JP2002531376A

JP2002531376A - ヒトレセプタータンパク質４−１ｂｂの使用方法

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Publication number: JP2002531376A
Application number: JP2000539866A
Authority: JP
Inventors: エス．クワン，ビヤング
Original assignee: アドバンストリサーチアンドテクノロジーインスティテュート，インコーポレイティド
Priority date: 1998-01-14
Filing date: 1999-01-14
Publication date: 2002-09-24
Also published as: US6569997B1; AU764257B2; US6303121B1; AU2320499A; CA2318525A1; EP1045701A1; US20060029595A1; WO1999036093A1; US6905685B2; JP4814758B2; US20040091476A1; JP2007084562A

Abstract

(57)【要約】 H4-1BBタンパク質、このタンパク質に対するリガンド、およびH4-1BBおよび療法上使用することができる他の分子に対して向けられた種々のmAb が開示される。H4-1BB分子の特質および重要性は、リガンドおよび関係する共刺激分子、T 細胞の活性化および増殖を増強または抑制する能力を提供する。レセプタータンパク質H4-1BBを発現したT 細胞を本明細書に開示する4 つの抗4-1BB モノクローナル抗体の1 つで処理することによって、免疫応答の活性化または阻害が見られる。また、ヒトレセプターH4-1BBのcDNAが開示される。ヒトレセプターH4-1BBのcDNAはマウスcDNA 4-1BBに対して約65％相同性であり、そしてネズミcDNA 4-1BBから誘導されたプローブにより単離された。ヒトレセプタータンパク質H4-1BBに対する細胞膜リガンドを検出するための融合タンパク質が開発された。それはレセプタータンパク質H4-1BBの一部分と、レセプタータンパク質H4-1BBの一部分に結合した、検出タンパク質、アルカリ性ホスファターゼとからなる。レセプタータンパク質H4-1BBに対するリガンドを発現したB 細胞を、レセプタータンパク質H4-1BBを発現した細胞で処理することができ、そしてB 細胞の増殖を誘導することができる。H4-1BBリガンドの結合をブロックするためのH4-1BBの使用は、器官の移の間の免疫系の抑制において、あるいは糖尿病、慢性関節リウマチ、および狼瘡を包含する自己免疫疾患に対する、実際的用途を有する。この技術の他の用途は、HIV-1 感染個体および癌腫を治療する方法の開発を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、ヒトH4-1BBタンパク質、そのリガンドの療法的および科学的使用、
並びにH4-1BBレセプタータンパク質を認識し、それに結合するモノクローナル抗
体の開発に関する。

【０００２】発明の背景ヒトおよび他の種の免疫系は、食細胞（phagocyte)、T リンパ球およびB 細胞
を包含する、白血球が骨髄中で作られることを必要とする。食細胞は、不必要な
物質、例えば、系からのウイルスタンパク質または細菌細胞壁を掃去するマクロ
ファージ細胞を包含する。リンパ球は、ヘルパーT 細胞(Th)、キラーT 細胞およ
びB 細胞、ならびに細胞の他の型、例えば、サプレッサーT 細胞としてカテゴリ
ー化される細胞を包含する。これらの細胞は抗体を産生する。キラーT 細胞はタ
ーゲット細胞を物理的に破壊し、そしてヘルパーT 細胞は全体のプロセスを促進
する。免疫系およびその機能の複雑さは、少なくとも一部分、リンホカインによ
り促進される。

【０００３】リンホカインは、免疫細胞が互いに連絡する、シグナル伝達タンパク質である
。科学者は、免疫学的疾患に対する療法的使用ために十分な量でリンホカインを
製造することができた。多数の既知のリンホカインタンパク質が存在し、そして
それらはインターフェロン、インターロイキン-1、2 、3 、4 、5 、6 、7 、コ
ロニー刺激因子、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、およびエリトロポイエチン並
びにその他を包含する。

【０００４】インターロイキン-1(IL-1)は、マクロファージから分泌され、ヘルパーT 細胞
を活性化し、体温を上昇させ、熱を引き起こし、これにより免疫細胞の活性を増
強させる。活性化されたヘルパーT 細胞はインターロイキン-2(IL-2)を産生し、
これは引き続いてヘルパーおよびキラーT 細胞を成長させ、分裂させる。ヘルパ
ーT 細胞はまた、他のリンホカイン、B 細胞成長因子(BCGF)( これはB 細胞を増
殖させる）を産生する。B 細胞の数が増加するにつれて、ヘルパーT 細胞はB 細
胞分化因子(BCDF)として知られている他のリンホカインを産生し、これはB 細胞
のいくつかの複製を停止させ、そしてそれらが抗体を産生するようにさせる。

【０００５】また、T 細胞はガンマインターフェロン(IF)を産生し、これは多数の作用を有
することにおいて、リンホカイン2 に類似する。ガンマインターフェロンはキラ
ーT 細胞の活性化を促進し、キラーT 細胞が、侵入する生物を攻撃できるように
する。BCGFと同様に、ガンマインターフェロンは、B 細胞が抗体を産生する能力
を増加させる。また、IFはマクロファージを感染部位に保持し、マクロファージ
が取り込んだ細胞の消化を促進する。マクロファージとT 細胞との間のリンホカ
インのシグナルの各種類をもつによる推進力を集めて、リンホカインは免疫系の
応答を増幅し、こうしてウイルスタンパク質、感染した細胞、または他の外来物
質は圧倒され、系から除去される。多数のリンホカインが存在し、100 またはそ
れ多いリンホカインが存在することがあり、これらは免疫プロセスである複雑な
ウェブに参加する。多数のリンホカインおよびそれらの正確な作用は未知のまま
である。

【０００６】ある種のリンホカインがターゲット細胞上のその特異的レセプターに結合する
とき、リンホカインの活性は産生される。科学者の間で、リンホカインの産生お
よびそれらのレセプターの産生のためにクローニングされた細胞系統が広く使用
されている。リンホカインおよびリンホカインレセプターmRNAの単離は普通の技
術となった。本発明者が前に発表(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 、84:2896-2900、 M
ay 1987 、 Immunology)した技術を使用して、マウスレセプタータンパク質、4-
1BB が単離され、T 細胞遺伝子の特異的発現に基づいて同定された。科学者は、
この刊行物において報告されたプロトコルを使用して事実上すべてのリンホカイ
ンを検出することができる。この方法は、発現された事実上すべてのmRNAを分別
的に検出するように設計されている。

【０００７】重要なことには、免疫細胞のmRNA配列は一般的にT 細胞に関係し、そして特異
的にキラーT 細胞に関係するので、それらは分別的に発現される。発現レベルは
低くかつリンホカインおよびそのレセプタータンパク質の量は少ないが、この発
現されたmRNAを検出し、単離することができる。上の刊行物に記載した分析は生
物学的に重要な分子、例えば、リンホカインおよびそれらのレセプターを明らか
にすることができるので、生物学的に重要なまたは活性な分子を非常に稀なメッ
セージ分子( すなわち、IF、インターロイキン、地図キナーゼキナーゼ、および
その他) により誘導された細胞のシグナルにより開始されるという多数の指示が
存在すると、本発明者は考える。

【０００８】大部分のT 細胞因子はアッセイにおいて生物学的活性を認識することによって
、その後タンパク質の情報を精製することによって、古典的に同定されてきてい
る。別のアプローチは特異的発現に基づく推定上のT 細胞遺伝子を単離し、それ
らを適当な発現ベクターの中に挿入し、次いで未知の単離されたタンパク質の機
能を証明することである。前述の変更された分別的スクリーニング手順を使用し
て、本発明者は1 系列のT 細胞サブセット特異的cDNAを、クローニングされたヘ
ルパーT(HTL)L2細胞およびクローニングされた細胞溶解性T リンパ球(CTL)L3 か
らクローニングした。

【０００９】 T 細胞は長期間の後天性免疫性において決定的に重要であり、ウイルス、細菌
および寄生体の感染に対する保護を提供する。T 細胞はそれら自身のT 細胞レセ
プター(TCR) 複合体および他の1 または2 以上の共刺激分子、例えば、CD-28 ま
たはCD-3を介して自己MHC(主要な組織適合性複合体）に関して侵入性病原体から
のペプチドに直面するとき、T 細胞は活性化される。他の1 または2 以上の共刺
激分子のエンゲージメントなしに、T 細胞はアネルギーとされる(Vassali et al
. 、 PNAS 、1979) 。今日まで、最もよく特性決定された共刺激分子はCD-28 で
あった。しかしながら、より最近において、他の細胞表面の分子、例えば、分子
4-1BB はある共刺激的役割を演ずることが示唆された。

【００１０】 4-1BB タンパク質はマウスにおいて活性化されたT 細胞上で発現される55kDa
のホモダイマー分子であり、そして神経成長因子レセプター(NGFR)/ 腫瘍壊死因
子レセプター(TNFR)遺伝子のスーパーファミリーのメンバーである(Haskins et
al. 、 J.Exp.Med. 、1983) 。このファミリーは細胞外ドメインにおけるシステ
インに富んだモチーフにより特徴づけられる。このファミリーの他のメンバーは
、NGFR、B 細胞活性化分子CD40、ラットにおけるT 細胞活性化分子OX-40 、およ
びCD27、TNFR-1およびTNFR-2と呼ぶTNF の2 つのレセプター、アポトーシス誘導
タンパク質Fas 、および細胞の成長および形質転換においてある役割を演ずるCD
-30 を包含する。

【００１１】これらのメンバーのいくつかは、HIV-1 感染において重要な役割、例えば、CD
4+T 細胞の増殖、アポトーシスおよびウイルスの複製を演ずることが示された。
CD30の高い血清レベルの存在はAIDSへの進行の予言因子となったが、循環するCD
30はHIV-1 血清反応陽性個体において見出されなかった。HIV-1 の発現はHIV-1
血清反応陽性個体のCD30をトリガー（triger) することによって誘導された。HI
V-1 の発現は、NF- κB 依存性経路を通してHIV-1 感染CD4+T 細胞のCD30をトリ
ガーすることによって誘導された。

【００１２】 Fas の産生はT リンパ球の顕著なアポトーシスをトリガーまたは誘導すること
が見出され、これはHIV-1 感染によるCD4+T 細胞の消耗に寄与することがある。
in vitro刺激後のCD40リガンドを発現するCD4+T 細胞の能力はHIV-1 感染のため
に損傷されないが、CD40/CD40 リガンドの相互作用はin vitroにおけるB 細胞の
HIV-1 複製を調節する。CD27のシグナリングは、HIV-1 感染個体においてT 細胞
の増殖的応答を正常な程度に増強した。

【００１３】本発明の開発に導いた実験において、1 系列のT 細胞表面特異的cDNAは、変更
された分別的スクリーニング手順を使用することによって、クローニングされた
ネズミT 細胞から単離された。cDNA種のいくつかのヌクレオチド配列および発現
特性が報告された。マウスのレセプタータンパク質4-1BB をコードする、従来特
性決定されてきていない遺伝子の1 つは、さらに研究された。これらの研究は4-
1BB に対するヒト相同体、H4-1BBの単離に導き、そしてH4-1BBレセプタータンパ
ク質に結合し、これによりH4-1BBのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用
することができる、1 系列のモノクローナル抗体に導いた。

【００１４】 T 細胞は、炎症の部位へのホーミング（homing) の間の内皮貫通移動後に、イ
ンテグリン（integrin) ファミリーのメンバーを通して細胞外マトリックス(ECM
) の成分と相互作用する。インテグリンは細胞表面のレセプターの1 ファミリー
中の非常に後期の抗原(VLA) であり、ECM タンパク質ならびに他の細胞への細胞
の接着を仲介する。ヘテロダイマーのインテグリンは、種々のアルファおよびベ
ータサブユニットから構成され、細胞外シグナルの伝達メカニズムとして作用す
る。インテグリン機能の調節は、細胞の活性化後の急速な接着のためのT 細胞お
よび他の白血球により利用される。

【００１５】これまでにT 細胞の分化に影響を与えることが知られている主要な因子は、リ
ンホカイン（また、サイトカインと呼ばれる）、例えば、IL-2およびIL-4である
。トランスジェニックマウスを使用するin vitroおよびin vivo の研究において
、IL-2は効率よいIF産生のためにT 細胞のTh1 サブセットをプライミングするこ
とによって、それらの発生を誘導し、IL-4産生細胞の発育を防止することが証明
された。しかしながら、従来、それらの相互作用が免疫応答の増幅およびT 細胞
のTh1 およびTh2 サブセットの発生を指令するように働く方法は未知のままであ
った。

【００１６】特定の免疫応答は、外来抗原に対する抗体の認識により支配される。抗体は1
ファミリーの構造的に関係する糖タンパク質を形成し、一般に、それらを産生す
る生物に、細胞媒介性免疫性の保護的作用を付与する。抗体はB リンパ球により
産生され、そして細胞膜に結合し、抗原のためのB 細胞レセプターとして機能す
る。抗体はまた、抗体による刺激に対して応答して分化するB 細胞子孫により分
泌される。特異的抗原は、1 またはそれ以上の相補的B リンパ球が増殖し、エフ
ェクター細胞に分化し、次いで抗原を排除するように、それらを誘発する。各リ
ンパ球は特定の特異性の抗体を産生し、こうして免疫応答は明確な抗原に対して
非常に特異的である。T リンパ球およびB リンパ球により認識される抗原の部分
は、エピトープまたは決定基と呼ばれる。

【００１７】特異的抗原エピトープについて事実上無制限の量のシグナル（モノクローナル
）抗体を産生する技術の開発は、臨床免疫学に対して莫大な衝撃を有した。既知
の特異性のモノクローナル抗体（mAb ）を産生するために、マウスに特定の抗原
、例えば、レセプタータンパク質を注射し、そして脾B リンパ球（そのタンパク
質に対する抗体を産生する）を体細胞ハイブリダイゼーションにより骨髄腫（リ
ンパ球腫瘍）に融合させて永久分裂能化性細胞系統を産生させて、ハイブリドー
マをつくることができる。これは、正常のB リンパ球が無限に成長することがで
きず、しかも骨髄腫と融合するとき、生ずるハイブリドーマが事実上無限に特異
的モノクローナル抗体を供給するからである。

【００１８】融合した細胞のみが成長し続けることを保証する、選択技術が開発された。各
ハイブリドーマ細胞はただ1 つの抗原決定基に対して特異的である。選択的異な
る抗体産生ハイブリドーマが産生される場合、個々のB リンパ球の各ハイブリド
ーマのクローンはただ1 つの表面抗原決定基に対する抗体のみを分泌するであろ
う。どのmAb がタンパク質レセプターに結合するか、あるいは所望の活性を有す
る（例えば、mAb がアゴニスト、アンタゴニストとして作用するか、あるいは重
大なエピトープに特異的に結合する）かを決定するために、ハイブリドーマをEL
ISA （酵素結合イムノアッセイ）によりスクリーニングすることができる。

【００１９】モノクローナル抗体は多数の用途を有する：1 ）ハイブリドーマは、通常少量
で入手可能であるか、あるいはまったく入手不可能である特異的抗体を大量に産
生することができる；2 ）複合抗原のために、通常非常に困難であることがある
、単一の抗原決定基に対する抗体を産生するように、ハイブリドーマを指令する
ことができる；3 ）精製することができない抗原に対して、純粋な抗体を得るこ
とができる；4 ）組織中を循環する特異的抗原を検出するか、あるいはイムノア
ッセイにおいてモノクローナル抗体を使用することによって、感染性または全身
性疾患の免疫診断；5 ）タンパク質レセプターの特性決定およびナイーブなT 細
胞からメモリーT 細胞への移行においてそれらが演ずる役割の特性決定；および
6 ）免疫応答または活性化のブロックまたは増強。

【００２０】こうして、必要なものは、活性化されたT 細胞上で発現されるタンパク質に特
異的に結合するリガンド、例えば、モノクローナル抗体である。そのうえ、必要
なものは、癌またはHIV-1 を処置または阻害するために使用できるようなリガン
ドである。

【００２１】発明の要約本発明は、ヒトレセプタータンパク質H4-1BB、およびヒトレセプタータンパク
質H4-1BBをコードするcDNA遺伝子を包含する。単離されたcDNAのヌクレオチド配
列を、推定されたアミノ酸配列と一緒に開示する。pH4-1BB として同定されたcD
NA遺伝子は、アグリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクシ
ョン(Agricultural Research Service Culture Collection)に受託され、受け入
れ番号：NRRL B21131 を割当てられた。

【００２２】 cDNAは、そのフラグメントおよび誘導体を包含し、レセプタータンパク質に類
似するタンパク質をコードするDNA 配列を単離するためにプローブとして使用す
ることができる。ヒトレセプター、H4-1BB、のcDNAは、cDNA 4-1BBから誘導され
たプローブを使用することによって単離された。p4-1BBとして同定されたcDNA遺
伝子は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Cultu
re Collection)( マリイランド州20852 、ロックビレ、パークローンドライブ
12301)にATCC No.67825 で受託された。こうして、本発明は、H4-1BBタンパク質、そのリガンド(H4-1BB/L 、活性化さ
れたマクロファージおよび成熟B 細胞上に見出される) 、それに対する抗体およ
び他の共刺激分子を提供し、これらは癌およびHIV-1 の処置において療法的に使
用することができる。

【００２３】ヒトレセプタータンパク質H4-1BBは次のようにして製造することができる：1
）H4-1BBのcDNAを適当な発現ベクターの中に挿入し、2 ）発現ベクターを適当な
トランスフェクション宿主の中にトランスフェクトし、3 ）トランスフェクトさ
れた宿主を適当な培地中で増殖させ、そして4 ）培地からレセプタータンパク質
を精製する。タンパク質およびフラグメントおよび誘導体は、次のように使用す
ることができる：1 ）ヒトレセプタータンパク質H4-1BBに対するリガンドを単離
するためのプローブとして、2 ）H4-1BBリガンドを発現するB 細胞の増殖を刺激
するために、または3 ）H4-1BBリガンドの結合をブロックするために。

【００２４】 B 細胞の増殖は、レセプタータンパク質H4-1BBに対するリガンドを発現したB
細胞を、レセプタータンパク質H4-1BBを発現した細胞で処理することによって誘
導することができる。H4-1BBリガンドの結合をブロックするために、H4-1BBタン
パク質、H4-1BBリガンドのタンパク質、またはタンパク質のフラグメントを使用
することは、器官の移植の間に免疫系の抑制において実際的応用性を有する。

【００２５】 H4-1BBに対して発生したモノクローナル抗体は、レセプタータンパク質H4-1BB
を発現したT 細胞を抗H4-1BBモノクローナル抗体で処理することによって、T 細
胞の増殖および活性化を増強または抑制するために使用することができる。免疫
反応を増強するために、アゴニストとして作用する抗体を発生させて、T 細胞の
増殖および／または活性化を抑制し、アンタゴニストとして作用する抗体を発生
させることができる。この目的で、4 つのモノクローナル抗体が使用のために開
発された。モノクローナル抗体BBK-1 およびBBK-4 はレセプタータンパク質H4-1
BBに対するアゴニストであるが、モノクローナル抗体BBK-2 およびBBK-3 はレセ
プタータンパク質H4-1BBに対するアンタゴニストであり、そして免疫系をアップ
レギュレートするか、あるいはその活性を抑制するために使用することができる
。

【００２６】いくつかの腫瘍は潜在的に免疫原性であるが、in vivo において有効な抗免疫
応答を刺激しない。腫瘍は抗原特異的シグナルをT 細胞に供給することができる
が、T 細胞の完全な活性化に必要な共刺激シグナルを供給することができない。
H4-1BBに対して発生したモノクローナル抗体（例えば、アゴニスト）は、T 細胞
の完全な活性化、増強、および／または増殖を提供するすることによって、低い
免疫原性を有する腫瘍を根絶することができる。そのうえ、抗H4-1BBmAb アゴニ
ストは、ナイーブT 細胞からメモリーT 細胞への移行における4-1BB レセプター
タンパク質の役割の評価において大きい実用性を有する。4-1BB と抗H4-1BBmAb
アゴニスト、例えば、BBK-1 またはBBK-4 との架橋は、4-1BB への4-1BB リガン
ドの結合に類似する作用を産生するであろう。

【００２７】 H4-1BBおよびH4-1BBリガンドの結合を妨害するために、また、H4-1BBに対する
mAb を使用することができる。例えば、抗H4-1BBmAb アンタゴニストBBK-2 およ
びBBK-3 を使用して、リガンドの結合を妨害することによって、免疫応答は抑制
されるであろう。これに関して、このようなmAb の療法的使用から利益を受ける
疾患は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、および糖尿病である。あ
るいは、この型の分子は器官移植において移植された組織の免疫系仲介拒絶反応
を抑制するために有用である。

【００２８】融合タンパク質は、ヒトレセプタータンパク質H4-1BBに対する細胞膜のリガン
ドを検出することができる。本発明の融合タンパク質は、レセプタータンパク質
H4-1BBの細胞外部分と、レセプタータンパク質H4-1BBの前記分に結合した検出タ
ンパク質（アルカリ性ホスファターゼ）またはIgG1のFc部分とを含んでなる。さ
らに、この開示は、CD28と4-1BB との共エンゲージメントは1 型エフェクターT
細胞の発生を促進したことを証明する。4-1BB シグナルはCD28仲介サイトカイン
産生のプロフィルを2 つの方法で調節し、1 型サイトカイン（リンホカイン）の
産生を増強し、同時に、2 型の産生を抑制した。

