KR20050071562A

KR20050071562A - 글루타민을 제공하기 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20050071562A
Application number: KR1020057006141A
Authority: KR
Inventors: 제프리 에이치 박스터; 호세 마리아 로페즈; 리카르도 루에다
Original assignee: 아보트 러보러터리즈
Priority date: 2002-10-08
Filing date: 2002-10-08
Publication date: 2005-07-07
Also published as: MXPA05003732A; EP1555896A1; CN1717184A; AU2002356547A1; WO2004032653A1; BR0215904A; CA2501540A1; NZ539139A; ZA200502843B; CN100382796C

Abstract

본 발명은 유효량의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 사람에게 경구 투여함으로써 글루타민을 보충하는 방법 및 조성물을 제공한다. N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염은 사람이 소비하기에 적합한 어떠한 액체 조성물에도 혼입시킬 수 있다. 적합한 조성물의 예에는, 예를 들어 경구 재수화 용액 및 액체 영양 제형(예: 장 제형, 경구 제형, 성인용 제형, 소아용 제형 및 유아용 제형)으로서 사용하기 위한 수용액이 포함된다. N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 양은 매우 다양할 수 있는데, 전형적으로는 본 조성물은 1일 체중 ㎏당 약 140㎎ 이상의 총 글루타민을 제공하기에 충분한 양으로 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 포함한다.

Description

글루타민을 제공하기 위한 방법 및 조성물{Methods and compositions for providing glutamine}

본 발명은 유효량의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 경구 투여하여 글루타민을 보충하는 방법에 관한 것이다.

글루타민은 인체에서 가장 풍부한 아미노산이다. 이는 골격근에서 유리 아미노산의 60% 이상을 차지하며 순환하는 총 아미노산의 20% 이상을 차지한다. 글루타민은 당신생, 뉴클레오타이드 합성, 산-염기 균형 및 기타 중요한 대사 과정을 포함한 다수의 신체 기능에 연루되어 있다. 연구들은, 글루타민이 신속하게 복제되는 세포, 특히 위장관세포 및 점막세포에 의해 사용되는 중요한 대사 기질임을 제시하고 있다. 글루타민은 생체내에서 사람의 공장(소장의 일부)에서 효율적으로 흡수될 수 있다.

글루타민은 실질적으로 신체의 모든 조직에서 합성될 수 있기 때문에 필수 아미노산으로 간주되지는 않는다. 신체가 정상적인 생리 상태에 있는 경우, 신체 요구(즉, 글루타민 소비 조직)를 적절하게 충족시키기에 충분한 양으로 글루타민이 생산되는 것으로 여겨진다. 그러나, 다수의 연구들은 비정상적 생리 상태(즉, 질환 및 대사성 스트레스)에서는 글루타민 생산이 신체의 요구를 충족시키기에 불충분할 수 있음을 보여주었다. 따라서 보다 정확하게 글루타민은 조건부 필수 아미노산으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 연구들은 장 외상의 경우에 글루타민을 이러한 등급으로 나누고 있다[참조문헌: Souba, W. W.; Smith, R.J.; and Wilmore, D.J.: Glutamine Metabolism by the Intestinal Tract. JPEN 9 (5): 608-617 (1985); Furst, P.; Albers, S and Stehle, P.: Evidence for a nutritional need for glutamine in catabolic patients. Kidney Intl. 36 (Suppl. 27): S-287-S-292 (1989); Klimberg, V. S. , et al.: Oral glutamine accelerates healing of the small intestine and improves outcome after whole abdominal rasiation]. 글루타민은 또한 배양된 헬라(HeLa) 세포의 1차 에너지원으로 제시되어 있다[참조문헌: Reitzer, L. J.; Wice, B. M.; and Kennell, D.: Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J. Biol. Chem. 254 (8): 2669-2676 (1979)]. 그리고, 글루타민은 종양세포에 의해 우선적으로 이용되어 암 환자의 경우 글루타민이 급속히 고갈되는 것으로 제시되어 있다[참조문헌: Souba, W. W.: Glutamine and Cancer. Ann. Surg. 218 (6): 715-728 (1993)].

