KR20060002827A - 질병에 관계되는 유전자의 특이적인 동시 억제를 위한화합물 및 이의 용도 및 관련 약물 - Google Patents

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알렉산드르 부토린
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크리스티앙 베일리
끌로드 헬레네
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상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄 (쎄엔알에스)
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Abstract

본 발명은 안정화된 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단에 의해 억제되는 유전자의 발현에 의해 발생하는 질병 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 하기 식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.
식 I
A-B-C
(상기 식에서,
A는 소정의 병리 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 DNA 서열 특이적 리간드이고;
B는 A의 3' 말단에 결합되는 링커 암이며;
C는 토포이소머라제 I 독임)
본 발명은 특히 감염성 미생물 또는 바이러스, 대사 이상 질병 및 자가면역 질병의 치료를 위한 용도에 관한 것이다.

Description

질병에 관계되는 유전자의 특이적인 동시 억제를 위한 화합물 및 이의 용도 및 관련 약물{COMPOUNDS AND THEIR USE FOR SPECIFIC AND SIMULTANEOUS INHIBITION OF GENES INVOLVED IN DISEASES AND RELATED DRUGS}
본 발명은 여러 유전자에 비가역적 손상을 유도하여 병리에 관계된 상기 유전자의 발현을 동시에 억제할 수 있는 생성물, 이의 제조 방법, 이의 사용 방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 선택된 서열을 선택적으로 표적으로 삼고, 소정의 병리에 관련된 여러 유전자가 공유하는 공통적인 서열을 동시에 억제하는 방법 및 생성물에 관한 것이다.
삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드(TFO)는 특정 유전자의 발현에 특이적으로 개입할 목적으로, [Biophysics Laboratory of the Museum National d'Histoire Naturelle USM 0503 Unit INSERM UR565, CNRS UMR 5153]에서 개발하였다. 상기 TFO는 다른 용도, 예를 들어, 플라스미드 정제 또는 표적 서열의 화학적 변형을 위해 사용되어 왔다. 1997년 시험관내 연구에서, 캄토테신의 유도체, 토포이소머라제 I 억제제, 또는 더 정확하게 독을 삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드에 대해 화학적으로 커플링하면 삼중 나선 올리고뉴클레오티드에 의해 표적이 된 올리고피리미딘-올리고퓨린 서열에 대해 특이적으로 토포이소머라제 I에 의한 DNA 절단이 유도된다 는 것이 밝혀졌다(Matteucci et al. J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) pp 6939-6940).
본 발명자들의 문헌, 특히 공보(Arimondo et al. 1999, 2000, 2001a,b, 2002)에 이미 기재된 바와 같이, 특이적 DNA 리간드에 커플링된 토포이소머라제 I 억제제는 DNA 리간드의 결합 부위에 대해 특이적이 된다. 본 발명에서, DNA 리간드에 공유 결합된 생성물 토포이소머라제 I 독은 하기에서 접합체로도 불린다. 이러한 접근법으로, 종양 상태에 관계된 단일 유전자의 선택적인 조절에 기초하는 작용을 기작으로 한 항종양 물질을 개발할 수 있다(도 1).
2개의 캄토테신(줄여서 CPT) 유도체와 같은 특정 토포이소머라제 I 억제제는 임상 실습에 사용되지만, 잠재적으로 이의 낮은 서열 특이성과 관련된 상당한 독성 수준을 가진다.
항종양 약물의 선택에 대한 문제는 다른 형태의 화학치료 약물(예, 항생제)에도 존재한다.
약물의 표적은 현대 치료에서 일반적인 문제로 볼 수 있고, 또한 대사 이상 질병(dismetabolic disease) 및 자가면역 질병을 포함한다.
링커 암(linker arm)에 의해 연결된 토포이소머라제 I 독 및 DNA 서열 특이적 리간드를 포함하는 특이적 접합체는 소정의 유전자 상에 토포이소머라제 I 독의 작용을 특이적으로 유도할 수 있고, 이의 발현은 질병, 특히 종양 또는 감염성 질병과 관련되는 것으로 현재 밝혀져 있다.
종래 기술과 관련된 문제점 및 결점은 본 발명에 따라 극복되며, 주요 과제는 하기에 나타나 있다.
우선 본 발명은 안정화된 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단에 의해 억제되는 유전자의 발현에 의해 발생하는 질병 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 하기 식 I의 화합물의 용도에 관한 것이다.
식 I
A-B-C
(상기 식에서,
A는 소정의 병리 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 DNA 서열 특이적 리간드이고;
B는 A의 3' 말단에 결합되는 링커 암이며;
C는 토포이소머라제 I 독임)
본 발명의 개발 과정에서, 본 발명자들은 본 발명의 구체적인 목적인 식 I [A-B-C]의 신규한 화합물을 또한 발견하였다.
본 발명은 또한 상기 화합물의 제조 방법, 이를 포함하는 조성물 및 새로운 약물의 개발 및 약리학적 테스트에서의 상기 화합물의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가 목적은, 소정의 병리 단백질, 특히 종양의 발달 및 유지에 관련된 단백질, 또는 바이러스성 및 병원성 단백질, 또는 대사 이상 또는 자가면역 질병에 관련된 단백질을 코딩하는 몇몇 표적 유전자의 발현을 동시에 억제하기 위한 방법으로서,
(i) 상기 표적 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 적어도 하나의 DNA 서열 특이적 리간드에 대해 적어도 하나의 토포이소머라제 억제제를 접합시켜, 적어도 하나의 토포이소머라제 I 억제제의 작용을 상기 유전자에 특이적인 부위 쪽으로 유도하는 단계,
(ii) 상기 접합체의 상기 리간드에 의해 게놈 내 상기 유전자를 인지하여 상기 표적에 대한 상기 리간드의 결합을 형성하는 단계,
(iii) 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단을 유도하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 단계
를 포함한다.
본 발명에 따라서, 이 방법은 특히 시험관내 및 생체내에서 수행할 수 있다.
상기 단계를 이용하여, 토포이소머라제 I 억제제(들)의 효과를 DNA 특이적 부위로 유도하여, 상기 부위에서 토포이소머라제 I에 의한 절단을 선택적으로 유도할 수 있다. DNA 특이적 리간드에 커플링된 억제제(들)는 그 자체로 DNA 리간드 고정 부위에 특이적이 된다. 유리하게, 표적화된 DNA 서열은 병리의 종류에 따라 선택될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 상기 유전자는 이의 발현이 세포 종양 상태의 발달 및 유지를 조절하는 유전자 중에서 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 유전자는 IGF-1, IGF-1R, VEGF, BCL2로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 상기 유전자는 감염성 미생물 또는 바이러스의 유전자 중에서 선택된다. 특히 바람직한 구체예에서, 유전자는 HIV 또는 HCV 바이러스로 구성되는 군에서 선택된 병원체의 유전자이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 상기 유전자는 대사 이상 질병과 관련된 유전자 중에서 선택된다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따라, 상기 유전자는 자가면역 질병과 관련된 유전자 중에서 선택된다.
본 발명에 따라, 토포이소머라제 I 억제제, 또는 더 구체적으로 독은, 토포이소머라제 I의 촉매 작용으로 매개되는 DNA/토포 I 절단 복합체를 안정화시키는 분자이다. 독은 유리하게 인돌로카르바졸 및 이의 유도체와 같은 삽입성 물질(intercalating agent), 캄토테신 및 이의 유도체와 같은 비-삽입성 물질, 벤즈이미다졸 및 이의 유도체와 같은 소홈(minor groove) 리간드로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 독은 캄토테신, 더 바람직하게는 캄토테신 유도체이다.
바람직한 캄토테신 유도체는 하기 화학식 1의 화합물, N1-산화물, 라세미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물 및 약학적 허용 염이다.
Figure 112005051973688-PCT00001
(상기 식에서,
R1은 -C(R5)=N-(0)n-R4 기이고, 이 때 n은 숫자 0 또는 1이고, R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C2-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기이며, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로-알킬 기는 할로겐, 히드록시, 케토, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR6R7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임), 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, 페닐임) 기로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있거나; 또는 R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬임)로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는 (C6-C10)아로일 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는 R4는 폴리아미노알킬 잔기, 특히 -(CH2)m-NR12-(CH2)p-NR13-(CH2)q-NH2(여기서, m 및 p는 정수 2∼6이고, q는 정수 0∼6이고, 양극단을 포함하고, R12 및 R13은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬기(예, N-(4-아미노부틸)-2-아미노에틸, N-(3-아미노프로필)-4-아미노부틸, N-[N-(3-아미노프로필)-N-(4-아미노부틸)]-3-아미노프로필임)이거나; 또는 R4는 글리코실 잔기(예, 6-D-갈락토실 또는 6-D-글루코실)이고; R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고; 동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시임)
화학식 1의 화합물의 바람직한 예는, n은 1이고, R4는 2-아미노에틸 또는 3-아미노프로필이고, R2 및 R3는 수소인 화합물이다(이들 화합물은 또한 본원에서 각각 ST1578 및 ST2541로 명명함).
상기 화합물은 WO 00/53607에 충분히 개시되어 있으며, 숙련된 독자는 이를 참조로 한다.
다른 바람직한 캄토테신 유도체는 하기 화학식 2의 화합물, N1-산화물, 라세미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물 및 약학적 허용 염이다.
Figure 112005051973688-PCT00002
(상기 식에서,
A는 포화 또는 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C10 시클로알킬-C1-C8 알킬이고;
n과 m이 1일 경우, Y는 NR12R13 또는 N+R12R13R14(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R12, R13 및 R14는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬임)로 치환된 포화 또는 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬이거나, 또는 Y는 BCOOX(여기서, B는 아미노산의 잔기이고, X는 이용가능한 위치에서 C1-C4 알콕시, 할로겐, 니트로, 아미노, C1-C4 알킬 중에서 선택된 적어도 하나의 기로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬, 벤질 또는 페닐, H임)이거나, 또는
n과 m이 모두 0일 경우, Y는 약학적 허용 산의 음이온을 가진 분자내 염(inner salt)의 형태 및 염의 형태의 4-트리메틸암모늄-3-히드록시부타노일이거나, 또는 Y는 상기 정의된 바와 같은 N+R12R13R14이고;
R1은 수소 또는 -C(R5)=N-(0)p-R4(여기서 p는 숫자 0 또는 1임) 기이고, R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C2-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기이며, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황의 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로알킬 기는 선택적으로 할로겐, 히드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR6N7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임), 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬임) 기 중에서 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있거나; 또는 R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬임) 중에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C6-C10)아릴 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는 R4는 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는 R4는 글리코실 잔기이고; R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고; 동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시임)
화학식 2의 화합물 중 바람직한 예는 p가 1이고, R4는 tert-부틸인 화합물로, 숙시닐-발릴-20-O-(7-테르부톡시이미노메틸캄토테신)(본원에서 ST2677로 명명함)이 특히 바람직한 화합물이다.
이들 화합물은 WO 03/101996에 충분히 기재되어 있으며, 숙련된 독자는 이를 참조로 한다.
다른 바람직한 캄토테신 유도체는 하기 화학식 3 또는 4의 화합물, N1-산화물, 라세미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물 및 이의 약학적 허용 염이다.
화학식 3 화학식 4
Figure 112005051973688-PCT00003
(상기 식에서,
R1은 수소 또는 -C(R5)=N-(0)p-R4(여기서, p는 정수 0 또는 1임) 기이고, R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C2-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C5)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기이며, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로-알킬 기는 할로겐, 히드록시, C1-C8 알킬, C1-C9 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로 및 -NR6R7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임); 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이 할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬임) 기로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있거나; 또는
R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C9 알킬임) 중에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C6-C10)아릴 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는
R4는 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는
R4는 글리코실 잔기이고;
R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고;
동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시이고;
n은 1 또는 2이며,
Z는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬 중에서 선택됨)
이들 화합물은 WO 03/101995에 충분히 기재되어 있으며, 숙련된 독자는 이를 참조로 한다.