【００２９】 4-1BB 仲介共刺激は、また、Th1 細胞においてγ- インターフェロン(IF)の産
生を誘導した。4-1BB の発現はサブセット特異的であり、主としてIF産生細胞で
検出されたが、IL-4産生細胞上で検出されなかった。そのうえ、4-1BB およびCD
30の発現は相互に独占的であり、それぞれ、1 型および2 型サブセットを表すこ
とが決定された。4-1BB およびCD28の共エンゲージメントは、反復したTCR 活性
化により誘導されたアポトーシスに対して感受性である細胞について長期間の細
胞の生存率を増強した。したがって、4-1BB およびCD30は相互作用して1 型およ
び2 型のT 細胞サブセットの間の均衡、および免疫応答の極性化を調節すること
が証明された。療法的に、それらは反対の作用を達成するために使用することが
できる。

【００３０】本発明は、T 細胞の接着性の応答における4-1BB とCD28との間の機能的相関が
存在すること証明するデータを提供する。本発明者は、4-1BB が細胞の接着を誘
導することができることを本明細書において開示する。4-1BB シグナルまたはア
ゴニストの存在により細胞の接着が増強されると、最適より低い濃度の抗−CD3
および抗−CD28に対する反復暴露に応答して、T 細胞の活性化は最大となる。こ
うして、4-1BB の作用は、一次T 細胞を反復的に活性化するために必要である抗
−CD3 濃度の限界値を減少する、その能力によるものと考えられた。したがって
、抗4-1BB に応答する細胞接着の程度は、4-1BB の発現レベルと相関し、相応し
てこれらの分子の療法的使用を達成する。

【００３１】 4-1BB の発現レベルおよびT 細胞を発現する4-1BB の百分率は、HIV-1 対照よ
りもHIV-1 陽性個体においてより高かった(P<0.01)。4-1BB シグナルはCD28と共
同して、HIV-1 、およびCD4+T 細胞の増殖を誘導した。さらに、4-1BB とアゴニ
スト性モノクローナル抗体との架橋は、HIV-1 個体からのCD4+T 細胞の一次およ
び二次再刺激の双方におけるHIV-1 複製を増強した。こうして、4-1BB は後期に
感染したCD4+T 細胞からのHIV-1 複製の活性化に関係し、そして4-1BB 共刺激経
路は療法的関与のターゲットであることができる。

【００３２】 HIV-1 感染が感染の初期段階において混乱される場合、H4-1BB抗体の使用によ
り、ウイルス負荷はより低くなるであろう。そのうえ、CD8+T 細胞上の4-1BB 発
現の増加は、HIV-1 感染における免疫不全の程度と相関するので、注目に値し、
CD8+T 細胞上の架橋する4-1BB はHIV-1 感染CD4+T 細胞に対する細胞障害活性の
増強を誘導するであろう。本発明の目的は、H4-1BBの細胞外部分と、検出部分とからなる融合タンパク質
を教示することである。本発明の他の目的は、H4-1BBに対するモノクローナル
抗体を構築することを教示することである。

【００３３】発明の詳細な説明下記において、4-1BB およびそのヒト相同体H4-1BBの単離、抗体を包含する、
末梢血細胞および使用する試薬の調製、融合タンパク質の産生、免疫化、および
H4-1BBのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用するモノクローナル抗体の
産生を説明する。また、4-1BB 、それに対する抗体、そのリガンドの療法的使用
、および免疫沈降の研究を開示する。

【００３４】マウスレセプター4-1BB の単離および特性決定配列番号:1はマウスレセプター4-1BB のヌクレオチド配列を示し、そして配列
番号:2は推定されたアミノ酸配列を示す。予測されたアミノ酸配列は、ヌクレオ
チド配列の下に示されている。4-1BB の転写は、マウス脾細胞、T 細胞クローン
、およびハイブリドーマにおいてコンカナバリンA により誘導可能であった。4-
1BB 転写物の発現はシクロスポリンA により阻害された。

【００３５】 4-1BB mRNAは抗原レセプターの刺激により誘導可能であったが、クローニング
されたT 細胞中のIL-2刺激により誘導可能ではなかった。4-1BB cDNAは、推定上
のリーダー配列、潜在的膜アンカーセグメント、および既知のレセプタータンパ
ク質の他の特徴を含有する256 アミノ酸のペプチドをコードする。したがって、
4-1BB の発現パターンはリンホカインmRNAのそれらに類似するが、配列はレセプ
タータンパク質の配列と一致するように見えた。

【００３６】細胞表面上の4-1BB の主要な種は55kDa の二量体であるように見える。4-1BB
はまた、30kDa のモノマーとして、そして可能性として110kDaのテトラマーとし
て存在するように見える。これらの4-1BB 種は細胞(T細胞のクローンf1) の相同
体の集団から免疫沈降されたので、すべての形態は各細胞上に潜在的共存する。
4-1BB のモノマーおよび二量体からのペプチド消化物は、4-1BB が細胞表面上の
ホモダイマーとして存在するかどうかを決定するために要求される。

【００３７】種々の細胞表面のレセプター、例えば、インスリンレセプター(Ebina et al.
、1985) 、B 細胞表面の免疫グロブリンレセプター(Vassali et al.)、T 細胞Ag
レセプター(Haskins et al. 、1983) 、CD-28 共刺激レセプター(Lesslaver et
al. 、1986) 、およびCD27 T細胞抗原(Van Lier et al.、1987) は、ジサルファ
イド結合されたサブユニットから構成されている。レセプターの二量体化は、リ
ガンドの結合および引き続く細胞シグナルのトランスダクションに要求されるこ
とがある。

【００３８】 4-1BB は休止T 細胞上で発現されないが、完全な成長刺激をT 細胞に供給する
アクチベーターにより誘導可能である。PMA とイオノマイシンとの組合わせは、
T 細胞の増殖に必要なシグナルを模倣することができる。PMA またはイオノマイ
シン単独は4-1BB mRNAを誘導したが、PMA とイオノマイシンとの組合わせは最適
な4-1BB の発現を生じた。さらに、4-1BB の発現は一時的ではなかった。精製さ
れた脾T 細胞を固定化抗−CD3 で刺激したとき、4-1BB mRNAが発現され、そして
この発現は刺激後96時間まで維持された。4-1BB が細胞周期の進行を通じて発現
されることを確証するために、細胞周期の分析が必要であろう。

【００３９】 4-1BB は神経成長因子のレセプターのファミリーのメンバーに構造的に関係づ
けられる。これらのレセプターは構造的に類似するリガンド結合特性（システイ
ンに富んだ領域）を有するが、これらのタンパク質の細胞質ドメインは非保存的
であり、膜貫通シグナリングにおける多様性を可能とすることができるであろう
。このファミリーのいくつかのメンバーはT 細胞またはB 細胞の活性化プロセス
に関係する。OX-40 、CD40およびCD27抗原についてのin vitroの機能的データが
存在する。OX-40 に対する抗体は混合リンパ球反応におけるT 細胞の応答を増大
し、そしてCD40に対する抗体はコアクチベーター、例えば、PMA またはCD20抗体
の存在下にB 細胞の増殖を増強し、そしてin vitroにおいてIL-4と共力してB 細
胞の分化を誘導しかつ長期間の正常B 細胞系統を発生する。

【００４０】 1 つのモノクローナル抗体である抗1A4 は、CD27分子上のエピトープを認識し
、カルシウムの移動化、IL-2分泌、ヘルパーT 細胞の機能、およびT 細胞の増殖
を阻害した。他方において、CLB-CD27/1、他の抗CD27 mAbは、PHA または抗−CD
3 mAb で刺激したヒトT 細胞の増殖を増強した。これらの結果が示すように、CD
27分子はT 細胞活性化において重要な役割を演ずる。TNFR、NCFRおよびCD40を除
外して、スーパーファミリーのメンバーが結合するリガンドまたは細胞表面の分
子はまだ同定されていない。レセプターが結合するリガンドの同定および特性決
定は、4-1BB の生理学的役割をよりよく定義する上で助けとなるであろう。

【００４１】細胞表面の4-1BB がT 細胞活性化に寄与するかどうかを確認するために、抗4-
1BB 53A2を4-1BB に対するアンタゴニストとして使用した。得られるデータが示
唆するように、4-1BB は、事実、T 細胞の活性化および増殖の間のアクセサリー
シグナリング分子として機能する可能性を有する。固定化抗−CD3 で刺激した精
製された脾T 細胞に可溶性53A2を添加すると、抗−CD3 単独で刺激したT 細胞に
比較して、³Hチミジンの組込みが増幅した。この増強パターンは3 回の独立の実
験において2 〜10倍の範囲であった。

【００４２】 BretcherおよびCohnの独創的な2 つのシグナルのモデルにおいて、シグナル1
、T 細胞の抗原レセプター(TCR) の占有が、アクセサリー細胞により提供される
、シグナル2 の非存在においてT 細胞の不活性化を生ずることを彼らは提案した
。これはそれ以来種々の研究により確証された(Moeller et al. 、1989) 。T 細
胞上の潜在的共刺激レセプターとしてのアクセサリー細胞CD28の同定は、最適な
T 細胞の増殖に必要な1 またはそれ以上のアクセサリーシグナルの特性決定の開
始において有意な寄与となった。他の細胞表面の分子はこれらの共刺激活性化の
要件に寄与することができる。

【００４３】 4-1BB を通して供給された生化学的シグナルは、その細胞質テイル中の推定上
のp56lckチロシン結合ドメインの存在を示す。後に、p56lckチミジンキナーゼは
4-1BB に結合することが決定された。また、T 細胞の活性化および引き続く増殖
にその発現が要求される、遺伝子、例えば、IL-2およびIL-2レセプターを4-1BB
仲介シグナリングが調節できるかどうかを決定することは価値がある。

【００４４】神経成長因子レセプター(NGFR)のスーパーファミリーのメンバーの正確な機能
は、多様であるように思われる。損傷のそれらの出現は、これらの分子が発現さ
れる、特定の細胞の型の応答性および生活能力を維持する、これらの能力に関す
る。例えば、NGF はin vitroおよびin vivo におけるニューロンの生活能力に絶
対的に要求される(Yamori et al.、1992) 。可溶性抗CD40モノクローナル抗体に
よりCD40の架橋は、胚芽中心の中心細胞がin vitroにおいてアポトーシスを行う
のをブロックする。CD40を通して供給されるシグナルは、また、分化因子に対す
る応答性の維持を促進することができる。IL-4の存在下のCD40と抗CD40F(ab')² フラグメントとの結合は、IgE の合成を大きい増加を誘導した。

【００４５】また、抗CD40はIL-10 で処理したナイーブB 細胞を活性化し、そして形質転換
成長因子- βはIgA を分泌するようになった(DeFrance et al.、1992) 。分子の
特性をNGFRスーパーファミリーと共有することに加えて、4-1BB は酵母elF-2bタ
ンパク質のそれに類似する推定上の亜鉛フィンガー構造を含有することが認めら
れた。また、4-1BB は、正しい光受容体の細胞の発生に必要である、sina seven
in absentia of Drosphila Melangaster を有する保存された領域を共有する(C
arthewおよびRubin 、1990) 。その特定の領域は、ディクチオステリウム（Dict
yostelium)のDG17遺伝子のタンパク質産物に類似し、その発現はcAMPにより凝集
の間に特異的誘導される。

【００４６】この領域はC-X₂-C-X₉-C-X₃-H-X₃-C-X-C のパターンを形成し、そしてシステイ
ンおよびヒスチジンは4-1BB 、sina、およびDG17タンパク質の中の同様な場所に
保存される。4-1BB およびSINAタンパク質の間の24アミノ酸のうちの10は同一で
ある；24のうちの3 は保存的置換基である。保存されたパターンは、これらのア
ミノ酸が機能的に重要である事を示唆する。sinaタンパク質は核の中に局在化し
、それが細胞中で調節機能を有することを示唆する。4-1BB のアミノ酸配列が亜
鉛フィンガー、核タンパク質、およびレセプタードメインのモチーフに似た特徴
を含有するという事実は、4-1BB が細胞の増殖および分化の間に多様な役割を演
ずることができることを示唆する。

【００４７】さらに、4-1BB はT 細胞-APCの相互作用に関係する他の細胞表面の分子を表す
ことができる。4-1BB-AP融合タンパク質は成熟B 細胞系統、抗IF活性化一次B 細
胞、および成熟マクロファージ- 細胞系統に特異的に結合した。4-1BB-APは低い
または無意味のレベルで未熟B およびマクロファージ細胞系統、T 細胞クローン
、一次培養T 細胞、および種々の非リンパ系細胞系統に結合した。4-1BB-APは栄
養B 細胞およびマクロファージに結合するので、4-1BB の結合のとき送出された
シグナルはある方法においてAPC 機能をモジュレートすることができる。この可
能性は探査されなていない。

【００４８】 4-1BB Rg、すなわち、4-1BB の細胞外ドメインと免疫グロブリンIgG のFc領
域とから成る融合タンパク質は、細胞外マトリックス(ECM) に結合することを、
Chalupny et al. は提案した。最高レベルの4-1BB Rgの結合はヒトビトロネクチ
ンに対してであった。本発明者らは、マイクロタイタープレート上で10mg／ウェ
ルで、0.007mg において固定化された4-1BB-APおよびヒトビトロネクチン(Yelio
s Pharmaceuticals/GIBCO-BRL 、ニューヨーク州グランドアイランド) を使用
して、この可能性を試験するためにELISA を実施した。AP活性をベースとする4-
1BB-APの結合は観測されなかった。

【００４９】 4-1BB-APが細胞表面に外的に結合されたタンパク質( 可能な細胞外マトリック
スの成分) に結合している可能性を除外するために、B 細胞のリンパ腫を結合ア
ッセイの前に酸性条件下に洗浄した。4-1BB-APは成熟B 細胞のリンパ腫なお特異
的に結合した。なお、B 細胞およびマクロファージ上で特異的に発現された4-1B
B-リガンドが存在するかどうか、および特定の結合条件下に4-1BB-APがECM に結
合することができるかどうを決定すべきである。ECM は特異的細胞表面のリガン
ドへの4-1BB の結合を促進することができるであろう。

【００５０】 B 細胞およびヘルパーT 細胞はB 細胞上のレセプターを通して互いに相互作用
して、T 細胞上のそれらの特異的反対（counter)- レセプターに結合する。この
相互作用は、2 つの細胞型の間の生化学的シグナリングリプレーのカスケードを
生ずる。この相互作用が進行するにつれて、これらの細胞は細胞周期のS 期の中
に入るようになる。T 細胞上のTCR とCD4+との間の初期の相互作用、およびB 細
胞上のプロセシングされた抗原-MHC II は、細胞周期の中に入ることができるB
細胞を生じない(Noelle およびSnow et al. 、1990) 。しかしながら、in vitro
系からの研究において、いったんT 細胞が刺激されると、T 細胞は細胞周期の中
に入るようにB 細胞を誘導することができる、新しく合成されたまたは修飾され
た細胞表面の分子を発現することが示唆された。

【００５１】このT 細胞の機能は抗原特異的またはMHC 制限的ではない。さらに、B 細胞の
活性化のTh誘導のために、可溶性因子は要求されない。いったんB 細胞が細胞周
期の中に入ると、IL-4はB 細胞を誘導してG1からのS 期に進行させる。B 細胞の
細胞周期の中へのエントリーを促進する活性化T 細胞またはT 細胞の膜の能力を
、シクロヘキシミドまたはシクロスポリンA の処理によりブロックすることがで
きる。これらの新しく発現された膜タンパク質は、それらの誘導特性において「
リンホカイン様」であるように見える。

【００５２】 4-1BB は、B 細胞の共刺激の要件を満足する発現特性を有する。4-1BB は抗−
CD3 またはTCR 仲介T 細胞刺激により誘導可能であり、そしてその発現はシクロ
スポリンA ならびにシクロヘキシミドの処理に対して感受性である。興味あるこ
とには、パラホルムアルデヒド固定SF21-4-1BB細胞は抗μを合成し、そしてB 細
胞の増殖を誘導した。SF21-4-1BBによる脾B 細胞の共刺激は、抗μの最適な(10
μg/ml) および次善の(1.0〜0.1mg/ml) の投与量において起こった。休止B 細胞
にSF21-4-1BB細胞を添加すると、有意なB 細胞の増殖は起こらなかった。SF21-4
-1BB細胞は、B 細胞の増殖の誘導において、12-O- テトラデカノイルホルバル-1
3-アセテートまたはイオノマイシン、あるいは次善濃度のリポ多糖(LPS) と共力
しなかった。

【００５３】大量の組換え可溶性タンパク質を発現させるためにバキュロウイルス系が使用
されてきているが、この系は組換え細胞表面のタンパク質の発現に利用すること
ができる。SF21単独の添加は有意なレベルの共刺激を生じなかったことは注目に
値する。それら自身で強い共刺激活性を示すことができるCOS またはL 細胞系統
使用するとき、これは潜在的問題であることがある。

【００５４】 NGFRスーパーファミリーの他のメンバーであるCD40はB 細胞上で発現され、そ
してgp39、すなわち、活性化されたT 細胞上で発現される分子と相互作用する。
ネズミおよびヒトgp39をコードするcDNAはクローニングされた；この細胞表面の
分子は腫瘍壊死因子に対する相同性を有するII型膜タンパク質である。CD40-B細
胞の増殖および分化を投与量依存的方法においてブロックすることができること
を、Noelle et al. は発見した。

【００５５】 Armitage et al. はネズミgp39のためのcDNAを単離し、そしてgp39が共刺激因
子の非存在下にB 細胞の増殖を誘導することができ、そしてIL-4の存在下にIgE
産生を生ずることができることを示した。ヒトgp39でトランスフェクトされたCO
S 細胞はヒトB 細胞の増殖においてTPA または抗CD20と共力することができ、そ
して共刺激因子の非存在下に、あるいは低いレベルのみの共刺激因子の存在下に
B 細胞を刺激できることを、Hollenbaugh et al.は示した。投与量のデータは、
CD40はT 細胞との物理的接触の間にシグナルを伝達するB 細胞表面の分子の1 つ
でありうることを示す。

【００５６】細胞表面のレセプターは、可溶性因子または隣接する細胞上で発現される他の
細胞表面の分子と相互作用することによって、それらの外部の環境と連絡する。
細胞- 細胞により供給される生化学的シグナルの役割と、細胞表面のレセプター
と相互作用する可溶性因子により供給されるものとの対比は不明瞭である。TNFR
IおよびIIならびにNGFRは2 以上のリガンドと結合するので、NGFRのスーパーフ
ァミリーは異常である。TNFR IおよびIIの双方はTNF-a およびTNF-R に結合する
。NGFRはNGF 、脳由来神経親和性因子、およびニューロトロフィン-3に結合する
。

【００５７】さらに、1 つのリガンドは細胞表面リガンドおよび可溶性リガンドの双方とし
て機能することができる。CD40リガンド、gp39についての最近の証拠は、このリ
ガンドが膜結合したリガンドとしてならびに可溶性リガンドとして存在できるこ
とを示唆する。4-1BB は可溶性形態ならびに膜結合した形態で分泌され、B 細胞
と相互作用することが可能であろう。NGFRレセプターのファミリーの1 メンバー
であるCD27は、T 細胞上で発現され、細胞表面上で発現されることに加えて、分
泌される(Hintzen et al. 、1991) 。また、2 以上のリガンドは、可溶性であり
かつ細胞表面上に存在する場合、4-1BB と結合することができるであろう。

【００５８】ヒト相同体、H4-1BBの単離マウス4-1BB のヒト相同体(H4-1BB)を単離するために、２工程のポリメラーゼ
連鎖反応(PCR) を設計した。PCR プライマーを設計するために、4-1BB は神経成
長因子レセプター(NGFR)スーパーファミリーの1 メンバーであるので、このスー
パーファミリーのメンバーの間のアミノ酸配列を比較した(MallettおよびBarcla
y 、1991) 。使用したアミノ酸配列はマウス4-1BB 、ヒトNGFR、ヒト腫瘍壊死因
子のレセプター、ヒトCD40、およびヒトCD27であった。NGFRスーパーファミリー
の間の配列の保存領域を選択した。

【００５９】材料および方法正常の健康な個体からの末梢血リンパ球を単離し、PMA(10ng/ml)およびイオノ
マイシン(1mM) で活性化した。リンパ球からのメッセンジャーRNA を単離した。
逆転写酵素を使用して、ヒトリンパ球mRNAを一本鎖cDNAに変換した。次いでプラ
イマーの組合わせ( 配列番号:3〜6 を使用してTaq ポリメラーゼでcDNAを増幅し
た。プライマーの組合わせを使用し、そしてこれらは約240bp の特異的バンドを
産生した。ヒト相同体タンパク質のサイズがマウス4-1BB のそれに類似する場合
、240bp はヒト4-1BB の期待するサイズである。PCR 生成物(240bp) をPGEM3 中
でクローニングし、配列決定した。