영양 제형에는 이미 글루타민이 보충되고 있다. 보충이란, 제형에 부가적인 글루타민을 유리 아미노산 또는 가수분해 밀 글루텐과 같은 비교적 농축된 형태로서 가한다는 의미이다. 천연 아미노산으로서, 글루타민은 모든 단백질중에 일정량으로 존재하므로 단백질을 함유한 어떠한 영양 제형에도 다소간 존재할 것이다. 그러나 글루타민은 대부분의 천연 단백질중에 일정 소량으로만 함유되어 있기 때문에, 특정 수준 이상의 글루타민이 함유된 제형을 생산하기 위해서는 글루타민을 보충된 형태로 부가해야만 한다. 이러한 글루타민 보충 제형중 몇몇은 대사 스트레스, GI 기능 장애(예: 심각한 다수의 외상, 설사, 염증성 장질환, GI 수술, 심각한 화상, 또는 화학치료 또는 방사선치료로 인한 손상에 기인), 흡수장애(예: 크론병) 및/또는 급성 외상이 있는 환자용으로 시판되고 있다.

글루타민이 풍부한 이러한 보충제를 생산하는 가장 쉬운 방법은, 이러한 폴리펩타이드의 복합 혼합물이 다량의 글루타민으로 특징적으로 규정되기 때문에 글루텐을 가수분해시키는 것이다. 글루텐은 소형 단편으로 가수분해되기 때문에, 글루텐을 함유하지 않는 이러한 생성물을 이용할 수 있는 것으로 생각된다. 그러나, 글루텐은 셀리악병을 유발하는 환경 인자이고 셀리악 환자의 경우 글리아딘의 소형 단편이 독성을 나타내기 때문에, 이러한 글루타민이 풍부한 글루텐 비함유 화합물을 사용하는 것에는 잠재적인 위험이 따른다.

셀리악병은 감수성이 있는 개체에서 글루텐 함유 곡물의 섭취에 의해 유발되는 자가면역 장병증이다. 밀 글루텐의 글리아딘 분획 및 다른 곡물중 유사한 알콜 가용성 단백질이 장 손상을 발생시키는 환경 인자이다. 현재 셀리악병은 섭취한 글루텐에 대한 부적절한 T-세포 매개된 면역반응의 결과인 것으로 입증되었다. 이 질환은 주조직적합복합체의 사람 백혈구 항원(HLA)과도 관련되어 있으며, 글루텐이 지속적으로 존재하는한 이 질환은 영속된다. 흡수 융모 손실 및 선와(crypt)를 특징으로 하는 과형성이 특징인 전형적인 장 손상은 환자 식이로부터 글루텐 함유 곡물을 제거하면 완벽하게 해결된다. 최근 전세계 인구중 100 내지 300명당 적어도 1명이 이 질환으로 고통받는 것으로 추정되고 있다. 또한 셀리악병은 삶의 질을 상당히 방해하는 일련의 합병증을 일으키는 것이 특징이며, 다수의 경우에 점막 림프종과 같이 생명을 위협하기도 한다.

