JP2008518882A - 関節リュウマチ治療又は予防用の坑４−１ｂｂ抗体含有薬組成 - Google Patents

Abstract

本発明は薬容認担体と共に、活性成分としてCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞を増殖しCD４^＋細胞抑制を誘導して、関節リュウマチ疾患の予防治療に有効な量の坑４−１BB抗体含有薬組成に関する。本発明の組成は一般的免疫反応で毒性が無く、抗原特異性免疫反応で誘導される進行炎症性か自己免疫性関節炎症状を顕著に緩和できる。従って関節疾患の予防や治療に拒絶反応なしに有効である。
【選択図】図１

Description

本発明は関節リュウマチ治療予防用の薬組成含有の薬組成に関する。

慢性衰弱性全身炎症病である関節リュウマチ（ＲＡ）は滑膜肥厚と炎症細胞補充、関節内フィブリン沈着で特徴づけられ、その進行段階では軟骨及び骨破壊で特徴づけられる。ＲＡの病因については議論の余地があるが、その病気発生現象の順序と同様に末期エフェクター機構は良く確立されているようである。ＣＤ４^＋ヘルパーＴ細胞が初期炎症性病変を支配する。マクロファージ様食細胞滑膜内面細胞と相互嵌合滑膜線維芽細胞が大量の主要組織適合性複合体クラスII（MHC）抗原を増殖発現する。活性化ヘルパーＴ細胞がＢ細胞を滑膜に浸潤し免疫グロブリンを産生するように思われる。これらの局所的合成抗体の大部分ついての特異性は未知であるが、そのいくらかは関節の他の免疫グロブリン（ＩｇＧ）分子と結合して免疫複合体を形成する免疫グロブリン（ＩｇＧ）リウマチ因子である。最終的には好中球とマクロファージの大量補充と浸潤、一連の分解酵素の合成及び腫瘍壊死因子―a（ＴＮＦ―α）、インターロイキンー１（ＩＬ−１）及びインターロイキンー６（ＩＬ−６＿）によりリュウマチ様関節の軟骨と他構成要素を浸食する（モアランド、エルダブリュ等（Moreland, L.W. et al.）、組換え型ヒト腫瘍壊死因子受容体（ｐ７５）Ｆｃ融合タンパク質による関節リュウマチ治療（Treatment of rheumatoid arthritis with recombinant human tumor necrosis factor receptor (p75)-Fc fusion protein）、ニュウイングランドジャーナルオブメディシン（N. Engl. J. Med.）、３３７巻、１４１−１４７頁、１９９７年）。

これらの異なる疾病経過は共通経路で収束して破壊に至るようである。

RAでの最もよく使用される動物モデルはDBA/１マウスの関節でのTh―１細胞依存性慢性炎症であるＩＩ型コラーゲン（CII）誘導関節炎（CIA）である。このモデルは再現性があり、良く意味が規定されているため認められており、腫瘍壊死因子―α（TNF―α）中和治療で例証されたようにRA用新規治療の開発に有用であることが分かった（ウイリアムス、アールオー（Williams, R.O.）、メイスン、エルジェイ（Mason, L.J.）、フェルデマン、エム（Feldmann, M.）及びマイーニ、アールエヌ（Maini, R.N.）、樹立コラーゲン誘導関節炎寛解での坑CD4と坑TNF間の相乗作用（Synergy between anti-CD4 and anti-TNF in the amelioration of established collagen-induced arthritis）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンスユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sic. USA）、９２巻、２７６２−２７６６頁、１９９４年）。適応免疫の二つの武器、T細胞とB細胞がCIA発病で中心的役割を果たすが、免疫活性化と関節破壊両者の刺激での相対的重要性はいまだ不明である。B細胞の主な役割は関節炎誘導坑CII抗体の産生であり、CIIと反応する抗体が軟骨と結合し関節炎を誘導する事実により明白に示された。CIAでのT細胞の役割はもっと複雑で、関節炎発生で相乗的な二つの主経路に分けられる。第一にT細胞は関節炎誘導坑CII抗体産生でB細胞に助けを提供する。第二にT細胞自身がサイトカイン産生での関節炎症と他細胞の活性化で役割を果たす。

最近の治療の大部分は恐らく滑膜細胞増殖と軟骨腐爛をもたらす免疫異常の矯正に向けられている。現在の関節炎治療は非ステロイド系坑炎症薬（NASID）、例えばアスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキセートなどに分類される痛み炎症コントロール用の第一選択薬を含む。第二の治療としては副腎皮質ステロイド、遅効性坑リュウマチ薬（SAARD）又は疾患修飾性薬（DM）、例えばペニシリナミン、シクロフォスファミド、金塩、アゾチオプリン、レバミソールなどがある。しかし最も強力なステロイドホルモンは色素沈着過剰、無月経、ざ瘡、筋無緊張などのような種々の副作用を示すことが今までに報告されている。最近炎症機構で重要な役割を果たすTNF受容体の産生に遺伝子組み換え法を用いた新規な坑関節炎治療法が試みられたが、炎症、浮腫、異常血管新生及び骨軟骨腐爛のような種々症候群の治療緩和に今なお高度な治療薬が必要である。

TNF受容体の４−１BBは主としてTリンパ球の同時刺激性受容体に作用し、T細胞が抗原特異性信号を受けときに誘導される。更に４−１BBはNK（ナチュラルキラー）細胞、CD４^＋CD25^＋制御T細胞、単球及び他樹状細胞（DC）のような他リンパ球骨髄球系列により発現すると報告された。４−１BBはT細胞を同時刺激して樹立腫瘍の根絶、一次CD８^＋T細胞応答の拡張、抗原特異性CD８^＋T細胞の記憶貯蔵の強化といったエフェクター機能を実施した。更に４−１BB媒介信号により主として炎症性でT細胞依存性抗体応答を促進するCD^＋４T細胞を抑制して、全身性エリテマトーデス（SLE）と実験的自己免疫性脳炎（ＥＡＥ）のような自己免疫疾患を改善する。

インドールアミンー２，３−ジオキシゲナーゼ媒介の免疫制御の重要性がマン等（Munn, et
al）の先駆的な研究により再発見された（マン、ディエッチ等（Munn D.H. et al.）、トリプトファン異化反応による同種胎児拒絶反応の防止（Prevention of allogeneric fetal rejection by tryptophan catabolism）、サイエンス（Science）、２８１巻、１１９１―１１９３頁、１９９８年）。

それ故本発明者等は４−１BBの生理作用の研究を試み、４−１BB媒介のRA抑制がCD１１ｃ^＋CD8^＋T細胞誘導により抗原依存型に起こることを確認した。更に本発明者等はこの誘導T細胞の新規個体群により大量のインターフェロンγ（IFNγ）が産生され、次いでDCとマクロファージ中にIDOを誘導し、IDO依存機構により抗原特異性CD４^＋T細胞が抑制されることを見いだした。その結果坑４−１BB抗体が関節疾患の治療や予防に有効であることを確認することで本発明を完成した。

その結果本発明の目的は薬容認担体と共に、活性成分としてCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞を増殖しCD４^＋細胞の抑制を誘導することで、関節リュウマチ予防治療に有効な量の坑４−１BB抗体含有薬組成を提供することである。

関節疾患治療用薬組成は組成全量をもとに約０．０１乃至８０重量％、好ましくは０．１乃至５０重量％の本発明の上記坑４−１BB抗体を含有できる。

ここに開示の坑４−１BB抗体は技術的に既知の方法に従い産生できる。例えば４−１BB（３H3）と４−１BBL（TKS―１）に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞は技術的によく知られた方法、例えば文献に開示の産生法で産生できる（シュフォード、ダブリュダブリュ等（Shuford, W.W., et al.）、４−１BBの同時刺激信号により好ましくはCD８^＋Ｔ細胞増殖を誘導し、細胞傷害性T細胞応答の生体内増幅をもたらす（4-1BB costimulatory signals preferentially induce CD8⁺ T cell proliferation and lead to amplification in vivo of cytotoxic T cell responses.）、ジャーナルオブエクスペリメンタルメディシン（J. Exp. Med.）、１８６巻、４７−５５頁、１９９７年；フタガワ、ティ等（Futagawa, T., et al.）、マウス樹状細胞上４−１BBと４−１BBリガンドの発現と機能（Expression and function of 4-1BB and 4-1BB ligand on murine dendritic cells）、インターナショナルインミュノロジー（Int. Immunol.）、１４巻、２７５−２８６頁、２００２年）。