【００６０】 PCR 生成物の1 つのオープンリーディングフレームはマウス4-1BB とほぼ65％
同一であった。したがって、240bp のPCR 生成物はマウス4-1BB のヒト相同体で
あると結論された。240bp のPCR 生成物を使用して、活性化されたヒトT リンパ
球のλgt11 cDNA ライブラリーをスクリーニングした。0.85kgのcDNAが単離され
た。cDNAの配列は配列番号:7に示されており、そして予測されたアミノ酸配列は
配列番号:8に示されている。

【００６１】 H4-1BB AP タンパク質を産生するための発現プラスミドを構築した。シグナル
配列および全体の細胞外ドメインをコードする配列を包含するH4-1BB cDNA の5'
部分を、PCR により増幅した。正しく配向されたクローニングを実施するために
、前方向プライマーの5'末端上のHindIII 部位および逆方向プライマーの5'末端
上のBglII 部位をつくった。 HindIII-BglII H4-1BBフラグメントを、ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ(A
P)のためのコーディング配列から上流において、哺乳動物発現ベクターAPtaq-1
の中に挿入した。

【００６２】 H4-1BB AP を使用して、ヒト4-1BB(すなわち、H4-1BB) のためのリガンドを発
現する細胞および組織を同定する。マウス4-1BB を使用する研究において、4-1B
B のリガンドは細胞表面上に存在ことが示された。B 細胞およびマクロファージ
は4-1BB を発現する主要な細胞であった。H4-1BBはヒトB 細胞およびマクロファ
ージ上で発現されることが期待される。

【００６３】結果 H4-1BBを発現するヒト細胞系統から、哺乳動物発現cDNAライブラリーを発生さ
せた。ライブラリーをヨウ素標識化H4-1BB-AP によりスクリーニングした。次い
でH4-1BBのcDNAを単離し、特性決定した。次いで可溶性組換えH4-1BBを産生した
。次いで、後述するように、発生した抗体を使用して免疫応答を抑制または増強
させた。H4-1BBに対するモノクローナル抗体を発生させ、そして後述する。

【００６４】本発明者が完結した研究に従うと、4-1BB は共刺激シグナルとして作用する。
それゆえ、H4-1BBはT 細胞活性化の共刺激シグナルとして作用することが期待さ
れる。マウス4-1BB はB 細胞の増殖および分化を促進した。H4-1BBは同一のこと
を実行することが見出された。H4-1BB-AP 、H4-1BBおよび下に開示する種々のモ
ノクローナル抗体を使用して、ヒト免疫応答を抑制または促進することができる
。

【００６５】実施例1. H4-1BBに対するモノクローナル抗体の産生 4-1BB 分子は活性化されたネズミT 細胞上で発現されるが、休止T 細胞上で発
現されないが、マウス4-1BB に対して向けられた1 AH2 mAb の架橋は抗−CD3 誘
導T 細胞の増殖を増強することが示された。T 細胞上の4-1BB がB 細胞およびマ
クロファージ上のそのリガンドに結合するのを4-1BB/APで阻害することによって
、正常脾細胞抗原提示およびT 細胞活性化をブロックすることができる。このタ
ンパク質4-1BB/APは、4-1BB の細胞外ドメインおよびアルカリ性ホスファターゼ
を含有する融合タンパク質である。H4-1BB mAbを特性決定し、次いで単離した。

【００６６】材料および方法組換えH4-1BBの産生 4-1BB およびグルタチオン-S- トランスフェラーゼ(GST) のGST 結合ドメイン
をコードする全長のcDNA配列を含有するPGX-3 発現ベクター(Pharmacia) を構築
し、そして細菌中で融合タンパク質を発現させた。H4-1BBをGST と融合させると
、GST-セファローズおよびセファローズ-4B のカラムクロマトグラフィーにより
単離するとき、rH4-1BB(組換えH4-1BB) の効率よい精製が可能であった。免疫化
前に、GST 結合ドメインを切断する。rH4-1BB 画分をGST-セファローズおよびセ
ファローズ-4B のカラムクロマトグラフィーにより精製し、引き続いて免疫化前
に因子Xaで切断してH4-1BB部分を解放する。

【００６７】 BALB/c動物をrH4-1BB タンパク質で免疫化し、脾細胞をSp2/0 融合相手と融合
させた。BALB/cマウスTitermax(Cytkx) または「 Complete Freunds」アジュバン
トの中に乳化した50μg のsH4-1BB で免疫化すべきである。3 回の腹腔内(ip)注
射を2 週の間隔で投与すべきである。最後の注射後3 日に、マウス宿主を殺し、
それらの脾臓を取出した。

【００６８】脾細胞をSp2/0 骨髄腫細胞と融合させた。脾細胞およびSp2/0 を5:1 の比で混
合し、50％のPEG を使用して融合させた。次いで細胞を洗浄し、OptiMEN(Gibco)
、10％のFCS 、5mM のハイポキサンチン、1 ％のアミノペプチン、および0.8mM
のチミジン(HAT) の中に再懸濁させ、96ウェルのU 字形の底のプレート(Corning
) 中の培養した。生ずる細胞上清をrh4-1BB の反応性についてELISA によりスク
リーニングした。クローンを単離し、サブクローニングした。

【００６９】活性化T 細胞は4-1BB+およびCD45RAおよびCD45R0を共発現する従来、マウス4-1BB は1 系列の免疫沈降研究およびペプチドマッピング研究に
よりp56lckに関連づけられることが示された。収集したデータは、4-1BB が活性
化T 細胞上でCD45およびp56lckと多ペプチド複合体を形成することを示す。ヒト
における4-1BB およびCD45のアソシエーションをよりよく評価するために、PHA
で48時間刺激したPBMCを、多色FCM によりCD45RAおよびCD45R0イソ型の発現につ
いて分析した。抗体の非特異的結合について補正した後、細胞の16〜19％は4-1B
B を発現し、ほとんどすべて（1 ％を除外する）はCD45RAを発現し、そしてほと
んどすべてはCD45R0を発現した。

【００７０】抗H4-1BB mAbについての使用いくつかのmAb はSF-21 細胞上で発現された4-1BB を特異的に認識するが、活
性化T 細胞上で発現された4-1BB を認識しない。これは、T 細胞上で暴露されな
いか、あるいはT 細胞上に存在するが、ヒトT 細胞と昆虫細胞(SF-21) との間の
グリコシル化およびプロセシングにおけるわずかの差のために、SF-21 細胞上で
アクセス可能であるか、あるいはSF-21 上に存在する、1 またはそれ以上のクリ
プティックまたはユニーク結合部位に対する特異性を有するmAb のためであろう
。

【００７１】マウスにおいて、4-1BB mRNAおよび表面の発現は休止の脾細胞または非刺激の
クローニングされたT 細胞上で検出不可能である。しかしT 細胞を抗−CD3 、抗
TNF-αまたは抗TNF-βにより活性化すると、4-1BB mRNAは3 時間の刺激で検出さ
れ、そして最初に刺激後2 〜3 日に細胞で検出可能である。最大の表面の発現は
刺激後約6 日に到達する。

【００７２】マウスにおけるように、4-1BB はヒトにおいて新しく単離された末梢血T 細胞
の表面上で検出されないが、PHA 刺激後容易に検出される。マウスにおけるのと
異なり、4-1BB はヒトにおいて非常により急速に発現され、12〜24時間以内にピ
ークの発現に到達する。4-1BB の発現、ならびに細胞表面上で4-1BB を発現する
細胞の細胞は、刺激後72時間以内に減少し始める。マウスおよびヒトの双方にお
いて、4-1BB はCD4+およびCDS+T 細胞サブセット上で発現される。

【００７３】 4-1BB はp56 ^lckに関連づけられる。[³²]PO4 がガンマ標識化ATP から、抗4-
1BB mAb 、1AH2 で免疫沈降させたコンカナバリンA(ConA) 活性化胸腺細胞中のp⁵ ⁶ 上に、転移されるとき、56kDa のタンパク質が検出される。ペプチドマッピン
グにより、この56kDa のホスホタンパク質はp56 ^lckとして同定される。p56 ^lc ^k および4-1BB 分子は、また、昆虫細胞の研究(SF-21) において、および4-1BB
およびp56 ^lckで形質転換されたHeLa細胞において、共免疫沈降されることが見
出された。さらに、4-1BB の架橋はp56 ^lckを活性化した。p56 ^lck-CD4/CD8複
合体の形成のために重大なシステイン残基は、また、p56 ^lck-4-1BBの相互作用
のために重大であった。

【００７４】予備的結果において、抗4-1BB は、また、ビオチン表面標識化ConA活性化胸腺
細胞から約200kDaのタンパク質を免疫沈降させることが認められた。抗CD45 mAb
を免疫沈降のために使用したとき、マウス4-1BB に対する同様なサイズの約30kD
a のタンパク質が検出された。従来、CD45はある種のタンパク質、例えば、p56 ^lck の脱リン酸化を仲介することが示された(Biffen et al.、1994)。多分、4-1B
B はCD45およびp56 ^lckを組合わせることにおいてある役割を演じ、そしてCD45
ホスファターゼによるp56lckの脱リン酸化を促進する。

【００７５】 4-1BB およびCD45のアソシエーションをさらに評価するために、PHA 刺激PBMC
を多色FCM により分析した。PHA 中の48時間培養したPBMCのほぼ16〜19％は4-1B
B を発現する。すべての4-1BB+細胞がCD45RAおよびCD45R0を発現する場合、4-1B
B+細胞の約17.5％はそれらの細胞表面上でCD45RAおよびCD45R0の双方を共発現す
るに違いない。PHA 刺激したCD45RA^hiR0^hi細胞のうちで、ほぼ40％は4-1BB を発
現する。CD45および4-1BB がアソシエーションを共有するという仮説を、このデ
ータはさらに支持する。

【００７６】より重要なことには、4-1BB はナイーブ表現型(CD45RA ^hiR0^lo) からメモリー
表現型(CD45RA ^loR0^hi) へのT 細胞の移行においてある役割を演ずることが示唆
される。以前においてPicker et al. は、多色FCM により、ナイーブT 細胞が明
確なCD45RA^hiR0^hiの中間的細胞型を通してナイーブ表現型(CD45RA ^hiR0^lo) から
メモリー表現型(CD45RA ^loR0^hi) への「段階的、1 方向の進行」を行うことを証
明した。末梢血において、この中間の表現型を発現するわずかの細胞が検出可能
である。

【００７７】しかしながら、二次リンパ系組織、例えば、扁桃腺においてT 細胞の2 〜10％
はCD45RA^hiR0^hiであることが見出された。多くはナイーブおよびメモリーT 細胞
について知られているが、わずかは移行細胞においてCD45RA^hiR0^hiについて知ら
れている。メモリーT 細胞の発生を生ずるこの移行相の間に、どんな事象が起こ
るかは知られていない。したがって、ナイーブからメモリーT 細胞への移行にお
ける4-1BB の役割および4-1BB とCD45との見掛けのアソシエーションを評価する
ことが必要であろう。これに関して、抗H4-1BB mAbは評価できない。

【００７８】結果抗H4-1BB mAbを使用してT 細胞の架橋を増強することができ、したがってある
型の癌細胞（黒色腫）に対するT 細胞の活性化を誘導することができる。T 細胞
の存在下に種々の癌細胞を用いる実験においてmAb を使用することによって、癌
細胞に対するT 細胞の活性化を開始する投与量および適切な処方物を決定するこ
とができる。同一型の癌を有する動物モデルにおいて、処方物を試験し、そして
処方物および投与量をヒトにおける試験のために改良する。

【００７９】慢性関節リウマチの患者における滑膜T リンパ球はH4-1BBを発現するが、この
疾患をもたない両種性の滑膜T リンパ球において4-1BB は発現されない。この疾
患は患者自身の組織に対する望ましくない免疫応答を含む。したがって、望まし
くない免疫応答のブロッキングは関節炎の患者に緩和を提供する。患者に抗H4-1
BB mAbまたは融合タンパク質を注射することによって、H4-1BBとそのリガンドと
の間の結合はブロックされるであろう。

【００８０】 mAb とH4-1BBとの結合が免疫系の活性化を増強しない場合、抗H4-1BB mAbによ
る結合の妨害は所望の作用を有し、そうでなければ融合タンパク質が結合のブロ
ッキングに使用されるであろう。融合タンパク質（モノマー）はH4-1BBまたはそ
のリガンドを刺激しないが、それはH4-1BBに結合し、これによりH4-1BBの結合を
防止しかつリガンドを刺激するので、すぐれたリガンドの結合ブロッカーである
。

【００８１】リガンドの結合をブロックする同様な方法、全身性エリテマトーデスの患者に
有用であろう。I 型糖尿病の患者について、T 細胞はそれらの自身のインスリン
産生細胞、膵臓ベータ細胞を攻撃する。mAb または融合タンパク質を注射するこ
とによって、この破壊をブロックすることができる。 AIDSまたはある型のflu ウイルスを有する患者における末梢血T 細胞はH4-1BB
を発現しているが、通常の患者における同一細胞はH4-1BBを発現していない。し
たがって、4-1BB はこの免疫応答において重要である。H4-1BBリガンド結合の増
強またはブロッキングは、これらの疾患を有する患者におけるT 細胞の調節にお
いて重要であろう。

【００８２】実施例2. 免疫応答の抑制におけるH4-1BB抗体の使用図1 および図2 は、T 細胞活性化に関係する分子を図解する。初期のT 細胞活
性化（認知相）の間に、休止T 細胞はTCR ／CD3 複合体および他の「アクセサリ
ー」分子を発現する。これらの構成的に発現された分子の間で、CD4+（またはCD
8+）、LFA-1 、およびCD28は多分共刺激シグナルを受け取るものである。TCR ／
CD3 複合体との初期の相互作用と、これらの「アクセサリー」共刺激シグナルと
の組合わせは、追加のレセプター分子、例えば、CD28、CTLA4 、および4-1BB の
引き続く発現に導く。これらの新しく発現された分子は、T 細胞活性化の後の段
階、例えば、クローナル発現において追加の重要な共刺激シグナルを受け取るで
あろう。

【００８３】図3 〜図5 は、正常のT 細胞活性化経路を図解する。図6 〜図8 は、4-1BB の
可溶性キメラによる免疫応答のブロッキングを図解する。4-1BB がT 細胞活性化
においてある役割を演ずる場合、抗原提示細胞上のそのリガンドに対する相互作
用のブロッキングはT 細胞依存性免疫応答を抑制させるであろう。CD28とそのカ
ウンター- レセプターB7との相互作用のブロッキングは、in vivo の抗体産生お
よび細胞仲介免疫応答の双方を、変化する程度で、抑制することが適切に証明さ
れている。双方の相互作用はより有効な免疫抑制を生ずるべきである；なぜなら
、4-1BB はT 細胞活性化の間に誘導されるからである。4-1BB とそのリガンドと
の相互作用のブロッキングは、CD28/B7 の相互作用がもはや無関係である、活性
化プロセスの後の段階において重要である。

【００８４】マウスレセプター4-1BB 、活性化されたT 細胞上で発現されるタンパク質、お
よび上記マウスリガンド4-1BB を使用して例示されるように、H4-1BB-AP の添加
はH4-1BBを発現する細胞をコーティングし、H4-1BBとH4-1BBL との間の正常の相
互作用をブロックするであろう。これは免疫抑制に導くであろう。この型の免疫
抑制は抗原特異的である。したがって、それは抗−CD3 またはシクロスポリンA
の処理により産生される一般化免疫抑制を回避する。H4-1BB-AP の処理を使用し
て、ある種の免疫疾患を治療し、器官の移植を促進することができる。

【００８５】結合活性レセプタータンパク質H4-1BBの一部分は細胞膜のリガンドに結合し、そして検
出タンパク質についての相対活性のアッセイにより、結合を検出することができ
る。融合タンパク質は、レセプタータンパク質H4-1BBを発現することが推測され
る細胞の存在下に配置される。次いで、細胞を洗浄して、細胞膜のリガンドに結
合しない融合タンパク質を除去する。いったん洗浄された細胞が検出タンパク質
の基質の存在下に配置されると、検出タンパク質の相対活性を測定することがで
きる。

【００８６】免疫反応の増強 H4-1BBはT 細胞活性化の後期の段階において機能し、そしてT 細胞活性化の完
結について重要な分子であろう。大部分の腫瘍は腫瘍特異的抗原を表示する。し
かしながら、免疫原性腫瘍が宿主免疫性から逃げることができる1 つの理由は、
腫瘍反応性T 細胞が不適切な共刺激を受け取ることである。したがって、共刺激
分子、例えば、H4-1BBを腫瘍の中に導入すると、活性をアップレギュレートする
ことによって、細胞障害性T 細胞(CTL) の抗腫瘍免疫性を増強することができる
であろう。

【００８７】細胞特異的方式でH4-1BBL を発現させることができる。例えば、メラノサイト
特異的プロモーター、例えば、チロシナーゼプロモーターを使用して、H4-1BBL
を黒色腫中で発現させることができる。H4-1BBL を発現する黒色腫はH4-1BBを通
して細胞障害性T 細胞を刺激し、黒色腫特異的CTL を活性化するであろう。活性
化された黒色腫特異的CTL は次いでターゲット癌（例えば、黒色腫）を破壊する
ことができる。

【００８８】実施例3. 1型サイトカインを促進するC ヒトH4-1BBによるCD28の共刺激 CD28の刺激におけるH4-1BBの役割を決定するために、研究を実施した。また、
ヒトエフェクターT 細胞の発生を促進するために、CD28が追加の共刺激シグナル
を必要とするかどうかをまた研究した。その努力において、サイトカインIL-2が
Th1 細胞中のIFの産生においてCD28と共同することは知られていた。in vitroに
おいて、Th1 応答の抗原誘導プライミングのためにIL-2は絶対的には要求されな
いが、プライミングの間にIL-2が存在すると、IF（ガンマインターフェロン）を
産生する、抗原プライムドTh1 細胞の能力は増強されることが決定された。

【００８９】 Th1 細胞により産生されるIFはTh1 の発生を増幅し、かつTh2 細胞における増
殖を阻害するが、Th2 により産生されるIL-4はTh1 細胞の発生をブロックする。
いったん、T 細胞の免疫応答がTh1 またはTh2 に対して発生し始めると、それは
その方向に漸進的に極性化するようになる傾向がある。T 細胞の初期のサイトカ
インの分泌が独立の調節プロセスにより決定されるかどうかは不明瞭のままであ
る。

【００９０】 T 細胞活性化はTCR を通して供給されるシグナル、および、ほとんどCD28を通
す、共刺激と呼ぶ、第2 シグナルを必要とする。CD28シグナルの非存在下にin v
itroにおける活性化されたT 細胞は、来るべき抗原刺激に対する応答を欠如し、
アネルギー（例えば、「アネルギー化された」）として特徴づけられる。ヒトT
細胞をin vitroにおいて抗−CD28で反復的に再活性化したとき、このプロセスは
IL-2の産生を減少させ、そしてTh2 様細胞を産生するようにIL-4を誘導した。CD
28欠乏マウスにおける抗原特異的サイトカインの産生に対する応答の研究におい
て、IL-4および、より少ない程度に、IFの産生はCD28仲介シグナルにより増強さ
れることが証明された。

【００９１】 CD28シグナリングはアポトーシス、すなわち、抗−CD3 活性化ネズミおよびヒ
トT 細胞の双方における活性化誘導細胞死(AICD)として知られている現象、を防
止することが最近示された。反復したTCR エンゲージメントは、Fas またはCD28
シグナリングに対する延長した非応答性を発現する細胞の蓄積を生ずる。CD28の
応答性の低下およびFas の獲得は、通常延長した刺激後にを生じ、エフェクター
T 細胞の集団の再活性化を防止するメカニズムを提供する。したがって、長期間
のT 細胞の維持およびエフェクターT 細胞の分化のためのAICDから細胞を保護す
るために、CD28に対する追加の共刺激因子の共エンゲージメントが要求されるで
あろう。

【００９２】 Th2 型サイトカインプロフィルをもつヒトCD4+およびCD8+クローンにより、CD
30分子は優先的に発現される。CD30発現とIFの産生との間の逆相関が存在する。
4-1BB およびCD30の発現は等しく活性化依存性であり、そして主としてCD45R0+
細胞に制限される。4-1BB に対する暴露はIL-2産生およびネズミ脾T 細胞の増殖
を支持した。4-1BB はCD4+およびCD8+T 細胞の双方上で発現され、そしてp56lck
に関連づけられる。

【００９３】本明細書において、4-1BB はCD28仲介共刺激で調節的役割を演じて、1 型細胞
の発生を特異的に促進し、かつAICDを防止する。4-1BB 仲介1 型応答はCD30陽性
細胞において観察されなかった。現在の結果が示すように、それらの発現が相互
に独占的である、4-1BB およびCD30は、1 型および2 型の発生の均衡を調節する
ように反作用することができる。

【００９４】材料および方法抗体および試薬モノクローナル抗4-1BB を使用して、フローサイトメトリー分析のためにT 細
胞上で4-1BB を結合しかつ4-1BB を染色した。抗−CD28、mAb9.3（マウスIgG2）
はCarl H.June 博士から提供され、そしてCD28.2( マウスIgG1) をPharmingen(
カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。