다른 바람직한 캄토테신은 문헌 [Arimondo P. B. et al., Nucleic Acid Research, 2003, Vol. 31, No. 14; 4031-4040]에 개시된 것으로, 특히 7-에틸-10-히드록시캄토테신이다. 또한 다른 바람직한 화합물은 10-히드록시캄토테신이다.
리간드는 리보핵산, 데옥시리보핵산, PNA, 펩티드 핵산, 2'O-알킬 리보핵산, 올리고포스포라미데이트, LNA(리보스 배위를 위해 차단된 RNA(Petersen 및 Wengel 2003))로 구성되는 군에서 선택되고, 삼중 나선에 결합 시 TFO로, 소홈에 결합 시 MGB로 불린다. 후자는 β-알라닌과 N-메틸피롤, N-메틸이미다졸 및 N-메틸-3-히드록시피롤의 폴리아미드 중에서 선택된다.
본 발명의 목적은 또한 하기 식 1의 화합물이다.
식 1
A-B-C
(상기 식에서,
A는 소정의 병리 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 DNA 서열 특이적 리간드이고;
B는 A의 3' 말단에 결합되는 링커 암이며;
C는 상기 화학식 1∼4의 캄토테신 유도체임)
본 발명의 일반적인 교시에서, 상기 기재된 화합물의 성분 A 및 C는 독 분자의 상이한 위치를 통해 링커 암으로 연결될 수 있는데, 상기 위치는 리간드에 결합되는 적절한 작용기를 가진다.
캄토테신 유도체를 사용하는 본 발명의 바람직한 구체예에서, 리간드 A는 바람직하게 7, 10 또는 20번 위치에서 캄토테신 분자에 결합할 수 있다.
적절한 링커 암은 길이가 1∼50, 바람직하게는 2∼30인, N 또는 O를 포함하는 군에서 선택된 헤테로원자 및 탄소 원자; 및 반응하여 포스포라미드 또는 아미드 결합, 또는 티오에스테르를 형성할 수 있는 말단 끝 부분(end terminal moieties)을 포함한다.
상기 링커 암의 예는 -HN-(CH2)n-NH-(n은 정수 1∼12)와 같은 디아미노 알킬; -NH-(CH2)n-CO-, 글리콜(-O(CH2)mO)n-(n은 정수 2∼6이고, m은 2∼3임)이다.
상기 구체예에 따른 접합체의 예는 TFO-L3-SCPT, 및 (3+3)-CPT, (4+4)-CPT, TFO-18-L6-10CPT, TFO-18-L4-10CPT, TFO-16-L6-10CPT, 및 TF016-L4-10CPT, TF016-L6-7CPT, TF018-L6-7CPT, SCPT-Ln-TFO, TFO-L4-cCPT, TFO-L6-cCPT를 포함하는 군에서 선택되고, 여기서 TFO는 삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드이고, L은 CH2 기의 수이고, CPT는 캄토테신 유도체이다. (3+3) 및 (4+4)는 헤어핀 폴리아미드이다.
다른 접합체는 레베카마이신, 특히 독으로서 레베카마이신의 인돌로카르바졸 유도체를 포함한다.
상기 접합체의 예는 TFO-Ln-RBC(Ln = -O(CH2)2O)n-(n = 2, 3 또는 6)이다.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 상기 접합체는 상기 정의된 바와 같은 리간드, 및 상기 토포이소머라제 I 억제제의 유도체로 구성되는 것이 특징인 2성분 복합체로, 링커 암은 억제제의 치환기에 혼입되어 있다. 상기 치환기는 포스페이트 또는 포스포티오에이트 기와 반응할 수 있는 말단 끝 부분을 포함한다. 상기 접합체의 예는 TFO-ST1578 및 TFO-ST2541, 및 화학식 1∼4의 관련 화합물이다.
접합체의 제3 그룹은 리간드, 상기 링커의 한 부분으로 기능하는 기에 의해 치환된 상기 포토이소머라제 I 독의 유도체, 및 또한 링커 암으로 구성되는 것을 특징으로 한다. 예로는 TFO-(CH2)n-cCPT(n은 2∼6); TFO-(CH2)3-SCPT, SCT-TFO, TFO-ST2677이 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 접합체는 2∼30번 위치에서 다수의 퓨린을 함유하는 상기 표적 유전자의 각 올리고피리미딘ㆍ올리고퓨린 서열 부근에서 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단을 유도한다. DNA/토포 I 절단 복합체의 기하로 인해, 절단 부위는 표적의 올리고피리미딘 가닥 상의 삼중체의 3' 측에 존재해야 한다.
이 화학 화합물은 또한 토포이소머라제 I 억제제로 유도된 상기 절단 부위가 리간드 결합 부위 끝으로부터 뉴클레오티드가 1∼10개 위치하는 것을 특징으로 한다.
치환기의 예는 선택적으로 불포화인 디아미노 알킬(예, H2N(CH2)n-O-N=CH-(여기서, n은 정수 2∼6임))을 포함하고, 상기 기는 화학식 1∼4의 화합물의 R4 기에서 인지할 수 있다.
다른 치환기는 -CO-NH-기-를 포함하는 디카르복시산 쇄를 포함한다.
상기 기는, 예를 들어,
Figure 112005051973688-PCT00004
로, 이 때 R은 C1-C4 직쇄 또는 분지쇄 알킬이고, n'은 정수 1∼6이다.
본 발명의 접합체에서, 억제제는 예를 들어 캄토테신이고, 치환기는 이의 20번 위치를 차지한다.
본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 접합체는 상기 정의된 바와 같은 링커 암을 거쳐 억제제의 치환기에 결합된 리간드를 포함한다.
본 발명은 또한 상기 접합체의 제조 방법에 관한 것이다. 포스포라미드 결합은 문헌 [Grimm et al. 2000]에 기재된 바와 같이 4-디메틸아미노피리딘의 존재 하에 트리페닐포스핀과 디피리딜디설피드를 반응시켜 얻는 반면; 아미드 결합은 상기 방법에 의해, 산 기능의 카르보디이미드 활성에 의해, 또는 HATU의 사용으로 변형된 펩티드 합성 절차에 의해 형성된다.
상기 접합체는 세포증식억제(cytostatic) 분자와 비교했을 때 신규한 기작을 통해 유리하게 효과적이다. 예로서 나타낸 바와 같이, 상기 접합체는 세포로 침투하여 이의 표적과 결합한다.
따라서, 본 발명의 새로운 접근법은 부작용은 줄이면서 최적의 항종양 효과를 유지하는 것을 목표로 한다.
예를 들어, 토포이소머라제 I 억제제의 용도는, 사례의 약 15%에서, 현재 잘 규명되어 있는 유전자의 상호 전좌로 특징지어지는 2차 백혈병의 출현과 관련있다고 입증되어 있다. 선택된 특정 유전자 쪽으로 상기 억제제를 유도하면 치료 효과 의 더 나은 선택성을 허용하여 백혈병성 세력이 감소할 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 소정의 유전자 또는 동시에 여러 유전자, 또는 하나 이상의 바이러스성 또는 병원성 단백질, 또는 세포의 종양 상태의 발달 및 유지와 관련된 단백질을 코딩하는 상기 유전자의 발현을 특이적으로 억제하는 방법에서의 상기 유전자의 용도에 관한 것이다.
유리한 방식으로, 단일 올리고뉴클레오티드-억제제 접합체는 현재 임상에서 사용되는 항종양 약물의 조합과 유사한 효과를 보이는 것으로 판단될 것이다. 접합체에 의해 표적화된 부위의 수는, CPT와 비교했을 때, 단독으로 사용할 경우 크게 감소한다.
따라서, 본 발명은 또한 약학적 비활성 비히클과 함께, 상기 정의된 바와 같이 적어도 하나의 접합체의 유효량을 함유하는 것이 특징인 약학 조성물과 관련있다.
이들 조성물은 주사 또는 스프레이로 투여할 수 있는 형태가 유리하다. 병리의 형태에 따라, 특히 치료될 암의 형태에 따라 당업자는 단위 및 일일 투여량을 측정할 것이다. 이와 관련하여, 기술 상태에서 개시된 접합체 중 일부는 시험관내 세포 시스템에서만 시험하였다는 것을 이해할 것이다. 본 발명자들은 세포로 화합물을 투여하는 것이 매우 어려우며, 심지어 불가능하다는 것을 발견하였다. 따라서, 새로운 화합물의 측면 및 알려진 화합물 용도의 측면 모두에서 본 발명의 화합물은, 세포 시스템에서 형질감염(transfection) 벡터와 함께 투여될 것이다. 형질감염 벡터의 예로는 나노입자, 리포솜, 양이온성 지질 및 양이온성 중합체가 있다.
매우 놀라운 방식으로, C가 화학식 1∼4의 캄토테신 유도체, 특히 코드 ST1578 및 ST2677로 확인된 캄토테신 유도체인 화합물은 세포에 투여하기 위해 임의의 형질감염 벡터를 필요로 하지 않는데, 이는 세포가 생체외 세포막을 침투하기 때문이다. 따라서, 화학식 A-B-C(이 때, C는 화학식 1∼4의 캄토테신 유도체, 특히 코드 ST1578 및 ST2677로 확인된 캄토테신 유도체임)를 포함하는 조성물 및 약물은 유리하게 추가 형질감염 벡터를 필요로 하지 않아, 이의 생물학적 이용을 더 간단하게 할 것이다.
본 발명의 다른 특성 및 이점은 과학 문헌 뿐 아니라 첨부된 도면을 참조한, 하기 실시예에 나타나 있다.
- 도 1은 특정 부위에서 토포이소머라제 I에 의한 DNA의 절단/자름을 표적으로 하는 원리를 예시하는 도해이다;
- 도 2A는 공지된 연구 시스템을 예시한다: 표적 올리고퓨린ㆍ올리고피리미딘 서열 및 상응하는 삼중체-형성 올리고뉴클레오티드(TFO)의 서열을 함유하는 324-염기쌍 이중체.
삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드(TF016, TF018, TF020, TF023)는 (예를 들어, 5-메틸-데옥시시토신(M) 및 5-프로피닐-데옥시우라실(P)을 사용하여) 복합체의 안정성을 증가시키기 위해 변형시켰다. TFO는 20S-10-카르복시캄토테신(10CPT), 20S-7-아미노에틸캄토테신(7CPT), 20S-7-에틸-10-히드록시캄토테신 아세트산(SCPT), 20S-7-아미노에틸이미노메틸캄토테신(ST1578), 20S-7-아미노프로필이 미노메틸캄토테신(ST2541) 및 숙시닐-발릴-20-0-(7-테르부톡시이미노메틸캄토테신)(ST2677)에 커플링되었다.
(3+3) 및 (4+4) 헤어핀 폴리아미드 형태의 2개의 소홈 리간드는 10-카르복시캄토테신(10CPT)에 커플링되었다.
