KR20050115315A - 약물 전달 및 서방성 약물 방출을 표적으로 하는 정맥 내 나노입자 - Google Patents

약물 전달 및 서방성 약물 방출을 표적으로 하는 정맥 내 나노입자 Download PDF

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KR20050115315A
KR20050115315A KR1020057018102A KR20057018102A KR20050115315A KR 20050115315 A KR20050115315 A KR 20050115315A KR 1020057018102 A KR1020057018102 A KR 1020057018102A KR 20057018102 A KR20057018102 A KR 20057018102A KR 20050115315 A KR20050115315 A KR 20050115315A
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츠토무 이시하라
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가부시키가이샤 엘티티 바이오파마
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Abstract

저분자량 및 수용성 약물을 캡슐화하고, 입자가 연장된 시간 기간을 초과하여 약물을 점차적으로 방출하는 표적 병변으로 약물을 전달할 수 있는 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 및 폴리(락트산) (PLA) 나노입자가 제공된다. 나노입자는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 약물을 소수성이게 되게 하는 금속 이온과 상호작용하도록 하고, 소수성화된 약물을 PLGA 또는 PLA 나노입자 내로 캡슐화하고, 계면활성제가 입자의 표면 위로 흡수되게 함으로써 제조된다.

Description

약물 전달 및 서방성 약물 방출을 표적으로 하는 정맥 내 나노입자 {INTRAVENOUS NANOPARTICLES FOR TARGENTING DRUG DELIVERY AND SUSTAINED DRUG RELEASE}
본 발명은 약물 전달 및 서방성 약물 방출을 목적으로 하는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 캡슐화하는 정맥 내 나노입자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 나노입자의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 입자가 연장된 시간 기간을 초과하여 약물을 점차적으로 방출하는 표적 병변으로 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 전달할 수 있는 정맥 내 나노입자 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 여기서, 정맥 내 나노입자는 약물을 함유하는 정맥 내 투여를 위한 나노입자를 의미한다.
많은 연구자들은 저분자량, 수용성 약물을 캡슐화하는 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 또는 폴리(락트산) (PLA) 마이크로입자 및 나노입자를 개발하고 제안하였다.
예를 들어, US 특허 No. 4,652,441 는 생리학적으로 활성인 폴리펩티드를 함유하는 PLGA 마이크로캡슐 및 그의 제조 방법을 기술한다. Japanese National Publication No. Hei 10-511957 은 다양한 치료제를 함유하는 혈관 내 투여용 PLGA 나노입자를 기술한다. 또한, Japanese Patent Laid-Open Publication No. Hei 8-217691 은 비-수용성이거나 또는 거의 수용성이지 않는 폴리 다원자가 금속 염의 형태로 제조되었던, 생리학적으로 활성인, 수용성 펩티드 화합물을 캡슐화하는 PLGA 마이크로캡슐을 포함하는 서방성-방출 제형물을 개시한다.
그러나, 상기 특허 공개 중 어느 것도 약물의 목적 전달 및 서방성 방출에 적합한 정맥 내 나노입자를 만들기 위해 나노입자 내로의 캡슐화 전에 금속 이온의 이용으로 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 소수성화하는 개념을 언급하거나 또는 제안하지 않는다.
본 발명자들은 또한 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 또는 폴리(락트산) (PLA) 나노입자를 포함하는 제형물에 관한 특허 출원 (예를 들어, Japanese Patent Application No. 2002-159190) 을 공개하였다. 그러나, 본 발명자들에 의해 제안된 나노입자는 단지 저분자량, 수용성 약물의 낮은 캡슐화 효율을 제공할 수 있었다. 따라서, 소수성 및 그로 인해 에스테르화를 포함한 방법을 통해 약물의 캡슐화 비율을 증가시키려는 시도가 있었다. 그러나, 상기 시도는 캡슐화 비율이 어느 정도 향상하였다 하더라도, 나노입자가 캡슐화된 약물을 방출할 수 있는 시간의 길이를 초과하여 감소하는 결과를 초래하였다. 즉, 나노입자의 목적하는 서방성 약물-방출 성질은 상기 시도에서 손상되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 연장된 시간 기간을 초과하여 병변에서 약물을 점차적으로 방출할 수 있기 위해 특정 병변을 표적으로 할 수 있고, 투여의 초기 단계에서 거의 버스트하지 않는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 캡슐화하는 정맥 내 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 생성물의 대규모 제조를 가능하게 하는 상기 정맥 내 나노입자의 간단한 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 기술된 목적을 취득하기 위해, 본 발명자들은 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 특정 금속 이온과 반응한다는 사실에 주의를 기울였다.
구체적으로는, 본 발명자들은 상기 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 약물에 소수성을 부여하기 위해 금속 이온에 결합할 수 있도록 하고, 그로 인해 약물을 PLGA 또는 PLA 나노입자 내로 캡슐화할 수 있도록 하는 가능성을 시험하였다. 그 결과, 본 발명자들은 상기 약물이 금속 이온에 결합될 때, 소수성이 되고, 따라서 PLGA 또는 PLA 나노입자 내에서 쉽게 캡슐화될 수 있다는 것을 발견하였다. 사실상, 소수성화된 약물의 나노입자 내로의 혼입의 캡슐화 효율이 극도록 높다는 것이 증명되었다. 본 발명자들은 또한 그렇게 해서 제조된 나노입자가 시간 경과하여 약물을 점차적으로 방출할 수 있는 능력을 가지고, 생체 내에서 특이 병변을 모으는 경향이 있다는 것을 발견하였다. 상기는 상기 나노입자가 효과적인 표적화된 약물 전달 및 서방성 약물 방출을 위한 제형물을 고안하는 데 적합하게 이용될 수 있다는 가능성을 내포하였다. 상기 발견은 궁극적으로는 본 발명자들이 본 발명을 고안하도록 하였다.
