KR20060000252A

KR20060000252A - 권백 추출물을 포함하는 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20060000252A
Application number: KR1020040048898A
Authority: KR
Inventors: 한병희; 강삼식; 손건호
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2004-06-28
Filing date: 2004-06-28
Publication date: 2006-01-06
Also published as: KR100633344B1; WO2006001664A1

Abstract

본 발명은 권백(Selaginella tamariscina Spring)을 물 또는 C₁∼C₄ 알콜로 추출하는 단계(1차 추출) 및 상기 1차 추출에서 얻어진 생성물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 유기용매로 추출하는 단계(2차 추출)를 포함하는 제조방법으로 얻어진 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

권백, 퇴행성 뇌질환, 치매, 뇌졸중

Description

권백 추출물을 포함하는 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating an acute or chronic neurodegenerative diseases comprising an extract of Selaginella tamariscina Spring}

도1은 활성화 산소에 의해서 유도되는 신경세포 사멸에 대한 권백 추출물의 억제정도를 측정한 결과를 나타내고,

도2는 신경세포 아폽토시스에 대한 권백 추출물의 억제정도를 측정한 결과를 나타내고,

도3은 뇌 부위별 카스파제-3 활성화에 미치는 권백 추출물의 영향을 측정한 결과를 나타낸다.

본 발명은 권백 추출물을 유효성분으로 포함하는 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

치매 등의 퇴행성 뇌질환과 아울러 허혈성 뇌졸중인 급성 퇴행성 뇌질환은 뇌신경 세포가 점차 파괴되어 뇌기능을 상실하는 질환으로서, 뇌손상의 정도 및 부 위에 따라 기억력 장애, 언어장애, 시공간 지각능력 장애, 판단력 장애, 성격 및 감정조절 장애 등 다양한 증상을 나타내며 뇌의 기능에 영구적 손실을 초래한다.

퇴행성 뇌질환은 국내의 경우 노인성 치매는 65세 이상 인구의 10%를 차지하고 있으며 파킨슨병은 약 1% 정도를 차지하고 있다. 또한, 허혈성 뇌졸중은 암 다음으로 높은 사망원인 중의 하나이며 2001년 통계청 자료에 의하면 인구 10 만명 당 매년 74명이 뇌졸중에 의해서 사망하고 있다. 이들 뇌질환은 주로 50세 이상의 고령층에서 급격히 발생빈도가 증가하는 성인 질환이며, 심각한 사회적 경제적 부담이 되는 질환일 뿐만이 아니라, 노인 연령층에서 삶의 질적 저하를 초래하는 주요 질환이다. 더구나 최근의 추세로 보면 평균수명의 연장으로 노령인구의 증가로 말미암아 퇴행성 뇌질환 환자가 증가하고 있으며 이를 해결하기 위해서는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 플라보노이드는 과일, 야채, 씨앗 등에 들어있는 천연 유래 다가 페놀 화합물로서, 플라보놀, 플라본, 이소플라본 구조로 분류되는 다양한 플라보노이드 유도체가 알려져 있으며, 이들에 대한 생물학적 및 약리학적 연구가 진행되고 있다.

예를 들어, 대한민국 특허등록 제139,179호 및 제267,060호는 권백(卷柏, Selaginella tamariscina Spring)으로부터 얻은 이소크립토메린, 크립토메린 B, 아멘토플라본 등의 플라보노이드 유도체가 면역억제제, 항염증제, 항암제, 및 진통제로서 유용하게 사용될 수 있다고 개시한 바 있다.

한편, 본 발명자들은 다양한 플라보노이드 유도체를 대상으로 퇴행성 뇌질환 에 미치는 영향을 연구하던 중, 놀랍게도 권백 추출물이 우수한 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 효과를 갖는다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 권백 추출물을 유효성분으로 포함하는 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서 유효성분으로 포함되는 상기 권백 추출물은 공지의 제조방법, 예를 들어, 대한민국 특허등록 제137,179호 또는 제267,060호에 개시된 제조방법으로 얻을 수 있다. 상기 권백 추출물 제조에 있어서, 1차 추출시 사용되는 용매로는 물 또는 C₁∼C₄ 알콜을 사용할 수 있으며, 상기 C₁∼C₄ 알콜로는 메탄올 또는 에탄올이 바람직하게 사용될 수 있다. 상기 2차 추출시 사용되는 유기용매로는 에틸아세테이트가 바람직하다.

