KR20060027536A

KR20060027536A - 누에번데기로부터 기름의 추출, 분리 및 정제방법

Info

Publication number: KR20060027536A
Application number: KR1020040076364A
Authority: KR
Inventors: 강필돈; 김진원; 김미자; 강석우; 류강선; 박용수; 권무길; 이민주; 서성곤; 문석식; 조순장; 송준식
Original assignee: 대한민국(관리부서:농촌진흥청); 근화제약주식회사
Priority date: 2004-09-23
Filing date: 2004-09-23
Publication date: 2006-03-28
Also published as: KR100573466B1

Abstract

본 발명은 누에번데기 추출, 분리 및 정제에 관한 방법으로써, 이를 건강보조식품, 의약품 또는 화장품 개발에 이용하고자 함이다.

누에번데기추출물, 리놀산, 리놀렌산.

Description

누에번데기로부터 기름의 추출, 분리 및 정제방법{Process for the extraction, isolation and purification of oil from the silkworm powder}

도 1a 는 누에번데기 추출농축액 초기상태의 적외선 흡수 스펙트럼이고,

도 1b : 누에번데기 추출농축액중 물질 A의 적외선 스펙트럼이며,

도 1c : 누에번데기 추출농축액중 물질 B의 적외선 스펙트럼이고,

도 1d : 누에번데기 추출농축액중 물질 C의 적외선 스펙트럼이며,

도 1e : 누에번데기 추출농축액중 물질 D의 적외선 스펙트럼이고,

도 1f : 누에번데기 추출농축액중 물질 E(팔미토렌산)의 적외선 스펙트럼이다.

도 2a : 누에번데기 추출농축액 초기상태의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이고,

도 2b : 누에번데기 추출농축액 물질 A의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이며,

도 2c : 누에번데기 추출농축액 물질 B의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이고,

도 2d : 누에번데기 추출농축액 물질 C의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이며,

도 2e : 누에번데기 추출농축액 물질 D의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이고,

도 2f : 누에번데기 추출농축액 물질 E(팔미토렌산)의 ¹H NMR 분석 스펙트럼이다.

도 3a : 누에번데기 추출농축액 초기상태의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이고,

도 3b : 누에번데기 추출농축액 물질 A의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이며,

도 3c : 누에번데기 추출농축액 물질 B의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이고,

도 3d : 누에번데기 추출농축액 물질 C의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이며,

도 3e : 누에번데기 추출농축액 물질 D의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이고,

도 3f : 누에번데기 추출농축액 물질 E(팔미토렌산)의 ¹³C NMR 분석 스펙트럼이다.

도 4a : 누에번데기 추출농축액중 함유된 지방산의 기체클로마토그래피 질량분석기를 이용한 분석스펙트럼이고,

도 4b : 누에번데기 추출농축액중 함유된 EPA 지방산의 기체클로마토그래피 질량분석기를 이용한 분석스펙트럼이다.

예로부터 무공해 생명체로 알려져 있는 누에번데기는 최근에 분말 및 추출물을 이용하여 강정제뿐만 아니라 당뇨, 고혈압 등의 성인병 치료 및 면역기능 강화를 위한 기능성 식품으로 많이 이용되어지고 있다. 현재까지 천연물로서의 누에의 안정성과 임상적 효능은 익히 알려져 있으나 그 활성기작은 아직까지 확실치 않다.

천연물로서의 누에번데기 그 자체는 부작용이 없고 다양한 성인병 관련 질환의 치료제로서의 효능이 계속적으로 밝혀지고 있기 때문에 이를 이용한 건강보조식품, 의약품 또는 화장품 개발에 직접 많이 활용되고 있다. 그럼에도 불구하고 이 누에번데기로부터 유용한 기름성분을 분리하고 그 성분을 화학적으로 규명한 연구는 알려져 있지 않다.

누에번데기는 자양강정, 혈당강화, 항암, 노화방지, 숙취해소, 피부보습, 주름제거 등에 매우 효과적인 것으로 알려져 있다. 누에번데기 추출물에는 봄비콜, 히드록시헥사데카디엔, 봄비신 등의 단백질과 아르기닌 등의 아미노산 함량이 높아 이러한 성분들이 복합적으로 작용하여 다양한 효능을 보이는 것으로 예상되고 있다.