TF016 및 2개의 소홈 리간드의 결합 부위는 사각형으로 표시되어 있다. 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭 염기쌍의 퓨린을 가지는 Hoogsteen-형태 수소 결합을 형성하는, 올리고퓨린ㆍ올리고피리미딘 서열에 결합한다. 소홈 리간드 (3+3) 및 (4+4)는 소홈에서 상호작용하여 결합한다. 접합체의 화학식은 도면 아랫 부분에 명기되어 있고, 링커 암은 이탤릭체로 나타나 있다. 올리고뉴클레오티드는 Eurogentec사(벨기에)에서 입수하였고, 문헌 [Grimm et al]에 기재된 방법에 따라 억제제와 커플링시킨다. 문헌 [Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 19 (2000) pp. 1943-1965 and by adapted peptide synthesis procedures]은 HATU의 용도를 기준으로 한다. 소홈 리간드는 문헌 [Arimondo et al. Angewandte Chem. Int. Ed. 40 (2001) pp. 3045-3048]에 기재된 바와 같이 합성하였다;
- 도 2B는 캄토테신 유도체 ST1578, ST2541 및 ST2677 및 접합체 TFO-ST1578, TFO-ST2541, TFO-L4-ST2677 및 TFO-L4-10CPT의 화학식을 나타낸다;
- 도 3A는 토포이소머라제 I 절단 부위를 나타낸다. 올리고피리미딘 가닥 상의 3' 위치에서 방사능 표지된 324-염기쌍 이중체(웰 1)는 3개의 캄토테신 유도체(웰 2∼4, 10CPT, 7CPT, SCPT), 또는 TFO 16과 접합된 3개의 유도체(웰 5∼7, TF016-L4-10CPT, TF016-L6-CPT, TF016-L3-SCPT)의 존재 하에 토포이소머라제 I과 항원 배양하였다. 절단 부위는 문자로 나타나 있고, 접합체의 결합 부위는 도식적으로 나타나 있다. L3 = 디아미노프로피닐; L4 = 디아미노부틸, L6 = 디아미노헥실; 항온 배양 후, 단백질은 SDS/프로테이나제 K로 처리하여 침지시키고, 절단 생성물은 변성 겔 상에서 분석한다;
- 도 3B는 토포이소머라제 단독, 또는 10 CPT 5 μM, 또는 ST1578, ST2677 또는 ST2541 5 μM, 또는 비접합된 TFO 1 μM 의 존재 하에 DNA를 대조군으로 사용한 본 발명에 따라 다른 접합체로 얻은 결과를 나타낸다. 1 μM에서, 모든 접합체는 올리고뉴클레오티드 결합 부위의 3' 측 상에서만 인간 토포이소머라제에 의한 DNA 절단을 유도하고, 이 때 억제제는 삼중-나선의 형성에 의한 위치에 있다(부위 b). nTFO는 비변형된 시티딘 및 티미딘을 보유한다.
반면, 억제제 단독으로 여러 부위에서의 절단을 자극한다(부위 a, b, c 및 d).
접합체 TFO-ST1578 및 TFO-ST2541은 접합체 TFO-L4-10CPT보다 3배 더 효율적이다.
접합체 TFO-L4-ST2677은 접합체 TFO-L4-10CPT에 필적한다.
또한 화학적으로 변형된 다른 TFO, 즉 서열이 +CP+CP+CP+CP+CP+TP+TP+TP(여기서, C는 LNA 시티딘을, +T는 LNA 티미딘을 의미한다)인 LNA(Locked Nucleic Acids)에 대한 결과를 제공한다.
1단계 합성에서 LNA가 ST1578에 결합하여, LNA-ST1678 접합체를 얻었다. 부위 b에서의 절단을 유도하는 이의 효과를 평가하였다. 상기 접합체는 TFO-ST1578 유사체보다 2배 덜 효과적이었다.
DNA/토포 I 절단 복합체의 분자 구속(molecular constraint)은 결합된 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 삼성분 복합체의 기하를 결정하고, DNA 절단을 유도한다.
- 도 4는 바람직한 부위에 존재하는지의 여부와는 상관 없이, 삼중 나선의 존재로 표적의 올리고퓨린 가닥 상의 삼중 나선의 5' 측 및 올리고피리미딘 가닥 상의 삼중 나선의 3' 측 절단이 유도된다. 3' 위치의 올리고뉴클레오티드 상의 억제제의 존재는 신호를 확장시키는 효과를 가진다.
- 도 5A는 다음과 같은 실험 구성을 나타낸다: 사용된 플라스미드는 SV40 프로모터의 조절 하에 피랄리스 루시퍼라제(Pyralis Luciferase) 유전자를 함유하는 pGL3 프로모터 벡터(Promega)의 전사 영역 및 비번역 영역 내 Hind III/Nco I 부위에서 54-염기쌍 이중체를 클로닝하여 얻는다. TFO 결합 서열 및 상기 서열 부근에서 캄토테신에 민감한 부위는 피랄리스의 루시퍼라제 유전자(luc)의 상측 전사 부위에 위치하고 있다. 54-염기쌍 삽입은 시험관 내 실험에서 사용된 완전한 삼중-나선 서열(pWT); 3' 부위 상에서 돌연변이 된 삼중-나선 서열(pMUT); 삼중-나선 서열 및 3' 측 상에서, 캄토테신에 의해 자극되는 잘 알려진 절단 부위(pTID), 및 TFO 임의의 안티센스 효과를 피하기 위해 반대 가닥 상에 삽입된 완전한 삼중-나선 서열(pIWT)을 포함한다.
- 도 5B는 표적 이중체, TFO 및 대조군 올리고뉴클레오티드 서열을 제공한다: TFO-L4-10CPT는 접합체 및 대조군으로서 사용하였고, 올리고뉴클레오티드는 포 스페이트에 의해(화합물 TFOP), 또는 10CPT, NH2-(CH2)4-NH2의 커플링을 위해 사용된 링커 암에 의해(화합물 TFO-NH2) 3'에서 보호되었다. 상기 암은 디페닐아세트산에 연결되어 있다(화합물 TFO-NPh2). 마지막 대조군으로서, 동일한 수정 염기를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하였지만, 상이한 서열과 함께 이를 링커 암 NH2-(CH2)6-NH2를 거쳐 3'의 포스페이트(16HIVUP) 또는 10CPT에 연결하였다(화합물 16HIV-CPT). 이어서 접합체 TFO-ST1578은 TFO-L4-10CPT에 필적하였다.
도 6A는 상기 분자를 이용한 HeLa 세포 내 피랄리스 루시퍼라제 유전자의 전사 억제를 처음으로 예시한다. 인간 점착성 HeLa 세포는 FCS 10%, 37℃에서 및 10% C02로 보충한 DMEN(Invitrogen)에서 배양하였다. 96 웰 플레이트에서 125 μL/웰로 세포를 뿌렸다(110,000 세포/mL). 24시간 후, 새 배지 112.5 μL 및 형질감염 혼합물 12.5 μL로 배지를 갈았다. 상기 형질감염 혼합물은, 무혈청 배지 중 pGL3Pr 1 μg 또는 변형된 것; pRL-TK 0.5 μg, 다양한 농도의 올리고뉴클레오티드 및 SuperfectTM(QIAGEN) 3 μL를 함유한다. 혼합물은 2배 또는 3배로 제조하였다. 24시간 뒤, 세포를 용해시키고, 루시퍼라제 발현을 평가하였다. 이중-루시퍼라제TM 리포터 분석 시스템(Promega)을 사용하여 동일한 세포 용해물 상에서의 두 리포터(피랄리스 및 레닐라(Renilla)) 활성을 측정하였다: 96-웰 플레이트의 각 웰은 수동 용해 완충액 30 μL에 용해시키고, 15 μL는 자동화 기구(Victor/Wallac)를 가진 "이 중 루시퍼라제TM 리포터 분석 시스템"을 이용하여 분석하였다. 두 활성(피랄리스 및 레닐라) 간의 비를 사용하여 효과의 선택성을 측정하였다. 상이한 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 두 활성 간의 비의 모든 값은 접합체 (DNA) 부재 하의 플라스미드 발현에 대해 일반화하였다. 대조군 올리고뉴클레오티드는 피랄리스 루시퍼라제의 발현에 영향을 주지 않는다. 단지 접합체 TFO-L4-10CPT는 완전한 삼중-나선 서열을 함유하는 두 표적(pTID 및 pWT) 상에서, 0.5 μM에서 발현의 약 40∼50% 억제한다.
삽입체가 없는 시판용 플라스미드에서, 접합체 pGL3Pr은 효과를 가지지 않으며, 이 효과는 돌연변이된 삼중-나선(pMUT)을 가지는 경우 크게 감소된다.
- 도 6B는 역 가닥을 가지는 플라스미드 구성을 사용하는 경우 얻은 결과에 관한 것이다.
- 도 7A 및 7B는 접합체의 존재 하에 삼중체의 형성 및 강한 특이적 분열의 존재(실시예 A), 및 삼중 나선 부위 상의 돌연변이에서, 삼중체 형성 및 DNA의 특이적 절단의 부재 하의 대조(실시예 B), 및 절단 부위 b 및 c에서 돌연변이된 이중체에서, 삼중체 부위의 3' 말단에서 강한 토포 I-매개 DNA 절단 부위의 부재 하에서의 삼중체 형성(실시예 C)을 나타낸다.
- 도 8은 DNA/토포 I/CPT 복합체의 형성과 생물학적 효과의 관련 결과를 제공한다: 세포 내 복합체 형성에 이어 면역블롯을 수행하였다.
- 도 9는 본 발명의 방법에서 유용한 특정 접합체/복합체의 (억제제 단독과 비교한 절단 강도 및 주어진 부위 a, b, c 및 d의 관점에서의) 유효성을 예시한다.
DNA 서열을 특이적으로 인지할 수 있는 올리고뉴클레오티드에 대한 토포이소머라제 억제제의 접합에 의해, 선택된 유전자에 대해 공통적인 표적 서열 상에 특이적 삼중 나선 복합체의 형성 때문에, 선택된 유전자 그룹 상에서 억제제를 표적으로 할 수 있다. 이어서, 상기 유전자 상의 비가역적 손상의 선택적 유도 및 이들 발현의 억제가 가능해진다.
이는 특히, 서열-특이적 DNA 리간드(예, 올리고뉴클레오티드), 또는 비-핵(non-nucleic) 리간드(예, 소홈 리간드(N-메틸 피롤 및 이미다졸로 구성되는 폴리아미드)) 또는 징크 핑거(zinc finger) 펩티드와 토포이소머라제 I 억제제의 공유 커플링을 사용하여, 그 자체로 공지된 방식으로 얻을 수 있다.
사실, 상기 리간드는 이중 나선의 주홈(major groove) 및 소홈에서 각각 결합하여 특정 DNA 서열을 특이적으로 인지할 수 있다. 선택적으로 상기 DNA 리간드에 대한 토포이소머라제 I 억제제의 화학적 커플링은 리간드의 결합 부위 근처에서 억제제를 배치하여, 이 부위로 토포이소머라제 I에 의해 유도된 단절을 특이적으로 유도한다.
따라서, 본 발명자들은 세포 종양 상태의 확산 및 유지 시, 토포이소머라제 억제제를 이와 관련하여 선택한 유전자 또는 유전자 그룹을 표적으로 함을 기초로 한 새로운 개념을 발달시켰다. 예를 들어, 상기 유전자는 세포 주기, 분열, 증식을 조절하는 유전자, 및 항-아폽토시스(apoptosis) 유전자로부터 선택된다. 바이러스 유전자 또한 이러한 전략으로 표적화할 수 있다.
선택된 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라, 선택성은 오직 단일 유전자를 목적으로 하기 위해 조절되거나, 유전자 군을 억제하기 위해 완화될 수 있다.
항종양 화학치료에서의 이러한 혁신적인 전략은 몇몇 유전자/작용의 동시 억제가 명백한 치료적 이득일 수 있는 다른 병리에까지 확장될 수 있다.
하기에 기재될 약리화학적 접근법의 유용성은 본질적으로 2개의 머리, 즉 표적 DNA를 인지하는 한 머리와 토포이소머라제를 모으는 다른 머리를 가진 접합체를 이용한 새로운 "쌍두(bicephalous)" 방법론의 정의에 존재한다.
상기 화합물의 고안은 목적으로 하는 서열에 적응되어야 하고, 상기 기재된 특성을 가져야 한다.
약리학적 접근법은 암성 종양의 세포 증식 및 유지와 관계된 특이적 유전자에 대해 토포이소머라제 I 독을 표적으로 하는 것을 기초로 한 새로운 치료적 전략 개발을 포함한다.
상기 접근법은 특히 세포 성장 및/또는 항-아폽토시스 유전자, 혈관신생에 관계된 유전자 상에서 안정한 삼중 나선을 형성하여 선택적으로 결합할 수 있는, 변형되거나 비변형된 올리고뉴클레오티드에 토포이소머라제 I 억제제를 화학적으로 커플링하는 것으로 구성된다(도 2: 올리고뉴클레오티드-억제제 접합체에 의해 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단의 표적).
