KR20220068046A

KR20220068046A - 민물김 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220068046A
Application number: KR1020200154950A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 김성규; 박상희; 이채영; 임혜연; 김동삼; 장석구; 박경자; 최영임
Original assignee: 삼척시
Priority date: 2020-11-18
Filing date: 2020-11-18
Publication date: 2022-05-25
Also published as: KR102506493B1

Abstract

본 발명은 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 부종 또는 염증관련 단백질 및 염증 신호전달 관련 단백질의 발현 등을 효과적으로 억제하여 항부종용 조성물로 용이하게 사용 가능하다.

Description

민물김 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating edema comprising Prasiola japonica extract or fraction thereof as active ingredient}

본 발명은 민물김의 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 민물김의 에탄올-클로로포름 분획물을 유효성분으로 부종 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

부종(edema)은 조직 내에 림프액이나 조직 삼출물 등의 액체가 고여 과잉 존재하는 상태를 의미하는 것으로, 국소 부종과 전신 부종으로 분류하여 원인을 평가해볼 수 있다. 국소 부종은 정맥 부전, 림프관의 폐색, 염증이나 국소적인 과민반응에 의하여 발생하나, 전신 부종은 대개 심부전증이나 간경변증, 폐성심, 영양결핍, 갑상선 기능 저하증이나 신증후군과 같은 질병의 증상으로 나타난다. 일부 환자에서는 일반적인 부종의 원인이나 기전을 찾을 수 없는 경우도 있는데 이를 특발성 부종이라고 한다.

특발성 부종은 일반적으로 여성에게서 나타나며, 이러한 여성 부종은 일반적인 부종의 증상 외에 동반되는 증상으로 생리전후, 배란기, 출산 전후로 더욱 심해진다. 특히, 산전산후 부종은 여성이 출산 전과 출산 후에 생기는 부종으로 몸이 붓는 현상을 말한다. 산전산후 부종의 원인은 출산 전후 과정의 피로, 스트레스, 호르몬의 작용으로 인해 우리 몸에 나트륨이 축적되면서 발생하거나, 또는 운동량이 부족하여 원활한 혈액 순환이 이루어지지 않아 더욱 심해지며, 자궁이나 회음부위 또는 제왕절개 부위에 염증반응으로 나타나기도 한다.

산후 부종은 흔히들 누구에게나 있는 증상이라고 생각하거나 곧 없어질 것으로 생각하는 것이 가장 큰 문제인데, 이는 평소 심장이 허약하거나 관절염 등이 있는 사람에게 잘 나타나며, 다른 증상을 치료하는데 시간을 빼앗기거나 산후 허약을 치료하다가 치료시기를 놓치는 경우도 많다.

또한, 대부분의 산모들은 산후 부종을 개선하기 위해 이뇨작용을 촉진시키는 식품을 섭취하는데 이 경우 신진대사가 저하되고 영양분이 손실되어 산후풍, 관절통으로 고생하는 경우가 있으며, 평생을 심각한 출산후유증으로 고생하는 경우도 있어, 적절한 치료 또는 개선을 위한 방법이 요구된다.

민물김(Prasiola japonica)은 물김이라는 이름으로 구전되어 왔으며, 현대에 이르러 민물김으로 알려지고 있다. 민물김은 홍조류인 바다김과 달리 녹조류(Green algae, Phylum Chlorophyta)로서 바다가 아닌 민물에서 생육하며, 민물파래과(Prasiolacease)에 포함된다(Park, M. K. et al., J. Plant Bio., 13, 1-10, 1970). 일본에서는 민물김을 카와노리(하천김)라는 이름으로 부르고 있으며, 하천김과 같은 민물 조류를 인공배양하여 높은 상업적 이윤을 창출하고 있다. 우리나라 민물김은 1938년 일본 학자인 Okada가 함경남도 문천군 문천면에서 최초로 채취하여 Prasiola formosana var. coreana Okada로 명명하여 발표한 것이 효시이며 (Okada, Y., J. Jpn. Bot., 15, 449-452, 1939), 삼척군의 집단에 대한 형태 및 생태학적 연구가 수행된 바가 있다(Park, M. K. et al., J. Plant Bio., 13, 1-10, 1970). 우리나라에서는 산업화에 따른 인위적 영향으로 40여년 전에 이미 사라진 종으로 알려졌으나 아직 강원도 삼척시의 소한천에 민물김이 분포하고 있음이 밝혀졌다.

