KR20050116981A

KR20050116981A - 항-4-1ｂｂ 항체를 포함하는 류마티스성 관절염의 예방 및치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20050116981A
Application number: KR1020040042125A
Authority: KR
Inventors: 권병세
Original assignee: 학교법인 울산공업학원
Priority date: 2004-06-09
Filing date: 2004-06-09
Publication date: 2005-12-14
Also published as: JP2008518882A; CN101720230A; WO2005120568A1; US20070253961A1; KR100694507B1

Abstract

본 발명은 류마티스 관절염의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 증가 및 CD4⁺ T 세포 억제를 유도하는 항-4-1BB 항체를 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 전체적인 면역반응에 유독하지 않으면서 항원 특이적인 면역억제를 유도하여 진행성, 염증성 또는 자가면역성 관절염 증상을 현저히 개선시킬 수 있으므로, 관절염의 예방 또는 치료제에 부작용없이 응용될 수 있다.

Description

항-4-1ＢＢ 항체를 포함하는 류마티스성 관절염의 예방 및 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising the anti-4-1BB antibody for preventing and treating rheumatoid arthritis}

본 발명은 항-4-1BB 항체를 포함하는 류마티스성 관절염의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA)은 자가면역질환의 일종으로 그 병인이 명확히 밝혀져 있지 않은 전신질환이다. 이 질병은 여러 관절, 특히 손 관절에 대칭적으로 염증을 일으켜 수년 내지 수십년에 결쳐 관절을 서서히 파괴시키며, 때로는 관절뿐만 아니라 폐, 심장, 눈, 혈관, 신경 등 여러장기를 침범하기도 한다. 또한, 이 질병은 주로 30대 전후 인생의 활동기에 발병하여 신체기능에 장애를 유발하여 삶의 질을 떨어뜨리고 작업능력을 저하시켜 막대한 경제적 손실을 초래한다.

비록 관절염의 병인은 아직 논쟁 중이지만, 질병의 진행 과정 및 최종단계의 작용기전은 비교적 잘 정립되어있다. 구체적으로, 초기 단계의 염증부위에는 CD4⁺ T 세포가 주를 이룬다. 대식세포와 유사한 형태의 활막세포(synovial lining cell)와 교합 활막 섬유아세포(interdigitating synovial fibroblast)가 증식을 하며, 많은 양의 주조직 적합성 복합체(MHC) 클라스 Ⅱ 항원이 발현된다. 이후, 활성화된 헬퍼(helper) T 세포는 B 세포가 활액막(synovium)으로 침투하여 항체를 생산하도록 유도한다. 상기 국부적으로 발현된 항체들의 주된 특이성은 알려지지 않았지만, 이중 일부는 다른 IgG 분자와 결합하여 관절내에 면역복합체를 형성하도록 하는 IgG 관절염성 인자(rheumatoid factor)이다. 최종적으로 호중구(neutrophil) 및 대식세포 (macrophage)의 대량 소환/침투, 일련의 분해효소의 생성, 그리고 TNF-α/IL-1/IL-6의 발현으로 연골과 다른 류마티스 관절 성분이 침식된다. 이러한 서로 다른 질병의 경로들은 파괴라는 공통 방향으로 모아지게 된다.

현재, 류마티스 관절염의 치료제로 여러 가지 약물이 사용되고 있으나, 완전한 증상 개선을 이루지 못하고 있다. 종래의 치료제로는 비스테로이드성 항염증제(아스피린, 이부프로펜), 금제제, 페니실아민, 스테로이드성 호르몬제 등이 있다. 이중 가장 개선효과가 뛰어난 스테로이드성 호르몬제는 장기간 복용시 부작용이 따르는 문제점이 있다. 근래에는 염증 기전의 중심 역할을 하는 TNF(tumor necrosis factor)의 수용성 수용체를 유전자 재조합 기술로 생산하여 치료제로 개발하려는 노력이 있으나, 류마티스 관절염의 제반증상인 염증, 부종, 비정상적인 신혈관 생성, 골 및 연골조직 침식 등을 개선할 보다 진보된 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

콜라겐 타입 Ⅱ-유도된 관절염(collagen type Ⅱ-induced arthritis, CIA)은 T 임파구성 류마티스 관절염의 동물모델로 사용되어 왔다(Autoimmunity to Type Ⅱ collagen: Experimental model of arthritis, J. Exp. Med., 146, 857-868, 1977). 이는 DBA/1 쥐에 콜라겐 Ⅱ를 주사하면 2주내에 파누스 형성, 뼈, 연골의 침식과 함께 관절염이 유발된다. 류마티스 관절염과 마찬가지로 콜라겐 유발 관절염도 콜라겐에 대한 체액성, 세포성 면역 반응을 일으킨다. 상기 동물 모델은 그 재현성과 과정이 정의된 이래로, TNF-α 중화와 같은 새로운 관절염 치료법 개발에 유용함이 증명되었다.

T 세포 및 B 세포는 적응면역(adaptive immunity)의 두 축으로서, CIA의 발병시 중추적 역할을 하지만, 면역활성 및 관절침식시 그 상대적 중요성은 아직 명확하지 않다. B 세포의 주요한 역할은 류마티스성(arthritogenic) 항-CⅡ 항체의 생산이며, 이 CⅡ에 특이적인 항체들은 연골에 부착하여 관절염을 유도할 수 있다는 사실이 증명되었다. CIA에서 T 세포의 역할은 좀더 복잡하지만 크게 두 가지 경로로 나누어질 수 있다. 첫 번째는 B 세포가 류마티스성 항-CⅡ 항체를 생산하도록 도움을 주는 것이며, 두 번째는 T 세포 그 자체가 사이토카인(cytokine) 생산 및 다른 세포들의 활성을 통해 관절 내 염증 발생을 유도하는 것이다.

4-1BB는 종양 괴사인자(tumor necrosis factor)의 수용체로서, T 림프구에서 주로 공동자극분자(costimulatory molecule)로 작용하며, T 세포가 항원특이적인 신호를 받을 경우 발현된다. 또한 4-1BB는 자연킬러(natural killer; NK) 세포, CD4⁺CD25⁺ 조절 T 세포, 대식세포(monocyte), 수지상세포(DC)와 같은 다른 임파구성/골수(lymphoid/myeloid) 세포 계열에서도 발현되는 것으로 알려져 있다. 4-1BB는 T 세포를 공동자극 함으로서 암 제거, 일차적인 CD8⁺ T 세포 반응의 증가, 항원 특이적 CD8⁺ T 세포의 메모리 풀(memory pool) 강화와 같은 작용체 기능(effector function)을 수행할 수 있게 한다. 이 과정은 주로 T 세포 의존적 항체반응과 염증을 유도하는 CD4⁺ T 세포의 기능을 저해 함으로서 이루어진다. 그러나, 4-1BB에 의해 매개되는 CD4⁺ T 세포의 억제 기전은 아직 밝혀지지 않았다.

이에 본 발명자들은 4-1BB를 통해 유도되는 관절염 억제가 항원 의존적인 방법으로 CD11c⁺CD8⁺ T 세포를 증가시킴으로써 유도됨을 확인하고, 유도된 상기 T 세포가 다량의 IFN-γ를 생산하며, 이는 다시 수지상세포 및 대식세포에서 IDO의 발현을 유도하고, 항원에 특이적인 CD4⁺ T 세포는 IDO를 통한 기전을 통해 억제됨을 확인하므로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항-4-1BB 항체의 투여로 인해 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 증가가 유도되는 신규한 용도를 제공하는 것이다. 즉, 항-4-1BB 항체를 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 증가 및 CD4⁺ T 세포 억제를 유도하는 항-4-1BB 항체를 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 항-4-1BB 항체는 전체 중량중 0.1 ~ 50 중량%를 포함하며, 상기 관절염은 콜라겐 유도성 관절염이다.