현재까지 누에번데기의 다양한 효능물질 및 효능기작을 정확하게 규명하지 못하고 있었으나, 본 발명을 통하여 누에번데기 기름에는 오메가-3 지방산인 리놀렌산(linolenic acid)(ω-3 지방산), 리놀산(linoleic acid), 올레산(oleic acid) 등의 다가불포화지방산이 다량함유되어 있는 것을 밝히고자 한다.

따라서 본 발명의 목적은 다양한 효능이 입증된 다가불포화지방산과 예로부터 알려진 임상적 효능을 기초로 하여 누에번데기로부터 천연 기름을 추출, 분리 및 정제하는 방법을 제공하고, 이를 주원료로 하는 기능성 식품, 의약품 또는 화장품의 원료로 사용함에 있다.

본 발명은 누에번데기를 메틸에틸케톤, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 헥산, 석유에테르, 이염화메탄, 프로판올, 이소프로판올 또는 초산에틸 중에서 선택한 1종 이상의 유기용매 및 초음파로 추출한 후에 분리 및 정제하여 천연기름을 얻고 이를 콜레스테롤 저하, 면역기능 강화, 피부보습, 항산화 효과, 주름제거 등의 효능을 가지는 식품, 의약품 또는 화장품 원료로 이용하도록 구성되어 있다. 그리하여 본 발명은 1) 누에번데기를 유기용매로 추출하는 단계 ; 2) 초음파로 추출하는 단계 ; 3) 누에번데기 기름을 분리ㆍ정제하는 단계 ; 4) 누에번데기 기름의 성분을 분석하는 단계를 포함하는 누에번데기 기름의 추출, 분리 및 정제방법을 특징으로 한다.

본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

건조된 누에번데기를 파쇄하여 가루로 만들고 누에번데기 1 킬로그람당 메틸 에틸케톤, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 헥산, 석유에테르, 이염화메탄, 프로판올, 이소프로판올 또는 초산에틸 중에서 선택한 500 밀리리터 ~ 5 리터의 혼합 또는 단일유기용매를 첨가한 후에 혼합하면서 20 ~ 80 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 추출하고, 초음파로 10 ~ 60 분 동안 재추출한 후에 원심분리 또는 여과를 통하여 추출액만을 분취하였다. 남아있는 누에번데기 고형물을 분리하여 같은 방법으로 3 회 반복 추출하여 추출액을 얻고, 추출액들을 모두 합하였다.

합한 추출액에 적당량의 10 % 수산화나트륨 수용액을 첨가하여 혼합하고 상온에서 수 십분 동안 방치하여 층 분리시킴으로써 수용성 불순물을 제거하였고 남아있는 유기용매층에 적당량의 염화암모늄을 혼합하여 다시 한번 층 분리시켰다. 이때 유기용매층만을 분리하여 적당량의 포화소금물과 혼합하여 다시 층 분리시켜 잔존하는 수용성 불순물을 완전히 제거하고 황산마그네슘을 첨가함으로써 유기용매로부터 물을 완전히 제거하였다. 유기용매층을 5 ~ 50 ㎛의 공극을 가진 여과지로 여과한 후에 20 ~ 80 ℃에서 감압 농축하여 유기용매를 제거하였다.

위 방법으로 얻어진 누에번데기 기름에 10 ~ 30 배량의 헥산과 적당량의 활성탄을 첨가하여 30 ~ 80 ℃에서 혼합하여 30 분 ~ 2 시간 동안 불순물을 흡착 제거시킨 후, 5 ~ 50 ㎛의 공극을 가진 여과지로 여과한 여과액을 감압농축하여 유기용매를 완전히 제거함으로써 최종 분리된 누에번데기의 기름성분을 획득하였다. 누에번데기의 초기 수분 함유량은 약 65 ~ 75 %이며, 획득한 기름성분은 중량기준으로 약 10 % 를 차지하였다. 이와 같은 방법으로 얻은 누에번데기 기름은 색깔이 거의 없으며, 누에번데기의 고유한 냄새가 전혀 나지 않는 투명한 점도가 있는 액체 이다. 이렇게 얻은 누에기름에는 적외선 스펙트럼(도 1), 핵자기공명 스펙트럼(도 2와 도 3) 등의 분광학적 방법으로 분석한 결과, 오메가-3 지방산이 25 ~ 35 % 함유되어 있음이 확인되었다.

