome marker), 18S (ribosomal RNA marker) 및 cytochrome C (mitochondria marker)를 qRT-PCR로 확인한 것이며, b는 웨스턴 블럿 결과이고, c는 PTD-bFGF 및 CSE의 처리 유무에 따른 MLE-12 세포주 유래 엑소좀에 함유된 let-7c의 수준을 나타낸 것이다.
도 9는 폐기종 마우스의 기관지폐포세척액으로부터 수득한 엑소좀을 대상으로 PTD-bFGF 처리 유무에 따른 let-7c, microRNA-155 및 microRNA-9의 발현수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 폐포상피세포인 MLE-12 세포주의 배양액에서 수득한 엑소좀에 대해 CSE 및 PTD-bFGF 처리 유무에 따른 let-7c, microRNA-155 및 microRNA-9의 발현수준을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에서 세포를 대상으로 PTD-bFGF를 처리하여 단백질 발현 유도를 위해 사용한 플라스미드 컨스트럭스(pET21b-PEP1-FGF2 플라스미드) 및 단백질 서열을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에서 PTD-bFGF를 처리한 MLE-12 세포주의 배양액으로부터 분리한 엑소좀의 형태를 투과전자현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에서 PTD-bFGF를 처리한 MLE-12 세포주의 용해물 및 분리한 엑소좀을 대상으로 HSP70, TSG101 및 Cyto C의 발현여부를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 아무것도 처리하지 않은 MLE-12 세포주 유래 엑소좀, bFGF를 처리한 MLE-12 세포주 유래 엑소좀 및 본 발명의 PTD-bFGF를 처리한 MLE-12 세포주 유래 엑소좀에 대한 엑소좀 나노입자의 크기 및 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 만성폐쇄성 폐질환을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 치료제 및 치료 방법에 대해 엑소좀을 이용할 수 있는 기술을 연구하던 중, PTD와 bFGF가 융합된 PTD-bFGF(protein transduction domian-basic fibroblast growth factor) 폴리펩티드를 이용할 경우, 엑소좀의 분비를 조절하고 micro RNA의 조절을 통해 보다 효과적으로 만성폐쇄성 폐질환을 치료할 수 있음을 확인하였고, 나아가 PTD-bFGF 폴리펩티드를 만성폐쇄성 폐질환이 유발된 마우스에 주입한 경우, 질환의 증상이 개선됨을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명은 PTD-bFGF 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
섬유모세포성장인자(fibroblast growth factor; FGF)는 섬유모세포를 위시한 다양한 세포의 증식, 이동, 분화 및 생존을 조절하는 성장인자 중 하나로서, 23종으로 구성된 일군의 단백질로 구성되어 있다. FGF는 각질세포, 섬유모세포, 혈관내피세포, 민무늬근세포, 연골세포와 비만세포 등에서 생성되며, 다양한 세포에서 발현되는 4종의 섬유모세포성장인자 수용체(FGF Receptor)를 활성화하여 상기와 같은 기능을 발휘한다. 다른 연구결과에 의하면 bFGF(basic fibroblast growth factor)는 혈관신생 또는 상처치료 등과 같은 생물학적 과정에 관여하는 성장인자로 알려져 있고, 우울 장애(major depressive disorder; MDD)를 개선하는 효과가 있음이 알려져 있다(Turner et al. 2008). 또한, 알부민으로 유발된 천식 마우스 모델에서 염증을 억제하는 활성이 있음이 보고된 바 있다.
본 발명에서 사용한 상기 PTD(protein transduction domian)은 단백질 전달 도메인으로서 bFGF를 세포 내로 효과적으로 유입할 수 있도록 하며, 상기 단백질 전달도메인으로 인해 bFGF가 세포흡수 작용(pinocytosis), 식세포 작용 (phagocytosis) 및 수용체-매개 세포내 취입 작용 (endocytosis)이 아닌 세포막 투과 기작을 통해 세포 내로 유입될 수 있도록 하였다. 따라서 bFGF의 세포 내로의 유입이 다른 기전과 비교하여 보다 효율적으로 이루어질 수 있도록 PTD와 bFGF가 융합된 형태인 PTD-bFGF를 사용하였다.
본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 상기 PTD-bFGF가 효과적으로 세포 내로 유입되고 있는지 확인하기 위해, his 프로브를 사용하여 형광현미경 관찰을 수행하였는데, PTD-bFGF 처리 농도 의존적으로 세포내로 잘 유입되는 것으로 확인되었고, 세포의 세포질에 위치하고 있음을 확인할 수 있었다.
바람직하게 본 발명에서 사용한 PTD-bFGF 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
한편, 만성폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)은 비가역적인 기도의 폐색을 동반한다는 점에서 천식과 다르며 기도 및 폐실질 염증에 의한 세기관지 및 폐실질의 병리학적 변화에 의해 발생하는 병으로, 폐쇄성 세기관지염 및 폐기종(폐실질 파괴)을 특징으로 한다. 만성폐쇄성 폐질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease)의 종류에는 만성폐쇄성 기관지염(Chronic obstructive bronchitis), 만성 세기관지염(Chronic bronchiolitis) 및 폐기종(Emphysema)이 있다. 본 발명의 조성물이 치료하고자 하는 대상질환은 바람직하게는 만성폐쇄성 폐질환일 수 있으나, 본 발명이 적용 가능한 비가역적인 기도의 폐색을 동반하며 기도 및 폐실질 염증에 의한 세기관지 및 폐실질의 병리학적 변화에 의해 발생하는 병에 제한되는 것은 아니다.
특히 본 발명에서는 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 만성폐쇄성 폐질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는지 구체적인 실험을 통해 확인하였는데, 만성폐쇄성 폐질환이 유발된 마우스 동물모델 및 담배연기 추출물(CSE)를 처리한 손상된 폐 상피세포를 대상으로, 본 발명의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리한 군과 처리하지 않은 군을 대상으로 질환의 치료 가능성을 분석하였다.
분석 결과, CSE가 처리된 폐 상피세포주(MLE-12 세포주)는 세포 생존력이 감소되는 것으로 나타난 반면, PTD-bFGF 처리 시 감소된 세포 생존력이 증가되는 것으로 나타났고, CSE 처리에 의해 증가된 전염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 발현 수준이 PTD-bFGF에 의해 감소된 것으로 나타났으며, 활성산소종 역시 PTD-bFGF에 의해 감소된 것으로 나타났다.