DNA 리간드 접근법은 여러 유전자에 대해 공통적인 표적 서열을 선택하여, 상기 유전자의 발현 시 동시에 작용할 수 있는 가능성을 제공한다.
암과 같은 다중유전자 병리를 효과적으로 치료하기 위해, 사실 유전자 패밀 리, 더 구체적으로는 세포의 일반적인 증식 회로를 변경하는 유전자 그룹을 동시에 조절하는 것이 필수적이다.
따라서, 더 유리한 방식으로, 단일 올리고뉴클레오티드의 억제제 접합체는 현재 임상에서 사용되는 항종양 약물의 조합에 대해 유사한 효과를 보일 수 있다.
상기 접근법은 최적 항종양 효과를 유지할 수 있는 동시에 특정 부작용을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 토포이소머라제 I 억제제의 용도는, 사례의 약 15%에서, 현재 잘 규명되어 있는 유전자의 상호 전좌로 특징지어지는 2차 백혈병의 출현과 관련있다는 사실이 밝혀졌다. 선택된 특정 유전자 쪽으로 상기 억제제를 유도하면 치료 효과의 더 나은 선택성을 허용하여 백혈병성 세력이 감소할 수 있다.
또한, 특히 이의 필수적인 측면 중 하나에서, 본 발명은 또한 토포이소머라제 I 억제제의 작용을 DNA 특이적 부위 쪽으로 유도할 수 있는, 선택적으로는 상기 부위에서 토포이소머라제 I에 의한 절단을 유도할 수 있는 방법에 관한 것이다.
이 새로운 개념은 하기에서 예시의 방법으로 상세히 설명되고, 암의 발달 및 유지와 관련된 2 그룹의 유전자, 즉 (1) 성장 인자 IGF-1(인슐린 유사 성장 인자-1)이 이의 수용체(IGF-1R)에 결합할 경우 규명되는 것과 같은 생존 경로의 유전자 및 (2) 아폽토시스를 억제하는 유전자(예, Bcl-2 패밀리의 IAP 및 항-아폽토시스 유전자)를 비제한적으로 취한다. 상기 유전자는 특정 암에서 과발현되고, 항종양 효과를 유도하는 것을 차단한다.
본 발명자들은 삼중 나선을 형성할 수 있고 표적으로 한 소정의 유전자 그룹에 공통적인 서열에 대한 조사를 수행하였다. 이 조사는 GCG 소프트웨어 Unix findpatterns 프로그램(Genetics Computer Group, Infobiogen, Villejuif)을 사용하여 수행하였다.
예비 조사에서, 발명자들은 올리고피리미딘 서열을 확인하였는데, 이는 IGF-1, IGF-1R 및 AKT/PBK 유전자에 대해 공통적인 12 염기쌍(bp), 및 bcl-2, bcl-XL 및 서바이빈(survivine) 항-아폽토시스 유전자에 대해 공통적인 10 염기쌍 서열을 포함한다.
또한, 도 2에 기재되어 있는 TFO 서열은 표 1에 나타나 있는 유전자 목록과 결합한다. 유리 CPT 유도체는 게놈에서 (및 따라서 많은 부위에서) 거의 특이성을 가지지 않고 절단을 유도하지만, 도 2에 묘사된 염기 서열을 가진 TFO-독 접합체는 상기 유전자, 및 이들 가운데 특히 종양 증식 및 유지에 관계된 IGF1R 및 VEGF 상에서만 절단을 유도한다. 이 조사는 UCSC에서 공개되어 사용가능한 바이오인포매틱스 자료를 사용하여 실시하였다.
이미 언급한 바와 같이, 소홈 리간드와 같은 서열 특이적 DNA의 비핵 리간드(N-메틸 피롤 및 N-메틸 이미다졸로 구성되는 폴리아미드)는 또한 소정의 부위 쪽으로 토포이소머라제 억제제의 작용을 유도하기 위해 사용될 수 있다.
이들의 사용으로 안정한 삼중 나선의 형성에 의한 올리고피리미딘ㆍ올리고퓨린 표적 서열 제한에서 벗어날 수 있게 하는 것이 가능해야 한다.
캄토테신과 커플링된 소홈 리간드에 대한 결과는 하기에 나타나 있다.
표적 유전자 그룹에 대해 공통적인 서열에 대한 이번 조사에서 개략적으로 또는 간단하게, 선택된 유전자 그룹의 부분을 형성하기 위한 방식으로 선택된 최적 표적 서열을 정의할 수 있어야 한다.
삼중 나선 올리고뉴클레오티드를 사용하는 경우, 접합체에 의한 절단은, 2∼100개, 바람직하게는 10∼30개의 퓨린을 함유하는 각각의 올리고피리미딘ㆍ올리고퓨린 표적 서열을, 표적의 올리고피리미딘 가닥 상에서 삼중체의 3' 측의 토포이소머라제 I 억제제에 의해 유도되는 절단 부위로 유도한다.
또한, 억제제에 의해 유도된, 유리하게는 삼중 나선 말단으로부터 1∼10개의 뉴클레오티드로 위치한 절단 부위, 및 링커 암은 절단 부위, 사용된 억제제, 올리고뉴클레오티드에 대한 억제제의 결합 지점에 따라 개조한다.
올리고뉴클레오티드-토포이소머라제 억제제 접합체에 대해, 본 발명자들은 캄토테신 유도체, 토포이소머라제 억제제에 대한 커플링을 수행하였다. 예비 작업에서, 본 발명자들은 토포이소머라제 I 억제제인 캄토테신과 레베카마이신 유도체의 올리고뉴클레오티드 16 뉴클레오티드 길이에 대한 공유 커플링으로, 억제제가 삼중 나선 형성에 의해 위치한 부위에 대해 특이적으로 토포이소머라제 I에 의한 시험관내 절단을 유도한다는 것을 발견하였다(Arimondo et al., 1999, 2000a).
동일한 방식으로, 즉 DNA 특이적 리간드의 말단에 대한 공유 방식으로 결합할 수 있는 토포이소머라제 독인 다른 형태의 억제제를 사용하여 동일한 단계를 수행할 수 있다.
리간드 부분 및 억제제 부분을 통합하는 링커 암의 최적화는 매우 중요하며, 이는 올리고뉴클레오티드에 대한 리간드 결합 부위 및 억제제의 결합 지점에 대해 사용된 억제제의 절단 부위 위치에 따라 개조되어야 한다(Arimondo et al. 2002).
올리고뉴클레오티드-억제제 접합체의 합성 후, 및 이들 세포 활성의 평가 전, 겔 이동 실험 및 열 해리 실험으로 삼중 나선을 형성하는 이들의 능력은 평가되어야 한다. 예를 들어, 도 2에 기재되어 있는 조성물의 TFO는 동일한 표적 서열을 공유하는, 시험한 2개의 유전자 내 리간드 인지 부위에 대해 특이적으로 결합하고 시험관내에서 토포 I-매개 DNA 절단을 유도한다.
선택된 억제제의 세포 활성
토포이소머라제 I 접합체의 올리고뉴클레오티드-억제제의 활성에 대해, 분자 및 세포 시스템은 IGF-1 및 이의 수용체를 포함하는 유전자의 캐스캐이드 상의 상이한 접합체 효과 연구를 가능하게 한다(Hamel et al., 1999). 특히, 절단 활성은 게놈 DNA의 직접 분석 및 트랜스크립톰에 의한 작용 특이성(DNA 칩 및 노던 블롯) 및 프로테옴(2차원 겔 및 웨스턴 블롯) 분석에 의해 평가할 수 있다. IGF-1 및 IGF-1R 유전자가 교아종, 간암종 및 전립선 종양의 증식에 관련있기 때문에, 안티센스 구조에 의한 이의 억제는 동물에서 융합된 종양의 증식을 차단한다(Lafarge-Frayssinet et al., 1977). 배양물 내 종양성 세포에 대한 시험은 가장 효과적인 올리고뉴클레오티드 접합체를 선택하고, (예를 들어, 누드 마우스에 주사한 교아종 또는 유전자가 동일한 래트 중 간암종을 가진) 동물 모델을 사용할 수 있을 것이다.
접합체의 약물동력학은 또한 표준 절차로 평가할 수 있다.
가장 효과적인 접합체에 대해, 암성 세포의 증식을 억제하기 위한 이의 능력 은 상이한 종양 세포주를 사용한 뒤, 마우스로 이종이식된 인간 종양으로부터 시험관내 또는 생체내 모델 내 대부분의 세포독성 분자에 대해 부분적으로 측정할 수 있다.
항암제로서 토포이소머라제 I 억제제와 커플링한 DNA 리간드의 평가
경제적 이해관계가 중요한데, 이는 암만큼 중요한 병리의 새로운 치료 경로와 관계되기 때문이다.
따라서, 병리에서 규칙에 벗어난 유전자에 대한 확인으로 새로운 약리 생성물의 기반을 형성할 수 있다.
약리적 성공이 다음에 대한 중요한 결과를 가질 것임은 명백하다:
ㆍ 부작용 감소 및 치료 효과의 증대
ㆍ 약학 치료와 관련된 비용의 감소
ㆍ 환자에 적합한 다수의 치료 해결책의 개발
ㆍ 국민 건강 지출의 현저한 감소
이러한 경제적 효과는 유감스럽게도, 개별 효과 수준이 낮은 다수의 치료 프로토콜 중에서 선택해야 하는 암 분야에서 매우 중요할 것이다.
구체예
약어:
CPT = 캄토테신; P = 5-프로피닐-2'-데옥시우리딘; M = 5-메틸-2'-데옥시시티딘; R = 이중체의 올리고퓨린 가닥, Y = 이중체의 올리고피리미딘 가닥.
ㆍ = 왓슨-크릭 염기의 쌍
Topo = 토포이소머라제
물질 및 방법
억제제
모든 억제제는 디메틸설폭시드에 용해한 뒤 물로 희석한다. 디메틸설폭시드의 최종 농도는 모든 시험에서 0.3%(v/v)를 절대 초과하지 않는다. 억제제는 도 2에서 이미 기재된 바와 같이 TFO의 3' 또는 5' 말단에 결합된다.
캄토테신 유도체는 문헌 [Arimondo et al.(2002)] 및 [Villemin et al.(1996)]에 기재된 기법에 따라 합성한다.
올리고뉴클레오티드 및 DNA 단편
올리고뉴클레오티드는 Eurogentec에서 구입하여, "quick spin" 컬럼 및 Sephadex G-25 fine(Boehringer, Mannheim) 상에서 정제한다. 농도는 260 nm에서 가장 근접합 모델로부터 계산한 몰 흡수 계수를 사용하여 25℃에서 분광광도계로 측정한다(Cantor et al., 1970).
CTP 접합체의 합성
캄토테신 CPT의 유도체는 상이한 링커 암을 통해 올리고뉴클레오티드의 3' 또는 5' 말단에서 포스페이트, 또는 문헌 [Grimm et al. Nucleosides, Nucleotides(2000)]에 기재된 약간의 변형을 가한 기법에 따른 소홈 리간드, N,N-디메틸-N'{1-메틸-4-[1-메틸-4-[1-메틸-4-[4-{[1-메틸-4-[1-메틸-4[1-메틸-4-(4-아미노부티릴)아미노피롤-2-카르보닐]아미노피롤-2-카르보닐]아미노피롤-2-카르보닐] }아미노부티릴]아미노피롤-2-카르보닐]아미노피롤-2-카르보닐]아미노피롤-2-카르보닐}프로필렌디아민(3+3), 및 아미드 결합 형성을 위해 올리고뉴클레오티드에 대해 개조한 HATU를 사용하는 펩티드 합성 절차에 대해 접합된다. 링커 암은 문헌 [Arimondo et al.(2001) Angewandte Chem. above Arimondo (2002)]에 기재된 바와 같이, N-메틸이미다졸, 디피리딜 디설피드 및 트리페닐포스핀으로 처리하여 활성화된 3' 또는 5' 말단에서 포스포릴화된 올리고뉴클레오티드에 대한 아미노-말단 끝의 반응으로 결합된다. 접합체는 UV 분광기 및 질량 분광기로 특징지어진다.