本発明の好ましい実施形態では、コラーゲン誘導CIAの進行での坑４−１BBの役割を理解するために、アゴニスト坑４−１抗体（３H3）をCIA誘導マウスに投与し、関節炎症の平均臨床指標を観察した。その結果疾患の発生がアゴニスト坑４−１ＢＢ投与により強く阻害された。滑膜肥厚の過剰産生、パンヌス形成、軟骨破壊や骨糜爛のようなCIAの特徴的特性の全てと、更には関節リュウマチの種々の発現因子、即ち単球走化性タンパク質１（MCP―１）、MCP―２、エオタキシン、マクロファージ炎症性タンパク質１a（MIP-1a）、好酸球走化性物質（ＲＡＮＴＥＳ）等のようなケモカイン、インターロイキンー６（IL―６）、IL―１５、TNF―αやIL―１βのようなサイトカインは見いだされず、坑CIIと反応する抗体の中で免疫グロブリン（IgG）と免疫グロブリン２ｂ（IｇG２ｂ）繁殖を完全に阻害する抗体特異性阻害反応を誘導する。

本発明の好ましい実施形態では、関節リュウマチ進行時でも坑４−BBは疾患指標を減少し且つ４−１BBの架橋結合によるCIAを阻害できる坑CII抗体の繁殖を阻害する。

坑４−１BB抗体治療による積極的な抑制機構によりCD^４＋T細胞誘導を阻害し、リンパ節細胞内のCD11ｃ^＋CD８^＋T細胞の増加を誘導する。誘導CD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞はCD１１ｃ^―CD8⁺、CD１１ｃ^＋CD８^＋、CD８^―CD１１ｃ^＋、DC細胞のような他の白血球表面マーカーとは異なるCD３^＋、T細胞受容体Vβ^＋（TCR Vβ^＋）、チミン１．１^＋（Thy１．１^＋）、CD１１ｃ及びクラスII抗原I―A^ｑを発現する新規CD８^＋リンパ球細胞である。CD11ｃ^＋CD８^＋T細胞を単離し養子移入すると、CIA発生を阻害した。それ故坑４−１BB処理により誘導されたCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞の増加により関節炎症が抑制できた。その時CD11ｃ^＋CD８^＋T細胞はCD１１ｂ^＋マクロファージとCD１１ｃ^＋樹状細胞でのIDO（インドールアミン２，３―ジオキシゲナーゼ）発現を誘導するIFN―γを産生し、１−メチルトリプトファン処理により坑４−１BB効果が退行する。CIAの阻害はCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞増殖により起こり、発現IFN―γのIDO依存性作用により抗原特異性CD４^＋Ｔ細胞を阻害する。

本発明の他様態によると、治療薬が必要なヒトを含む哺乳類で関節リュウマチ治療防止用治療薬製剤に坑４−１BB抗体の使用を提供する。

本発明の他様態によると、有効量の坑４−１BB抗体を薬容認担体と共に投与することを含む哺乳類の関節疾患治療防止法を提供する。

この発明組成は更に使用法に従い在来の担体、補助剤又は希釈剤を含んでも良い。該担体はその使用と適用法に従う適切な物質として使用するのが好ましいが限定はされない。適切な希釈剤はレミントンの薬科学（Remington's Pharmaceutical Science）（マック出版社（Mack Publishing Co.）、イーストン（Easton）、ペンシルバニア（PA））の文書テキストに記載されている。

以下の配合法と賦形剤は以後単に模範例であり該発明を全く制限するものではない。

本発明による組成は薬容認担体、補助剤又は希釈剤、例えばラクトース、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アラビアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル含有薬組成として提供できる。この配合物は更に充填剤、坑凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料添加剤、乳化剤、防腐剤や類似体を含有しても良い。該発明組成物は技術的に良く知られた方法のいずれかを用いて患者に投与後、活性成分を迅速、持続的又は遅延的に放徐できるように配合しても良い。

例えば本発明の組成は通常注射を実現するのに用いるオイル、プロピレングリコールや他溶媒に溶解できる。担体の適例としては生理食塩水、ポリエチレングリコール、エタノール、植物油、ミリスチン酸イソプロピルエステルなどがあるが、これらに限定はされない。局所投与に関しては本発明の化合物を軟膏やクリームの形で配合できる。

発明組成含有の薬配合物は経口投薬型（粉末、錠剤、カプセル剤、軟カプセル剤、水薬、シロップ、エリキシル剤、粉末、小袋、顆粒）や局所用製剤（クリーム剤、軟膏、ローション、ゲル、芳香性軟膏、パッチ、ペースト剤、噴霧溶液、エアロゾル及び類似物）又は注入可能製剤（溶液、懸濁液、乳化液）のようないずれかの形で調合できる。

本発明組成の薬用量形態としてはその薬容認塩の形で用いても良く、単独か適切な連合更には他の薬容認活性化合物との組み合わせで用いても良い。

該発明の所望用量は被験者の条件と体重、重症度、薬剤形態、投与経路や期間により変わり、技術的な熟練者が選択できる。しかし好ましい効果を得るには、通常本発明化合物の発明抗体化合物を体重/日単位で０．０１乃至１０ｇ/ｋｇ、好ましくは１乃至５ｇ/ｋｇ範囲の量を投与するのを薦める。この用量を一日当たり１回か複数回用量として投与できる。組成に関しては該発明組成は組成全重量に基づく重量で０．０１乃至８０重量％、好ましくは０．５乃至５０重量％が含まれる必要がある。

本発明の薬組成は種々の経路を通して哺乳類（ラット、マウス、家畜又はヒト）のような被験動物に投与できる。投与形態の全てが検討され、例えば投与として、経口、直腸投与や静脈、筋肉内、皮下、皮内、くも膜下腔内、硬膜外や脳室内注入が可能である。