또한, 본 발명은 항-4-1BB를 함유하는 상기 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 D11c⁺CD8⁺ T 세포의 증가 및 CD4⁺ T 세포 억제를 유도하는 항-4-1BB 항체를 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 관절염은 이에 한정하는 것은 아니나 CIA 유도된 관절염인 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 콜라겐에 의해 유도되는 관절염(CIA)의 발병과정중 4-1BB의 역할을 이해하기 위해, 콜라겐 2형(CⅡ)을 투여하여 CIA를 유도한 쥐에 아고니스트(agonist)항-4-1BB 항체(3H3)를 투여하여 관절 염증의 평균 임상질병지수를 관찰한 결과, 아고니스트 항-4-1BB를 투여한 쥐는 질병 발달이 강하게 억제된다. 또한, 상기 항-4-1BB 항체(3H3)를 투여된 쥐의 조직에서는 관절활액 과다생성, 판누스(pannus) 형성, 연골파괴 및 뼈침식 등과 같은 CIA의 모든 특징들이 나타나지 않으며, 관절염 유발의 지표가 되는 MCP-1, MIP-2, 에오탁신(eotaxin), MIP-1a 및 RANTES 등과 같은 케모카인(chemokine) 및 IL-6, IL-15, TNF-α, IL-1β 와 같은 사이토카인이 검출되지 않고, 항-CⅡ에 반응하는 항체 중 IgG와 IgG2b의 생성을 완전히 억제시키는 항원 특이적인 억제반응을 유도한다.

한편, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 이미 관절염이 진행중인 상태에서도 항-4-1BB는 질병지수를 감소시키며, 항-CⅡ 항체의 생성도 억제시키는 바, 4-1BB의 교차결합(cross-linking)에 의해 CIA를 억제시키는 것이 가능하다.

또한, 항-4-1BB 항체 투여에 의한 능동적 억제기전은 CD4+ T 세포의 유도를 억제시키며, 출수 림프절 내 CD11c⁺CD8⁺ T 세포군의 증가 유도한다. 이때, 유도된 CD11c⁺CD8⁺ 세포는 CD11c^-CD8⁺, CD11c⁺CD8 ⁺, CD8^-CD11c⁺ DCs 세포의 세포표면 표지분자(surface marker)와 달리 CD3⁺, TCR Vβ⁺, Thy1.1⁺, CD11c 및 클라스(class) Ⅱ 항원 I-A^q를 발현하는 새로운 CD8⁺ T 림프구 세포이다. 한편, CD11c⁺CD8 ⁺ T세포를 분리한 후 입양전달한 경우에도 CD4⁺ T 세포의 유도를 억제시키고, CIA의 발병을 완화시키는 바, 본 발명의 항-4-1BB 투여에 의해 증가가 유도된 CD11c⁺CD8⁺ T 세포는 관절염 생성을 억제할 수 있다.

이때, CD11c⁺CD8⁺ T 세포가 생산하는 주 생성물은 IFN-γ이며, 상기 IFN-γ는 CD11b⁺대식세포 및 CD11c⁺수지상 세포에서 IDO(indoleamine 2,3-dioxygenase)의 발현을 유도시키며, 1-메틸트립토판(1-methyltryptophan)의 처리가 항-4-1BB의 효과를 상쇄시키는 바, CIA는 억제는 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 증식에 의해 야기되고, 상기 세포에 의해 발현된 IFN-γ의 IDO 의존적인 작용에 의해 항원 특이적인 CD4⁺ T 세포를 억제하여 이루어진다.

본 발명의 관절염의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 항-4-1BB 항체를 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 항-4-1BB를 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 항-4-1BB의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 항-4-1BB를 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 시클로크레아틴을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 시클로크레아틴에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 항-4-1BB의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항-4-1BB는 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 항-4-1BB는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroven tricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 참고예, 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 이하의 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 아니한다.

참고예 1. 항체의 준비

4-1BB(3H3)³⁵ 와 4-1BBL(TKS-1)³⁶를 생산하는 잡종세포(hybridoma)는 로버트 미틀러 (Drs. Robert Mittler, Emory University, Atlanta, Georgia)와 히데오 야기타 및 코 오쿠무라(Hideo Yagita 및 Ko Okumura, Juntendo University, Tokyo, Japan)로부터 각각 제공받았으며, 항체는 단백질 G-칼럼(protein G-column)에 의해 복수 (Ascites, 생쥐의 배(복강)의 활액)로부터 정제하였다. 항-CD3(anti-CD3) 단일클론항체로 자극된 T 세포 또는 4-1BBL을 발현하는 P815 세포를 이용하여 단일클론항체의 결합능력을 검사하였다. 3H3의 F(ab')₂ 조각은 펩신(pepsin)으로 항체를 분해한 후, 세파크릴 S-200HR(Sephacryl S-200HR) 컬럼을 사용하여 정제하였다. 한편, 정제된 쥐의 IgG(Sigma 사)를 대조군(control) 항체로 이용하였다. 하기의 단일클론 항체(BD PharMingen 사)는 유세포 분석에 사용하였다. FITC-, PE-, PerCP- 또는 비오틴-항-CD8 (53-6.7); PE-항-CD4 (GK1.5) PE- 또는 비오틴-항-CD11c (HL3); FITC- 또는 비오틴-항-CD11b (M1/70); PE-항-B220 (RA3-6B2); FITC-항-IFN-γ (XMG1.2); FITC-항-IL10 (JESS-16E3); PE-항-IL12 (C15.6); 비오틴-항-H-2K^g (KH14); 비오틴-항-I-A^g (KH116); 비오틴-항-CD80 (16-10A1); 비오틴-항-CD86 (GL1); 비오틴-항-CD40 (3/23); 비오틴-항-CD45RA (14.8); 정제된 항-CD16/CD32 (2.4 G2); PE-, FITC-, 또는 Cy-스트랩트아비딘; 및 마우스 Vβ TCR 스크리닝 패널(screening panel). 한편, FITC-항-DEX205(NLDG-145)는 세로텍(Serotec) 사로부터 구입하였다.

실시예 1. CIA 유도 및 항-4-1BB 항체의 투여

콜라겐에 의해 유도되는 관절염(CIA)의 발병과정중 4-1BB의 역할을 이해하기 위해, 아고니스트(agonist)항-4-1BB 항체(3H3) 또는 저해성 항-4-1BBL(TKS-1) 항체가 CIA 발병을 변화시킬 수 있는지 살펴보았다.

구체적으로, 6~7 주령의 수컷 DBA/1(Chrles River Japan, Japan) 쥐에 M. 투베르쿨로시스(tuberculosis)를 함유하는 CFA(Complete Freund's Adjuvant) 유상액의 100 ㎍ 콜라겐 2형(CⅡ) 0.2 ㎖를 꼬리 기저부에 피하주사하여 면역원을 투여하였다. 그 후, 200 ㎎의 항-4-1BB(3H3), 200 ㎎의 항-4-1BBL(TKS-1) 또는 대조군 IgG를 면역원 투여후 0, 2, 4, 6, 8일째에 각각 복강주사하였다. 각 그룹은 10마리의 쥐를 지정하여 이용하였으며, 이후, CIA(Collagen-Induced Arthritis) 유도된 쥐를 매일 관찰하면서 관절 염증의 평균 임상질병지수를 판단하였다. 질병의 정도는 정상(0), 발목 관절에 제한된 홍반과 약한 부음(1), 발목관절로부터 홍반과 확장된 부음(2), 발목관절로부터 확장된 홍반과 보통의 부음(3), 발목관절로부터 확장된 홍반과 심한 부음(4)으로 기록하였으며, 족(足)당 최고의 관절염 지수는 4이므로 쥐 1마리당 최고의 질병 지수는 16이었다.

