TWI568443B - 白蠟樹萃取之新裂環烯醚萜及生物活性成分及其製備方法 - Google Patents

白蠟樹萃取之新裂環烯醚萜及生物活性成分及其製備方法 Download PDF

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白蠟樹萃取之新裂環烯醚萜及生物活性成分及其製備方法
本發明係有關於一種白蠟樹萃取之新裂環烯醚萜及生物活性成分及其製備方法；更詳而言之，係指一種從白蠟樹分析出三種新secoiridoid化合物：(8E)-4"-O-methylligstroside(1),(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)及3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)的分析系統。另外，抗發炎活性試驗之結果顯示(8E)-4"-O-methylligstroside(1),(8E)-4"-O-methyldimethyl-ligstroside(2),3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3),oleuropein(5),aesculetin(7),isoscopoletin(9),aesculetin dimethyl ester(10),fraxetin(12),tyrosol(13),4-hydroxyphenethyl acetate(14)，及(+)-pinoresinol(15)對於fMLP/CB所誘導超氧陰離子(O2 ．-)的產生，具有良好的抑制活性(IC50 7.65 μg/mL)。另外，(8E)-4"-O-methylligstroside(1),aesculetin(7),isoscopoletin(9),fraxetin(12),tyrosol(13)及4-hydroxyphenethyl acetate(14)對於fMLP/CB所誘導彈性蛋白酶(elastase)的釋放，具有良好的抑制作用(IC50 3.23 μg/mL)。
白蠟樹屬於落葉喬木，分布於中國、日本、韓國、俄羅斯及越南，白蠟樹的樹皮又稱秦皮(Qinpi)，於《神農本草經》，列為中品，歷代本草中有記載，苦澀寒、清熱燥濕、收斂、明目，主要用來治療熱痢、泄瀉，赤白帶下、目赤腫痛、目生翳膜；白蠟樹具有消炎鎮痛、止咳、祛痰、平喘、利尿、促進尿酸排泄、促進血液循環、抑制腸蠕動、抗腫瘤、抗過敏、防紫外線作用、抗微生物等作用。
本案發明人從事醫藥相關研究多年，對於醫藥相關知識有相當程度的了解，由前述分析得知，白蠟樹治療效果廣泛，本發明人認為此藥材治療效果應不止於此，所以針對白蠟樹研究是否還有新的治療功能。
有鑑於此，本案發明人遂依其多年從事相關領域之研發經驗，針對前述進行深入研究，並依前述尋找新的萃取化合物方法，歷經長時間的努力研究與多次測試，終於完成本發明。
本發明之主要目的係在提供一種白蠟樹萃取之新裂環烯醚萜及生物活性成分及其製備方法，並藉由各種實驗數據分析得到的三種新secoiridoid化合物及具有抗發炎活性之化合物。
A.利用本發明所述之萃取、層析、純化及結構解析步驟，發現三個新化合物：(8E)-4"-O-methylligstroside(1),(8E)-4"-O-methyldimethyl-ligstroside(2)及3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)。
B.三個新化合物之實驗數據如下： (8E)-4"-O-methylligstroside(1)：yellow oil；[α]25 D=-182.2°(c 0.2,MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)238(4.05),276(3.82),283(3.81),318(3.76)nm；IR(neat)υmax 3402(OH),1727(C=O),1709(C=O)cm-1；1H NMR(CD3OD,500 MHz)：δ 1.63(3H,dd,J=7.0,1.0 Hz,H-10),2.44(1H,dd,J=14.0,9.5 Hz,Hα-6),2.69(1H,dd,J=14.0,4.5 Hz,Hβ-6),2.85(2H,t,J=7.0 Hz,H-β),3.30-3.35(3H,m,H-2',4',5'),3.41(1H,dd,J=9.0,8.5 Hz,H-3'),3.66(1H,dd,J=12.0,5.5 Hz,H-6'),3.71(3H,s,OMe-11),3.76(3H,s,OMe-4"),3.88(1H,dd,J=12.0 Hz,H-6'),3.96(1H,m,J=9.5,4.5 Hz,H-5),4.12(1H,dt,J=10.5,7.0 Hz,H-α),4.24(1H,dt,J=10.5；7.0 Hz,H-α),4.80(1H,d,J=8.0 Hz,H-1'),5.92(1H,br s,H-1),6.06(1H,br q,J=7.0,H-8),6.85(each 1H,d,J=9.0 Hz,H-3",5"),7.15(each 1H,d,J=9.0 Hz,H-2",6"),7.51(1H,s,H-3)；13C NMR(CD3OD,125 MHz)：δ 13.7(C-10),32.0(C-5),35.2(C-β),41.3(C-6),52.1(OMe-11),55.9(OMe-4"),62.9(C-6'),67.0(C-α),71.7(C-4'),74.9(C-2'),78.1(C-3'),78.6(C-5'),95.3(C-1),101.0(C-1'),109.5(C-4),115.1(C-3",5"),125.1(C-8),130.1(C-9),131.2(C-2",6"),131.5(C-1"),155.3(C-3),160.0(C-4"),168.9(C-11),173.4(C-7)；ESIMS m/z 561[M+Na]+；HRESIMS m/z 561.1950[M+Na]+(calcd for C26H34O12Na,561.1948).