발명의 개시
따라서, 본 발명의 한 측면은 약물 전달 및 서방성 약물 방출을 표적으로 하도록 고안된 정맥 내 나노입자에 관한 것이다. 나노입자는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 금속 이온에 의해 소수성으로 제조되고 폴리(락틱-코-글리콜산) (PLGA) 또는 폴리(락트산) (PLA) 로 형성된 나노입자 내에서 캡슐화되고, 계면활성제가 PLGA 또는 PLA 나노입자의 표면에 적용되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 한 특정한 구현예에서, PLGA 또는 PLA 나노입자는 50 내지 300 nm 의 직경을 갖는다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 한 특정한 구현예에서, PLGA 또는 PLA 나노입자 내에서 캡슐화된 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물은 1000 이하의 분자량을 갖는다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 또다른 특정한 구현예에서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물에 결합된 금속 이온은 아연, 철, 구리, 니켈, 베릴륨, 망간 및 코발트 중 임의이다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 추가의 특정한 구현예에서, PLGA 또는 PLA 나노입자 내에서 캡슐화되는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물은 그의 분자 내에서 인산기 또는 카르복시기를 갖는다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 더욱 더 특정한 구현예에서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물은 항염증제, 비-스테로이드성 항염증제, 프로스타노이드, 항균제, 또는 항암제이다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 더욱 더 특정한 구현예에서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 캡슐화하는 PLGA 또는 PLA 나노입자의 표면을 코팅시키는 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르, 레시틴, 또는 폴리비닐알콜이다.
본 발명의 또다른 측면은 약물 전달 및 서방성 약물 방출을 표적으로 하는 정맥 내 나노입자의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 방법은 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 금속 이온을 이용하여 소수성화하고 ; PLGA 또는 PLA 과 함께, 물과 섞이는 유기 용매 내에서 저분자량, 비-펩티드 약물을 용해시키거나 또는 현탁하고 ; PLGA 또는 PLA 나노입자의 표면에 계면활성제를 적용하기 위해 생성 용액 또는 현탁액을 계면활성제의 수용액에 첨가하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 제조 방법의 한 특정한 구현예에서, 생성 PLGA 또는 PLA 나노입자는 50 내지 300 nm 의 직경을 갖는다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 제조 방법의 또다른 특정한 구현예에서, PLGA 또는 PLA 나노입자 내에서 캡슐화된 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물은 1000 이하의 분자량을 갖는다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 제조 방법의 추가의 특정한 구현예에서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물에 결합된 금속 이온은 아연, 철, 구리, 니켈, 베릴륨, 망간 및 코발트 중 임의이다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 제조 방법의 더욱 더 특정한 구현예에서, PLGA 또는 PLA 나노입자 내에서 캡슐화되는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물은 그의 분자 내에서 인산기 또는 카르복시기를 갖는다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 제조 방법의 더욱 더 특정한 구현예에서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물은 항염증제, 비-스테로이드성 항염증제, 프로스타노이드, 항균제, 또는 항암제이다.
본 발명에 따른 정맥 내 나노입자의 제조 방법의 더욱 더 특정한 구현예에서,저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 캡슐화하는 PLGA 또는 PLA 나노입자의 표면을 코팅시키는 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르, 레시틴, 또는 폴리비닐알콜이다.
본 발명의 또다른 측면은 상기-언급된 나노입자를 활성 성분으로 함유하는 치료 제조물에 관한 것이다. 구체적으로는, 치료 제조물은 수용성 스테로이드를 캡슐화하는 나노입자를 활성 성분으로 함유하는 항염증제/항-류마티스제이다.
발명을 수행하기 위한 최상의 모드
상기 기술된 바와 같이, 본 발명은 생분해가능한 PLGA 또는 PLA 나노입자 ; 금속 이온에 결합되고, 나노입자 내에서 캡슐화되는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물 ; 및 나노입자의 표면에 적용되는 계면활성제를 포함한다.
구체적으로는, 약물 전달 및 서방성 약물 방출을 표적으로 고안된 본 발명의 정맥 내 나노입자는 금속 이온으로 소수성화되고, 이어서 그의 표면에 적용된 계면활성제로 PLGA 또는 PLA 나노입자 내에서 캡슐화된 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 포함한다.
상기 측면에서, 본 발명의 나노입자는 그것이 50 내지 300 nm 의 직경을 가질 때, 표적 병변에 의해 가장 효과적으로 취득된다는 것이 밝혀졌다. 50 nm 미만의 직경을 갖는 나노입자는 원하는 병변이 아닌 지역에 의해 취해지려는 경향이 있고, 따라서 바람직하지 못하며, 300 nm 초과의 직경을 갖는 나노입자도 바람직하지 못한데, 이는 내피 세포에 의해 취해지려는 경향이 있어서이다.
본 발명의 한 특징은, 저분자량 약물이 소수성이 될 금속 이온에 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 결합되고, 따라서 나노입자 내에서 효과적으로 캡슐화되는 것이다. 상기 목적을 위해 적합한 금속 이온 중에는 아연 이온, 철 이온, 구리 이온, 니켈 이온, 베릴륨 이온, 망간 이온, 및 코발트 이온이 있다. 상기 중에서, 아연 이온 및 철 이온이 특히 바람직하다.