그 결과, 대조군으로서 쥐의 IgG를 투여한 쥐는 항원투여 28일 경과후 심한 관절염을 형성하였고, 42일 경과후 관절염의 지수는 최고조를 이루었다(severity = 13.4±2.7; 발병율 (incidence) = 9/10; 발두께 = 3.5±0.26). 또한, 4-1BB와 4-1BBL의 상호작용을 차단하기 위해 사용된 항-4-1BBL 항체를 투여한 쥐는 대조군인 IgG를 투여한 쥐보다는 비교적 약한 관절염이 발생하였다(severity = 9.6±3.2, p < 0.05; 발병율 = 8/10; 발두께 = 2.7±2.5, p < 0.05). 한편, 아고니스트 항-4-1BB를 투여한 쥐는 질병 발달을 강하게 억제하였다(severity = 1.6±1.6, p < 0.0001; 발병율 = 2/10 발두께 = 1.7±0.2, p < 0.001)(도 1a 및 1b). 즉, 아고니스트 항-4-1BB 항체는 CIA의 발병을 억제함을 확인할 수 있었다.

실험예 1. CIA 유도에 있어서 조직학적 특징과 면역 염색

상기 실시예 1에서 CIA가 유도된 쥐의 조직학적 특징을 면역 염색에 의해 확인하였다.

구체적으로, 면역원 투여후 45일째에 쥐를 안락사시킨 후, 쥐의 뒷발을 10% 포르말린(formalin)으로 고정하고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀을 묻혔다. 관절 절편(5-7㎛)을 준비하고 일반적인 과정으로 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다. 염색된 절편을 광학 현미경으로 검사하였다. 이중 형광 염색을 위해 1㎍의 표지되지 않은 항-FcrR 항체로 블록하고 폴리-L-리신(poly-L-lysine)으로 코팅한 유리 슬라이드에 분리된 CD11c⁺CD8⁺T 세포를 37℃에서 배양하였다. 비오틴(Biotin)이 부착된 CD11c와 CD3 항체로 60분간 배양한 후, 슬라이드를 세척하고 PE (Phycoerythrin)가 부착된 스트랩트아비딘(streptavidin)과 FITC(Fluorescein)가 부착된 항-햄스터(anti-hamster) IgG와 1시간동안 반응시켰다. 마지막 세척 후 슬라이드에 GVA 마운팅(mounting) 용액을 얹고 레이저 스캐닝 공초점 현미경(laser scanning confocal microscope)을 이용하여 관찰하였다. 출수 림프절의 이뮤노퍼옥시다제(immunoperoxidase) 염색을 위해 출수림프절(8㎛)의 절편을 PBS로 세척하고, 정제된 항-CD8 단일클론 항체와 호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse radish peroxidase, HRP)가 접합된 항-랫트 IgG 로 염색한 후, 3-아미노-9-에틸카바졸(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)로 현상하였다. 첫 번째 염색 후 이 절편을 비오틴이 부착된 항-CD11c 단일클론 항체와 HRP가 결합된 항-햄스터 IgG로 다시 염색하였으며, 3'-디아미노벤지딘(3'-diaminobenzidine, DAB)으로 현상하였다. 염색된 절편은 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 대비염색(countstain)한 뒤 형광 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 대조군 IgG 및 항-4-1BBL 항체를 투여한 쥐의 관절은 많은 면역세포들이 침투(infiltration)해 있으며, 관절활액 과다생성, 판누스(pannus) 형성, 연골파괴 및 뼈침식 등과 같은 CIA의 모든 특징들이 발생함을 확인하였다. 그러나, 항-4-1BB 항체를 투여한 쥐의 관절은 상기 질병의 특징들이 나타나지 않았다(도 2).

실험예 2. CIA 유도에 있어서 사이토카인 발현여부

통상적인 관절염(rheumatoid arthritis)의 특징이라 볼 수 있는 높은 수준의 IL-1β, TNF-α, IL-6 등의 사이토카인 발현여부를 살펴보기 위해, 상기 실험예 1의 쥐의 발목관절 조직으로부터 RNA를 분리하여 RPA로 사이토카인 발현을 분석하였다.

2-1. RNase protection assay

면역원 부여 후 40일째 쥐의 각 그룹의 관절 조직으로부터 트리졸 시약(TRIzol reagent)을 사용하여 전체 RNA를 분리하였다. 사이토카인과 케모카인 mRNA 수준은 제조사의 설명서에 따라 RNase 보호 어세이(RNase protection assay)에 의해 양을 측정하였다.

구체적으로, 전체 RNA 15㎍을 [₃₂P]-UTP로 표지된 리보프로브(riboprobe)(Mck-1과 Mck-5)와 56℃에서 하루 동안 혼성화하였다. 그후, 혼성화되지 않은 단일 가닥 RNA를 RNase 처리에 의해 제거하였다. 분해되지 않은 RNA는 페놀/클로로포름(phenol/chloroform)과 에탄올 침전에 의해 정제하였다. 샘플은 6% 폴리아크릴아미드/7M 우레아 겔에서 전기영동하였다. 그 후, 겔을 건조한 후 자기방사법(autoradiography)으로 분석하였다.

2-2. RT-PCR

수퍼스크립트 Ⅱ(Superscript Ⅱ)와 올리고(dT)를 이용하여 1㎍의 전체 RNA로부터 단일 가닥의 cDNA를 제조하였다. 그 후, cDNA에는 10U RNase-H를 처리하였다. PCR은 0.5 μM의 각 프라이머와 0.5 ㎕ cDNA를 섞어 20 ㎕로 수행하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다. IL-1β(서열번호 1로 기재되는 센스 프라이머, 서열번호 2로 기재되는 안티센스 프라이머), TNF-α(서열번호 3으로 기재되는 센스 프라이머, 서열번호 4로 기재되는 안티센스 프라이머), GAPDH (서열번호 9로 기재되는 센스 프라이머, 서열번호 10으로 기재되는 안티센스 프라이머).

그 결과, 관절 조직의 사이토카인 발현분포에 있어서, 대조군 IgG 및 항-4-1BBL 항체를 투여한 쥐는 MCP-1, MIP-2, 에오탁신(eotaxin), MIP-1a 및 RANTES 등과 같은 케모카인(chemokine)들을 높은 수준으로 발현하는 반면, 항-4-1BB 항체를 투여한 쥐에서는 상기와 같은 사이토카인들을 거의 검출할 수 없었다. 사이토카인의 종류에 있어서도 대조군 IgG를 투여한 쥐는 높은 수준의 IL-6, IL-15, TNF-α, IL-1β mRNA를 발현하였고, 항-4-1BBL 항체를 투여한 쥐에서도 높은 수준의 IL-15, TNF-α, IL-1β를 발현 및 낮은 수준의 IL-6 mRNA를 발현하였다. 그러나, 항-4-1BB 항체를 투여한 쥐는 상기와 같은 사이토카인들을 거의 검출할 수 없었다(도 3).

실험예 3. 콜라겐에 특이적인 항체의 측정

본 발명자들은 항-4-1BB 항체 투여가 항-CⅡ 항체 생산을 저해하는지 살펴보았다.