민물김과 같은 녹조류 유래 추출물이 항고혈압 및 미코스포린-유사 아미노산(mycosporine-like amino acids, MAAs)에 의한 자외선 차단 등의 활성을 가지는 것으로 보고되었다(Cha, S. H. et al., J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 35, 307-314, 2006; Groniger, A. et al., J. Photochem. Photobiol. B., 66, 54-59, 2002). 한편 일본에서 민물유래 식용김으로 사용하고 있는 스이젠지노리(Suizenzinori, Aphanothece sacrum)에는 고 함량의 철분 및 칼슘 등 미네랄 성분이 풍부한 것으로 조사되었으며, 알러지성 피부염을 억제하는 성분인 사크란 (Sacran, sulfated polysaccharide)이 함유되어 있어 약리학적 활용도가 높게 평가되고 있다(Ngatu, N. R. et al., Ann. Allergy Asthma Immunol., 108, 117-122, 2012). 그러나, 국내 자생 민물김에 대한 생리활성물질 성분분석 및 약리학적 분석에 대한 연구는 아직까지 많이 이루어지지 않고 있는 실정이다.

한편, 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 조성물과 관련된 종래선행문헌으로서, 선행문헌 [Seo, D. W. et al., J. Biomed. Res., 14(2), 83-90, 2013] 및 [Sa, J. H. et al., Rep. Inst. Health & Environ., 25, 52-62, 2014]에는 민물김 추출물의 생리활성(항암 효과, 항염증 효과, 항산화 효과, 항당뇨 효과, 자외선 차단효과)이 개시되었으며, 한국등록특허 제10-1853687호에는 방사무늬김 추출물의 스테롤 분획물을 포함하는 항염증 조성물 및 방사무늬김 추출물의 스테롤 분획물의 제조방법이 개시되었고, 한국등록특허 제10-1015702호에는 해조추출물을 포함하는 염증 및 피부자극 개선 및 완화용 조성물이 개시되었으며, 한국등록특허 제10-1479096호에는 생약혼합물의 추출물을 함유하는 산전산후부종 예방 또는 개선용 건강기능식품이 개시된 바 있다. 그러나, 본 발명과 같이 민물김 추출물의 부종 예방 또는 치료 효과에 대해 직접적인 확인 실험을 개시한 이전 보고는 아직 없다.

이에 따라 본 발명자들은 민물김 추출물을 연구하는 과정에서, 상기 민물김 추출물 또는 분획물을 부종이 유발된 동물 모델에 처리하는 경우 부종의 정도가 현저하게 감소하였으며, 특히 산후 부종에 효과적임을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

한국등록특허 제10-1853687호, 방사무늬김 추출물의 스테롤 분획물을 포함하는 항염증 조성물 및 방사무늬김 추출물의 스테롤 분획물의 제조방법, 2018년 04월 25일, 등록. 한국등록특허 제10-1015702호, 해조추출물을 포함하는 염증 및 피부자극 개선 및 완화용조성물, 2011년 02월 10일, 등록. 한국등록특허 제10-1479096호, 생약혼합물의 추출물을 함유하는 산전산후부종 예방 또는 개선용 건강기능식품, 2014년 12월 29일, 등록.

Cha, S. H. et al., Screening of extracts from marine green and brown algae in Jeju for potent marine angiotension-I converting enzyme(ACE) inhibitory activity, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 35, 307-314, 2006. Groniger, A. et al., Induction of the synthesis of an UV-absorbing substance in the green alga Prasiola stipitata, J. Photochem. Photobiol. B., 66, 54-59, 2002. Ngatu, N. R. et al., Anti-inflammatory effects of sacran, a novel polysaccharide from Aphanothece sacrum, on 2,4,6- trinitrochlorobenzene-induced allergic dermatitis in vivo, Ann. Allergy Asthma Immunol., 108, 117-122, 2012. Okada, Y., On a new Prasiola from Corea, J. Jpn. Bot., 15, 449-452, 1939. Park, M. K. et al., Ecological and morphological studies on the Prasiola sp. in the Samchuck-Chodang, J. Plant Bio., 13, 1-10, 1970. Sa, J. H. et al., Chemical Characteristics and Physiological Activities from Freshwater Laver Grown in the Area of Samcheokcity, Rep. Inst. Health & Environ., 25, 52-62, 2014. Seo, D. W. et al., Screening of functional components derived from fresh water laver, Prasiola japonica, and its pharmacological properties, J. Biomed. Res., 14(2), 83-90, 2013. Lee, H. M. et al., Expression of MMP-9 and TIMP-1 in the Nasal Mucosa of Allergic Rhinitis, Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2000;43(6): 604-609.