누에번데기 기름성분에 존재하는 지방산의 구조와 조성비율을 정확히 알아내기 위하여, 누에번데기 기름을 수산화나트륨으로 가수분해한 후에 메틸화 반응하여 구성하고 있는 각각의 물질을 순수 분리하였다. 이때 사용한 관크로마토그라피에는 관충진제로 실리카겔 또는 역상 옥타데실실리카겔, 이동상으로는 헥산, 초산에틸, 메탄올, 아세토니트릴 등의 혼합액을 사용하였다. 분리된 메틸화 지방산의 구조는 적외선, 핵자기공명 등의 분광학적 방법으로 규명하였다. 메틸화 지방산의 고속액체크로마토그라피 분리결과로 얻은 지방산의 무게를 측정함으로써, 누에번데기로부터 분리한 기름의 지방산 함유 조성비율을 규명하였다. 누에 기름은 25 ~ 35 : 3 ~ 7 : 35 ~ 45 : 20 ~ 30 중량%의 비율로 존재하는 α-리놀렌산(α-linolenic acid)(ω-3 지방산), 리놀산(linoleic acid), 올레산(oleic acid), 스테아린산(stearic acid) 등의 주요 지방산과 글리세롤이 결합된 지방산 글리세롤 에스터이며, 그밖에 팔미토렌산(palmitoleic acid), 팔미틴산(palmitic acid) 및 에이코사펜타에노인산(eicosapentaenoic acid; 일명 EPA)등이 함유되어 있음이 확인되었다. 기름에 함유된 불포화지방산과 포화지방산의 함량 비율은 약 7 : 3 이다(표 1 참조). 이들 지방산의 구조는 하기 표 2에 도시하였다.

표 1. 누에 기름을 이루고 있는 주요 지방산과 이들의 함량 비율

표 2. 누에 기름의 주요 지방산의 구조식

본 발명에 따른 고도로 정제된 리놀산과 리놀렌산 등으로 구성된 누에로부터 얻은 기름은 콜레스테롤 저하, 면역기능 강화, 피부보습, 항산화 효과, 주름제거 등의 효과가 있어 식품, 의약품 또는 화장품 원료로의 사용이 기대된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 아래와 같다.

실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발 명의 범위가 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 명확하다 하겠다.

실시예 1 : 누에번데기를 유기용매와 초음파로 추출하는 단계

건조된 누에번데기 1 킬로그람을 교반기로 파쇄하고 1 리터의 초산에틸을 첨가하여 40 ℃에서 1 시간 동안 누에성분을 추출한 후에, 10 분 동안 초음파(135 W, 42 KHz)로 다시 추출하였다. 20 ㎛ 여과지를 이용하여 여과액을 분취하였다. 이 과정을 3회 반복하여 내용물을 추출하였다.

실시예 2 : 누에번데기 기름을 분리 및 정제하는 단계

추출액과 추출액의 1/2 량의 10 % 수산화나트륨을 혼합한 후에 상온에서 30 분 동안 방치하여 층분리시킴으로써 수용성 불순물을 제거하는 공정을 2 회 반복하였고 남아있는 유기용매추출액에 1/2 량의 염화암모늄을 혼합하여 층 분리하는 공정을 다시 2 회 반복하였다. 유기용매 층분리로 얻어진 추출액과 추출액 1/2 량의 포화된 염화나트륨을 혼합하여 상온에서 방치시킴으로써 잔존하는 수용성 불순물을 완전히 제거하였고, 10 %(w/v) 황산마그네슘을 첨가하여 물 성분을 완전히 제거하였다. 위에서 얻은 유기용매 추출액을 10 ㎛의 공극을 가진 여과지로 다시 여과한 후에 40 ℃에서 감압 농축하여 유기용매를 제거하였다. 남은 기름에 5 배량의 50 % 이염화메탄를 첨가하여 혼합한 후에 10 ℃에서 2 시간 동안 방치시켜 이염화메탄 층을 분리하여 감압 농축하여 유기용매를 제거하였다. 분취되어진 누에번데기 기름 에 20 배량의 헥산을 첨가하여 녹인 후 5 %(w/v) 활성탄을 첨가하여 60 ℃에서 1 시간동안 혼합하면서 불순물을 흡착시켜 활성탄을 여과하여 없애고 감압 농축하여 유기용매를 완전히 제거함으로써 분리ㆍ정제된 누에번데기의 기름성분을 획득하였다.

