KR20060015398A

KR20060015398A - 보리 추출물을 함유하는 알코올성 간세포 보호용ｃｙｐ2ｅ1 저해제 및 그 정제방법

Info

Publication number: KR20060015398A
Application number: KR1020040064127A
Authority: KR
Inventors: 조홍연; 홍범식; 신동훈; 김혜경; 이유현; 호진녕; 김은주; 김춘화
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2004-08-14
Filing date: 2004-08-14
Publication date: 2006-02-17

Abstract

본 발명은 보리 추출물을 유효성분으로 함유하는 알코올성 간손상의 유발과 밀접한 관련이 있는 cytochromeP450 2E1(CYP2E1) 저해제 및 그 정제방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 CYP2E1 저해제는 보리의 메탄올 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획한 후 Diaion HP20 크로마토그래피, Sephadex LH-20 크로마토그래피, Toyoperal HW-40 크로마토그래피 및 HPLC 등 일련의 과정을 거쳐 정제되었으며, 상기 추출물, 정제단계의 물질, 정제물 등은 CYP2E1의 활성을 저해하게 되고 이로 인해 간에서의 활성산소 생성이 감소함으로써 알코올성 간 질환 예방용 기능성식품이나 약물에 유용하게 사용될 수 있게 되는 것이다.

Description

보리 추출물을 함유하는 알코올성 간세포 보호용 ＣＹＰ2Ｅ1 저해제 및 그 정제방법 {cytochromeP450 2E1 inhibitor comprising barley extract and its purification method}

도 1은 본 발명의 일 실시예로서 보리로부터 메탄올 추출 및 추출물의 유기용매 분획 단계를 보인 과정도이다.

도 2는 도1의 각 단계 분획물의 CYP2E1 저해활성을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.

도 3은 본 발명의 일 실시예로서 Sephadex LH-20 컬럼을 사용하여 분리한 크로마토그램이다.

도 4는 본 발명의 일 실시예로서 Toyopearl HW-40 컬럼을 사용하여 분리한 크로마토그램이다.

도 5는 본 발명의 일 실시예로서 분획된 메탄올 추출물로부터 정제단계를 보인 과정도이다.

도 6은 도 5의 분리물질의 정제도를 보인 크로마토그램이다.

도 7은 정제단계물질의 저해활성을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.

도 8은 알코올 급여 동물실험에서 저해활성을 시험한 결과이다.

본 발명은 보리로부터 분리한 알코올성 간세포 보호용 CYP2E1 (cytochromeP450 2E1) 저해제 및 그 정제방법에 관한 것이다.

알코올은 그 독특한 약리작용으로 인해 습관성 및 의존성이 높으며, 종류나 음주 유형에 관계없이 섭취한 알코올의 양이 알코올성 간 질환의 가장 핵심적인 인자로 알려져 있다. 섭취한 알코올의 일부는 폐와 위장에서도 흡수되지만, 대부분은 소장에서 흡수되어 간에서 alcohol dehydrogenase(ADH), cytochromeP450 효소계, catalase 등에 의해 분해된다. 알코올로 인한 간손상은 알코올 산화에 따른 활성산소종의 발생으로 NADH:NAD 비율의 변화, 아세트알데히드 프로테인 어덕트의 형성, CYP2E1의 유도, 그에 따른 1-hydroxyethyl radical(HER)의 형성 등에 의해 일어나게 된다. 이들 손상을 야기하는 가장 중요한 위험요인은 알코올 섭취의 양과 기간으로 남자는 매일 40-80 mg 알코올을 10년에서 20년간 섭취하면 지방간을, 80-160 mg 섭취하면 간경화를 초래하며, 여성의 경우는 알코올성 간손상에 훨씬 민감하여 하루 20 mg 이상일 때 알코올성 간질환을 야기한다. 대부분의 알코올은 간에서 주로 alcohol dehydrogenase(ADH)와 aldehyde dehydrogenase(ALDH)에 의해 분해되지만 microsomal ethanol oxidizing system(MEOS)계에 의해 10% 정도알코올이 대사되며, 후자의 경우 알코올 산화에 있어 CYP2E1이 관여한다. (참조 : 대한내과학회, Harrison's principle of internal medicine, Vol. 2, 2643-2646, MIP, 2003, Cameron, R. G. et al. Toxicology in vitro, 12, 111-122, 1998)