TNF-α, IL-6 및 IL-1β와 같은 염증성 사이토카인과 케모카인들은 폐혈관 순환에서부터 폐포로까지 호중구의 트래피킹(trafficking) 활성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이들은 모두 염증과 관련된 사이토카인 또는 케모카인들로서, 만성폐쇄성 폐질환의 경우, 호중구 수가 증가하며 이러한 염증성 사이토카인 또는 케모카인이 분비된다. 이러한 분비 물질은 기도에 염증을 유발하게 되고, 근육벽이 두꺼워지며, 점액 분비가 증가하여 기관지 폐쇄가 나타난다. 기관지가 폐쇄되면 폐포는 확장되고 손상되어 산소와 이산화탄소의 교환능력이 손상을 받게 되며, 호흡부전발생이 높아지게 된다. 특히, 이들 염증성 사이토카인 또는 케모카인은 COPD를 앓고 있는 환자들에게서 발현이 증가됨이 밝혀져, 만성폐쇄성 폐질환과의 원인 요소로 알려져 있다.
따라서 본 발명자들은 본 발명의 PTD-bFGF가 MLE-12 세포주에서 CSE에 의한 전염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있어 염증성 사이토카인에 의한 폐 세포 손상을 억제하고 또는 손상된 폐 세포를 회복시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한 본 발명의 다른 일실시예에 의하면, 폐기종을 유발시킨 마우스 동물모델을 대상으로 PTD-bFGF의 처리 유무에 따른 질환 증상의 개선 여부를 확인한 결과, 폐기종이 유발된 마우스는 전염증성 사이토카인들이 증가되어 있는 반면 PTD-bFGF을 주입한 군에서는 전염증성 사이토카인들이 감소되어 있는 것으로 나타났고, H & E 염색 분석에서도 질환 유발에 의해 증가된 폐포의 평균 선형 절편값(Lm)이 PTD-bFGF 처리시 감소되는 것으로 나타남에 따라 폐포의 확장을 억제하여 폐 손상을 감소시키는 효과가 있음을 확인하였다. 따라서 동물모델을 통해서도 본 발명의 PTD-bFGF가 만성폐쇄성 폐질환을 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 본 발명의 PTD-bFGF가 만성폐쇄성 폐질환을 어떠한 기작을 통해 치료할 수 있는 것인지 확인하기 위한 실험을 수행하였는데, 그 결과, MAPKs 신호전달을 억제하는 활성을 통해 만성폐쇄성 폐질환의 발병 및 관련 기작의 활성화을 억제 및 감소시킴으로써 만성폐쇄성 폐질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다. 특히 일실시예에서 PTD-bFGF의 처리에 의해 NK1/2, ERK1/2, p38 MAPK 단백질들의 인산화가 효과적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명의 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드는, 산화질소(NO) 생성억제; 전염증성 사이토카인의 생성억제; 활성산소종(ROS) 생성억제; 및 MAPK 신호전달 인자인 JNK1/2, ERK1/2 및 p38 MAPK 단백질의 인산화 억제 활성을 갖는다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 처리된 포유류의 세포 또는 조직 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
앞서 기술한 바와 같이, 본 발명자들은 만성폐쇄성 폐질환의 새로운 치료제로서 엑소좀을 활용하고자 하는 연구를 진행하였는데, 그 결과, 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 세포 또는 조직에 처리할 경우, 엑소좀의 생성 및 분비를 촉진시킬 수 있으며, 특히 만성폐쇄성 폐질환 치료를 위한 micro RNA들의 조절이 가능함을 확인할 수 있었다.
엑소좀(exosome), 마이크로비히클(microvesicles) 및 아팝토틱 바디(apoptotic body)를 포함하는 세포외 소낭(extracellular vesicles)은 인지질 이중층에 의해 둘러싸여 있으며 세포 간 커뮤니케이션의 역할을 한다(Fujita 등 2015). EVs의 종류 중에서 엑소좀은 가장 작은 크기를 가지며 대부분의 세포에서 endolysosomal pathway에 의해 분비 되어진다(S et al. 2010). 또한, 이러한 세포외 소낭은 메신저 RNA (mRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 막 단백질 및 수용체로 구성되어 있고, 치료제 또는 손상된 세포에서 다른 세포로 물질 이송 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 본 발명의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 엑소좀을 조절할 수 있는지 확인하기 위해, PTD-bFGF 폴리펩티드를 각기 다른 농도로 MLE-12 세포주에 처리한 후, 엑소좀을 분리하고 이를 정량화 하였다.
그 결과, PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리한 군이 처리하지 않은 군에 비해 엑소좀이 더 많이 생성된 것으로 나타났고, 이는 PTD-bFGF 폴리펩티드 처리에 의해 세포 내에서 소포체의 형성이 증가되어 엑소좀의 분비가 촉진된다는 것을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 일실시예에 의하면, 마우스 유래 제2형 폐상피세포주인 MLE12 세포주를 대상으로 아무것도 처리하지 않은 MLE12 세포주(대조군), bFGF를 처리한 MLE12 세포주 및 본 발명의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리한 MLE12 세포주로로부터 각각 엑소좀을 분리한 후, 엑소좀 나노입자의 크기 및 수를 측정하였는데, 그 결과, 아무것도 처리하지 않은 MLE12 세포주(대조군) 및 bFGF를 처리한 MLE12 세포주 유래의 엑소좀에 비해, 본 발명의 PTD-bFGF가 처리된 MLE12 세포주 유래의 엑소좀이 더 다양한 크기를 갖는 것으로 나타났고 엑소좀의 수도 월등히 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 14 참조).