(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)：yellowish oil；[α]25 D=-182.5°(c 0.25,MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)225(4.04),276(3.80),282(3.79),317(3.73)nm；IR(KBr)υmax3334(OH),1728(C=O),1707(C=O)cm-1；1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δ 1.66(3H,dd,J=7.0,1.0 Hz,H-10),2.41(1H,dd,J=14.0,9.5 Hz,H-6),2.79(1H,dd,J=14.0,4.5 Hz,H-6),2.85(2H,t,J=7.0 Hz,H-β),3.29-3.35(3H,m,H-2',4',5'),3.41(1H,dd,J=9.0,8.5 Hz,H-3'),3.67(1H,dd,J=12.0,5.5 Hz,H-6'),3.76(3H,s,OMe-4"),3.88(1H,dd,J=12.0,1.5 Hz,Hβ-6'),4.01(1H,m,J=9.5,5.0 Hz,H-5),δ 4.12(1H,dt,J =10.5,7.0 Hz,H-α),4.23(1H,dt,J=10.5,7.0 Hz,H-α),4.80(1H,d,J=8.0 Hz,H-1'),5.87(1H,br s,H-1),6.05(1H,br q,J=7.0,H-8),6.85(each 1H,d,J=9.0 Hz,H-3",5"),7.15(each 1H,d,J=9.0 Hz,H-2",6"),7.39(1H,s,H-3)；13C-NMR(CD3OD,125 MHz)δ 13.6(C-10),31.9(C-5),35.2(C-β),41.3(C-6),55.9(OMe-4"),62.9(C-6'),66.9(C-α),71.6(C-4'),74.9(C-2'),78.1(C-3'),78.6(C-5'),95.0(C-1),101.0(C-1'),110.2(C-4),115.1(C-3",5"),125.1(C-8),130.1(C-9),131.2(C-2",6"),131.5(C-1"),152.8(C-3),160.0(C-4"),171.0(C-11),173.3(C-7)；ESI-MS m/z 547[M+Na]+；HR-ESI-MS m/z 547.1787[M+Na]+(calcd for C25H32O12Na,547.1791).