어떠한 링커 암도 ST1578 및 ST2541에서와 같이 사용되지 않을 경우, CPT 유도체 상의 아미노기는 문헌 [Grimm et al. 2000]에 기재된 기법에 따라 올리고뉴클레오티드의 말단 포스페이트에 직접 결합된다.
(DNA) 표적 유전자의 제조
pBSK(+/-) 플라스미드는 Promega(USA)에서 구입하여, 77-염기쌍 표적 이중체를 BamHI과 EcoRI 부위 사이에 삽입한다. PvuII 및 EcoRI로 플라스미드를 침지하여 3' 말단에서 클레노우(Klenow) 폴리머라제(Ozyme, GB) 및 α[32P]dATP(Amersham, U.S.A.)로 표지하기 적합한 324-머(mer) 단편을 생산한다. 상기 이중체 DNA의 분리, 정제 및 표지를 위한 기법에 대한 상세한 내용은 문헌 [Arimondo 2002]에 기재되어 있다. 2개의 59-염기쌍 이중체는 가닥을 말단 트랜스퍼라제(Ozyme, GB) 및 α[32P] ddATP(Amersham, U.S.A.)로 표지한 뒤 5분간 90℃에서 비표지된 상보 서열과 하이브리드하고, 상온으로 천천히 냉각시켜 얻는다. 방사능 표지된 단편은 상기 기재된 문헌 [Arimondo 2002]에서와 같이 겔 크로마토그래피로 정제한다. 가닥은 다 음과 같이 명명한다: 올리고퓨린에 대해서는 R 가닥 및 올리고피리미딘 가닥에 대해서는 Y.
토포이소머라제 절단 시험
방사능 표지된 이중체(50 nM)는 TFO 또는 MGB의 존재 하에 언급한 농도에서 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0.5 mM DTT, 0.1 mM EDTA 및 30 μg/μL BSA 중 30℃에서 항온배양한다(총 반응 부피 10 μL). 토포 I DNA 절단 생성물을 분석하기 위해, 효소(Invitrogen Inc) 10 단위를 첨가하고, 상기 기재된 바와 같이 리간드 및/또는 억제제로 사전 항온배양한 뒤, 30℃에서 20분간 항온배양한다. 토포 I-DNA 복합체는 SDS를 첨가하여 해리시킨다(최종 농도 0.25%). 에탄올 침전 후, 길고 짧은 표적에 대해 각각 1 x TBE 완충액(50 mM Tris-HCl, 55 mM 붕산, 1 mM EDTA) 중 7.5 M 우레아를 함유하는 8% 및 10% 변성 폴리아크릴아미드 겔[19/1 아크릴아미드:비스아크릴아미드] 상에 침착되기 전, 모든 샘플은 포름아미드 6 ㎕ 중에서 재현탁시키고, 90℃로 4분간 가열하고, 다시 4분간 얼음 상에서 냉각시킨다. 절단 강도를 정량화하기 위해, 겔은 Dynamics 445SI Phosphorimager를 사용하여 스캔한다. 절단 속도를 측정하기 위해, 전체 침착에 대한 표준화를 수행한다.
10번 위치에서 산에 결합된 TFO-SCPT 및 SCPT-TFO 접합체를 제조하는 데 사용한 새로운 CPT 유도체인 20S-(7-에틸-10-히드록시캄토테신)아세트산(SCPT) 뿐 아니라, 10번 위치 또는 7번 위치에서 결합된 다른 접합체(예, TFO-10CPT 및 TFO- 7CPT, (3+3)-CPT 및 (4+4)-CPT)의 화학식은, 예를 들어 도 2A에 나타나 있다. 링커 암으로 작용하는 치환기를 가지는 캄토테신 유도체 ST1578 및 ST2677은 도 2B에 나타나 있다.
본 발명자들은 항종양제, 및 TFO(삼중 나선-형성 올리고뉴클레오티드)를 가진 6개의 캄토테신 유도체, 및 2개의 소홈 리간드를 가진 10-카르복시캄토테신 유도체(MGB, 소홈 결합제)로서 임상 시도를 현재 실시하고 있는 분자와 유사한, 3개의 레베카마이신 유도체를 화학적으로 커플링함으로써 그 접근법을 확인하였다(도 2).
본 발명자들은 억제제 유도체가 존재하지 않거나 너무 길지 않을 경우, 적절한 링커 암을 통해 올리고뉴클레오티드 또는 소홈 리간드의 한쪽 끝에 억제제를 공유 결합시켰다. 접합체는 UV 분광기 및 질량 분석기(Q-star I)로 특징지어졌다. 접합체의 절단 특이성은 시험관 내 표준 토포이소머라제 I 절단 시험에 의해 측정하였다. 절단 지수는 DNA 리간드와 커플링된 억제제의 존재 하의 절단 강도 및 비결합된 억제제의 존재 하의 절단 강도 간의 관계로서 계산한다. 표적의 예는 도 3에 나타나 있다. 세 개의 비커플링된 캄토테신 유도체(웰 2, 3, 4)는 여러 부위(부위 a∼i)에서 절단을 촉진한다. 유도체가 적절한 암을 가진 TFO의 3' 말단에 공유 결합하는 경우, 삼중 나선이 형성되고(웰 5, 6, 7), 접합체는 삼중 나선의 3' 측에서만 절단을 유도한다(부위 "b"). 이는 이의 표적에 접합체의 올리고뉴클레오티드 부분을 결합시켜 삼중 나선 부위의 3' 측 억제제의 특이적인 포지셔닝 때문이다. 올리고뉴클레오티드의 경우 음성으로 전하된 리간드의 존재는 다른 부위에 접합된 억 제제의 결합을 저해하는데, 이는 삼중 나선 또는 이 부위에서 더 먼 곳에 위치하는 다른 부위의 5' 측에 위치하는 부위 "a"의 소멸로 명백해진다.
본 발명자들은 상이한 길이의 TFO(16, 18, 20 및 24 뉴클레오티드)(도 9 참조), 및 상이한 레베카마이신 및 캄토테신 유도체에 대한 DNA 리간드의 결합 부위 근처에서 토포이소머라제 I에 의한 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단의 표적을 입증하였다. 동일한 접근법을 DNA 소홈 내에 특이적으로 결합하는 N-메틸 피롤 헤어핀 폴리아미드와 같은 다른 서열 특이적 DNA 리간드에 대해서도 적용하였다(도 2: (3+3)-CPT 및 (4+4)-CPT 접합체). 발명자들은 또한 이를 다른 표적으로까지 확장시켰다: HIV-1 바이러스의 PPT(폴리퓨린 구역(polypurine tract))(5' AAAAGAAAAGGGGGGA 3'/3'TTTTCTTTTCCCCCT 5') 및 IGF-1의 프로모터 1의 존재 하에 22-머 서열(5' AGAAGAGGGAGAGAGAGAGAAGG 3'/3'TCTTCTCCCTCTCTCTCTCTTCC 5'). 또한 도 2에 기재된 TFO는 IGF1R의 인트론 2에 결합하는 것으로 나타났다(표 1).
따라서 상기 접근법은 특히 상이한 서열 특이적 DNA 리간드의 두 클래스(TFO 및 MGB), 즉, 토포이소머라제 Ⅰ 억제제의 상이한 클래스 및 상이한 표적에 대해 명백하다.
본 발명의 목적은 또한, 유리한 방식으로, 사용된 리간드가 서열 특이적 DNA 리간드(예, 올리고뉴클레오티드), 또는 비핵 리간드(예, 소홈 리간드)(N-메틸 피롤 및 N-메틸 이미다졸, 특히 (3+3)-CPT 및 (4+4)-CPT 접합체로 구성되는 헤어핀 폴리아미드), 또는 징크 핑거 펩티드로 구성되는 군에서 선택된, 상기 정의한 바와 같은 방법이다.
본 발명자들은 또한, 리간드의 결합 부위에서 자극된 토포이소머라제 Ⅰ 절단 효능이, 한편으로는 억제제와 리간드 사이의 링커 암 크기에 따라, 다른 한편으로는 억제제의 고유 효과에 따라 달라질 수 있음을 입증하였다. 또한, 본 발명자들은 리간드의 결합에 의한 항종양제의 포지셔닝이 표적 부위에서 상기 분자의 시험관내 국재 농도를 증가시킨다는 것을 발견하였다; 사실, 접합체는 1∼10 nM의 농도에서 토포이소머라제 Ⅰ에 의해 절단이 촉진된다. 또한, DNA/토포이소머라제/억제제 절단 복합체는 억제제가 TFO 에 접합하여 삼중 나선을 형성할 경우 훨씬 더 안정적이다. 고농도의 염(> 600 mM NaCl)이 이를 해리하기 위해 필요하다.
상기 항종양제를 선택적으로 리간드-억제제 접합체의 DNA 리간드에의 결합으로 인지되는 서열인 부위 쪽으로 유도하는 상기 접근법은 새로운 항종양 약물의 개발 시 급진적으로 새로운 접근법을 허용한다.
현재 3차 토포이소머라제 Ⅰ/DNA/ 억제제 복합체의 구조는 아직 완전하게 설명되어 있지 않지만, 본 발명자들은 3차 DNA/토포이소머라제/억제제 복합체의 구조 분석을 위해 접합체를 사용하였다. TFO에 대한 억제제의 결합 부위를 바꾸면 삼성분 복합체 내 억제제의 위치가 바뀌어, 효소에 의한 절단이 효과적이 된다(도 4 및 9 참조). 따라서, 본 발명자들은 상이한 길이의 TFO에 대해 2개의 캄토테신 유도체, 즉 10-카르복시캄토테신 및 7-아미노에틸캄토테신를 공유 결합시켰다. 따라서, 삼성분 복합체 근처의 위치 및 절단 강도에 대한 연구에서, 삼성분 복합체를 설명하는 현재의 모델이 적합하지 않으며, 다른 형태를 고려해야 한다는 것이 입증되었다. 삼성분 복합체의 구조 유연성에 대한 다른 표시는, 절단 효과를 10-카르복시캄 토테신이 주홈 리간드(TFO) 또는 소홈 리간드(MGB)에 결합하는지에 따라 비교할 수 다는 사실로 알 수 있다.
예상 외로, 삼중 나선만의 존재로 토포 I-매개 DNA 절단의 특정 표적을 유도한다.
본 발명자들은 접합체가 다음에 기재된 특징을 가질 경우 절단이 일어난다는 것을 입증하였다:
또한 본 발명의 과제는 우선, 특히 종양의 발달 및 유지에 관계되는 단백질을 코딩하는 여러 표적 유전자의 발현을 동시 억제하는 방법으로, 다음의 단계를 포함한다:
(iv) 상기 표적 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 적어도 하나의 DNA 서열 특이적 리간드에 대해 적어도 하나의 토포이소머라제 억제제를 접합시켜, 적어도 하나의 토포이소머라제 I 억제제의 작용을 상기 유전자에 특이적인 부위 쪽으로 유도하는 단계,
(v) 상기 접합체의 상기 리간드에 의해 게놈 내 상기 유전자를 인지하여 상기 표적에 대한 상기 리간드의 결합을 형성하는 단계,
(vi) 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단을 유도하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 단계.
함께 모으는 단계는 상기 유전자 및 토포이소머라제를 함유하는 생물학적 샘플을 이용하여 시험관내에서, 배양액으로부터의 세포를 이용하여 생체 외에서 수행한다.
토포이소머라제 억제제의 존재로 토포이소머라제 I로 매개되는 DNA 절단의 표적 효과가 유리한 방식으로 증폭된다. 삼중체에 의해 유도되는 상기 절단은 정확한 기하에 의존한다: 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합은 표적의 올리고피리미딘 가닥 상의 삼중 나선의 3' 측 및 표적의 올리고퓨린 가닥 상의 5' 측에서만 절단을 촉진한다(도 4).