本発明の他様態によると、治療薬が必要なヒトを含む哺乳類での関節リュウマチ治療防止用治療薬の製剤に坑４−１BB抗体の使用を提供する。

本発明の他様態によると、有効量の坑４−１BB抗体を薬容認担体と共に投与することを含む哺乳類の関節疾患治療防止法を提供する

技術の熟知者には該発明の精神や範囲を逸脱することなしに本発明の組成、用途や調合で種々の修正と変更が可能なことは明らかである。

本発明を以下の図と実施例によりより具体的に説明する。しかし本発明はどのような形でもこれら実施例に限定されないことを理解する必要がある。

本発明を以下の図と実施例によりより具体的に説明する。しかし本発明はどのような形でもこれら実施例に限定されないことを理解する必要がある。

［実施例１ 抗体の調合］
４−１BB（３H3）と４−１BBL（TKS-1）に対する抗体を産生する融合細胞腫細胞はロバートミットラー博士（Drs. Robert Mittler）（エモリー大学（Emory University）、アトランタ（Atlanta）、ジョージア（Georgia））と八木田秀夫（Hideo Yagita）と岡村弘（Ko Okamura）、（順天堂大学（Juntendo University）、東京（Tokyo）、日本（Japan））のそれぞれからの贈り物である。抗体をタンパク質Gカラム（シグマ社（Sigma）、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ（Missouri））により腹水から精製した。内毒素レベルはリムルスアメーバ状細胞溶解物（LAL）アッセイ（カムブレックス（Cambrex）、ウオーカーズビル（Walkersville）、メリーランド（Maryland））で０．０５単位以下である。単クローン抗体（ｍAb）の結合活性を坑CD3ｍAｂ刺激T細胞か４−１BBL形質移入P815細胞でテストした。３H3のF(ab')_２断片はペプシンで抗体を消化後セファクリルｓ−２００HRカラム（シグマ社（Sigma））を用いて精製した。精製ラットIgGはシグマ社（Sigma）から購入し対照抗体として用いた。以下のｍAｂを流動細胞計測分析用にビーディファーミンゲン社（BD Pharmingen）（サンジエゴ（San Diego）、カリフォルニア（California））から購入した。フルオレセインイソチオシアネート（FITC）―ホスホジエタノールアミン（PE）―、PerCP―及びビオチンー坑CD８（５３−６．７）；ＰＥ−坑ＣＤ４（ＧＫ１．５）、PE―ビオチンー坑CD１１ｃ（HL3）；FITC―及びビオチンー坑CD１１ｂ（M1/70）；PE―抗B220（RA3-６B２）；FITC―坑IFN―γ（XMG１．２）；FITC―坑IL１０（JESS―１６E3）；PE―坑IL１２（C1５．６）；ビオチンー坑H―２K^ｇ（KH１４）；ビオチンー坑I―A^ｑ（KH１１６）；ビオチンー坑CD８０（１６―１０A1）；ビオチンー坑CD８６（GL１）；ビオチンー坑CD４０（３／２３）；ビオチンー坑CD４５RA（１４．８）；精製坑CD１６／CD３２（２．４G2）；PE―、FITC―及びCy―ストレプトアビジン；Vβ２、３、４、５．１／５．２、６、７、８．１／８．２、８．３、９、１０ｂ、１１、１２、１３、１４及び１７T細胞受容体（ＴＣＲ）に対するFITC標識ｍAb含有マウスVβTCR選択パネル。FITC―坑DEX２０５（NLDG―１４５）はセロテック社（Serotec）（キドリングトン（Kidlington）、オックスフォード（Oxford）、英国（United Kingdom））から購入した。DX５はイーバイオサイエンス社（eBioscience）（サンジエゴ（San Diego）、カルフォルニア（California））から購入した。

［実施例２ CIA誘導と坑４−１BB処理］
CIAの進行での４−１BBの役割を理解するため、アゴニスト坑４−BB（３H3）かブロッキング坑４−１BBリガンド（坑４−１BBL）（TKS―１）のいずれがCIAの進行を修飾するかを試験した。

完全フロインドアジュバント（CFA）に乳化したＩＩ型ウシコラーゲン（ＣＩＩ）（コンドレックス社（Condrex）、レッドモンド（Redmond）、ワシントン（Washington））１００Ｄを尾底部に皮内注入して生後６乃至７週間のオスDBA/1マウスにCIAを誘発した。抗原をエムツバキュロセス（M. tuberculosis）H37RA（２．０ｍｇ／ｍｌ、コンドレックス社（Condrex））で補充した。マウスの関節炎症の兆候を毎日調べ以下のように採点した：０、正常；１、足関節に限られた紅斑と軽い腫大；２，足関節外に広がった紅斑と軽い腫大；３、足関節外に広がった紅斑と中ぐらいの腫大；４、足関節外に広がった紅斑と重度の腫大。足当たりの関節炎の最大得点は４、マウス当たりの疾患の最大得点は１６であった。

対照IgG処理マウスは免疫後（PI）約２８日で重度の関節炎を発生した。関節炎の重症度は免疫後４２日目でピークに達した（重症度＝１３．４±２．７；発生率＝９／１０；足厚さ＝３．５±０．２６）。４−１BBと４−１BBL間の相互作用を遮断する坑４−１BBL処理マウスも関節炎を又発生したが、疾患は対照IgG処理群より軽かった（重症度＝９．６±３．２、Ｐ＜０．０５；発生率＝８／１０；足厚さ＝２．７±０．２５、P＜０．０５）。アゴニスト坑４−１BB処理により疾患発生は強く抑制された。（重症度＝１．６±１．６、P＜０．０００１；発生率＝２／１０；足厚さ＝１．７±０．２、P＜０．００１）（図１参照）。

［実施例３ 組織診断と免疫染色］
免疫後、後足を１０％緩衝化ホルマリンで固定、脱灰し、パラフィンに埋め込んだ。関節断面（５−７Ｄ）を作成し常法でヘマトキシリンとエオシンで染色した。断面を光学顕微鏡で調べた。二重蛍光染色に関しては、精製CD11⁺CD8⁺T細胞をL―リシン塗布スライドガラス上で３７℃、１時間培養し、次いで１Ｄの無標識の２．４G２坑FcγRAb（ビーディファルミンゲン社（BD PharMingen）で遮断した。この細胞をFITC―坑CD３＋PE―坑CD８、FITC―坑CD３＋PE―坑CD１１ｃ又はFITC―坑CD８＋PE―坑CD１１ｃで染色した。最終洗浄後、スライドをグリセロールービニルアルコール（GVA）封入液（ザイメッド社（Zymed）、サンフランシスコ（San Francisco）、カルフォルニア（California））に封入し、共焦点レーザー顕微鏡（FV５００、オリンパス（Olympus）、東京（Tokyo）、日本（Japan））を用いて調べた。流入領域リンパ節（DLN）の免疫染色に関しては、DLN（８Ｄ）断面をリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、FITC―坑CD３＋PE―坑CD１１ｃ又はFITC―坑CD８＋PE―坑CD１１ｃで染色した。スライドを上記のように処理した。二重着色試料チャネル間の掛け合い応答を最小化するため、一度に一つの染料のみを励起する連続的スキャニング法を用いた。

組織検査によりアイソタイプ４−１BBLか坑４−１BBL処理マウスの関節が白血球によりひどく浸潤され、全てCIA特性である滑膜肥厚、パンヌス形成、軟骨破壊及び骨糜爛をもつことが示された。その一方、坑４−１BB処理マウスの関節は正常無病で、低重症度得点が示された（図２参照）。

［実施例４ サイトカイン発現］
関節リュウマチのよく知られた特性のIL―６、IL１５、TNF―α及びIL―１β含有のサイトカインが高レベルで発現するか否かを調べるために、RNA分解酵素保護アッセイ（ＰＲＡ）を用いてサイトカイン発現をマウス関節組織からRNAを単離分析した。

［ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ］
トリゾール（TRIzol）試薬（インビトローゲン社（In Vitrogen）、カールスバッド（Carlsbad）、カルフォルニア（California））を用いて免疫後４０日目に各郡のマウスの足首組織から全ＲＮＡを単離した。サイトカインとケモカインの伝令RNAレベルをメーカー説明書（リボクアント社（Riboquant）、ビーディファルミンゲン社（BD PharMingen））によりリＲＮＡ分解酵素保護アッセイにより定量した。簡単には全RNAの１５Ｄを[^３２P]ウリジン三リン酸（UTP）標識リボプローブ（ｍCK-1とｍCK-5；ビーディファルミンゲン社（BD PharMingen））で５６℃、一夜ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成後、非ハイブリッド形成一重鎖RNAをRNaseで消化した。次いで保護RNAをフェノール／クロロフォルム抽出とエタノール沈降により精製した。試料を６％ポリアクリルアミド／７M尿素ゲル上で電気泳動にかけた。ゲルを乾燥しオートラジオグラフィ分析にかけた。

［逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）］
一重鎖相補DNA（ｃDNA）をスーパースクリプトII（SuperscriptII）（ライフテクノロジー社（Life Technologies）、ゲエイテルスバーグ（Gaithersburg）、メリーランド（Maryland））を用いて１Ｄの全RNAから産生し、オリゴｄTで刺激した。次いでｃDNAをRNA分解酵素―H（ライフテクノロジー社（Life Technologies））１０単位で処理した。ポリメラーゼ連鎖反応を０．５ＤｃDNAと０．５μM各プライマーの反応混合物２０Ｄ中で実施した。以下のプライマーを用いた。