상기한 바와 같은 의학적 장점으로 인해 영양학적 생성물에 글루타민을 혼입시키려는 시도가 있어왔다. 이러한 노력을 어렵게하는 한가지 문제는 수용액중에서 글루타민의 안정성이 제한된다는 점이다. 유리 글루타민은 수용성 매질에서 분해되어 피로글루탐산 및 글루탐산을 형성하는 것으로 공지되어 있다. 몇몇 연구는 설치류에서 피로글루탐산이 신경독임을 보여주고 있다[참조문헌: C. F. deMello, et al.: Neurochemical effects of L-pyroglutamic acid. Neurochem. Res. 20 (12): 1437-1441 (1995); McGreer, E. G. and Singh, E.: Neurotoxic effects of endogenous materials: quinolinic acid, L-pyroglutamic acid, and thyroid releasing hormone (TRH). Exp. Neurol. 16 (3-4): 410-413 (1984); Rieke, G. K., et al.: L-Pyroglutamate: an alternative neurotoxin for a rodent model of Huntington's disease. Exp. Neurol. 104 (2): 147-154 (1989)]. 영양 제형을 공급하는 경우, 이러한 분해는 피로글루탐산을 생성할 뿐만 아니라 신체가 이용할 수 있는 글루타민의 양을 감소시킨다. 따라서, 영양 공급원중 글루타민 보충원으로서 유리 글루타민을 이용하는 것은, 공급 직전 또는 거의 직전(24 내지 48시간)에 물로 재구성하고 재구성후 냉장하에 최적으로 보관하는 분말 제형으로 거의 제한된다. 이러한 분말 제형에는 알리트라큐(AlitraQ^R; Ross Products Division of Abbott Laboratories), 뉴-이뮨(Nu-Immu^R; Enjoy Foods) 및 비보넥스 플러스(Vivonex Plus^R; Sandoz)가 포함된다. 이러한 제형은 1500㎉당(분석치) 대략 25.4g, 20.1g 및 14.5g의 글루타민을 각각 제공한다. 또한 유럽 특허원 제EP 1097646호(Mawatari et al.)는 글루타민 및/또는 글루타민 함유 펩타이드를 함유한 개질된 분유 조성물의 이용을 기술하고 있다. 이러한 생성물은 환자의 치료에 상당한 기여를 하지만 미국의 대부분의 보건의료 기관들은 분말 생성물을 최적인 것으로 여기지 않는다. 다수의 미국 지역사회에서는 훈련된 의료인이 부족하므로 보건의료 기관에서는 바로 공급가능한(RTF) 영양제를 매우 선호한다. 또한 이러한 영양제는 시장에서 허용되기 위해서는 저장 수명이 12개월 이상어야 한다. 따라서, 유리 글루타민은 이의 제한된 안정성 때문에 이러한 RTF 생성물에서는 허용될 수 없다.

연구자들은 용액중에서 장기간 안정성을 지닌 글루타민 공급원을 계속 찾아왔다. 예를 들어 미국 특허 제5,561,111호[참조문헌: Guerrant et al., "Stable Glutamine Derivatives for Oral and Intravenous Rehydration and Nutrition Therapy"]는 상기한 역할을 위한 알라닌-글루타민의 이용을 기술하고 있다. 구에란트 등은 포괄적으로 글루타민에 아실 보호 그룹이 위치할 수 있다고 명시하고 있지만 이러한 주장을 입증하는 생물학적 데이타를 제공하지는 않았다. 또한, 상기한 문헌은 일정량으로 유도체를 함유한 임의의 경구 또는 정맥내 화합물의 구체적인 제형에 관한 어떠한 기준도 제공하지 않았다.

간디니 등에 의해 지적된 바와 같이 용액을 이용한 제형화 문제의 견지에서는 이러한 실패가 특히 중요하다[참조문헌: Gandini et al., "HPLC Determination of Pyroglutamic Acid as a Degradation Product in Parenteral Amino Acid Formulations" Chromatographia, vol. 36, pp. 75-78 (1993)]. 저자는 글루타민이 피로글루탐산으로 분해되는 문제를 극복하기 위해서 디펩타이드를 이용할 것을 제안하였지만 이는 생성된 용액중 아미노산 함량이 질적으로 불균형하게 된다는 단점이 있다고 언급하였다. 저자는 또한 글루타민 유도체인 아세틸-글루타민의 낮은 생체이용율도 언급하였다.

구에란트 등의 결여된 생물학적 데이타는 이 분야의 다른 연구자들의 작업의 견지에서는 극히 중요한 것이었다. 팔메리니 등은 방사능 표지된 N-아세틸-L-글루타민을 랫트에게 경구 투여하였다[참조문헌: Palmerini et al., "Uptake of Doubly-Labeled N-Acetyl-L-Glutamine in Rat Brain and Intestinal Mucosa In Vivo, Farmaco, vol. 36 (7), pp. 347-355 (July 1981)]. 팔메리니 등은 N-아세틸-L-글루타민(NAQ)이 소장 점막을 통해 그대로 흡수됨을 입증하였다. 글루타민의 일차적인 활성중 하나가 장 상피세포를 보호하는 것이므로 아세틸기의 소장 가수분해 결여로 인해, 당분야의 숙련가는 영양 생성물중 잠재적인 글루타민 공급원으로서 NAQ를 고려하지 않을 것이다. 아미노산이 소장에 흡수되는 동안 상기한 보호 작용이 우세하게 일어난다.