상기 이유에서, 본 발명에 따라 PLGA 또는 PLA 나노입자 내에서 캡슐화되는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물은 바람직하게는 약물이 쉽게 금속 이온에 결합하여 소수성이 되게 할 수 있는 그의 분자 내에 인산기 또는 카르복시기를 포함한다.
바람직하게는, 저분자량/수용성 및 비-펩티드 약물은 1000 미만의 분자량을 갖는다.
다양한 약물이 본 발명에서 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물로서 이용될 수 있는 반면, 수용성 스테로이드성 항염증제, 비- 스테로이드성 항염증제, 프로스타노이드, 항균제 및 항암제가 특히 바람직하다.
스테로이드성 항염증제의 특정 예는 베타메타손 포스페이트, 덱사메타손 포스페이트, 프레드니솔론 포스페이트, 히드로코르티손 포스페이트, 프레드니솔론 숙시네이트, 및 히드로코르티손 숙시네이트를 포함한다.
비-스테로이드성 항염증제의 예는 락소프로펜 소듐, 및 디클로페낙 소듐을 포함한다.
프로스타노이드의 예는 프로스타글란딘 E1 (PGE1) 을 포함하며, 항균제의 예는 반코마이신, 글로람페니콜 숙시네이트, 락타모세프 (latamoxef), 세프피롬 (cefpirome), 클린다마이신 (clindamycin) 포스페이트, 및 카루모남 (carumonam) 을 포함한다. 항암제의 예는 빈크리스틴 (vincristin) 및 빈블라스틴 (vinblastine) 을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 실례의 방법에서, 정맥 내 나노입자는 하기 방법으로 제조된다 : 먼저, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 금속 이온에 결합되어 제제를 소숭수성이 되게 한다. 다음, 물과 섞이는 유기 용매 내에서 PLGA 또는 PLA 와 함께, 약물이 용해되거나 또는 현탁된다. 생성 용액 또는 현탁액이 계면활성제의 수용액에 첨가되고, 혼합물이 교반되어 목적하는 나노입자가 수득된다.
본 발명에 이용되기 위한 물과 섞이는 유기 용매의 예는 아세톤, 아세토니트릴, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 디옥산, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
계면활성제의 예는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르, 레시틴, 및 폴리비닐알콜을 포함한다.
바람직하게는, 그렇게 제조된 본 발명의 나노입자는 원심분리, 겔 여과, 섬관 투석, 또는 초여과에 의해 정제되고, 이어서 성분으로서 PLGA 또는 PLA 의 안정성을 보장하기 위해 저장을 위해 동결-건조된다.
동결-건조 제조물이 투여 시 재현탁될 수 있도록 동결-건조 시, 안정화제 및 등장성제 (isotonizing agent) 가 나노입자 현탁액에 바람직하게 첨가된다. 안정화제 및 등장성제의 바람직한 예는 수크로스 및 트레할로스를 포함하는데, 이는 바람직하게는 나노입자의 양의 5 배 이상의 양 (중량) 으로 첨가된다.
상기-기술된 방식으로 제조된 나노입자는, 입자가 효과적으로 축적하고, 시간 경과에 캡슐화된 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 지속적으로 방출하여, 연장된 시간 기간 동안 목적하는 생물 활성을 제공하는, 다양한 염증 부위, 혈관 손상, 감염 부위 및 전이성 종양 조직을 표적하기 위해 정맥 내로 투여된다. 이는 본 발명의 나노입자의 또다른 유리한 특성이 있는 곳이다 : 금속 이온이 투여 후 초기 단계에서 캡슐화된 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 나노입자의 폭발하는 방출로부터 예방하도록 작용하고, 그로 인해 연장된 시간 기간 동안 약물이 지속적으로 방출되게 한다.
따라서, 나노입자가 약물 제형물로서 유용하도록 하기 위해, 원하는 목적에 따라, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물의 캡슐화 비율 및 방출 프로파일뿐만 아니라, 나노입자의 표면 성질 및 입자 크기를 조절하는 것이 중요하다. 예를 들어, 나노입자의 표면 성질은 상이한 유형의 계면활성제를 이용함으로써 조절될 수 있다.
나노입자의 입자 크기를 조정하는 것은 생체 내에서 나노입자의 분배가 입자 크기에 의해 크게 영향을 받기 때문에 또한 중요하다. 이 때문에, 나노입자의 크기는 입자가 어떻게 잘 상이한 병변 (예를 들어, 염증 부위, 혈관 손상 부위, 감염 부위, 및 전이성 종양 조직) 에 축적하느냐를 고려함으로써 조정된다. 구체적으로는, 입자 크기는 나노입자의 제조 동안에 수성상이 교반되는 비율, 이용되는 유기 용매의 양 및 유기 용매가 수성상에 첨가되는 비율을 포함하여 조건을 조절함으로써 조정될 수 있다.
저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물의 PLGA 또는 PLA 나노입자 내로의 캡슐화의 효율은 저분자량 약물의 물리적 성질에 크게 의존한다. 일반적으로, 친수성 (수용성) 약물은 소수성 약물보다 덜 효과적으로 PLGA 또는 PLA 나노입자 내로 혼입되는 경향이 있다. 상기 이유에서, 본 발명에 이용되는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물은 금속 이온에 결합되어, 제제에 소수성을 부여할 필요가 있다. 구체적으로는, 상기는 약물이 비-수용성 침전물을 형성하는 그러한 방식으로, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 금속 이온에 결합하도록 함으로써 행해진다.
