KR20060002639A

KR20060002639A - 혈액응고 억제성분이 제거된 애엽 추출물, 이의 제조방법및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20060002639A
Application number: KR1020040051766A
Authority: KR
Inventors: 김종오; 오태영; 안병옥; 김정훈; 권종원; 김원배; 최설민; 강경구
Original assignee: 동아제약주식회사
Priority date: 2004-07-03
Filing date: 2004-07-03
Publication date: 2006-01-09
Also published as: KR101000951B1; WO2006004358A1

Abstract

본 발명은 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 함량의 손실없이 혈액응고 억제작용을 나타내는 유해성분만을 선택적으로 제거한 애엽(Artemisia asiatica, A. mongolica, A. princeps, A. argyi) 추출물, 상기 애엽 추출물의 제조방법, 상기 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 상기 애엽 추출물의 구성 성분 중 하나인 아테미카핀 C를 유효성분으로 하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학 조성물 그리고 상기 애엽 추출물, 계면 활성제 및 공용매로 이루어진 애엽 추출물의 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 애엽 추출물은 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C의 함량 손실 없이 혈액응고 억제작용을 나타내는 유해성분만을 선택적으로 제거하였고, 본 발명에 따른 애엽 추출물의 경구용 조성물 및 이를 포함하는 경구용 제제는 난용성 약물인 애엽 추출물의 용해도 및 용출율을 상승시킴으로써 생체 이용율을 현저히 증가시킬 수 있도록 하였다. 또한, 애엽 추출물 중의 아테미카핀 C는 위궤양 병변 억제효과와 함께 세포 보호작용을 나타내는 프로스타글란딘의 생합성을 촉진하여 위염 및 소화성궤양에 대한 우수한 치료효과를 나타낸다.

애엽 추출물

Description

혈액응고 억제성분이 제거된 애엽 추출물, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물 {DICOUMAROL-REMOVED-EXTRACT OF ARTEMISIA, PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS THEREOF}

도 1은 애엽을 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출한 후 유해성분을 제거하는 공정을 거치지 않은 액체크로마토그래피법으로 유파틸린, 디쿠마롤 및 아테미카핀 C의 존재를 확인한 것이고,

도 2는 애엽을 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출한 후 유해성분을 제거하는 공정을 거친 다음 액체크로마토그래피법으로 유파틸린, 디쿠마롤 및 아테미카핀 C의 존재를 확인한 것이고,

도 3은 실험예 6의 pH=1.2 완충 용액에서 애엽 추출물 60mg을 함유하는 본 발명의 연질 캅셀 제제(시험제제) 및 비교예에 따른 제제(비교제제)를 교반한 후 시간에 따른 용출율을 비교한 것이고,

도 4는 실험예 6의 pH=6.8 완충 용액에서 애엽 추출물 60mg을 함유하는 본 발명의 연질 캅셀 제제(시험제제) 및 비교예에 따른 제제(비교제제)를 교반한 후 시간에 따른 용출율을 비교한 것이고,

도 5는 실험예 7의 유파틸린 20mg을 함유하는 본 발명의 연질 캅셀 제제(시 험제제) 및 비교예로부터 제조된 제제(비교제제)를 쥐에게 경구 투여한 후 시간에 따른 혈중 농도를 비교한 것이다.

본 발명은 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C 함량의 손실 없이 혈액응고 억제작용을 나타내는 유해성분만을 선택적으로 제거한 애엽(Artemisia asiatica, A. mongolica, A. princeps, A. argyi) 추출물, 상기 애엽 추출물의 제조방법, 상기 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 상기 애엽 추출물의 구성 성분 중 하나인 아테미카핀 C를 유효성분으로 하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학 조성물 그리고 상기 애엽 추출물, 계면 활성제 및 공용매로 이루어진 애엽 추출물의 약학적 조성물에 관한 것이다.

위염과 위궤양은 소화기 질환 중에서 가장 빈도수 높은 질병으로서, 위장관 점막이 위산에 의해 소화되어 궤양을 형성하는 상태를 말하며, 인구의 약 10% 가량이 일생 중 한번은 위염이나 위궤양을 경험한다는 보고가 있다. 위벽은 점막층, 점막하층, 근육층, 장막으로 구성되어 있는데, 위염은 점막이 손상된 상태이고, 위궤양은 점막하층 또는 근육층까지 손상된 경우를 말한다. 위염 및 위궤양은 발생빈도가 높은 것에 비해 발생원인은 정확히 밝혀져 있지 않으며, 공격인자와 방어인 자의 불균형, 즉 공격인자의 증가나 방어인자의 약화에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 공격인자의 증가 요인으로는 산, 펩신분비의 증가 등을 들 수가 있고 방어인자의 약화 요인으로는 위점막의 구조나 형태의 결손, 점액분비의 감소, 중탄산 이온 분비의 감소, 프로스타글란딘 생산의 저하 등을 들 수 있으며, 최근 헬리코박터 피롤리(Helicobacter pylori)의 감염에 의해서도 위궤양이 발생된다는 보고가 있다.

이중 위궤양 발생의 주요원인은 위산의 과다분비인데, 위산은 위점막에서 분비되는 고농도의 염산으로서, 펩신을 활성화시켜 단백질을 분해시킬 뿐만 아니라 손상된 위벽에도 치명적 작용을 한다. 위산은 위벽세포에서 분비되며, 위벽세포의 막에는 위산분비에 관여하는 3가지 수용체(receptor)가 있다. 이 수용체들은 히스타민(histamine), 개스트린(gastrin) 및 아세틸콜린(acetylcholine)의 자극에 반응하여 위산을 분비한다. 현재 사용되는 위염 및 위궤양의 치료제로는, 위산의 분비량에는 영향을 주지 않고 이미 생성된 위산을 중화시키는 제산제, 위산의 분비를 억제하는 약제, 프로스타글란딘의 분비촉진제, 위벽코팅제 등 방어인자를 증강시키는 약제들이 많다. 특히, 최근에는 위산분비를 억제시키는 방법으로 위산분비를 촉진하는 히스타민의 작용을 억제하는 히스타민-H2 길항제, 부교감신경의 흥분을 억제하여 위산분비를 감소시키는 항콜린제, 또는 개스트린 길항제 등이 사용되고 있으며, 특히 히스타민-H2 길항제인 라니티딘(ranitidine), 시메티딘(cimetidine), 파모티딘(famotidine) 그리고 H+/K+ ATPase인 오메프라졸(omeprazole) 등이 많이 사용되고 있다.

그러나, 이들 약제를 사용하는 경우 재발율이 높으며, 장기 복용해야 하는 문제점이 있다. 실제로 6주 정도 복용하면 궤양은 치료되나 이들 환자의 대부분이 1년 정도 지나면 재발한다고 보고 되어 있다. 또한, 라니티딘, 시메티딘, 파모티딘을 위궤양 치료를 위해 장기 복용할 경우에는 위종양을 유발하고, 오메프라졸을 장기 복용할 경우에는 신경내분비 세포종양(neuroendocrine cell tumor)을 유발한다는 보고가 계속되고 있어서, 인체에 안전한 위염 및 위궤양 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다(DN & P 4(5), 1991. 6).

그러나, 위염 및 위궤양은 여러가지 복합적 원인에 의해 발생되며, 아직까지도 발생원인이 명확하게 규명되지 않은 상태에 있고, 따라서 그 치료방법도 절대적인 방법이 아직 없는 실정이다.

한편, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease)은 특발성의 재발율이 높은 만성 난치성 질환으로서 궤양성 대장염과 크론씨병을 포함한다. 궤양성 대장염과 크론씨병은 발병기전, 면역학적 배경과 병리학적 소견에 있어 별개의 질환으로 인정되나, 두 질환 모두 20대의 청년층에서 호발하며, 피부염, 안염, 관절염, 췌장염, 담관염 등의 합병증과 영양장해를 나타내고, 무엇보다도 감별진단이 어려운 까닭에 염증성 장질환으로 통칭하고 있다. 염증성 장질환은 비록 흔한 질병은 아니지만 만성적 경과를 나타낸다는 점과 장기간의 치료를 요하며, 가장 생산성이 높은 젊은 환자에서 유병율이 높고 최근 들어 환자수가 급격히 증가되고 있다는 점에서 주목받고 있는 질환이다.

현재까지 염증성 장질환은 원인이 확실히 밝혀지지 않은 상태이나 병태생리에 있어 산소자유기(oxygen free radical)의 역할이 중요한 것으로 알려져 있으며, 이러한 사실은 결장 염증부위에서의 호중구의 산소자유기가 과도하게 생산된다는 것을 화학발광에 의해 확인할 수 있고, 대표적 항산화효소인 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase)에 의해 염증이 개선된다는 연구결과에 의해 뒷받침되고 있다. 염증성 장질환은 병소의 정도와 위치에 따라 치료방법이 달라져야 한다는 어려움 때문에 아직까지 절대적인 치료법이 없으며, 상당수의 환자에서 약물요법에도 불구하고 수술이 요구되고 있다. 따라서 현재 염증성 장질환 치료의 목표는 질병을 경감시키고, 재발을 억제하며, 임상증상과 합병증을 조절하는 데에 그치고 있다.

약물요법으로는 아미노살리실산염(aminosalicylates), 부신피질호르몬제제(corticosteroid) 등의 항염증제, 아자치오퓨린(azathiopurine), 사이클로스포린 A(cyclosporin A) 등 면역억제제 및 메트로니다졸(metronidazole) 등의 항생제가 사용되고 있으나 만족스러운 결과를 얻지 못하고 있는 실정이고, 더욱이 대부분의 약제가 부작용을 나타내고 있어 장기간 사용이 쉽지 않은 단점을 갖고 있다. 예를 들면, 염증성 장질환에 가장 널리 사용되는 메살라진(mesalazine)의 경우 낮은 농도에서도 태반을 통한 태아로의 이행율이 높아 임산부에서의 사용이 제한되고 있으며, 전신적인 과민증과 간질성 신염이 부작용으로 보고 되어 있다. 간질성 신염의 경우 약 1%의 환자에서 발생하나 혈중 크레아티니딘 수치(creatinidine value)의 정기적 검사만이 이를 발견할 수 있으며, 신장장해 발생 후 18개월 이상 메살라진을 복용하면 신장기능의 영구적 상실을 초래하므로 정기적인 혈액검사를 통한 신장기능검사가 요구된다. 또한, 프레드니존(prednisone)과 프레드니솔론(prednisolone) 등 부신피질호르몬제제(corticosteroid)는 단기적인 완화요법으로 유용하나 장기사용시 전신적으로 심한 부작용이 나타나므로 단기요법에만 이용되고 있다. 이러한 문제점 때문에 염증성 장질환에 대해 유효성과 안전성이 높은 신의약품 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한편, 애엽은 국화과(Compositae)에 속하는 다년생 초본식물로서, 독특한 향기와 맛을 갖고 있다. 어린잎은 식용으로서 쑥떡 등에 이용되어 왔고, 한방에서는 자궁을 따스하게 하여 자궁출혈, 임신 중의 출혈 등에 효과가 있다고 알려져 있으며, 강장보혈, 부인병, 설사치료제로 사용되어 왔다(동의보감).