3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)：amorphous powder；[α]25 D=-155.2°(c 0.22,MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)226(4.24),277(3.40)nm；IR(KBr)υmax3350(OH),1721(C=O),1698(C=O)cm-1；1H-NMR(CD3OD,500 MHz)δ 1.66(3H,dd,J=7.0,1.0 Hz,H-10),2.41(1H,dd,J=14.0,9.5 Hz,Hα-6),2.80(1H,dd,J=14.0,4.5 Hz,Hβ-6),2.86(2H,t,J=7.0 Hz,H-β),3.28-3.36(3H,m,H-2',4',5'),3.41(1H,dd,J=8.5,8.5 Hz,H-3'),3.66(1H,dd,J=12.0,5.5 Hz,H-6'),3.80(3H,s,OMe-4"),3.82(3H,s,OMe-3"),3.88(1H,dd,J=12.0,1.5 Hz,H-6'),4.00(1H,dd,J=9.5,4.5 Hz,H-5),4.15(1H,dt,J=10.5,7.0 Hz,H-α),4.27(1H,dt,J=10.5；7.0 Hz,H-α),4.80(1H,d,J=8.0 Hz,H-1'),5.86(1H,br s,H-1),6.06(1H,br q,J=7.0,H-8),6.79(1H,dd,J=8.5；2.0 Hz,H-2"),6.86(1H, d,J=2.0 Hz,H-2"),6.88(1H,d,J=8.5 Hz,H-5"),δ 7.38(1H,s,H-3)；13C-NMR(CD3OD,125 MHz)δ 13.6(C-10),32.0(C-5),35.7(C-β),41.3(C-6),56.7(OMe×2),62.9(C-6'),66.8(C-α),71.6(C-4'),74.9(C-2'),78.1(C-3'),78.6(C-5'),95.3(C-1),101.0(C-1'),110.1(C-4),113.3(C-5"),114.1(C-3"),122.6(C-6"),124.7(C-8),130.6(C-9),132.5(C-1"),149.3(C-4"),150.5(C-3"),152.9(C-3),171.0(C-11),173.3(C-7)；ESI-MS m/z 577[M+Na]+；HR-ESI-MS m/z 577.1892[M+Na]+(calcd for C26H34O13Na,577.1897).
C.白蠟樹分離之化合物，藉由抑制formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine/cytochalasin B(fMLP/CB)所誘導人類嗜中性白血球產生超氧陰離子(O2 ．-)及彈性蛋白酶(elastase)之效果，來評估其抗發炎活性。抗發炎活性試驗之結果顯示(8E)-4"-O-methylligstroside(1),(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2),3",4"-di-O-methyldemethyl-oleuropein(3),oleuropein(5),aesculetin(7),isoscopoletin(9),aesculetin dimethyl ester(10),fraxetin(12),tyrosol(13),4-hydroxyphenethyl acetate(14)，及(+)-pinoresinol(15)對於fMLP/CB所誘導超氧陰離子(O2 ．-)的產生，具有良好的抑制活性(IC50 7.65 μg/mL)。另外，(8E)-4"-O-methylligstroside(1),aesculetin(7),isoscopoletin(9),fraxetin(12),tyrosol(13)及4-hydroxyphenethyl acetate(14)對於fMLP/CB所誘導彈性蛋白酶(elastase)的釋放，具有良好的抑制作用(IC50 3.23 μg/mL)。
D. 在所有分離化合物中，(8E)-4"-O-methylligstroside(1)及fraxetin(12)為最有效的化合物，其對於抑制fMLP/CB所誘導超氧陰離子的產生及彈性蛋白酶的釋放之IC50值，分別為0.08±0.01及0.50±0.10μg/mL。此兩種化合物具有研究開發為抗發炎藥之潛力。
為期許本發明之特徵及結構能夠有更詳盡之了解，請配合參閱圖一至圖十五；圖一係為(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之核磁共振氫譜，圖二係為(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之核磁共振碳譜，圖三係為(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之HMBC圖譜，圖四係為(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之NOSEY圖譜，圖五係為(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之高解析電灑游離質譜，圖六係為(