본 발명의 목적은 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 부종 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 데 있다.

본 발명은 본 발명은 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 민물김은 녹조류로 홍조류인 바다김과는 달리 바다가 아닌 민물에서 생육하며, 민물파래과(Prasiolacease)에 속한다.

상기 민물김 추출물은 민물김을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, n-부탄올, 아세톤, 헥산, 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하여 얻을 수 있으며, 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 민물김 추출물은 바람직하게는 민물김의 에탄올 추출물이다.

상기 민물김 추출물은 민물김의 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, n-부탄올 및 물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 더 추출한 분획물일 수 있다. 바람직하게는 상기 민물김 추출물은 민물김의 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물일 수 있다. 상기 민물김의 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물은 민물김의 에탄올 추출물을 농축 및 물에 현탁하고 클로로포름으로 더 추출하여 클로로포름 층에 포함된 추출물이다.

상기 민물김 추출물은 바람직하게는 민물김을 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출한 다음 농축 및 물에 현탁하고, 이를 헥산, 클로로포름, n-부탄올 및 물로 순차적으로 추출한 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, n-부탄올 분획물 및 물 분획물로 이루어진 군으로부터 선택된 민물김 추출물 분획물일 수 있다. 더욱 바람직하게는 민물김을 에탄올 또는 에탄올 수용액으로 추출한 다음 농축 및 물에 현탁하고, 이를 헥산, 클로로포름, n-부탄올 및 물로 순차적으로 추출한 분획물 중 클로로포름 분획물일 수 있다.

추출 또는 분획시 사용되는 용매는 사용되는 민물김 중량 대비 1~100배 부피를 사용할 수 있으며 상기 과정을 1~5회 반복하는 것도 가능하다.

또한, 상기 추출물 또는 분획물의 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 1일 이내에 추출 또는 분획하는 것이 바람직하며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기 등을 이용하여 통상적으로 사용되는 모든 추출 또는 분획방법, 예컨대, 가압 추출, 침지(냉침, 온침), 초음파 추출, 환류 추출법 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 추출물 또는 분획물은 상기 과정으로부터 얻은 추출 또는 분획액, 추출 또는 분획액의 희석액이나 농축액, 추출 또는 분획액의 건조물, 추출 또는 분획액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출 또는 분획액 자체 및 이를 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물 또는 분획물을 포함한다.

상기 부종은 간질환, 신장질환, 심장질환, 내분비질환, 영양결핍, 부신피질호르몬제 사용, 비스테로이드성 진통제 사용 또는 항고혈압약제 사용에 의한 전신부종을 포함한다. 또한 상기 부종은 산후 부종을 포함한다.

상기 부종 예방 또는 치료는 INOS, COX-2, TNF-α 또는 MMP-9 유전자의 발현 유전자의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용 가능”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 또한, 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로즈, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아라비아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산프로필, 탈크, 스테아르산마그네슘 및 광물유를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 안정화제, 결합제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 미결정셀룰로오스, 수크로스 또는 락토오스, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 히프로멜로오스 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아르산마그네슘, 탈크 같은 활택제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 유동파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 추출물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질과 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

본 발명에 개시된 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여시간, 투여경로, 약물의 흡수, 분포 및 배설률, 사용되는 다른 약물의 종류 및 처방자의 판단 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이며, 보다 바람직하게는 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 특발성 부종인 산후 부종의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

상기 건강기능식품은 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 또는 가공한 식품을 지칭하는 것으로, 예를 들어 건강보조식품, 기능성 식품, 영양제, 보조제 등을 모두 포함한다.