그러므로 본 발명의 PTD-bFGF는 엑소좀의 생성 및 분비를 직접적으로 향상시키는 활성이 있음을 알 수 있었고, 따라서 본 발명의 PTD-bFGF을 세포주에 처리함으로써 만성 폐쇄성 폐질환의 치료 효능을 갖는 엑소좀을 대량 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명자들은 본 발명의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 엑소좀의 생성 및 분비 촉진과 함께 엑소좀 내 micro RNA를 조절할 수 있는지를 확인하였는데, 우선 만성폐쇄성 폐질환과의 관련성이 알려진 Let-7C micro RNA를 확인한 결과, PTD-bFGF을 처리한 군은 담배연기추출물(CSE)에 의해 발현이 감소된 Let-7C micro RNA를 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다. Let-7C micro RNA는 만성폐쇄성 폐질환이 유발되면 그 발현양이 감소되는 것으로 알려져 있다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 엑소좀 내 micro RNA를 조절할 수 있으며, 특히 만성폐쇄성 폐질환의 치료 효능을 갖는 Let-7C micro RNA가 다량 함유된 엑소좀을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 만성폐쇄성 폐질환과 관련성이 있는 엑소좀 내 특정 micro RNA를 규명하던 중, 특이하게도 microRNA-155 및 microRNA-9가 만성 폐쇄성 폐질환이 유발된 경우, 즉 CSE 또는 PPE 처리에 의해 폐 세포의 손상이 유발되었거나 폐 조직이 손상된 경우, 이들 microRNA들의 발현 수준은 증가되어 있는 것으로 확인되었고, 반면, 본 발명의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리한 경우, 엑소좀 내에서 microRNA-155 및 microRNA-9의 발현이 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
상기 Let-7C micro RNA, microRNA-155 및 microRNA-9에 대한 각각의 염기서열은 당업계에 알려져 있다(Wikipedia 사이트).
따라서 본 발명자들은 microRNA-155 및 microRNA-9가 만성폐쇄성 폐질환과 관련성이 있음을 예상할 수 있었고, 본 발명의 PTD-bFGF가 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시킬 수 있으며, 특정 micro RNA의 발현 수준을 조절함을 통해 만성 폐쇄성 폐질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 상기 본 발명에 따른 microRNA let-7c, microRNA-155 및 microRNA-9들은 QIAGEN에서 구입한 것을 사용하였으며, microRNA let-7c은 카탈로그 번호 MS00005852, microRNA-155은 카탈로그 번호 MS00001701, microRNA-9는 카탈로그 번호 MS00012873의 것을 사용하였다.
그러므로 본 발명은 포유류 유래 분리된 세포 또는 조직에 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료를 위한 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시키는 방법을 제공할 수 있다.
나아가 본 발명은 포유류 유래 분리된 세포 또는 조직에 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는, 엑소좀 내에서 let-7c의 microRNA를 증가시키는 방법을 제공할 수 있고, 포유류 유래 분리된 세포 또는 조직에 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는, 엑소좀 내에서 microRNA-155 및 microRNA-9의 발현 및 생성을 억제시키는 방법을 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하여 수득한 엑소좀에는 let-7c의 microRNA는 증가되어 있고, microRNA-155 및 microRNA-9는 감소되어 있으며, 바람직하게 상기 세포는 폐 상피세포주인 MLE-12 세포이고, 상기 조직은 폐 조직일 수 있다.
또한, 상기 포유류 유래 분리된 세포 또는 조직에 대해 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하는 것은, 상기 세포 또는 조직의 배양액에 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하여 배양하는 방법으로 수행될 수 있으며, 또는 인간을 제외한 포유 동물의 세포 또는 조직에 직접 투여하는 방법으로도 수행될 수 있는데, 이 경우 바람직하게 상기 PTD-bFGF 폴리펩티드를 함유한 식염수를 복강 내 주사를 통해 주입할 수 있다.
본 발명에서 상기 "배지"는 생체 외(in vitro)에서 세포의 성장과 증식에 필요한 필수성분을 포함하는 조성물을 의미하는 것으로, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 줄기세포 배양용 배지를 모두 포함하며, 예를 들어 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있고, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 "만성폐쇄성 폐질환"은 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 이로 인해 점차 기류 제한이 진행되어 폐 기능이 저하되고 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환을 말한다. 만성폐쇄성 폐질환의 주된 증상은 만성적인 기침 또는 만성적인 가래(객담)을 비롯하여 호흡곤란 등이 있으며, 베타항진제, 항콜린제, 메틸잔틴계 등의 기관지 확장제 또는 부신피질 호르몬 흡입제 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 만성폐쇄성 폐질환은 바람직하게는 만성 기관지염(chronic bronchitis) 또는 폐기종(emphysema)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "만성 기관지염(chronic bronchitis)"이란, 2년 연속, 1년에 3개월 이상 가래가 있고 기침이 지속되는 질환을 의미한다. 흡연, 대기오염, 직업적 노출 등의 자극에 의한 기관지 손상이 원인으로 추정되고 있으며, 주요 증상으로는 만성 기침, 가래, 운동시 호흡곤란 등이 있다. 또한, 만성폐쇄성 폐질환의 특징인 급성 악화가 있을 수 있으며, 이때에는 수 시간에서 수일 사이 호흡곤란이 빠르게 악화되고 가래의 양이 늘어나거나 가래의 성상이 점액성에서 화농성으로 변하면서 진한 노란색이나 푸르스름한 색을 띄게 되고 점도가 높아져 뱉어내기 힘들어진다.
본 발명에서 용어, "폐기종(emphysema)"이란, 종말 세기관지(terminal bronchiole) 원위부 공기공간(airspace)의 파괴로 인하여 비정상적이며 영구적인 말초 기도 및 폐포의 확장상태를 의미한다. 유해 입자와 가스의 흡입에 의하여 발생하며, 임상적으로 가장 의미있는 위험인자는 흡연으로 알려져 있다. 주요 증상으로는 만성적인 기침과 가래, 호흡곤란 등이 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 만성폐쇄성폐질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 사용된 용어, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 만성폐쇄성 폐질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있으며, 공인된 만성폐쇄성폐질환 억제 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용 가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 상기 본 발명의 유효성분을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 본 발명의 유효성분을 약학적 조성물에 0.001 내지 1500 ㎍/ml로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.001 내지 1000 ㎍/ml으로 포함될 수 있다.
나아가 본 발명은 본 발명의 유효성분을 포함하는 약학적 조성물을 COPD의 예방 또는 치료가 필요한 개체에 투여하여 COPD를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 개체는 만성폐쇄성 폐질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물을 만성폐쇄성 폐질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 구체적으로, 상기 개체는 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<준비예>
실험방법
(1) PTD - bFGF 준비
PTD-bFGF는 Bioceltran으로부터 입수하여 사용하였는데, 동결 건조된 PTD-bFGF을 완충액(50mM NaPO4, 0.4M NaCl, 2mM EDTA, 100 mg/ml cavasol (pH7.5))으로 용해시켜 사용하였다. 이때 비히클 군은 MLE-12 세포에 대해 완충액으로 26 시간 동안 처리하여 사용하였다. 또한, 하기 본 발명의 실시예에서 수행한 PTD-bFGF 처리는 PTD-bFGF를 포함하는 발현벡터(pET21b-PEP1-FGF2 벡터)를 세포에 처리하여 세포 내에서 PTD-bFGF 발현에 따른 영향을 분석한 것이다. 본 발명에서 사용한 pET21b-PEP1-FGF2 벡터지도는 도 11에 나타내었고, PTD-bFGF의 아미노산 서열 및 염기서열도 도 11에 기재되어 있다.