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之核磁共振氫譜，圖七係為(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之核磁共振碳譜，圖八係為(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之HMBC圖譜，圖九係為(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之NOSEY圖譜，圖十係為(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之高解析電灑游離質譜，圖十一係為3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之核磁共振氫譜，圖十二係為3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之核磁共振碳譜，圖十三係為3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之HMBC圖譜，圖十四係為3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之NOSEY圖譜，圖十五係為3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之高解析電灑游離質譜。本發明所述之萃取新聯苯化合物製備方法，其步驟如下：
A. 將白蠟樹莖皮切碎陰乾後共得4.0kg，以甲醇冷浸抽取三次， 所得之抽取液經減壓濃縮後，得到MeOH浸膏384g，接著以EtOAc：H2O(1：1,v/v)進行分配，得到EtOAc層抽出液，經減壓濃縮後得到EtOAc層抽出物(Fr.A,180g)。再將H2O層抽出液與n-Hexane(1：1,v/v)再進行分配，得到n-B Hexane層抽出物(Fr.B,56g)及H2O層抽出物(Fr.C,119g)。
B. EtOAc層抽出物(Fr.A,180g)經管柱層析法分離，由CH2Cl2開始沖湜，漸次增加CH2Cl2及MeOH以提高其極性，共得到10個分劃：Fr.A1(5 L,CH2Cl2),A2(6 L,CH2Cl2/MeOH,90：1),A3(9 L,CH2Cl2/MeOH,80：1),A4(6 L,CH2Cl2/MeOH,60：1),A5(5 L,CH2Cl2/MeOH,50：1),A6(10 L,CH2Cl2/MeOH,40：1),A7(5 L,CH2Cl2/MeOH,20：1),A8(3 L,CH2Cl2/MeOH,10：1),A9(4 L,CH2Cl2/MeOH,1：1),A10(2 L,MeOH)。
C. Fr.A1(5.8g)經管柱層析法分離，以n-hexane/acetone(2：1)進行沖提，得到8個分劃(each 500mL,Fr.A1-1~A1-8)。由Fr.A1-1得到4-hydroxyphenethyl acetate(14)(6.6mg)(R f =0.78)。Fr.A1-5(mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/EtOAc,8：1)純化，得到(+)-pinoresinol(15)(5.5mg)(R f =0.32)。
D. Fr.A3(7.8g)經由管柱層析法分離，以n-hexane/EtOAc(1：1)進行沖提，共得到10個分劃(each 300mL,Fr.A3-1~Fr.A3-10)。由Fr.A3-1得到isoscopoletin(9)(1.0mg)(R f =0.81)。Fr.A3-4(190mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/MeOH,25：1)純化，得到fraxidin(11)(1.5mg)(R f =0.41)。由Fr.A3-8得到tyrosol(13)(4.9mg)(R f =0.52)。Fr.A3-10(190mg)以preparative TLC(silica gel,n-hexane/EtOAc,1：1)純化，得到 fraxetin(12)(5.9mg)(R f =0.30)。
E. Fr.A4(8.5g)經由管柱層析法分離，以CH2Cl2/acetone(10：1)沖提，共得到5分劃(each 1.2 L,Fr.A4-1~Fr.A4-5)。Fr.A4-2再次使用管柱層析法分離，以n-hexane/acetone(3：2)沖提，共得到4分劃(each 1.2 L,Fr.A4-2-1~Fr.A4-2-4)。Fr.A4-2-3(195mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/acetone,15：1)純化，得到scopoletin(8)(3.1mg)(R f =0.39)。Fr.A4-3(192mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/acetone,5：1)純化，得到aesculetin(7)(3.9mg)(R f =0.46)。