영양 제형에 N-아세틸-L-글루타민을 사용하는 경우의 단점은 정맥 투여한 N-아세틸-L-글루타민 용량의 20 내지 40%가 뇨로 배출됨을 발견한 마그누손 등에 의해 논의되었다[참조문헌: Magnusson et al., "Utilization of Intravenously Administered N-Acetyl-L-Glutamine in humans" Metabolism, vol. 38 (8), suppl. 1 (August), pp. 82-88 (1989)]. 특히 랫트에서의 다른 잠재적인 문제는 월레스 등에 의해 언급되었는데, 그는 N-아세틸-(알라닌)₂와 같은 아세틸화 펩타이드의 부적절성 및 비효율적인 이용과 관련된 문제가 있다고 결론지었다[참조문헌: "Uptake of acetylated peptides from the small intestine in sheep and their nutritive value in rats" British Journal of Nutrition, v. 80, pp. 101-108 (1998)].

요약

본 발명에 따르면, 사람의 경구 글루타민 보충제로서 N-아세틸-L-글루타민이 유용하다는 것이 밝혀졌다. 본 발명자들은 사람의 소장 조직이 글루타민 공급원으로서 N-아세틸-L-글루타민을 이용할 수 있음을 밝혀내었다. 따라서, 사람이 소비하도록 디자인한 액체 영양제에 N-아세틸-L-글루타민을 혼입시킬 수 있다. 이러한 조성물은 장기간의 안정성을 지니며 사람이 생체이용할 수 있는 형태로 N-아세틸-L-글루타민을 제공한다. N-아세틸-L-글루타민은 산으로서 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염으로 투여할 수 있다. 이러한 발견은 사람을 제외한 다른 포유동물에서 실시한 초기의 작업의 견지에서는 예상치 못한 것이다.

N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염은 사람이 소비하기에 적합한 어떠한 액체 조성물에도 혼입시킬 수 있다. 적합한 조성물의 예에는 수용액, 예를 들어 경구 재수화 용액, 액체 영양 제형(예: 장 제형, 경구 제형, 성인용 제형, 소아 환자용 제형 및 유아용 제형) 등이 포함된다. N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 양은 매우 다양할 수 있는데, 전형적으로는 본 조성물은 사람의 경우 1일 체중 ㎏당 약 10㎎ 이상의 총 글루타민을 제공하기에 충분한 양으로 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유한다.

도 1은 다양한 pH 값 및 주위 온도에서 N-아세틸-L-글루타민의 수성 안정성을 그래프 형식으로 도시한 것이다. pH 5.0 내지 pH 8.0 샘플의 경우 모든 값이 동일하다.

도 2는 용액을 실온에서 180일 동안 방치하는 경우, pH 2.0 내지 8.0에 걸쳐 N-아세틸-L-글루타민 수용액중에 형성되는 분해 생성물을 그래프 형식으로 도시한 것이다.

도 3은 본원에서 기술하는 바와 같은 수술중(Intra-Surgery) 실험 동안에 분리된 돼지 소장 고리에 물질을 도입한 후, 시간의 함수로서 부가된 글루타민 또는 N-아세틸-L-글루타민의 소장내강중 잔류량을 그래프 형식으로 도시한 것이다. 분석물 잔류량은 0시간에 존재하는 분석물의 %로서 표현하였다.

도 4는 본원에서 기술하는 바와 같은 수술중 실험 동안에 분리된 돼지 소장 고리에 물질을 도입한 후, 시간의 함수로서 부가된 글루코스의 소장내강중 잔류량을 그래프 형식으로 도시한 것이다. 글루코스 잔류량은 0시간에 존재하는 양의 %로서 표현하였다.

도 5는 상이한 물질(글루코살린 대조, 글루코살린중 글루타민 또는 글루코살린중 N-아세틸-L-글루타민)을 분리된 소장 고리에 도입하는 경우, 돼지 문맥중 글루타민의 양을 투여 후 시간에 대한 그래프 형식으로 도시한 것이다.