(2) 세포배양 및 처리
마우스 AE 타입 II 세포주 및 MLE-12 세포는 ATCC(Manassas, VA, USA)로부터 구입하였으며, MLE-12 세포는 37℃ 및 5% CO2 조건에서 0.005 mg/ml 인슐린, 30μM 소듐 셀레나이트, 10nM 하이드로코르티존(hydrocortisone) 및 10nM β- 에스트라디올이 함유된 2% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토 마이신을 함유하는 DMEM/F-12 배지에서 배양하였다. MLE-12 세포를 FBS가 없는 배지로 12 시간 동안 배양 후, MLE-12 세포에 PTD-bFGF 10-100ng/ml을 2시간 동안 처리하였다. 이 후, MLE-12 세포를 PBS로 2 회 세척하고 동일한 농도의 PTD-bFGF 및 0.25~0.5% CSE(담배연기추출물)로 24 시간 동안 처리하였다. 처리 종료 후, NO 생성 확인을 ELISA 분석을 통해 수행하였는데, 이를 위해 MLE-12 세포 배양배지를 사용하였다. 또한, 세포는 PBS로 세척하고 Trizol Isolation Reagent (# 79306, QIAGEN, NRW, Germany) 및 RIPA 완충액으로 용해시켰다.
(3) MTT 어세이
MLE-12 세포를 96웰 플레이트에서 PTD-bFGF 및 CSE(담배연기 추출물) 처리와 함께 배양하였다. 이후 MTT 시약(20㎕/㎖)을 2시간 동안 37 ℃ 및 5 % CO2 조건 하에서 처리하였고, 이후 MTT 시약을 제거한 후, 보라색 포르마잔 결정을 용해시키기 위해 디메틸설폭시드(DMSO)에 첨가하여 세포 생존력을 분석하였다. 세포 생존력은 마이크로 플레이트 판독기 (BioTek, VT, USA)를 사용하여 측정하였다.
(4) 산화질소(NO) 생성수준 측정
MLE-12 세포의 배양배지는 NO 생성 측정에 사용하였다. MLE-12 세포 배양 배지를 같은 양의 그리리제 (griess reagent)와 함께 96 웰 플레이트에 첨가한 후, 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(5) 활성산소종(ROS)의 측정
세포 내 ROS 수준은 2',7- 디클로로플루오레신-디아세테이트(DCF-DA) 시약을 이용하여 측정하였다. MLE-12 세포를 10μM DCF-DA로 30분간 37℃에서 처리하였고, 이후 MLE-12 세포를 PTD-bFGF 및/또는 CSE로 처리하였다. 그런 뒤, 트립신 처리에 의해 MLE-12 세포를 수득한 다음, 유세포 계측기(Accuri C6, BD Biosciences, CA, USA)로 분석하였다.
(6) 실험 동물준비
본 실험에서 사용한 실험 동물은 8주령 수컷 C57 BL / 6 마우스를 두열 바이오텍(서울, 대한민국)에서 구입하여 사용하였다. 모든 동물 실험은 기관동물관리 및 사용위원회 (강원대학교, KW-150820-1)의 규정의 승인 하에서 진행하였다.
(7) PPE (porcine pancreatic elastase ) 주입으로 폐 손상이 유발된 마우스 모델 제조
폐기종이 유발된 마우스 모델은 생리식염수 50 ㎕에 50 U/kg PPE를 기관 내 주사하여 제조하였다. 이후 5일 동안 0.1~0.5 mg/kg PTD-bFGF/bFGF을 200μl 식염수에 용해시켜 복강 내 주사하였다. 마우스 동물들을 대조군, 저용량 PTD-bFGF 주입군(0.1 mg/kg), 고용량 PTD-bFGF 주입군(0.5 mg/kg), PPE 처리군, PPE+저용량 처리군, PPE+고용량 처리군으로 각각 그룹핑하여 나눈 뒤, 14 일 이후 모든 마우스들을 희생시켰다.
(8) 폐 조직 수집
PTD-bFGF 및/또는 PPE 처리 후, 트리졸 분리용 시약(# 79306, QIAGEN, NRW, Germany)을 이용하여 마우스의 오른쪽 폐를 균질화하였고, RIPA 완충액 및 4 % 파라포름알데히드로 왼쪽 폐를 24 시간 동안 고정시켰다. 왼쪽 폐를 파라핀에 임베딩 후 6μm 두께의 절편으로 절단하였다. 폐 절편은 조직학적 분석을 위해 헤마토크실렌 및 에오신 (H & E)으로 염색하였다.
(9) 기관지 폐포 세척액( Bronchoalveolar lavage fluid ( BALF )) 수집
희생된 마우스의 기관지 폐포 세척액(BALF)은 카테터와 얼음-식염수 1ml를 이용하여 마우스의 기관으로부터 추출하였다. 추출한 BALF를 3,000 rpm으로 10 분 동안 4 ℃에서 원심분리하고 상층액을 수득하였다. 그 후, BALF를 cytospin 원심 분리기를 사용하여 3,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, 슬라이드에 놓았다. 슬라이드는 Hema-3 염색(Thermo Fisher Scientific)으로 염색하였고, 염색된 세포를 현미경으로 계수 하였다.