【００９５】ヒトCD3 に対するモノクローナル抗体(OKT3、マウスIgG1) をオルト・ダイアグ
ノスチック（Ortho Diagnsotic)(マサチュセッツ州ウェストウッド）から購入し
た。フローサイトメトリーのための二次架橋ヤギ抗マウスIgG(H+L)、および抗マ
ウスIgG1-FITC を、それぞれ、ザイムド（Zymed ）( カリフォルニア州サウスサ
ンフランシスコ) およびサザーン・バイオテクノロジー・アソシエーツ( アラバ
マ州バービンガム) から購入した。

【００９６】抗IF- フィコエリトリン(PE)、抗IL-4-PE 、抗CD4-Cy- クローム、およびPE標
識化マウスIgG1イソ型対照(MOPC-21) をファーミンゲン(PharMingen)から購入し
た。4-1BBFc 、すなわち、ヒトIgG(38) のFc領域に結合したヒト4-1BB の細胞外
部分から成る融合タンパク質は、イムネックス(Immunex)(ワシントン州シアトル
）から入手した。アイソトープ対照マウスIgG をシグマ(Sigma)(ミゾリー州セン
トルイス) から購入した。T ヘルパー細胞を単離するためのモノクローナル抗体
、および補体のプレミックスカクテル(LymphoKwik)をワン・ラムダ(One Lambda)
( カリフォルニア州カノガパーク) から購入した。

【００９７】 Histopaque-1077(Sigma)密度遠心により、ヒトPBMCを健康なドナーのバッフィ
ーコートから単離した。対応するモノクローナル抗体および補体によりPBMCから
CD8+T 細胞、B 細胞、およびマクロファージ細胞を消耗させることによって、CD
4+T 細胞を精製した。CD4+T 細胞の純度は、フローサイトメトリー分析により測
定して、約85％であった。

【００９８】 1 ×10⁶細胞/ml の精製されたT 細胞またはPBMCを5 μg/mlのフィトヘムアグ
ルチニン(PHA、 Calbiochem) で4 日間活性化し、次いでPHA を洗浄除去し、引き
続いて100 μl/mlのIL-2の存在下に次に続く実験に依存して3 〜10日間拡張し、
3 日毎に新鮮なIL-2で置換した。>95 ％のT 細胞を含む生ずる細胞を以後「PHA/
IL-2細胞」と呼ぶ。増殖アッセイのために、すべてのクラスター化PHA 芽細胞が
完全に分散するようになるまで、細胞を10日間IL-2中で培養し、再活性化前に細
胞サイズを減少させた。

【００９９】T 細胞の再活性化イソ型対照マウスIgG1(MOPC-21) 、または4-1BB に対する追加の抗体、CD3 の
存在下にCD28に対する抗体または2 つの抗体の組合わせで、各々10μg/mlにおい
て、4 ℃において一夜被覆したプレート(Costar 、マサチュセッツ州ケンブリッ
ジ) 中において、精製されたCD4+T 細胞またはPBMCからのPHA/IL-2細胞を5 倍過
剰のヤギ抗マウスIgG の存在下に1 μg/mlの可溶性抗−CD3 mAb で再活性化した
。3 〜5 日間抗−CD3 で活性化した後、同一方法において抗体で被覆した新しい
プレートに細胞を移し、必要に応じて、他の活性化サイクルを反復した。

【０１００】サイトカインの産生イソ型対照マウスIgG1、抗4-1BB 、抗−CD28、および抗4-1BB と抗−CD28との
組合わせで、10μg/mlの各抗体において、被覆した24ウェルのプレート中でPHA/
IL-2細胞を抗−CD3 で再活性化した後、コンディショニングした培地を収集して
、IL-2、IF、TNF-α、IL-4、およびTGF-βを測定した。サイトカインIL-2をIL-2
依存性細胞系統、CTLL-2によりアッセイし、そしてサイトカインの残部を商業的
に入手可能なELISA キットにより測定した；IF(Endogen) 、TNF-α(Genzyme) 、
IL-4およびTGF-β(RおよびD Systems)。細胞増殖のアッセイ

【０１０１】一次T 細胞を、前述したように、3 つの連続的サイクルにより反復的に活性化
した。各3 サイクルの抗−CD3 活性化後、細胞を収集し、１μg/mlの抗−CD3 お
よび5 μg/mlの架橋性抗マウスIgG により再活性化して、96ウェルのマイクロタ
イタープレート(5×104 細胞/200μl/ウェル) 中の抗−CD3 仲介TCR 活性化にお
いて、固定化抗−CD28または抗4-1BB または双方の抗体に対する応答性を測定し
た。追加の抗4-1BB(10μg/ml) の存在または非存在下に表示した濃度の抗−CD28
を、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS) 中で96ウェルのプレート上に4 ℃において一
夜被覆した。[3H]チミジンの組込みを3 日の培養の最後の6 時間の間測定した。

【０１０２】フローサイトメトリー 4-1BB の発現を測定するために、異なる共刺激条件下に再活性化されたほぼ2
×10⁶細胞を洗浄し、100 μl の染色溶液(1％のBSA を含有するPBS ）中の2 μ
g/mlの抗4-1BB の中に懸濁させ、4 ℃において30分間インキュベートした。引き
続いて細胞を3 回洗浄し、200 μl の1 μg/mlのFITC結合抗マウスIgG1の中に再
懸濁させ、30分間インキュベートした。

【０１０３】洗浄後、FACScan(Becton Dickinson、カリフォルニア州マウンテンビュー) 上
のフローサイトメトリー分析前に、試料を1 ％のパラホルムアルデヒドで固定し
た。前方向／側面の散乱プロフィルに基づいて、ゲートを生きている細胞につい
て設定した。各場合において、少なくとも10,000の事象を各試料について収集し
た。細胞内IFおよびIL-4のレベルを測定するために、製造業者が推奨するプロト
コルに従った( 引用することによって本明細書の一部とされる) 。

【０１０４】 PHA で活性化されたPBMCを、抗4-1BB の存在または非存在下に、抗−CD3 およ
び抗−CD28により3 日間反復的に活性化し、収集し、洗浄し、それぞれ前述した
ように、表面の4-1BB およびCD30を抗4-1BB-FITCおよび抗−CD30-FITC で染色し
た。4-1BB およびCD30を同定するために、4-1BB について抗4-1BB-ビオチンおよ
びストレプトアビジン-PE を使用しかつCD30について抗−CD30-FITC を使用する
2 色の染色を使用した。

【０１０５】細胞を4 ％のパラホルムアルデヒドで固定し、そして0.1 ％のサポニンで透過
性化した後、細胞をさらに0.1 ％のサポニン中で1 μg/mlのIF-PE またはIL-4-P
E で染色した。細胞を最後に1 ％のBSA を含有するPBS の中に再懸濁させ、そし
てFACScan により2 色染色された表面のマーカーおよび細胞内のサイトカインに
ついて分析した。ある場合において、細胞内染色前に細胞を4-1BB またはCD30に
加えてCD4 について抗CD4-Cy- クロームで染色した。

【０１０６】結果それ自身のシグナル( 例えば、陽性フィードバックループ) により反復的に活
性化した後、4-1BB の最大の発現が見られた。CD28はナイーブおよびメモリーT
細胞の大部分上で発現される。CD28、4-1BB と対照的に、健康なボランティアか
ら新しく調製されたナイーブT 細胞において、他の細胞表面の分子は検出されな
かった。また、ヒトT 細胞上の最大の4-1BB の発現についての活性化条件を研究
した。4-1BB の発現はPHA または抗−CD3 刺激により誘導され、最大のプラトー
レベルは3 または4 日後であった。ピークにおいて、T 細胞の20％より小は4-1B
B 陽性であった。

【０１０７】 PHA 刺激後、10日間IL-2(100u/ml) 中で休止させると(PHA/IL-2 細胞と呼ぶ)
、4-1BB の発現はT 細胞陽性の5 ％より低く減少した。抗4-1BB の存在または非
存在下の抗−CD3 および抗−CD28によるPHA/IL-2細胞の再活性化は、4-1BB を顕
著に増加させた。T 細胞の50％より多は3 日で4-1BB 陽性となった。

【０１０８】高い4-1BB の発現は一時的であり、そして再活性化の次のサイクルのための抗
−CD28単独を使用する連続的抗−CD3 の再活性化は4-1BB の発現を維持せず、10
％より少ない4-1BB 陽性細胞を生じた。対照的に、抗−CD28共刺激との4-1BB 共
エンゲージメントは劇的の差を生じ、反復した活性化で60％より高い4-1BB 発現
の増加に導いた。この発見が示すように、高い4-1BB 発現はCD28および4-1BB の
双方からの共刺激シグナルを使用する反復したTCR 活性化を必要とする。CD28が
関与しない4-1BB 共刺激を使用する抗−CD3 活性化は4-1BB の誘導で適度の作用
のみを生じた。

【０１０９】したがって、4-1BB シグナルはそれ自身の発現において重要な役割を演じ、CD
28は本質的に止まるすることが決定された。CD28を使用するそれ自身のシグナル
の共刺激により引き起こされる、高い4-1BB 発現は、in vivo における反復抗原
投与の間の積極的フィードバックのループを通して4-1BB を発現するT 細胞に極
性化する手段を提供することができる。4-1BB シグナルは、1 型サイトカイン産
生を増強するが、2 型サイトカイン産生を抑制するように、CD28共刺激を調節し
た。

【０１１０】 4-1BB 、またはCD28、または4-1BB とCD28との組合せに対する共刺激抗体を使
用して抗−CD3 により、PHA/IL-2細胞を再活性化した。3 日の再活性化後のコン
ディショニングされる培地の中に分泌したサイトカインをアッセイした。それ以
来4-1BB はCD4+およびCD8+細胞の双方において誘導される。CD4+およびCD8+T 細
胞のエフェクター表現型に与えられた表示は、Th1 またはTh2 の代わりに、それ
ぞれ、集合的に1 型および2 型であった。4-1BB シグナルはIL-2、TNF-α、およ
びIF（これらは主として1 型サイトカインとして分類される）をCD28共刺激単独
により誘導されたレベルよりも数倍高く増強した。誘導されたサイトカインの間
で、IF( ガンマインターフェロン) は4-1BB により最も有意に増強された(7.3倍
) 。

【０１１１】 CD28共刺激を使用しない、4-1BB 単独は、有意な作用を示さなかった。CD28に
対する追加の4-1BB シグナルはその代わりにIL-4、2 型サイトカインおよびTGF-
βを、より少ない程度に、CD28共刺激単独により誘導されるレベルよりも下に増
強したことは驚くべきことであった。4-1BB シグナルは、投与量依存的方法でCD
28仲介IL-4産生を抑制した。この結果が示すように、CD28共刺激と共エンゲージ
(co-engage) するときとように、4-1BB は特異的に1 型サイトカイン産生を誘導
しかつ2 型サイトカイン産生を抑制することにおいて調節的役割を演ずる。

【０１１２】 4-1BB シグナルは、もっぱらCD30陰性細胞において、IF産生細胞集団を拡張し
た。4-1BB シグナリングによる同時の1 型サイトカイン産生の増強および2 型サ
イトカイン産生の抑制は、共刺激におけるCD28との4-1BB の共エンゲージメント
が1 型サブセットT 細胞の発生の誘導に実際に関係するかどうかに関する検査を
刺激した。フローサイトメトリーにより細胞内IFを検出することによって、IF産
生細胞が単細胞レベルにおいて同定された。

【０１１３】 PHA/IL-2細胞は、抗−CD3 および抗−CD28で再活性化するとき、全体の集団の
3 ％においてIF産生細胞を産生した。追加の抗4-1BB を使用して抗−CD3 および
抗−CD28で再活性化した同一細胞は、集団の15％より多く、IF産生細胞を増加し
た。したがって、共刺激においてCD28に対する4-1BB の共エンゲージメントの結
果として、培地中のIFの増強はIF産生細胞の増加に帰属させることができる。IF
産生細胞は直接的に4-1BB シグナルにより、あるいは間接的に促進されたサイト
カインにより、あるいは双方の組合わせにより発生されたかどうかは未知である
。

【０１１４】抗4-1BB により発生したIF産生細胞は、2 つの表面マーカー、4-1BB およびCD
30、他の誘導可能な分子によりさらに同定され、ここで誘導可能な分子はTNF レ
セプターのスーパーファミリーのメンバーとして4-1BB に対する構造的相同性を
有する。他の研究者らは潜在的Th2 マーカーとしてCD30を提案した。IF産生細胞
の大部分は4-1BB 陽性であった。

【０１１５】 4-1BB と逆に、同一IF産生細胞は主としてCD30陰性であるように見えた。これ
らの結果が示すように、多分1 型サブセット特異的4-1BB の発現のために、特異
的にIF産生であるが、CD30陰性である細胞の拡張に4-1BB シグナルは関係する。
傾斜した円錐形パターンによりドットプロットで発現されるように、細胞内IFの
強度と表面の4-1BB 発現との間の積極的相関がまた見出された。IFおよび4-1BB
発現の積極的相関は、4-1BB シグナルが新規なIF機能、ならびにIF産生細胞の発
現に直接的に関係するという見解を支持する。4-1BB タンパク質は、IL-4産生細
胞上ではなく、IF産生細胞上の優先的に発現された。

【０１１６】 4-1BB 誘導IF産生細胞はCD30を欠如したので、4-1BB 発現が1 型表現型をもつ
細胞のもっぱら制限されるかどうかを次の検査した。この開示の目的で、ガンマ
インターフェロンおよびIL-4サイトカインを、それぞれ、1 型および2 型表現型
のための代表的なマーカーサイトカインとして選択し、そして2 つのサブセット
集団において4-1BB 発現のレベルを比較した。

【０１１７】 PHA/IL-2細胞を抗−CD28および抗4-1BB を使用して抗−CD3 により3 日間再活
性化し、表面の4-1BB について染色し、引き続いてマーカーサイトカイン、IFま
たはIL-4で同定した。IF陽性およびIL-4陽性の細胞についてゲートアウトした集
団における4-1BB の発現レベルを比較した。IF産生細胞とIL-4産生細胞との間に
4-1BB の発現レベルの有意差が見出された。4-1BB 発現は、IL-4産生細胞(22.7
％) に比較してIF陽性細胞(61.7 ％) において高度に富んでいた。これらの結果
が示すように、4-1BB はランダムではなく、1 型サブセット細胞上で優先的に発
現される。4-1BB およびCD30は発現において相互に独占的である。

【０１１８】結果が示すように、IF産生細胞上の優先的4-1BB 発現およびIF産生を誘導する
その能力をベースとして、4-1BB は1 型T 細胞の分化を仲介する。他方において
、他のグループはCD30がTh2 マーカーまたはIL-4応答のマーカーであることを証
明した。また、4-1BB およびCD30の発現がT 細胞集団の2 つの異なるサブセット
にもっぱら分割されるかどうかを検査した。2 色染色を使用するフローサイトメ
トリーにより、CD4+T 細胞における4-1BB およびCD30の表面の発現を分析した。
CD4+細胞上および95％より高くCD8+であるCD4-細胞上で、4-1BB およびCD30の双
方は発現された。

【０１１９】 4-1BB はCD8+細胞上で主として発現されるので、CD8+細胞における4-1BB およ
びCD30の発現の相関を分析した。4-1BB およびCD30を発現する細胞は大きく2 つ
の別々のグループに分割され、わずかに小さい細胞の集団が4-1BB およびCD30の
双方を共有した。また、これらのCD4+細胞は同様な4-1BB およびCD30の発現パタ
ーンを発生し、互いに対して発現は相互に独占的である。これらの結果が証明す
るように、4-1BB およびCD30はT 細胞上の発現が相互に独占的であり、そして2
つの分子の相互のこの独占性はCD4+およびCD8+細胞の間におけるそれらの示差的
優勢から生じなかった。

【０１２０】4-1BB シグナルはCD30陽性細胞集団をダウンレギュレートした 4-1BB およびCD30の双方が細胞表面の分子であることを考慮して、CD30産生細
胞集団の発生における4-1BB とCD30との間の交差調節の可能性を検査した。これ
を実施するために、4-1BB またはCD30のシグナリングに応答する初期の活性化の
間に、CD30を発現する細胞の発生レベルをフローサイトメトリーにより測定した
。抗−CD3 および抗−CD28と、4-1BB およびCD30、または4-1BB およびCD30の双
方に対する追加の抗体との組合わせで、PHA 活性化した(2日間)PBMC を直ちに2
日間再活性化した。4-1BB およびCD30のシグナリングは、CD30産生細胞の発生レ
ベルにおいて互いに反作用することが決定された。

【０１２１】明らかなように、4-1BB のシグナリングは、CD28単独で再活性化した細胞のレ
ベルより下に、CD30レベルをダウンレギュレートした。CD30のシグナリングは、
4-1BB が4-1BB 発現を誘導するのと正確に同一の方法において、CD30陽性細胞集
団を増加した。4-1BB およびCD30の双方のシグナルが存在したとき、4-1BB シグ
ナルはCD30の作用を逆転した。4-1BB およびCD30のシグナリングは、アンタゴニ
ストのサイトカイン、例えば、IFおよびIL-4を解放して対応分子で細胞集団をダ
ウンレギュレートすることによって、互いの機能を交差調節することができる。

【０１２２】これらの結果が支持するように、4-1BB およびCD30は、サブセット細胞がそれ
ら自身の分子を発現するときそれらの細胞を主として維持することができる。反
復したTCR 活性化の間の4-1BB およびCD30とCD28との共エンゲージメントの調節
は、1 型および2 型の発生を極性化する他のコントロールメカニズムを提供する
ことができる。4-1BB シグナルとCD28共刺激との共エンゲージメントは、反復し
た抗−CD3 活性化の間の増殖を維持するために重大であった。

【０１２３】また、高い投与量の可溶性抗−CD3 による以前に活性化された細胞の多サイク
ルの再活性化後、有意な細胞の死が見られることが発見された。これは実質的な
量の抗−CD28の存在においてさえ真実であった。抗原、および細胞周期の進行の
ための高い濃度のIL-2に対する強い初期の増殖的応答後、TCR の再エンゲージメ
ントはアポトーシスを誘導したという他の研究者らによる最近の報告と、これら
の結果は一致する。特に高い投与量のIL-2に対する暴露後における、反復したin
vitro活性化の結果の1 つは、CD28共刺激に対する応答性の段階的減少である。
反復したTCR 活性化、すなわち、細胞死のための条件は、その代わりに、4-1BB
発現を誘導した。

【０１２４】したがって、連続的再活性化は、CD28シグナリングの非存在においてさえ、不
可逆的損傷を引き起こし、アポトーシスに導き、そして4-1BB とCD28との共エン
ゲージメントは抗−CD3 再活性化推進アポトーシスを防止することができると考
えられる。抗−CD3 および抗−CD28によるin vitroの反復した活性化の間におけ
る、細胞の増殖活性に対する4-1BB の作用を研究した。PHA 活性化T 細胞は、T
細胞の芽細胞がより小さい細胞サイズに戻るまで10日間IL-2刺激した後、4-1BB
共エンゲージメントの存在または非存在下に、抗−CD3 および抗−CD28により連
続的に再活性化した。3 サイクルの再活性化の各々の後、追加の10μg/mlの抗4-
1BB の存在または非存在下に、0.01から10μg/mlまでの連続希釈した抗−CD28で
被覆した96ウェルのプレート中で、細胞を再び抗−CD3 で再活性化した。

【０１２５】 [³H]チミジンの組込みの測定により、細胞を増殖活性について検査した。再活
性化サイクルの数が進行するにつれて、飽和抗−CD28濃度を使用してさえ、細胞
は抗−CD28に対する応答性を減少させ、より低い最大増殖プラトーを生じた。第
3 サイクルの再活性化後、T 細胞は抗−CD28単独に対してめったに応答しなかっ
た。しかしながら、CD28との4-1BB の共エンゲージメントは、欠陥のある増殖を
克服において劇的作用を発揮し、ならびに最大の発現プラトーを完全に回復した
。4-1BB シグナル単独は強いレベルの発現を示すことができなかった。4-1BB の
作用は機能的アンタゴニスト、4-1BBFc 、4-1BB の可溶性形態（それを再活性化
に含めるとき、抗4-1BB の特異性を示す）によりブロックされた。

【０１２６】抗−CD28の応答が抗−CD28の反復した活性化により弱化した後、最も有意な4-
1BB の作用が観測されたので、4-1BB 応答の主要な機能の1 つは、連続的な高い
投与量の抗原の再チャレンジの間におけるCD28との相乗的共同により、クローナ
ル拡張を維持することであるように思われる。

【０１２７】反復的に活性化されたT 細胞における細胞周期の進行に対する4-1BB の作用細胞増殖および死の事象は反復したin vitroのCD-3活性化の間に同時に起こっ
たので、細胞周期の進行およびアポトーシスの事象に対する4-1BB シグナルの作
用を決定した。これはヨウ化プロピジウムで染色されたDNA を測定することによ
って達成された。染色は再活性化の間に実施された。細胞周期およびAICDの間のアポトーシスの状態に対する4-1BB シグナルのトラ
ンスダクションの作用を検査するために、PHA/IL-2細胞を抗−CD3 、抗−CD28、
または抗4-1BB 単独で、あるいは双方の抗体の組合わせで、2 サイクルで3 日間
再活性化した。ヨウ化プロピジウムで染色した細胞のDNA 含量を、ModFitソフト
ウェアプログラムにより分析した。