F. Fr.A6(8.2g)經由管柱層析法分離，以CH2Cl2/EtOAc(10：1)沖提，共得到7個分劃(each 1 L,Fr.A6-1~Fr.A6-7)。Fr.A6-4(180mg)以preparative TLC(silica gel,n-hexane/EtOAc,2：1)純化，得到aesculetin dimethyl ester(10)(1.5mg)(R f =0.71)。Fr.A6-7(28mg)以preparative TLC(silica gel,CHCl3/MeOH8：1)純化，得到oleoside methyl ester(6)(4.5mg)(R f =0.19)。
G. Fr.A9(7.3g)經由管柱層析法分離，以CH2Cl2/MeOH(7：1)進行沖提，共得到4個分劃(each 500mL,Fr.A9-1~Fr.A9-4)。Fr.A9-2(202mg)以preparative TLC(silica gel,CHCl3/MeOH 7：1)純化，得到(8E)-4"-O-methylligstroside(1)(4.5mg)(R f =0.66)。Fr.A9-4(188mg)再次使用管柱層析法分離，以CHCl3/MeOH(3：1)沖提，共得到2分劃(each 150mL,Fr.A9-4-1~Fr.A9-4-2)。Fr.A9-4-1(210mg)以preparative TLC(silica gel,CHCl3/MeOH,4：1)純化，得到3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)(3.1mg)(R f =0.61)。Fr. A9-4-2(205mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/MeOH,5：1)純化，得到(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)(4.2mg)(R f =0.55)。
H. Fr.A10(6.8g)經由管柱層析法分離，以CH2Cl2/MeOH(7：1)進行沖提，共得到4個分劃(each 700mL,Fr.A10-1~Fr.A10-4)。Fr.A10-1(200mg)以preparative TLC(silica gel,CHCl3/MeOH,7：1)純化，得到(8E)-ligstroside(4)(7.3mg)(R f =0.65)。Fr.A10-2(180mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/acetone 1：2)純化，得到oleuropein(5)(3.6mg)(R f =0.35)。
將上述步驟之純化所得化合物進行抗發炎活性檢測，如下列步驟所示：
一、實驗材料：
(A)白蠟樹莖皮部所分離之化合物
(B)human neutrophils
(C)HBSS：Hank’s buffered saline solution
(D)fMLP：formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine
(E)CB：cytochchalasin B
(F)SOD：superoxide dismutase
(G)ferricytochrome c
二、實驗方法： (A)人類嗜中性白血球的製備
自年約20-30歲的健康捐血者(作息正常且禁服藥物二週以上)，以真空無菌採血管於手肘靜脈採血，約30-80ml。利用Ficoll gradient離心方法，將嗜中性白血球分離，方法如下：25℃，650g，男性全 血離心10min，女性全血則離心8min，去除上清液，將下層血球的部份和3% dextran溶液以等體積混合，於室溫下靜置30min。將含豐富嗜中性白血球的上層覆蓋於等體積Histopaque-1077溶液的50ml離心管中，於20℃下，400g，離心35min，取pellet。利用低張溶液溶血的方法將殘存的紅血球脹破。最後，於4℃下，離心，去除上清液，將分離出的嗜中性白血球懸浮於冰浴的Hank’s buffered saline solution(HBSS)中。
(B)超氧陰離子自由基(O2 ．-)釋放之測定
將含有0.5mg/ml ferricytochrome c、1mM CaCl2及1mM MgCl2的嗜中性白血球的懸浮液(6×105cells/ml)，預熱5分鐘使其達37℃，在加入待測藥物作用5分鐘後，再加入fMLP(0.1μM)/cyto-chalasin B(CB,1μg/ml)反應10分鐘。使用紫外光分光光度計，於波長550nm下測量其吸光值。實驗中評估嗜中性白血球所釋出超氧自由基的量(extinction coefficient 21.1/mM/cm)可以經由superoxide dismutase(SOD,100U/ml)抑制ferricytochrome c還原，計算得知。
△A550=extinction coefficient×1×△C
△C=△A550/(21.1/mM/cm×1cm)
△C=△A550×47.4nmol/ml
其中為△A550待測樣品的吸光值減去SOD抑制組之吸光值，△C為待測檢品的O2 ．-產量。
(C)彈性蛋白酶(elastase)釋放之測定
嗜中性白血球的懸浮液含Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide(Ms-Ala-Ala-Pro-Val-pNA)，預熱5分鐘使達37℃，加 入待測藥物作用5分鐘後，再加入fMLP/CB反應10分鐘。使用紫外光分光光度計，於波長405nm下測量其吸光值。
三、實驗原理：