(10) ELISA
DuoSet ELISA 개발키트(R & D systems, MN, USA)를 이용하여 MLE-12 세포 및 마우스 BALF의 배양배지에 존재하는 TNF-α(# DY410), IL-6(# DY406) 및 IL-1β(# DY1679) 미국)의 양을 측정하였다. 측정은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
(11) 웨스턴 블럿
MLE-12 세포 용해물 및 폐 균질물을 RIPA 용해 버퍼를 이용하여 단백질 시료를 제조하였다. 단백질 측정은 Bicinchoninic (BCA) 단백질 분석 키트 (# 23225, Thermo Fisher Scientific, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 측정 후, 25μg의 단백질을 5X SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합하였고, 10-15 % SDS- 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동을 수행하였다. 그런 뒤, 니트로셀룰로오스 막(# 162-0115, BIO-RAD, CA, USA)으로 단백질을 이동시키고, 5 % 탈지유를 이용하여 블록킹 반응을 수행하였다. 이후 1차 항체를 처리하여 실온에서 4 시간 동안 배양하였고, TBST 완충액 (0.05 % Tween 20을 갖는 TBS)으로 3 회 세척한 후, 2 차 항체를 처리하고 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 이후 TBST 버퍼로 3 번 세척 한 후, 막을 ECL 기질 (# 170-5061, BIO-RAD, CA, USA)을 사용하여 반응시킴으로써 단백질을 검출하였다.
(12) 면역블롯팅
MLE-12 세포는 37℃ 및 5% 이산화탄소 조건 하에서 2 시간 동안 1~10μg/ml의 PTD-bFGF로 처리하고 커버슬라이드에 코팅하였다. 생체 내 모델에서 마우스를 7 일 동안 매일 5mg/kg bFGF 또는 PTD-bFGF로 처리하였다. 마우스를 희생시킨 후, 마우스로부터 추출한 폐 조직은 파라핀 블록에 임베딩하였고 슬라이드 상에서 6μm 두께로 절편화 하였다. 폐 조직 슬라이드는 항원 검색 단계를 수행하였다. 세척 후, MLE-12 세포 및 폐 조직은 4 % 파라포름 알데히드로 10 분간 고정시켰고, 투과화를 위해 Triton X-100으로 10분 동안 처리하였다. 슬라이드를 10% 정상 염소 혈청으로 실온에서 30 분 동안 차단시켰다. His 프로브 항체가 함유된 Aspirate blocking 용액은 1% 정상 염소 혈청으로 슬라이드에 처리한 후, 습기 찬 암실에서 4 ℃의 온도로 밤새도록 두었다. 이차 항체는 anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488 conjugate, # 4412, Cell signaling)를 사용하였고, 2차 항체를 1 시간 동안 처리 한 후, 슬라이드를 염색하고 DAPI (# 6057, Sigma-ALDRICH, MO, USA)로 Fluoroshield에 장착한 후, 슬라이드는 공 촛점 현미경으로 관찰하였다.
(13) 엑소좀 분리
엑소좀은 PTD-bFGF 및/또는 CSE로 처리된 MLE-12 세포 배양배지(CM)로부터 분리하였는데, CM을 10분 동안 4℃에서 2,000 rpm으로 원심분리하여 세포를 제거한 다음, 4 ℃에서 10,000 rpm으로 원심분리하여 죽은 세포와 파편 세포를 제거하였다. 그 다음, 상등액을 0.2μm 멸균 필터(# 16534, Sartorius stedim, Germany)로 여과하였고, 상등액을 75,000g에서 초원심 분리하여 엑소좀에 해당하는 펠렛을 수거하였다. 펠렛을 PBS로 세척 한 후, 75,000g의 속도로 펠릿을 한 번 더 초원심 분리시켜 엑소좀을 수득하였다.
(14) qRT - PCR
총 RNA는 트리졸 시약을 이용하여 MLE-12 세포로부터 분리하여 수득하였다. cDNA는 역전자 프리믹스(# EBT-1514, Elpis Biotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 총 RNA 1 μg을 가지고 합성반응을 수행하였다. 유전자 발현 mRNA 수준은 1 단계 플러스 실시간 PCR 시스템(Thermo Fisher Scientific, IL, USA)을 사용하여 SYBR Green (# RT501, Enzynomics, Daejeon, Korea)으로 측정하였고, 유전자 발현의 정상화는 18S의 Ct 값을 통해 2-ΔΔCt 방법으로 계산하였다.
(15) MicroRNA 어세이
small RNA를 포함한 총 RNA는 MLE-12 세포 유래 엑소좀 miRNeasy mini kit (QIAGEN, NRW, Germany)를 이용하여 분리하였다. cDNA의 합성은 miScript II RT 키트(QIAGEN, NRW, Germany)를 사용하였고 총 500ng의 RNA을 이용하여 수행하였다. miScript SYBR green PCR kit (QIAGEN, NRW, Germany) 및 miScript primer assay (# MS00005852 및 # MS00033740, QIAGEN, NRW, Germany)를 이용하여 cDNA를 증폭시켰다. 마이크로 RNA 발현수준은 RNU6B의 Ct 값을 통해 2-ΔΔCt 방법으로 계산하였다.
(16) 통계처리
모든 통계처리는 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, CA, USA)으로 분석하였고, Bonferroni post-hoc test에 대해 일방 분산 분석 (ANOVA)을 사용하였다. * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001의 값을 대조군과 비교하였으며, 모든 실험은 최소 3 회 수행하였다.
< 실시예 1>
PTD - bFGF의 폐 손상 보호 효과 분석
본 발명의 PTD-bFGF가 폐 손상 보호 활성이 있는지 확인하기 위해, 담배연기 추출물(CSE)에 의해 유발된 폐 세포 손상에 대한 보호 효과여부를 분석하였는데, MLE-12 세포주에 CSE를 처리하고 본 발명의 PTD-bFGF 처리 유무에 따른 산화질소(NO)생성여부, 전염증성 사이토카인의 생성량, 활성산소종 생성여부 및 세포 생존력에 대한 분석을 수행하였다.
그 결과, MLE-12 세포의 세포 생존력은 CSE 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났으나, PTD-bFGF 처리한 군에서는 CSE 처리에 의한 감소된 새포 생존력이 증가되는 것으로 나타났다(도 1a). 또한, NO 생성량은 CSE 처리 시, 증가되는 것으로 나타났고, PTD-bFGF 처리 시 NO 생산에는 큰 변화를 보이지 않는 것으로 나타났다 (도 1b). 한편, TNF-α, IL-6 및 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인은 CSE 처리 시 상향 조절되었으나, PTD-bFGF 처리 군에서는 CSE 처리 군에 비해 전염증성 사이토카인들이 하향 조절되는 것으로 나타났다(도 1c, 1d 및 1e). 또한 DCF-DA 형광을 사용하여 세포 내 활성산소종 (ROS) 분석 결과에서도, 세포 내 ROS는 CSE에 의해 유의하게 증가하였으나, PTD-bFGF에 의해 감소되는 것으로 나타났다(도 1f).