CYP2E1(cytochromeP450 2E1)은 NADPH-cytochrome P-450 reductase와 함께 MEOS에서 알코올의 산화에 핵심적인 역할을 수행하고 있다. 급성 알코올 섭취시 ADH에 의해 산화되어 아세트알데하이드로 전환되는 반면 알코올 중독자 또는 만성 알코올 섭취자의 경우 CYP2E1이 관여하면서 아세트알데하이드의 생성과 동시에 HER을 비롯한 수종의 ROS를 생성한다. 특히 알코올의 만성섭취에 의해 inducible form으로 유도된 CYP2E1은 각종 radical을 과량생성함으로써 GSH에 의해 소거되지 않고 지질과산화를 비롯하여 활성산소에 의한 손상을 일으킨다. CYP2E1이 유도되는 정도와 malondialdehyde(MDA) 생성량 증가 및 ferritin으로부터 철의 유리량 증가에 의한 지질 과산화는 직접적인 관련을 갖고 있다. 또한 알코올에 의해 유도된 CYP2E1의 양은 drug 대사에도 영향을 미쳐 정상적인 microsomal detoxication 활성을 증가시킴으로써 과량의 약물투여를 유발하여 약물증독증상의 원인이 되기도 한다(참조 : Albert Y. Sun et al. Ethanol and Oxidative stress, Alcoholism;Clinical and Experimental Research, 25, No.5, 237S -243 S, 2001). 따라서 알코올성 간질환 중 지질의 과산화에 의한 간질환 및 활성산소에 의한 간손상을 예방하기 위한 phytochemicals의 소재화에 있어 이들의 직접적인 원인으로 작용하는 CYP2E1의 생합성과 활성을 억제하고 저해할 수 있는 물질의 검색이 필수적이다.

보리(Hordeum vulgare var. hexastichon)는 주요 재배작물의 하나로 마디가 높고 원줄기는 둥글며 속이 비어 있으며 마디 사이가 길다. 잎자루는 잎집으로 되어 원줄기를 완전히 둘러싸고 녹색으로 털이 없다. 이삭은 줄기 끝에 달리고, 한 이삭에는 15~20개의 마디가 있으며 씨알의 배열이 6줄로 된 여섯줄보리와 세 개의 영화 중 가운데 영화만 여물고 2개의 영화는 퇴화되어, 씨알이 2줄로 배열되는 두줄보리로 나뉜다. 보리의 영화에는 외영과 내영이 있고, 외영의 끝에는 까락[芒]이 달려 있어 보리의 종류나 품종에 따라 이 까락의 길이가 달라진다. 보리는 숙취에 좋다고 알려져 있으며, 숙취의 예방과 치료에는 갈색심이 있는 시커먼 보리를 선택하여 완전한 보리밥이나 보리가 아주 많이 섞인 밥을 항시 지어 먹으면 좋다고 했다(참조 : 신재용 저, 동의 민간요법, 116-117). 보리는 폴리페놀성 물질이 함유되어 있고, 이들 화합물은 보리의 내부 배유조직보다 껍질을 포함하는 외층부 및 배아부위에 더 많이 함유되어 있으며, 보리 추출물 중에는 높은 항산화성 및 활성산소 소거능을 가지고 있는 것으로 보고되었다(참조 : 석호문 등, 한국 식품과학회지, 34, 5, 889, 892, 2002). 또한 보리는 콜레스테롤 억제, 당뇨, 심장병 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, CYP2E1 저해효과는 아직 보고된 바가 없다.