애엽의 약리작용을 살펴보면, 애엽 추출물은 혈액응고시간을 연장시키며(약학회지 28(2): 69-77, 1984), 애엽으로부터 추출한 플라본(flavone)은 항암활성, 혈소판응집 억제작용(Zhongguo Zhongyao Zazhi, 17(6): 353, 1992), 항진균활성이 있으며, 항보체작용을 하여 숙주의 방어체계를 도와 알러지나 염증에 효과가 있고(Chem. Pharm. Bull. 33(5): 2028-2034, 1985), 혈압강하작용과 진정작용을 한다고 보고 된 바 있다.

그 외에도 애엽으로부터 유파틸린(eupatilin)이 분리 및 규명되었으며, 이에 대해 항종양제(WO 8803805), 건선치료제(WO 8803800), 알러지치료제(JP 84155314) 및 아구창(aphthous ulcer)치료제(CA 2065496 AA) 등의 용도가 특허로 출원된 바 있다. 한편, 애엽의 동속식물인 인진호(茵蔯蒿, Artemisia capillaris)의 대장염 치료효과가 최근 보고 된 바 있으나(대한소화기학회지 28: 224, 1996) 인진호는 본 발명에서의 애엽과는 형태학적 및 약리학적으로 큰 차이를 보이며, 습열황달의 작용이 있어 예로부터 황달 치료제로 사용되어 온 생약이다(본초학 366, 1995, 대한약사회, 서울, 대한민국).

애엽속의 약리성분으로는 이소쿠마린(isocoumarin), 쿠마린(coumarin), 다이테르펜락톤(diterpenlactone), 플라보노이드(flavonoid), 펠란드렌(phellandrene), 큐프롤(cuprol), 카디넨(cardinene) 등이 밝혀져 있다(Plants Med. 60, 437, 1994; J. Nat. Prod. 44(5), 586-7, 1981; Herba Hungarica, 1985, Tom. 24 No. 2-3).

쑥속(Artemisia)의 여러 가지 유효성분 중 쿠마린류는 과다섭취시 위장관을 포함한 피부, 점막 등의 출혈을 야기할 수 있으며(Thrombosis and haemostasis, 66(1), 153-159, 1991), 간독성이 나타날 수 있다(Toxicology, 88(1-3), 113-125, 1994; International Journal of Experimental Pathology, 77(2), 79-82, 1996).

상기 쿠마린류는 벤조피렌(benzopyrene) 유도체로서, 자연계의 식물, 균류 및 박테리아 등에서 이미 약 1300여 종류가 보고 되어 있으며, 애엽에도 다양한 쿠마린류가 함유되어 있다. 디쿠마롤(dicoumarol)을 비롯한 이소쿠마린(isocoumarin), 쿠마린(coumarin), 드라쿤쿨린(dracunculin), 스코폴레틴(scopoletin), 이소프락시딘(isofraxidin), 프락시딘(fraxidin), 다프노레틴(daphnoretin), 헤르니아린(herniarine), 스코파론(scoparone) 등의 쿠 마린류가 함유되어 있다고 보고 되어 있다.

디쿠마롤은 간장내에서의 비타민 K 의존적 항응고 요소인 II, VII, IX 및 X의 합성을 저해하며, 개에서 APTT(activated partial thromboplastin time)와 PT(prothrombin time)을 연장시키며, 혈소판의 수를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 디쿠마롤은 1985년 Levine에 의하여 썩은 전동싸리(spoiled sweet clover)에서 분리된 이후, 미나리과 식물(Conioselinum Univittatum)에도 0.44mg/이 정도 함유되어 있음이 밝혀졌다. 또한, 같은 연구자들에 의하여 태국에서 판매중인 알코올성 생약 추출액에도 종류에 따라 0.58, 1.86 및 6.00mg/dl 정도의 디쿠마롤이 함유되어 있으며, 주로 2주에서 2개월 사이의 영아에서 발병하는 선천성 비타민 K 결핍증(Idiopathic vitamin K deficiency)의 원인이 이를 복용한 산모의 모유에 기인할 가능성을 제기한 바 있다. 미국에서는 쿠마린의 랫트에 대한 간독성 실험결과를 근거로 하여 1954년 식품의 향신료로서 사용을 중지시켰으며, 뒤이어 1965년 영국에서도 쿠마린의 사용이 중지되었다.

지금까지 애엽을 의약품으로 이용할 때 애엽에 함유되어 있는 상기 혈액응고 억제성분에 의하여 나타날 수 있는 부작용에 대한 충분한 연구가 없었으며, 따라서 이들 혈액응고 억제성분을 선택적으로 제거할 수 있는 방법에 대한 연구도 없었다.

특히, 애엽 추출물은 예로부터 한국, 중국, 일본 등에서 달이거나 환제, 산제 또는 찧은 즙의 형태로 사용되어 왔으나, 애엽 추출물에 있어서 유효성분이나 혈액응고 억제성분에 대한 체계적인 분석이 이루어지지 않았으며, 복용시 함유된 함량 또한 그다지 높지 않은 것이 사실이었다. 그러나, 추출방법들이 발달하면서 유효성분뿐만 아니라 상기 혈액응고 억제성분까지도 고농도로 함유하게 되어 애엽 추출물을 함유한 의약품 등을 장기간 복용할 경우 부작용이 나타날 수 있는 가능성이 증대되고 있다.

더구나, 위염, 위궤양 및 염증성 장질환은 질환의 특성상 출혈을 수반하기 쉽기 때문에 애엽 추출물의 혈액 응고 억제작용은 이들 질환에 대한 애엽 추출물의 치료효과를 현저히 감소시킬 수 있고, 위염, 위궤양 및 염증성 장질환 등과 같은 만성질환에 사용시 장기간 약물투여를 필요로 하므로 애엽 추출물 치료제의 상기 부작용을 최소화하는 것이 애엽 추출물의 약리효과 못지않게 중요하다고 할 수 있다. 따라서, 애엽 추출물의 유효성분은 그대로 유지하면서 혈액응고 억제성분만을 선택적으로 제거하는 애엽 추출 방법의 공정개발이 유효성과 안정성이 높은 의약품 개발 측면에서 절실히 요구되고 있다.

또한, 애엽 추출물은 난용성이어서 생체에 투여되었을 때 체내로 흡수되는 과정에서 소화액에서의 용해도와 용출 속도가 낮고 약물 흡수가 지연되므로 생체 이용율이 낮아진다는 단점이 있다. 따라서 애엽 추출물을 포함한 난용성 약물의 가용화 또는 용출 속도를 향상시키기 위한 다양한 제제화 수단이 강구되어야 한다.

한편, 현재까지 알려진 Artemisia속의 쑥 및 그 추출물에 함유된 성분으로는 스코폴레틴 (scopletin), 세사민(sesamine), 유파폴린(eupafolin), 마트리카린 (matricarin), 베타시토스테롤(β-sitosterol), 알파아밀린(α-amyrin), 캐필린(capillin), 캐필라린(capillarin), 모노터페노이드류(monoterpenoids), 이소스코폴레틴(isoscopoletin) 아테필린 A, C(artepillin A, C), 아로마틱 화합물류(aromatic compounds) 등 무수히 많으나 개별 성분의 약리학적 활성에 대해서는 아직 제대로 밝혀져 있지 않은 실정이다.

쑥 추출물에는 현재까지 밝혀진 성분 이외에 아직도 미지의 여러가지 성분이 함유되어 있으며 이들 중 일부 성분은 인체에 유효한 약리작용을 나타낸다. 그러나 현재까지는 물이나 에탄올 및 기타 다양한 용매를 이용하여 추출한 쑥 추출물 자체를 의학적 용도로 이용하려는 시도가 있었을 뿐이다. 본 발명자들은 다양한 실험을 실시한 결과 쑥 추출은 위염 및 소화성궤양에 치료효과가 있으며, 중량기준으로 계산시 정제된 유파틸린이나 자세오시딘을 사용하는 경우보다 더 강력한 치료효과를 나타내는 것을 확인하여 아직 밝혀지지 않은 미지 성분들이 유파틸린이나 자세오시딘과 상승작용을 나타내는 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명자들은 애엽 추출물을 위장관 질환 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제로 사용하는데 있어서 그 치료효과를 극대화하고 부작용을 최소화하기 위해 연구를 계속한 결과, 상기 애엽 추출물의 성분 중 아테미카핀 C가 위염 및 소화성궤양의 치유에 대하여 유파틸린이나 자세오시딘과 함께 우수한 치료효과를 나타냄을 알아내고, 애엽 추출물에서 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C 함량의 손실 없이 위장관 질환 또는 염증성 장질환에 치명적인 디쿠마롤만을 선택적으로 제거하였으며, 상기 애엽 추출물과 계면 활성제 및 공용매로 이루어진 약학적 조성물을 통하여 난용성인 애엽 추출물의 가용화 또는 용출 속도를 개선함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C를 함유하고, 혈액응고 억제작용을 나타내는 유해성분만이 선택적으로 제거된 애엽(Artemisia asiatica, A. mongolica, A. princeps, A. argyi) 추출물 및 상기 애엽 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 애엽 추출물의 유효성분 중 하나인 아테미카핀 C를 함유하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 난용성 약물인 애엽 추출물의 용해도 및 용출율을 상승시킴으로써 생체 이용율을 현저히 증가시키기 위하여 애엽 추출물, 계면활성제 및 공용매로 이루어진 약학적 조성물 및 이를 포함하는 경구용 제제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C를 함유하고, 혈액응고 억제성분만이 선택적으로 제거된 애엽(Artemisia asiatica, A. mongolica, A. princeps, A. argyi) 추출물을 제공한다. 특히, 본 발명에서는 혈액응고 억제성분인 디쿠마롤을 선택적으로 제거한 애엽 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 애엽 추출물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 이를 포함하는 경구용 제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 애엽 추출물은 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출한 애엽 추출물에서 위장관 질환 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료에 유효한 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C는 함유하고, 위장관 질환 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료에 유해한 혈액응고 억제성분을 제거한 것이다. 애엽을 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출하여 얻은 애엽 추출물에는 여러가지 약리성분이 있으며, 대표적인 약리성분은 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C가 함유되어 있고, 대표적인 혈액응고 억제성분으로는 디쿠마롤이 함유되어 있다(표 1).

[표 1]

애엽의 알코올 또는 알코올 수용액 추출물에서 성분함량

	유파틸린	자세오시딘	아테미카핀 C	디쿠마롤
실시예 1	0.449%	0.277%	0.067%	0.004%
실시예 2	0.412%	0.225%	0.062%	0.004%
실시예 3	0.443%	0.252%	0.066%	0.004%
실시예 4	0.734%	0.513%	0.110%	0.007%
실시예 5	0.823%	0.493%	0.123%	0.006%
실시예 6	0.896%	0.487%	0.134%	0.007%
실시예 7	1.010%	0.640%	0.151%	0.008%
실시예 8	0.994%	0.565%	0.149%	0.009%
실시예 9	0.987%	0.534%	0.148%	0.008%
실시예 10	1.284%	0.649%	0.192%	0.009%
실시예 11	1.129%	0.638%	0.169%	0.008%
실시예 12	0.978%	0.541%	0.146%	0.008%

그러나, 본 발명의 추출방법에 의하여 얻어진 애엽 추출물은 유파틸린 및 자 세오시딘의 함량에는 변화가 없고, 유해성분인 디쿠마롤만이 제거되어 있음을 알 수 있다(표 2).