以fMLP/CB(formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine/cyto-chalasin B)來誘導嗜中性白血球(neutrophil)產生超氧陰離子(superoxide anion)及彈性蛋白酶(elastase)，而超氧陰離子的產生及彈性蛋白酶的釋放與發炎性疾病的發生有關。因此，藉由對fMLP/CB誘導超氧陰離子產生及彈性蛋白酶釋放的抑制效果，可以用來評估分離化合物之抗發炎活性。
四、統計分析：
實驗結果以平均值±標準差(SEM)(n=4)來呈現，且使用『Student’s t test』做比較，probability為0.05或以下被認為具統計學意義。
五、結果與討論
對木犀科植物白蠟樹莖皮進行化學成分之研究，目前由厚朴樹皮共分離得到3個為新secoiridoid化合物：(8E)-4"-O-methylligstroside(1),(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)及3",4"-di-O-methyldemethyl-oleuropein(3)，以及12個已知化合物(4-15)。上述化合物經各種實驗數據分析(包括2D-NMR：NOESY,COSY,HMBC,HSQC...等)以及比對相關文獻上之數據，而確認其結構。
1.化合物結構鑑定
三個為新聯苯化合物(1-3)以UV,IR,ESI-MS,HR-ESI-MS,NMR(1H-NMR,13C-NMR,DEPT,COSY,NOESY,HSQC,HMBC....),.....等各種實驗資料，決定其化學結構。十二個已知化合物(4-15)，包括3個 secoiridoids(8E)-ligstroside(4),oleuropein(5)及oleoside methyl ester(6)；6個coumarins：aesculetin(7),scopoletin(8),isoscopoletin(9),aesculetin dimethyl ether(10),fraxidin(11)及fraxetin(12)；2個phenylethanoids：tyrosol(13)及4-hydroxyphenethyl acetate(14)以及1個lignan：(+)-pinoresinol(15)，經與文獻資料比對其1H-NMR、IR、UV、MS等數據，結果均一致而確定其結構。
2.生理活性研究
發炎，是人體正常的防禦反應，為了對抗外來病原菌而產生的保護機制，在局部呈現紅、熱、腫、痛等徵狀之現象。白血球在對抗外來病原菌時，會使用高氧化力的自由基，不但會殺死外來病原菌，同時周遭的正常組織或細胞也常被波及。正常細胞的DNA一旦受損，基因就會發生突變，影響細胞的生長與分化。若在重要的基因中產生突變，形成惡性腫瘤的機會就大增。由於慢性發炎是經年累月地刺激正常細胞，染色體的變異也一直在累積，最後就導致癌症，或者免疫系統也可能因為長期的負荷，讓許多慢性退化性疾病開始產生。
研究指出約有百分之三十的癌症與慢性發炎或慢性感染有關；尤其是心肌梗塞、糖尿病、阿茲海默氏症、癌症、過敏性及自體免疫疾病等，現在有愈來愈多的證據顯示都與慢性發炎息息相關。舉例來說，有些心臟病發作的人，其實本身的膽固醇並不高，血管壁上慢性發炎所造成的粥狀硬化塊剝落，啟動凝血機制，阻塞冠狀動脈才是心肌梗塞的原因；肝的慢性發炎變成肝癌，就是免疫系統的攻擊所造成的；子宮頸癌也是體內為了對抗人類乳突病毒的發炎反應所引起的；胃液逆流造成食道發炎也容易產生食道癌。因此，理論上如果能夠阻斷發 炎反應，就可以明顯地抑制癌細胞。
當人類嗜中性白血球(neutrophil)受到刺激活化後，會釋放出超氧陰離子(superoxide anion,O2 ．-)、過氧化氫(hydrogen peroxide)及氫氧自由基(hydroxyl radical)等活性氧類[(reactive oxygen species(ROS)]，以及會釋放出彈性蛋白酶(elastase),β-glucuronidase,lysozyme,PAF等媒介物質，而上述物質均和發炎性疾病有關如：類風濕關節炎、腎絲球腎炎、皮膚病、局部缺血性再灌流損傷、心肌梗塞、慢性肺阻塞疾病及氣喘。抑制嗜中性白血球過度或不適當活化被認為可以改善這些發炎性疾病。因此新的治療與預防發炎性疾病的藥物之開發，一直是醫藥界研究探討的熱門話題。由過去天然物所分離有關抗發炎活性成分之研究，顯示flavonoids、terpenoids及lignans等成分具有良好的抗發炎活性，因此由天然物經由抗發炎試驗之體外篩選，選擇抗發炎活性較『佳』之植物進行成分分離與藥理評估，對於開發新的抗發炎藥物是可行之路。
白蠟樹莖皮分離之化合物，藉由抑制formyl-L-methionyl-L-leucyl-L-phenylalanine/cytochalasin B(fMLP/CB)所誘導人類嗜中性白血球產生超氧陰離子(O2 ．-)及彈性蛋白酶(elastase)之效果，以評估其抗發炎活性。抗發炎活性之數據列於表一。Diphenyleneiodonium及phenylmethylsulfonyl fluoride分別當作[O2 .-產生]及[elastase釋放]之positive control。對於抗發炎試驗之結果，可歸納出以下七點結論：