본 발명자들은 식용생물자원으로부터 생리활성을 갖는 미량소재에 관하여 연구하던 중 보리의 메탄올 추출물에서 CYP2E1을 저해하는 물질이 함유되어 있음을 1차적으로 확인한 다음, 추출물로부터 CYP2E1 저해능을 갖는 물질을 분리, 정제함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 상기와 같이 알코올 섭취에 의한 간손상 예방·개선용 소재를 개발함에 있어 간의 보리로부터 분리된 CYP2E1 저해활성물질을 제공함을 목적으로 한다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 보리로부터 CYP2E1 저해활성물질을 분리하는 방법을 제공함에 있다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 CYP2E1 저해활성물질을 함유하는 알코올성 간 질환 예방, 치료용 기능성 식품이나 약학적 조성물을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보리(Hordeum vulgare var. hexastichon)추출물을 유효성분으로 함유하는 간 CYP2E1 (cytochromeP450 2E1) 저해제를 제공한다.

본 발명에 있어서, 보리 추출물은 물, 친수성유기용매 또는 이들의 혼합용매로도 추출될 수 있으나, 바람직하게는 보리의 메탄올 추출물인 것을 특징으로 한다. 여기서, 메탄올은 50%~100%로 물에 희석하여 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 100% 메탄올로 추출하는 것이 활성성분의 용출에 유리하다.

본 발명에 있어서, 보리 추출물은 보리를 메탄올로 추출한 후 각종 유기용매로 분획할 수 있는데, 바람직하게는 보리를 분쇄한 후 실온에서 메탄올로 추출하고 그 농축물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획하고 남은 것을 메탄올에 녹여 각각을 여과포로 여과하고 잔사를 감압 농축한 것을 특징으로 한다. 여기서, 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트는 순차적으로 일부 또는 전체 분획할 수 있다.

본 발명에 있어서, 보리 추출물은 각종 유기용매로 분획한 후 각종 크로마토그래피로 정제될 수 있는데, 바람직하게는 보리의 메탄올 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획한 후, 이온교환(ion exchange) 크로마토그래피, 겔여과(gel filtration) 크로마토그래피, 친화성(affinity) 크로마토그래피 및 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)의 일련의 과정을 거쳐 정제된 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명은 크로마토그래피를 위해, Diaion HP20 크로마토그래피, Sephadex LH-20 크로마토그래피, Toyoperal HW-40 크로마토그래피 및 HPLC(u-Bondapak C₁₈)를 사용하였다. 여기서, 크로마토그래피는 순차적으로 일부 또는 전체 정제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 간 CYP2E1 저해제는 알코올성 간 질환 예방 및 치료에 사용되는 것을 특징으로 한다. 알코올성 간 손상이 CYP2E1에 의해 발생하는 활성산소종으로부터 기인한다는 것은 당업계에 잘 알려져 있으므로(Cameron, R. G. et al. Toxicology in vitro, 12, 111-122, 1998; Albert Y. Sun et al. Ethanol and Oxidative stress, Alcoholism;Clinical and Experimental Research, 25, No.5, 237S -243 S, 2001), 본 발명은 CYP2E1의 활성을 저해시킴으로써 활성산소의 발생을 억제한다는 관점에서 기존의 알코올성 간질환 약제보다 유용성이 높을 것이다. 또한, 본 발명은 식용식물인 보리로부터 분리한 천연물질로 기존의 유기합성약제에 비해 부작용이 없고, 안전성이 매우 높다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 보리의 메탄올 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올로 분획하는 단계와; 상기 단계에서 획득한 메탄올 분획물을 Diaion HP20 컬럼에 주입한 다음 50% 메탄올로 용출분획하여 수득하는 단계와; 상기 수득공정에서의 활성분획물을 Sephadex LH-20 컬럼에 주입 한 다음 메탄올 50~100% gradient로 분획하는 단계와; 상기 수득공정에서의 활성분획물을 Toyopearl HW-40 컬럼에 주입한 다음 100% 메탄올로 분획하는 단계와; 상기의 활성 분획을 C₁₈ Symmetry column이 부착된 HPLC를 사용하여 0.05% TFA와 40% Acetonitrile로써 CYP2E1 활성억제제를 분리하는 보리로부터 분리한 CYP2E1 저해제의 정제방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 간 CYP2E1 저해제를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간 질환 예방 및 치료용 기능성식품을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 간 CYP2E1 저해제를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