[표 2]

	유파틸린	자세오시딘	아테미카핀 C	디쿠마롤
실시예 16	0.441%	0.269%	0.063%	0%
실시예 17	0.410%	0.219%	0.057%	0%
실시예 18	0.437%	0.246%	0.062%	0%
실시예 19	0.729%	0.509%	0.107%	0%
실시예 20	0.818%	0.487%	0.118%	0%
실시예 21	0.887%	0.473%	0.129%	0%
실시예 22	0.998%	0.613%	0.146%	0%
실시예 23	0.983%	0.541%	0.143%	0%
실시예 24	0.973%	0.523%	0.145%	0%
실시예 25	1.236%	0.621%	0.188%	0%
실시예 26	1.121%	0.629%	0.166%	0%
실시예 27	0.967%	0.537%	0.141%	0%

또한, 본 발명은 상기 유해성분이 제거된 애엽 추출물의 제조방법을 제공한다.

상세하게는, 본 발명은

1) 애엽 잎을 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출하는 단계(단계 1);

2) 상기 단계 1에서 얻어진 추출물에 알칼리 용액을 첨가하고 80℃에서 1시간 이상 반응시키는 단계(단계 2);

3) 상기 단계 2에서 얻어진 추출물에 산성 용액을 첨가하여 중화시키는 단계 (단계 3);및

4) 상기 단계 3에서 얻어진 추출물을 감압농축한 후 동결 건조하는 단계(단계 4)를 포함하는 애엽 추출물의 제조방법을 제공한다.

단계 1에서는 건조된 애엽 잎을 상온에서 알코올 또는 알코올 수용액으로 10 내지 36시간 동안 1 내지 2회 냉침추출, 3 내지 8시간 동안 초음파 추출 또는 4 내지 10시간 동안 2 내지 3회 환류 추출한 다음 건조하여 유파틸린과 자세오시딘을 고농도로 함유하는 애엽 추출물을 제조한다. 이때, 상기 알코올 또는 알코올 수용액은 10 내지 100%의 에틸알코올(ethyl alcohol), 10 내지 100%의 메틸알코올(methyl alcohol)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 특히 70% 내지 100%의 에틸알코올인 것이 바람직하다.

단계 2에서는 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10 내지 11로 조절한다. 이후 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시켜 유파틸린 및 자세오시딘을 고농도로 함유하며 유해성분인 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물을 제조한다.

단계 3에서는 염산, 구연산 및 사과산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상을 첨가하여 애엽 추출물을 pH 6.5 내지 7.5로 중화시킨다.

마지막으로 단계 4에서는 모든 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분의 의약품 원료를 제조한다.

본 발명의 애엽 추출물의 제조방법에 의하여 디쿠마롤(화학식 4)의 카르복실기(Carboxyl group, -COOH)가 상기와 같은 반응공정에 의하여 가수분해(decarboxylative hydrolysis)되지만, 유파틸린(화학식 1) 및 자세오시딘(화학식 2)에는 카르복실기가 존재하지 않으며 아테미카핀 C(화학식 3)은 상기의 반응조건에서는 카르복실기의 가수분해에 의한 불활성화 반응이 일어나지 않는다. 따라서, 본 발명의 애엽 추출물의 제조방법은 애엽 추출물 중 유효성분인 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C 함량의 손실없이 유해성분인 디쿠마롤만 선택적으로 제거할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 애엽 추출물의 성분 중 하나인 아테미카핀 C를 함유하는 유효성분으로 하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 아테미카핀 C는 정제, 과립, 캡슐, 분말, 시럽, 연고, 좌제 및 피하, 근육, 정맥 또는 점적 주사제 등의 일반적인 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있으며, 1일 10∼1000mg을 1회 내지 수회에 나누어 복용할 수 있다.

본 발명의 아테미카핀 C의 위염 및 소화성 궤양에 대한 치료효과를 수침· 구속 스트레스 위궤양 모델, 염산-에탄올(HCl-EtOH) 위염 모델, 인도메타신 위궤양 모델을 이용하여 확인한 결과, 위궤양 병변 억제효과와 함께 프로스타글란딘 생합성을 촉진하여 위염 및 소화성 궤양에 대한 우수한 치료효과가 나타났다.

또한, 본 발명은 상기 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 위장질환 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 위장관 질환 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료제에 적합하다. 상기 위장관 질환은 위염 또는 위궤양인 것이 바람직하다. 상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염 또는 크론씨병인 것이 바람직하다.

본 발명의 유해성분이 제거된 애엽 추출물의 위장관 질환에 관한 효과를 검 토하기 위해 초산 유발 위병변의 보호 작용을 검토한 결과, 본 발명의 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 대조군에 비하여 유의성 있는 위병변 보호작용을 나타내었다.

또, 본 발명의 유해성분이 제거된 애엽 추출물의 염증성 장질환에 관한 효과를 검토하기 위해 트리니트로벤젠 설폰산(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)으로 유발된 염증성 장질환의 보호작용을 검토한 결과, 본 발명의 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 대조군에 비하여 유의성 있는 염증성 장질환 보호작용을 나타내었다.

특히, 본 발명의 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 디쿠마롤이 제거되지 않은 애엽 추출물과 유사한 위장관질환 또는 염증성 장질환에 관한 보호작용을 나타낸 반면, 디쿠마롤이 제거되지 않은 애엽 추출물에 비하여 장기복용시 혈액응고시간의 연장을 통한 부작용의 발생가능성이 훨씬 감소하였다.

본 발명의 애엽 추출물은 위장 질환, 위염 및 위궤양 치료에 탁월한 효과를 가지고 있고, 정제, 과립, 캡슐, 분말, 시럽, 연고, 좌제 및 피하, 근육, 정맥 또는 점적 주사제 등의 일반적인 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있으며, 1일 10∼1000mg을 1회 내지 수회에 나누어 복용할 수 있다.

본 발명에 따른 애엽 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 계면 활성제 및 공용매를 추가로 포함할 수 있다.

상기 계면 활성제는 난용성 약물인 애엽 추출물이 수용액 및 생체액에 노출될 경우 자동적으로 미셀이 형성되는 자동 미셀화 약물 송달 시스템을 형성하도록 함으로써 상기 난용성 약물의 용해도 및 용출율을 극대화시키고 물리적 그리고 화학적인 안정성을 유지하는 역활을 한다. 또한, 본 발명에서는 계면 활성제를 최소량 사용하여 복용을 용이하게 하도록 하였다.

상기 계면 활성제는 약학적으로 허용되는 음이온계, 양이온계, 비이온계 또는 양쪽성 계면 활성제를 포함한 각종의 계면 활성제를 사용할 수 있다. 구체적으로는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르(polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, tween), 소르비탄 지방산 에스테르(sorbitan fatty acid ester, span), 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르(polyoxyethylene fatty acid ester), 미리즈(Myrj), 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체(polyoxyethylene polyoxypropylene block copolymer, poloxamer), 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 공중합체(polyoxyethylene polyoxypropylene copolymer, pluronic), 천연 또는 수소화 식물성 오일과 에틸렌 글리콜의 반응 생성물(reactant of natural or hydrogenated vegetable oil and ethylene glycol, cremophor, 이하 크레모포아 라고 함), 디옥틸 술포숙신산 나트륨(dioctylsulfosuccinic acid sodium salt), 라우릴 술폰산 나트륨(lauryl sulfonic acid sodium salt), 인지질, 프로필렌 글리콜 모노 또는 디 지방산 에스테르(propylene glycol mono or di fatty acid ester, 미글리올 840(Miglyol 840), 천연 식물성 오일 트리글리세라이드와 폴리알킬렌 폴리올의 트랜스-에스테르화 반응 생성물(trans-estrification reactant of natural vegetable oil triglyceride and polyalkylene polyol, labrafil M), 모노-, 디- 또는 모노/디 글리세라이드(mono-, di- or mono/di glyceride, imbitol), 스테롤(sterol) 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 계면 활성제로 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 천연 또는 수소화 식물성 오일과 에틸렌글리콜의 반응 생성물 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용한다.

상기 공용매는 프로필렌 카르보네이트(propylene carbonate), 프로필렌 글리콜(prolylene glycol), 에탄올(ethanol), 디에틸렌글리콜 모노에틸 에테르(diethyleneglycol monoethyl ether, transcutol), 글리코퓨롤(glycofurol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 디메틸 이소소르비드(dimethyl isosorbide) 및 N-메틸 피롤리돈(N-methyl pyrrolidone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용한다. 바람직하게는 상기 공용매로 디에틸렌글리콜 모노에틸 에테르, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 사용한다. 본 발명의 조성물은 애엽 추출물, 계면 활성제 및 공용매가 1:0.1∼50:0.1∼50 중량비로, 바람직하게는 1:0.1∼20:0.1∼20 중량비로 혼합하여 제조되는 것이다.

또한, 상기 조성물은 약효에 악영향을 미치지 아니하는 범위 내에서 약제학적으로 통상 사용되는 물질, 예를 들면 애엽 추출물의 용해도 및 위장관내 흡수를 증가시키고 경구 투여시에 물과 함께 분산 및 유화됨으로써 용출을 증가시키고 생 체 이용율 향상에 널리 활용될 수 있는 지방산 또는 지방산 알코올과 같은 첨가제, 백당, 맥아이온 엿, 정백당, 젤라틴, 설탕 및 물엿과 같은 당류, 스테아린산 마그네슘, 탈크와 같은 활택제, 미세결정셀롤로우스, 인산일수소칼슘, 전분, 만니톨과 같은 부형제, 제제가 산화되는 것을 방지하는 항산화제, 착향제, 방부제, 방향제, 감미료, 색소, pH 조절제 및 점도 조절제를 추가로 포함할 수 있으며, 이들은 애엽 추출물에 대하여 통상적으로 사용되는 사용량으로 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 지방산 또는 지방산 알코올로는 구연산(citric acid), 올레인산(oleic acid), 스테아릴 알코올(stearyl alcohol), 미리스틱산(myristic acid), 리놀레산(linoleic acid) 또는 라우릭산(lauric acid), 카프릭산(capric acid), 카프릴릭산(caprylic acid), 카프로익산(caproic acid) 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 항산화제는 부틸화된 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene), 소듐 바이설파이트(sodium bisulfite), α-토코페롤(α-tocopherol), 비타민 C(ascorbic acid), β-카로틴(β-carotin), 토코페롤 아세테이트(tocopherol acetate), 푸마릭산(fumaric acid), 날릭산(nalic acid), 부틸화된 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole), 프로필 갈레이트(propyl galate) 및 소듐 아스코베이트(sodium ascorbate) 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 착향제는 혼합 과일향, 사과향, 딸기향, 체리향, 박하향, 바닐라향, 요쿠르트향 또는 드링크향 등이 사용될 수 있으나, 이 들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 방부제는 안식향산, 안식향산 나트륨, 에틸파라벤, 메틸파라벤 또는 프로필파라벤등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 방향제는 박하뇌, 박하유, 오렌지 오일, 정향 오일, 시나몬 오일, 딸기 에센스 및 기타 통상의 과일향 또는 식물 에센스등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 감미제는 정백당, 포도당, 과당, 아스파탐, 스테비오사이드, 솔비톨, 만니톨, 올리고당, 물엿 또는 맥아이온 엿등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 색소는 녹색 3호, 적색 2호, 적색 3호, 청색 1호, 청색 2호, 황색 4호, 황색 5호, 수용성 만니톨, 캐러멜, 산화티타늄 또는 산화제 이철 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 pH 조절제는 탄산나트륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에탄올아민 또는 모노에탄올 아민 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 점도 조절제는 히드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropylcellulose, HPC), 히드록시프로필메틸 셀룰로오스(hydroxypropylmethyl cellulose, HPMC), 히드록시에틸 셀룰로오스(hydroxyethyl cellulose), 에틸 셀룰로오스(ethyl cellullose), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose), 아카시아(acacia), 벤토나이트(bentonite), 알긴산(alginic acid), 프로필렌글리콜알지네이트(propylene glycol alginate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrolidon), 폴리비닐 알콜(polyvinyl alcohol), 카보풀(carbopol), 폴리카르보필(polycarbopil), (tragacanth) 또는 (xanthan gum)등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기 애엽 추출물을 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 경구용 제제를 제공한다.