＜IL―１β＞
配列識別番号１：５’−CTGAAAGCTCTCCACCTC―３’（センスプライマー）、
配列識別番号２：５’−GGTGCTGATGTACCAGTTG―３’（アンチセンスプライマー）、
＜TNF―α＞
配列識別番号３：５’−CCACCACGTCTTTG―３’（センスプライマー）、
配列識別番号４：５’−ATGGGCTCATACCCAGGG―３’（アンチセンスプライマー）、
＜GAPDH>
配列識別番号９：５’−GAACGGGAAGCTTGTCATCAA―３’（センスプライマー）、
配列識別番号１０：５’−CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG―３’（アンチセンスプライマー）

関節組織のサイトカイン産生特性は又疾患重症度を反映した。対照IgGか坑４−１BBL処理マウスは単球走化性タンパク質１（MCP-1）、マクロファージ炎症性タンパク質２（MIP-2）、エオタキシン、MIP-１α及びRANTESを含む試験ケモカインを高レベルで有する一方、坑４−１BB処理マウスではこれらケモカインは低いか検出不能レベルであった。対照IgG処理マウスは高レベルのIL-6、IL―１５、TNF―α及びIL―１伝令RNA（ｍＲＮＡ）を示した。興味あることに坑４−１BBL処理マウスでは高レベルのIL―１５、TNF―α及びIL―１を産生したが、非常に低レベルのIL―６ｍRNAを産生した。その一方、坑４−１BB処理マウスではこれらサイトカインは低いか検出不能レベルを示した。高レベルのIL―１β、TNF―α及びIL―６発現は関節リュウマチのよくしられた特性である（図３参照）。

［実施例５ コラーゲン特異性抗体の測定］
次いで坑４−１BB処理が坑ＣＩＩ抗体産生を阻害するか否かを調べた。

抗ウシＣＩＩ ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２a、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_２、ＩｇＭ及びＩｇＥの血清中濃度を酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。簡単にはマイクロタイタープレートをウシＣＩＩ（１０Ｄ／ｍｌ、コンドレックス社（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ））で塗布、ブロックし段階希釈した試験血清で培養した。結合ＩｇＧを西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ラット抗マウスＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２a、ＩｇＧ_２ｂ、ＩｇＧ_３、ＩｇＭ又はＩｇＥ（ビーディファルミンゲン社（BD PharMingen））と基質とテトラメチルベンジジン（エンドーゲン社（Endogen）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ（Illinois））との培養で検出した。光学密度おＥＬＩＳＡプレート読み取り機（ワラック（Ｗａｌｌａｃ）、ツルク（Turku）、フィンランド（Finland））で４５０nmで測定した。

坑ＣＩＩ抗体の血清中濃度を免疫後１９日目、２８日目、３５日目及び４２日目に測定した。坑４−１BB処理により坑CIIＩｇＧ_１とＩｇＧ_２ｂ産生を完全に抑制し（P＜０．００１）、坑４−１BBL処理により坑CII抗体産生をいくらか減少した（P＜０．０５）。CIIにアイソタイプな他のIgG、IgA及びIgEは非常に低いか検出不能であった（データは示していない）。これらの結果は疾患重症度を再度反映する。

CIAモデルでのこれらの研究の結果は坑４−１BBで４−１BBの引き金を引くと、４−１BB/４−１BBL相互作用を遮断するのとは異なる活性抑制機構を誘導することが示唆する（図４参照）。

［実施例６ 坑４−１BB（３H3）による樹立CIAの回復］
CIAをDBA/1マウスに誘導し、マウスをその群の関節炎の平均得点が等しくなるように免疫後２８日目に三つの群に分け、それらを免疫後２８日目、３０日目、３２日目、３４日目及び３６日目に対照IgG、坑４−１BB又は坑４−１BBLで処理した（図５参照）。

坑４−１BBで処理した群のみ関節炎が逆戻りした。この効果は免疫後５２日目から顕著であった（P＜０．０５）。CII特異性抗体レベルの変化を又調べた。坑４−１BB処理により血清坑CII抗体が迅速且つ殆ど完全に除去された（P＜０．００１）。これらのデータは架橋した４−１BBがCIAに対し抑制機構を誘導することが再度示された（図６参照）。

［実施例７ 坑４−１BBによるCII特異性CD４⁺T細胞増殖の抑制］
坑４−１BB処理により誘導される活性抑制がCD4⁺T細胞に向けられるか否かを試験した。

CD4⁺T細胞を免疫後１４日目にCII免疫マウスの流入領域リンパ節（DLN）から単離し、CIIに対するCD4⁺T細胞のリコール応答を体外で調べた。CD4⁺T細胞をCII免疫後１２日目のIgG、坑４−１BB又は坑４−１BBLｍAb処理マウスのDLN（腋リンパ節と鼠径リンパ節）から電磁ビーズ（ミルテニーバイオテック社（Miltenyi Biotech））により精製した。精製CD4⁺T細胞（１ｘ１０^５個）を変性CII（０．５Ｄ／ｍｌ）存在下か非存在下でマイトマイシンーC（シグマ社（Sigma））処理（５０Ｄ／ｍｌ、３７℃、２０分）相乗性脾臓抗原提示細胞（APC）（２ｘ１０^５個）で共培養した。５％炭酸ガス雰囲気下で３７℃、７２時間培養後、培養物を最後の１２時間に[^３H]チミジン（１．０μCi／穴）（アメルシャムファルマシア（Amersham Pharmacia）、ビスカタウエィ（Piscawaway）、ニュージャージー（New Jersey））でパルスした。組み込み放射能をシンチレーションカウンター（ワラック社（Wallac））を用いて計測した。上記培養物のサイトカイン産生をメーカーの提案によりエンドーゲン社（Endogen）のサイトカイン特異性抗体対を用いてELISAにより評価した。

坑４−１B処理マウスのCD4⁺T細胞ではリコール応答を示さない一方、対照IgG処理マウスのCD4⁺TはCIIに応答して大規模に増殖した。CIAモデルでの坑４−１BBL処理マウスのCD4⁺T細胞は対照IgG処理群より低いリコール対応を示した（P＜０．０５）。これらのデータは坑４−１BB媒介抑制はCIAモデルのCD4⁺T細胞に向けられることを示す（図７参照）。

［実施例８ 坑４−１BB処理によるDLNでのCD11ｃ^＋CD8⁺T細胞個体群増殖の誘導］
［８．１ フローサイトメトリー］
CIAモデルでの４−１BB媒介CD4⁺T細胞抑制に関する機構を調べるために、免疫後１２日目にDLNと脾臓の白血球亜集団を分析した。坑４−１BB処理群での特定個体集団の白血球の増減を求め、対照IgG処理群と比較した。坑４−１BBL処理群により追加の対照と結果の確認を得た。

DLNと脾臓から無赤血球単細胞懸濁物を得、１Ｄの非標識坑FcγRAb（ビーディファルミンゲン社（BD Biosciences）による初期遮断段階が蛍光色素標識抗体で示された後に、リンパ球（１００Ｄ中に１ｘ１０^６個の細胞）を4℃でフローサイトメトリー分析にかけ、次いでファックスキャリバーサイトメーター（FACSCalibur）（ビーディバイオサイエンス社（BD Biosciences））により分析した。細胞内サイトカイン染色に関しては、細胞をCII（５０Ｄ／ｍｌ）又はCII＋ホルボールミリステートアセテート（PMA）（５０ng／ｍｌ；シグマ社（Sigma））とイオノマイシン（５００ng／ｍｌ；シグマ社（Sigma））で18時間刺激した。ゴルジプラグ（GolgiPlug）（ビーディファルミンゲン社（BD PharMingen））を最後の6時間に添加した。細胞を先ず表面マーカーで染色し、固定、透過処理し、メーカー説明書に従いサイトフィックス／サイトパームキット（ビーディファルミンゲン社（BD PharMingen））付きのFITC標識坑IFNγ、坑トランスフォーミング増殖因子β（TGF―β）、IL―４，坑IL―１０又はIL―１２ｍAbで培養した。