따라서 본 발명자들은 이러한 결과들을 토대로, 본 발명의 PTD-bFGF가 MLE-12 세포에서 CSE에 의한 폐 세포 손상을 효과적으로 예방할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 2>
PTD - bFGF의 MAPK 신호전달 영향에 대한 분석
PTD-bFGF가 MAPKs 신호전달 체계에 영향을 주는지 확인하기 위해, PTD-bFGF을 처리한 MLE-12 세포주 및 처리하지 않은 세포주에서 MAPKs 신호전달 관련 인자인 JNK1/2, ERK1/2 및 p38 MAPK 단백질들의 활성(인산화)과 발현수준을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.
그 결과, MAPK의 신호경로는 CSE 처리 시, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 유의적으로 인산화되는 것으로 나타난 반면, PTD-bFGF 처리 시, 이들 단백질의 인산화가 탈인산화되어 신호 전달의 활성이 억제되는 것을 알 수 있었다(도 2). 따라서 본 발명의 PTD-bFGF는 CSE으로 유도된 MAPKs의 신호전달 활성을 유의하게 억제함을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
폐기종 마우스 모델에서 PTD - bFGF의 치료 효과분석
PPE 주입으로 폐기종이 유발된 마우스 모델에서 PTD-bFGF 처리에 의해 폐기종의 증상이 개선되었는지를 확인하였다. 이를 위해 PPE를 투여하여 마우스에서 폐기종을 유발시킨 후, PTD-bFGF 처리 유무에 따른 폐 조직의 상태를 H & E 염색을 통해 확인하였고 폐포의 선형절편(Lm)을 분석하였으며, 또한 총 BAL 세포와 전염증성 사이토카인을 분석하였다.
그 결과, 폐 조직을 H & E로 염색한 결과에 따르면, 마우스 폐의 폐포는 PPE 에 의해 파괴된 것으로 나타났으며(도 3b), 폐포의 평균 선형 절편값(Lm)도 PPE에 의해 증가되는 것으로 나타났다. 한편, PTD-bFGF 처리 시, PPE에 의해 증가된 평균 선형 절편값은 감소하는 것으로 나타나 PTD-bFGF가 폐를 보호하는 효과가 있음을 알 수 있었다(도 3c). 또한 각 마우스 군으로부터 수득한 BALF에서 면역세포(BAL cell) 수를 분석한 결과, PPE 처리에 의해 증가된 면역세포가 PTD-bFGF에 의해 감소되는 것으로 나타났고(도 4a 및 4b), ELISA 분석을 통해 전염증성 사이토카인의 생성정도를 분석한 결과에서도 PPE 처리 시 증가된 TNF-α, IL-6 및 IL-1β와 같은 전염증성 사이토카인이 PTD-bFGF 처리에 의해 감소되는 것으로 나타났다(도 4c, 4d 및 4e). 따라서, 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 PTD-bFGF가 PPE로 유도되는 만성폐쇄성 폐질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
PPE로 유발된 폐기종 마우스 모델에서 PTD - bFGF에 의한 MAPK 신호전달 억제 효과규명
앞서 실시예를 통해 본 발명자들은 PTD-bFGF가 MAPKs 신호전달을 억제하는 활성이 있음을 확인하였으며, 나아가 PPE에 의한 MAPKs 신호전달의 활성을 본 발명의 PTD-bFGF가 억제할 수 있는지를 확인하였는데, 이를 위해 PPE가 주입되어 폐기종이 유발된 마우스의 폐 조직 및 질병 마우스에 PTD-bFGF를 처리하여 수득한 폐 조직을 대상으로 JNK1/2, ERK1/2, p38 MAPK 단백질들의 활성화 여부를 웨스턴 블럿을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, PPE에 의해 인산화되어 활성화된 JNK1/2, ERK1/2, p38 MAPK 단백질들은 PTD-bFGF 처리 시, 유의적으로 인산화 정도가 감소되어 활성이 억제되는 것으로 나타났다(도 5 참조).
따라서 본 발명의 PTD-bFGF은 PPE에 의해 활성화되는 MAPKs 신호전달을 효과적으로 억제하여 폐기종과 같은 만성 폐쇄성 폐질환을 개선, 예방 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 5>
폐조직 및 MLE -12 세포주에서 PTD - bFGF의 위치 분석
본 발명의 PTD-bFGF가 폐 조직 및 MLE-12 세포주에서 어느 부위에 위치하고 있는지 확인하기 위해 his 프로브를 사용하여 형광현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 MLE-12 세포에서 his 프로브의 강도는 PTD-bFGF 처리 농도에 의존적으로 증가하는 것으로 나타났고, 세포의 세포질에 위치하고 있는 것으로 확인되었다. 또한, 마우스 폐 조직에서 his 프로브의 강도 분석 결과, 프로브의 강도는 bFGF 처리 군에 비해 본 발명의 PTD-bFGF 처리군이 유의적으로 더 증가되어 있는 것으로 나타났다(도 7 참조).
< 실시예 6>
엑소좀에 미치는 PTD - bFGF의 영향 분석
PTD-bFGF가 엑소좀에 미치는 영향을 분석하기 위해, MLE-12 세포주로부터 상기 실험방법에 기재된 방법에 따라 엑소좀을 추출하였고, 추출된 엑소좀이 맞는지 확인하기 위해 엑소좀의 마커인 TSG101 및 HSP70 단백질 확인을 위한 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿을 수행하였다. 또한 대조군으로는 미토콘드리아의 마커인 사이토크롬 C에 대한 qRT-PCR 및 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 수득한 엑소좀에서는 TSG101 및 HSP70이 존재하고 있음을 확인할 수 있었으며, 반면 사이토크롬 C는 엑소좀에서는 거의 검출되지 않음을 알 수 있었다(8a 및 8b). 따라서 본 발명의 방법은 엑소좀을 제대로 수득할 수 있다는 것을 의미한다.
또한, MLE-12 세포주에 CSE를 단독 처리하여 폐 세포 손상이 유발된 군 및 CSE와 PTD-bFGF을 함께 처리한 군에 대해 Let-7C micro RNA를 분석하였다. Let-7C micro RNA는 만성폐쇄성 폐질환이 유발되면 그 발현양이 감소되는 것으로 알려져 있다.