실시예 3 : 누에번데기의 유기용매 추출 및 구조 분석

누에번데기(107 g, 냉동)을 분쇄기로 잘게 간 후에 에탄올(200 mL)를 넣고 교반기로 충분히 저어주었다. 거름장치를 이용하여 고체부분을 걸러서 여과액과 찌꺼기로 나누었다. 이 찌꺼기를 초산에틸 100 mL로 3 회 추출하여 합하였다. 이 용액을 진공 농축하여 다시 헥산(150 mL)에 녹인 후, 활성탄(20 g)을 넣고 1 시간 동안 가열하였다. 이 혼합물을 식힌 후 셀라이트(celite)을 이용하여 여과하였다. 여과액을 진공 농축하여 무색무취의 점성 액체 기름 3.4 g을 얻었다. 이 기름은 IR(도 1) 분광기, ¹H NMR(도 2) 및 ¹³C NMR(도 3) 분광기로 분석한 결과, 여러가지 불포화 및 포화지방산들의 글리세롤 에스터인것으로 판명하였다.

이하 본 발명의 도면을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

실시예 4 : 기름의 가수분해로 지방산 정제

위에서 얻은 지방(1 g)을 에탄올(50 mL)에 녹인후 수산화나트륨(300 mg)을 넣었다. 이 혼합물을 1 시간 동안 가열 환류하였다. 반응물을 식힌 후에 차가운 1 M 염산수용액을 넣어서 pH 2가 되게 만들었다. 여기에 물(50 mL)과 초산에틸(50 mL)를 넣고 잘 흔들어준 후에 방치하여 생긴 초산에틸 층을 포화 소금물로 씻어주고 무수 황산마그네슘을 넣고 잔여 수분을 제거하였다. 이 혼합물을 여과하여 나온 여과액을 농축하여 생성물 900 mg을 얻었다. 이 생성물을 실리카겔 크로마토그라피 (7 : 3 헥산/초산에틸)하여 지방산 혼합물 800 mg을 얻었다.

실시예 5 : 가수분해된 지방산의 메틸화 반응

위에서 얻은 지방산 혼합물 일부(190 mg)를 에테르(20 mL)에 녹인 후 다이아조메탄 발생 장치로부터 발생된 다이아조메탄 에테르 용액을 떨어뜨렸다. 이 혼합물을 7 시간 동안 교반하였다. 초산을 방울 방울 넣어서 여분의 다이아조메탄을 제거하였다. 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨로 씻고 다시 포화 소금물로 씻었다. 무수 황산마그네슘을 넣어서 흔들어준 후 여과하여 얻은 용액을 농축하여 약간의 백색 고체가 섞여있는 무색의 액체생성물(181 mg)을 얻었다. (다이아조메탄 발생 방법 : 5 g의 다이아잘드(diazald)를 40 mL의 에테르에 녹인 용액을 5 g의 수산화칼륨이 녹은 10 mL의 에탄올 용액에 온도를 60 도로 유지하면서 방울 방울 떨어뜨렸다. 이때 발생되는 다이아조메탄 에테르 용액을 증류장치를 이용하여 얻었다)

실험 1. 지방산 메틸 에스테르 혼합물의 고속액체크로마토그라피 순수 분리 및 구조 규명

지방산 혼합물의 정제는 다이나맥스(dynamax) C-18 컬럼(column)(22.5 i.d. ×250 mm)을 이용하여 고속액체크로마토그라피 하였다. 용출은 95 % 아세토니트릴을 40 분 동안 100 % 아세토니트릴이 되게 점진적으로 변화시켰으며, 유속은 7 mL/min으로 하였다. UV 208 nm에서 흡수를 보이는 4 개의 피크를 분취후 농축하였다. 얻은 물질의 무게는 28.0 mg(무색 액체, 물질 A), 5.2 mg(무색 액체, 물질 B), 44.0 mg(무색 액체, 물질 C), 32.0 mg(백색 고체, 물질 D)였다. 이들 물질을 적외 선(IR), 자외선(UV), ¹H 핵자기공명(NMR), ¹³C 핵자기공명(NMR) 분광기로 분석하여 각각 α-리놀렌산(α-linolenic acid ; ω-3 지방산), 리놀산(linoleic acid), 올레산 (oleic acid), 스테아린산(stearic acid)의 메틸 에스터로 규명되었다. 이들 물질의 물리화학적 자료는 다음과 같다.