BrｄUアッセイをメーカー指示書（ＢｒｄＵフローキット、ビーディファルミンゲン社（BrｄU Flow Kit、（BD PharMingen））により実施した。簡単にはDLN細胞（２ｘ１０^５個）をCII（５０Ｄ／ｍｌ）存在下で培養した。細胞をPE標識坑CD4で染色し、固定、透過処理し、DNA分解酵素I（DＮase I）で処理し、ＦＩＴＣ坑BrｄU（ビーディファルミンゲン社（BD PharMingen））で培養した。試料を直ちにファックスキャリバーサイトメーター（ビーディバイオサイエンス社（ BD Biosciences））で分析した。

多くの組み合わせの白血球表面マーカーを蛍光細胞分析分離装置（FACS）により調べ、坑４−１処理マウスのDLNと脾臓でCD11c^＋CD8⁺細胞の飛躍的な増殖を見いだした。この個体群でのCD11ｃの発現レベルはCD11ｃ^＋DCより低かった。（この個体群の表現型はCD11ｃ^lowCD8⁺であるが、簡単のためにこれら細胞をCD11c^＋CD8+細胞と呼ぶ。）CD11c^＋CD8⁺細胞の増殖は対象IgG処理群では見られなかった。

CD11c^＋CD8⁺細胞の増殖を推進する条件を決定しようとした。上記のようにDBA/1マウスをCIIと対照IgGで免疫すると、CD11c^＋CD8⁺細胞は増殖しなかった。４−１BBノックアウト（KO）マウスをCIIと坑４−１BBで免疫すると、この細胞個体群の増殖は又なく、増殖には４−１BBが必要であることを示した。DBA/1マウスをCIIで免疫し、坑４−１BBの（Fab'）_２断片を注入すると、CD11c^＋CD8⁺個体群は増殖しなかった。増殖には無傷の坑４−１BBｍAbとの架橋により産生の４−１BB信号が必要であった。最後にDBA/1マウスを坑４−１BBとCIIなしの完全フロインドアジュバント（CFA）で免疫すると、増殖は起こらなかった。CIIと４−１BB信号が一緒に与えられた時のみにCD11c^＋CD8⁺細胞の増殖が起こった。それ故CD11c^＋CD8⁺増殖は４−１BB依存であり抗原駆動効果である（図８参照）。

［８−２ CD11c^＋CD8⁺細胞の表現型］
CD11c^＋CD8⁺細胞の表現型を決めるために、CD11c^―CD8⁺Ｔ細胞、CD11c^＋CD8⁺Ｔ細胞及びCD８α^―CD１１ｃ⁺DCでの表面マーカーの発現を比較した。CD11c^＋CD8⁺細胞はCD3⁺、T細胞受容体（TCR）Vβ^＋及びチミン（Thy）１．２^＋のようなT細胞マーカーを発現した。これらの細胞は定型的なCD11c^―CD8⁺T細胞とは異なり、CD11ｃとクラスII抗原I―A^ｑ以外に３３D1樹状細胞マーカーを発現した。これらは又CD11c^＋CD8⁺ＤＣとは異なり、CD205、B220及びCD40のようなＤＣマーカーを発現せず且つ蛍光性デキストラン粒子を消化しない。

この新規細胞個体群はCD8^＋T白血球のサブセットと結論づけた（図９参照）。

又CD11c^＋CD8⁺T細胞に関するTCR Vβ発現プロファイルを決定した。マウスをCIIで免疫してCIAを誘導し、次いでマウスを対照坑４−BBで処理した。CD11c^―CD8⁺T細胞、CD11c^＋CD8⁺T細胞及びCD4⁺T細胞をDLNから単離した。VβT TCR単クローン抗体をパネル染色し、ファックスキャリバーサイトメーター（FACSCalibur）（ビーディバイオサイエンス社（ BD Biosciences）、サンホセ（San Jose）、カルフォルニア（California）））で分析した。

その結果３０％以上の細胞がVβ８．１／８．２を示し、Vβ８．３、Vβ５．１／５．２及びVβ７はそれぞれは２８％、２２％及び１７％を示した。CD4⁺T細胞でのVβ発現スペクトルはCD11c^＋CD8⁺T細胞の発現スペクトルと同様であった（図１０参照）。

［８−３ 単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）感染によるCD11c^＋CD8⁺T細胞の産生］
細胞が外部抗原で生じる免疫原を受けた後に坑４−１BB抗体を投与したときでさえもCD11c^＋CD8⁺T細胞が誘導されるか否かを決定した。

ケタミン塩酸塩（１ｍｇ／ｋｇ、ベタミン（Vetamine）、フェニックスサイエンティフィック社（Phoenix Scientific Inc.）、セイントジョセフ（St. Joseph）、ミズーリ（Missouri））とキシラジン（０．５ｍｇ／ｋｇ、ベンヴェニュラボラトリーズ社（Ben Venue Laboratories）、ベッドフォード（Bedford）、オハイオ（Ohio））を腹腔内注入によりマウスを麻酔し、それぞれの後足蹠にリン酸緩衝食塩水（PBS）２０Ｄ中の４ｘ１０^５プラーク形成単位（PFU）の単純ヘルペスウイルス１（HSV-1）を感染した。精製坑４−１BB（３H3、２００Ｄ）又はラットIgGを0日目と2日目にHSV-1感染マウスに腹腔内注入した。単細胞懸濁液が免疫後５日目にDLNで産生した。細胞を先ず２．４G2で培養し、次いでPE標識坑マウスCD11ｃとシアン（Cy）標識坑CD-8ｍAbで染色した。染色細胞をファックスキャリバーサイトメーター（FACSCalibur）（ビーディバイオサイエンス社（ BD Biosciences）、サンホセ（San Jose）、カルフォルニア（California）））で分析した。対照IgGか坑４−１BBで処理したHSV-1感染マウスの細胞の一部を９６穴プレート（５ｘ１０^５細胞／穴）に蒔き、１Ｄ／ｍｌのｇBペプチド存在下か非存在下に3日間培養した。細胞を１０μMのBrdUで1時間標識化し、PE坑CD４又はPE坑CD８ｍAbで染色し、次いでFITCBrdUで細胞内染色した。

抗原を坑４−１BBと一緒に投与したとき、CD11c^＋CD8⁺T細胞を又HSV-1感染を含む他抗原により誘導した。坑４−１BB処理によりCD8^＋T細胞の応答はIｇG処理群に比して強化されるが、再度HSV-1に対するCD4⁺T細胞のリコール応答は再度非常に減少した（図１１参照）。

［８−４ CD11c^＋CD8⁺T細胞の増殖動力学と特性］
CIIを注入したDBA/1マウスのCD11c^＋CD8⁺T細胞増殖の経時変化を調べた。

CD11c^＋CD8⁺T細胞増殖の経時変化をCIIと坑４−１BBを注入したDBA/1マウスで測定した。増殖は免疫後5日目に始まり、12日目でピークに達した。細胞は再度18日目で検出不能であった。坑４−１BBを再度免疫後24日目に再投与すると、増殖が4日遅れで再開した。標準CD11c^＋CD8⁺T細胞のパーセントが又増加した（図１２参照）。

CD11c^＋CD8⁺T細胞は坑CD-3と坑CD8で染色するか、坑CD-3と坑CD11ｃで染色するか、坑CD8とCD11ｃで染色して共焦点顕微鏡法により観察した。マーカーCD3、マーカーCD8及びマーカーCD11ｃ^―全ての三つが細胞表面で検出され混合できた。CD11ｃの発現レベルはCD3とCD8の発現レベルより遙かに低い（図３ｂ１）。ヨウ化プロピジウム染色とFACS分析によりCD11c^＋CD8⁺T細胞のDNA含有量は２Nであることが示された（図３ｂ２）。多量のCD11c^＋CD8⁺T細胞がリンパ節断面に見いだされた。そのピークではこれら細胞が全DLN細胞の約２２％に相当した。

CD11c^＋CD8⁺T細胞をCIIで刺激後の培養物上澄み液を用いて、細胞内染色及びELISAによりCD11c^＋CD8⁺T細胞のサイトカイン産生を測定した（図１５参照）。