상기 경구용 제제는 정제, 환제, 산제, 경질 캅셀제, 젤라틴 밴딩한 경질캅셀제 및 연질 캅셀제, 카라멜 또는 젤리 타입의 츄정 및 수용액을 함유하는 경구용 액제이다. 바람직하게는 상기 조성물을 포함하는 연질 캅셀제를 제공한다. 본 발명에 따른 상기 조성물은 애엽 추출물, 계면 활성제 및 공용매를 혼합하고, 80℃에서 가열 용해시킨 후 통상적인 방법을 이용하여 경구용 제제로 제형화 할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

그러나, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

세절한 애엽 잎 100g을 70% 에탄올 1L로 상온에서 24시간씩 2회 냉침하고 추 출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 10.8g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 0.449%, 자세오시딘의 함량은 0.277%, 아테미카핀 C의 함량은 0.067% 및 디쿠마롤의 함량은 0.004%였다.

<실시예 2>

세절한 애엽 잎 100g을 70% 에탄올 1L로 4시간씩 2회 환류추출하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 16.2g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 0.412%, 자세오시딘의 함량은 0.225%, 아테미카핀 C의 함량은 0.062% 및 디쿠마롤의 함량은 0.004%였다.

<실시예 3>

세절한 애엽 잎 100g을 70% 에탄올 1L로 상온에서 4시간씩 2회 초음파추출하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 12.8g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 0.443%, 자세오시딘의 함량은 0.252%, 아테미카핀 C의 함량은 0.066% 및 디쿠마롤의 함량은 0.004%였다.

<실시예 4>

세절한 애엽 잎 100g을 90% 에탄올 1L로 상온에서 24시간씩 2회 냉침하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 7.2g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 0.734%, 자세오시딘의 함량은 0.513%, 아테미카핀 C의 함량은 0.110% 및 디쿠마롤의 함량은 0.007%였다.

<실시예 5>

세절한 애엽 잎 100g을 90% 에탄올 1L로 4시간씩 2회 환류추출하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 13.4g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 0.823%, 자세오시딘의 함량은 0.493%, 아테미카핀 C의 함량은 0.123% 및 디쿠마롤의 함량은 0.006%였다.

<실시예 6>

세절한 애엽 잎 100g을 90% 에탄올 1l로 상온에서 4시간씩 2회 초음파 추출하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 9.7g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 0.896%, 자세오시딘의 함량은 0.487%, 아테미카핀 C의 함량은 0.134% 및 디쿠마롤의 함량은 0.007%였다.

<실시예 7>

세절한 애엽 잎 100g을 95% 에탄올 1L로 상온에서 24시간씩 2회 냉침하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 5.0g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 1.010%, 자세오시딘의 함량은 0.640%, 아테미카핀 C의 함량은 0.151% 및 디쿠마롤의 함량은 0.008%였다.

<실시예 8>

세절한 애엽 잎 100g을 95% 에탄올 1L로 4시간씩 2회 환류추출하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 10.3g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 0.994%, 자세오시딘의 함량은 0.565%, 아테미카핀 C의 함량은 0.149% 및 디쿠마롤의 함량은 0.009%였다.

<실시예 9>

세절한 애엽 잎 100g을 95% 에탄올 1L로 상온에서 4시간씩 2회 초음파 추출하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 9.7g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 0.987%, 자세오시딘의 함량은 0.534%, 아테미카핀 C의 함량은 0.148% 및 디쿠마롤의 함량은 0.008%였다.

<실시예 10>

세절한 애엽 잎 100g을 100% 에탄올 1L로 상온에서 24시간씩 2회 냉침하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 5.2g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 1.284%, 자세오시딘의 함량은 0.649, 아테미카핀 C의 함량은 0.192% 및 디쿠마롤의 함량은 0.009%였다.

상기 제조된 쑥추출물은 고성능 액체 크로마토그래피법에 의하여 유파틸린, 자세오딘 및 디쿠마롤의 존재를 확인하였다(도 1). 분석조건은 Inertsil ODS II 컬럼을 사용하여 자외선 파장 330nm에서 확인하였으며(유속: 1.0ml/min), 이동상으로 는 5mM 메탄설폰산나트륨(CH3SO3Na) 및 10mM 인산칼륨(KH2PO4)과 아세톤니트릴(acetonitril)을 5:5(retention time ∼15분) 및 6:4(retention time 15분∼40분)로 혼합하여 사용하였다.

<실시예 11>

세절한 애엽 잎 100g을 100% 에탄올 1L로 상온에서 4시간씩 2회 환류추출하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 8.9g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린의 함량은 1.129%, 자세오시딘의 함량은 0.638%, 아테미카핀 C의 함량은 0.169% 및 디쿠마롤의 함량은 0.008%였다.

<실시예 12>

세절한 애엽 잎 100g을 100% 에탄올 1L로 상온에서 4시간씩 2회 초음파추출하고 추출여액을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 7.1g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.978%, 자세오시딘 함량은 0.541%, 아테미카핀 C의 함량은 0.146% 및 디쿠마롤의 함량은 0.008%였다.

<실시예 13>

세절한 쑥잎 100g을 95% 에탄올 800㎖로 상온에서 24시간씩 냉침하고 추출여액을 1/150로 감압 농축한 후 유당 7.0g, 옥수수전분 3.0g을 가하여 연합하고 20메쉬 체를 통과시켜 과립화 한 다음 80℃에서 열풍건조하여 고형분 14.8g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.429%, 자세오시딘의 함량은 0.231%, 아테미카핀 C 함량은 0.064%였다.

<실시예 14>

세절한 쑥잎 100g을 95% 에탄올 800㎖로 상온에서 24시간씩 냉침하고 추출여액을 1/100로 감압 농축한 후 덱스트린 0.5g을 고르게 분산시킨 다음 분무건조하여 고형분 13.9g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.417%, 자세오시딘의 함량은 0.227%, 아테미카핀 C 함량은 0.062%였다.

<실시예 15>

세절한 쑥잎 100g을 95% 에탄올 800㎖로 상온에서 24시간씩 2회 냉침하고 추출여액을 감압 농축한 후 동결건조하여 고형분 5.0g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 1.3127%, 자세오시딘의 함량은 0.667%, 아테미카핀 C의 함량은 0.196%였다.

이하, 상기 실시예 1 내지 12에서 얻은 애엽 추출물에서 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물을 제조하는 방법에 관하여 다음의 실시예를 통해 상세히 설명한다.

<실시예 16> 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물

실시예 1에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 10.3g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.441%, 자세오시딘 함량은 0.269%, 아테미카핀 C 함량은 0.063% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 17>

실시예 2에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 15.8g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.410%, 자세오시딘 함량은 0.219%, 아테미카핀 C 함량은 0.057% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 18>

실시예 3에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 12.6g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.437%, 자세오시딘 함량은 0.246%, 아테미카핀 C 함량은 0.062% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 19>

실시예 4에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 7.1g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.729%, 자세오시딘 함량은 0.509%, 아테미카핀 C 함량은 0.107% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 20>

실시예 5에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 12.8g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.818%, 자세오시딘 함량은 0.487%, 아테미카핀 C 함량은 0.118% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 21>

실시예 6에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 9.3g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.887%, 자세오시딘 함량은 0.473%, 아테미카핀 C 함량은 0.129% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 22>

실시예 7에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 4.8g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.998%, 자세오시딘 함량은 0.613%, 아테미카핀 C 함량은 0.146% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 23>

실시예 8에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 10.1g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.983%, 자세오시딘 함량은 0.541%, 아테미카핀 C 함량은 0.143% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 24>

실시예 9에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5∼7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 9.5g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.973%, 자세오시딘 함량은 0.523%, 아테미카핀 C 함량은 0.145% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 25>

실시예 10에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5-7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 4.9g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 1.236%, 자세오시딘 함량은 0.621%, 아테미카핀 C 함량은 0.188% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

상기 제조된 디쿠마롤이 제거된 쑥추출물은 고성능 액체 크로마토그래피법에 의하여 유파틸린, 자세오딘 및 디쿠마롤의 존재를 확인하였다(도 2). 분석조건은 Inertsil ODS II 컬럼을 사용하여 자외선 파장 330nm에서 확인하였으며, 이동상으로는 5mM 메탄설폰산나트륨(CH3SO3Na) 및 10mM 인산칼륨(KH2PO4)과 아세톤니트릴(acetonitril)을 5:5로 혼합하여 사용하였다.

<실시예 26>

실시예 11에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5-7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 8.5g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 1.121%, 자세오시딘 함량은 0.629%, 아테미카핀 C 함량은 0.166% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 27>

실시예 12에서 제조된 애엽 추출물에 수산화칼륨 수용액을 첨가하여 pH 10-11로 조절한 뒤, 항온실에서 80℃로 1시간 반응을 진행시키며 염산, 구연산, 사과산 중 하나 이상을 사용하여 pH 6.5-7.5로 중화시키고, 반응이 종료된 애엽 추출물을 감압농축한 후 동결건조하여 고형분 6.8g을 얻었다. 고형분 중 유파틸린 함량은 0.967%, 자세오시딘 함량은 0.537%, 아테미카핀 C 함량은 0.141% 및 디쿠마롤 함량은 0%였다.

<실시예 28>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 중 60mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 40mg 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 40mg를 혼합하였다. 상기 혼합액에 크레모포아 RH40 및 디에틸렌글리콜 모노에틸 에테르 100mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하였다. 상기 조성물을 연질 캅셀에 충진하여 제제화하였다.

<실시예 29>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 40mg 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 40mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 프로필렌 카르보네이트 100mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하였다. 상기 조성물을 연질캅셀에 충진하여 제제화하였다.