분석 결과, 도 8c에 나타낸 바와 같이, PTD-bFGF을 처리한 군은 CSE에 의해 발현이 감소된 Let-7C micro RNA을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.
즉, 이러한 결과는 본 발명의 PTD-bFGF이 만성폐쇄성 폐질환의 치료를 위한 엑소좀을 조절할 수 있으며, 만성폐쇄성 폐질환과 관련된 micro RNA의 발현도 조절하여 궁극적으로 만성 폐쇄성 폐질환을 예방, 개선 및 치료할 수 있음을 의미한다.
< 실시예 7>
micro-RNA에 미치는 PTD - bFGF의 영향 분석
나아가 본 발명자들은 PTD-bFGF가 micro-RNA를 조절할 수 있는지를 확인하기 위해, PPE가 처리된 기관지폐포세척액 유래의 엑소좀과 PPE를 처리하지 않은 기관지폐포세척액 유래의 엑소좀에서 발현 변화를 보이는 micro-RNA를 분석한 결과, PPE를 처리하지 않은 군에 비해 처리한 군에서 microRNA-155 및 microRNA-9가 증가되어 있는 것으로 나타났다.
따라서 microRNA-155 및 microRNA-9는 만성 폐쇄성 폐질환의 발병과 관련되어 있다는 것을 의미하면, 본 발명의 PTD-bFGF는 발병 원인 인자로 볼 수 있는 microRNA-155 및 microRNA-9의 발현을 감소시킴을 통해 만성 폐쇄성 폐질환을 치료할 수 있음을 알 수 있다.
한편, microRNA-155 및 microRNA-9에 대해 본 발명의 PTD-bFGF가 상기 microRNA의 발현을 조절할 수 있는지 분석한 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, PPE에 의해 발현이 증가된 상기 microRNA들을 본 발명의 PTD-bFGF 처리에 의해 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
또한, PPE에 의해 발현이 감소된 let-7c micro RNA는 PTD-bFGF 처리에 의해 발현이 증가되는 것으로 나타났다. 참고로 도 9는 PPE의 주입으로 폐질환이 유발된 마우스의 기관지폐포세척액 유래 엑소좀에 함유된 micro RNA를 분석한 것이고, 도 10은 폐포상피세포인 MLE-12 세포주의 배양액에서 수득한 엑소좀에 함유된 micro RNA을 분석한 것이다.
이러한 결과를 통해 본 발명의 PTD-bFGF는 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시킬 수 있으며, 특정 micro RNA의 발현 수준을 조절함을 통해 만성 폐쇄성 폐질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실시예 8>
PTD - bFGF에 의한 엑소좀의 발현 및 분비 향상 효과분석
나아가 본 발명자들은 본 발명의 PTD-bFGF에 의한 엑소좀의 발현, 생성 및 분비 향상 효과를 직접적으로 확인하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다. 먼저 마우스 유래 제2형 폐상피세포주(MLE12)를 세포배양접시 cm2 면적당 1.7 x 104의 세포수로 분주한 후, 세포주 특이 배지에서 3일간 배양한 다음 serum-free 세포배지에서 24시간 동안 배양하고 starvation한 후, 100 mg/mL bFGF 펩타이드 또는 100ng/mL의 본 발명의 PTD-bFGF 펩타이드가 함유한 배지로 각각 교체한 후, 2시간 배양하였다. 이후 세포 배양액을 수득하여 원심 분리 및 여과를 수행하고, 최종적으로 스핀 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 엑소좀을 분리하였다. 또한, 얻어진 세포배양액을 낮은 중력속도에서 원심분리하여 large debris 또는 aggregate를 제거하고 남은 배양액만 100kDa MWCO 필터 장치를 6배로 농축시켰다. 얻어진 농축액은 원심분리 및 나노다공성막을 통한 브라운 운동을 이용하여 미세단백질과 같은 불순물이 제거된 일정한 크기를 갖는 순수한 엑소좀(50nm, 100nm, 200nm, 400nm 크기의 엑소좀)을 분리하였다.
이후 분리한 엑소좀의 형태를 투과전자현미경 (TEM, transmission electron microscope)을 통해 관찰하였고, 웨스턴 블럿을 통해 엑소좀 표지인자인 HSP70 (Heat shock protein 70)과 TSG101 (Tumor susceptibility 101)의 발현 수준을 확인하였으며, negative 인자인 Cyto C (Cytochrome C)의 발현도 분석하였다. 또한, 나노입자분석기(nanosight, dynamic light scattering)를 이용하여 나노입자추적분석 (NTA, nanoparticle tracking analysis)을 통해 상기 분리한 엑소좀의 나노입자 (nanoparticle) 크기와 나노입자 수를 정량분석하여 엑소좀의 분비량을 확인하였으며, 정량분석 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 이때 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 MLE12 세포주 처리군을 사용하였다.
Figure pat00001
분석 결과, MLE12 세포에 본 발명의 PTD-bFGF를 처리한 결과, 도 12와 같은 형태의 엑소좀이 생성 및 분비되는 것으로 나타났으며, 도 13에 나타낸 바와 같이, 엑소좀 표지 마커인 HSP70과 TSG101이 발현되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 나노입자분석기(nanosight, dynamic light scattering)를 통한 엑소좀의 나노입자(nanoparticle) 크기와 나노입자 수를 측정한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군인 폐상피세포주 MLE12에서 분리된 엑소좀의 크기와 나노입자 수(14A); 및 bFGF 펩타이드가 처리된 MLE12에서 분리된 엑소좀의 크기와 나노입자 수(15B)에 비해, 본 발명의 PTD-bFGF가 처리된 MLE12 세포에서 분리한 엑소좀의 크기가 더 다양한 것으로 나타났고, 나노입자수도 현저히 많은 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 14A, 14B 및 14C의 결과를 취합한 14D의 그래프를 통해 명확히 알 수 있다. 구체적으로 MLE12에서 분리된 엑소좀의 크기는 약 250nm 크기 이하의 것들임을 확인할 수 있었고, bFGF가 처리된 MLE12에서 분리된 엑소좀의 크기는 약 350nm 크기 이하의 것들임을 알 수 있었으며, 반면 본원발명의 PTD-bFGF가 처리된 MLE12 세포에서 분리한 엑소좀은 이들보다 큰 150~650nm의 다양한 크기를 갖는 엑소좀이 분비되고 있음을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 표 4에는 엑소좀을 분리하기 위하여 초기에 배양된 세포의 수, NTA 분석결과 각 군에서 얻어진 엑소좀의 평균 나노입자의 수와 크기 및 분리된 엑소좀의 단백질 정량을 측정한 사항으로, 동일한 MLE12 세포주에 대해 본 발명의 PTD-bFGF가 처리된 군이 다른 대조군들에 비해 엑소좀의 수, 크기 및 단백질 함량이 모두 현저하게 증가되어 있는 것으로 나타났다.