상기 목적을 위해, 금속 이온에 결합할 수 있는, 포스페이트 및 카르복실과 같은 관능기가 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물의 분자 내로 바람직하게 도입된다. 금속 이온으로의 침전의 형성에 참가하거나 또는 방해하지 않는 약물 분자 내에 존재하는 임의의 관능기는 적절한 보호기로 보호받아야 한다는 것이 또한 요구된다.
더욱이, 이용되는 유기 용매의 유형과 양 및 유기 용매가 부어지는 비율은 또한 나노입자의 입자 크기에 영향을 미치고, 따라서 최적화될 필요가 있다.
나노입자의 성분으로서 작용하는 PLGA 및 PLA 에 관해, 상이한 분자량을 가진 PLGA 또는 PLA 가 캡슐화된 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 나노입자로부터 방출되는 비율을 조정하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 나노입자를 평가하기 위해, 나노입자의 PK/PD (약동학/약력학) 의 평가에 적합한 시험관 내 또는 동물 (생체 내) 모델을 구축하는 것이 필요하다.
상기에서 기술된 바와 같이, 본 발명은 약물에 소수성을 부여하는 금속 이온을 이용하여 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물의 PLGA 또는 PLA 나노입자 내로의 높은 캡슐화 비율을 달성하였다. 본 발명은 입자가 연장된 시간 기간을 초과하여 점차적으로 약물을 방출할 수 있는 표적 병변으로의 약물 전달을 표적으로 고안된 정맥 내 나노입자의 간단하고, 산업적-규모의 제조를 허용한다.
본 발명은 실시예 및 시험예를 참조롤 이제 상세히 설명될 것이다.
실시예 1: 금속 이온과 함께 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물의 비-수용성 침전물의 형성
하기 표 1 에 나타낸 화합물을 인산기를 갖는 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물로서 이용하였다. 각각의 화합물을 20 mM 의 농도로 0.2M Tris-HCl 완충액 (pH7.8) 에서 용해하였다. 다음, 상기 용액을 상이한 금속 이온의 1OO mM 수용액의 동일한 부피에 첨가하였다. 각각의 생성 혼합물의 탁도를 관찰하였다.
결과를 하기 표 1 에 나타낸다.
금속 이온으로 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물의 침전물의 형성
저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물
나프틸-포스페이트 베타메타손 포스페이트 덱사메타손 포스페이트 리보플라빈 포스페이트 Tris-HCl 완충액 (0.1 M/pH 7.8)
금속 이온 NiCl2 - - + - -
CuCl2 - +++ +++ +++ -
Zn(CH3COO)2 +++ +++ +++ +++ -
ZnCl2 +++ +++ +++ +++ -
MgCl2 - - - - -
FeCl2 +++ +++ +++ +++ -
FeCl3 +++ +++ +++ +++ -
3N HCl - - - - -
생성 혼합물을 하기와 같이 평가하였다 :- : 화합물이 용해되었다 ;+ : 혼합물이 약간 탁하였다 ;++ : 혼합물이 확연히 탁하였다 ;+++ : 혼합물이 확연히 탁하고, 침전이 형성되었다.
표 1 의 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 분명한 탁도 및 침전물 형성이 아연, 철 (페릭 (ferric) 또는 페러스 (ferrous)), 또는 구리 이온의 존재 하에 각각의 포스페이트-함유 화합물에서 관찰되었다.
베타메타손 포스페이트 대 아연 이온의 몰 비 및 리보플라빈 포스페이트 대 아연 이온의 몰 비가 생성 침전물의 양을 시험하기 위해 다양하게 되었을 때, 침전물 형성은 아연 이온에 대한 몰 비가 약 1 이었을 때, 저분자량 화합물의 각각에 대해 가장 분명하였다.
실시예 2 : 스테로이드를 캡슐화하는 PLGA/PLA 나노입자의 제조
상이한 스테로이드를 100 ㎕ 의 물에 용해시키고, 생성 용액을 각각 500 ㎕ 의 0.5M 수성 아연 아세테이트 용액 또는 500 ㎕ 의 0.5M 수성 철 클로라이드 용액에 첨가하였다. 각각의 혼합물을 12,000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리시키고, 상층액을 버려서 아연-스테로이드 또는 철-스테로이드의 형태로 침전물을 수득하였다. 침전물에, 500 ㎕ 의 아세톤, 아세톤/아세토니트릴 혼합물, 또는 20 mg PLGA 또는 PLA (WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES LTD.) 이 용해된 아세톤/에탄올을 각각 첨가하였다. 생성 용액의 각각에, 아연 아세테이트의 수용액을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 방치하였다. 이어서, 용액 (또는 현탁액) 을 27G 주사기를 통해 1 ㎖/분의 속도로 Pluronic F68 (비이온성 고분자량 계면활성제) 의 0.5% 수용액에 첨가하여, 400 rpm 에서 교반하여, 나노입자를 수득하였다. 생성 나노입자를 실온에서 1 내지 2 시간 동안 교반하고, EDTA (pH 8) 의 0.5 M 수용액을 첨가하였다 (부피로 0.4). 다음, 혼합물을 20,000G 에서 20 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 잔류물을 물에 재현탁시키고, 현탁액을 다시 원심분리하여 나노입자를 세척하였다. 생성 나노입자를 NaOH 의 2N 수용액에 첨가하여, PLGA/PLA 를 분해시키고, 나노입자 내의 스테로이드 함량을 HPLC 에 의해 결정하였다. 유사하게, 비-수용성 스테로이드를 금속 이온이 없이 상이한 방법으로 제조된 나노입자에 대해 결정하였다.