<실시예 30>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 30mg 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 40mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 디에틸렌글리콜 모노 에틸에테르 100mg 및 폴리에틸렌글리콜 400 50mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하 였다. 상기 조성물을 연질캅셀에 충진하여 제제화하였다.

<실시예 31>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 80mg 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 40mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 폴리에틸렌 글리콜 400 80mg 및 프로필렌 글리콜 5 mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하였다. 상기 조성물을 연질캅셀에 충진하여 제제화하였다.

<실시예 32>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 40mg 및 크레모포아 RH40 60mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 디메틸 이소소르비드 100mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하였다. 상기 조성물을 연질 캅셀에 충진하여 제제화하였다.

<실시예 33>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 80mg 및 크레모포아 EL 80mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 디에틸렌 글리콜 모노 에틸에테르 95mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하였다. 상기 조성물을 연질캅셀에 충진하여 제제화하였다.

<실시예 34>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 40mg 및 크레모포아 RH 40 40mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 N-메틸 피롤리돈 100mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하였다. 상기 조성물을 연질캅셀에 충진하여 제제화하였다.

<실시예 35>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 200mg 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 200mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 폴리에틸렌 글리콜 400 150mg 및 프로필렌 글리콜 600mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하였다. 상기 조성물에 백당 10,000mg, 구연산 30mg 및 혼합 과일향 5mg을 첨가하고 용해시킨 후 적당량의 정제수로 정용하여 멸균하였다. 멸균이 완료된 후, 병에 충진하여 액상 제제로 제제화하였다.

<실시예 36>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 크레모포아 RH 40 20mg 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 10mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 미세결정셀롤로우스 90mg, 폴리비닐피롤리돈(콜리돈 CL) 30mg, 스테아린산 마그네슘 2.5mg, 콜로이드성 실리콘디옥사이드(에어로실 200) 2mg을 첨가하여 혼합한 후 타정하여 정제를 얻었다.

<실시예 37>

애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제

실시예 22에서 제조한 애엽 추출물 60mg, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 350mg, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 200mg을 혼합하였다. 상기 혼합액에 폴리에틸렌 글리콜 400 380mg 및 프로필렌 글리콜 20mg을 첨가하고 80℃에서 가열하여 투명할 때까지 용해시켜 조성물을 제조하였다. 상기 조성물에 맥아이온 엿 1,000mg, 정백당 1,000mg, 젤라틴 100mg, 설탕 500mg, 물엿 100mg, 딸기 에센스 5mg 및 구연산 5mg을 첨가하여 카라멜 타입의 츄정으로 제제화하였다.

<비교예>

혼합기(High Speed Mixer)에 유당 8㎏과 옥수수 전분 4㎏을 넣어 고르게 혼합하였다. 이 혼합물을 실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 애엽 추출물 3㎏과 혼합하고 연합기에서 연합한 후, 20호체로 조립하였다. 60℃에서 열풍 건조한 후, 20호체로 정립하여 과립을 얻었다. 제조한 과립을 자동캅셀 충전기에 충전하여 과립 제제를 제조하였다.

이하, 상기한 실시예에서 얻은 쑥추출물과 유파틸린, 아테미카핀 C의 위염, 소화성궤양에 대한 치료효과를 알아보기 위하여 수침·구속 스트레스 위궤양 모델, 염산-에탄올(HCl-EtOH) 위염 모델, 인도메타신 (indomethacin) 위궤양 모델을 이용하여 약효를 비교 조사하였다. 또한 그 작용기전을 규명하기 위하여 쑥추출물과 유파틸린, 아테미카핀 C의 점막보호효과를 조사하였다.

<실험예 1>

수침·구속 스트레스 위궤양 모델에서의 쑥추출물과 유파틸린,

아테미카핀 C의 항궤양 효과

Takagi 등 (Jap. J. Pharmacol. 18: 9-18, 1968)의 방법에 준하여 랫드를 24시간 절식시킨 다음 실시예 22의 쑥추출물과 상기 쑥추출물에 함유된 용량에 해당되는 유파틸린 및 아테미카핀 C를 각각 경구투여하고 30분 후에 스트레스 케이지(stress cage)에 넣어 검상돌기가 물에 잠기도록 물속에 넣고 수온을 21±1℃로 유지하면서 8시간 동안 방치하였다. 이후 에테르(ether) 마취하에서 동물을 치사시킨 다음 위를 적출하여 1% 포르말린 13ml을 위내에 주입하고 1% 포르말린 용액에 넣어 1시간 동안 고정하였다. 고정이 끝난 위를 대만부를 따라 절개하여 펼친후에 실체현미경 (X10)으로 위병변의 면적(mm²)을 측정하고 하기의 수학식 1을 이용하여 위병변 억제율을 산출하였다. 반수유효용량 (50% effective dose, ED50)은 회귀분석(regression analysis)를 통하여 계산하였다.

전술한 실시예 22의 쑥추출물과 쑥추출물에 함유된 용량에 해당하는 유파틸린과 아테미카핀 C의 항궤양 효과는 표 3에 나타내었다. 시험결과 대조군을 제외한 모든 시험물질 투여군에서 수침·구속 스트레스 유발 위궤양에 대한 항궤양 효과가 나타났다. 대조군의 궤양면적은 30.5±2.7mm²이었으며, 쑥추출물 투여군에서는 25 mg, 50 mg, 100 mg/kg 투여군에서 용량의존적인 항궤양효과가 관찰되었다.

[표 3]

수침·구속 스트레스 위궤양 모델에서의 쑥추출물과 유파틸린, 아테미카핀 C의 항궤양 효과

시험군	용량 (mg/kg)	동물수	위병변 면적 (mm²)	병변억제율 (%)
대조군	-	10	30.5±2.7	-
쑥추출물	25	8	21.5±3.0*	28.6
	50	8	16.0±2.5*	46.8
	100	8	8.6±2.7*	71.4
유파틸린	0.33	8	24.1±2.8	20.0
	0.66	8	19.3±3.0	35.6
	1.32	8	14.0±2.4	53.6
아테미카핀 C	0.05	8	27.1±1.9	10.0
	0.10	8	25.0±2.5	16.9
	0.20	8	23.2±3.2	22.9
유파틸린 + 아테미카핀 C	0.33/0.05	8	22.5±3.2	25.1
	0.66/0.10	8	17.6±1.5	41.7
	1.32/0.20	8	11.2±3.9*	62.9

* : 대조군에 비하여 유의하게 차이를 보임 (p<0.05)

쑥추출물에 함유된 함량과 동일한 함량의 아테미카핀 C를 투여한 군에서는 뚜렷한 항궤양 효과가 관찰되지 않았다. 유파틸린만을 투여한 시험군의 경우에도 모든 용량군에서 항궤양효과가 인정되었지만 그 정도는 쑥추출물을 투여한 시험군에서 보다는 뚜렷히 약하게 관찰되었다. 한편, 유파틸린과 아테미카핀 C를 동시에 투여한 시험군에서도 항궤양효과가 관찰되었는데, 그 정도는 유파틸린이나 아테미카핀 C 단독으로 투여한 경우보다는 강하고 쑥추출물을 투여한 시험군에서 보다는 약한 정도로 관찰되었다. 이러한 결과는 쑥추출물의 항궤양 효과는 유파틸린 단독으로라기보다는 아테미카핀 C와 그외 여러 가지 미지의 성분에 의해 상승작용을 나타내는 것임을 의미한다.

<실험예 2>

염산-에탄올 유발 위염 모델에서의 쑥추출물과 유파틸린, 아테미 카핀 의 효과

랫드를 24시간 절식시킨 다음 Mizui 등 (Jap. J. Pharmacol. 33: 939-945, 1983)의 방법에 준하여 실시예 22의 쑥추출물과 상기 쑥추출물에 함유된 용량에 해당되는 유파틸린 및 아테미카핀 C를 각각 경구투여하고 1시간 후에 60% 에탄올을 150 nM의 염산에 녹여 마리당 1.5 ㎖씩 경구투여하였다. 1시간 후에 에테르 마취하에서 동물을 치사시킨 후 위를 적출하여 1% 포르말린 13 ㎖를 위내로 주입하여 1% 포르말린에 넣어 1시간 동안 고정하였다. 위의 대만부를 따라 절개하여 펼친후에 실체현미경(X10)하에서 위병변면적(mm2)을 측정하고 구속·수침 스트레스 모델에서와 동일한 방법으로 위병변억제율과 반수유효용량(mg/kg)을 계산하였다.

실시예 22에서 얻어진 쑥추출물과 쑥추출물에 함유된 용량에 해당하는 유파틸린과 아테미카핀 C의 염산-에탄올 유발 위염 모델에서의 효과는 표 4에 나타내었다. 대조군의 궤양면적은 53.2±8.2 이었으며, 쑥추출물 투여군에서는 25 mg, 50 mg, 100 mg/kg 투여군에서 용량의존적인 항위염효과가 관찰되었으며, 100 mg/kg 투여군의 경우 위병변억제율은 82.5%로 나타났다.

유파틸린과 아테미카핀 C 단독 투여군의 경우에도 약한 위병변 억제효과는 관찰되었으나 그 정도는 쑥추출물 투여군과 비교시 상대적으로 약하였다. 유파틸린과 아테미카핀 C 병용 투여군의 경우에는 항 위염 효과가 각각의 단독 투여군보다는 강하게 관찰되어 병변억제율은 60-70% 정도였으나 쑥추출물 투여군보다는 약하게 나타나 쑥추출물의 항궤양 효과는 함유된 여러 가지 성분에 의해 상승적으로 나타나는 것으로 판단되었다.

[표 4]

염산-에탄올 유발 위염 모델에서의 쑥추출물과 유파틸린, 아테미카핀 C의

효과

시험군	용량 (mg/kg)	동물수	위병변 면적 (mm²)	병변억제율 (%)
대조군	-	10	53.2±8.2	-
쑥추출물	25	8	23.8±3.3*	55.3
	50	8	15.5±3.9*	70.9
	100	8	9.6±2.7*	82.5
유파틸린	0.33	8	32.6±4.0*	38.7
	0.66	8	24.5±1.3*	53.9
	1.32	8	20.3±3.3*	61.9
아테미카핀 C	0.05	8	42.9±7.4	19.3
	0.10	8	39.6±8.8	25.5
	0.20	8	39.2±3.3*	26.4
유파틸린 + 아테미카핀 C	0.33/0.05	8	27.3±1.3*	48.6
	0.66/0.10	8	19.6±3.9*	63.1
	1.32/0.20	8	14.6±2.7*	72.6

* : 대조군에 비하여 유의하게 차이를 보임 (p<0.05)

<실험예 3>

인도메타신 위궤양 모델에서의 쑥추출물과 유파틸린, 아테미카핀 C의 효과

Urushidani 등 (Jap. J. Pharmacol. 27: 316-319, 1977)의 방법에 따라 랫드를 24시간 절식시킨 후에 실시예 22의 쑥추출물과 상기 쑥추출물에 함유된 용량에 해당되는 유파틸린 및 아테미카핀 C를 각각 경구투여하고 1시간 후에 인도메타신 40 mg/kg을 경구투여 하였다. 6시간후에 동물을 에테르로 마취하여 치사시킨 후 위를 적출하여 1% 포르말린 13 ㎖을 위내로 주입하고 1% 포르말린 용액에 넣어 1시 간 동안 고정하였다. 위의 대만부를 따라 절개하여 펼친 후에 실체현미경 (X10) 하에서 위병변 면적(mm2)을 측정하고 구속·수침 스트레스 모델에서와 동일한 방법으로 위병변억제율과 반수유효용량(mg/kg)을 계산하였다.