이하 상기와 같이 구성된 본 발명의 보리로부터 분리한 간의 CYP2E1 저해제 및 그 정제방법의 기술적 사항을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 있어서, 보리 추출물에는, 추출, 분획 및 정제 처리의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그 희석액 또는 농축액, 또는 그 건조물 중 어느 하나도 포함하는 것으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 추출용매로서 사용할 수 있는 친수성유기용매로는, 예컨대, 메탄올, 에탄올, 프로필알콜, 이소프로필알콜 등의 탄소수1~5의 저급알콜;아세톤, 메틸에틸케톤 등의 저급지방족케톤; 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 탄소수 2~5의 다가알콜 등을 들 수 있고, 이들 친수성 유기용매와 물과의 혼합용액 등을 이용할 수 있다.

구체적으로는, 본 발명자들은 식용생물자원에서 추출한 추출물 중에서 보리의 메탄올 추출물이 비교적 높은 CYP2E1 저해활성을 가지고 있음을 발견하였다. 이에 보리에 포함된 CYP2E1 저해물질을 분리하고자 실온에서 100% 메탄올로 추출한 후 이 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획을 실시한 다음, CYP2E1 저해활성이 높았던 메탄올 분획물을 이온교환수지인 Diaion HP20으로 크로마토그래피하였다. CYP2E1 저해활성이 높은 분획을 모아 Sephadex LH-20으로 크로마토그래피를 실시한 후, Toyopearl HW-40으로 겔여과한 다음 높은 활성의 분획을 HPLC를 실시하여 정제분획을 얻었다.

본 발명의 원료인 보리 추출물은 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 과립, 정제, 캡슐 또는 드링크제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 또한, 보존이나 취급을 용이하게 하기 위하여 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 통상 제제화에 사용되는 캐리어, 그 밖의 임의의 조제를 부가하여도 좋다. 또한, 식품 또는 약물에 통상적으로 첨가되는 보조적인 원료 또는 첨가물로는 특히 제한되지 않으나, 예컨대, 포도당, 과당, 자당, 말토오스, 솔비톨, 스테비오사이드, 롭소사이드, 콘시럽, 유당, 구연산, 주석산, 사과산, 호박산, 유산, L-아스코르빈산, d1-α-토코페롤, 엘리솔빈산 나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 글리세린지방산 에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 자당지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, 아라비아껌, 칼라기난, 카제인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B류, 니코틴산 아미드, 팬트텐산 칼슘, 아미노산류, 칼슘염류, 색소, 향료, 보존제 등을 들 수 있다.

본 발명의 보리 추출물은, 이를 그대로 음식물중에 첨가하여 알코올성 간 질환 예방 및 치료용의 음식물로 할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 음식물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에, 높은 간 기능 개선 효과를 기대할 수 있어, 매우 유용하다.

이와 같은 음식물에 있어서의 보리 추출물의 첨가량은, 대상인 음식물의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 음식물 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상음식물에 대하여 통상 0.01~50질량%, 바람직하기로는 0.1~20질량%의 범위이다. 또한, 과립, 정제 또는 캡슐형태의 음식물의 경우에는 통상 0.1~100질량%, 바람직하기로는 5~100질량%의 범위에서 첨가하면 된다.

또한, 본 발명의 간 CYP2E1 저해제의 유효성분인 보리 추출물은, 성인 하루당 섭취량이 1~3000mg이 되도록 투여하는 것이 적당하다. 또한, 투여량은 연령, 증상 등에 따라 적당히 증감하는 것이 가능하다.

이하, 상기와 같이 구성된 본 발명에 대해 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서는 자명할 것이다.