본 발명에 따라 무공해 천연물인 누에번데기로부터 리놀렌산(오메가-3), 리놀산(오메가-6), 올레산(오메가-9)과 같은 불포화지방산을 다량으로 함유한 기름성분을 분리ㆍ분취하였다. 본 발명으로 고부가가치의 원료로 사용할 수 있도록 누에기름의 분리 정제 방법이 확립되었으며, 동시에 누에 기름을 구성하고 있는 주요 지방산 조성비율과 이들의 화학구조가 규명되었다. 누에의 약효능은 예전부터 문헌과 민간요법을 통하여 익히 알려져 있으며 최근에는 다양한 연구개발을 통하여 그 효능이 입증되고 있어 활용방안이 다양해지고 있다. 누에번데기 기름성분을 이용하여 피부 임상 시험을 한 결과 보습효능을 가지고 있으며 피부를 부드럽게 유지시켜 주었다. 혈당강하, 자양강정 등의 효능을 가진 누에번데기로부터 얻어지는 누에번데기 기름은 동맥경화 등의 심혈관계 질환의 억제 효능[참고문헌1-6], 피부노화 방지 등의 효능이 있는 것으로 알려진 오메가-3 다가불포화지방산인 리놀렌산을 다량으로 함유하고 있기 때문에 누에번데기 기름을 이용한 식품 또는 의약품 등의 원료로 사용이 가능하다.

참고문헌1) L. S. Rallidis, G. Paschos, M. L. Papaioannou, G. K. Liakos, D. B. Panagiotakos, G. Anastasiadis, A. Zampelas. The effect of diet enriched with -linolenic acid on soluble cellular adhesion molecules in dyslipidaemic patients. Atherosclerosis, 174 (2004), 127-132.

참고문헌2) L. S. Rallidis, G. Paschos, G. K. Liakos, A. H. Velissaridou, G. Anastasiadis, A. Zampelas. Dietary a-linolenic acid decreases C-reactive protein, serum amyloid A and interleukin-6 in dyslipidaemic patients. Atherosclerosis, 167 (2003), 237-242.

참고문헌3) Y. E. M. Dommels, G. M. Alink, P. J. van Bladeren, B. van Ommen. Dietary n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids and colorectal carcinogenesis : results from cultured colon cells, animal models and human studies. Environmental Toxicology and Pharmacology, 12 (2002), 233-244.

참고문헌4) Y. E. M. Dommels, G. M. Alink, P. J. van Bladeren, B. van Ommen. Dietary n-6 and n-3 polyunsaturated fatty acids and colorectal carcinogenesis : results from cultured colon cells, animal models and human studies. Environmental Toxicology and Pharmacology, 11 (2002), 297-308.

참고문헌5) A. Morise, C. Serougne, D. Gripois, M.-F. Blouquit, C. Lutton, D. Hermier. Effects of dietary alpha linolenic acid on cholesterol metabolism in male and female hamsters of the LPN strain. J. Nutritional Biochemistry, 15 (2004), 51-61.

참고문헌6) A. Leaf, Y.-F. Xiao, J. X. Kang, G. E. Billman. Prevention of sudden cardiac death by n3 polyunsaturated fatty acids, Pharmacology & Therapeutics, 98 (2003), 355-377.

Claims

누에번데기분말을 메틸에틸케톤, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 헥산, 석유에테르, 이염화메탄, 프로판올, 이소프로판올 또는 초산에틸 중에서 선택한 1종이상의 유기용매로 20 ~ 80 ℃에서 1 ~ 3 시간 동안 추출하고, 초음파로 재추출한 다음, 얻어진 추출액을 5 ~ 50 ㎛ 공극을 가진 여과지로 여과하고, 추출액에 수산화나트륨 등의 염을 첨가하여 수용성 불순물을 제거하고 남은 유기용매를 제거하는 누에 기름의 추출방법.
청구항 1에 따라 추출된 누에번데기 기름을 10 ~ 30 배량의 헥산에 녹인 후, 활성탄에 30 ~ 80 ℃에서 30 분 ~ 2 시간 동안 불순물을 흡착시킨 후, 5 ~ 50 ㎛의 공극을 가진 여과지로 여과하여 얻은 여과액을 감압 농축하여 용매를 제거하는 무색 무취의 누에번데기 기름의 정제 방법.
청구항 2에 따라 정제된 리놀렌산 25 ~ 35 %, 리놀산 3 ~ 7 %, 올레산 35 ~ 45 %, 스테아린산 20 ~ 30 %, 팔미토렌산, 팔미틴산 및 에이코산펜타에노인산(EPA)로 구성된, 약 7 : 3의 불포화지방산과 포화지방산의 비율로 이루어진 누에번데기 기름.
기능성 식품보조제 및 기능성 화장품 원료로서의 청구항 3의 조성을 갖는 누에번데기 기름의 용도.