(a)(8E)-4"-O-methylligstroside(1),(8E)-4"-O-methyldimethyl-ligstroside(2),3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3),oleuropein(6),aesculetin(9),isoscopoletin(11),aesculetin dimethyl ester(12),fraxetin(14),tyrosol(21),4-hydroxyphenethyl acetate(22)及 (+)-pinoresinol(24)對於fMLP/CB所誘導超氧陰離子的產生，具有良好的抑制活性(IC50 7.65μg/mL)。
(b)(8E)-4"-O-methylligstroside(1),aesculetin(9),isoscopoletin(11),fraxetin(14),tyrosol(21)及4-hydroxyphenethyl acetate(22)對於fMLP/CB所誘導彈性蛋白酶的釋放，具有良好的抑制活性(IC50 3.23μg/mL)。
(c)在C-4"位具有methoxyl group之(8E)-4"-O-methylligstroside(1)，對於超氧陰離子及彈性蛋白酶的抑制效果，比其類似化合物(8E)-ligstroside(5)(C-4"位具有hydroxy group)更有效。
(d)在C-6,7位具有取代基之coumarin類似化合物(7-10)中，具有6,7-dihydroxy group之aesculetin(7)對於超氧陰離子(O2 ．-)的抑制效果比8-10更有效。
(e)在C-6,7,8位具有取代基之coumarin類似化合物(11,12)中，具有7-hydroxy group之fraxetin(12)，對於超氧陰離子及彈性蛋白酶的抑制效果，比其類似化合物fraxedin(11)(C-7位具有methoxy group)更有效。
(f)在所有分離化合物中，(8E)-4"-O-methylligstroside(1)及fraxetin(12)為最有效的化合物，其對於抑制fMLP/CB所誘導超氧陰離子的產生及彈性蛋白酶的釋放之IC50值，分別為分別為0.08±0.01及0.50±0.10μg/mL。
圖一：(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之核磁共振氫譜；圖二：(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之核磁共振碳譜；圖三：(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之HMBC圖譜；圖四：(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之NOESY圖譜；圖五：(8E)-4"-O-methylligstroside(1)之高解析度電灑游離質譜；圖六：(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之核磁共振氫譜；圖七：(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之核磁共振碳譜；圖八：(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之HMBC圖譜；圖九：(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之NOESY圖譜；圖十：(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)之高解析度電灑游離質譜；圖十一：3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之核磁共振氫譜；圖十二：3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之核磁共振碳譜；圖十三：3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之HMBC圖譜；圖十四：3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之NOESY圖譜； 圖十五：3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)之高解析度電灑游離質譜。

Claims (3)

  1. 一種白蠟樹萃取之新裂環烯醚萜及生物活性成分的製備方法，乃藉由下列步驟方法製備得：A. 將白蠟樹莖皮切碎陰乾後共得4.0kg，以甲醇冷浸抽取三次，所得之抽取液經減壓濃縮後，得到MeOH浸膏384g，接著以EtOAc：H2O(1：1,v/v)進行分配，得到EtOAc層抽出液，經減壓濃縮後得到EtOAc層抽出物(Fr.A,180g)。再將H2O層抽出液與n-Hexane(1：1,v/v)再進行分配，得到n-B Hexane層抽出物(Fr.B,56g)及H2O層抽出物(Fr.C,119g)。B. EtOAc層抽出物(Fr.A,180g)經管柱層析法分離，由CH2Cl2開始沖湜，漸次增加CH2Cl2及MeOH以提高其極性，共得到10個分劃：Fr.A1(5 L,CH2Cl2),A2(6 L,CH2Cl2/MeOH,90：1),A3(9 L,CH2Cl2/MeOH,80：1),A4(6 L,CH2Cl2/MeOH,60：1),A5(5 L,CH2Cl2/MeOH,50：1),A6(10 L,CH2Cl2/MeOH,40：1),A7(5 L,CH2Cl2/MeOH,20：1),A8(3 L,CH2Cl2/MeOH,10：1),A9(5 L,CH2Cl2/MeOH,1：1),A10(2 L,MeOH)。