상기 권백 추출물 제조에 있어서, 1차 추출은 수욕상에서 약 6시간씩 1회 이 상 바람직하게는 약 3회 반복하여 수행하는 것이 바람직하고, 1차 추출에서 얻어진 추출물을 농축한 후 2차 추출에 사용되는 것이 바람직하다. 또한, 2차 추출은 상기 1차 추출물의 농축액을 증류수에 현탁시킨 후 분액여두에 넣고 상기 유기용매를 사용하여 순차적으로 또는 별도로 추출함으로써 수행할 수 있다.

선행기술(대한민국 특허등록 제137,179호)에 따르면, 상기 권백 추출물은 아멘토플라본, 크립토메린 B, 이소크립토메린 등의 플라보노이드 유도체를 함유하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 하기 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 조성물에 유효성분으로 함유되는 상기 권백 추출물은 아멘토플라본에 비해 더욱 강력하게 뇌신경세포 손상을 억제한다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하며, 치매 또는 뇌졸중을 포함한 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용으로 인간 또는 동물에게 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.

경구투여용 조성물은 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 액제, 현탁제, 겔제 등의 다양한 형태일 수 있으며, 부형제, 붕해제, 활택제 등의 통상의 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제에는 시럽, 아라비아고무, 젤라틴, 솔비톨, 락토오스, 당분, 옥수수-전분, 인산칼슘, 글리신, 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 감자전분, 또는 황산라우릴나트륨 등의 통상적인 부형제와 일반적 향미제 또는 착색제를 포함한다. 또한 본 발명에 따른 조성물의 비경구 투여용 조성물(예, 주사제)은 등장용액일 수 있으며, 또한 멸균시킬 수 있으며 및/또는 보존제, 안정화제 등과 같은 통상의 첨가제를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료를 목적으로 평균 성인환자(약 70kg)에게 약 100 mg/day ∼ 1 g/day의 용량으로 투여될 수 있으나, 상기 용량은 질환의 종류 및 상태에 따라 변경될 수 있다. 따라서, 전형적인 성인 환자에 대해서, 각각의 단위 투여형태는 약제학적으로 허용가능한 적합한 담체와 함께 본 발명에 따른 화합물을 약 100 mg 내지 1 g을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에서 권백 추출물(1차 추출용매: 메탄올, 2차 추출용매: 에틸아세테이트)은 대한민국 특허등록 제137,179호의 실시예 1에 개시된 제조방법에 의해 제조한 것(하기 실시예에서는 "권백 추출 분획"이라 칭함)을 사용하였다.

실시예 1: 권백 추출 분획의 허혈성 자극에 의한 신경세포 사멸에 대한 억제 효과

허혈에 의한 신경세포 사멸을 유도한 뒤, 권백 추출 분획의 신경세포사멸 억제효과를 측정하였다. 신경세포주로는 SH-SY5Y 셀(cells) (한국세포주 은행, No. 22266)을 이용하였다. 상기 신경세포를 5X10⁴ 세포/웰(well) 농도로 48-웰(well) 세포배양판에 분주하고 5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 10% 말 혈청(horse serum)을 함유하는 DMEM 배지를 가하여 37℃에서 세포 배양하였다.