구체적으로, 항-소(bovine) CⅡ IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgE 아종의 혈청내 농도를 효소결합 면역 측정법(ELISA)으로 측정하였다. 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 소의 CⅡ (10㎍/㎖)를 코팅과 블록한 후 연속적으로 희석한 실험 혈청을 반응하였다. 결합된 IgG는 HRP가 부착된 쥐의 항-마우스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgE 및 기질로서 테트라메틸 벤지딘 인큐베이트(tetramethyl benzidine incubate)를 사용하여 측정하였다. 혈청내 항-CⅡ 항체의 수준은 항원 투여 후 19, 28, 35, 42일에 측정하였다. 광학 농도는 ELISA 플레이트 리더로 450nm에서 측정하였다.

그 결과, 항-4-1BB 항체 투여시 항-CⅡ에 반응하는 항체 중 IgG와 IgG2b의 생성을 완전히 억제하였으며(p < 0.001)(도 4), 항-4-1BBL 항체투여는 약간의 항-CⅡ 항체 형성을 낮추었다(p < 0.05). CⅡ에 반응하는 IgG의 또 다른 이소타입(isotype)과, IgA, IgE 역시 검출되지 않을 만큼 낮은 수준이었다. CIA 모델에서의 상기와 같은 결과들은 항-4-1BB 항체투여에 의한 4-1BB 신호전달이 4-1BB/4-1BBL 상호작용을 차단하는 것과는 달리 능동적인 억제기전을 유도함을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 항-4-1BB (3H3) 항체 투여에 의한 진행중인 질병의 완화.

DBA/1 쥐에 CIA를 유도한 후, 항원 투여 28일째에 관절염 정도가 동일한 쥐를 세 개의 집단으로 나누어 각각 IgG, 항-4-1BB, 항-4-1BBL 항체를 28, 30, 32, 34, 36일에 투여하였다.

그 결과, 관절염은 항-4-1BB 항체를 투여한 집단에서만 완화되었다(도 5a). 상기와 같은 효과는 항원 투여 후 52일째에 가장 두드러졌다(P<0.05). CⅡ-특이적인 항체수준의 변화를 살펴본 결과, 항-4-1BB를 투여가 혈중내 항-CⅡ 항체를 거의 완벽하게 낮추었다(도 5b 및 5c). 상기와 같은 결과는 4-1BB의 교차결합(cross-linking)으로 CIA에 대한 억제기전이 유도되는 것을 다시 한번 보여준다.

실험예 5. 항-4-1BB 항체 투여에 의한 항원 특이적 CD4 ⁺ T 세포 증식의 억제

본 발명자들은 항-4-1BB 항체 투여에 의한 능동적 억제기전이 CD4+ T 세포를 제어하는지 살펴보기 위해, 항원에 대한 CD4⁺ T 세포의 리콜(recall) 반응을 체외에서 살펴보았다. 이때, 리콜 반응이라 함은 특정 항원을 면역한 후 약 2-3주가 지나서 기억 세포(memory cell)들이 형성되고, 상기 세포들이 그 특정 항원에 대해 빠르게 반응하여 면역반응을 유도하는 것을 말하며, 일반적으로 상기 세포의 증식을 BrdU 또는 [3H]-티미딘을 사용하여 측정한다.

구체적으로, 쥐를 CⅡ로 면역시킨 후, 12일째에 대조군으로서의 IgG, 항-4-1BB, 항-4-1BBL 단일클론 항체를 처리한 쥐의 출수림프절(axillary와 inguinal 림프절)에서 마그네틱 비드(magnetic bead)를 이용하여 CD4⁺ T 세포를 분리하였다. 분리된 CD4⁺ T 세포 (1x10⁵)는 미토마이신-C(mitomycin-C) 처리(50 ㎍/㎖, 37℃, 20분)한 동종(syngenic)의 비장 항원 제시세포(2x10⁵)와 함께, 그리고 변성된 CⅡ (0.5 ㎍/㎖)를 첨가하거나 첨가하지 않고 배양하였다. 세포는 5% CO₂, 37℃ 조건에서 72시간 동안 배양하였으며, 배양중 마지막 12시간 동안 [3H]티미딘(1.0 μCi/웰)으로 표지하였다. 표지된 방사능을 신틸레이션 카운터(scintillation counter)로 측정하였다. 상기 배양 상층액으로부터 사이토카인 수준을 측정하기 위해, 엔도젠(Endogen) 사에서 구매한 사이토카인 특이적인 항체 쌍을 사용하여 ELISA를 수행하였다.

그 결과, 항-4-1BB를 투여한 쥐의 CD4⁺ T 세포는 리콜 반응을 보이지 않은 반면, 대조군 IgG 투여한 쥐의 CD4⁺ T 세포는 항원에 반응하여 강하게 증식되었고, 항-4-1BBL를 투여한 쥐의 CD4⁺ T 세포는 IgG 투여한 쥐의 것보다 낮은 recall 반응을 보여주었다(P<0.05)(도 6). 즉, 상기와 같은 결과는 CIA 모델에서 항-4-1BB로 조절되는 억제 기전이 CD4⁺ T 세포의 억제에 의한 것임을 확인할 수 있었다.

실험예 6. 항-4-1BB 항체 투여에 의한 출수 림프절 내 CD11c ⁺ CD8 ⁺ T 세포군의 증가 유도

6-1. CD11c ⁺ CD8 ⁺ 세포의 증가를 유도 조건 조사

CIA 모델에서 4-1BB에 의해 조절되는 CD4+ T 세포의 억제에 관한 기전을 살펴보기 위해, 본 발명자들은 항원 투여 후 12일째에 출수 림프절과 비장의 백혈구 아세포군(subpopulation)의 증감을 살펴보았다.

구체적으로, 유세포분석기(FACS)를 이용하여 백혈구의 다양한 세포표면 표지분자(surface maker)를 조사하였다. 즉, 출수 림프절과 비장으로부터 적혈구가 없는 단일 세포 부유를 수득한 후, 표지 되지 않은 1 ㎍의 항-FcγR 항체로 첫 번째 블록 후에 각각의 형광으로 표지된 항체를 수득된 1x10⁶ 의 림프구 세포(100㎕)와 반응시켜 유세포 분석을 하였다. 세포내 사이토카인 염색을 위해, 세포를 CⅡ(50 ㎍/㎖) 또는 CⅡ + PMA (50 ng/㎖) + 이오노마이신(ionomycin)(500 ng/㎖)로 18시간 동안 자극한 후, 마지막 6시간 동안 GolgiPlug(BD PharMingen 사)를 첨가하였다. 우선 세포표면 표지분자로 염색하고, 제조사의 설명서에 따라 Cytofix/Cytoperm kit(BD PharMingen 사)를 사용하여 고정(fixation), 침투(permeablization)한 후, FITC가 결합된 항-IL-10이나 IL-12 단일클론 항체로 반응시켰다. 이때, BrdU 표지분석은 제조사(BrdU Flow Kit, BD PharMingen 사)의 설명서에 따라 수행하였다. 구체적으로, 출수림프절 세포(2x10⁵)를 CⅡ(50 ㎍/㎖)의 존재하에 배양하였다. 세포를 PE (phycoerythrin)가 결합된 항-CD4로 염색하고 고정, 침투, DNase I 처리, 그리고 FITC가 결합된 BrdU로 반응시킨 후, 즉시 FACS 칼리버(Calibur)(BD Biosciences 사)로 분석하였다.