실시예 1 : 보리로부터 간의 CYP2E1 저해활성물질 분리를 위한 추출조건 확립과 저해능 확인

식용생물자원으로부터 냉수, 열수, 메탄올로 추출한 추출물을 대상으로 CYP2E1 저해활성을 검색하던 중 보리의 메탄올 추출물이 CYP2E1 저해능을 나타내는 것을 확인하였다. 이에 보리에 포함된 CYP2E1 저해활성물질을 분리하고자 보리를 100℃에서 5분간 blanching하여 생세포내 효소를 불활성화시키고 handmixer로 곱게 분쇄한 후, 실온에서 시료의 다섯배의 100% 메탄올(v/v)로 24시간 동안 정치하여 추출하고, 그 추출물을 감압 농축하여 건조시켰다(C-M). 상기의 건조물을 다시 증류수 1 리터에 녹여 같은 양의 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 각각 분획깔대기에 넣어 분획(M-H, M-C, M-E)하고 남은 것을 메탄올에 녹여 여과포로 여과하고 잔사를 감압 농축한 후 건조하여 추출물을 얻었다(M-M). 도 1은 본 발명의 일 실시예로서 보리로부터 메탄올 추출 및 추출물의 유기용매 분획 단계를 보인 과정도이다.

각 분획물에 대한 CYP2E1 저해활성을 측정하기 위해, 기질인 p-nitrophenol을 이용한 assay계에 따라(참조: Phillips et al. cytochromeP450 protocol, 147-161, Human press Inc. 1998) Clontech으로부터 구입한 human liver cDNA에서 증폭시킨 CYP2E1, cytochromeP450 reductase 및 cytochrome b₅각 유전자를 함유한 vector(pACYC184:ATCC-37033)를 transduction한 E. coli DH5α의 membrane fraction을 조제한 후 CYP2E1의 기질인 p-nitrophenol을 사용하여 CYP2E1의 활성을 측정하였다. 조제된 membrane의 P450 함량은 P450 spectrum으로부터 계산하여, 50 pmol씩 실험에 사용하였다. 효소반응계를 0.1 M phosphate buffer (pH 7.6), 50 pmol membrane fraction, 1 mM p-nitrophenol로 최종 volume이 500 ㎕이 되도록 첨 가한 후, 37ㅀC 수조에서 5분간 반응시킨 다음 NGS mixture (20 mM NADP+, 20 mM glucose-6-phosphate, 66 mM MgCl_2,glucose-6-phosphate dehydrogenase 4 U/ml)를 순차적으로 첨가하여 동일 조건에서 40분간 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 20% trichloroacetic acid를 각 반응액에 100 ㎕씩 첨가하고, 5,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 상등액 500 ㎕를 취하여, 2 M NaOH 250 ㎕와 반응시켜 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. CYP2E1의 활성은 product 생성량, 반응시간과 반응에 사용된 P450의 양(nmol/min/P450(pmol))으로 표현되었으며, 시료에 의한 CYP2E1 저해활성은 아래 식에 따라 환산하였다.

Inhibitory effect (%) = [1 - (As / Ac)] ×100

As : 시료를 처리한 실험구의 CYP2E1 활성

Ac : 시료를 처리하지 않은 실험구의 CYP2E1 활성

상기와 같이 분획에 따른 CYP2E1 저해활성을 측정한 결과, 처음 메탄올 추출물(C-M)에서도 상당한 활성을 나타내나, 최종 메탄올 분획(M-M)에서 가장 높은 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 도 2는 도1의 각 단계 분획물의 CYP2E1 저해활성을 시험한 결과를 나타낸 도표이다.