허혈성 자극에 의한 신경세포 사멸을 유도하기 위하여 세포배양 배지를 혈청을 가하지 않은 DMEM 배지로 교체한 후 0.5 mM 과산화수소수를 가하고 24시간 세포배양을 지속하였다. 세포사멸을 측정하기 위하여 MTT (methylthiazoletetrazolium)을 세포배지에 가하고 3시간 배양한 후, 배지를 제거하고 100 ul 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)를 가하여 혼합한 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

권백 추출 분획을 DMSO에 녹인 후 화합물의 최종농도가 1, 5, 25 ug/ml가 되도록 세포에 가한 후 1 시간 후에 과산화수소수로 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 이 때 DMSO의 최종 농도는 0.5% 가 넘지 않도록 하였으며 이 농도에서 DMSO는 세포사멸에 영향을 미치지 않았다. 혈청이 있는 조건에서의 세포생존을 100% 하고, 상대적인 세포생존율 즉 세포사멸을 억제하는 정도(%)를 구하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 각 농도에서 세포사멸을 억제하는 정도는 도1과 같다.

도1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 권백 추출 분획은 활성화 산소에 의해서 유도되는 신경세포 사멸에 대하여 효과적인 억제작용을 나타냈다. 도1 중 *는 대조군에 비하여 유의성 있게 세포사멸이 억제되는 것을 나타낸다 (p<0.05).

신경세포의 사멸은 형태학적으로 아폽토시스 (apoptosis) 및 네크로시스(necrosis)로 분류할 수가 있으며 카스파제-3(caspase-3)는 단백질 분해효소로서 아폽토시스성 세포사멸에 중요한 역할을 담당하는 효소이다. 권백 추출 분획의 카스파제-3 활성화에 대한 작용을 시험하기 위하여 신경세포주를 세포배양액(대조군) 또는 권백 추출 분획(1, 5, 25 ug/ml)으로 처리한 후 1시간 경과 후에 세포를 0.4 mM 과산화수소수로 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 8시간 후에 세포를 수집한 후 세포를 완충용액(10 mM HEPES pH7.4, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 1% 트리톤 X-100, 1 mM PMSF)에 녹여서 총단백질을 분리한 다음 카스파제-3 활성은 펩타이드 기질을 이용하여 형광분석법으로 측정하였으며, 그 결과는 도2와 같다.

도2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 과산화수소수는 카스파제-3활성을 현저히 증가시켜 아폽토시스성 세포사멸을 유도함을 보였으며 권백 추출 분획을 처리한 군에서는 농도의존적으로 카스파제-3 활성을 현저히 감소시켰다. 도2 중 *는 대조군에 비하여 유의성 있게 세포사멸이 억제되는 것을 나타낸다 (p<0.05).

상기한 바와 같이 상기 권백 추출 분획은 활성화산소에 의한 신경세포사멸을 억제하는 우수한 약리활성을 나타내므로, 뇌졸중 등 허혈에 의한 신경손상을 예방 및 치료에 유효한 치료제로 사용할 수 있다.

실시예 2: 권백 추출 분획의 허혈성 뇌졸중 동물모델에서의 치료 효과

허혈에 의한 뇌손상을 유발하기 위하여 생후 7일 된 스프라그-달리 (Sprague-Dawley)계 랫트를 이소플로렌 마취하에서 좌측 경동맥을 결찰한 후 수술부위를 봉합 한 후 마취에서 회복되도록 하였다. 랫트를 8% 산소-92% 질소 혼합가스에 2.5 시간 노출시켜 뇌손상을 유발하였다.

실험동물은 세 군으로 분리하여 대조군은 생리식염수, 약물처리군은 권백 추출 분획에 함유된 것으로 알려져 있는 아멘토플라본(amentoflavone) 및 권백 추출 분획을 각각 10mg/kg 용량으로 복강내에 투여하였다. 뇌손상 유발 24 시간 후에 뇌를 적출하고 뇌손상의 정도는 카스파제-3 활성화의 정도를 형광분석법을 이용하여 측정하였으며, 그 결과는 도3과 같다.