본 발명은 또한 적어도 하나의 리간드의 복합체, 특히 표적의 올리고퓨린 가닥 상의 5' 측 및 표적 유전자의 올리고피리미딘 가닥 상의 3' 측 상에서 토포이소머라제 I에 의한 절단을 유도하는, 삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드("TFO") 복합체에 관한 것이다.
또한 본 발명은 삼중 나선을 형성하고, 삼중 나선의 3' 측에서 효소의 선택적이고 강한 절단을 촉진하는 토포이소머라제 I 억제제에 대해 3' 위치에서 커플링된 피리미딘 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
삼중체의 3' 측은 수소 결합의 형성으로 TFO에 의해 인지되는 올리고퓨린 서열의 3' 측으로 정의된다. 이 절단 위치는 절단 부위에서 DNA 상의 토포이소머라제 I의 결합이 대칭이 아니고, 효소는 5'OH 말단을 이탈하는 절단된 가닥의 3' 포스페이트를 가진 포스포로티로실 결합을 형성한다는 사실과 관련있다. 그러므로, 삼중 나선은 효소에 대한 입체 장애(steric hindrance) 없이 표적 상의 절단 부위의 3' 측 상에 존재할 수 있다. 이는 토포이소머라제 I의 선호 부위가 삼중 나선의 존재에 의해 유도될 뿐 아니라, 삼중 나선의 존재 하에서만 검출할 수 있는 부위임이 강조되어야 한다. 이는 삼중체의 존재 하에 연결된 DNA의 국재적 형태 변화 때문이 라 생각할 수 있다. 사실 절단 효능은 삼중 나선의 5' 측 및 3' 측 상에서 동일하지 않다는 점을 주목해야 하며, 삼중 나선의 두 말단이 동등하지 않다는 것은 알려져 있다. 반면, 삼중체 구조에 의한 물리적 차단으로 효소 진행을 멈추어, 효소를 "정지(pause)"시켜 부근을 절단할 시간을 줄 수 있다는 것 또한 생각할 수 있다. 이 2개의 가설은 서로 배타적이지 않다.
본 발명의 과제는 또한 다음의 단계를 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 방법이다:
(vii) 상기 표적 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 적어도 하나의 DNA 서열 특이적 리간드에 대해 적어도 하나의 토포이소머라제 억제제를 접합시켜, 적어도 하나의 토포이소머라제 I 억제제의 작용을 상기 유전자에 특이적인 부위 쪽으로 유도하는 단계,
(viii) 상기 접합체의 상기 리간드에 의해 게놈 내 상기 유전자를 인지하여 상기 표적에 대한 상기 리간드의 결합을 형성하는 단계,
(ix) 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단을 유도하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 단계
본 발명의 바람직한 구체예에 따라, 표적화된 서열은 리간드에 의해 인지되는 부위를 함유하는데, 올리고뉴클레오티드의 경우, 상기 서열은 2∼100개, 바람직하게는 2∼30개 염기쌍의 퓨린을 함유하는 각 올리고피리미딘ㆍ올리고퓨린 표적 서열이다.
좀 더 바람직한 방식으로, 상기 표적화된 서열은 또한 더 나은 효능을 얻기 위해 상기 서열 근처에 토포이소머라제 억제제 부위를 포함한다. 억제제에 의해 유도된 절단 부위는 삼중 나선의 말단으로부터 1∼10개 뉴클레오티드로 위치해야 한다. 링커 암은 절단 부위, 사용된 억제제, 및 올리고뉴클레오티드에 대한 억제제의 결합 지점에 따라 수정되어야 한다.
이어서, 본 발명자들은 처음으로 세포 내에서의 확실한 접근법을 보였다.
시험관내 실험에서는 핵 장벽, 크로마틴의 구조 및 핵 내 접합체의 특이성을 고려할 수 없기 때문에, 본 발명자들은 세포 시스템에서 접합체를 시험하였다. 접합체는 삼중 나선의 형성 및 올리고뉴클레오티드에 대해 커플링된 억제제의 존재에 따라 세포 내에서 특이적 효과를 유도한다.
더 자세하게, 본 발명자들은 TFO의 결합 서열 및 이 근처에서 캄토테신에 감수성이 있는 부위의 결합 서열이 피랄리스 루시퍼라제 유전자(luc)의 상측 전사 영역에 위치하는, HeLa 세포로 형질감염된 플라스미드 발현 벡터를 사용하였다. 상기 플라스미드는 Hind III와 Nco I 부위 사이의 벡터 pGL3 프로모터(Promega)에서, 도 5에 기재된 서열을 함유하는, 54 염기쌍을 가진 단편을 클로닝한 뒤 얻었다. 레닐라 루시퍼라제 유전자를 코딩하는 pRL-TK(Promega)는 형질감염 대조군으로 사용된다.
HeLa 인간 점착성 세포는 FCS 10% 및 37℃에서 10% CO2로 보충한 DMEM 배지(Invitrogen)에서 배양한다. 96 웰 플레이트에서 125 μL/웰로 세포를 뿌렸다(110,000 세포/mL). 24시간 후, 세포 배지는 혈청이 있는 새 배지 112.5 μL 및 형 질감염 혼합물 12.5 μL 로 갈았다. 형질감염 혼합물은 무혈청 배지 중, pWT 또는 pMTUC 또는 pMUT 또는 pIWT 1 μg; pRL-TK 0.5 μg, 다양한 농도의 올리고뉴클레오티드, 및 SuperfectTM(Qiagen) 3 μL를 함유한다. 혼합물은 2배 또는 3배로 제조한다. 24시간 후, 세포를 용해시켜 루시퍼라제 발현을 분석한다.
이중-루시퍼라제TM 리포터 분석 시스템(Promega)을 사용하여 동일한 세포 용해물 상에서의 두 리포터(피랄리스 및 레닐라) 활성을 측정하였다: 96-웰 플레이트의 각 웰은 "수동 용해 완충액" 30 μL에 용해시키고, 15 μL는 자동화 기구(Victor/Wallac)를 가진 "이중 루시퍼라제TM 리포터 분석 시스템"을 이용하여 분석하였다.
두 활성 간의 비(피랄리스/레닐라)를 사용하여 효과의 선택성을 측정하였다. 도 6은 접합체의 부재 시 플라스미드의 발현과 비교했을 때 표준화된, 상이한 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 두 활성 간의 비를 나타낸다. 3개의 플라스미드 pWT, pMTUC 및 pMUT는 올리고뉴클레오티드 부분의 길이가 상이한 4개의 접합체 뿐 아니라, 암(arm) 및 결합된 캄토테신 유도체의 길이를 나타낸다. (CH2)4-NH2(올리고-NH2) 암에 대해 3' 위치에서 결합한 올리고뉴클레오티드 TF016은 대조군으로 사용한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 매우 안정한 삼중 나선을 형성한다.
삼중 나선을 형성하는 대조군 올리고뉴클레오티드 올리고-NH2 1 μM이 존재하면 루시퍼라제 유전자의 발현이 약 30% 억제된다. 캄토테신에 대한 커플링으로 억제 효과가 증가된다(접합체에 따라, 45∼60% 억제). 이러한 억제 증가는 시험관내에서 관찰된 바와 같이, 삼중 나선 형성에 의해 위치된 캄토테신의 존재 하에 토포이소머라제로 유도되는 삼중 나선 부위 근처의 DNA 절단으로 설명할 수 있다. 접합체는 이의 효능에 따라 상이하다: 10-카르복시캄토테신 TF016, TF016-L6-10CPT 및 TF016-L4-10CPT의 유도체가 가장 효율적이다(약 60% 억제)(도 9 참조). 결합 암의 길이는 억제 효능에 크게 영향을 미치지 않는다. 시험관내 실험에서, 상기 접합체는 삼중 나선의 3' 말단으로부터 부위 "b" 4 염기쌍에서의 절단을 효율적으로 촉진한다는 것이 나타났다(상기 참조, 도 3). 시험관 내에서는 동일하게 유효하지만 16-머에 비해 특이성이 낮은 TF018-L6-10CPT 접합체는 루시퍼라제 유전자 발현을 45%만 억제한다. 7-아미노에틸캄토테신을 함유하는 TF016-L6-7CPT는 상응하는 TF016-L6-10CPT 접합체에 비해 억제가 약 50% 덜 효율적이다. 이는 억제제의 절단 효능에 대한 시험관내 결과와 일치한다: 10-카르복시캄토테신은 7-아미노에틸-캄토테신에 비해 더 효과적으로 토포이소머라제 Ⅰ에 의한 DNA 절단을 촉진한다. 관찰된 효과는 확실히 표적 상에서 접합체의 올리고뉴클레오티드 부분에 의한 삼중 나선의 형성 때문이다. 이는 2개(pMTUC) 또는 3개(pMUT) 부위 상의 삼중 나선 서열 중 돌연변이된 표적 상에서의 측정으로 확인된다. 2개의 퓨린 돌연변이의 존재로 억제 효능이 감소하고, 삼중 나선은 여전히 형성되지만 효율성이 떨어진다: 올리고-NH2는 30∼약 15% 억제로, TF016-L6-10CPT 접합체는 60∼45% 억제를 통과한다. 결합 부위 중 3개의 피리미딘 돌연변이의 존재는 총 억제 감소를 의미한다. 도 7A 및 7B를 참조한다.
합성된 RNA 상의 접합체(pIWT)의 안티센스 효과를 피하기 위해, 보존된 가닥을 가진 플라스미드 구성을 사용하였다. 결과는 도 6B에 나타나 있다. 대조군은 루시퍼라제 피랄리스의 발현을 억제하지 않았고, 접합체 TFO-L4-CPT는 0.5 μM에서 40∼50%의 발현을 억제한다. 접합체 TFO-ST1578이 훨씬 더 효율적으로, 0.5 μM에서 50∼60%의 억제가 측정된다. 상기 접합체는 삼중 나선 부위를 가지지 않는 플라스미드 pGL3Pr 구성 상에서 불활성이었다.
도 8에 해당하는 실험에서, HeLa 핵 세포(5,000,000)를 제조하고, 토포이소머라제 I 독이 없거나(CPT 또는 ST1578), 또는 올리고뉴클레오티드에 커플링되거나(TFO-L4-10CPT 또는 TFO-ST1578 또는 LNA-ST1578), 또는 다양한 농도에서의 대조군 올리고뉴클레오티드(TFO-NH2 또는 TFO-NPh2)를 이용하여, 37℃에서 3시간 동안 항온배양하였다(도 8, 5 μM에서). 사르코실을 첨가한 후, 용해물은 CsCl 구배 상에서 16시간 동안 한외원심분리(ultracentrifugation)하였다. 12개의 단편을 수거하여 웨스턴 슬롯 블롯으로 분석해, 토포이소머라제 I을 함유하는 단편을 나타냈다(미처리된 대조군에 대한 1∼4에서(모의체)).
DNA를 함유하는 단편은 250 nm에서 흡광도를 측정하여 확인하였다(단편 8∼10). DNA/토포 I 절단 복합체가 안정할 경우, 억제제(CPT 또는 ST1578) 또는 접합체(TFO-L4-10CPT, TFO-ST1578 또는 LNA-ST1578)의 존재 하에 DNA를 함유하는 단편에서만 토포이소머라제 I가 관찰되었다. 대조군 TFO(TFO-NH2, TFO-NPh2)를 사용한 경우, 미처리된 세포(모의체)에 대한 제1 단편 중에서만 토포이소머라제 I이 존재하였다.
상기 접근법을 이용하여, 본 발명자들은 상기 접합체가 세포 시스템 중에서 선택된 부위 상의 토포이소머라제에 의한 특이적 절단을 유도할 수 있다는 것을 보였다. 상이한 토포이소머라제 I 억제제를 사용할 수 있고, 억제는 본 발명자들이 6개의 캄토테신 유도체 및 인돌로카르바졸 유도체로 관찰한 바와 같이, 억제제의 고유한 효능에 따라 다를 것이다.