더욱이, 5mg 베타메타손 포스페이트와 아연을 혼합함으로써 형성된 침전물을 아세톤의 부피를 달리하면서 용해시킨 다음, 나노입자 내에 혼입된 베타메타손 포스페이트의 캡슐화 효율을 상기 기술된 것과 동일한 방식으로 결정하였다.
결과를 하기 표 2 및 3 에 나타낸다.
PLGA 나노입자 내로의 스테로이드의 캡슐화
스테로이드 베타메타손 베타메타손 아세테이트 BDP BP-Na BP-Zn
스테로이드/나노입자 (중량%) 0.01 0.15 0.47 0 2.03
스테로이드 BP-Fe DP-Na DP-Zn HP-Na HP-Zn
스테로이드/나노입자 (중량%) 1.15 0 1.15 0 1.05
BDP : 베타메타손 디프로피오네이트BP : 베타메타손 포스페이트DP : 덱사메타손 포스페이트HP : 히드로코르티손 포스페이트
베타메타손 포스페이트의 PLGA 나노입자 내로의 캡슐화 비율에 있어 아세톤 부피의 효과
아세톤의 양 (㎕) 500 700 900 1100 1300 1500
스테로이드/나노입자 (중량%) * 7.34 4.28 3.46 2.71 1.93
* 입자 응집 때문에 데이타가 수득되지 못하였음.
표 2 에서 보는 바와 같이, 각각이 나노입자 내로의 혼입을 실질적으로 보이지 않았던, 소듐 염의 형태로 제공되는 스테로이드 포스페이트의 경우와는 반대로, 아연 또는 철 이온 (즉, BP-Zn, BP-Fe, DP-Zn, 및 HP-Zn) 의 첨가를 통해 발생된 스테로이드 포스페이트의 침전물의 이용은 각각의 스테로이드의 PLGA 나노입자 내로의 캡슐화 비율을 확연히 증가시켰다.
표 3 은 PLGA 및 베타메타손 포스페이트의 양을 유지하면서 베타메타손 포스페이트의 용매인 아세톤의 양을 다양하게 함으로써 수득된 PLGA 나노입자 내로의 캡슐화 비율을 나타낸다. 상기 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 나노입자는 500 ㎕ 이하의 아세톤 내에서 응집물을 형성하였다. 한편, 베타메타손 포스페이트의 나노입자 내로의 높은 캡슐화 비율을 보이면서, 입자는 700 ㎕ 의 아세톤 내에 안정적으로 분산되어 남아 있었다. 나노입자가 700 ㎕ 이상의 아세톤 내에서 안정적으로 분산되어 있더라도, 캡슐화 비율은 아세톤의 양이 증가함에 따라 점차적으로 감소하였다.
실시예 3 : PLGA/PLA 나노입자로부터의 스테로이드 방출 프로파일
5 mg 베타메타손 포스페이트를 100 ㎕ 의 물에 용해시키고, 상기 용액을 500 ㎕ 의 0.5M 아연 아세테이트 수용액에 첨가하였다. 다음, 혼합물을 12,000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하고, 상층액을 버려서 아연-스테로이드 침전물을 수득하였다. 침전물에, 상이한 분자량으로 20 mg 의 PLGA 또는 PLA 가 용해된 500 ㎕ 의 아세톤을 첨가하였다. 상기 용액을 실온에서 2 시간 동안 방치하고, 이어서, 27G 주사기로 1 ㎖/분의 속도로 400 rpm 에서 교반되었던 Pluronic F68 (비이온성 고분자량 계면활성제) 또는 레시틴의 0.5% 현탁액에 첨가하였다. 생성 나노입자를 실온에서 1 내지 2 시간 동안 교반하였다. EDTA 를 첨가하고 이어서, 나노입자를 농축 및 세척을 위해 Centriprep YM-10 (Amicon) 에서 초여과하였다. 다음, 나노입자를 500 ㎍/mL PLGA 농도에서 FBS (소 태아 혈청)/PBS (v/v=1) 의 혼합물에 현탁시키고, 예정된 시간 후에, EDTA (pH8) 의 0.5M 수용액을 첨가하였다 (부피로 0.4). 다음, 현탁액을 20,000G 에서 30 분 동안 원심분리하고, 상층액을 버렸다. 잔류물을 물에 재현탁시키고, 다시 현탁액을 원심분리하여 나노입자를 세척하였다. 생성 나노입자를 2N NaOH 수용액에 첨가하여, PLGA/PLA 를 가수분해하고, 나노입자 내의 스테로이드 함량을 HPLC 로 결정하였다.
대조군으로서, BDP (베타메타손 디프로피오네이트), 소수성 스테로이드를 캡슐화하는 나노입자를 이전의 특허 출원(일본 특허 출원 No. 2002-159190) 에서 본 발명자들에 의해 제안된 방법에 따라 제조하였다. 캡슐화된 스테로이드의 양을 동일한 방식으로 결정하였다.
결과를 하기 표 4 에 나타낸다.