［８−５ CD11c^＋CD8⁺T細胞の養子移入によるCIA処理］
CD11c^＋CD8⁺T細胞の養子移入がCII特異性CD4⁺T細胞を抑制するか否かを測定した。CD11c^＋CD8⁺T細胞及びCD11c^―CD8⁺T細胞をCII免疫坑４−１BB処理マウスの全DLNで産生し、CD11c^―CD8⁺T細胞をCII免疫対照IgG処理マウスから又精製した。細胞を同じ日にCII免疫を受けた新規DBA/1マウス群に養子移入した。7日後全DLNのCD4⁺T細胞を各群のマウスから産生し、CII（５０Ｄ／ｍｌ）存在下か非存在下で72時間γ線照射抗原提示細胞（APC）で培養した。脾臓を小断片に切断し、コラゲナーゼII型（１ｍｇ／ｍｌ；シグマ社（Sigma））とDNase I（１５Ｄ／ｍｌ；ローチェ社（Roche））存在下に、３７℃で４０分間培養した。流入領域リンパ節をコラゲナーゼ１ｍｇ／ｍｌと５ｍMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）存在下に37℃で5分間培養した。単細胞懸濁物を産生しCD11c^＋CD8⁺T細胞をマックス分離カラム（ミルテニイバイオテック社（Miltenyi Biotec））で分離した。CD11c^＋CD8⁺T細胞はCD4細胞、F4/80細胞、CD40細胞及びB220細胞にネガティブであるが、在来のCD11ｃ^＋DCはそうでないため（データは示していない）ので、CD11c^＋CD8⁺T細胞の精製をこれら分子に対する抗体含有反応混液の培養によるCD4^＋、F4/80、CD４０^＋及びB220^＋細胞個体群を免疫磁気除去することができた。特定の実験ではCD49ｂに特異なDX5が反応混液に含まれた。ネガティブ選択細胞（ＤＣネガティブ）を坑マウスCD11ｃ（N418）ミクロビーズで更に培養し、CD11c^＋CD8⁺細胞とCD11ｃ^―細胞に分けた。上記ステップでのネガティブ細胞分画(CD11c-)を坑マウスCD8（Lｙ−２）ミクロビーズで培養し、CD11c^―CD8⁺細胞分離をマックス（MACS）カラムで達成した。選択細胞個体群の純度は８７％乃至９０％の範囲であった。養子移入に関しては５ｘ１０^６個の精製細胞をDBA/1マウスに静脈内移入した。

その結果CD11c^＋CD8⁺T細胞を受けたマウスのCD4⁺T細胞はCIIに対し増殖リコール応答を示さないが、CD11c^―CD8⁺T細胞を受けたCD4⁺T細胞はCIIに対して正常リコール応答を示した（図１６参照）。

次いでCD11c^＋CD8⁺T細胞の養子移入がCIA発生を抑制するか否かを調べた。坑４−１BB処理マウスからのCD11c^＋CD8⁺T細胞又は坑４−１BB処理マウスか対照IgG処理マウスからのCD11c^―CD8⁺T細胞を産生し、免疫後０日目、10日目、25日目及び３５日目にCII免疫DBA/1マウスに養子移入した。CD11c^＋CD8⁺T細胞の養子移入によりCIAの発生が回復した（図１７参照）。

［実施例９ 坑インターフェロンγ（IFN―γ）によるIDO）とiNOSの坑４−１BB媒介誘導とCD4⁺T細胞抑制の逆転］

CD11c^＋CD8⁺T細胞がIFN―γを産生するので、IDOのようなIFN―γ誘導可能エフェクター分子や誘導可能一酸化窒素合成酵素（iNOS）がDLN細胞で産生するか否かを調べた。ＩＤＯ（インドールアミンー２，３−ジオキシゲナーゼ）発現細胞は妊娠期に母親T細胞により生ずる免疫反応を制御する。

具体的にはCII+対照IgGとCII＋坑４−１BBをマウスに処理し、14日後CD8^＋T細胞、CD11⁺ｂ単球及びCD11⁺DCを対照IgG処理マウスから単離した。CD11c^―CD8⁺T細胞、CD11c^＋CD8⁺T細胞、CD11ｂ^＋単球及びCD11⁺DCをCDIIと坑４−１BBで処理したマウスから単離した。RNAを精製細胞から単離し、RT-PRCをIDO、iNOS及びグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（GAPDH）特異性プライマーを用いて実施した。以下のプライマーを使用した。

＜IDO＞
配列識別番号５：５’−CACTGTACCAGTGCAGTAG―３’（センスプライマー）、
配列識別番号６：５’―ACCATTCACACACTCGTTAT―３’（アンチセンスプライマー）、
＜iNOS＞
配列識別番号７：５’―AAGTCAAATCCTACCAAAGTGA―３’（センスプライマー）、
配列識別番号８：５’―CCATAATATGGTTGATGAACT―３’（アンチセンスプライマー）、
＜GAPDH＞
配列識別番号９：５’―GAACGGGAAGCTTGTCATCAA―３’（センスプライマー）、
配列識別番号１０：５’―CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG―３’（アンチセンスプライマー）。

処理マウスの脾臓を小片に切断し、コラゲナーゼＩＩ型（１ｍｇ１／ｍｌ；シグマ社（Sigma））とDNaseＩ（１５Ｄ／ｍｌ；ローチェバイオケミカル社（Roche Biochemicals）マンハイム(Mannheimｍ)、ドイツ(Germany)）存在下で３７℃で、40分間培養した。洗浄後マクロファージ細胞を坑CD１１ｂ磁性ビーズを用い、次いで、マックス（MACS）カラム（ミルトニイーバイオテック社（Miltenyi Biotec）、オーバーン（Auburn）、カリフォルニア（California））による分離で精製した。ＤＣ単離では細胞を坑CD90ミクロビーズで培養しマックス（MACS）カラムで更に選別した。ネガティブ選択細胞個体群（CD11c^＋CD8^―）を更に坑CD11ｃミクロビーズで培養し、CD11⁺DCを析出した。単離ミクロファージとDCの純度は87乃至９０％であった。

その結果対照IgG処理マウスでは全くIDOとiNOS伝令RNAを産生せず、iNOSはIDOとは異なるCD11c^＋CD8⁺T細胞中で発現した。IgG処理の対照マウスのCD11c^＋DCは低レベルのIDOとiNOSを発現する。しかしIDOとiNOS伝令RNAはCD11⁺単球と同様に坑４−１BB抗体で処理したCD11ｃ⁺DC中で強く誘導された（図１８参照）。

実施例１０ IFN―γによるIDOとiNOSの坑４−１BB媒介誘導とCD4⁺T細胞抑制の逆転

IDOとiNOSの誘導がIFN―γにより仲介されるか否かを決定するため、CII免疫か非免疫のマウスをIFN―γでIgGか坑４−１BBと共に処理した。各郡のマウスのリンパ節からマクロファージとDCを産生し、IDOとiNOS伝令RNA（ｍRNA）発現を測定した。

具体的にはDBA/1マウスをCIIで免疫してCIAに誘導し、次いで対照IgG又は坑４−１BBで坑ＩＦＮ―γと共にそのマウスを処理した。CD11ｂ^＋単球を免疫後１４日目にDLN細胞から収集し、IDO、iNOS及びGAPDHのＲＴ−ＰＣＲを、対照IgG、対照ＩｇＧと坑INF-γ坑４−１ＢＢの両者、坑４−１BBと坑INF-γの両者処理のCD11ｂ＋細胞及びポジティブ対照群として坑INF-γ処理の２６４個の生細胞から単離した各RNAを用いて実施した。

その結果坑INF-γAbは坑４−１BB仲介IDOとiNOSを中和することが示され、坑INF-γAb中和によりCD11b^＋単球でのIDOとiNOS発現を阻害することを示した（図１９参照）。