따라서 이러한 결과들을 통해 본 발명자들은 본 발명의 PTD-bFGF를 세포에 처리한 경우, 상기 세포로부터 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Kangwon National University <120> Composition for prevention or treatment of chronic obstructive pulmonary disease comprising PTD-bFGF or incresed exosome by PTD-bFGF <130> NPDC66468 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 498 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD-bFGF polypeptide sequence <400> 1 Met Glu Thr Leu Tyr Ser Gly Leu Thr His Arg Thr Arg Pro Thr Arg 1 5 10 15 Pro Gly Leu Thr His Arg Thr Arg Pro Thr Arg Pro Thr His Arg Gly 20 25 30 Leu Thr Arg Pro Ser Glu Arg Gly Leu Asn Pro Arg Leu Tyr Ser Leu 35 40 45 Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Leu Tyr Ser Val Ala Leu Leu Glu 50 55 60 Gly Leu Pro Arg Ala Leu Ala Leu Glu Pro Arg Gly Leu Ala Ser Pro 65 70 75 80 Gly Leu Tyr Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Gly Leu Tyr Ala Leu Ala Pro 85 90 95 His Glu Pro Arg Pro Arg Gly Leu Tyr His Ile Ser Pro His Glu Leu 100 105 110 Tyr Ser Ala Ser Pro Pro Arg Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Leu Glu Thr 115 120 125 Tyr Arg Cys Tyr Ser Leu Tyr Ser Ala Ser Asn Gly Leu Tyr Gly Leu 130 135 140 Tyr Pro His Glu Pro His Glu Leu Glu Ala Arg Gly Ile Leu Glu His 145 150 155 160 Ile Ser Pro Arg Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Ala Arg Gly Val Ala Leu 165 170 175 Ala Ser Pro Gly Leu Tyr Val Ala Leu Ala Arg Gly Gly Leu Leu Tyr 180 185 190 Ser Ser Glu Arg Ala Ser Pro Pro Arg His Ile Ser Ile Leu Glu Leu 195 200 205 Tyr Ser Leu Glu Gly Leu Asn Leu Glu Gly Leu Asn Ala Leu Ala Gly 210 215 220 Leu Gly Leu Ala Arg Gly Gly Leu Tyr Val Ala Leu Val Ala Leu Ser 225 230 235 240 Glu Arg Ile Leu Glu Leu Tyr Ser Gly Leu Tyr Val Ala Leu Cys Tyr 245 250 255 Ser Ala Leu Ala Ala Ser Asn Ala Arg Gly Thr Tyr Arg Leu Glu Ala 260 265 270 Leu Ala Met Glu Thr Leu Tyr Ser Gly Leu Ala Ser Pro Gly Leu Tyr 275 280 285 Ala Arg Gly Leu Glu Leu Glu Ala Leu Ala Ser Glu Arg Leu Tyr Ser 290 295 300 Cys Tyr Ser Val Ala Leu Thr His Arg Ala Ser Pro Gly Leu Cys Tyr 305 310 315 320 Ser Pro His Glu Pro His Glu Pro His Glu Gly Leu Ala Arg Gly Leu 325 330 335 Glu Gly Leu Ser Glu Arg Ala Ser Asn Ala Ser Asn Thr Tyr Arg Ala 340 345 350 Ser Asn Thr His Arg Thr Tyr Arg Ala Arg Gly Ser Glu Arg Ala Arg 355 360 365 Gly Leu Tyr Ser Thr Tyr Arg Thr His Arg Ser Glu Arg Thr Arg Pro 370 375 380 Thr Tyr Arg Val Ala Leu Ala Leu Ala Leu Glu Leu Tyr Ser Ala Arg 385 390 395 400 Gly Thr His Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Thr Tyr Arg Leu Tyr Ser 405 410 415 Leu Glu Gly Leu Tyr Ser Glu Arg Leu Tyr Ser Thr His Arg Gly Leu 420 425 430 Tyr Pro Arg Gly Leu Tyr Gly Leu Asn Leu Tyr Ser Ala Leu Ala Ile 435 440 445 Leu Glu Leu Glu Pro His Glu Leu Glu Pro Arg Met Glu Thr Ser Glu 450 455 460 Arg Ala Leu Ala Leu Tyr Ser Ser Glu Arg Leu Glu Ala Gly Leu Ala 465 470 475 480 His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His Ile Ser His 485 490 495 Ile Ser

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드는,
    산화질소(NO) 생성억제;
    전염증성 사이토카인의 생성억제;
    활성산소종(ROS) 생성억제; 및
    MAPK 신호전달 인자인 JNK1/2, ERK1/2 및 p38 MAPK 단백질의 인산화 억제; 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 전염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-6 또는 IL-1β인 것을 특징으로 하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 만성폐쇄성 폐질환(COPD)은 만성폐쇄성기관지염, 만성세기관지염 또는 폐기종(Emphysema)인 것을 특징으로 하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드가 처리된 포유류의 세포 또는 조직 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 세포는 폐 상피세포주인 MLE-12 세포이고, 상기 조직은 폐 조직인 것을 특징으로 하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 엑소좀 내에는 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드 처리에 의해 let-7c의 microRNA가 증가되어 있고, microRNA-155 및 microRNA-9는 감소되어 있는 것을 특징으로 하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 포유류 유래 분리된 세포 또는 조직에 서열번호 1의 PTD-bFGF 폴리펩티드를 처리하는 단계를 포함하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료를 위한 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포는 폐 상피세포주인 MLE-12 세포이고, 상기 조직은 폐 조직인 것을 특징으로 하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료를 위한 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시키는 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 엑소좀은 let-7c의 microRNA가 증가되어 있고, microRNA-155 및 microRNA-9는 감소되어 있는 것을 특징으로 하는, 만성폐쇄성 폐질환(COPD)의 예방 또는 치료를 위한 엑소좀의 생성 또는 분비를 증가시키는 방법.
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