그 결과, DBA/1 쥐를 CⅡ로 면역반응을 유도하고 대조군 IgG를 투여하였을 경우 CD11c⁺CD8⁺ 세포의 증가를 보이지 않았다(도 7의 B). 4-1BB 녹아웃(knock-out) 쥐를 CⅡ로 면역하고 항-4-1BB 항체를 투여하였을 때도 동일한 결과를 나타내었으며(도 7의 C), 이는 항-4-1BB가 CD11c⁺CD8⁺ 세포의 증가에 필수임을 나타낸다. 동일한 조건 아래 항-4-1BB의 (Fab')₂ 단편을 투여한 결과에서도 역시 CD11c⁺CD8 ⁺ 세포의 증가를 보이지 않았다(도 7의 D). CD11c⁺CD8⁺ 세포의 증가는 완전한 항-4-1BB 항체의 교차결합(cross-linking)에 의해 발생되는 4-1BB 신호전달이 필수적이었다. 최종적으로, DBA/1 쥐를 항-4-1BB 항체 투여하고 면역촉진제(adjuvant)를 주사한 결과, CD11c⁺CD8⁺ 세포의 증가는 보이지 않았다(도 7의 E). CD11c ⁺CD8⁺ 세포의 증가는 단지 CⅡ 항원 투여와 항-4-1BB 항체 투여에 의한 4-1BB 신호전달이 함께 이루어졌을 때 나타났다(도 7의 A). 따라서, CD11c⁺CD8⁺ 세포의 증가는 4-1BB 의존적이며 항원 유도적인 효과로 이루어짐을 확인할 수 있었다.

6-2. 유도된 CD11c ⁺ CD8 ⁺ 세포의 표현형

한편, 실험예 6-1에서 유도된 CD11c⁺CD8⁺ 세포의 표현형을 살펴보기 위해서, 본 발명자들은 CD11c^-CD8⁺, CD11c⁺CD8⁺, CD8^-CD11c ⁺ DCs 세포에서 세포표면 표지분자(surface marker)를 비교하였다.

그 결과, CD11c⁺CD8⁺ 세포는 T 세포 표지인 CD3⁺, TCR Vβ⁺, Thy1.1⁺를 발현하였다. 또한, 상기 세포들은 일반적인 CD11c^-CD8⁺ T 세포와 달리 33D1 수지상 세포 표지분자와 더불어 CD11c와 클라스(class) Ⅱ 항원 I-A^q를 발현하였다. 한편, 상기 세포들은 CD11c⁺CD8α⁺DCs와는 달리 수지상 세포 표지분자인 CD205를 발현하지 않았고, 형광으로 표지된 덱스트란(dextran)을 섭취하지 않았다(도 8). 따라서, 본 발명자들은 상기 새로운 세포군이 CD8⁺ T 림프구 세포임을 확인할 수 있었다.

또한, CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 TCR Vβ 발현 양상을 살펴보기 위해, CⅡ로 면역원을 부여한 후 항-4-1BB를 처리한 쥐로부터 CD11c^-CD8⁺T 세포, CD11c⁺CD8⁺T 세포, CD4⁺ T 세포를 출수 림프절에서 분리한 후, VβTCR 단일클론 항체의 패널로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다.

그 결과, 이 세포의 30% 이상이 Vβ8.1/8.2를 지니고 있었고, Vβ8.3, Vβ5.1/5.2, Vβ7은 각각28%, 22%, 17%로 나타났다. CD4⁺ T 세포에서 Vβ의 발현 양상은 CD11c⁺CD8⁺ T 세포와 유사하였다 (도 9).

6-3. HSV-1 감염에 의한 CD11c ⁺ CD8 ⁺ T 세포의 생산

외부항원에 의해 면역원이 부여된 후, 본 발명의 항-4-1BB 항체를 투여한 경우에도 CD11c⁺CD8⁺T 세포가 유도되는지 살펴보았다.

구체적으로, 쥐를 케타민 하이드로클로라이드(ketamine hydrochloride)(1 ㎎/㎏)와 자일라진(xylazine)(0.5 ㎎/㎏)의 복강 주사로 마취시키고 PBS 20㎕에 HSV-1 4x10⁵ PFU를 각 뒷발에 감염시켰다. HSV-1로 감염된 쥐에 정제된 항-4-1BB (3H3, 200㎍)또는 대조군 IgG를 0, 2일에 복강 주사하였다. 면역성 부여 후 5일째에 출수림프절에서 단일 세포 부유액을 준비한다. 세포는 2.4 G2로 처음 반응시키고, 그 후 PE가 결합된 항-CD11c와 Cy가 결합된 항-CD8 단일클론항체로 염색하였다. 염색된 세포를 유세포 분석기로 분석하였다.

그 결과, CD11c⁺CD8⁺ T 세포는 또한 HSV-1 감염과 같은 다른 항원에 의해서도 항-4-1BB 항체 투여시 유도되었다(도 10).

6-4. CD11c ⁺ CD8 ⁺ T 세포의 증가 양상과 특징

상기 실험예 6-1에서 유도된 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 시간별 증가 양상 및 특징을 DBA/1 쥐에 CⅡ 항원과 항-4-1BB 항체를 투여한 뒤 살펴보았다.

그 결과, 항원 투여 후 5일째 증가가 시작되어 12일째에 최고치를 보여주었다. 이 세포는 항원 투여 후 18일 이후로는 더 이상 검출되지 않았다. 그리고 항원 투여 후 24일째에 다시 항-4-1BB 항체를 투여하였을 때, 4일 후에 천천히 다시 증가하였다(도 11a). 또한, 일반적인 CD11c^-CD8⁺ T 세포 역시 증가하였다( 도 11b).

또한, CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 세포적 특성을 공초점 미세현미경(Confocal microscopy)으로 관찰한 결과, 세가지 형태의 CD11c⁺CD8⁺ T 세포가 발견되었다. 즉, 수지상을 지닌 큰 세포(도 12의 A), 약간의 수지상을 지닌 중간 크기의 세포(도 12의 B) 및 수지상을 지니지 않은 작은 세포(도 12의 C)로서, 이들은 명백히 수지상 세포와 달랐다(도 12의 D)(녹색: 항-CD3; 빨간색: 항-CD11c). 이때, CD11c⁺CD8 ⁺ T 세포는 최고 수준에 이를 때 모든 출수 림프구 세포의 약 22%를 차지하였다(도 13).

한편, 본 발명자들은 CⅡ 항원으로 CD11c⁺CD8⁺ T 세포를 자극 후, 세포내 염색(도 14a)과 배양 상층액으로부터 효소결합 면역측정법(ELISA)을 이용하여(도 14b) 상기 세포의 사이토카인 형성을 알아보았다. 그 결과, IFN-γ는 CD11c⁺CD8⁺ T 세포가 생산하는 주 생성물이었다.

실험예 7. CD11c ⁺ CD8 ⁺ T 세포의 분리와 입양전달

본 발명자들은 CD11c⁺CD8⁺ T세포의 입양전달이 CⅡ에 특이적인 CD4⁺ T세포를 억제하는지 알아보았다.