【０１２８】以前の増殖結果と一致して、抗−CD28または抗4-1BB の結合単独はS 期におい
て有意な細胞集団を発生しなかった(10 ％より少ない) が、比較的高い画分がサ
ブG 期において存在し、アポトーシス細胞を表すと推定された。4-1BB およびCD
28の同時の結合はS 期において細胞集団を劇的に増加させ(40 ％より高い) 、付
随的にサブG 期の細胞を減少させた。これらの結果が示すように、4-1BB とCD28
との間の追加の共刺激は、G1/S期の移行を通して細胞の進行を増強するためにば
かりでなく、かつまた慢性的刺激の間のアポトーシス細胞死を防止するために必
須であった。4-1BB 分子は、CD28と共同して1 型サブセットの発生を促進するた
めの、調節共刺激分子である。

【０１２９】本明細書に開示するデータは、T 細胞の活性化の2 工程のモデルを支持する。
第1 工程において、T 細胞の活性化はTCR を介する抗原のシグナルとの共刺激シ
グナルとしてCD28-B7 の認識を包含する。一次T 細胞活性化の結果として、活性
化されたT 細胞は二次認知依存的認識の中に入ることができる。活性化されたAP
C により提供される、新規な調節細胞表面の分子およびそれらのリガンドは、異
なる環境に対して特異的な方法において、T 細胞とAPC との間の順次のクロス-
トーク(cross-talk)により相互作用するであろう。

【０１３０】二次活性化相において、TCR 活性化推進細胞死を防止し、ならびに、特に細胞
が多数サイクルの分裂を通して進行した後、エフェクター細胞の分化を促進する
ために、細胞はCD28-B7 の認識の外に追加のシグナルを必要とするであろう。こ
のモデルにおいて、新しい調節分子の認知依存的認識は生存または死のシグナル
を送出すように厳密に調節されなくてはならない。

【０１３１】 4-1BB の役割を描写するために、in vivo において反復的に活性化された細胞
を使用する実験モデルを採用した。CD28単独は、細胞を反復的に活性化した後、
細胞周期の維持を維持することができないように見えた。これらの結果が示すよ
うに、4-1BB およびCD28の共エンゲージメントは長期間の増殖活性を維持した。
したがって、4-1BB は細胞死を促進するCD30またはFas により複雑な調節ネット
ワークを阻害することができる。これに関して、4-1BB は二次活性化相において
1 型細胞に対して特異的に向けられた生存因子である。そのうえ、CD28との4-1B
B の共エンゲージメントは1 型表現型の応答の促進に対して、かつ4-1BB を発現
する細胞集団の特異的拡張において重大であることが示された。

【０１３２】遅延された型の過敏性(DTH) は、主としてIFを産生するTh1 集団により仲介さ
れる。Th1/Th2 調節ネットワークの変更は、局所的免疫応答の決定において重要
であろう。Th2 細胞の産生は、in vivo におけるそれらの抗炎症作用のための強
い基礎を提供する。最近、CD28/B7 経路は非肥満型糖尿病のマウスにおいて自己
抗原特異的T 細胞のためのTh2 の発生を選択的に促進することが報告された。

【０１３３】こうして、抗自己免疫Th2 細胞を誘導するための4-1BB 仲介Th1 応答のブロッ
クは、自己免疫疾患に関係する有害なDTH 反応のための抗原特異的療法のすぐれ
たアプローチである。HIV 感染の病原的進行は、また、1 型サイトカイン産生の
減少および2 型サイトカイン産生の増強に関連づけられた。したがって、1 型サ
イトカインの活性の増強は、HIV 感染の個体に介入する方法を提供するという利
益を有するであろう。CD30シグナルは、CD3 抗体に応答して、HIV 転写およびIL
-4産生の双方を増強する。したがって、抗−CD28共刺激の連続的使用はHIV-1 の
促進を防止または阻害するであろう。

【０１３４】実施例4. HIV-1 感染細胞に対して抗H4-1BB抗体の使用 4-1BB はヒト末梢血T リンパ球において検出されず、5 ％〜20％の範囲の、マ
イトジェンによる刺激および／またはCD3 の架橋により誘導され、引き続いて延
長した活性化後、段階的に減少する。4-1BB によるシグナリングは、T リンパ球
の増殖および生存の調節に関係する。

【０１３５】 4-1BBFc 融合タンパク質は、マウス脾細胞においてばかりでなく、かつまたヒ
トPBMCにおいて、抗−CD3 誘導増殖を防止し、細胞死を引き起こした。最近、CD
28分子の共刺激は4-1BB の誘導のために必須であり、引き続いて4-1BB は連続的
刺激のとき陽性フィードバックループとしてそれ自身の発現を増強することが決
定された。CD28および4-1BB の双方からの組合わされた共刺激から生ずる4-1BB
シグナルは、引き続いて細胞の生存およびエフェクター細胞の発生を促進した。

【０１３６】 HIV-1 感染において、CD28およびCD8+T 細胞の数とHIV-1 関係疾患との間にお
いて観測される有意な相関により発現されるように、CD28の発現はダウンレギュ
レートされる。他の研究者らによる以前の研究が示すように、CD28に対する可溶
性モノクローナル抗体を介するCD4+T 細胞の共刺激は、in vitroにおけるHIV-1
感染および複製を促進した。これらの結果に比較して、HIV-1 の個体からのCD4+
T 細胞を固定化された抗−CD3 ＋固定化された抗−CD28 mAbで刺激したとき、HI
V-1 ウイルスの負荷が減少した、ポリクローナルCD4+T 細胞細胞の数が増加した
。

【０１３７】HIV-1 感染誘導からのT リンパ球における4-1BB の役割 40のHIV-1 陽性の個体および12のHIV-1 陰性の個体からのT 細胞上の4-1BB の
発現レベルを比較した。また、TCR/CD3 仲介シグナルに対する応答を損傷した、
HIV-1 陽性の個体からのT 細胞を、4-1BB 共刺激、およびHIV-1 ウイルスの負荷
に対する4-1BB 結合の作用により回復させることができるかどうかを検査した。

【０１３８】材料および方法患者 HIV-1 感染患者の血液試料は、Wishard Hospital Department of Medicine 、
Division of Infections Diseasesにおける外来患者のクリニックから入手した
。この研究は55のHIV-1 陽性の個体をカバーし、それらのうちの47はCD段階II/I
IIとして分類され、そして18はHIV-1 に関係する疾患を有する( 段階IV) として
分類された。12性別および年齢の匹敵する健康なドナーを対照として研究した。

【０１３９】抗体および試薬抗4-1BB モノクローナル抗体(mAb) 、BBK-1 、BBK-2 、BBK-3 およびBBK-4 を
以前に記載されたように製造した。BBK-1 およびBBK-4 はT 細胞活性化のための
アゴニストであり、そしてこの研究において使用した。BBK-2 およびBBK-3 は4-
1BB アンタゴニストであり、また、この研究のために発生させ、使用した。精製
されたBBK-1 をFITC(Pierce 、イリノイ州ロックフォード) と製造業者の使用説
明書に従いインキュベートすることによって、FITC結合抗4-1BB mAb を発生させ
た。

【０１４０】抗−CD28 mAb、9.3 は、Carl June 博士(Naval Medical Research Institute
、マリイランド州ベセスダ) から提供された。抗−CD3 mAb はオルト(Ortho) か
ら購入した。抗4-1BB mAb/Cychrome、抗CD8 mAb/Cychromeおよびイソ型対照のmA
b は、ファーミンゲン(Pharmingen)( カリフォルニア州サンディエゴ）から入手
した。ヤギ抗マウスIgG(M-450)と結合した磁気ビーズをダイナル(Dynal)(ニュー
ジャージイ州レイクサクセス) から購入した。

【０１４１】細胞および細胞の刺激ヒト末梢血単核細胞(PBMC)を、Histopaque 1077(Sigma 、ミゾリー州セントル
イス) 密度遠心により、EDTA抗結合血液から調製した。Lymphokwik(One Lambda
Inc.、カリフォルニア州カノガパーク) を製造業者の使用説明書に従い使用する
陰性消耗により、CD4+T 細胞をPBMCから調製した。簡単に述べると、PBMCをLymp
hokwik Th 単離溶液で37℃において45分間処理し、次いで5 分間遠心した。フロ
ーサイトメトリー分析によると、CD4+T 細胞の純度は約85〜90％であり、T 細胞
は5 ％より低かった。

【０１４２】培地は10％の胎仔ウシ血清(Hyclone、ユタ州) 、ペニシリン(50u/ml)、ストレ
プトマイシン(50 μg/ml) 、および2mM のグルタミン(Sigma) を補充したRPMI 1
640(Life Technologies,Inc.)(RPMI-CM)であった。RPMI-CM 中において3 日間PH
A(Calbiochem、5 μg/ml) で活性化する前または後に、PBMCを使用した。示した
濃度の抗−CD3 mAb とBBK-4 または9.3 または双方との組合わせで被覆した、平
らな底の96ウェルのマイクロタイタープレート(Costar Corporation 、マサチュ
セッツ州ケンブリッジ) の中に、新しく単離したCD4+T 細胞(2.5×104/ウェル)
を添加した。

【０１４３】リン酸塩緩衝生理食塩水、pH7.3(PBS)中で4 ℃において一夜、培養プレートへ
の抗体の固定化を実施した。いくつかの実験において、150gの各抗体／磁気ビー
ズの添加により、mAb を磁気ビーズ(M-450、 Dynal) に結合し、ウイルス誘導研
究において3:1 の磁気ビーズ／CD4+T 細胞の比において添加した。新鮮なCD4+T
細胞をPHA(5 μg/ml) および組換えIL-2(20U/ml)(Boehringer,Mannheim、インジ
アナ州インジアナポリス) を10日間培養し、新鮮なIL-2を3 日毎に交換すること
によって、ポリクローナルCD4+T 細胞系統を発生させた。前述したように、共刺
激抗体の存在下に96ウェルのプレート中で、ポリクローナルT 細胞系統からのCD
4+T 細胞の芽細胞(5×10⁴/ウェル) をさらに3 日間培養した。4-1BB cDNAでトラ
ンスフェクトされたJurkat細胞(J8-1)を調製し、RPMI-CM 中で維持した。

【０１４４】フローサイトメトリー分析細胞を染色し、FACScan(Becton Dicknson)上で、Hurado et al. 、J.Immunol.
、150:771-781(1993) に記載されているように、分析した。簡単に述べると、新
鮮な細胞を1 回洗浄し、1 ％のBSA を含有するPBS 中で3 回培養した。ほぼ2.5
〜5 ×10⁵細胞を希釈したmAb を含む200 μl のPBS-1 ％のBSA の中に再懸濁さ
せ、氷上で30分間インキュベートした。2 回洗浄した後、細胞を1 ％のパラホル
ムアルデヒドで固定した。前方向／側面の散乱プロフィルに基づいてリンパ球で
ゲートした細胞について、フローサイトメトリー分析を実施した。

【０１４５】増殖アッセイ四重反復実験のウェル中の細胞を5 日間刺激し、次いで5 時間[3H]チミジン(T
dR)(NEN 、マサチュセッツ州ボストン）で1.0Ci/ウェルにおいてパルスした。刺
激された細胞の[³H]の計数／分(CPM) を非刺激細胞のそれらで割ることによって
、刺激指数を計算した。

【０１４６】RT活性のアッセイ Willey et al.(J.Virol.、62:139-47 、1988) が記載するように、下記の変更
を加えて、ヴィリオン関連逆転写酵素(RT)活性を測定した：50mMのTris、pH7.8
、7.5mM のMgCl₂、2mM のジチオスレイトール(DTT) の中に鋳型プライマーポリ
(A)(5 μg/ml) 、Oligo(dT)(1.57μg/ml)(Pharmacia)および10μg[³H]dTTP(Amer
sham Corp.、イリノイ州アーリントンハイツ) を含有する混合物の25μl に、5
μl の7 日の培養上清を三重反復実験において添加した。

【０１４７】 37℃において2 時間インキュベートした後、6 μl の混合物をDE81紙上にスポ
ッティングし、空気乾燥し、2 ×SSC(150mM の塩化ナトリウム／15mMのクエン酸
ナトリウム、pH7.0)緩衝液中で5 回洗浄し、95％のエタノール中でさらに2 回洗
浄した。紙を乾燥し、切断し、シンチレーションカウンター上で計数した。

【０１４８】遺伝子のトランスフェクションおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT) 活性のアッセイヒトJurkatT リンパ球および4-1BB トランスフェクトされたサブライン(subli
ne) 、J8-1、を、Bressler(J.Immunol. 、147:2290-94 、1991) が記載するよう
に、DEAE-Dextran法により、PHIV-1-LTR-CATプラスミド(20 μg/10⁷細胞) で一
時的にトランスフェクトした。ルシフェラーゼ遺伝子を正規化のために共トラン
スフェクトした。

【０１４９】トランスフェクション後24時間に、細胞を固定化mAb で示すように、またはPH
A(5 μg/ml) ＋PMA(10ng/ml)で24時間刺激した後、収集した。全細胞の抽出物を
トランスフェクタントから調製し、そして0.1 μCi(3.7kBq)の¹⁴C-クロラムフェ
ニコール、4mM のブチル- 補酵素A および0.25M のTris-HCl、 pH7.4を含有する
150 μl の最終体積で37℃において一夜CAT 活性のアッセイを実施した。結果を
クロラムフェニコールからそのモノアセチル化形態への変換百分率で与える。ル
シフェラーゼ活性の正規化後に4 つの独立のトランスフェクタントから、値を得
た。

【０１５０】統計学的解析データを平均±SDとして表す。両側スチューデントのt 検定を使用して、グル
ープの間の差の意味を決定した。「 r 」線形相関係数を使用して、相関を計算し
た。結果 HIV-1PBMC からのCD4+およびCD8+T 細胞上の4-1BB の発現：臨床的相関 40のHIV-1 感染被検体および12の血清反応陰性対照を、免疫蛍光サイトメトリ
ーによりT 細胞上の4-1BB の発現について検査した。in vivo 刺激の前に、HIV-
1 感染または対照の個体からの未刺激T リンパ球上で、4-1BB の発現レベルは検
出できなかった。PHA 刺激後、4-1BB を発現する細胞の百分率は、HIV-1 陰性の
対照の個体におけるよりもHIV 陽性の個体において有意に高かった。4-1BB の発
現レベルばかりでなく、かつまた4-1BB ＋T 細胞の集団はHIV-1 陽性の個体にお
いて増加したことに注意すべきである。

【０１５１】 3 グループ内のCD4+およびCD8+T 細胞上の4-1BB 発現の分布は、HIV-1 対照に
おいてCD4+T 細胞の10.9％であり、そして無症候性HIV-1 陽性の個体の間におい
てCD4+T 細胞の28.9％であった(p<0.01)。4-1BB は段階IVｎｏ個体においてCD4+
T 細胞の30.9％上で発現された。対照と段階II/IIIの患者のT 細胞の間の4-1BB
発現の差は、CD4+T 細胞におけるよりも8+T 細胞においていっそう深遠であった
。

【０１５２】さらに、無症候性個体に比較して、4-1BB 8+T 細胞の有意な増加は段階IVの患
者( メジアン47.9％) において見出された(p<0.05)。段階II/IIIの個体において
、CD4+およびCD8+T 細胞の間の4-1BB 発現において有意な相関が存在した(r=0.7
2 、p<0.01) 。また、すべてのHIV-1 陽性の個体において、絶対CD4+細胞計数と
4-1BB を発現する8+T 細胞の百分率との間の逆の相関(r=0.63 、p<0.05) が存在
した。

【０１５３】4-1BB 共刺激に対するCD4+T 細胞の増殖的応答 4-1BB シグナルおよびCD3 刺激は、一次T 細胞の増殖のためには十分ではなか
った。したがって、抗4-1BB および抗−CD28 mAbの相乗的作用を試験し、そして
抗−CD3 mAb(1 μg/ml) とともに、組織培養プレート上に固定化された抗4-1BB(
10μg/ml) の存在または非存在下に、連続希釈の抗−CD28(0〜10μg/ml) を使用
して、３人のHIV-1 健康なドナーからのCD4+T 細胞の増殖を測定した。CD4+T 細
胞をmAb とともに5 日間培養し、[³H]TdR の吸収により、細胞の増殖を測定した
。1 μg/mlの抗−CD28 mAbは4-1BB 共刺激活性と共力することができることが見
出された。

【０１５４】これらの結果に基づいて、組合わされた抗−CD28(1μg/ml) および抗4-1BB mA
b(10μg/ml) を使用して、HIV-1 陽性の個体からのCD4+T 細胞の増殖に対する4-
1BB 共刺激の機能を研究した。9 人のHIV-1 陽性の個体からのPBMCから精製した
CD4+T 細胞(CD4+ の計数：468 ±142)を、5 日間の培養後に増殖について検査し
た。4-1BB シグナル単独は、HIV-1 陽性の個体のCD4+T 細胞において刺激活性を
ほとんど示さなかった。しかしながら、CD28による次善の刺激を加えたとき、4-
1BB の架橋を使用してCD4+T 細胞の増殖は起こった。さらに、HIV-1 個体と比較
して、HIV-1 感染した個体において、CD4+T 細胞の増殖の応答は低いことが決定
された。さらに、より低い増殖はより低いCD4+T 細胞の計数に対応した。

【０１５５】H4-1BB共刺激およびHIV-1 産生 CD4+T 細胞におけるHIV-1 産生に対する4-1BB 共刺激の作用を研究するために
、プレート結合またはビーズ結合したmAb によりCD4+T 細胞を刺激した。HIV-1
産生を逆転写酵素(RT)活性により測定し、そして刺激指数(SI)により表示される
ように、細胞の増殖を[³H]TdR により測定した。陰性の対照のメジアンよりも3
標準偏差だけ高い値により、RT活性の陽性の限界値を設定した。10人の試験した
個体の間で陽性のウイルスの複製( 刺激グループの少なくとも1 つから) を有し
た6 人のHIV-1 ＋患者からの結果を、表1 に要約する。

【０１５６】 7 日の培養後、これらのグループにおける細胞はほとんど生き残らなかったの
で、いくつかのグループの増殖指数を決定しなかった。2 人の患者において、RT
活性は組合わされたCD28および4-1BB 共刺激のグループのみから検出され、CD28
単独のグループから検出されなかったが、双方のグループは同様な刺激指数を示
した。3 人の患者において、RT活性は組合わされたCD28および4-1BB 共刺激のグ
ループにおいて、CD28単独のグループと比較して、同様であるか、あるいはわず
かに高かった。すべてのこれらの6 人の患者において、CD3 刺激のグループまた
はCD3 刺激＋4-1BB 共刺激のグループにおいて、ウイルスは検出されなかった。

【０１５７】また、刺激後にウイルスを産生したCD4+T 細胞の大部分は、CD4 計数がより低
い患者からものであることが見出された。9 人の患者のうちの6 人からのデータ
を表2 に示し、ここで6 人の患者のT 細胞はDynal M450ビーズに結合したmAb で
刺激され、そして刺激グループの少なくとも1 つからRT活性を産生した。プレー
ト結合したmAb の刺激と比較して、ビーズ結合mAb により仲介される刺激はRT活
性レベルがより高く、多分ビーズ上に固定化されたmAb がより強いシグナルを与
えることを示す。ビーズに結合したmAb の刺激は、CD3 およびCD3 ＋4-1BB 刺激
のグループにおいてさえ細胞を増殖させることができるであろう。

【０１５８】したがって、ウイルスの複製において4-1BB 共刺激単独の機能を観測すること
ができるようになった。表2 に示すように、組合わされたCD28および4-1BB 共刺
激はすべてのドナーからのCD4+T 細胞培養物からウイルスを産生した。RT活性は
、CD28共刺激単独と比較して、CD28および4-1BB の組合わされた共刺激により1.
2 倍〜11倍増加した。2 人のドナーにおいて他の抗4-1BB mAb(BBK-4)を使用した
とき、同様な結果得られた。

【０１５９】重要なことには、ウイルスはまた抗4-1BB mAb 単独の共刺激において検出され
たが、これらのグループにおいて7 日の培養後に、刺激指数は非常に低かった。
表1 および2 に要約するデータから示唆されるように、4-1BB を介する共刺激は
CD4+T 細胞活性化を生じ、引き続いて、ウイルス産生を増強する。HIV-1 産生に
ついてのこれらの活性化シグナルは、増殖応答を仲介するものと一致することが
ある。

【０１６０】

【表１】

【０１６１】

【表２】

【０１６２】3HIV-1＋個体からのポリクローナルCD4+T 細胞系統における4-1BB 共刺激およびウイルスの複製 4-1BB シグナルはHIV-1 感染した個体からのCD4+T 細胞におけるHIV-1 の複製
を増強するという発見をさらに確証するために、ポリクローナルCD4+T 細胞系統
を6 人の無症候性個体からPHA およびIL-2で10日間刺激することによって発生さ
せた。培養上清からRT活性は検出されないか、あるいは非常に低いRT活性が検出
された。引き続いて、これらの細胞を固定化抗−CD3 mAb および追加の共刺激抗
体で3 日間刺激した。ウイルスのレベルは、抗−CD3 mAb 刺激単独よりも、4-1B
B 共刺激において有意に高かった(p<0.05)。