나노입자로부터 베타메타손의 방출
PLGA/PLA 누적하는 방출된 베타메타손 (%)
5 시간 1 일 2 일 4 일 8 일 11 일 20 일
PLA*1(Mw 14000) 27 53 64 79 97 98 100
PLGA*2(Mw 8000) 0 17 29 35 60 70 93
PLGA*2(Mw 13000) 0 11 18 34 47 53 62
PLA*2(Mw 9000) 0 12 13 25 28 30 38
PLA*2(Mw 14000) 0 3 4 8 10 14 31
*1 : 일본 특허 출원 No. 2002-159190 에서 기술된 방법에 따라 제조된 나노입자*2 : 본 발명의 방법에 따라 제조된 나노입자
본 발명자들에 의해 이전에 제안되었던 방법 (일본 특허 출원 No. 2002-159190) 에 따라 제조된 BDP (베타메타손 디프로피오네이트), 소수성 스테로이드를 캡슐화하는 나노입자는 6 일 후에 방출된 베타메타손의 약 90% 이상으로 초기 단계에 베타메타손의 확연한 양을 방출하였다. 이와는 달리, 본 발명의 방법에 따라 제조된 나노입자는 스테로이드의 초기 폭발 방출이 확연히 감소되었는데, 더 점차적인 방식으로 스테로이드를 방출하였고, 연장된 시간 기간을 초과하여 그것을 방출할 수 있었다.
소분자량으로 PLGA 또는 PLA 로 만들어진 나노입자는 초기 단계에서 스테로이드를 방출하려는 경향이 있고, PLGA 로 만들어진 나노입자는 PLA 로 만들어진 것보다 더 일찍 스테로이드를 방출하려는 경향이 있음이 또한 기술되었다.
실시예 4 : 대식세포에 의해 흡수된 나노입자로부터의 스테로이드의 방출 프로파일
1.5 ㎖ 의 10% 프로테오스 펩톤의 복강 내 투여에 의해 자극을 받았던 마우스의 복강 (abdominal cavity) 으로부터 대식세포를 수합하였다. 세포를 6 x 105 세포/12 웰로 심고, 대식세포-SFM 배지 (Gibco) 내에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이어서, 배양 배지를 교체하고, 실시예 3 에서 기술된 과정에 따라 제조된 PLGA 또는 PLA 나노입자를 첨가하였다. 세포를 37℃ 에서 또다른 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS 및 배지로 3 회 세척하고, 배지 내의 베타메타손의 양을 예정된 간격으로 ELISA 방법에 의해 결정하였다.
대조군으로서, BDP (베타메타손 디프로피오네이트), 소수성 스테로이드를 캡슐화하는 나노입자는 본 발명자들에 의해 이전에 제안된 방법 (일본 특허 출원 No. 2002-159190) 에 따라 제조하고, 세포에 첨가하였다.
결과를 하기 표 5 에 나타낸다.
나노입자를 흡수하는 대식세포로부터 베타메타손의 방출 프로파일
누적하는 방출되는 베타메타손 (%)
2 시간 4 시간 10 시간 1 일 2 일 3 일 5 일 7 일
대조군나노입자 26 42 68 86 96 97 98 99
본 발명의 나노입자 3 4 11 27 64 77 89 96
*1 : PLA (MW 14,000) 를 이용하여 제조된 나노입자 (일본 특허 출원 No. 2002-159190)*2 : PLGA (MW 8,000) 를 이용하여 제조된 나노입자
본 발명자들에 의해 이전에 제안된 방법 (일본 특허 출원 No. 2002-159190) 에 따라 제조된 BDP (베타메타손 디프로피오네이트), 소수성 스테로이드를 캡슐화하는 나노입자는 2 일 후 일찍 대부분의 베타메타손을 방출하였다. 이와는 달리, 본 발명의 방법에 따라 제조된 나노입자는 처음 2 내지 3 일 기간 동안에 거의 선형의 방출 프로파일을 나타내고, 연속하는 기간 동안에 베타메타손을 점차적으로 방출하였다.
실시예 5 : 나노입자의 분산 안정성의 평가
실시예 3 에서 기술된 과정에 따라 제조된 아세톤 용액을 상이한 계면활성제의 수용액에 적가하여, 나노입자를 수득하였다. 생성 나노입자를 농축시키고, 세척하고, 정제한 다음, 농도를 달리하면서 수크로스 용액 내에서 동결-건조시켰다. 동결-건조된 나노입자를 물에 재현탁시키고, 입자의 입자 크기를 광-산란 광도계를 이용하여 측정하였다.
상이한 계면활성제, 즉, 레시틴, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 및 폴리소르베이트의 수용액을 이용함으로써 제조된 나노입자는 실질적으로 동일한 입자 크기를 가졌다. 계면활성제의 농도가 0.01 내지 1% 의 범위 내에서 다양할 때, 나노입자의 크기 및 분산 안정성, 및 베타메타손 포스페이트의 캡슐화 비율에서조차도 계면활성제 사이에서 확연한 차이가 나타나지 않았다.
비교로, 폴리비닐알콜 용액으로 제조된 나노입자는 다른 계면활성제로 제조된 것보다 크기 면에서 더 컸고, 베타메타손 포스페이트의 낮은 캡슐화 비율을 가졌다. 나노입자를 동결-건조시키기 전에 나노입자의 양의 5 배 초과의 양 (중량) 으로 수크로스를 첨가함으로써 동결-건조된 나노입자의 재-분산성을 또한 나타내었다.
실시예 6 : 염증 부위에서의 나노입자의 축적
염증은 수컷 Lewis 래트의 좌측 뒷발에 1% 카라게에닌 (carrageenin) 을 함유하는 생리식염수 100 ㎕ 를 주사함으로써 유도되었다. 4 시간 후, 두 가지 상이한 크기 (200nm 및 500nm) 의 로다민-캡슐화 나노입자의 일시 투여량이 꼬리 정맥 내로 주사되었다. 투여 후 2 시간째에, 생성 다리 수종 (leg edema) 를 자르고, 크리오스타트 섹션을 제조하였다. 조직 샘플을 형광 현미경으로 관찰하였다.