[표 5]

인도메타신 위궤양 모델에서의 쑥추출물과 유파틸린, 아테미카핀 C의 효과

시험군	용량 (mg/kg)	동물수	위병변 면적 (mm²)	병변억제율 (%)
대조군	-	10	49.5±4.4	-
쑥추출물	25	8	30.2±4.1*	39.0
	50	8	23.5±2.3*	52.5
	100	8	14.0±2.2*	71.7
유파틸린	0.33	8	40.0±3.8*	27.3
	0.66	8	29.7±2.6*	39.9
	1.32	8	22.9±2.6*	53.8
아테미카핀 C	0.05	8	42.7±2.7	13.6
	0.10	8	40.1±4.5	18.9
	0.20	8	38.1±3.3*	22.9
유파틸린 + 아테미카핀 C	0.33/0.05	8	32.5±4.7*	34.3
	0.66/0.10	8	26.4±4.5*	46.7
	1.32/0.20	8	18.3±1.3*	63.1

* : 대조군에 비하여 유의하게 차이를 보임 (p<0.05)

상기 표 5에서 알 수 있는 바와 같이 쑥추출물을 투여하는 경우 인도메타신에 의해 유발되는 위궤양이 용량의존적으로 감소하였다. 유파틸린과 아테미카핀 C를 단독으로 투여하는 경우 각각의 항궤양 효과는 쑥추출물에 비하여 약하게 관찰되었으며, 유파틸린 투여군에서의 최대 병변억제율은 약 54% 정도로 나타났다. 쑥추출물에 함유된 함량과 동일한 함량의 유파틸린과 아테미카핀 C를 병용투여한 경우에는 약 50-60% 정도의 병변억제효과가 관찰되었으나 쑥추출물 자체보다는 상대 적으로 그 정도가 약하게 관찰되었다.

<실험예 4>

알콜에 의한 위점막손상 모델에서의 아르테미카핀의 위점막 보호 효과

랫드를 24시간 절식시킨 이후 99% 이상의 고순도 알콜을 4g/kg의 용량으로 경구투여하여 위점막에 손상을 유발하였다. 위점막 손상 유발 1시간 이전에 실시예 22의 쑥추출물, 유파틸린 및 아테미카핀 C를 각각 표 6에서 나타낸 바와 같은 용량으로 경구투여 하였으며, 위점막 손상 유발 30분 이후에 부검하여 위점막내 프로스타글란딘 (Prostaglandin E2)의 함량을 EIA 방법 (Enzyme Immunoassay Kit, Assay Designs, Inc.)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 표 6에서 보는 바와 같이 알콜에 의한 위점막 손상에 따른 프로스타글란딘의 감소는 쑥추출물, 유파틸린 및 아테미카핀 C 단독 투여에 의하여 통계적으로 유의하게 회복되었으며, 특히 유파틸린과 아테미카핀 C 병용투여군은 정상동물의 약 90%이상의 수치를 나타내었다. 이러한 결과는 쑥추출물내에 함유되어 있는 아르테미카핀에 위점막 보호 효과가 있음을 의미한다.

[표 6]

위점막내 프로스타글란딘(PGE2)의 함량 변화

시험군	용량 (mg/kg)	동물수	총 PGE₂ (pg)
정상동물대조군	-	10	3210±123
용매대조군	-	10	2130±103
쑥추출물	25	10	2802±145*
	50	10	2934±120*
	100	10	3156±114*
유파틸린	0.33	10	2731±134*
	0.66	10	2812±131*
	1.32	10	2895±102*
아테미카핀 C	0.05	10	2339±104*
	0.10	10	2398±111*
	0.20	10	2464±105*
유파틸린 + 아테미카핀 C	0.33/0.05	10	3014±130*
	0.66/0.10	10	3098±110*
	1.32/0.20	10	3199±121*

* : 대조군에 비하여 유의하게 차이를 보임 (p<0.05)

이상과 같은 결과는 쑥추출물에 의한 항궤양 효과는 유파틸린만의 작용이 아니라 유파틸린과 아테미카핀 C 혹은 그 외 미지의 성분이 복합적으로 작용하여 나타나는 것을 의미하며, 특히 유파틸린과 아테미카핀 C가 위점막에서 프로스타글란딘 E2의 생성을 촉진하여 위점막 보호효과를 나타냄을 알 수 있다.

이하, 인위적으로 유도된 위염 및 소화성궤양 동물모델에서 실시예 25에 의하여 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물을 함유하는 약학적 조성물이 위염 및 소화성궤양 치료의 질(quality)에 미치는 영향을 다음 실험예에 의거 상세히 설명하고자 한다. 본 발명의 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실험예 5> 초산 유발 위병변에 대한 보호작용

실험적 아만성 궤양모델로 가장 널리 이용되는 초산 유발 위병변에 대해 실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물의 영향을 검토하였다. 초산을 투여하지 않은 정상군, 초산만 투여한 대조군, 실시예 7의 애엽 추출물 투여군, 디쿠마롤이 제거된 실시예 22의 애엽 추출물 투여군 및 위궤양의 치료에 널리 사용되는 라니티딘 투여군으로 실험군을 나누었다.

초산에 의한 위궤양 모델은 표준적 시험법에 의거하여(Gastroenterology 95: 636, 1988), 6주령의 랫트를 마취시킨 후 개복하여 위장장막에 초산을 접촉시킨 후 다시 봉합하여 제작하였다. 궤양유발 1일 후부터 1일 1회 4주간 각 약물을 경구투여하였으며, 약물투여 2주 및 4주에 각 군의 일부를 부검하여 위를 적출하고 궤양치유정도를 평가하고(Gastroenterologica japonica 17(6): 530, 1982, J Clin Gastroenterol 13(suppl 1): S42, 1991), 크러스칼-월리스(Cruskal-Wallis) 분산 분석한 후 던(Dunn) 테스트를 통해 다중비교를 하였다. 그 결과, 표 7 및 표 8에 나타난 바와 같이 본 발명의 실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 실시예 7에서 제조된 애엽 추출물과 동일한 궤양치유효과를 나타내었다.

[표 7]

약물투여 2주의 궤양치유정도

[표 8]

약물투여 4주의 궤양치유정도

상기 표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 약물투여 2주에 재생점막의 파스-알시안블루(PAS-AB) 염색도 및 궤양저부의 섬유화 정도에서 대조군에 비해 실시예 7에서 제조된 애엽 추출물 및 실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물 투여군 모두 점막충실도 및 섬유화 정도에서 유의한 회복성을 나타내었고, 재생점막의 성숙도를 나타내는 파스-알시안블루 염색에서도 유의성은 없었으나 대조군에 비해 파스염색성이 강해 성숙도가 높은 것으로 나타났다.

또, 상기 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 투여 4주후에 평가한 조직소견에서 치유된 궤양저부의 섬유화(세포치밀도) 정도는 각 군간 차이를 나타내지 않았으나 궤양저부의 혈관신생(vasculization) 정도와 재생점막의 정상화(normalization) 정도는 실시예 7에서 제조된 애엽 추출물 및 실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물 투여군 모두에서 대조군에 대비하여 유의한 회복도를 나타내었다.

이상과 같은 결과를 통하여 유해성분이 선택적으로 제거된 본 발명의 애엽 추출물의 치료효과를 확인하였으며, 이는 기존의 애엽 추출물의 부작용을 경감시키는 안전하고 유용한 소화성궤양 치료법의 도입이 가능함을 의미한다.

또한, 이하 염증성 장질환 예방 또는 치료제로서의 애엽 추출물의 용도를 실시예에 의거하여 상세히 설명하고자 한다.

실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물의 염증성 장질환에 관한 예방 또는 치료효과를 알아보기 위하여 트리니트로벤젠 설폰산(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)으로 유발한 염증성 장질환 모델에서 하기와 같은 방법으로 애엽 추출물의 약효를 조사하였다.

<실험예 6> 염증성 장질환에 대한 약효

우선, TNBS를 투여하지 않은 정상군, TNBS만 투여한 대조군, 실시예 7의 애엽 추출물 투여군, 디쿠마롤이 제거된 실시예 22의 애엽 추출물 투여군 및 염증성 장질환의 치료에 널리 사용되는 메살라진 투여군으로 실험군을 나누었다. Shibata 등(Dig. Endosc. 5: 13, 1993)의 방법을 응용하여 7주령의 웅성 SPF SD 랫트를 하루 절식한 후 에테르(ether)로 마취하고 항문에서 8cm 깊이만큼 고무 캐뉼라(canula, 내경 2mm)를 삽입하여 30% 에탄올에 용해시킨 TNBS(TCl, lot No. FIE01)를 마리당 20mg/ml의 용량으로 투여한 후 2ml의 생리식염수로 세척해주는 방법으로 1회 적용하였다. 유발 후 1일부터 14일까지 각 약물을 연일 경구투여하였다. 시험 제7일 및 15일에 모든 동물을 부검하여 대장점막의 병변형성정도를 Wallace의 기준(표 5. Can. J. Physiol. Pharmacol. 66: 422, 1988)에 의해 평점하였다. 각 군당 마리수는 8마리 이상이며, 각 동물의 병변평점은 상용 통계처리프로그램인 시그마-스탯(Sigma-Stat)을 사용하여 랭크(rank)로 변환한 후 Kruscal-Wallis 비모수분산 분석(non-prametric ANOVA)을 실시하고 Student-Newman- Keuls 다중비교(multiple comparison)를 하여 p<0.05인 경우 군간 유의성이 있는 것으로 하였다.

[표 9]

대장점막의 병변지수

전술한 Shibata 등(Dig. Endosc. 5: 13, 1993)의 시험법에 따른 실시예 25의 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물의 약효는 표 10과 같다.

[표 10]

TNBS로 유발된 염증성 장질환 모델에서의 약효

* : 대조군에 비해 유의하게 차이를 보임(p<0.05)

그 결과, 염증성 장질환에 가장 널리 사용되는 메살라진의 경우 임상사용 해당용량인 25mg/kg 투여군만을 포함한 모든 시험군이 시험 제7일에 유의한 대장점막손상 억제효과를 나타내었다. 한편 만성적 염증소견을 나타내는 시험 제15일에서는 애엽 추출물, 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물 및 메살라진 등 모든 시험군에서 대조군에 비해 우수한 치료효과를 나타내었으나 애엽 추출물과 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물 25mg/kg 용량군만이 유의한 차이를 나타내었다.

<실험예 8> 산소자유기 소거작용

염증성 장질환의 병인은 현재까지 완전히 밝혀지지 않은 상태이나 전술한 바와 같이 최근 산소자유기에 의한 산화적 스트레스가 병태생리에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 본 발명자들은 산소자유기 소거작용의 지표가 되는 호중구의 화학발광(chemiluminescence) 및 대장점막에서의 과산화지질 함량에 미치는 영향을 실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물을 이용하여 검토하였다.