【０１６３】対照的に、ウイルスのレベルはCD3 刺激グループよりもCD28共刺激グループに
おいて高かったので、これらの2 つのグループの間で統計的意味は見出されなか
った。この研究において、増殖指数はこれらのグループのすべてにおいてほとん
ど同一であった。ポリクローナルCD4+T 細胞系統からのこれらの結果は、表1 お
よび2 に示す一次CD4+T 細胞の刺激から得られた結果と一致した。総合すると、
4-1BB 共刺激はHIV-1 感染CD4+T 細胞の培養物におけるウイルスの産生を増強す
ることがデータから示唆される。

【０１６４】4-1BB 結合はJurkat細胞系統におけるLTR 推進転写を増強する J8-1細胞系統はJurkatの下位系統であり、そして高いレベルの4-1BB を構成的
に発現する4-1BB トランスフェクタントである。J8-1をpHIV-1＋LTR-CAT で一時
的にトランスフェクトし、引き続いて固定化共刺激mAb またはPHA ＋PMA で活性
化した。フローサイトメトリーにより検出可能な4-1BB を発現しない親Jurkat細
胞を対照として使用した。刺激グループにおけるCAT 活性のレベルを、フォルド
オーバー(fold over) 非刺激対照として示した。イソ型対照と比較して、J8-1に
おいて固定化抗−CD3 mAb において、1.9 倍のCAT 活性の増加が観測された。抗
4-1BB mAb それ自体はJS-1においてCAT 活性を増加しなかった。

【０１６５】しかしながら、固定化抗−CD3 mAb と組合わせたとき、抗4-1BB mAb はイソ型
対照と比較してCAT 活性の5.8 倍の増加を与えるか、あるいは抗−CD3 mAb 刺激
単独と比較して3.2 倍の増加を与えた。4-1BB 刺激はCD3 ＋CD28の組合わされた
刺激に対して追加の作用を有した。親Jurkat細胞において、4-1BB 共刺激は抗−
CD3 mAb 単独と比較して1.2 倍より高いCAT 活性を産生した。親Jurkat細胞にお
ける4-1BB 共刺激からのCAT 活性のこれらのわずかの増加は、活性化の間に誘導
された少量の4-1BB 発現から生ずる増加であろう。これらのデータから、1 ）TC
R ／CD3 との4-1BB 共刺激はHIV-1-LTR の転写を増強する；2 ）4-1BB は抗−CD
3 ＋抗−CD28刺激に追加の刺激作用を提供する、ことが示された。

【０１６６】考察このデータの結果が示すように、CD4+およびCD8+T 細胞の双方において4-1BB
を発現するT 細胞の相対的比率は、PHA 刺激後、HIV-1 血清反応陽性個体から増
加し、そして8+T 細胞上の4-1BB の相対的発現はCD4+T 細胞の計数に相関し、こ
れらは疾患の重症度および進行に関係づけることができる。4-1BB 分子は急速に
発現され、そして48〜72時間の間にそのピークに到達した。発現されたH4-1BBの
レベルは刺激後72時間までに減少し始め、究極的に正常レベルに戻った。いった
んこれらの細胞が再活性化されると、各細胞上の4-1BB のレベルおよび4-1BB を
発現する細胞の数は増加することが決定された。

【０１６７】 HIV-1 感染の間、HIV 抗原の刺激後の初期段階において、T 細胞はプライミン
グされるが、数週後、これらのあるものはメモリー細胞の特性を獲得し、同一組
の活性化マーカーを発現し続ける。この組のマーカーはHLA-DRおよびCD38を包含
する。これらは4-1BB の発現が休止T 細胞上で見出されないという発見を説明す
ることができ、これはそれ自体in vivo におけるHIV-1 抗原に応答するCD4+4-1B
B+T 細胞の連続的活性化および死に関係づけられる。次いで、in vitro刺激後の
HIV-1 感染した個体のT リンパ球上の4-1BB 発現の増加は、HIV-1 感染における
免疫活性化の現在の状態ばかりでなく、かつまたin vivo 急性感染の間のHIV-1
抗原によりチャレンジされたメモリー- プライムド細胞の状態を反映するであろ
う。

【０１６８】再刺激後のCD4+T 細胞上の4-1BB 発現の増加は、ウイルス複製の増加に関係づ
けられる。HIV-1 感染において、感染した細胞の古典的HLA 制限細胞溶解反応お
よびある分泌されたCD8 細胞の抗ウイルス因子を含む非細胞溶解的メカニズムを
通して、8+T 細胞はHIV-1 複製の抑制においてある役割を演ずる。4-1BB は、細
胞表面の分子として、HIV-1 感染においてCD8+細胞上のその発現を増加し、8+T
細胞の増殖および抗ウイルス機能に関係することができる。HIV-1 患者において
、CD8+細胞は、抗4-1BB mAb で刺激されるとき、一般にCD4+T 細胞よりもいっそ
う激しく増殖する。

【０１６９】可溶性抗−CD3 の存在または非存在下のCD28と可溶性mAb との結合は、HIV-1
感染ドナーから調製されたCD4+T 細胞からのウイルスを誘導することが報告され
た。しかしながら、HIV-1 陽性ドナーからのCD4+T 細胞を固定化抗−CD3 および
抗−CD28 mAbで活性化すると、ウイルス耐性状態が誘導された。この作用はマク
ロファージ向性HIV-1 に対して特異的であり、そしてCCR5、融合因子のダウンレ
ギュレーションの結果であるように見える。統計的有意差は見出されなかったが
、固定化9.3 によるCD28の結合はあるHIV-1 感染ドナーからのHIV-1 複製を事実
増加した。

【０１７０】この観察は、他の報告と異なり、ビーズ上の抗−CD3 または抗−CD28 mAbの固
定化方法のためであろう。ビーズ固定化されたmAb を使用する研究において、4-
1BB からの追加のシグナルはHIV-1 陽性ドナーからの一次CD4+T 細胞からのウイ
ルスの複製を増強することが示された。正確な量の抗−CD28 mAbおよび抗−CD3
mAb を組合わされたCD28および4-1BB 共刺激およびCD28共刺激のグループにおい
て使用したので、ウイルス産生の増強を追加の4-1BB シグナリングから考慮すべ
きである。

【０１７１】さらに、ウイルスは4-1BB 共刺激単独により誘導された。あるドナーにおいて
、ウイルスのレベルはCD28共刺激によりそれよりも高いが、4-1BB 共刺激に応答
する一次CD4+T 細胞の刺激指数は非常に低かった。ポリクローナルCD4+T 細胞系
統において、4-1BB 共刺激とCD3 刺激単独との間の統計的有意差が見出された。
この比較は各グループ内の同様な刺激指数に基づいた。これらの研究から、HIV-
1+個体からのCD4+T 細胞における4-1BB およびCD3 の架橋はウイルスの産生を誘
導することが示された。ウイルスの産生に対する4-1BB 共刺激の機能はT 細胞の
増殖に対する機能と相関せず、多分HIV-1 誘導を仲介する細胞の経路が、突然変
異誘発的刺激のそれらに類似するが、同一ではないことを示唆するであろう。

【０１７２】 in vitroにおけるHIV-1 の発現をアップレギュレートする、多数の因子が報告
されてきている。TNF-α、抗−CD30 mAb、HIV Tat タンパク質を包含するこれら
の因子の多数は、HIV-1-LTR の中に存在するNF- κB エンハンサーを通してHIV-
1 転写を活性化する。実施された実験において、HIV-1-LTR のトランス活性化は
抗−CD3 および抗4-1BB mAb の組合わせにより得られたことが示された。

【０１７３】これらの結果から、HIV-1 の病原性における4-1BB のいくつかの潜在的役割が
示唆される：(1) 4-1BB は潜在的に感染した細胞におけるウイルスゲノムの転写
を直接的にアップレギュレートする；(2) 4-1BB および4-1BB リガンドの相互作
用は抗原性刺激の存在下にCD4+T 細胞のウイルス複製を活性化することができる
；(3) 4-1BB 共刺激は結果CD4+T 細胞を活性化することができ、結局、活性化さ
れたCD4+T 細胞を優先的に感染する、新しく産生されたヴィリオンの効率よい増
殖を促進することができる；(4) HIV-1 感染CD4+T 細胞に対する4-1BB 仲介シグ
ナルはアポトーシスに結合することができ、感染した細胞の早期の死を生ずる。

【０１７４】これらの結果が証明するように、免疫活性化および疾患の進行に相関するin v
itro活性化後、4-1BB 発現はHIV-1 感染PBMCにおいて増加された。HIV-1 感染CD
4+T 細胞における4-1BB の結合は、NF- κB 経路を通して仲介されるとき、in v
itroのウイルス複製を増強した。4-1BB 共刺激経路が感染を初期段階において混
乱するか、あるいは故意に妨害する場合、ウイルスの負荷はより低くなるようで
ある。次いで、これはCD4+T 細胞の引き続く損失を防止し、免疫受容能を維持す
る働きをするであろう。8+T 細胞細胞上の4-1BB 発現の増加は、HIV-1 感染にお
ける免疫不全の程度に関係づけられる。

【０１７５】実施例5. ヒトCD4+T 細胞の接着における4-1BB の役割ヒト4-1BB タンパク質はT 細胞の細胞表面の分子である。ヒト一次T 細胞およ
び2 つのT 細胞系統、すなわち、CEM およびJurkat、とのT 細胞の接着における
4-1BB の役割を研究することによって、4-1BB 共刺激はT 細胞の接着を劇的に誘
導することが発見された。抗4-1BB のシグナリングはPMA ／イオノマイシンの刺
激と一緒に、4-1BB を高いレベルで発現するCEM 細胞の特色を示さない細胞接着
を引き起こした。対照的に、4-1BB を検出可能なレベルで発現しないJurkat細胞
は、フィブロネクチン(FN)に対する細胞接着において抗4-1BB に対する応答をほ
とんど示さなかった。

【０１７６】 Jurkat細胞を4-1BB を産生するようにトランスフェクトしたとき、Jurkat細胞
は抗4-1BB 刺激によりFNに応答して接着する能力を獲得した。Jurkatトランスフ
ェクタント中の細胞接着に対する4-1BB シグナリングの付加における抗−CD3 刺
激についての絶対的共通要件は、抗4-1BB により引き起こされる接着が、4-1BB
とFNまたは抗4-1BB との間の直接的相互作用よりむしろ接着シグナリングの活性
化を通して、仲介されることを示唆する。この方法において、4-1BB 共刺激のシ
グナルは、CD28共刺激を接着の応答で仲介することによって、T 細胞の接着を増
幅する。

【０１７７】接着の研究のための抗体および試薬モノクローナル抗4-1BB 、BK-4、また、4B4-1 （マウスIgG ）と呼ばれる、を
使用して、T 細胞上の4-1BB を刺激しかつ免疫染色した。抗4-1BB をフローサイ
トメトリー分析のためにビオチンと結合させた。抗−CD28、mAb9.3( マウスIgG2
a)は、C.H.June博士(Nava Medical Research Institute、マリイランド州ベセス
ダ）から提供された。モノクローナル抗−CD3(OKT3) は、オルト・ダイアグノス
チック(Ortho Diagnostic)( マサチュセッツ州ウェストウッド) から購入した。
二次架橋性ヤギ抗マウスIgG(H+L)はザイムド(Zymed)(カリフォルニア州サウスサ
ンフランシスコ) から購入した。

【０１７８】ブロッキング抗インテグリンb1はイムノテク(Immunotech)( ネブラスカ州ウェ
ストブルック) から購入した。ヒトIgG1のFc領域とカップリングしたH4-1BBの細
胞外部分から成る融合タンパク質、すなわち、4-1BBFc はイムネックス(Immnex)
( ワシントン州シアトル）から入手した。ビオチンと結合したイソ型構造マウス
IgG1(MOPC-21) は、ファルミンゲン(PharMingen)( カリフォルニア州サンディエ
ゴ）から購入した。ヒトフィブロネクチンはFred Pavalko博士(Indiana Univaer
sity) から入手した。T 細胞を単離するためのモノクローナル抗体と補体とのプ
レミックスカクテルは、ワン・ラムダ(One Lambda)( カリフォルニア州カノガパ
ーク) から購入した。

【０１７９】フローサイトメトリー選択したT 細胞を抗−CD3 および抗−CD28で3 日間刺激しかつ再刺激し、そし
て異なる共刺激mAb に応答する増殖および接着のアッセイのために使用した。CE
M 、すなわち、ヒト白血病性T 細胞系統を、接着アッセイの前に、PMA(10ng/ml)
およびイオノマイシン(IgM) で刺激した。Jurkatヒト白血病性T 細胞系統をpcDN
A3および全体の4-1BB cDNAでトランスフェクトし、そして制限希釈によりネオマ
イシン耐性クローンについて選択した。トランスフェクタントの細胞表面上の4-
1BB の発現レベルをフローサイトメトリーにより測定した。

【０１８０】 T 細胞(2×10⁵細胞) を染色溶液、200ml の1 ％のBSA を含有するPBS 中の2
μg/mlのビオチンと結合した抗4-1BB の中に懸濁させ、4 ℃において30分間イン
キュベートした。引き続いて細胞を3 回洗浄し、200ml の1 μg/mlのフィコエリ
トリン(PE)結合ストレプトアビジンの中に再懸濁させ、30分間インキュベートし
た。洗浄後、試料を1 ％のパラホルムアルデヒドで固定し、次いでFACScan(Bect
on Dicknson 、カリフォルニア州マウンテンビュー) 上でフローサイトメトリー
分析に付した。ビオチン結合抗4-1BB のイソ型対照のために、ビオチン結合マウ
スIgG(MOPC-21 、PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。前
方向／側面の散乱プロフィルに基づいて、ゲートを生きている細胞上に設定した
。各試料のための、10,000事象を収集した。

【０１８１】平らな底のポリスチレンの96ウェルのマイクロタイタープレート(Costar 、マ
サチュセッツ州ケンブリッジ) に抗体およびFNを固定化し、40℃において抗4-1B
B 、抗−CD28で、PBS 中の10μg/mlまたはそうでなければテキスト中に示されて
いる濃度において一夜被覆した。ある場合において、抗体溶液に対照として各々
0.1 μg/mlのFNまたはBSA を添加した。次いでプレートをすすいで非接着タンパ
ク質を除去し、そして最終洗浄後直ちに細胞をプレートに添加した。抗4-1BB を
ブロックするために、T 細胞を200 μg/mlの[-5'Cr] クロム酸ナトリウムで37℃
において1 時間標識化し、抗−CD28、抗4-1BB または双方の抗−CD28および抗4-
1BB で被覆した96ウェルのプレート(5×10¹細胞/ ウェル) に移した。

【０１８２】一次およびJurkat細胞についての接着アッセイのために、抗体に加えてFNで被
覆されるプレートを使用した。細胞を37℃において一酸化炭素のインキュベータ
ー中で示した時間の間インキュベートした後、前もって加温した培地でプレート
を洗浄して非結合細胞を除去し、そしてプレートに結合したままの細胞を1 ％の
SDS(ドデシル硫酸ナトリウム) 中の溶解した。ライゼイトを反応性について計数
し、そして結合／ウェルに添加した全体のcpm の比として、結合した細胞の百分
率を計算した。CEM 細胞についての接着アッセイをプレート中で実施し、ここで
FNを抗体被覆において省略した。Jurkat4-1BB トランスフェクタントについての
接着アッセイを、1 μg/mlの可溶性抗−CD3 の存在または非存在下に実施した。

【０１８３】増殖についてのアッセイ前述したように抗−CD3 および抗−CD28で反復的に刺激した一次T 細胞を、共
刺激抗−CD28または抗4-1BB でまたは10μg/mlの抗−CD28＋示した濃度の追加の
抗4-1BB で被覆した96ウェルのプレート中において、1 μg/mlの可溶性抗−CD3
および5 μg/mlの二次抗マウスIgG でさらに活性化した。ある場合において、次
善の0.1 μg/mlのFNを含む固定化共刺激抗体で細胞を共刺激した。3 日後、1.0/
ウェルの[³H]チミジンの6 時間のパルス−標識化により増殖速度を測定した。

【０１８４】 4-1BB シグナルは、培養プレートに対するPMA ／イオノマイシン刺激CEM 細胞
の特色を示さない細胞接着を誘導した。CD28および4-1BB は増殖およびIL-2産生
と同様にT 細胞を共刺激することができるが、2 つの分子の1 つの明らかな差は
それらの発現モードである。ほとんどのT 細胞において構成的に発現するCD28に
比較して、4-1BB の発現は高度に調節される。ヒトリンパ腫の大部分からの4-1B
B 分子は検出されなかった。

【０１８５】試験したT 細胞系統は、Jurkat、CEM 、Molt-4、およびHUT-78を包含した。し
かしながら、CEM 細胞は、PMA ／イオノマイシン刺激のとき、活性化一次T 細胞
により誘導されたものに比較して極めて高いレベルに4-1BB を容易に誘導するこ
とにおいて例外的である。CEM 細胞は、PMA ／イオノマイシン刺激後、芽細胞と
なり、凝集したが、培養プレートに接着しないままであった。

【０１８６】実験の間に、刺激したCEM 細胞はプレート結合抗4-1BB に対して激しく応答し
、培養プレートに完結に拡大することが明らかとなった。応答は非常に強かった
ので、外部の刺激接着レセプターのリガンドは不必要であった。PMA ／イオノマ
イシン刺激されたCEM 細胞の80％より多くは、1 時間以内に抗4-1BB に応答して
培養プレートに堅固に結合した。反対に、以前に刺激されず、したがって、検出
可能な4-1BB を産生しないCEM 細胞は抗4-1BB に対してまったく応答しなかった
。CD28は主要な細胞表面の分子であるので、抗−CD28に対するCEM 細胞の応答を
試験して、CEM 細胞のこの誘導が4-1BB 共刺激に対してユニークであるかどうか
を決定した。抗4-1BB と対照的に、CD28は刺激されたCEM 細胞および非刺激CEM
細胞の双方について細胞接着を誘導しなかった。

【０１８７】顕著な共刺激はCEM 細胞接着において4-1BB およびCD28から結果であり、2 つ
の細胞表面の分子はオーバーラップしないシグナルを送出すことが示される。そ
れらの抗原がCEM 細胞表面に豊富に存在するが、4-1BB を使用するとき見られる
ような応答が観測されない、いくつかの抗4-1BB mAb を試験した。4-1BB シグナ
ルはCEM 細胞の形態を変更した。また、CEM 細胞における顕著な形態学的変化は
抗4-1BB に応答する培養プレートへの堅固な結合の直後であることが決定された
。

【０１８８】 CEM 細胞は培養の間に分散した形態に止まり、通常PMA ／イオノマイシン刺激
後にクラスターとなった。刺激された細胞を固定化抗4-1BB に暴露したとき、細
胞の形状は劇的に変化した。PMA ／イオノマイシン刺激後の抗4-1BB シグナルは
、丸い細胞を鋭いスパイクをもつ細長い繊維芽細胞の形状に完全に変更した。こ
の観察から、4-1BB シグナルは細胞を培養プレートへの細胞接着に適合させる、
細胞骨格の再配列を誘導することができること示唆される。抗−CD28を使用して
同様な形態学的変化は観測されなかった。

【０１８９】しかしながら、抗4-1BB により引き起こされる接着および形態学的変化は、細
胞の増殖速度に影響を与えなかった。4-1BB 共刺激シグナルはFNへのJurkat細胞
の接着を誘導した。CEM 細胞はT 細胞活性化において4-1BB の役割を誘発するた
めのすぐれたモデルを提供したが、主として4-1BB 刺激の間に4-1BB を産生する
PMA ／イオノマイシン刺激のために、結果を解釈するために障害が存在した。同
時の多重シグナルは、最終の結果の原因となる4-1BB の作用の識別を困難とした
。このPBMCを回避するために、4-1BB 発現を誘導する前の刺激を使用しないで、
4-1BB を構成的に発現する、安定なT 細胞のトランスフェクタントを発生させた
。

【０１９０】 Jurkat細胞は4-1BB を検出可能なレベルで発現しなかった。発現プラスミドpc
DNA3の中に挿入された4-1BB cDNAを使用して、4-1BB を産生するようにJurkat細
胞をトランスフェクトした。G418選択後、最低から最高の順序で4-1BB 、17-2、
8-1 および2-7 を異なるレベルで発現する、3 つのトランスフェクタントのクロ
ーンが得られた。親および各々のJurkatトランスフェクタントの4-1BB 発現を、
フローサイトメトリーにより測定した。最高の4-1BB 産生体、トランスフェクタ
ント、2-7 、の4-1BB の発現レベルは、CEM において見られるものよりも、なお
10倍低かった。したがって、T 細胞におけるインテグリン仲介接着を主として支
持するプレート結合した次善のFN(0.1μg/ml) への４ｄ仲介細胞接着のために、
親Jurkatおよびこれらのトランスフェクタントを使用した。