도3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 허혈에 의해서 약 13 배 정도의 카스파제-3 활성화가 뇌손상부위에서 관찰이 되었다. 10 mg/kg 복강내 투여 용량에서 아멘토플라본 및 권백 추출 분획 투여군 모두 유의성 있게 카스파제-3 활성을 억제하였으며, 권백 추출 분획이 아멘토플라본 보다 강력한 억제작용을 나타내었다. 따라서 권백 에틸아세테이트 분획은 아멘토플라본 뿐만 아니라 함유된 다른 화합물에 의해서 상승작용을 나타며 효과적으로 신경세포손상을 억제하는 것을 알 수 있다. 도3 중 *는 대조군에 비하여 유의성 있게 세포사멸이 억제되는 것을 나타내며 (p<0.05), #는 아멘토플라본 투여군에 비하여 유의성 있게 세포사멸이 억제되는 것을 나타낸다(p<0.05).

실시예 3: 베타이밀로이드에 의한 신경세포 사멸에 대한 억제 효과

치매환자에서 신경세포 손상은 주로 베타아밀로이드(Aβ)의 축적에 의해서 직접적인 신경독성을 일으키거나 뇌신경소교세포(microglia 세포)의 활성화에 의한 염증반응에 의해서 신경세포의 소실을 초래하는 것으로 보고된 바 있다. 베타아밀로이드(Aβ_25-35) 펩타이드를 이용하여 신경세포사멸을 유도하고, 권백 추출 분획의 신경세포 사멸 억제효과를 측정하였다.

신경세포와 유사한 특징을 갖는 세포주(PC12 cells, 한국세포주은행 No. 21721)를 이용하여 Aβ_25-35에 의해 유도되는 신경세포 사멸에 활성을 측정하였다. PC12 세포를 5X10⁴ 세포/웰(well) 농도로 48-웰(well) 세포배양판에 분주하고 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)을 함유하는 DMEM 배지를 가하여 37℃에서 세포 배양하였다.

세포 사멸을 유도하기 위하여 세포배양 배지를 혈청을 가하지 않은 DMEM 배지로 교체한 Aβ_25-35 로 세포를 처치하고 24시간 세포배양을 지속하였다. 세포사멸을 측정하기 위하여 MTT를 세포배지에 가하고 3시간 배양한 후, 배지를 제거하고 100 ul DMSO를 가하여 혼합한 후, 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

권백 추출 분획을 DMSO에 녹인 후 최종농도가 0.4, 2, 10, 50 ug/ml가 되도록 세포에 가한 후 1 시간 후에 Aβ_25-35 로 처리하여 세포사멸을 유도하였다. 이 때 DMSO의 최종 농도는 0.5% 가 넘지 않도록 하였으며 이 농도에서 DMSO는 세포사멸에 영향을 미치지 않았다. 혈청이 있는 조건에서의 세포생존을 100% 하고, 상대적인 세포생존율 즉 세포사멸을 억제하는 정도(%)를 구하였다. 모든 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 권백 추출 분획의 세포사멸을 억제하는 정도는 표 1과 같다.

	농도 (μg/ml)
	0.4	2	10	50
권백 추출 분획	7.8 ± 1.6	13.2 ± 1.4	34.1 ± 2.6	48.0 ± 1.1

표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 권백 추출 분획은 베타아밀로이드에 의 해서 유도되는 신경세포 사멸을 억제하는 효과를 나타낸다.

본 발명에 따른 권백 추출물을 포함하는 조성물은 허혈 또는 베타아밀로이드에 의한 신경세포 사멸을 효과적으로 억제할 수 있으며, 상기 추출물에 함유된 것으로 알려진 아멘토플라본 뿐만 아니라 다른 성분이 상승적으로 작용하여 신경세포사멸을 억제하는 약리활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 치매 또는 뇌졸중 등의 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

Claims

권백(Selaginella tamariscina Spring)을 물 또는 C₁∼C₄ 알콜로 추출하는 단계(1차 추출) 및 상기 1차 추출에서 얻어진 생성물을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 유기용매로 추출하는 단계(2차 추출)를 포함하는 제조방법으로 얻어진 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 C₁∼C₄ 알콜이 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유기용매가 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환이 뇌졸중 또는 치매인 것을 특징으로 하는 조성물.