도 6은 본원에서 기술하는 바와 같은 수술중 실험 후 측정한 돼지 소장의 공장 점막중 글루타민 및 글루타메이트의 양(㎍/g 습윤 점막)을 그래프 형식으로 도시한 것이다.

도 7은 30일 동안 인슈어 플러스(ENSURE PLUS) 제형을 공급한 건강한 돼지(A 및 B 패널) 및 카제인(C 및 D 패널), 글루타민(E 및 F 패널) 또는 NAQ(G 및 H 패널)가 보충된 동일 제형을 공급한 단백질 에너지 영양실조 돼지의 공장세포를 투명한 세포질 공간 및 림프구 침윤과 같은 염증 징후에 대해 분석한 투과 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 8은 30일 동안 인슈어 플러스(ENSURE PLUS) 제형을 공급한 건강한 돼지(A 및 B 패널) 및 카제인(C 및 D 패널), 글루타민(E 및 F 패널) 또는 NAQ(G 및 H 패널)가 보충된 동일 제형을 공급한 단백질 에너지 영양실조 돼지의 회장세포를 투명한 세포질 공간 및 림프구 침윤과 같은 염증 징후에 대해 분석한 투과 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 9는 셀리악병 환자의 비치료 점막상에서 세포사멸 및 염증의 발생에 대한 상이한 생성물/화합물의 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 N-아세틸 글루타민(A) 및 P5(B)로 처리한 점막 샘플에서 상피세포 TUNEL 발현 패턴을 나타낸 것이다.

도 11은 N-아세틸 글루타민(A) 및 P5(B)로 처리한 점막 샘플의 상피하 구획에서의 CD25 발현 패턴을 나타낸 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이 다음의 용어들은 하기하는 의미를 갖는다:

a) "총 글루타민"은 글루타민으로서 표현되는, 임의의 공급원으로부터의 생물학적으로 이용가능한 또는 잠재적으로 이용가능한 글루타민의 총량을 의미한다. 여기에는 유리 글루타민, 펩타이드의 일부 또는 완전한 단백질로서 발견되는 글루타민 및 생물학적으로 이용가능한 다른 글루타민 공급원(예: N-아세틸-L-글루타민)으로서 보충되는 글루타민이 포함될 수 있다. 글루타민 분해 부산물(예: 피로글루탐산 등)은 포함되지 않는다. 이러한 계산의 예로서 가설 생성물을 하기할 것이다.

영양 생성물은 하기하는 성분들을 포함한, 완전 단백질 및 약간 가수분해된 단백질을 함유한 단백질 시스템 60g/ℓ을 함유한다:

i. 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 방법에 의해 측정된 바와 같은 1.1g/ℓ의 유리 글루타민;

ii. 단백질 100g당 3.4g의 글루타민을 함유하도록 공개된 방법[참조문헌: Fouques, et al., "Study of the Conversion of Asparagine and Glutamine of proteins into Diaminopropionic and Diaminobutyric Acids Using [Bis (trifluoroacetoxy) iodo] benzene Prior to Amino Acid Determination. "Analyst, Volume 116, (May), pp 529- 531 (1991)]에 의해 분석된, 50.0g/ℓ의 단백질을 함유한 완전 단백질 및 약간 가수분해된 단백질의 블렌드; 및

iii. 하기에서 계산한 바와 같이 9.0g의 글루타민을 함유하는 11.6g/ℓ의 N-아세틸-L-글루타민:

따라서, "총 글루타민은" 이러한 3가지 공급원의 합이 된다: 1.1g/ℓ(유리)+(3.4g/100g 단백질×50g 단백질/ℓ)+9.0g/ℓ(NAQ)=11.8g.

b) "mmol"은 밀리몰(즉 1/1000몰)을 의미한다.