【０１９１】 FNに加えてイソ型対照b1、抗−CD28、抗4-1BB または双方の抗−CD28および抗
4-1BB で被覆したプレートを使用して、細胞接着アッセイを実施し、そして可溶
性抗−CD3 の存在または非存在下に37℃において1 〜5 分培養した後、プレート
に結合した細胞を測定した。抗−CD3 の存在下にのみ親Jurkat細胞は抗4-1BB に
対して即座に応答したが、4-1BB トランスフェクタントは応答しなかった。

【０１９２】 Jurkat4-1BB トランスフェクタントからのデータは、4-1BB に応答する細胞接
着が4-1BB の発現レベルに依存する方法で起こることを明瞭に示した。最高の応
答はトランスフェクタント2-7 において見られたが、最低の応答はトランスフェ
クタント17-2において見られた。同一条件下に、対照Igおよび抗−CD28 mAbは、
飽和濃度において試験したすべての細胞について、このような細胞接着を誘導し
なかった。

【０１９３】 4-1BB およびCD28のシグナルが互いに相互作用するかどうかを検査するために
、双方の抗4-1BB および抗−CD28の存在下の細胞接着レベルを測定した。試験し
た。2 つの共刺激シグナルは相乗的により高い細胞接着を生じた。したがって、
4-1BB は最大の接着応答のためにCD28シグナリングを必要とするように見える。
抗−CD3 の存在下に検出された抗体仲介接着応答は、抗−CD3 が存在しないとき
、完全に壊滅された。4-1BB 仲介細胞接着における抗−CD3 の決定的な要件は、
この細胞接着が4-1BB と抗4-1BB またはFNとの間の相互作用ではなく、むしろに
細胞接着経路への中間のCD3 シグナリングより簡単な引き起こされたことを示す
。

【０１９４】総合すると、4-1BB およびCD28の双方は共刺激T 細胞であるが、4-1BB の役割
はFNへのT 細胞の接着の誘導においてCD28と異なる。抗4-1BB シグナルを通す細
胞接着は、CEM において見られるように、Jurkat細胞において増殖速度を変化さ
せなかった。4-1BB 発現は反復したCD3 活性化により漸進的に増加した。以前の
研究およびヒト末梢血T 細胞との連結は、抗4-1BB 活性化の間の4-1BB 発現パタ
ーンを使用する、1 系列のフローサイトメトリー実験を通して強化された。

【０１９５】 4-1BB の発現レベルは、健康な個体から新しく調製されたT 細胞の約2 ％のみ
であった。レベルは反復したin vitroの抗−CD3 および抗−CD28の活性化を通し
て増加した。抗−CD3 および抗−CD28で3 〜4 日間刺激したT 細胞は約20％の細
胞が4-1BB 陽性であることを示したが、レベルはピーク後段階的に減少した。抗
−CD3 および抗−CD28の非存在下にIL-2中の活性化された細胞の数は拡大された
。4-1BB の発現レベルは、IL-2中の培養の間に漸進的に減少した。

【０１９６】しかしながら、抗−CD3 および抗−CD28を使用して再刺激するとき、4-1BB 陽
性の細胞数および発現レベルの双方における4-1BB の劇的増加が得られ、4-1BB
を使用して50％のより大きい陽性の細胞を生じた。追加の抗4-1BB シグナルを抗
−CD3 および抗−CD28の刺激に付加するとき、反復した刺激サイクルは4-1BB の
発現レベルをなおより高く漸進的に増加した。これらの観察から示唆されるよう
に、4-1BB を産生する細胞集団は、反復した刺激の間の追加の4-1BB 共刺激のた
めに、増殖上の利点を有することができる。

【０１９７】 T 細胞の大きい部分は、4-1BB 発現に関して延長して活性化した後でさえ、4-
1BB の発現をなお記録した。4-1BB シグナリングは、主としてインテグリンを通
して、一次T 細胞の接着を誘導した。抗−CD3 および抗−CD28を使用して3 日間
の連続的刺激サイクルにより活性化されたヒト一次T 細胞を調製して、細胞の4-
1BB 発現を増加させた。再刺激の前に、細胞をIL-2中で7 日間維持した。各刺激
工程後、CEM およびJurkat細胞において観測されるように、活性化された一次T
細胞を次善のFNに対する細胞接着を誘導できるかどうかを決定した。

【０１９８】 1 時間後、可溶性抗−CD3 の存在下に0.1 μg/mlの次善のFNに加えて抗−CD28
または抗−CD28および抗4-1BB で被覆したプレートに結合した細胞の百分率を決
定した。抗−CD3 単独または抗−CD3 および抗4-1BB はFNに対する無視できる接
着を誘導したが、抗−CD28共刺激は次善のFNで被覆したプレートに対して約16％
の結合を生じた。しかしながら、活性化されたT 細胞を双方の抗4-1BB および抗
−CD28により共刺激したとき、細胞接着の劇的増加が見られ、1 時間後、プレー
トに堅固に結合した50％の細胞を生じた。アッセイにおいて使用した刺激したT
細胞の約50％のみが4-1BB を発現したことを考慮すると、観測された細胞接着は
達成可能な最大レベルであったと言うことができる。

【０１９９】反復した再刺激によりさらに活性化された細胞は、シグナル抗−CD28単独に対
する応答性を段階的に喪失したが、抗−CD28および4-1BB の双方からの組合わさ
れたシグナルに対して喪失しなかった。インテグリン、主として(X401(CD49d/CD
29) およびa5b1(CD49e/CD29)は主としてFN相互作用を伝達するための主要な接着
分子である。FNに対する4-1BB 誘導細胞接着がインテグリンにより仲介されるか
どうかを決定するために、接着アッセイ前にインテグリンb1に対するブロッキン
グmAb と細胞をインキュベートした。抗4-1BB により誘導される接着は、抗イン
テグリンを使用する前処理の結果として、50％より高く効果的に阻害された。

【０２００】これらの結果が示すように、4-1BB はFNとの直接的アソシエーションに関係す
るよりむしろ、FN相互作用を促進するようにインテグリンを活性化することがで
きる。ネズミ4-1BB はFNに対して強いアフィニティーを有することが知られてい
るが、4-1BB とFNとの間の直接的相互作用はこの細胞接着における主要な力であ
るように思われない。FNはCD28共刺激に対する相乗的4-1BB 作用を増強した。4-
1BB およびCD28はFNに対するT 細胞の接着を促進するために共同したが、細胞接
着の応答が増殖の応答のための4-1BB とCD28との間の相乗性に影響を与えるかど
うかを決定した。

【０２０１】 CD28と共同的に働く場合、4-1BB の作用がFNによりさらに増幅されると仮定さ
れた。事実、FNそれ自体はT 細胞を共刺激して、T 細胞活性化のための抗原の限
界値を減少させることが示された。この可能性を試験するために、抗−CD28、抗
4-1BB 、または双方の抗体により共刺激された活性化一次T 細胞の増殖の応答に
おけるFNの作用を決定した。抗4-1BB の作用を最大化するために、0.5 μg/mlの
次善の抗−CD28濃度を選択した。なぜなら、それは抗−CD3 による限界的増殖の
みに導くからである。これらの条件下に、FNの存在または非存在下に抗−CD28仲
介増殖に対する抗4-1BB の作用を決定した。抗4-1BB 単独は高度に精製されたヒ
トT 細胞を抗−CD3 で適度に共刺激する。

【０２０２】しかしながら、抗4-1BB は次善の抗−CD28が高い増殖応答に導くことができる
させ、共刺激においてCD28と4-1BB との間に明確な共同が存在したことが示され
る。次に、このCD28との4-1BB の共同がFNにより増幅されるかどうかを決定した
。実験の結果により、CD28と4-1BB との間の相乗的共同がFNにより大きく増強さ
れることが証明された。この実験において使用した次善のFN濃度は、CD28または
4-1BB をほとんど共刺激しなかった。次善のCD28およびFNの影響下に、細胞は4-
1BB シグナルの存在により抗−CD3 活性に完全に応答することができた。これに
より示されるように、4-1BB の主要な役割は、TCR 共刺激および細胞接着を一体
化することによって、抗原の活性化に応答するようにT 細胞を増感することであ
る。

【０２０３】 T 細胞の増殖の応答に対する抗4-1BB の作用は、4-1BBFc 、すなわち、4-1BB
に対する競合的ブロッキング因子を培養に含めるとき、完全に壊滅され、抗4-1B
B の特異性が示された。4-1BB のシグナリングは、CD28の共刺激に必要なCD3 シ
グナルの限界値を低下させた。共刺激シグナルは抗原の限界値を低下させること
ができる。強化された共刺激入力は抗原刺激の限界値を低下させることができる
。CD28共刺激に対する相乗的4-1BB の作用がCD3 シグナルの限界値をさらに低下
させることができるかどうかを決定するために、増殖により測定したT 細胞の活
性化に必要な抗−CD3 濃度を滴定により測定した。

【０２０４】抗−CD28、抗4-1BB または双方抗−CD28および抗4-1BB による異なる共刺激条
件下に、抗−CD3 濃度を0.01、0.1 および1mg/mlで変化させることによって、活
性化された一次T 細胞を増殖させた。CD28共刺激に対する4-1BB の相乗的作用は
0.1mg/mlの抗−CD3 で高い増殖を可能とし、この濃度は、細胞が抗−CD28または
抗4-1BB の単独で共刺激される場合、比較的低い増殖の応答に導くであろう濃度
であった。

【０２０５】このような高い増殖の応答は、細胞を抗−CD3 単独で共刺激したときよりも10
より高い抗−CD3(1mg/ml) により達成された。したがって、有効な抗−CD3 濃度
はCD28共刺激に対する4-1BB のエンゲージメントにより低下させることができる
であろう。しかしながら、抗4-1BB 共刺激単独は適度の増殖を生じた。これらの
結果が証明するように、4-1BB シグナルはCD28との共同により抗−CD3 の限界値
の低下において顕著な衝撃を発生する。

【０２０６】 CD28共刺激に対する4-1BB の作用を確認するために、10mg/lの固定した抗−CD
28濃度において抗4-1BB の量を増加させて共刺激条件下に0.1mg/mlの抗−CD3 に
対するT 細胞増殖の応答を測定した。CD28共刺激に対する4-1BB の相乗的作用は
投与量依存的方法であることが、結果により示された。したがって、4-1BB シグ
ナルは接着の応答を増強することによってCD28仲介T 細胞活性化を相乗化し、こ
れによりより低い抗−CD3 濃度で高い増殖の応答を可能とすることが示された。

【０２０７】この4-1BB の機能は、慢性的免疫反応の間の制限された共刺激シグナルにおい
て連続的に活性化されるか、あるいは生き残ることが要求されるT 細胞について
重要であるすることがある。特に、T 細胞の免疫監視機構をしばしばダウンレギ
ュレートする免疫原性が弱い腫瘍細胞を根絶するために、細胞障害性T 細胞の応
答を増幅することにおいて、4-1BB の役割は重大であることがある。4-1BB によ
り促進された接着応答は、腫瘍細胞に対する8+T 細胞の細胞障害性の4-1BB 仲介
増幅のための、主要な仲介経路であることがある。

【０２０８】T 細胞のインテグリン活性化インテグリン活性のアップレギュレーションは数分以内にT 細胞の活性化によ
り誘導され、インテグリンレセプターの機能の定量的変更が示唆される。インテ
グリンは、FNまたは他の適当なECM タンパク質の存在下に突然変異誘発より低い
レベルの抗−CD3 により活性化されたT 細胞を共刺激する。インテグリンa4b1お
よびa5b1はフィブロネクチン(FN)または小胞細胞接着分子1(VCAM-1) に結合し、
FN共刺激されたT 細胞の増殖および細胞内CA+2のシグナリングの仲介において主
要な役割を演ずる。T 細胞のFN仲介接着はインテグリンの活性化および結合活性
を示す。

【０２０９】 T 細胞を活性化するレセプターは、CD3/TCR 複合体およびCD2 、CD7 、CD28お
よびサイトカインを包含する。T 細胞をホルボールエステル、PMA またはCA+ イ
オノホア、イオノマイシンで処理すると、また、インテグリン活性はアップレギ
ュレートされ、タンパク質キナーゼC および細胞内カルシウムをこの調節事象と
関係づける。インテグリンはアソシエートされた細胞内細胞骨格タンパク質であ
り、そしてアクチンの末端はフォーカル接着として知られている細胞結合構造に
繊維束応力を加える。

【０２１０】インテグリンの刺激は究極的にRho 依存的フォーカル接着の形成に導き、これ
はパクシリンのチロシンリン酸化ならびにFAK 、Src およびCsk のメンバーの活
性の変化により達成される。CD28、すなわち、T 細胞上の糖タンパク質は、また
、FN、VCAM-1および細胞内接着分子-1(ICAM-1)に対する接着を増加させる。b1-
インテグリン依存的接着のCD28仲介調節1:1 は、ホスファチジルイノシトール-3
- キナーゼ(PI3-K) のアソシエーションを含む。CD28は、IL-2遺伝子の発現を生
ずる、T 細胞活性化のための細胞表面の分子として適切に特徴づけられた。

【０２１１】細胞接着に対する4-1BB の作用は抗−CD3 を絶対的を必要としたが、抗−CD28
を必要としなかった。こうして、4-1BB の機能は抗原活性化により厳密にコント
ロールされる。Jurkat細胞の接着においてCD28および4-1BB のシグナルの間で相
乗性が存在し、こうして内部から外への接着応答に適合するようにTCR シグナル
を促進する下流の経路のために、4-1BB はCD28共刺激を補足する機能をすること
ができる。

【０２１２】一次T 細胞の初期の活性化後、細胞特異的リガンドまたはECM に対する1 系列
の接着応答もまたT 細胞の増殖を共刺激する。インテグリン活性化は、それらの
リガンドに対する結合活性を増強するためにTCR シグナルを必要とする。4-1BB
および接着分子の双方の発現は延長したTCR 活性化を必要とすることがあり、そ
して4-1BB は細胞接着を活性化することができ、活性化されたT 細胞を高い活性
化状態に維持し、これは特に弱い抗原提示において陽性のフィードバック増幅ル
ープにより4-1BB 発現を増強する。4-1BB の発現は高度にin vitroCD28共刺激に
依存的であり、したがって、一次T 細胞における4-1BB およびCD28共刺激の相関
はJurkat4-1BB トランスフェクタントにおけるそれらよりもいっそう複雑なであ
る。

【０２１３】抗−CD3 シグナルの限界値のそれ以上の低下における4-1BB およびCD28の本質
的共存により示される2 つの分子の共同は、接着分子の活性化に主として帰属さ
れる。したがって、4-1BB は抗原レセプターのシグナリングの限界値を低下し、
これによりエフェクターT 細胞の機能に影響を与えるという作用を有する。TCR
シグナリングの強度は、主として共刺激により影響を受け、また、サイトカイン
、例えば、IFおよびIL-2の産生パターンに影響を与える。4-1BB 仲介増幅された
T 細胞の応答は、細胞障害性T 細胞上の接着分子のアップレギュレートされた結
合活性からか、あるいは免疫原性が低い腫瘍の抗原性限界値を低下させるH4-1BB
の能力から適切に生ずることができる。

【０２１４】引用文献および参考文献引用することによって本明細書の一部とされる 1. Smith 、C.A.、Davis 、T.、Anderson、D.、Solam 、L.、Beckmann、M.P.
、Jerzy 、R.、Dower 、S.K.、Cosman、D.、およびGoddwin 、R.G.、1990、腫瘍
壊死因子のレセプターは細胞およびウイルスのタンパク質の異常なファミリーを
定める、Science 248:1019-1023 。 2. Ebina 、Y.、L.Ellis 、K.Jaruagin、M.Edery 、L.Graf、E.Clauser 、J.
On、F.Marizrz 、Y.W.Kan 、J.D.Goldfine、R.A.RothおよびW.J.Rutter、1985、
ヒトインスリンレセプターcDNA：ホルモン活性化された膜貫通シグナリングのた
めの構造的基準、Cell 40:747 。 3. Vassali 、R.、R.Tedghi、B.Listowska-Bernstein 、A.Tartakoff および
J.C.Jaton 、1979、マウスB リンパ球膜結合IgM の重鎖内の疎水性領域について
の証拠、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:5515。

【０２１５】 4. Haskins 、K.、R.Kubo、J.White 、M.Pigeon、J.Kappler およびP.Marrac
k 、1983、T 細胞I 上の主要な組織適合性複合体- 制限抗原レセプター。モノク
ローナル抗体を使用する単離、J.Exp.Med. 157:1149 。 5. Lesslaver 、W.およびH.Gmunder 、1986、ヒトT 細胞の9.3 抗原の生化学
的特性決定：細胞表面におけるジサルファイド結合90kDa の二量体および遊離サ
ブユニットの刺激発現、Mol.Immunol. 23:271 。 6. Van Lier、R.、J.Borst 、T.Vroom 、H.Klein 、P.Mourik、W.Mourik、W.
Zeijlemaker およびC.Melife、1987、Tp55(CD27)新規な分化抗原の組織分布およ
び生化学的および機能的性質、J.Immunol. 139:1589 。 7. Mallet、S.、S.FossumおよびA.Barclay,1990、活性化CD4 陽性T リンパ球
- 神経成長因子のレセプターに関係する分子のMRC OX40抗原の特性決定、EMBO J
. 9:1603。 8. Banchereau、J.、P.Paoli 、A.、Valle 、E.GarciaおよびF.Roussel 、19
91、インターロイキン-4およびCD40に対する抗体に依存する長期間のヒトB 細胞
系統、Science 251:70。

【０２１６】 9. Moeller 、D.L.、M.K.Jenkins およびR.H.Schwartz、1989、クローナル拡
張／機能的クローナル不活性化：共刺激シグナリング経路はT 細胞抗原レセプタ
ーの占有の結果を決定する、Ann.Rev.Immunol. 7:445。 10. June、D.H.、J.A.Ledbetter 、P.S.Linsley およびC.B.Thompson、T 細胞
の活性化におけるCD28レセプターの役割、Immunol.Today 11:211。 11. Yang、L.、B.Jones 、A.Aruffo、K.M.Sullivan、P.S.Linsley およびC.A.
Janeway 、Jr. 、1992、熱安定性抗原はCD4 T 細胞の成長のための共刺激分子で
ある、J.Exp.Med. 175:437。 12. Yamori,T. 、1992、神経の多様性および特異性の発生の分子のメカニズム
：有糸分裂後のニューロンの発生におけるポリペプチド因子のフォールス(foles
) 、 Neuroscience Res. 12:545 。 13. Liu,Y.J.、 D.E.Joshua 、G.T.Williams、C.A.Smith 、J.GordonおよびI.
C.M.MacLennan 、1989、胚中心における抗原推進選択のメカニズム、Nature 342
:929。

【０２１７】 14. Jabara、H.H.、S.M.Fu、R.S.Geha、およびD.Vercelli、1990、CD40および
IgE ：高度に精製されたヒトB 細胞によるIgE 合成の誘導における抗CD40モノク
ローナル抗体とインターロイキン-4との間の相乗性、J.Exp.Med. 172:1861 。 15. Defrance、R.B.Vanbervliet 、F.Briere、I.Durnad、F.Roussle およびJ.
Banchereau、1992、インターロイキン10および形質転換性成長因子b は共同して
抗CD40活性化されたナイーブヒトB 細胞を誘導して免疫グロブリンA を分泌させ
る、J.Exp.Med. 175:671。 16. Donahue 、T.、Cigan 、A.、Pahich、E.およびValavicius、B.、酵母elF-
2b遺伝子におけるZn(II)フィンガーモチーフにおける突然変異は走査プロセスの
間のリボソーム開始部位の選択を変更する、Cell 54(1988)621-632。

【０２１８】 17. Carthew 、R.W.およびRubin 、G.M.、アブセンチア(absentia)、ショウジ
ョウバエ(Drosophila)の眼におけるR7細胞ラットの規格に必要な遺伝子における
7 つ、Cell 63(1990)561-577。 18. Driscoll、D.M.およびWilliams、J.G.、発生の間の誘導可能な、共調節さ
れたディクチィオステリウム・ディスコイデウム(Dictyostelium dicoideum) お
よび環状AMP の2 つの発散的に転写された遺伝子、Mol.and Cell.Biol. 7(1987)
4482-4489 。 19. Chalupny、N.J.、 Peach、R.、Hollenbaugh 、D.、Ledbetter 、J.A.、Fa
rr、A.G.およびAruffo、A.、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10360-10364 。 20. Noelle、R.J.、およびSnow、E.C.、1991、The FASEB J. 5:2770-2776。 21. Noelle、R.およびSnow、E.、1990、Immunol.Today 11:361-368。

【０２１９】 22. Zurawski、G.、Benedik 、M.、Kamb、B.J.、Abrams、J.S.、Zurawaki、S.
M.およびLee 、F.D.、1986、Science 232:772-775 。 23. Kinachi 、T.、1986、Nature 3235:70-73 。 24. Gershenfield、H.K.およびWissman 、I.L.、1986、Science 232:854-858
。 25. Biggin、M.、Gison 、T.およびHung、G.、1983、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
80:3963-3965 。 26. Hodgkin 、P.D.、Yamashita 、L.C.、Coffman 、R.L.およびKehry 、M.R.
、1990、J.Immunol. 145:2025-2034。 27. Barlett 、W.C.、McCann、J.、Shephaer、D.M.、Roy 、M.およびNoelle、
R.J.、1990、J.Immunol. 145:3956-3962。