상기 민물김 추출물은 전체 건강기능식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001중량% 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001중량% 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001중량% 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 및 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명 민물김 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명은 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 민물김 추출물을 부종이 유발된 동물 모델에 처리하면 부종의 두께, 부피가 농도 의존적으로 감소하며, 특히 부종 또는 염증관련 단백질 및 염증 신호전달 관련 단백질의 발현 등을 효과적으로 억제하여 항부종용 조성물로 용이하게 사용 가능하다.

도 1은 카라기난(Carrageenan)으로 부종이 유도된 마우스 오른발에서의 민물김 추출물(Pj-EE) 과 이의 각 용매 분획물 및 비교대상 추출물 처리에 따른 부종 정도를 확인한 사진이다.
도 2는 카라기난(Carrageenan)으로 부종이 유도된 마우스 오른발에서의 민물김 추출물(Pj-EE) 과 이의 각 용매 분획물 및 비교대상 추출물 처리에 따른 부종 부피(A) 및 오른발 두께(B)의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 카라기난(Carrageenan)으로 부종이 유도된 마우스 오른발에서의 민물김 추출물(Pj-EE) 과 이의 각 용매 분획물 및 비교대상 추출물 처리에 따른 염증 관련 유전자 INOS(A), COX-2(B), TNF-α(C), MMP-9(D) 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)의 농도별 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 세포생존률을 나타낸 그래프이다.
도 5는 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포주에서 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)의 농도별 처리에 따른 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 HEK 293 세포에서 MyD88 및 TRIF에 의한 NF-κB 및 AP-1 활성화에 미치는 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)의 효과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 Carageenan 유도 마우스 Paw 부종 모델에서 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)에 의한 염증 신호전달 관련 단백질의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

< 실시예 1. 민물김 추출물 제조>

본 발명의 민물김(Prasiola japonica)은 삼척시에서 채취한 민물김을 사용하였다.

삼척시에서 채취한 민물김은 불순물들을 제거하기 위해 수돗물로 세척하였고, 70%[v/v] 에탄올을 이용하여 살균 처리 후, 증류수로 세척하여 동결 건조하였다. 동결 건조한 민물김을 곱게 파쇄하고, 파쇄된 민물김 100g에 80%[v/v] 에탄올 1ℓ을 넣고 실온에서 24시간 동안 침지시켰다. 이러한 과정을 3회 반복하여 얻은 추출액을 와트만 여과지(filter paper)로 여과시킨 후, 증발기(evaporator)를 이용하여 용매를 증발시켜 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)을 확보하였다.

상기 수득한 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)은 물에 용해시킨뒤 헥산을 넣어 녹아나오는 상층액을 따로 분리한 뒤 진공농축기를 이용하여 상층액에 포함된 용매를 제거시켰다. 용매가 제거되어 남아 있는 용매 분획물을 3번 반복하여 수득하여 헥산 분획물(Pj-EE-HF) 을 제조하였다. 그 뒤 녹아 나오지 않는 하층부 용액에 클로로포름을 넣고 상기 과정과 같은 과정을 통해 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)을 수득하였고, 이후 남아있는 침전용용액에 n-부탄올(Pj-EE-BF), 물(Pj-EE-WF)을 각각 순차적으로 넣어 분획물을 제작하였다. 한편, 민물김의 비교군으로, 중국김(Prasiola yunnanica), 파래(Enteromorpha linza), 구포미역(Undaria pinnatifida), 매생이(Capsosiphon fulvescens)의 에탄올 추출물을 상기 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE) 수득과정과 동일한 방법으로 수득하여 준비하였다.

< 실시예 2. 민물김 추출물의 Carrageenan 유도 마우스 Paw 부종 모델에서 항부종 효과>

ICR (암컷, 8주령) 마우스에 상기 실시예 1에서 준비한 각 시료를 100 ㎎/㎏이 되도록 1 회/일, 1주일간 구강 투여하였다. 7일째 되는 날 각 실험군의 마우스 뒷발(양쪽)에 부종 유도 물질인 카라기난(carrageenan, 1%)을 주사하였다. 카라기난은 주사기를 이용하여 검지와 중지 발가락 사이를 통과하여 발바닥에 주사하여 부종을 유도하고, 3시간 뒤 발을 절제하였다. 상기 과정에서 절제한 발의 부종 정도를 확인하여 도 1에 나타내었으며, 이때 발의 두께, 부종의 부피를 측정하여 도 2A 및 도 2B에 나타내었다. 발의 두께는 두께측정기, 부피는 부종부피측정기 를 이용하여 측정하였다.