1) 호중구의 화학발광에 미치는 영향

사람의 호중구를 Grisham 등(J. Immunol. Methods 82: 315, 1985)의 방법에 따라 분리한 후 1ㅧ10⁶cell/mL 부유액을 조제하였다. 사람 호중구가 헬리코박터 필로리(H. pylori)에 의해 활성화되어 나타나는 화학발광은 Suematsu 등(J. Clin. Lab. Immunol. 24: 125, 1987)의 방법에 따라 측정하였다. 준비된 호중구 용액 100L KRP buffer 0.89mL와 혼합하고 화학 발광 표지물질로 luminol 5L를 가하였다. 이상의 혼합물을 37℃에서 화학발광측정기(chemiluminometer, Berthold Model LB 9505)에 넣고 5분 후에 헬리코박터 필로리 균액(1.2ㅧ10⁸cfu/mL) 20L를 가해 잘 혼합한 뒤 30분간 화학발광 정도를 측정하였다. 대조군의 경우는 호중구 혼합액에 애엽 추출물의 부형제인 유당(lactose) : 전분(starch)을 2:1로 혼합한 것을 10㎍/mL로 되도록 가하였다. 화학발광 정도는 피이크(peak)의 총면적으로 하였으며, 실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물의 화학발광 억제정도는 대조군 피이크면적에 대한 백분율로 나타내었다. 그 결과는 표 11과 같다.

[표 11]

헬리코박터 필로리에 의한 사람 호중구의 화학발광에 대한 애엽 추출물의 억 제작용

* : 대조군에 비해 유의한 차이를 보임(p<0.05, Fisher's Exact test)

그 결과, 본 발명의 실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 실시예 7에서 제조된 애엽 추출물과 마찬가지로 용량의존적으로 호중구의 화학발광을 억제하였으며, 20㎍/mL 이상의 농도에서는 유의성이 인정되었고, 고용량인 100㎍/mL에서는 각각 81.6% 및 83.2%의 억제율을 나타내었다. 이는 애엽 추출물 및 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물 모두 헬리코박터 필로리 등 외부자극에 의한 호중구의 활성화 및 산소자유기 생산을 유의하게 억제함을 의미한다.

2) 결장점막에서의 과산화지질

전술한 TNBS 유발 염증성 장질환 약효시험중 분리하여 -70℃에 보관중인 손상 결장점막증 과산화지질의 함량을 측정하였다. Ohkawa 등(Anal. Biochem. 95: 351, 1979)의 방법에 준해 결장점막 조직 마쇄균질액 일정량에 8.1% 도데실설페이트염(sodium dodesyl sulfate), 20% 아세테이트 완충액(acetate buffer, pH 3.5) 및 0.8% 치오바르비츄린산(thiobarbituric acid) 용액을 가해 95℃에서 1시간 동안 반응시키고 실온으로 냉각한 다음 생성된 홍색의 치오바르비츄린산 반응물질을 n-부탄올:피리딘(15:1) 혼액으로 이행시켜 파장 532nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 정량하였다. 과산화지질의 함량은 단백 1mg당 말론디알데히드(MDA)의 양을 n mole로 나타내었다.

그 결과, 표 12에 나타난 바와 같이, 시험 제7일 TNBS만 적용한 대조군에서는 무처치 정상군에 비해 유의한 과산화지질생성 증가가 관찰되었으나 TNBS 처치후 애엽 추출물과 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물 5 및 25mg/kg을 투여한 모든 용량군에서 무처치 정상군과의 유의한 차이를 나타내지 않았다. 또한 애엽 추출물과 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물을 투여한 모든 용량군에서는 정도의 차이가 있지만 대조군에 비해 유의한 과산화지질 생성억제효과를 관찰할 수 있었다.

[표 12]

TNBS에 의한 결장점막손상부위에서의 과산화지질생성량 (시험 제7일)

* : 정상군(무처치)에 비해 유의한 차이를 보임(p<0.01, Dunnett's t-test)

+ : 대조군에 비해 유의한 차이를 보임(p<0.01, Dunnett's t-test)

이상과 같은 결과는 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물이 염증성 장질환의 주 병리기전중의 하나인 산소스트레스(oxygen stress)에 대해 호중구의 활성 및 산소자유기 유리, 또한 이로 인한 지질과산화반응을 효과적으로 차단하여, 염증성 장질환에 대해 약효를 나타냄을 의미한다. 본 발명의 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 염증성 장질환에 대하여 기존의 애엽 추출물과 동일한 효과를 나타내었다.

<실험예 8> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 암수 랫트를 사용하여 실시예 7에서 제조된 애엽 추출물과 실시예 22에서 제조된 애엽 추출물에 대한 급성독성시험을 실시하였다. 실험 동물은 바이오제노믹스에서 공급받아 사용하였으며, 동물입수시 외관에 대한 육안적 검사를 실시한 이후 7일 이상 순화사육하여 건강한 동물만을 선별하여 실험에 사용하였다. 본 실험은 온도 23±2℃, 상대습도 60±10 %, 환기횟수 15-20회/시간, 조도 150-600 Lux, 조명시간 12시간(07:00 점등 - 19:00 소등)으로 설정된 동아제약㈜ 연구소 SPF 청정 동물사육구역내에서 실시하였다. 사료는 방사선 조사(2 rad) 실험동물용 고형사료를 자유섭취시켰으며, 음수는 살균 수도수를 자유섭취시켰다. 사료조성, 일반세균검사는 공급자측에서 제공하였으며, 사료 및 음수에 있어서 시험에 영향을 미칠만한 요인은 관찰되지 않았다.

실험군의 구성은 군당 암수 각각 5마리씩의 동물에 대하여 각각의 애엽 추출물을 1g/kg, 2g/kg 및 5g/kg의 용량군으로 하였으며, 실험물질은 5% 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈(hydroxypropylmethyl cellulose, HPMC) 용액에 현탁하여 1회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부와 임상증상은 1회/1일의 빈도로 14일동안 관찰하였고, 체중은 시험물질 투여후 1, 3, 7 및 14일에 측정하였다. 실험종료 후 에테르 마취하에 복부 대정맥에서 채혈하여 혈액학적 검사(혈구자동측정기, Mascot 850) 및 혈액응고능 검사(혈액응고능 자동 측정기)를 실시하였다. 또한, 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 실험 결과, 실시예 7에서 제조된 애엽 추출물과 실시예 22에서 제조된 애엽 추출물을 투여한 모든 동물에서 실험기간 중 특기할 만한 임상증상이나 체중의 변화는 관찰되지 않았고, 폐사한 동물도 없었다. 그 결과는 표 13 내지 15와 같다.

[표 13]

본 발명에 따른 애엽 추출물의 경구 투여시 랫트에서의 폐사율

[표 14]

본 발명에 따른 애엽 추출물의 경구투여시 랫트에서의 임상증상의 변화

[표 15]

본 발명에 따른 애엽 추출물의 경구투여시 랫트에서의 체중의 변화

또한, 혈액학적검사 및 육안적 부검소견에서도 독성학적으로 특이한 변화는 관찰되지 않았다.

[표 16]

본 발명에 따른 애엽 추출물의 경구 투여시 랫트에서의 혈액학적 수치의 변 화

그러나, 표 17에서 나타낸 바와 같이 실시예 7에서 제조된 애엽 추출물은 혈액응고능의 지표인 프로트롬빈 시간(prothrombin time, PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time, APTT)을 대조군에 비하여 연장시키는 것으로 나타났다. 비록 이러한 변화가 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았지만, 이는 장기복용시 혈액응고시간의 연장을 통한 부작용의 발생가능성이 있음을 의미한다. 반면 실시예 25에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 대조군과 같은 PT 및 APTT 수준을 나타내었다.

[표 17]

혈액응고능에 대한 영향

상기 결과는 실시예 7에서 제조된 애엽 추출물에 함유되어 있는 디쿠마롤에 의하여 비타민 K 의존적 항응고요소인 응고인자들의 합성이 저해된 것이며, 실시예 22에 의한 애엽 추출물에서는 디쿠마롤의 제거에 의하여 혈액응고 연장효과가 사라졌음을 의미한다. 이상의 결과에서 본 발명의 실시예 22에서 제조된 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 5g/kg까지 혈액응고능에 대한 변화를 포함한 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여시 반수 치사량(LD50)이 5g/kg 이상의 안전한 물질로 판단되었다.

이하, 본 발명의 자동 미셀화 약물 송달 시스템에 의한 애엽 추출물경구용 제제의 용해도, 용출율 및 혈중 농도를 하기의 실시예에 따라 살펴보도록 한다.

<실험예 9> 용해도 비교 실험

본 발명의 자동 미셀화 약물 송달 시스템에 의한 애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제 및 이러한 시스템이 없는 애엽 추출물의 경구용 조성물 을 포함하는 경구용 제제의 용해도를 측정하여 비교하였다.

구체적으로는, 실시예 22로부터 제조된 애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 연질 캅셀과 비교예로부터 제조된 애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 과립의 위장관내의 pH 조건(pH= 1.2)과 소장 및 대장에서의 pH 조건(pH=6.8)에서 약물의 용해도를 측정하였다.

실험 방법은 다음과 같다.

실시예 22 및 비교예로부터 제조된 경구용 제제 중 애엽 추출물 60mg에 해당하는 양을 취하여, pH 1.2의 완충 용액(대한 약전 제 8개정: 염화 나트륨 2.0g에 염산 7.0㎖및 물을 넣어 총 부피가 1L가 되도록 하였다.) 및 pH 6.8의 완충 용액(대한 약전 제 8개정: 0.2mol/L인산이수소칼륨용액 250㎖에 0.2mol/L수산화나트륨 용액 118㎖ 및 물을 넣어 총 부피가 1L가 되도록 하였다.) 150㎖에 각각 첨가하였다. 상기 용액을 37℃에서 1 시간동안 교반한 후, 용해도를 측정하였다. 용해도는 원심분리 후 HPLC를 이용해서 측정하였다. 구체적으로 컬럼은 하이크롬(Hichrom) RPB (250*4.6mm, 입자 크기:5㎛)을 사용하였고, 분석 파장은 350nm 이었으며, 이동상은 0.5% 초산 완충액과 아세토니트릴을 부피비 58:42로 혼합한 것을 사용하였다. 이동상의 유속은 1㎖/분, 시료 주입량은 20㎕이었다.

그 결과는 표 18에 나타내었다.

[표 18]

pH=1.2 및 pH=6.8에서 용해도 및 비교

제제	용해도
제제	pH1.2	pH6.8
실시예 22(시험제제)	8.3	8.6
비교예(비교제제)	1.5	3.4
용해도 비교(실시예 1/비교예)	5.53	2.53

상기 표 18에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 실시예 22로부터 제조된 경구용 제제의 용해도는 pH=1.2 및 pH=6.8에서 각각 8.3㎍/㎖ 및 8.6㎍/㎖이었으며, 비교예로부터 제조된 경구용 제제의 용해도는 각각 1.5㎍/㎖ 및 3.4㎍/㎖이었다. 또한, 상기 용해도를 비교하였을 때 본 발명에 따른 경구용 제제의 용해도가 pH=1.2 및 pH=6.8에서 각각 5.5배 및 2.5배 높음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 자동 미셀화 약물 송달 시스템에 의한 경구용 제제는 통상적인 방법으로 제조된 제제에 비하여 위장관내 소장 및 대장의 pH 조건에서 용해도가 매우 높음을 알 수 있으며, 다양한 pH 조건에서도 일정하게 용해됨을 알 수 있다.