c) 용어 "영양학적으로 허용되는 염"은 사람에게 투여하기에 적합하고 액체 조성물중에 사용하도록 허용될 수 있는 N-아세틸-L-글루타민의 염을 의미한다. N-아세틸-L-글루타민의 영양학적으로 허용되는 염은 카복실기의 수소가 다른 양이온기로 치환된 염이다. 이러한 염은 N-아세틸-L-글루타민의 최종 분리 및 정제 동안에 제조하거나, 카복실기를 적합한 염기(예: 금속 양이온의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염), 또는 암모니아 또는 유기 1급, 2급 또는 3급 아민과 반응시켜 별도로 제조할 수 있다. 영양학적으로 허용되는 염 양이온은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속(예: 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄), 및 비독성 4급 암모니아 및 아민 양이온(예: 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민, 트리부틸아민, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민, 프로카인, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민)을 기본으로 한다. 염기 부가염의 형성에 유용한 다른 대표적인 유기 아민에는 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘 및 피페라진이 포함된다.

d) 명세서 및 청구항에서 전해질의 양에 관한 언급은 경구 재수화 용액중 전해질의 최종 농도를 의미하는 것으로 파악해야 한다. 수도물은 종종 잔류 나트륨, 염소 등을 포함한다. 본 명세서에서 나트륨 40mEq는 경구 재수화 용액중에 존재하는 총 나트륨이 40mEq임을 의미하는데, 이는 부가된 나트륨뿐만 아니라 경구 재수화 용액을 제조하는데 사용된 물에 존재하는 나트륨까지 고려한 것이다.

e) 본 명세서에서 숫자의 범위에 관한 언급은 형용사 "약"에 의해 가감되는 것으로 간주해야 한다. 또한, 어떠한 숫자의 범위도 범위의 부분집합을 나타내는 청구항을 지지하는 것으로 간주해야 한다. 예를 들어, 1 내지 10의 범위는 명세서 및 청구항에서 이 범위내의 어떠한 부분집합(예: 2 내지 9, 3 내지 6, 4 내지 5, 2.2 내지 3,6, 2.1 내지 9.9)도 지지하는 것으로 간주해야 한다.

본 발명은 유효량의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 경구 투여함으로써 사람에게 글루타민을 보충하는 방법 및 조성물을 제공한다. 영양 제형에 사용하기에 적합한 N-아세틸-L-글루타민은 익히 정립되어 있는 표준 화학 합성법을 이용하여 제조할 수 있는데, 예를 들어 합성후 적합한 염기 촉매(예: 피리딘)의 존재하에 유리 L-글루타민을 아세트산 무수물과 항온처리한 다음, 재결정화시켜 적절하게 정제하여 식용 등급으로 적합하게 순수한 화합물을 제조할 수 있다. 실제 아미노산 화학에서 익히 숙달되어 있는 몇몇 화학 회사는 식용 등급의 N-아세틸-L-글루타민을 제공한다(예: Kyowa Hakko Kogyo Co, Ltd., Tokyo, Japan; Flamma, s. p. a., Italy). 또한 다른 방법(예: 미생물 발효; 참조문헌: JP 제51038796호, JP 제57001994호 및 JP 제57016796호)을 이용하여 적합한 식용 등급의 N-아세틸-L-글루타민을 제조할 수 있다. N-아세틸-L-글루타민의 영양학적으로 허용되는 염은 카복실기의 수소를 다른 양이온으로 치환한 염이다. 이러한 염은 N-아세틸-L-글루타민의 최종 분리 및 정제 동안에 제조하거나, 카복실기와 적합한 염기(예: 금속 양이온의 수산화물, 탄산염 또는 중탄산염), 또는 암모니아 또는 유기 1급, 2급 또는 3급 아민을 반응시켜 별도로 제조할 수 있다. 영양학적으로 허용되는 염 양이온은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속(예: 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 및 알루미늄), 및 비독성 4급 암모니아 및 아민 양이온(예: 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테테라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민, 트리부틸아민, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민, 프로카인, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민 및 N,N'-디벤질에틸렌디아민)을 기본으로 할 수 있다. 염기 부가염의 형성에 유용한 다른 대표적인 유기 아민에는 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘 및 피페라진이 포함된다. 경우에 따라 시그마사(Sigma)의 약제학적 등급의 N-아세틸-L-글루타민을 사용할 수 있다.

사람에게 글루타민을 보충하는 방법은 유효량의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 경구 투여하는 것이 포함된다. 전형적으로는 N-아세틸-L-글루타민을 액체, 예를 들어 경구 재수화 용액, 스포츠 음료 또는 장 제형의 일부로 투여한다.