坑４−１BB処理マウスのCIIに対するCD4⁺T細胞応答の抑制にインターフェロンγ（INF-γ）が関与するかを明確にするために、DBA/1マウスをCIIで免疫してCIAを誘導し、次いでそのマウスを対照IgGか坑４−１BBで坑INF-γと共に処理した。全DLN細胞を免疫後14日目に収集し、生体外でCIIで刺激した。

CII特異性CD４⁺T細胞増殖をBrdU取り込みにより測定した。坑４−１BB処理マウスのCD４⁺T細胞はCIIに応えては増殖しなかった。この抑制は坑INF-γに坑４−１BBを投与すると逆行した（図２０参照）。

これらのデータは坑４−１BB作用の関節炎緩和効果が主としてINF-γ誘導により仲介されることを示唆する。INF-γが抗原との組み合わせで坑４−１BBにより増殖したCD11c^＋CD8⁺T細胞により産生するように思われる。

坑ＩＮＦ-γがＣＩＡの４−１ＢＢ仲介抑制を逆転するか否かを決定するため、３郡のＤＢＡ／１マウスをＣＩＩで免疫し、対照IgG、坑４−１ＢＢ又は坑４−１ＢＢ＋坑ＩＦＮ―γで処理した。その結果は坑ＩＮＦ-γＣＩＡの４−１ＢＢ仲介による回復を中和することを示した。

［実施例１１ １−メチルトリプトファン（１−MT）によるCIAの４−１BB仲介抑制の完全な逆転］
坑４−１BB投与はIDOを誘導し、IDOはINF-γの分子エフェクターであり得るので、CD4⁺T細胞とCIAの４−１BB仲介抑制にIDOが関与するか否かを調べた。

各マウスに免疫後0日目、2日目、4日目、6日目及び8日目に精製坑４−１BB（３H3、ラットIgG）、坑４−１BBL（TKS-1、ラットIgG₁）又は対照ラットIgGの２００Ｄを腹腔内注入した。坑４−１BBでのINF-γ血清中濃度を測定して体内での抗体の用量反応と坑４−１BBLに対するリコール応答の抑制を試験した。抗体をマウス当たり１５０乃至２００Ｄの用量を投与する時に最大効果が見られた。樹立CIAを処理するために、マウスに免疫後２８日目、３０日目、３２日目、３４日目及び３６日目に注入した。INF-γを遮断するため、免疫後０日目、4日目、８日目及び１２日目の4日ごとに精製R4-6A2の５００Ｄを腹腔内注入した。ラットIgGが再度対照として働く。

IDO活性を阻害するため、１−MT（１０ｍｇ／日の放徐速度）含浸の徐放ポリマーペレットかプラセボペレット（イノベイティブリサーチオブアメリカ（Innovative Research of America）、サラソタ（Sarasota）、フロリダ（Florida））を免疫一日前に背皮膚に移植した。いくつかの実験では、それぞれが２１０ｍｇの１―MT含有ペレット2個を各マウスに移植し、21日の期間中２０ｍｇ／日の用量を与えた。大きさの小さいマウスに比してこれらペレットの大きさが大きいために、マウス当たり各ペレットが１２０ｍｇの１−MT含有小ペレット2個（１０ｍｇ／日の放徐速度）を12日間２０ｍｇ／日の用量を移植する追加実験を行った。13日目に更に2個のペレットを移植し、全投与期間は２４日であった。

その結果１−ＭＴ２０ｍｇ／日の用量により坑４−１ＢＢのＣＩＡ対する抑制効果は完全に逆転した。逆転は用量依存であり、マウスの５ｍｇ／日処理では不完全であった。１−ＭＴによる３Ｈ３効果の逆転は遅れた。１−ＭＴ処理マウスでは免疫後48日目までは疾患は明らかにならない一方、対照マウスでは免疫後30日目に先ず病気の兆候を示した（図２２参照）。

これらの実験で１−ＭＴにより坑４−１ＢＢ抑制効果の逆転が対照マウスと同時にこれらマウスでのＣＩＡ出現をもたらす。

［実施例１２ 毒性試験］
坑４−１ＢＢ抗体の細胞傷害性を調べるために、以下の実験を行った。

［方法］
平均体重１０８．３−１２６．０の特定病原体除去（ＳＰＦ）スプラーグドーリーラット（バイオジェノミックス社（Biogenomics））に対する急性毒性を坑４−１ＢＢ抗体を用いて行った。5匹のラットからなる各群に坑４−１ＢＢ抗体８０００ｍｇ／ｋｇを経口投与し、14日間観察した。この試験を韓国食品衛生局（Korea Food and Drug Administration）公布の医薬品安全評価の試験ガイドライン（告示番号１９９９−６１）、韓国食品衛生局（Korea Food and Drug Administration）公布の非臨床ラボ研究に関する医薬品安全性試験実施基準規制（Good Laboratory Practice Regulations for Non-clinical Laboratory Studies）（告示番号２００４−６３）及び医薬品安全性試験実施基準（Good Laboratory Practice）に関するＯＥＣＤ原則に従って実施した。

［結果］
４−１ＢＢ抗体を８０００ｍｇ／ｋｇ使用することで、いずれの群でもいずれの性別でも死亡率、臨床的兆候、体重変化及び全体的所見に対する処理関連の影響はなかった。これらの結果は本発明の調合化合物は効能があり且つ安全であることを示唆した。

以後賦形剤の調合法と種類を記載するが、本発明はそれらに限定はされない。代表的製剤例を以下に記載する。

［注入調合液］
坑４−１ＢＢ抗体 １００ｍｇ
メタ重亜硫酸ナトリウム ３．０ｍｇ
メチルパラベン ０．８ｍｇ
プロピルパラベン ０．１ｍｇ
最適量の注入用蒸留水

注入調合液は活性成分を溶解し、ｐＨを約７．５に制御し、次いで全成分を２Ｄアンプルに充填し、在来の注入液調合法で減菌して調合した。

［粉末製剤］
坑４−１ＢＢ抗体 ５００ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
タルク １０ｍｇ

粉末製剤は上記成分を混合し、封入袋に充満して製剤した。
［錠剤製剤］
坑４−１ＢＢ抗体 ２００ｍｇ
トウモロコシ澱粉 １００ｍｇ
ラクトース １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量
錠剤製剤は上記成分を混合し、錠剤化して製剤した。

［カプセル剤調合］
坑４−１ＢＢ抗体 １００ｍｇ
ラクトース ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉 ５０ｍｇ
タルク ２ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム 適量

錠剤製剤は上記成分を混合し、在来ゼラチン製剤法でゼラチンカプセルを充満して調合した。

［液体製剤］
坑４−１ＢＢ抗体 １０００ｍｇ
糖 ２０ｇ
多糖 ２０ｇ
レモン香料 ２０ｇ

液体製剤は活性成分を溶解し、次いで全成分を１０００Ｄのアンプルに充満し、在来液体製剤法で減菌して調合した。

このように該発明を説明したが、同じことが種々な形に変形できることは明白である。そのような変形は本発明の精神と範囲を逸脱するとは考えず、技術の熟知者には明白なその修正の全ては以下の特許請求の範囲内であることを意図する。

本発明で記載のごとく、本発明の発明坑４−１ＢＢ抗体含有成分は一般的免疫反応で毒性が無く、抗原特異性免疫反応で誘導される進行炎症性か自己免疫性関節炎症状を顕著に緩和できる。従って関節疾患の予防や治療に拒絶反応なしに有効である。

配列のリスト

配列識別番号１の５’−CTGAAAGCTCTCCACCTC―３’はＰＲ−ＰＣＴでのＩＬ−１βのセンスプライマーであり、配列識別番号２の５’−GGTGCTGATGTACCAGTTG―３’はＰＲ−ＰＣＴでのＩＬ−１βのアンチセンスプライマーである。

配列識別番号３の５’−CCACCACGTCTTTG―３’はＰＲ−ＰＣＴでのＴＮＦ―αのセンスプライマーであり、配列識別番号４の５’−ATGGGCTCATACCCAGGG―３’はＰＲ−ＰＣＴでのＴＮＦ―αのアンチセンスプライマーである