구체적으로, CⅡ로 면역한 후, 항-4-1BB 항체를 투여한 쥐의 출수 림프절로부터 CD11c⁺CD8⁺ T세포와 CD11c^-CD8⁺ T 세포를 준비하였으며 쥐의 IgG를 투여한 쥐의 출수 림프절로부터 CD11c^-CD8⁺ T세포를 준비하였다. 각 세포들을 새로운 DBA/1 쥐로 입양전달(adaptive transfer) 하였으며, 동시에 CⅡ 또한 면역하였다. 7일 후 쥐의 각 그룹의 출수 림프절에서 CD4⁺ T세포를 준비하고 CⅡ(50㎍/㎖)을 넣거나 넣지 않고 감마선을 투사한 항원제시세포(APC)와 함께 72시간 동안 배양하였다. [3H]티미딘은 수거하기 8시간 전에 추가하였다. 출수 림프절은 1㎎/㎖ 콜라겐아제와 5 mM의 EDTA 존재하에 37℃ 에서 5분 동안 반응하였다. 단일 세포 부유로 준비하고 MACS 분리 컬럼에 의해 CD11c⁺CD8⁺ T 세포로 분리되었다. 이 세포군은 일반적인 CD11c⁺ DC (dendritic cell; 수지상 세포)와는 달리 CD4, CD11b, CD40, B220를 발현하지 않기 때문에, CD11c⁺CD8⁺ T 세포 분리를 위해 이들 분자에 대한 항체를 모두 섞어 반응시킨 후 CD4⁺, CD11b⁺, CD40⁺, B220⁺ 세포를 모두 제거하였다. 상기와 같이 분리된 세포는 수지상세포를 포함하지 않기 때문에 CD11c(N418)-마이크로비드로 반응시킨 후 CD11c⁺CD8⁺와 CD11c^- 세포를 분리하였다. 윗 단계에서 CD11c ^- 세포를 항-CD8(LY-2) 마이크로비드로 반응하여 CD11c^-CD8⁺ 세포 분리하였다. 분리된 세포군의 순도는 87 - 90% 범위였다. 입양전달을 위해 5x10⁶의 정제된 세포들을 DBA/1 쥐에 정맥주사로 전달하였다.

그 결과, CD11c⁺CD8⁺ T세포를 입양전달 받은 쥐로부터의 CD4⁺ T세포는 CⅡ에 대해 반응하지 않았다. 그러나, CD11c^-CD8⁺ T세포를 입양전달 받은 쥐의 CD4 ⁺ T세포는 CⅡ에 대한 정상적인 반응을 보여주었다(도 15).

또한, 본 발명자들은 CD11c⁺CD8⁺ T세포의 입양전달이 CIA의 발병을 억제하는지를 알아보았다. 항-4-1BB 항체를 투여한 쥐로부터 CD11c⁺CD8⁺ T 세포와 CD11c ^-CD8⁺ T 세포를 수득하여 준비하고, 대조군 IgG를 투여한 쥐로부터 CD11c^-CD8⁺ T 세포를 수득하여 준비한 후, CⅡ로 면역된 DBA/1쥐에 0, 10, 25, 35일에 입양전달 하였다. 그 결과, CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 입양전달은 CIA의 발병을 완화시켰다(도 16 ).

실험예 8. 항-4-1BB 항체투여에 의한 대식세포와 수지상 세포에서 IDO와 iNOS mRNA의 유도

CD11c⁺CD8⁺ T 세포가 IFN-γ를 생산하는 바, 본 발명자들은 IFN-γ 유도 작동체 분자인 IDO (Indoleamine 2,3-dioxygenase)와 iNOS (inducible Nitric Oxide Synthetase)가 출수 림프절에서 생산되는지를 살펴보았다.

인돌아민 2,3-디옥시겐아제(Indoleamine 2,3-dioxygenase; IDO)를 발현하는 세포는 임신기간 동안 모계의 T 세포에 의해 유발되는 면역반응을 조절한다(Munn 등). 상기 IDO는 사람과 쥐 모두 수지상 세포 중 일부 아종(subset)에서 항상 발현된다.

구체적으로, 쥐에 CⅡ+대조군 IgG, CⅡ+항-4-1BB를 각각 처리하였다. 그 후, 14일째 CⅡ와 대조군 IgG를 처리한 쥐로부터 CD8⁺ T 세포, CD11b⁺ 단핵구, CD11c ⁺ DCs를 분리하여 정제하였다. 또한, CⅡ와 항-4-1BB를 처리한 쥐로부터 CD11c-CD8+ T 세포, CD11c⁺CD8⁺ T 세포, CD11b⁺ 단핵구, CD11c⁺ DCs를 분리하여 정제하였다. 상기 정제된 세포에서 RNA를 추출하고 IDO, iNOS, GAPDH에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이때, 사용한 프라이머는 IDO (서열번호 5로 기재되는 센스 프라이머, 서열번호 6으로 기재되는 안티센스 프라이머), iNOS (서열번호 7로 기재되는 센스 프라이머, 서열번호 8로 기재되는 안티센스 프라이머), GAPDH (서열번호 9로 기재되는 센스 프라이머, 서열번호 10으로 기재되는 안티센스 프라이머)이다. 한편, 대식세포의 분리는 마우스로부터의 비장을 적출한 후, 작은 조각으로 자르고 콜라겐아제 타입 Ⅱ(collagenase type Ⅱ)(1 ㎎/㎖)와 DNase I(15㎍/㎖)를 처리하여 37℃에서 40분 동안 배양하였다. 세척 후 CD11b 이뮤노마그네틱 비드(immunomagnatic bead)를 사용하여 MACS (Magnate Activated Cell Sort) 컬럼으로 대식세포를 분리하였다. 이후, 세포를 CD8a 마이크로비드(microbead)로 반응시키고 MACS 컬럼으로 수지상 세포를 추가분리하였다. 컬럼에 부착되지 않은 세포군(CD11c⁺CD8^-)을 CD11c 마이크로비드(microbead)로 다시 배양하여 CD11c⁺ DC를 분리해냈다. 분리한 대식세포와 수지상세포의 순도는 87-90%였다.

그 결과, 대조군 IgG를 처리한 쥐는 IDO와 iNOS mRNA 모두를 생산하지 않았다. iNOS는 IDO와 달리 CD11c⁺CD8⁺ T 세포에서도 유도되었다. IgG를 처리한 대조군 쥐의 CD11c⁺ DC는 IDO와 iNOS를 낮은 수준으로 발현하였다. 그러나, 항-4-1BB 항체를 투여한 경우에는, CD11b⁺ 단핵구(monocyte)에서 IDO와 iNOS mRNA가 강하게 유도되었으며, CD11c⁺ DC에서 IDO와 iNOS mRNA 또한 유도됨을 확인하였다(도 17).

실험예 9. IFN-γ 중화에 의한 항-4-1BB에 의한 IDO와 iNOS의 유도 및 CD4 ⁺ T 세포의 억제 효과의 상쇄

IDO와 iNOS의 유도가 IFN-γ에 의한 것인지 알아보기 위해, 본 발명자들은 각 그룹 쥐의 출수 림프절로부터 CD11b⁺단핵구를 준비하고 IDO와 iNOS mRNA의 발현을 확인하였다.

구체적으로, CⅡ로 면역원을 부여하고 항-IFN-γ첨가 또는 무첨가하여 대조군 IgG 또는 항-4-1BB를 각각 처리하였다. 그 후, 14일째에 출수 림프절로부터 CD11b+ 단핵구를 분리하였다. 대조군 IgG 처리, 대조군 IgG + 항-IFN-γ 처리, 항-4-1BB 처리, 항-4-1BB + 항-IFN-γ 처리한 쥐의 CD11b+ 세포 및 IFN-γ를 양성 대조군으로 처리한 raw 264 세포에서 분리한 각각의 RNA를 이용하여 IDO, iNOS, GAPDH의 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 항-4-1BB에 의해 CD11b⁺ 단핵구에서 유도되는 IDO와 iNOS가 항-IFN-γ 항체에 의해 중화됨을 확인하였다(도 18). 즉, IFN-γ의 중화는 CD11b+ 단핵구에서 IDO와 iNOS의 발현을 저해하는 것이다.