대조군으로서, 한 군을 생리식염수를 투여하고, 다룬 군을 로다민만을 투여하였다.
조직 섹션에서 관찰된 형광의 농도는 생리식염수만을 받았던 대조군에서보다 200 nm 나노입자를 받은 군에서 확연히 더 높았고, 이는 염증 부위에서의 나노입자의 확연한 축적을 가리킨다.
로다민만을 받은 군 또는 500 nm 나노입자로 투여받은 군에서는 나노입자의 확연한 축적이 없는 것이 관찰되었다.
실시예 7 : 보조제-유도된 관절염을 억제하는 활성
관절염은 130 내지 160 g 이 나가는 7-주령 Lewis 래트에서 유도되었고, 에테르 마취하에서, 6mg/mL M. Butyricum Desiccated (DIFCO) 을 함유한 50 ㎕ 의 불완전 Freund's 보조제 용액 (DIFCO) 을 좌측 뒷발에 주사함으로써 1 주일 동안 미리조절되었다. 동물을 군으로 나누었는데, 동물의 좌측 뒷다리의 부피에 있어 군 간에 확연한 차이가 없었다. M. Butyricum 의 투여 후 14 일 째에, 베타메타손 포스페이트를 캡슐화하는 PLA 나노입자의 일시 투여를 한 군에 정맥 내로 투여하였다.
대조군으로서, 베타메타손 포스페이트 및 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 의 일시 투여를 래트의 각 군에 피하 투여하였고, 리메타손 (MITSUBISHI PHARMA) 의 일시 투여를 또다른 군에 정맥 내 투여하였다.
염증을 억제하는 나노입자의 능력을 물 이동 기술 (water displacement technique) 을 이용함으로써 약물의 투여 전 및 투여 후 7 일 째에 좌측 뒷다리의 부피를 측정함으로써 분석하였다.
결과를 하기 표 6 에 나타낸다.
보조제-유도된 관절염을 억제하기 위한 나노입자의 활성
군 투여 후 염증 비율 (%)(# 일)*3
1 2 3 4 5 6 7
본 발명의 나노입자*1 69 68.7 68.3 69 70.3 70.8 71.3
리메타손*2 66.9 72 79.2 78.5 80 79 -
베타메타손 포스페이트 (300㎍) 68.3 76.5 79.2 81.7 88 - 84.8
베타메타손 포스페이트 (100㎍) 78.4 80 82.8 85.4 84.2 83 81.7
생리식염수 100.8 98.1 98 96.7 96 95.5 96.2
*1 : 베타메타손 포스페이트-함유 나노입자는 PLA (MW 14000) 을 이용하여 제조되었다. 나노입자는 100 ㎍ 베타메타손 포스페이트에 상응하는 양으로 주어졌다.*2 : 100 ㎍ 덱사메타손 포스페이트에 상응하는 양으로 주어졌다.*3 : 염증 비율을 하기 식으로 계산하였다 :염증 비율 (%) = (측정된 다리 부피 - 비-주사된 보조제 정상 래트의 다리 부피)/(스테로이드 투여 전 다리 부피 - 비-주사된 보조제 정상 래트의 다리 부피) x 100.
표 6 에서 나타낸 바와 같이, 베타손 포스페이트의 3 배를 이용하여 관찰된 것과 비교해 항-염증 효과는 투여 후 1 일만큼 초기에 임상 용도에서 벌써 항염증제인 리메타손으로 투여받은 군에서 관찰되었다. 베타메타손 포스페이트만을 투여한 경우처럼, 리메타손의 항염증 효과는 시간이 지나면서 점차적으로 상실되었다. 비교로, 베타메타손 포스페이트를 캡슐화하는 본 발명의 PLA 나노입자는 투여 후 1 일만큼 초기에 리메타손에 비해 높은 항-염증 효과를 나타내었고, 연속하는 7 일 기간을 초과하여서도 강한 효과를 나타내기를 계속하였다.
실시예 8 : PGE 1 을 캡슐화하는 PLGA/PLA 나노입자의 제조
1 mg 의 PGE1 을 20 ㎕ 의 에탄올에 용해시키고, 상기 용액을 철 (또는 페릭) 클로라이드의 80 ㎕ 의 0.5 M 수용액에 첨가하였다. 다음, 혼합물을 12,000 rpm 에서 5 분 동안 교반하고, 상층액을 제거하여 철-PGE1 침전물을 수득하였다. 상기 침전물에, 아세톤 내의 PLGA (WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) 또는 PLA (WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.) 를 첨가하였다. 아연 아세테이트의 수용액을 추가로 첨가하고, 용액을 실온에서 2 시간 동안 방치하였다. 27G 주사기를 이용하여, 용액 (또는 현탁액) 을 이어서 400 rpm 에서 미리-교반되었던 Pluronic F68 (비이온성 고분자량 계면활성제) 또는 레시틴의 0.5% 현탁액에 1 ㎖/분의 속도로 첨가하였다. 생성 나노입자를 실온에서 1 내지 2 시간 동안 교반하고, EDTA (pH8) 의 0.5M 수용액을 첨가하였다 (부피로 0.4). 다음, 현탁액을 20,000G 에서 20 분 동안 교반하고, 상층액을 버렸다. 잔류물을 물에 재현탁시키고, 현탁액을 다시 원심분리하여, 나노입자를 세척하였다. 생성 나노입자를 아세토니트릴에 용해시키고, 이어서 PBS 로 희석하였다. 다음, PGE1 의 양을 ELISA 방법에 의해 결정하였다.