실시예 2 : 크로마토그래피를 이용한 CYP2E1 저해활성물질의 정제

도 1과 같이 조제한 메탄올 분획물로부터 다음과 같은 크로마토그래피에 의해 CYP2E1 저해활성물질을 정제하였다. 먼저 5% NaOH와 HCl로 수세하고 물로 중화시킨 Diaion HP20 컬럼에 시료인 메탄올 분획을 loading하고 물, 50% 메탄올, 100% 메탄올, 100% 아세톤 순으로 3 bed volume 씩 전개하여 CYP2E1 저해활성을 측정한 결과 50% 메탄올 용출분획(HII)에서 높은 CYP2E1 저해활성을 확인하고, 이 분획물을 Sephadex LH-20 컬럼을 사용하여 50%부터 100%까지 메탄올 농도구배로 5 bed volume 전개하였다. 그 결과 크로마토그램을 도 3에 도시하였다. CYP2E1 저해활성이 높은 용출분획(fraction I: HVI)을 Toyopearl HW-40 컬럼에 100% 메탄올을 사용하여 분획을 분리하고, 그 결과 크로마토그램을 도 4에 도시하였다. 이중 활성이 높은 용출분획(fraction γ: HVIγ)을 모아 HPLC (u-Bondapak C₁₈ (4.5 ×150 mm)를 사용하여 0.05% TFA와 acetonitrile (0.05% TFA-H₂O : acetonitrile = 100 : 0 ~ 60 : 40)의 용매조건과 1 ml/min의 유속으로 용출시키고, 활성분획(HVIγ-1)만을 농축한 후 활성분획을 동일한 조건에서 HPLC를 실시한 결과 좌우 대칭의 단일 peak를 얻음으로써 비교적 정제도 높게 물질을 정제할 수 있었다. 도 5은 본 발명의 일 실시예로서 분획된 메탄올 추출물로부터 정제단계를 보인 과정도이고, 도 6는 도 5의 분리물질의 정제도를 보인 크로마토그램이다.

실시예 3: 보리로부터 분리한 정제단계별 물질의 CYP2E1 저해활성

실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 보리로부터 분리한 정제단계별 CYP2E1 저해활성을 측정하였다. 도 7는 정제단계물질의 저해활성을 시험한 결과를 나타낸 도표이다. 정제단계가 진행될수록 더 많은 저해활성을 나타내었으며, 최종 HPLC 정제물(HVIγ-1)은 0.1 mg/ml의 농도에서 74 %에 이르는 저해활성을 보였다.

실시예 4: 보리 추출물의 제제화 (정제)

하기의 배합의 정제를 통상의 타정기에 의해 제조하였다.

실시예 1의 보리추출물의 분말 20질량부

덱스트린 72질량부

분당(粉糖) 80질량부

글리세린지방산에스테르 8질량부

원료의 혼합과 타정은 용이하고, 정미가 양호한 정제가 얻어졌다.

실시예 5: 보리 추출물의 제제화 (갭슐제)

통상의 방법에 의해, 이하의 조성을 갖는 캡슐제를 제조하였다. 또한, 캡슐에는 1호 하드젤라틴캡슐을 사용하였다.

<1캡슐(1정 200mg)중의 조성>

실시예 1의 보리추출물의 분말 5mg

콘스타치 60.0mg

유당 100.0mg

유산칼슘 10.0mg

하이드록시프로필셀룰로오스(HPC-L) 10.0mg

실시예 6: 보리 추출물의 제제화 (과립)

통상의 방법에 의해, 하기의 배합의 인스턴트티 과립을 유동층조립기에 의해 제조하였다.

실시예 1의 보리추출물의 분말 20질량부

올리고당 40질량부

구연산 50질량부

설탕 50질량부

덱스트린 810질량부

원료의 혼합과 유동층조립기에 의한 과립화는 용이하며, 정미가 양호한 인스턴트티과립이 얻어졌다.