도 1 및 도 2에서 보는 바와 같이, 카라기난(carrageenan, 1%)을 주사한 마우스 발은 카라기난(carrageenan, 1%)을 주사하지 않은 대조군에 비하여 발의 두께 및 부종의 부피가 모두 2배 이상 증가하여 부종이 유도된 것을 확인하였다. 이때, 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)을 7일간 경구 투여한 마우스의 경우, 부종 유도된 마우스의 발의 두께 및 부종의 부피가 모두 감소하여 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)의 부종 억제를 확인하였다. 또한, 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)의 용매 분획물 중, 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)이 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)보다 발의 두께 및 부종의 부피가 모두 감소하여 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)보다 뛰어난 부종 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이에 반하여 부탄올 및 물 분획물(Pj-EE-BF, Pj-EE-WF)은 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)보다 오히려 부종 억제 효과가 감소되었으며, 헥산 분획물(Pj-EE-HF)의 경우, 발의 두께는 감소되었으나, 부종 자체의 부피는 큰 차이가 없었다.

상기와 같이 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)보다 부종 억제 효과가 뛰어났으며, 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)과 유사한 부종억제효과를 보인 중국김, 구포미역 또는 매생이의 에탄올 추출물보다 더욱 뛰어난 부종억제효과를 나타내었다. 이러한 결과는 민물김 에탄올 추출물이 비극성 용매인 클로로포름으로 분획과정 중 부종억제효과를 나타내는 화합물이 농축되면서 뛰어난 부종억제효과를 나타내는 것으로 사료된다.

< 실시예 3. 민물김 추출물의 Carrageenan 유도 마우스 Paw 부종 모델에서 염증 관련 유전자 발현에 미치는 효과>

상기 실시예 2에서 얻어진 부종이 유도된 발 조직을 TRI-Zol을 이용하여 상기 세포를 분해하고, BCP(1-bromo-3-chloropropane)를 이용하여 중화시켰다. 중화시킨 액체에 isopropanol을 이용하여 mRNA를 침강시켰다. 이어서 원심분리기를 이용하여 침강된 mRNA만을 모아 실험에 이용하였다. 세포내 mRNA는 cDNA kit를 이용하여 cDNA로 합성하여, PCR을 통해 염증 관련 유전자인 INOS, COX-2, TNF-α 및 MMP-9 유전자의 발현양을 확인하여 도 3A 내지 3D에 나타내었다. Matrix metalloproteinase(기질단백분해효소, MMP로 약함)는 아연과 칼슘-의존 엔도펩티다아제(endopeptidase)의 일종으로 MMP-1, MMP-2(gelatinase A), MMP-3, 및 MMP-9(gelatinase B) 등으로 구분되며 결체 조직들의 여러 구성성분을 분해한다. 특히 MMP-9은 기저막의 주요성분인 젤리틴(gelatin)과 교원질을 분해하며 염증반응시 MMP의 작용에 의해 염증세포들의 이동과 침윤이 촉진된다 (Korean J Otolaryngol 2000;43:604-9).

도 3A 내지 3D에서 보는 바와 같이, Carageenan에 의해 유도된 부종 조직은 염증 및 멜라닌 형성 관련 유전자인 INOS, COX-2, TNF-α 및 MMP-9 유전자의 발현이 대조군과 비교하여 10~20 배 증가하였다. 이러한 INOS, COX-2, TNF-α 및 MMP-9 유전자의 발현은 Pj-EE 처리 군에서 크게 감소하였으며, 특히 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF) 처리에서 현저하게 감소함을 확인하여, 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)이 염증관련 유전자 발현 수준에서 부종 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

< 실시예 4. 민물김 추출물의 RAW 264.7 세포에서의 세포 생존률 확인>

RAW 264.7 세포에서 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물의 세포 독성 여부를 확인하고자, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 실시하였다. RAW 264.7 세포 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin) 및 100 IU/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

배양한 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)을 0, 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 가 되도록 시료 100㎕씩 각 웰에 처리하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 상기 배양액의 상등액 100㎕를 제거하고, 5㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 10㎕씩 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응하였다. 이 후 반응액을 제거하고 각 웰 당 반응정지 용액(10% SDS in 0.1N HCl) 100㎕를 가하여 24시간 동안 반응한 뒤, 570㎚에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 RAW 264.7 세포의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여, 시료를 처리한 세포의 생존율을 계산하였다.