한편, 항-4-1BB를 처리한 쥐에서 발생하는 CⅡ에 대한 CD4⁺ T 세포 반응의 억제에 IFN-γ의 관련성을 좀 더 명확히 알아보기 위해, CⅡ로 DBA/1에 면역을 한 후 항-IFN-γ 항체와 함께 대조군 IgG 또는 항-4-1BB 항체를 처리하였다. 그 후, 출수 림프절 세포들을 면역시킨 후, 14일에 분리하여 시험관 내에서 CⅡ로 자극하였다. CⅡ에 특이적인 CD4⁺T 세포 증식은 BrdU 표지를 통해 측정하였다. 항-4-1BB 항체를 처리한 쥐의 세포는 CⅡ에 대한 반응에서 증식하지 않았다. 이러한 억제는 항-4-1BB와 함께 항-IFN-γ 항체를 투여했을 때 발생하지 않았다(도 19). 즉, 상기와 같은 결과들은 항-4-1BB 항체에 의한 관절염 억제효과가 주로 IFN-γ의 유도에 의한 것을 제시하며, 이 IFN-γ는 항-4-1BB 항체와 항원에 의한 증가되는 CD11c⁺CD8⁺ T 세포에 의해 발현되는 것임을 확인할 수 있었다.

또한, 항-IFN-γ 항체 투여가 4-1BB에 의한 CIA의 억제기전을 되돌리는지 살펴보기 위해, 세 그룹의 DBA/1 쥐를 CⅡ로 면역하고 대조군 IgG, 항-4-1BB, 항-4-1BB + 항-IFN-γ를 투여 하였다. 그 결과, 항-4-1BB에 의한 CIA 억제효과가 항-IFN-γ 항체 투여에 의해 중화되는 것을 확인하였다(도 20).

실험예 10. 1-메틸트립토판(1-MT)에 의한 4-1BB로 유도되는 CIA 억제효과의 차단

항-4-1BB 항체 투여가 IDO를 유도하였으며 IDO가 IFN-γ의 분자적인 작동자(effector)일 수 있으므로, 본 발명자들은 IDO가 4-1BB에 의한 CD4⁺T세포와 CIA의 억제효과에 관련이 있는지 살펴보았다.

구체적으로, 각 쥐에 정제된 항-4-1BB(3H3, rat IgG1), 항-4-1BBL(TKS-1, rat IgG1), 대조군으로서 IgG 200 ㎍을 면역원 주입 후, 0,2,4,6,8일째에 복강 주사하였다. 발병된 CIA 치료를 위해서는 쥐에 면역원 주입 후 28,30,32,34,36일에 주사하였다. IFN-γ를 중화시키기 위해 정제된 R4-6A2 500 ㎍을 4일 간격으로 0,4,8,12일에 복강 주사하였고 랫트 IgG를 대조군으로서 투여하였다.

IDO 활성을 저해하기 위해 천천히 방출되는 중합체 정제로서의 1-MT(방출 비율 10mg/1일) 또는 플라시보(placebo) 정제를 면역 하루 전에 쥐의 등쪽 피부아래에 이식하였다. 1-메틸트립토판(1-methyltryptophan; 1-MT)은 IDO 기능의 저해제로서, 어떤 실험에서는 21일 기간동안에 하루에 20mg이 제공되는 각 210mg을 함유한 1-MT 두개를 각 쥐에 이식하였다. 쥐의 작은 크기에 비해 이들 알약의 큰 크기 때문에, 추가 실험에서는 20mg/1일 농도로 12일간 방출시키기 위해 각 쥐에 두 개의 작은 알약 (10mg/1일) 을 이식하는 실험을 수행하였다. 13일째 24일의 총 투약 기간을 위해 알약 두 개를 더 이식하였다.

그 결과, 1-MT 20 mg/day는 CIA에서 항-4-1BB 항체의 억제효과를 완벽하게 제거하였다. 이러한 1-MT의 효과는 농도 의존적이었으며 5 mg/day로 쥐에 처리하였을 경우 그 효과가 불완전하였다(도 21a). 한편, 동량(20 ㎎)의 1-MT를 처리하였을 경우에는 대조군 IgG 만을 처리한 쥐와 달리 항-4-1BB를 처리한 쥐에서는 질병 억제효과가 1-MT에 의해 상실되었다(도 21b).

실험예 11. 급성독성 실험

11-1. 경구투여

ICR계 마우스와 스프라그 도올리 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 조성물을 각각 100, 250, 500 및 1000 ㎎/㎏의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

11-2. 복강투여

ICR계 마우스(몸무게 25 ㅁ 5 g)와 스프라그 도올리 랫트를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 조성물을 각각 25, 50, 100 및 200㎎/㎏의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

따라서, 본 발명의 조성물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

항-4-1BB ..................................100 ㎎

소디움 메타비설파이트......................3.0 ㎎

메틸파라벤.................................0.8 ㎎

프로필파라벤...............................0.1 mg

주사용 멸균증류수...........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2 ㎖로 한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

항-4-1BB....................................200 ㎎

유당........................................100 ㎎

전분........................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘.........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

항-4-1BB...................................100 ㎎

유당........................................50 ㎎

전분........................................50 ㎎

탈크........................................2 ㎎

스테아린산 마그네슘.........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

항-4-1BB....................................1000 ㎎

설탕.........................................20 g

이성화당.....................................20 g

레몬향......................................적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

이상에서 설명한 본 발명의 조성물은 전체적인 면역반응에 유독하지 않으면서 항원 특이적인 면역억제를 유도하여 진행성, 염증성 또는 자가면역성 관절염 증상을 현저히 개선시킬 수 있으므로, 관절염의 예방 또는 치료제에 부작용없이 응용될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 DBA/1쥐에 CIA를 유도한 후, 항-4-1BB(3H3)(200mg), 항-4-1BBL(TKS-1)(200mg) 및 대조군 IgG를 각각 복강 주사한 후, CIA의 발병정도를 살펴본 도로서, 도 1a는 평균 임상질병지수를, 도 1b는 발두께의 변화를 나타낸 그래프이고,

도 2는 CIA가 유도된 쥐에 대조군 IgG(A), 항-4-1BBL(B) 및 항-4-1BB(C)를 투여한 후 관찰한 발목관절의 조직사진이고,

도 3은 45일째에 CIA가 유도된 쥐의 발목관절 조직으로부터 RNA를 추출하여 RPA(RNase Protection Assay)로 사이토카인 발현을 분석한 겔 사진이고,

도 4a 및 도 4b는 대조군 IgG, 항-4-1BBL 및 항-4-1BB로 면역된 쥐에서 항-CⅡ 항체의 생산 억제여부를 살펴본 흡광도 그래프로서, 도 4a는 항-CⅡ IgG1의 수준을, 도 4b는 항-CⅡ IgG2b의 수준을 ELISA에 의해 측정한 그래프이고,

도 5a 내지 도 5c는 이미 CIA가 진행중인 쥐에 대조군 IgG, 항-4-1BBL 및 항-4-1BB를 처리한 경우로서, 도 5a는 평균 임상질병지수를, 도 5b는 항-CⅡ IgG1의 수준을, 도 5c는 항-CⅡ IgG2b의 수준을 ELISA에 의해 측정한 그래프이고,

도 6은 CIA가 유도된 쥐의 슬와(Popliteal) 출수 림프절로부터 CD4⁺ T세포를 분리한 후, 감마선을 쏘인 비장세포와 CⅡ 첨가 유무에 따른 CⅡ 특이적인 CD4⁺ T세포의 반응을 [3H] 표지에 의해 측정한 그래프이고,