【０２２０】 28. Kwon、B.S.、Kestler 、D.P.、Eshhar、Z.、Oh、K.、およびWakulchik 、
M.、1989、2 つの潜在的T 細胞メディエイター遺伝子の発現特性、Cell Immunol
. 121:414-422 。 29. Armitage、R.、Fanslow 、W.、Strockbine、L.、Sato、T.、Clifford、K.
、MacDuff 、B.、Anderson、D.、Gimpel、S.、Davis-Smith 、T.、Maliszewski
、C.、Clark 、E.、Smith 、C.、Grabstgein、K.、Cosman、D.およびSpriggs 、
M.、1991、Nature 357:80-82。 30. Kwon、B.、Kestler 、D.、Lee 、E.、Wakulchik 、M.およびYoung J.、19
88、J.Exp.Med.。 31. Noelle、R.J.、Roy 、M.、Shepherd、D.M.、Stamenkovic 、I.、Ledbette
r 、J.A.およびAruffo、A.、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6550-6554 。 32. Hollenbaugh 、D.、Grosmaier 、L.S.、Kullas、C.D.、Chalupny、N.J.、
Braesch-Andersen、S.、Noelle、R.J.、Stamenkovic 、I.、Ledbetter 、J.A.お
よびAruffo A. 、1992、EMBO J. 11:4314-4321。

【０２２１】 33. Schall、T.J.、M.Lewis 、K.J.Koller、A.Lee 、G.C.Rice、G.H.W.Wong、
T.Gatanaga、G.A.Granger 、R.Lentz 、H.Raab、W.J.Koher およびD.V.Goeddel
、1990、ヒト腫瘍壊死因子のレセプターの分子クローニングおよび発現、Cell 6
1:361 。 34. Klein 、R.、Nanduri 、V.、Jing、S.、Lamballe、F.、Tapley、P.、Brya
nt、S.、Cordon-Cardo、C.、Jones 、K.R.、Reichardt 、L.F.およびBarbacid、
M.、1991、Cell 66:395-403 。 35. Armitage、R.J.、Sato、T.A.、Macduff 、B.M.、Cliford 、K.N.、Alpert
、A.R.、Smith 、C.A.およびFanslow 、W.C.、1992、Eur.J.Immunol. 22:2071-2
076 。 36. Hintzen 、R.Q.、deJong、R.、Hack、E.E.、Chamuleau 、M.、de Vries、
E.F.R.、ten Berge 、I.J.M.、およびvan Lier、R.A.W.、1991、J.Immunol. 147
:29-35。 37. Mallett 、S.、およびBarclay 、A.N.、1991、神経成長因子のレセプター
に関係する細胞表面のタンパク質の新しいスーパーファミリー、Immunol.Today
12:220-223。

【０２２２】 38. Kwon、B.S.およびWeissman、S.M.、1989、2 つの誘導可能なT 細胞遺伝子
のcDNA配列、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1963-1967 。 39. Johnson 、D.、Lanaham 、A.、Buck、C.R.、Sehgal、A.、Morgan、C.、Me
rcer、E.、Bothwell、M.、およびChao、M.、1986、ヒトNGF レセプターの発現お
よび構造、Cell 47:545-554 。 40. Stamenkovic 、I.、Clark 、E.、およびSeed、B.、1989、神経成長因子の
レセプターに関係しかつ癌腫中のサイトカインにより誘導された、AB- リンパ球
の活性化分子、EMBO J. 8:1403-1408 。 41. Pollok、 K.E. 、 Y-J Kim、 Z.Zhou 、 J.Hurtado、 K.K.Kim、およびB.
S.Kwon、1993、誘導可能なT 細胞抗原4-1BB ：発現および機能の分析、J.Immuno
l. 150:771。 42. Antibody Lab Manual 、1988、編者:E.Harlow およびD.Lane、Cold Sprin
g Harbor Lab. 。 43. Pelchen-Matthews,A. 、 J.E.Armes、 G.Griffiths、およびM.Marsh 、19
91、リンパ球および非リンパ球細胞中のCD4 の示差的エンドサイトーシス、J.Ex
p.Med. 173:575。

【０２２３】 44. Biffen、 M. 、 D.McMichael-Phillips 、 T.Larson 、A.Venkitaraman、
およびD.Alexander 、1994、CD45チロシンホスファターゼはヒトT 細胞における
抗原レセプター関連P59 およびCD4 関連p56lckチミジンキナーゼの特異的プール
を調節する、EMBO J. 13:1920 。以上の記載は、例示および説明のための特許法の要件に従い本発明の特定の態
様に向けられて来た。しかしながら、当業者にとって明らかなように、本発明の
範囲および精神から逸脱しないで多数の変更および変化が可能である。下記の請
求の範囲はすべてのこのような変更を包含することを意図する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図1 は、T 細胞活性化の認知相に関係する分子を図解する。

【図２】図2 は、T 細胞活性化の後期部分において起こるT 細胞のクローナル拡張に関
係する分子を図解する。

【図３】図3 は、正常T 細胞活性化経路の休止部分を図解する。

【図４】図4 は、正常T 細胞活性化経路の間の「プライムド」細胞を図解する。

【図５】図5 は、非自己、抗原提示細胞の存在により活性化された、活性化T 細胞を図
解し、正常T 細胞活性化経路の結論を表す。

【図６】図6 は、Ｔ細胞活性化経路における工程をブロックするために使用される、そ
れぞれ、アネルギー化T 細胞CTLA4-1g単独、4-1BB/APとCTLA4-1gとの組合わせ、
および4-1BB/AP単独を図解する。

【図７】図7 は、T 細胞活性化経路をブロックするときの4-1BB/APとCTLA4-1gとの組合
わせを図解する。

【図８】図8 は、T 細胞活性化経路における工程をブロックするために使用するときの
4-1BB/AP単独を図解する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 29/00 １０１Ａ６１Ｐ 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 14/705 ＺＮＡＣ０７Ｋ 14/705 ＺＮＡ 16/28 16/28 19/00 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/08 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＦターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA92X AA93Y CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA17 AA20 AA24 BA02 BA44 DA39 DA45 MA17 MA35 MA52 MA66 ZA961 ZB022 ZB071 ZB081 ZB151 ZB261 ZC012 ZC351 4C085 AA13 AA14 BB11 DD63 EE01 GG01 GG08 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA50 DA76 EA22 EA28 FA72 FA74 【要約の続き】た細胞で処理することができ、そしてB 細胞の増殖を誘導することができる。H4-1BBリガンドの結合をブロックするためのH4-1BBの使用は、器官の移の間の免疫系の抑制において、あるいは糖尿病、慢性関節リウマチ、および狼瘡を包含する自己免疫疾患に対する、実際的用途を有する。この技術の他の用途は、HIV-1 感染個体および癌腫を治療する方法の開発を包含する。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】第1 のH4-1BBレセプターのリガンドが少なくとも1 つのT 細
胞と接触し、これによりそれを活性化させるように、有効量の前記レセプターの
リガンドを投与することを含んでなる、T 細胞の活性化を増強する方法。
【請求項２】投与される前記H4-1BBレセプターのリガンドがアゴニスト性
抗−H4-1BBモノクローナル抗体である、請求項1 に記載の方法。
【請求項３】投与される前記H4-1BBレセプターのリガンドがアンタゴニス
ト性抗−H4-1BBモノクローナル抗体である、請求項1 に記載の方法。
【請求項４】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドがH4-1BBタンパク質
である、請求項1 に記載の方法。
【請求項５】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを0.20μmol 〜2.0
μmol に等しいか、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日の
回数で投与する、請求項1 に記載の方法。
【請求項６】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドの投与を医薬製剤、
例えば、錠剤または静脈内注射剤の投与により達成し、ここで前記第1 のH4-1BB
レセプターのリガンドの投与は前記少なくとも1 つのT 細胞の活性化における前
記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドの有効性を減少させない、請求項5 に記載
の方法。
【請求項７】さらに、第2 の刺激分子を前記第1 のH4-1BBレセプターのリ
ガンドと組み合わせて投与し、これによりこれらの化合物の各々が前記少なくと
も1 つのT 細胞と接触するようにさせることを含む、請求項1 に記載のT 細胞の
活性化を増強する方法。
【請求項８】前記第2 の刺激分子が、本質的に、 a) 抗−CD3 抗体； b) 抗−CD28抗体；および c) CD28タンパク質；から成る群より選択される、請求項7 に記載の方法。
【請求項９】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを0.20μmol 〜2.0
μmol に等しいか、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日の
回数で投与し、そして前記第2 の刺激分子を0.10μmol 〜2.0 μmol に等しいか
、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日の回数で投与する、
請求項5 に記載の方法。
【請求項１０】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドおよび前記第2 の
刺激分子の投与を医薬製剤、例えば、錠剤または静脈内注射剤の投与により達成
する、請求項5 に記載の方法。
【請求項１１】第3 の刺激分子の使用をさらに含み、前記第2 の共刺激分
子が抗−CD3 抗体であり、そして前記第3 の刺激分子が抗−CD28抗体である、請
求項9 に記載の方法。
【請求項１２】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンド、前記第2 の刺激
分子、および前記第3 の刺激分子の投与を医薬製剤、例えば、錠剤または静脈内
注射剤の投与により達成する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】第1 有効量のH4-1BBレセプターのリガンドを投与し、こう
して前記化合物を少なくとも1 つのT 細胞と接触するようにさせ、そして前記H4
-1BBタンパク質を第2 の刺激分子と共同して働かせ、こうしてこれらの双方の化
合物が前記少なくとも1 つのT 細胞と接触するようにさせる、ことを含んでなる
、癌腫が減少するように癌腫を処置する方法。
【請求項１４】前記第2 の刺激分子が、本質的に、 a) 抗−CD3 抗体； b) 抗−CD28抗体；および c) CD28タンパク質；から成る群より選択される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを2.0 μmol 〜8.
0 μmol に等しいか、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日
の回数で投与し、そして前記第2 の刺激分子を0.10μmol 〜2.0 μmol に等しい
か、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日の回数で投与する
、請求項13に記載の方法。
【請求項１６】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドおよび前記第2 の
刺激分子の投与を医薬製剤、例えば、錠剤または静脈内注射剤の投与により達成
する、請求項13に記載の方法。
【請求項１７】 CD4+およびCD8+T 細胞のサイトカイン産生を増強する方法
において、 a) 有効量の3 つの化合物を同時に投与し、前記3 つの化合物は： i) 抗H4-1BB抗体； ii) 抗−CD3 抗体； iii) 抗−CD28抗体；を含んでなり、前記投与は前記3 つの化合物の各々が少なくとも1 つのT 細胞と
接触するようになるように実施される、ことを含んでなる方法。
【請求項１８】その産生が増強されるサイトカインが、 a) ガンマインターフェロン(IF); b) インターロイキン-1(IL-1); c) インターロイキン-10(IL-10); d) B 細胞成長因子(BCGF); e) B 細胞分化因子(BCDF); および f) インターロイキン-2(IL-2); から成る群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】 H4-1BBタンパク質に対するアンタゴニストの有効量を投与
することを含んでなり、前記アンタゴニストはH4-1BBレセプターへのH4-1BBタン
パク質の結合を防止することができ、前記アンタゴニストそれ自体はCD4+または
CD8+T 細胞を活性化することができない、ことを特徴とする自己免疫反応を処置
する方法。
【請求項２０】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを0.20μmol 〜2.
0 μmol に等しいか、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日
の回数で投与する、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドの投与を医薬製剤
、例えば、錠剤または静脈内注射剤の投与により達成する、請求項19に記載の方
法。
【請求項２２】前記処置される自己免疫反応が自己免疫疾患に関連する反
応であり、前記自己免疫疾患が、 a) 真性糖尿病； b) 慢性関節リウマチ; および c) 全身性エリテマトーデス; から成る群より選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】器官移植後に起こる自己免疫反応を抑制するために、自己
免疫反応を防止する前記方法を使用する、請求項19に記載の方法。
【請求項２４】既知量の組織中のH4-1BBの発現レベルを測定することによ
って、病原性ウイルスHIV-1 により引き起こされる後天性免疫不全症の進行レベ
ルをモニターする方法において、 a) CD8+T 細胞の試料を収集し、 b) 細胞を分画し、ライゼイトを保持し、そして前記H4-1BBタンパク質に対し
て向けられた1 または2 以上のモノクローナル抗体を使用して、H4-1BBについて
試験し、 c) 前記1 または2 以上の抗体を他の分子に結合させ、前記分子はシンチレー
ションカウンターまたは蛍光顕微鏡または抗体の結合の程度の測定に有用な他の
手段により検出することができ、そして d) CD8+T 細胞の前記試料中のH4-1BBの発現レベルを測定し、同等の組織の型
の同一サイズの試料中のH4-1BBの正常の発現レベルを反映する既知の測定値と比
較する、ことを含んでなる方法。
【請求項２５】 H4-1BBタンパク質に対するアンタゴニストの有効量を投与
することを含んでなり、前記アンタゴニストがH4-1BBレセプターのリガンドへの
H4-1BBタンパク質の結合を防止することができ、前記アンタゴニストそれ自体は
CD4+またはCD8+T 細胞を活性化することができない、自己免疫反応を防止する方
法。
【請求項２６】 CD4+T リンパ球上の前記H4-1BBレセプタータンパク質に結
合することができる因子の有効量を投与し、これによりそれをブロックする段階
を含んでなる、HIV-1 の進行を妨害する方法。
【請求項２７】前記因子が、 a) 4-1BB-Fc分子； b) 抗4-1BB モノクローナル抗体；および c) 前記H4-1BBタンパク質の一部分からなる融合タンパク質；
【請求項２８】 N 末端のアミノ酸配列Phe −Glu −Arg −Thr −Arg −Se
r −Leu −Gln −Asp −Pro −Cys −Ser −Asn −Cys −Pro −Ala −Gly −Th
r を有する精製されたヒト4-1BB ポリペプチドと免疫学的に反応性である抗体。
【請求項２９】 H4-1BBタンパク質のアンタゴニストがH4-1BBレセプターの
活性化を防止するように、有効量のH4-1BBレセプターのアンタゴニストを投与す
ることを含んでなる、T 細胞の活性化を防止する方法。
【請求項３０】第1 のH4-1BBレセプターのリガンドが少なくとも1 つのT
細胞と接触するように有効量の第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを投与し、こ
れにより少なくとも1 つのCD8+T 細胞を活性化することを含んでなる、ウイルス
の病原性HIV-1 により引き起こされるヒト後天性免疫欠損症を処置する方法。
【請求項３１】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドまたはアゴニスト
性モノクローナル抗体を0.20μmol 〜2.0 μmol に等しいか、あるいはそれより
多い投与量範囲において、1 〜3 回／日の回数で投与する、請求項30に記載の方
法。
【請求項３２】前記少なくとも1 つのCD8+T 細胞が、 a) CD4+細胞; b) 星状細胞; c) マクロファージ; d) 樹枝状細胞; および e) 小グリア細胞; から成る群より選択される、HIV-1 感染細胞を殺すことができる請求項30に記載
の方法。
【請求項３３】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドの投与を医薬製剤
、例えば、錠剤または静脈内注射剤の投与により達成する、請求項30に記載の方
法。
【請求項３４】前記アゴニストの抗4-1BB モノクローナル抗体がBBK-1 と
表示するモノクローナル抗体である、請求項2 に記載の方法。
【請求項３５】前記BBK-1 と表示するモノクローナル抗体を産生できるハ
イブリドーマをさらに含む、請求項34に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３６】レセプタータンパク質H4-1BBを発現したT 細胞を前記BBK-
1 と表示するモノクローナル抗体で処理する段階を含んでなる、T 細胞の活性化
を増強するためにモノクローナル抗体を使用する方法。
【請求項３７】前記アンタゴニストの抗4-1BB モノクローナル抗体がBBK-
2 と表示するモノクローナル抗体である、請求項3 に記載の方法。
【請求項３８】前記BBK-2 と表示するモノクローナル抗体を産生できるハ
イブリドーマをさらに含む、請求項37に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３９】レセプタータンパク質H4-1BBを発現したT 細胞を、前記BB
K-2 と表示するモノクローナル抗体で処理する段階を含んでなる、T 細胞の活性
化を増強するためにモノクローナル抗体を使用する請求項37に記載の方法。
【請求項４０】前記アンタゴニストの抗4-1BB モノクローナル抗体がBBK-
3 と表示するモノクローナル抗体である、請求項3 に記載の方法。
【請求項４１】前記BBK-3 と表示するモノクローナル抗体を産生できるハ
イブリドーマをさらに含む、請求項40に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４２】レセプタータンパク質H4-1BBを発現したT 細胞を前記BBK-
3 と表示するモノクローナル抗体で処理する段階を含んでなる、T 細胞の活性化
を増強するためにモノクローナル抗体を使用する請求項40に記載の方法。
【請求項４３】前記アンタゴニストの抗4-1BB モノクローナル抗体がBBK-
4 と表示するモノクローナル抗体である、請求項2 に記載の方法。
【請求項４４】前記BBK-4 と表示するモノクローナル抗体を産生できるハ
イブリドーマをさらに含む、請求項43に記載のモノクローナル抗体。
【請求項４５】レセプタータンパク質H4-1BBを発現したT 細胞を、前記BB
K-4 と表示するモノクローナル抗体で処理する段階を含んでなる、T 細胞の活性
化を増強するためにモノクローナル抗体を使用する請求項43に記載の方法。
【請求項４６】第1 のH4-1BBレセプターのリガンドが少なくとも1 つのT
細胞と接触するように有効量の第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを投与し、こ
れによりそれを活性化し、ここで前記H4-1BBレセプターのリガンドはアゴニスト
の抗4-1BB モノクローナル抗体である、T 細胞の活性化を増強する方法。
【請求項４７】第1 のH4-1BBレセプターのリガンドが少なくとも1 つのT
細胞と接触するように有効量の第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを投与し、こ
れによりそれを活性化し、ここで前記H4-1BBレセプターのリガンドはアンタゴニ
スト性抗4-1BB モノクローナル抗体である、T 細胞の活性化を増強する方法。
【請求項４８】第1 のH4-1BBレセプターのリガンドが少なくとも1 つのT
細胞と接触するように有効量の第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを投与し、こ
れによりそれを活性化し、ここで前記H4-1BBレセプターのリガンドはH4-1BBタン
パク質である、T 細胞の活性化を増強する方法。
【請求項４９】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを0.20μmol 〜2.
0 μmol に等しいか、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日
の回数で投与する、請求項46〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドの投与を、医薬製
剤、例えば、錠剤または静脈内注射剤の投与により達成し、そして前記第1 のH4
-1BBレセプターのリガンドの投与は前記少なくとも1 つのT 細胞の活性化におけ
る前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドの有効性を減少させない、請求項49に
記載の方法。
【請求項５１】さらに、第2 の刺激分子を前記第1 のH4-1BBレセプターの
リガンドと組み合わせて投与し、これにより前記分子およびリガンドの双方が前
記少なくとも1 つのT 細胞と接触するようにさせることを含む、請求項46〜50の
いずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】前記第2 の刺激分子が、本質的に、 a) 抗−CD3 抗体； b) 抗−CD28抗体；および c) CD28タンパク質；から成る群より選択される、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを、0.20μmol 〜
2.0 μmol に等しいか、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／
日の回数で投与し、そして前記第2 の刺激分子を0.10μmol 〜2.0 μmol に等し
いか、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日の回数で投与す
る、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドおよび前記第2 の
刺激分子の投与を医薬製剤、例えば、錠剤または静脈内注射剤の投与により達成
する、請求項51に記載の方法。
【請求項５５】第3 の刺激分子の使用をさらに含み、前記第2 の共刺激分
子が抗−CD3 抗体であり、そして前記第3 の刺激分子が抗−CD28抗体である、請
求項53に記載の方法。
【請求項５６】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンド、前記第2 の刺激
分子、および前記第3 の刺激分子の投与を医薬製剤、例えば、錠剤または静脈内
注射剤の投与により達成する、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】第1 有効量のH4-1BBレセプターのリガンドを投与し、こう
して前記化合物を少なくとも1 つのT 細胞と接触するようにさせ、そして前記H4
-1BBタンパク質が第2 の刺激分子と共同して働かせ、こうしてリガンドおよび分
子の双方が前記少なくとも1 つのT 細胞と接触するようにさせる、ことを含んで
なる、癌腫が減少するように癌腫を処置する方法。
【請求項５８】前記第2 の刺激分子が、本質的に、 a) 抗−CD3 抗体； b) 抗−CD28抗体；および c) CD28タンパク質；から成る群より選択される、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドを2.0 μmol 〜8.
0 μmol に等しいか、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日
の回数で投与し、そして前記第2 の刺激分子を0.10μmol 〜2.0 μmol に等しい
か、あるいはそれより多い投与量範囲において、1 〜3 回／日の回数で投与する
、請求項57に記載の方法。
【請求項６０】前記第1 のH4-1BBレセプターのリガンドおよび前記第2 の
刺激分子の投与を医薬製剤、例えば、錠剤または静脈内注射剤の投与により達成
する、請求項57に記載の方法。