配列識別番５の５’−CACTGTACCAGTGCAGTAG―３’はＰＲ−ＰＣＴでのIDOのセンスプライマーであり、配列識別番号６の５’―ACCATTCACACACTCGTTAT―３’はＰＲ−ＰＣＴでのIDOのアンチセンスプライマーである。

配列識別番号７の５’―AAGTCAAATCCTACCAAAGTGA―３’はＰＲ−ＰＣＴでのiNOSのセンスプライマーであり、配列識別番号８の５’―CCATAATATGGTTGATGAACT―３’はＰＲ−ＰＣＴでのiNOSのアンチセンスプライマーである。

配列識別番号９の５’―GAACGGGAAGCTTGTCATCAA―３’はＲＴ−ＰＣＲでのGAPDHのセンスプライマーであり、配列識別番号１０の５’―CTAAGCAGTTGGTGGTGCAG―３’はＲＴ−ＰＣＲでのGAPDHのアンチセンスプライマーである。

図１は免疫原曝露後の各試験群、即ち対照IgG、坑４−１BBL及び坑４−１BBでの臨床成績（a）と足厚み（ｂ）を示す。

図２はCIA誘導マウスに対照IgG（a）、坑４−１BBL（b）及び坑４−１BB（c）を注入後の足関節の病理組織診断を示す。

図３はRPA（RNA分解酵素保護アッセイ）による足関節での各郡、即ち対照IgG、坑４−１BBL及び坑４−１BBに対するサイトカイン発現を示す。

図４は坑CII抗体の産生と、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した各郡、即ち対照IgG、坑４−１BBL及び坑４−１BBに対する坑CII IgG₁処理（a）と坑CII IgG_２ｂ処理（ｂ）での血清中濃度を示す。

図５は各試験群、即ち対照IgG、坑４−１BBL及び坑４−１BBに対するCIA（コラーゲン誘導関節炎）の臨床成績を示す。

図６はＥＬＩＳＡで測定した各試験郡、即ち対照IgG、坑４−１BBL及び坑４−１BBでの坑CII IgG₁（a）と坑CII IgG_２ｂ（ｂ）レベルを示す。

図７は[^３H]マーカーで測定した各試験群、即ち対照IgG、坑４−１BBL及び坑４−１BBでのCII特異性CD４⁺T細胞を示す。

図８はFACS（蛍光標示式細胞分取器）で観察したCII+坑４−１BB（a）、CII+対照IgG（ｂ）及び欠損マウスのCII＋坑４−１BB（ｃ）、CII坑４−１BBのＦ（ａｂ’）_２断片（ｄ）及びCII＋坑４−１BB（ｃ）で処理後のフロインド完全アジュバント（CFA）＋坑４−BB（e）処理のCIA誘導マウスの写真を示す。

図９はFACSで観察したCD１１ｃ^―CD８^＋T細胞（a）、CD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞（ｂ）及びCD８a^―CD１１ｃ^＋DC細胞（ｃ）の細胞表面マーカー発現を示す。

図１０は誘導CD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞のTCR Vβ発現スペクトルを示す。

図１１は単純ヘルペスウイルス１（HSV―１）処理後に坑４−１BB抗体を注入したときの各試験群、即ち対照IgG、坑４−１BBL及び坑４−１BBでのCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞誘導を示す。

図１２はCII抗原と坑４−１BB抗体をDBA/１マウスに注入後、各試験群、即ち対照IgG、坑４−１BBL及び坑４−１BBの各時点でのCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞（a）及びCD１１ｃ^―CD８^＋T細胞（ｂ）の増加を示す。

図１３は共焦点顕微鏡法で観察した誘導CD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞のタイプ（（a）緑：坑CD-３、赤：CD11ｃ）（（a）大型樹状細胞、（ｂ）中型樹状細胞、（ｃ）樹状形態を示さない小型細胞、（ｄ）非樹状形態）を示す。

図１４はCII+対照IgG（a）とCII+坑４−１BB（ｂ）処理後のヨウ化プロピジウムで染色したリンパ節断面を示す。

図１５は各試験群、即ち対照IgGと坑４―１BBでの細胞間染色観察（a）とELISA観察の培養物上澄み（ｂ）を含む坑４―１BB処理による誘導CD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞のIFN―γ産生を示す。

図１６は各試験群でのCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞とCD１１ｃ^―CD８^＋T細胞の新規DBA/１マウスへの移植、即ち移植なし、CD１１ｃ^―CD８^＋T/対照IgG、CD１１ｃ^―CD８^＋T/坑IgG、CD１１ｃ^＋CD８^＋T/坑IgGに対する[^３H]マーカーで測定したCII特異性CD４⁺T細胞抑制反応を示す。

図１７はCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞とCD１１ｃ^―CD８^＋T細胞の各試験群での新規DBA/１マウスへの移植、即ち移植なし、CD１１ｃ^―CD８^＋T/対照IgG、CD１１ｃ^―CD８^＋T/坑４−１BB、CD１１ｃ^＋CD８^＋T/坑４−１BB移植後の臨床成績を示す。

図１８は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（RT―PCR）と電気泳動を用いて、坑４−１BB処理とIDO、誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）及びグリセルアルデヒド三リン酸脱水素酵素（GAPDH）間の相関関係を示す。

（レーン１：対照IgGによるCD１１ｃ^―CD８^＋T細胞処理、レーン２：坑４−１BBによるCD１１ｃ^―CD８^＋T細胞処理、レーン３：坑４−１BBによるCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞処理、レーン４：対照IgGによるCD１１ｂ^＋T細胞処理、レーン５：坑４−１BBによるCD１１ｂ^＋T細胞処理、レーン６：対照IgGによるCD11ｃ^highT細胞処理、レーン７：坑４−１BBによるCD11ｃ^highT細胞処理。）

図１９はＲＴ−PCRと電気泳動を用いてIDOとiNOS誘導に対するIFN―γの効果を示す。

（レーン１：対照IgGによるCD１１ｂ^＋T細胞処理、レーン２：対照IgGと坑IFN―γによるCD１１ｂ^＋T細胞処理、レーン３：坑４−１BBによるCD１１ｂ^＋T細胞処理、レーン４：坑４−１BBと坑IFN―γによるCD１１ｂ^＋T細胞処理、レーン５：正の対照としてのIFN―γ処理。）

図２０はブロモデオキシウリジン（BrdU）取り込みにより測定した各試験群、即ち対照IgG、対照IgG/坑IFN―γ、坑４−１BB、坑４−１BB/坑IFN―γでの坑IFN―γ処理とCII特異性CD４⁺T細胞増殖間の相関関係を示す。

図２１は対照IgG、坑４−１BB、坑４−１BBと坑IFN―γによるCIA誘導マウス処理後の治療成績を示す。

図２２は（a）各試験群、即ち対照IgG、坑４−１BB/１−メチルD,L―トリプトファン（１−MT）、坑４−１BB/１−MT及び坑４−１BB/プラセボでの１−MT用量依存性に関する平均臨床成績と（ｂ）各試験群、即ち対照IgG/１−MT、坑４−１BB/１−MT及び坑４−１BB/プラセボでの坑４−１BB処理依存性に関する平均臨床成績を含む４−１BBによる１−メチルーＤ，Ｌ―トリプトファン（１−MT）のCIA阻害効果を示す。

Claims (4)

1. 薬容認担体と共に活性成分としてCD１１ｃ^＋CD８^＋T細胞を増殖しCD４^＋細胞の抑制を誘導して、関節リュウマチ疾患の予防治療に有効な量の坑４−１BB抗体含有薬組成。
2. 該組成が組成全体重量で約０．０１乃至５０重量／重量％を含有する請求項１による薬組成。
3. 該関節リュウマチ疾患がコラーゲン誘導関節炎である請求項１による薬組成。
4. ヒトを含む哺乳類で関節リュウマチ治療予防に必要な治療薬製剤での坑４−１ＢＢ抗体の使用。

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