도 7은 CIA가 유도된 쥐에게 항-4-1BB 처리가 출수 림프절 내에서 CD11c⁺CD8⁺T 세포의 확장을 유도하는지 여부를 살펴보기 위해, CⅡ+항-4-1BB( A), CⅡ+대조군 IgG(B), 4-1BB 녹아웃 쥐에서 CⅡ+항-4-1BB(C), CⅡ+항-4-1BB의 F(ab')₂ 단편(D) 및 CFA+항-4-1BB(E) 처리후 유세포분석기(FACS; Fluorescence-Activated Cell Sorter)를 이용하여 관찰한 사진이고,

도 8은 유도된 CD11c⁺CD8⁺T 세포의 표현형을 살펴보기 위해, CD11c^-CD8 ⁺T 세포(A), CD11c⁺CD8⁺T 세포(B), CD8α-CD11c⁺DCs 세포( C)의 세포표면 표지분자(CD3, 33D1, CD205 및 I-A^q) 발현여부를 유세포분석기를 이용하여 관찰한 사진이고,

도 9는 유도된 CD11c⁺CD8⁺T 세포의 TCR Vβ 발현양상을 CD11c^-CD8 ⁺T 세포 및 CD11c⁺CD4T 세포와 비교한 그래프이고,

도 10은 다른 외부항원(HSV-1)을 처리한 후 항-4-1BB 항체를 투여한 경우에도 CD11c⁺CD8⁺ T 세포가 유도되는지 여부를 살펴본 사진이고,

도 11a 및 도 11b는 DBA/1 쥐에 CⅡ 항원과 항-4-1BB 항체를 투여한 후, 시간대별 CD11c⁺CD8⁺T세포(a) 및 CD11c^-CD8⁺T세포( b)의 증가양상을 살펴본 그래프이고,

도 12는 유도된 CD11c⁺CD8⁺T 세포의 형태를 공초점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰한 사진(녹색 : 항-CD3, 빨간색 : 항-CD11c)이고,

도 13은 DBA/1 쥐에 CⅡ+대조군 IgG(A) 및 CⅡ+항-4-1BB(B)를 각각 처리한 후, 림프절 단편을 항-CD8과 항-CD11c로 염색하여 관찰한 사진이고,

도 14a 및 도 14b는 항-4-1BB 처리에 의해 유도된 CD11c⁺CD8⁺ T 세포의 IFN-γ 생산여부를 살펴본 것으로서, 도 14a는 세포내 염색에 의해 관찰한 도이고, 도 14b는 배양 상층액을 ELISA에 의해 관찰한 그래프이고,

도 15는 CD11c⁺CD8⁺ T 세포와 CD11c^-CD8⁺ T 세포를 각각 새로운 DBA-1 쥐에 입양전달하고 같은 날에 감마선에 노출된 APC 세포와 CⅡ 첨가 유무에 따른 CⅡ 특이적인 CD4⁺ T 세포의 억제 반응을 [3H] 표지에 의해 측정한 그래프이고,

도 16은 항-4-1BB 또는 대조군 IgG를 처리하여 유도된 CD11c⁺CD8⁺ T 세포와 CD11c^-CD8⁺ T 세포를 각각 새로운 DBA-1 쥐에 입양전달한 후 평균 임상질병지수를 나타낸 그래프이고,

도 17은 항-4-1BB 처리에 의한 IDO, iNOS 및 GAPDH의 유도 유무를 RT-PCR을 수행하여 살펴본 전기영동 사진으로서,

1 레인 : CD11c^-CD8⁺ T 세포에 대조군 IgG 처리한 경우,

2 레인 : CD11c^-CD8⁺ T 세포에 항-4-1BB 처리한 경우,

3 레인 : CD11c⁺CD8⁺ T 세포에 항-4-1BB 처리한 경우,

4 레인 : CD11b⁺ T 세포에 대조군 IgG 처리한 경우,

5 레인 : CD11b⁺ T 세포에 항-4-1BB 처리한 경우,

6 레인 : CD11c^high T 세포에 대조군 IgG 처리한 경우,

7 레인 : CD11c^high T 세포에 항-4-1BB 처리한 경우이고,

도 18은 항-4-1BB 처리에 의한 IDO 및 iNOS 유도에 있어서, IFN-γ의 영향을 살펴보기 위해 항-IFN-γ를 처리한 후 RT-PCR을 수행하여 살펴본 전기영동 사진으로서,

1 레인 : CD11b⁺ T 세포에 대조군 IgG 처리한 경우,

2 레인 : CD11b⁺ T 세포에 대조군 IgG 및 항-IFN-γ를 처리한 경우,

3 레인 : CD11b⁺ T 세포에 항-4-1BB 처리한 경우,

4 레인 : CD11b⁺ T 세포에 항-4-1BB 및 항-IFN-γ를 처리한 경우,

5 레인 : 양성 대조군으로서 IFN-γ만 처리한 경우이고,

도 19는 CIA가 유도된 쥐에 대조군 IgG 또는 항-4-1BB를 처리한 후, 항-IFN-γ의 처리유무가 CⅡ 특이적인 CD4⁺ T 세포 증식에 미치는 효과를 BrdU 표지법으로 측정한 도이고,

도 20은 항-IFN-γ 항체투여가 4-1BB에 의한 CIA 억제효과를 상쇄시키는지 여부를 확인하기 위해, CIA 유도된 쥐에 대조군 IgG 처리, 항-4-1BB 처리, 항-4-1BB 및 항-IFN-γ의 동시처리를 각각 수행한 후의 평균 임상질병지수를 나타낸 그래프이고,

도 21a 및 도 21b는 1-메틸 D,L-트립토판(1-methyl D,L-tryptophan; 1-MT)의 4-1BB에 의한 CIA 억제효과를 살펴본 것으로서, 도 21a는 1-MT의 처리량을 달리하여(5 ㎎, 20 ㎎) 살펴본 평균 임상질병지수이고, 도 21b는 동량(20 ㎎)의 1-MT를 처리하였을 경우 항-4-1BB의 처리유무를 달리한 평균 임상질병지수이다.

<110> ULSAN INDUSTRIAL EDUCATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition comprising the anti-4-1BB antibody for preventing and treating rheumatoid arthritis <130> DIF/2004-03-0004/CHC <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for RT-PCR of IL-1 beta <400> 1 ctgaaagctc tccacctc 18 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for RT-PCR of IL-1 beta <400> 2 ggtgctgatg taccagttg 19 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for RT-PCR of TNF-alpha <400> 3 ccaccacgtc tttg 14 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for RT-PCR of TNF-alpha <400> 4 atgggctcat acccaggg 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for RT-PCR of IDO <400> 5 cactgtacca gtgcagtag 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for RT-PCR of IDO <400> 6 accattcaca cactcgttat 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for RT-PCR of iNOS <400> 7 aagtcaaatc ctaccaaagt ga 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for RT-PCR of iNOS <400> 8 ccataatatg gttgatgaac t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for RT-PCR of GAPDH <400> 9 gaacgggaag cttgtcatca a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for RT-PCR of GAPDH <400> 10 ctaagcagtt ggtggtgcag 20

Claims

D11c⁺CD8⁺ T 세포의 증가 및 CD4⁺ T 세포 억제를 유도하는 항-4-1BB 항체를 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 항-4-1BB 항체는 조성물 총 중량에 대해 0.1 ~ 50 중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 관절염은 콜라겐 유도성 관절염인 것을 특징으로 하는 조성물.
항-4-1BB를 함유하는 제1항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 관절염의 예방 또는 치료방법.