억제제 효과를 증가시키기 위해, 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드, 예를 들어, PNA, 펩티드 핵산, 2'O-알킬 리보핵산, 올리고포스포라미데이트, LAN(리보스의 변형에 대해 차단된 RNA)을 사용할 수 있다.
접합체는 다음을 목표로 할 수 있다:
ㆍ 예를 들어, 특정 (단일) 유전자의 발현에 따른 병리에 대한 인간 게놈에, 또는 바이러스 프로게놈에(예, 특정 바이러스, HIV 및 HSV의 발달에 관계된 유전자), 또는 기생충 게놈에 존재하는 단일 서열 중 하나 또는 모두. 이어서 접합체는 유전자를 선택적으로 불활성화시킨다; 또는
ㆍ 병리의 유지 및 발달에 관계된 몇몇 유전자에 대해 공통적인 표적 서열(예, 종양성 종양 세포에서 관찰된 질병에 관여하는, 종양 유전자, 성장 인자, 항-아폽토시스 유전자, 세포 주기 및 분열을 조절하는 유전자). 이어서 접합체는 몇몇 유전자를 동시에 조절할 수 있다.
사실, 접합체의 리간드 부분에 대해 선택된 결합 부위의 길이 및 서열에 따 라, 접합체의 선택성은 단일 유전자만을 목표로 하기 위해 엄격하거나, 또는 유전자 군을 표적으로 하기 위해 완화될 수 있다.
제1 경우에서, 통합된 바이러스의 게놈은 이 게놈에만 존재하는 서열에 대해 유도되는 접합체에 의해 특이적으로 표적화되거나 절단될 수 있다. 본 출원의 범위에서, 본 발명자들은 접근법을 확장하여 HIV-1 바이러스의 PPT를 포함하였다.
제2 경우에서, 특정 종양성 병리에 관계된 몇몇 유전자는 공통적인 표적 서열을 선택하는 토포이소머라제 I에 의해 특이적, 또한 동시에 절단될 수 있다.
암 특성의 획득 및 유지와 관련된 유전자의 동시 억제는 암 세포의 악성 특성에 대해 특이적인, 필수 생화학 과정을 표적으로 할 수 있다. 본 발명자들은 성장 신호의 전달 및 아폽토시스의 억제와 관계된 2 그룹의 유전자를 선택하였다. 제1 경우에서, 성장 인자 IGF-1(인슐린 유사 성장 인자-1), 이의 수용체 IGF-1R 및 상응하는 신호화 캐스캐이드에서 하위에 위치하는 유전자를 선택하였다. 이들 유전자는 세포 생존 경로를 활성화시키고, 교아종, 간암종 및 전립선 종양의 증식에 관계된다. 안티센스 구성에 의한 IGF-1 또는 IGF-1R 유전자의 억제는 동물로 융합된 종양 증식을 차단한다. 제2 경우에서, 아폽토시스-억제 유전자(예, C-IAP1/2, XIAP, 서바이빈, bcl-2, bcl-W, bcl-XL, Mcl-1)에 공통적인 서열을 표적으로 하는, 암성 세포 내 아폽토시스를 유도하는 것을 목적으로 한다. 아폽토시스 또는 프로그램화된 세포 사멸은 캐스파제에 의해 발효된 세포의 조절된 단편화이다. 이 과정은 아폽토시스를 유도하는 단백질과 이를 억제하는 단백질 사이의 평형으로 조절된다. 세포 수명을 연장시킴으로써, 아폽토시스를 억제하는 유전자는 세포 악성 형질변형 을 유도하는 유전적 사건의 확률을 증가시킨다: 이들은 종종 암성 세포에서 과발현된다.
본 발명자들이 표적으로 하고자 하는 유전자 그룹에 대해 공통적인 삼중 나선을 형성할 수 있는 서열을 조사하기 위해, 후자는 GCG Unix 소프트웨어 findpatterns 프로그램(Genetics Computer Group, Wisconsin package version 8.1, by Infobiogen, Villejuif) 및 UCSC 인간 게놈 데이터베이스를 사용하였다.
IGF-1, IGF-1R 및 AKT/PKB 유전자에 대해 공통적인 12개의 염기쌍(bp)(GGAGGAGGAGGG) 및 항-아폽토시스 bcl-2, bcl-XL 및 서바이빈 유전자에 대해 공통적인 10개의 염기쌍 서열(GAAGAAGAGG)의 올리고피리미딘-올리고퓨린 서열에 대한 사전 조사는 접근법의 실행 가능성을 보여주었다. 올리고피리미딘ㆍ올리고퓨린 서열의 선택은 상기 접근법에 대해 제한되지 않는데, 이는 상기 서열이 인간 게놈에서 과량존재하기 때문이며, 전체 유전자(조절 영역, 코딩 및 비코딩 영역)가 삼중 나선을 형성하는 올리고뉴클레오티드에 대한 잠재적인 표적이기 때문이다. 또한 도 2에 도시된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 암 특성의 획득 및 유지에 관계된 IGF1R 및 VEGF와 같이, 다양한 유전자 내에 존재하는 공통적인 서열을 인지한다(표 1).
또한, 토포이소머라제 억제제는 일반적으로 절단 부위 주변의 디뉴클레오티드에 한정되는, 특정 서열 특이성을 가진다는 것을 잊어서는 안된다. 사실, 본 발명자들은 삼중 나선 부위에 대한 접합체의 결합이 강한 절단을 유도하는 데 충분하지 않고, 삼중 나선 부위 근처의 억제제에 대한 특이적 부위의 존재가 토포이소머 라제에 의한 절단의 보충 및 유도에 대해 매우 바람직하다는 것을 발견하였다. 이 사실로부터 본 발명자들은 표적화된 서열이 올리고뉴클레오티드에 의해 인지된 부위 뿐 아니라 이 근처의 토포이소머라제 I 억제제의 부위를 바람직하게 포함하여, 접합체의 선택성을 증가시킨다는 것을 추론하였다.
마지막으로, 본 발명자들은 DNA 리간드(예, 올리고뉴클레오티드), 및 N-메틸-피롤 및 N-메틸 이미다졸의 폴리아미드에 대한 접근법을 확인하였지만, 원리는 다른 클래스의 리간드(예, 징크 핑거 펩티드)로 확장될 수 있다.
본 발명의 과제는 또한 다음과 같다:
ㆍ 상기 정의된 방법은, 접합체(특히 TFO (삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드)-토포이소머라제 억제제를 포함함)에 의한 절단이, 2∼100개, 바람직하게는 2∼30개의 퓨린을 함유하는, 더 효과적으로는 표적의 올리고피리미딘 가닥 상의 삼중체의 3' 측 토포이소머라제 I 억제제로 유도되는 절단 부위를 가진 상기 올리고피리미딘ㆍ올리고퓨린 표적 유전자 각각의 서열에 대해 유도되는 것을 또한 특징으로 한다.
ㆍ 상기 정의된 방법은, 토포이소머라제 I 억제제로 유도된 상기 절단 부위가 삼중 나선의 말단에서부터 1∼10개 뉴클레오티드로 위치하는 것을 또한 특징으로 한다.
ㆍ 상기 정의된 방법은, 상기 표적 유전자의 서열이 병리에 관계되는 유전자 상의 인간 게놈에 존재하는 단일 표적 서열, 또는 바이러스 또는 기생 동물의 유전자에만 존재하고 인간 게놈에는 부재하는 표적, 또는 병리의 유지 또는 발달에 관 계되는 유전자 그룹에 존재하는 서열인 것을 또한 특징으로 한다.
본 발명자는 또한 다음을 제안하고/하거나 보였다:
ㆍ 본 발명에 따른 방법에서 유용한 접합체는 세포 증식, 성장 인자 및 호르몬 수용체 신호화, 및 항-아폽토시스 유전자 그룹에서 작용할 수 있는 새로운 효과적인 항종양 물질이 된다.
ㆍ 토포이소머라제 I 억제제와 커플링된 상기 소홈 리간드는 효소에 의해 선택적으로 리간드의 결합 부위에 대한 절단을 또한 유도하고, 올리고뉴클레오티드-억제제 접합체로서 동일한 용도를 가진다.
참조 문헌
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Claims (41)

  1. 안정화된 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단에 의해 억제되는 유전자의 발현에 의해 발생하는 질병 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 하기 식 I의 화합물의 용도.
    식 I
    A-B-C
    (상기 식에서,
    A는 소정의 병리 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 DNA 서열 특이적 리간드이고;
    B는 A의 3' 말단에 결합되는 링커 암(linker arm)이며;
    C는 토포이소머라제 I 독임)
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 그 발현이 세포의 종양 상태의 발달 및 유지를 조절하는 유전자인 용도.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 IGF-1, IGF-1R, VEGF, BCL2로 구성되는 군에서 선택되는 유전자인 용도.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 감염성 미생물 또는 바이러스 유전자인 용 도.
  5. 제4항에 있어서, 상기 유전자는 HIV 또는 HCV 바이러스 유전자인 용도.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 대사 이상 질병(dismetabolic disease)에 관계되는 것인 용도.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 자가면역 질병에 관계되는 것인 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 토포이소머라제 I 독은 캄토테신, 레베카마이신, 소홈(minor groove) 리간드 및 벤즈이미다졸로 구성되는 군에서 선택되는 것인 용도.
  9. 제8항에 있어서, 상기 토포이소머라제 독은 캄토테신인 용도.
  10. 제9항에 있어서, 상기 캄토테신은 7-에틸-10-히드록시캄토테신 및 10-히드록시캄토테신으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 용도.
  11. 제9항에 있어서, 상기 캄토테신은 하기 화학식 1의 화합물, N1-산화물, 라세 미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물, 및 약학적 허용 염인 것인 용도.
    화학식 1
    Figure 112005051973688-PCT00005
    (상기 식에서,
    R1은 -C(R5)=N-(0)n-R4 기이고, 이 때 R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C2-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기이며, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로-알킬 기는 할로겐, 히드록시, 케토, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR6R7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임), 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, 페닐임) 기로부터 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있거나; 또는 R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬임)로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는 (C6-C10)아로일 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는 R4는 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는 R4는 글리코실 잔기이고; R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고; 동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시임)
  12. 제9항에 있어서, 상기 캄토테신은 하기 화학식 2의 화합물, N1-산화물, 라세미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물, 및 약학적 허용 염인 것인 용도.
    화학식 2
    Figure 112005051973688-PCT00006
    (상기 식에서,
    A는 포화 또는 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C10 시클로알킬-C1-C8 알킬이고;
    n과 m이 1일 경우, Y는 NR12R13 또는 N+R12R13R14(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R12, R13 및 R14는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬임)로 치환된 포화 또는 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬이거나, 또는 Y는 BCOOX(여기서, B는 아미노산의 잔기이고, X는 이용가능한 위치에서 C1-C4 알콕시, 할로겐, 니트로, 아미노, C1-C4 알킬 중에서 선택된 적어도 하나의 기로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬, 벤질 또는 페닐, H임)이거나, 또는
    n과 m이 모두 0일 경우, Y는 약학적 허용 산의 음이온을 가진 분자내 염(inner salt)의 형태 및 염의 형태의 4-트리메틸암모늄-3-히드록시부타노일이거나, 또는 Y는 상기 정의된 바와 같은 N+R12R13R14이고;
    R1은 수소 또는 -C(R5)=N-(0)p-R4(여기서 p는 숫자 0 또는 1임) 기이고, R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C1-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기이며, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황의 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로알킬 기는 선택적으로 할로겐, 히드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR6N7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임), 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬임) 기 중에서 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있거나; 또는 R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬임) 중에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C6-C10)아로일 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는 R4는 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는 R4는 글리코실 잔기이고; R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고; 동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시임)
  13. 제9항에 있어서, 상기 캄토테신은 하기 화학식 3 또는 4의 화합물, N1-산화물, 라세미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물 및 이의 약학적 허용 염인 용도.