도 4에서 보는 바와 같이, 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 25 ㎍/㎖ 처리 시까지 세포 독성을 나타내지 않았으며, 50 ㎍/㎖에서 90% 이상의 세포 생존률을 나타내었다. 따라서, 이후 실험은 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF) 농도를 최대 50 ㎍/㎖로 하여 실험을 수행하였다.

< 실시예 5. 민물김 추출물의 LPS 유도 RAW 264.7 세포주에서 산화질소 생성 억제 효과 확인>

RAW 264.7 세포에서 민물김 추출물의 NO 생성에 미치는 효과를 확인하였다. 상기 실시예 4에서 배양한 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 농도별로 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF) 50㎕씩 각 웰에 처리하고 30분간 배양한 다음, RAW 264.7 세포의 염증반응을 유도하는 LPS(lipopolysaccharide)를 최종 농도가 1㎎/㎖가 되도록 50㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 새로운 96웰 플레이트에 상기 세포 배양액의 상등액 100㎕과 NO의 양을 정량할 수 있는 Griess 용액(0.5% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5% sulfanilamide, 25% H₃PO₄) 100㎕를 더한 다음 570㎚에서의 흡광도를 측정하여 NO 생성능을 분석하고 이를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 보는 바와 같이, 염증이 유발된 대식세포인 RAW 264.7 세포에 본 발명의 Pj-EE-CF 을 처리하는 경우 농도 의존적으로 염증 물질인 NO 생성량이 감소하는 것을 확인하였다.

< 실시예 6. 민물김 추출물의 LPS 유도 HEK 293 세포에서의 항염증 효과 확인>

HEK 293 세포는 100㎜ 세포배양접시(cell culture dish)에 5% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin) 및 100 IU/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's Modified Medium) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

상기 배양한 HEK 293 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린(penicillin) 및 100 IU/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 1×10⁶세포/㎖ 세포가 되도록 농도를 조절한 다음 37℃, 5% CO₂조건에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포가 70% 밀도가 되었을 때 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000)을 이용하여 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 또는 AP-1(Activator protein 1) 루시퍼라아제 DNA, β-갈락토시다아제(β-galactosidase), Flag-MyD88 또는 CFP-TRIF DNA를 각각 트랜스펙션(co-transfection)하였다. 1㎍ DNA와 1㎕ 리포펙타민 2000을 배지에 각각 희석해 준 다음 상온에서 20분 동안 배양하고, DNA 희석액과 리포펙타민 2000 희석액을 혼합하여 다시 상온에서 20분 배양하였다. 상기 배양액을 HEK 293 세포가 분주된 24웰 플레이트에 넣어주고 24시간 동안 배양한 다음, 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)을 농도별(0, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양 후 루시퍼라아제 용해 완충액(luciferase lysis buffer)으로 세포를 용해시킨 다음 기질인 루시페린(luciferin)과 1:1로 반응하였다. 반응물은 루미노미터(Luminometer)로 흡광도를 측정하여 도 6에 나타내었다. β-갈락토시다아제의 경우에는 X-gal과 1:1로 반응시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 6에서 보는 바와 같이, HEK 293 세포에 Pj-EE-CF을 처리하는 경우 MyD88 또는 TRIF에 의한 NF-κB 또는 AP-1 활성이 농도 의존적으로 감소되었다. 이로부터, Pj-EE-CF는 염증 반응을 억제시키는 효과가 우수한 조성물임을 확인하였다.