<실험예 10> 용출율 비교 실험

본 발명의 자동 미셀화 약물 송달 시스템에 의한 애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제 및 이러한 시스템이 없는 애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제의 용출율을 측정하여 비교하였다.

실험 방법은 다음과 같다.

실시예 22 및 비교예로부터 제조된 애엽 추출물의 경구용 조성물을 포함하는 경구용 제제 중 애엽 추출물 60mg에 해당하는 양을 취하여, 상기 실험예 5과 동일 한 방법으로 제조한 pH=1.2 및 pH=6.8의 완충 용액 500㎖에 첨가하고 100rpm에서 교반하였다. 패들 방법에 의하여 교반 시간 10분, 20분, 30분, 40분, 50분 및 60분에 시료를 취하여 이로부터 추출되는 애엽 추출물의 함량을 측정하였다. 용출율은 경구용 제제에 포함되어 있는 애엽 추출물의 함량을 100으로 하고 상기 시료로부터 측정된 애엽 추출물을 이용하여 %로 측정하였다.

pH=1.2에서 측정한 용출율은 도 3에 나타내었으며, pH=6.8에서 측정한 용출율은 도 4에 나타내었다.

도 3에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 실시예 22로부터 제조된 경구용 제제(시험제제)는 10분 동안 60% 이상의 용출율을 보여주었으며, 20분∼60분 동안 일정한 용출율을 보여주었다. 반면에 비교예로부터 제조된 경구용 제제(비교제제)는 실시예 1로부터 제조된 경구용 제제에 비하여 교반 시간마다 낮은 용출율을 보여주었다. 따라서, 본 발명에 따른 경구용 제제가 pH=1.2 완충 용액에서 높은 용출율을 가지고 있음을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 경구용 제제는 교반 시간 10분 동안 급속한 용출율의 증가를 보여주고 있음을 알 수 있다.

도 4에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 실시예 22로부터 제조된 경구용 제제(시험제제)는 10분 동안 60%이상의 용출율을 보여주었으며, 20분∼60분 동안 일정한 용출율을 보여주었다. 반면에 비교예로부터 제조된 경구용 제제(비교제제)는 실시예 1로부터 제조된 경구용 제제에 비하여 교반 시간마다 낮은 용출율을 보여주었다. 따라서, 본 발명에 따른 경구용 제제가 pH=6.8 완충 용액에서 높은 용출율을 가지고 있음을 알 수 있다.

도 3 및 도 4에서 보여지는 바와 같이 본 발명에 따른 경구용 제제는 비교예로부터 제조된 경구용 제제에 비하여 pH=1.2 및 pH=6.8에서 높은 용출율을 가지고 있음을 알 수 있으며, 용출율의 형상이 유사하여 다양한 pH에서도 일정한 용출율을 가지고 있음을 알 수 있다.

<실험예 11> 혈중 농도 비교 실험

본 발명에 따른 경구용 제제와 비교예로부터 제조된 경구용 제제를 쥐에게 투여하였을 때 혈중 농도를 측정하여 비교하였다.

실험 방법은 다음과 같다.

바이오제노믹스에서 구입한 250∼310g의 실험용 수컷 흰쥐(Sprague-Dawely 계)를 약 1∼2주일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험 개시전 24시간 이상동안 절식시킨 쥐를 에테르로 마취시키고 좌측 대퇴 동맥을 캐뉼레이션(canulation)하여, 50 IU/㎖의 헤파린이 채워진 주사기가 연결되어 있는 관을 삽입하였다. 약 2시간이 지나 쥐가 마취에서 깨어나면 실시예 25로부터 제조된 연질 캡슐 제제 및 비교예로부터 제조된 제제를 경구용 존대(zonde)를 사용하여 유파틸린 20mg/kg의 용량을 투여하였다. 제제를 투여하고 0, 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 및 8시간이 지난 후에 좌측 대퇴 동맥으로부터 혈액을 채취하여 3500rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 혈장을 분리하여 분석전까지 -20℃에서 보관하였다.

혈중내의 유파틸린의 함량을 HPLC를 이용하여 정량하였다. 먼저 혈액 300㎕ 를 마이크로튜브에 넣고 초산완충 용액(acetate buffer) 100㎕ 및 -글루쿠로니다제(glucuronidase) 20㎕를 첨가한 후, 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 내부 표준 물질인 바이오체이닌 에이(biochainin A) 100㎕ 와 에테르 1.5㎖를 첨가한 후, 2분동안 볼텍싱(voltexing)하였다. 12,000 rpm에서 2분 동안 원심분리한 후 상징액을 따로 분리하고 질소가스 하에서 증발시켰다. 이동상 130 ㎕를 넣고 1분 동안 볼텍싱한 후, 그 중 100㎕를 HPLC에 주입하였다. 분석 조건은 컬럼은 하이크롬(Hichrom) RPB (250*4.6mm, 입자 크기:5㎛), 분석 파장은 350nm, 이동상은 0.5% 초산 완충액과 아세토니트릴을 부피비 50:50로 혼합한 것이다. 이동상의 유속은 1㎖/분, 시료 주입량은 100㎕이었다. 내부 표준 물질과의 면적비로서 유파틸린을 정량하였다.

그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보여지는 바와 같이, 실시예 22로부터 제조된 본 발명의 연질 캅셀제(시험제제)를 쥐에게 투여하였을 때의 혈중 농도는 비교예로부터 제조된 제제(비교제제)를 투여하였을 때의 혈중 농도보다 높음을 알 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 연질 캅셀 제제는 비교예로부터 제조된 제제에 비하여 2배 이상의 최고 혈중 농도와 10배 이상의 혈중농도곡선하면적(AUC)을 가지고 있음을 알 수 있다.

추가적으로는 비교예로부터 제조된 제제는 쥐에게 투여하고 4 시간이 지난후 혈중 농도가 0이 되었으나, 본 발명에 따른 연질 캅셀 제제는 8 시간이 지난 후 혈중 농도가 0이 되었다. 따라서, 본 발명에 따른 연질 캅셀 제제가 혈중에서 더 오랫동안 존재함을 알 수 있다. 이와 같은 실험을 통하여 본 발명에 따른 연질 캅셀 제제가 비교예로부터 제조된 제제에 비하여 생체 이용율이 더 높음을 알 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 애엽 추출물 즉, 유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C의 함량 손실없이 유해성분만을 선택적으로 제거한 애엽 추출물은 위장질환 또는 염증성 장질환의 예방 또는 치료에 뛰어난 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 디쿠마롤이 제거된 애엽 추출물은 위장관질환 또는 염증성 장질환에 대하여 기존의 애엽 추출물과 동등 이상의 효과를 나타내며, 유해성분의 선택적 제거를 통하여 장기복용에 따른 부작용의 발생 가능성을 차단한 더욱더 안전한 약제이다. 상기한 본 발명의 아테미카핀 C는 위궤양 병변 억제효과와 함께 세포보호 작용을 나타내는 프로스타글란딘의 생합성을 촉진하여 위염 및 소화성궤양에 대한 우수한 치료 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명에 따른 애엽 추출물의 약학적 조성물 및 이를 포함하는 경구용 제제는 난용성 약물인 애엽 추출물의 용해도 및 용출율을 상승시킴으로써 생체 이용율을 현저히 증가시킬 수 있도록 한다.

Claims

유파틸린, 자세오시딘 및 아테미카핀 C를 함유하고 혈액응고 억제작용을 나타내는 혈액응고 억제성분만이 선택적으로 제거된 애엽 추출물(Artemisia asiatica, A. mongolica, A. princeps, A. argyi).
제 1항에 있어서, 상기 애엽 추출물이 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출한 것을 특징으로 하는 애엽 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 혈액응고 억제성분이 디쿠마롤인 것을 특징으로 하는 애엽 추출물.
제 1항에 있어서, 상기 혈액응고 억제성분이 애엽 추출물에 알칼리 용액을 첨가하고 80℃에서 1시간 이상 반응시킨 후, 다시 산성 용액으로 중화시킴으로써 제거되는 것을 특징으로 하는 애엽 추출물.
제 4항에 있어서, 상기 알칼리 용액이 수산화칼륨 수용액인 것을 특징으로 하는 애엽 추출물.
제 4항에 있어서, 상기 산성 용액이 염산, 구연산 및 사과산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 애엽 추출물.
1) 애엽 잎을 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출하는 단계(단계 1);

2) 상기 단계 1에서 얻어진 추출물에 알칼리 용액을 첨가하고 80℃에서 1시간 이상 반응시키는 단계(단계 2);

3) 상기 단계 2에서 얻어진 추출물에 산성 용액을 첨가하여 중화시키는 단계(단계 3);및

4) 상기 단계 3에서 얻어진 추출물을 감압농축한 후 동결건조하는 단계를 포함하는 제 1항의 애엽 추출물의 제조방법.
제 7항에 있어서, 상기 알코올 또는 알코올 수용액이 70 내지 100%의 에틸알코올인 것을 특징으로 하는 애엽 추출물.
아테미카핀 C를 유효성분으로 함유하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제9항에 있어서, 상기 아테미카핀 C가 애엽으로부터 추출된 것임을 특징으로 하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 1항의 애엽 추출물을 유효성분으로 하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제11항에 있어서, 상기 위장질환이 위염, 위궤양 또는 염증성 장질환인 것을 특징으로 하는 위장질환 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제1항의 애엽 추출물, 계면 활성제 및 공용매로 이루어진 애엽 추출물의 약학적 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 계면 활성제가 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로피렌 공중합체, 천연 또는 수소화 식물성 오일과 에틸렌 글리콜의 반응 생성물, 디옥틸술포숙신산 나트륨, 라우릴 술폰산 나트륨, 인지질, 프로필렌 글리콜 모노 또는 디 지방산 에스테르, 천연 식물성 오일 트리글리세라이드와 폴리알킬렌 폴리올의 트랜스형-에스테르화 반응 생성물, 모노- 디- 또는 모노/디 글리세라이드, 스테롤 및 그 유도체로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 공용매가 프로필렌카르보네이트, 프로필렌글리콜, 에탄올, 디에틸렌글리콜 모노에틸 에테르, 글리코퓨롤, 폴리에틸렌 글리콜, 디메틸 이소소르비드 및 N-메틸 피롤리돈으로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 조성물이 애엽 추출물, 계면 활성제 및 공용매가 1:0.1∼50:0.1∼50 중량비로 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성 물.
제 13항 또는 제 16항의 약학적 조성물을 포함하는 경구용 제제.
제 17항에 있어서, 상기 경구용 제제가 정제, 환제, 산제, 경질 캅셀제, 젤라틴 밴딩한 경질 캅셀제, 연질 캅셀제, 카라멜 또는 젤리 타입의 츄정 및 수용액을 함유하는 경구용 액제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 경구용 제제.