C. Fr.A1(5.8g)經管柱層析法分離，以n-hexane/acetone(2：1)進行沖提，得到8個分劃(each 500mL,Fr.A1-1~A1-8)。由Fr.A1-1得到4-hydroxyphenethyl acetate(14)(6.6mg)(R f =0.78)。Fr.A1-5(mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/EtOAc,8：1)純化，得到(+)-pinoresinol(15)(5.5mg)(R f =0.32)。D. Fr.A3(7.8g)經由管柱層析法分離，以n-hexane/EtOAc(1：1)進行 沖提，共得到10個分劃(each 300mL,Fr.A3-1~Fr.A3-10)。由Fr.A3-1得到isoscopoletin(9)(1.0mg)(R f =0.81)。Fr.A3-4(190mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/MeOH,25：1)純化，得到fraxidin(11)(1.5mg)(R f =0.41)。由Fr.A3-8得到tyrosol(13)(4.9mg)(R f =0.52)。Fr.A3-10(190mg)以preparative TLC(silica gel,n-hexane/EtOAc,1：1)純化，得到fraxetin(12)(5.9mg)(R f =0.30)。E. Fr.A4(8.5g)經由管柱層析法分離，以CH2Cl2/acetone(10：1)沖提，共得到5分劃(each 1.2 L,Fr.A4-1~Fr.A4-5)。Fr.A4-2再次使用管柱層析法分離，以n-hexane/acetone(3：2)沖提，共得到4分劃(each 1.2 L,Fr.A4-2-1~Fr.A4-2-4)。Fr.A4-2-3(195mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/acetone,15：1)純化，得到scopoletin(8)(3.1mg)(R f =0.39)。Fr.A4-3(192mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/acetone,5：1)純化，得到aesculetin(7)(3.9mg)(R f =0.46)。F. Fr.A6(8.2g)經由管柱層析法分離，以CH2Cl2/EtOAc(10：1)沖提，共得到7個分劃(each 1 L,Fr.A6-1~Fr.A6-7)。Fr.A6-4(180mg)以preparative TLC(silica gel,n-hexane/EtOAc,2：1)純化，得到aesculetin dimethyl ester(10)(1.5mg)(R f =0.71)。Fr.A6-7(28mg)以preparative TLC(silica gel,CHCl3/MeOH 8：1)純化，得到oleoside methyl ester(6)(4.5mg)(R f =0.19)。G. Fr.A9(7.3g)經由管柱層析法分離，以CH2Cl2/MeOH(7：1)進行沖提，共得到4個分劃(each 500mL,Fr.A9-1~Fr.A9-4)。Fr.A9-2(202 mg)以preparative TLC(silica gel,CHCl3/MeOH 7：1)純化，得到(8E)-4"-O-methylligstroside(1)(4.5mg)(R f =0.66)。Fr.A9-4(188mg)再次使用管柱層析法分離，以CHCl3/MeOH(3：1)沖提，共得到2分劃(each 150mL,Fr.A9-4-1~Fr.A9-4-2)。Fr.A9-4-1(210mg)以preparative TLC(silica gel,CHCl3/MeOH,4：1)純化，得到3",4"-di-O-methyldemethyloleuropein(3)(3.1mg)(R f =0.61)。Fr.A9-4-2(205mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/MeOH,5：1)純化，得到(8E)-4"-O-methyldimethylligstroside(2)(4.2mg)(R f =0.55)。H. Fr.A10(6.8g)經由管柱層析法分離，以CH2Cl2/MeOH(7：1)進行沖提，共得到4個分劃(each 700mL,Fr.A10-1~Fr.A10-4)。Fr.A10-1(200mg)以preparative TLC(silica gel,CHCl3/MeOH,7：1)純化，得到(8E)-ligstroside(4)(7.3mg)(R f =0.65)。Fr.A10-2(180mg)以preparative TLC(silica gel,CH2Cl2/acetone 1：2)純化，得到oleuropein(5)(3.6mg)(R f =0.35)。
  2. 一種白蠟樹萃取之新裂環烯醚萜： (8E)-4"-O-Methyldemethylligstroside(2)
  3. 一種白蠟樹萃取之新裂環烯醚萜： 3",4"-di-O-Methyldemethyloleuropein(3)
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