    화학식 3 화학식 4
    Figure 112005051973688-PCT00007
    (상기 식에서,
    R1은 수소 또는 -C(R5)=N-(0)p-R4(여기서, p는 정수 0 또는 1임) 기이고, R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C2-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로 알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C5)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기이며, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로-알킬 기는 할로겐, 히드록시, C1-C8 알킬, C1-C9 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로 및 -NR6R7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임); 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬임) 기로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있거나; 또는
    R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C9 알킬임) 중에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C6-C10)아로일 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는
    R4는 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는
    R4는 글리코실 잔기이고;
    R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고;
    동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시이고;
    n은 1 또는 2이며,
    Z는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬 중에서 선택됨)
  14. 제9항에 있어서, 상기 캄토테신이 7-에틸-10-히드록시캄토테신 또는 10-히드록시캄토테신인 용도.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 삼중 나선-형성 올리고뉴클레오티드(TFO)인 용도.
  16. 제15항에 있어서, 상기 TFO는 리보핵산, 데옥시리보핵산, PNA, 펩티드 핵산, 2'O-알킬 리보핵산, 올리고포스포르아미데이트, LNA로 구성되는 군에서 선택되는 것인 용도.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 서열 특이적 리간드는 소홈 결합제(MGB)인 용도.
  18. 제17항에 있어서, 상기 MGB는 β-알라닌과 N-메틸피롤, N-메틸이미다졸 및 N-메틸-3-히드록시피롤의 폴리아미드로 구성되는 군에서 선택되는 것인 용도.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커 암은 길이가 1∼50, 바람직하게는 2∼30인, N 또는 O로 구성되는 군에서 선택된 헤테로원자 및 탄소 원자; 및 반응하여 포스포라미드 또는 아미드 결합, 또는 티오에스테르를 형성할 수 있는 말단 끝 부분(end terminal moieties)으로 형성되는 것인 용도.
  20. 제19항에 있어서, 상기 링커 암은 디아미노 알킬 및 글리콜로 구성되는 군에서 선택되는 것인 용도.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 질병 부위에 국소 주사로 투여하는 것인 용도.
  22. 제21항에 있어서, 상기 질병은 종양 또는 감염인 용도.
  23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 전신 경로로 투여하고, 상기 화합물은 형질감염(transfection) 벡터에 의해, 또는 단독으로 전달되는 것인 용도.
  24. 제20항에 있어서, 상기 형질감염 벡터는 나노입자, 리포솜, 양이온성 지질 및 양이온성 중합체로 구성되는 군에서 선택되는 것인 용도.
  25. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는 전신 경로로 투여하고, 화합물 C는 7-(2-아미노에톡시이미노메틸)캄토테신 및 7-(3-아미노프로폭시이미노메틸)캄토테신으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 용도.
  26. 하기 식 Ⅰ의 화합물, N1-산화물, 라세미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물 및 약학적 허용 염.
    식 Ⅰ
    A-B-C
    (상기 식에서,
    A는 소정의 병리 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 DNA 서열 특이적 리간드이고;
    B는 A의 3' 말단에 결합되는 링커 암이며;
    C는 하기 화학식 1의 캄토테신 유도체임)
    화학식 1
    Figure 112005051973688-PCT00008
    (상기 식에서,
    R1은 -C(R5)=N-(0)n-R4 기이고, 이 때 R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C2-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기이며, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로-알킬 기는 할로겐, 히드록시, 케토, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR6R7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임), 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, 페닐임) 기로부터 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있거나; 또는 R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬임)로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환되는 (C6-C10)아로일 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는 R4는 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는 R4는 글리코실 잔기이고; R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고; 동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시임)
  27. 제26항에 있어서, R1은 2-아미노에톡시이미노메틸 및 3-아미노프로폭시이미노메틸로 구성되는 군에서 선택되고, R2 및 R3는 수소인 화합물.
  28. 하기 식 Ⅰ의 화합물, N1-산화물, 라세미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질 체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물 및 이의 약학적 허용 염.
    식 Ⅰ
    A-B-C
    (상기 식에서,
    A는 소정의 병리 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 DNA 서열 특이적 리간드이고;
    B는 A의 3' 말단에 결합되는 링커암이며;
    C는 하기 화학식 2의 캄토테신 유도체임)
    화학식 2
    Figure 112005051973688-PCT00009
    (상기 식에서,
    A는 포화 또는 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C3-C10 시클로알킬-C1-C8 알킬이고;
    n과 m이 1일 경우, Y는 NR12R13 또는 N+R12R13R14(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R12, R13 및 R14는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬임)로 치환된 포화 또는 불포화된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬이거나, 또는 Y는 BCOOX(여기서, B는 아미노산의 잔기이고, X는 이용가능한 위치에서 C1-C4 알콕시, 할로겐, 니트로, 아미노, C1-C4 알킬 중에서 선택된 적어도 하나의 기로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬, 벤질 또는 페닐, H임)이거나, 또는
    n과 m이 모두 0일 경우, Y는 약학적 허용 산의 음이온을 가진 분자내 염의 형태 및 염의 형태의 4-트리메틸암모늄-3-히드록시부타노일이거나, 또는 Y는 상기 정의된 바와 같은 N+R12R13R14이고;
    R1은 수소 또는 -C(R5)=N-(0)p-R4(여기서 p는 숫자 0 또는 1임) 기이고, R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C1-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기로, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황의 원자로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로알킬 기는 선택적으로 할로겐, 히드록시, C1-C8 알킬, C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR6N7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임), 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬임) 기 중에서 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있거나; 또는 R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬임) 중에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C6-C10)아로일 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는 R4는 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는 R4는 글리코실 잔기이고; R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고; 동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록실, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시임)
  29. 하기 식 Ⅰ의 화합물, N1-산화물, 라세미 혼합물, 이의 개별 거울상이성질체, 이의 개별 부분입체이성질체, 이의 혼합물 및 이의 약학적 허용 염.
    식 Ⅰ
    A-B-C
    (상기 식에서,
    A는 소정의 병리 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 DNA 서열 특이적 리간드이고;
    B는 A의 3' 말단에 결합되는 링커 암이며;
    C는 하기 화학식 3 또는 4의 캄토테신 유도체임)
    화학식 3 화학식 4
    Figure 112005051973688-PCT00010
    (상기 식에서,
    R1은 수소 또는 -C(R5)=N-(0)p-R4(여기서, p는 정수 0 또는 1임) 기이고, R4는 수소, 또는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬 또는 C2-C8 알케닐 기, 또는 C3-C10 시클로알킬기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C5)알킬기, 또는 C6-C14 아릴기, 또는 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬기, 또는 헤테로시클릭기 또는 직쇄 또는 분지쇄 헤테로시클로-(C1-C8)알킬기이며, 상기 헤테로시클릭기는 (C1-C8)알킬기로 선택적으로 치환된 질소 원자, 및/또는 산소 및/또는 황 원자로부터 선택 된 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하고; 상기 알킬, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릭 또는 헤테로시클로-알킬 기는 할로겐, 히드록시, C1-C8 알킬, C1-C9 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로 및 -NR6R7(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R6 및 R7은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬, -COOH 기 또는 이의 약학적 허용 에스테르 중 하나임); 또는 -CONR8R9(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R8 및 R9는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 (C1-C8)알킬임) 기로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환될 수 있거나; 또는
    R4는 할로겐, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시, 페닐, 시아노, 니트로, -NR10R11(여기서, 동일하거나 상이할 수 있는 R10 및 R11은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C9 알킬임) 중에서 선택된 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C6-C10)아로일 또는 (C6-C10)아릴설포닐 잔기이거나; 또는
    R4는 폴리아미노알킬 잔기이거나; 또는
    R4는 글리코실 잔기이고;
    R5는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알킬, 직쇄 또는 분지쇄 C2-C8 알케닐, C3-C10 시클로알킬, 직쇄 또는 분지쇄 (C3-C10)시클로알킬-(C1-C8)알킬, C6-C14 아릴, 직쇄 또는 분지쇄 (C6-C14)아릴-(C1-C8)알킬이고;
    동일하거나 상이할 수 있는 R2 및 R3는 수소, 히드록시, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C8 알콕시이고;
    n은 1 또는 2이며,
    Z는 수소, 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4 알킬 중에서 선택됨)
  30. 하기 식 Ⅰ의 화합물.
    식 Ⅰ
    A-B-C
    (상기 식에서,
    A는 소정의 병리 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 DNA 서열 특이적 리간드이고;
    B는 A의 3' 말단에 결합되는 링커 암이며;
    C는 7-에틸-10-히드록시캄토테신 및 10-히드록시캄토테신, 숙시닐-발릴-20-0-(7-테르부톡시이미노메틸캄토테신)(ST2677), 20S-7-아미노에틸이미노메틸캄토테신(ST1578), 20S-7-아미노프로필이미노메틸캄토테신(ST2541)으로 구성되는 군에서 선택된 캄토테신 유도체임)
  31. 적어도 하나의 약학적 허용 비히클 및/또는 부형제와의 혼합물로 제1항에 기재된 바와 같은 화합물을 포함하는 약학 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 주사용으로 적합한 것인 약학 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 형질감염 벡터를 더 포함하는 약학 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 형질감염 벡터는 나노입자, 리포솜, 양이온성 지질 및 양이온성 중합체로 구성되는 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  35. 소정의 병리 단백질, 특히 종양의 발달 및 유지에 관련된 단백질, 또는 바이러스성 및 병원성 단백질, 또는 대사 이상 또는 자가면역 질병에 관련된 단백질을 코딩하는 몇몇 표적 유전자의 발현을 동시에 억제하기 위한 시험관 내 방법으로서,
    (i) 상기 표적 유전자에 대해 공통적인 서열을 동시에, 또한 특이적으로 인지할 수 있는 적어도 하나의 DNA 서열 특이적 리간드에 대해 적어도 하나의 토포이소머라제 억제제를 접합시켜, 적어도 하나의 토포이소머라제 I 억제제의 작용을 상기 유전자에 특이적인 부위 쪽으로 유도하는 단계,
    (ii) 상기 접합체의 상기 리간드에 의해 게놈 내 상기 유전자를 인지하여 상기 표적에 대한 상기 리간드의 결합을 형성하는 단계,
    (iii) 토포이소머라제 I-매개 DNA 절단을 유도하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 단계
    를 포함하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 표적 유전자의 서열은 그 부근에 토포이소머라제 억제제 위치를 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 적어도 하나의 토포이소머라제 억제제는 인돌로카르바졸 및 이의 유도체와 같은 삽입성 물질(intercalating agent), 캄토테신 및 이의 유도체와 같은 비-삽입성 물질, 벤즈이미다졸 및 이의 유도체와 같은 소홈 리간드를 포함하는 군에서 선택되는 것인 방법.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 리간드는 삼중 나선을 형성하는 경우 리보핵산, 데옥시리보핵산, PNA, 펩티드 핵산, 2'O-알킬 리보핵산, 올리고포스포라미데이트, LNA로 구성되는 군에서 선택되는 TFO이고, 소홈에 결합하는 경우 β-알라닌과 N-메틸피롤, N-메틸이미다졸 및 N-메틸-3-히드록시피롤의 폴리아미드 중에서 선택되는 MGB인 것인 방법.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 삼중 나선 형성 올리고뉴클레오티드-토포이소머라제 억제제를 포함하는 접합체에 의한 절단은 2∼100개, 바람직하게는 10∼30개의 퓨린을 함유하는 상기 표적 유전자의 각 올리고피리미딘ㆍ올리고퓨린 서열에 대해 유도되며, 토포이소머라제 I 억제제에 의해 유도되는 절단 부위는 표적의 올리고피리미딘 가닥 상의 삼중체의 3' 측에 위치하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 토포이소머라제 억제제에 의해 유도된 상기 절단 부위는 삼중 나선의 말단으로부터 3∼8개 뉴클레오티드 내측에 위치하는 것인 방법.
  41. 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 유전자의 서열은 유전자 그룹, 특히 아폽토시스(apoptosis) 발달 및/또는 억제 신호의 전달에 관련되는 유전자 그룹에 존재하는 것인 방법.
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