실시예 7 : 보리의 메탄올추출물 투여 쥐로부터 얻은 간의 CYP2E1 저해효과

실시예 1의 in vitro assay계에서 높은 CYP2E1 저해활성을 보인 보리의 in vivo 저해활성을 검토하기 위해 보리 메탄올추출물(C-M)을 쥐에게 0.15%와 0.3%의 농도로 4주간 액체식이로 공급하였고, 알코올은 전체 식이 열량의 30%에 이르도록 서서히 상승시켰다. 4주 후 희생시킨 다음 간을 적출하여 다섯 배의 potassium phosphate buffer(pH7.4, w/v)를 넣고 Teflon glass homogenizer(Glas-Col)로 균질화한 후, 10,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 취하고 다시 35,000 rpm에서 초원심분리하여 microsome을 분리하여 CYP2E1 저해활성측정에 사용하였다. CYP2E1 활성은 p-nitrophenol(PNP) hydroxylation에 의해 형성된 4-nitrocatechol을 측정하는 방법으로, 효소반응은 50 pmol CYP2E1, 5 mM PNP가 함유되어 있는 100 mM potassium phosphate 완충용액(pH 7.4)에 NADPH generating system(1 mM glucose 6-phosphate, 0.5 mM NADP⁺ 및 1 U glucose-6-phosphatedehydogenase)의 첨가에 의하여 개시되며 100 ㎕ trichloroacetic acid(TCA, 20% v/v)에 의하여 중지시켰다. 5분간 10,000 ×g에서 원심분리 후, 0.5 ml의 상등액을 얻고 2 N NaOH 0.25 ml을 가하여 혼합한 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 보리 메탄올추출물은 0.15%, 0.3%의 투여농도에서 정상 대조군과 유사한 CYP2E1 억제활성을 나타냄으로써 알코올에 의한 CYP2E1 억제를 위한 기능성 신소재로 실용화될 가능성을 시사하였다(도 8).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명 보리로부터 분리한 간 CYP2E1의 저해 제 및 그 정제방법은 보리를 blanching하고 분쇄한 후, 메탄올로 추출한 다음 그 잔사를 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획하여 Diaion HP20 크로마토그래피, Sephadex LH-20 크로마토그래피, Toyopearl HW-40 크로마토그래피, HPLC 등 일련의 정제공정을 수행함으로써 얻어졌으며, 알코올성 간손상 예방 및 치료용 기능성식품이나 약물에 사용될 수 있는 효과가 있게 되는 것이다.

Claims

보리(Hordeum vulgare var. hexastichon) 추출물을 유효성분으로 함유하는 간 CYP2E1 (cytochromeP450 2E1) 저해제.
제 1항에 있어서, 보리 추출물은 보리의 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 간 CYP2E1 저해제.
제 1항에 있어서, 보리 추출물은 보리를 분쇄한 후 실온에서 메탄올로 추출 하고 그 농축물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획하고 남은 것을 메탄올에 녹여 각각을 여과포로 여과하고 잔사를 감압 농축한 것을 특징으로 하는 간 CYP2E1 저해제.
제 1항에 있어서, 보리 추출물은 보리의 메탄올 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트 순으로 분획한 후, 이온교환(ion exchange) 크로마토그래피, 겔여과(gel filtration) 크로마토그래피, 친화성(affinity) 크로마토그래피 및 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)의 일련의 과정을 거쳐 정제된 것을 특징으로 하는 간 CYP2E1 저해제.
제 1항에 있어서, 알코올성 간 질환 예방 및 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 간 CYP2E1 저해제.
보리의 메탄올 추출물을 핵산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메탄올로 분획하는 단계와; 상기 단계에서 획득한 메탄올 분획물을 Diaion HP20 컬럼에 주입한 다음 50% 메탄올로 용출분획하여 수득하는 단계와; 상기 수득공정에서의 활성분획물을 Sephadex LH-20 컬럼에 주입한 다음 메탄올 50~100% gradient로 분획하는 단계와; 상기 수득공정에서의 활성분획물을 Toyopearl HW-40 컬럼에 주입한 다음 100% 메탄올로 분획하는 단계와; 상기의 활성 분획을 C₁₈ Symmetry column이 부착된 HPLC를 사용하여 0.05% TFA와 40% Acetonitrile로써 CYP2E1 활성억제제를 분리하는 보리로부터 분리한 CYP2E1 저해제의 정제방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 간 CYP2E1 저해제를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간 질환 예방 및 치료용 기능성식품.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 간 CYP2E1 저해제를 유효성분으로 함유하는 알코올성 간 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.