< 실시예 7. 민물김 추출물의 LPS 유도 RAW 264.7 세포주에서 염증 신호전달 경로 단백질의 발현에 미치는 효과 확인>

배양한 RAW 264.7 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(100 IU/㎖)을 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하여 플레이트(30㎜)에 웰 당 2×10⁶개의 세포가 되도록 2㎖씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 18시간 동안 배양하였다. 배양 후 상기 배양액의 상등액 1㎖을 제거하고, Pj-EE-CF을 0, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖가 되도록 500㎕씩 처리한 다음 37℃, 5% CO₂조건에서 30분간 배양하였다. 여기에 RAW 264.7 세포의 염증반응을 유도하는 LPS(lipopolysaccharide)를 최종 농도가 1㎎/㎖가 되도록 500㎕ 첨가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS를 완전히 제거한 후 세포 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 처리하였다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동한 SDS-PAGE 젤의 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후, 단백질 이동이 완료된 PVDF 막을 상온에서 TBS-T(in 100mM NaCl, 10mM Tris, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.4 (PBST)containing 3% BSA)로 블록킹하였다. 그 다음 TBS-T를 사용하여 10분간 3회 세척한 후, 3% BSA를 녹인 TBS-T에 1차 항체를 1시간 처리하고, TBS-T로 충분히 세척하였다. 그리고 2차 항체를 1시간 동안 처리하고 PBS-T로 10분씩 3회 세척하였다. 그 다음 ECL detection system을 사용하여 염증 질환 관련 인자인 JNK, p38, ERK, c-FOS, c-Jun 및 이들의 인산화된 단백질 발현을 확인하고 그 결과를 도 7에 나타내었다. 단백질 양의 보정은 PVDF 막을 재활용(stripping)하여 액틴 단백질의 양을 확인함으로써 동량임을 확인하였으며, 각각의 항체는 Cell signaling 및 Santacruz에서 구입하였다.

도 7에서 보는 바와 같이, LPS에 의하여 염증이 유발된 대식세포는 인산화된 c-Jun, c-FOS, ERK, p38의 단백질 발현이 증가하였으며, 이는 본 발명의 Pj-EE-CF을 처리하는 경우, 그 발현이 감소하였다.

상기 결과를 통하여 본 발명 Pj-EE-CF은 인산화된 p38, ERK, c-FOS, c-Jun의 단백질 발현을 감소시킴으로써 염증 신호전달 경로 단백질 발현을 억제하고 이를 통해 염증 반응이 감소됨을 확인하였으며, 이로부터 항염증용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

< 제제예 1. 정제의 제조>

본 발명 민물김 추출물 또는 분획물 20g을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

< 제제예 2. 캡슐제의 제조>

본 발명 민물김 추출물 또는 분획물 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 3. 주사제의 제조>

본 발명 민물김 추출물 또는 분획물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

< 제제예 4. 건강기능식품의 제조>

제제예 4-1. 건강기능식품의 제조

본 발명의 민물김 추출물 또는 분획물 2g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.

제제예 4-2. 건강기능성 음료의 제조

본 발명의 민물김 추출물 또는 분획물 1g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 100g, 정제수 900g을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.

Claims

민물김(Prasiola japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 민물김 추출물은 민물김을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, n-부탄올, 아세톤, 헥산, 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출 및 농축하여 얻은 것을 특징으로 하는 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 민물김 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 민물김 추출물은 민물김의 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, n-부탄올 및 물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 더 추출한 분획물인 것을 특징으로 하는 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 민물김 추출물은 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물인 것을 특징으로 하는 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서
상기 부종은 간질환, 신장질환, 심장질환, 내분비질환, 영양결핍, 부신피질호르몬제 사용, 비스테로이드성 진통제 사용 또는 항고혈압약제 사용에 의한 전신부종 또는 국소부종인 것을 특징으로 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 부종은 산후 부종인 것을 특징으로 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 부종 예방 또는 치료는 INOS, COX-2, TNF-α 또는 MMP-9 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 부종 예방 또는 치료는 MyD88 또는 TRIF에 의한 NF-κB 또는 AP-1 활성이 감소하는 것을 특징으로 부종 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 부종 예방 또는 치료는 인산화된 p38, ERK, c-FOS 및 c-Jun로 구성된 군으로부터 선택된 1 이상의 염증 신호전달 경로 단백질 발현을 억제하는 것을 특징으로 부종 예방 또는 치료용 조성물.
민물김(Prasiola japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 부종 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11항에 있어서,
상기 민물김 추출물은 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 부종 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11항에 있어서,
상기 민물김 추출물은 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물인 것을 특징으로 하는 부종 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제11항에 있어서,
상기 부종은 산후 부종인 것을 특징으로 하는 부종 예방 또는 개선용 건강기능식품.