실시예 4 에서 기술된 바와 같이, 대식세포는 PGE1-캡슐화 PLGA 나노입자를 취하게 되었고, 배지 내에 함유된 PGE1 의 양을 간격을 두고 ELISA 로 결정하였다.
결과를 하기 표 7 에 나타낸다.
나노입자를 흡수하는 대식세포로부터 PGE1 의 방출 프로파일
누적하는 방출된 PGE1 (%)
2 시간 5 시간 10 시간 1 일 2 일 3 일 4 일 6 일 8 일
PGE1-캡슐화 나노입자*1 22 42 60 75 90 95 98 99 100
*1 : PLGA (MW 8,000) 를 이용하여 제조된 나노입자
PGE1 의 PLGA 나노입자 내로의 캡슐화 비율은 약 0.1 내지 1 중량% 였다. 표 7 에서 나타낸 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 방출 프로파일이 베타메타손 포스페이트, 스테로이드성 항염증제에 대한 것만큼 우수하지 않더라도, PGE1 은 8 일 동안 계속해서 나노입자로부터 방출되었다.
이처럼, 본 발명은 충분한 양의 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 캡슐화할 수 있고, 투여의 초기 단계에 거의 폭발하지 않으며, 연장된 시간 기간 동안에 약물을 방출할 수 있는 정맥 내 PLGA 또는 PLA 나노입자를 제공한다.
본 발명의 정맥 내 나노입자는 다양한 염증 부위, 혈관 손상 부위, 감염 부위 및 전이성 종양 조직을 표적하고, 캡슐화된 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 시간 경과에 방출되어, 연장된 시간 기간 동안에 그의 생물 활성을 나타내는 상기 부위 또는 조직에서 효과적으로 축적하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 나노입자가 야기할 수 있는 잠재적인 의약 효과는 따라서 분명하다.

Claims (18)

  1. 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 금속 이온에 의해 소수성으로 되고 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 폴리(락트산) 으로 형성된 나노입자 내에서 캡슐화되고, 계면활성제가 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 폴리(락트산) 의 나노입자의 표면에 적용되는 것을 특징으로 하는, 약물 전달 및 서방성 약물 방출을 표적하기 위한 정맥 내 나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 입자가 50 내지 300 nm 의 직경을 갖는 정맥 내 나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 1000 이하의 분자량을 갖는 정맥 내 나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 금속 이온이 아연, 철, 구리, 니켈, 베릴륨, 망간, 및 코발트 중 임의인 정맥 내 나노입자.
  5. 제 1 항에 있어서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 약물을 금속 이온에 의해 소수성화되기 쉽게 하는 인산기를 갖는 정맥 내 나노입자.
  6. 제 1 항에 있어서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 약물을 금속 이온에 의해 소수성화되기 쉽게 하는 카르복시기를 갖는 정맥 내 나노입자.
  7. 제 1 항에 있어서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 스테로이드성 항-염증 약물, 비-스테로이드성 항-염증 약물, 프로스타노이드, 항균 약물, 또는 항암 약물인 정맥 내 나노입자.
  8. 제 1 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르, 레시틴, 또는 폴리비닐알콜인 정맥 내 나노입자.
  9. 하기의 단계를 포함하는, 약물 전달 및 서방성 약물 방출을 표적하기 위한 정맥 내 나노입자의 제조 방법 :
    금속 이온을 이용하여 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물을 소수성화시키고 ;
    물과 섞이는 유기 용매 내에서 폴리(락틱-코-글리콜산) 또는 폴리(락트산) 과 함께, 소수성화된 약물을 용해시키거나 현탁시키고 ;
    나노입자의 표면에 계면활성제를 적용하기 위해 계면활성제의 수용액에 생성 용액 또는 현탁액을 첨가함.
  10. 제 9 항에 있어서, 입자가 50 내지 300 nm 의 직경을 갖는 정맥 내 나노입자의 제조 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 1000 이하의 분자량을 갖는 정맥 내 나노입자의 제조 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 금속 이온이 아연, 철, 구리, 니켈, 베릴륨, 망간, 및 코발트 중의 임의인 정맥 내 나노입자의 제조 방법.
  13. 제 9 항에 있어서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 약물을 금속 이온에 의해 소수성화되기 쉽게 하는 인산기를 갖는 정맥 내 나노입자의 제조 방법.
  14. 제 9 항에 있어서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 약물을 금속 이온에 의해 소수성화되기 쉽게 하는 카르복시기를 갖는 정맥 내 나노입자의 제조 방법.
  15. 제 9 항에 있어서, 저분자량, 수용성 및 비-펩티드 약물이 스테로이드성 항-염증 약물, 비-스테로이드성 항-염증 약물, 프로스타노이드, 항균 약물, 또는 항암 약물인 정맥 내 나노입자의 제조 방법.
  16. 제 9 항에 있어서, 계면활성제가 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트, 폴리옥시에틸렌 옥틸페닐 에테르, 레시틴, 또는 폴리비닐알콜인 정맥 내 나노입자의 제조 방법.
  17. 활성 성분으로서, 제 1 항에 따른 수용성 스테로이드를 캡슐화하는 나노입자를 함유하는 항-염증성/항-류마티스성 약물.
  18. 제 17 항에 있어서, 수용성 스테로이드가 베타메타손 포스페이트인 항-염증성/항-류마티스성 약물.
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