N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 유효량은, 바람직하게는 1일당 대략 10 내지 50g의 총 글루타민 또는 1일당 체중 ㎏당 약 140㎎ 이상의 총 글루타민을 제공하기에 충분한 양, 보다 바람직하게는 1일당 체중 ㎏당 250㎎ 이상(㎎/㎏/일)의 총 글루타민을 제공하기에 충분한 양이다. N-아세틸-L-글루타민은 매일을 기준으로 환자가 소비하는 총 글루타민의 약 1 내지 100%, 바람직하게는 약 10 내지 95%, 보다 바람직하게는 약 75 내지 90%를 제공한다.

N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염이 환자가 소비하는 글루타민의 유일한 공급원으로 제공되는 경우, N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 유효량은 바람직하게는 약 0.7mmol/㎏/일 이상이다. 보다 바람직하게는 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 유효량은 약 1.0mmol/㎏/일 이상이다. 심지어 보다 더 바람직하게는 N-아세틸-L-글루타민의 유효량은 약 1.5mmol/㎏/일 이상이다.

상기한 바와 같이, 250㎎/㎏/일의 총 글루타민을 제공하는데 필요한 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 양은 환자가 소비하는 다른 단백질 성분중에 존재하는 글루타민의 양에 따라 좌우될 것이다. 본 발명의 완벽한 효과를 얻기 위해서, 환자는 일반적인 기준으로 1일당 ㎏당 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 약 0.7 내지 약 4.0mmol으로 소비해야 한다. 단백질 시스템의 다른 성분의 총 글루타민 함량에 따라 이보다 적은 양이 유리할 수도 있다. 일반적으로 충분한 N-아세틸-L-글루타민은 1일당 체중 ㎏당 약 140㎎ 이상, 보다 바람직하게는 250㎎ 이상의 총 글루타민을 제공해야 한다.

본 방법을 이용하여 성인, 아동 및 유아에게 글루타민을 보충시킬 수 있다. 용어 "아동"은 1세부터 약 16세(즉, 성인기)까지의 사람을 의미한다. 용어 유아는 1세 미만의 모든 사람을 의미하는데 미숙아 및 조산아(micro-preemie)도 포함한다. 용어 미숙아는 임신 37주 이전에 태어난 유아 및/또는 출생시 2500g 미만의 유아를 의미하고, 조산아는 임신 23주 내지 28주 사이에 태어난 유아를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 비성인은 아동 및 유아를 포함한다.

성인, 아동 및 유아에게 공급되는 글루타민 등가물의 농도는 다양하다. 이러한 이유는 다양한 스트레스 상황에서 칼로리 요구량이 크게 달라지기 때문이다. 이러한 상황의 한가지 예로는, 심각한 외상 또는 미숙아에서 매우 소량의 장 영양제만이 허용될 수 있는 경우가 있다. 이러한 경우, 영양제의 다수는 먼저 비경구 공급을 통해 제공될 수 있다. 이러한 경우, 매우 소량의 장 영양제가 허용될 수 있으며 가능한 한 많은 글루타민 등가물을 공급하는 것이 유리하다. 따라서, 고농도의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 사용할 수 있다. 다른 적용에서는 표준 유아 제형에 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 보충하여 장 기능을 지지할 수 있는데, 이때 실질적으로 보다 낮은 농도를 사용한다.

글루타민이 유용한 어떠한 조건에도 N-아세틸-L-글루타민을 이용할 수 있다. 이러한 조건에는 적어도 위장 수술후의 회복 향상, 위장 절개, 소장 이식 및 기타 수술후 외상, 기아, 심각한 질환 및 손상(예: 다발성 외상), 소장증후군, 화상, 골수 이식, AIDS, 구강점막염, 셀리악병, 크론병, 괴사성 소장결장염, 장 미숙, 및 중증 기회감염(예: 패혈증)의 예방 또는 감염이 포함된다. 또한 화학요법 또는 방사선요법과 같이 특수한 치료와 관련된 장 악화의 예방 또는 경구 영양공급이 극히 제한되는 상황(예: 극도의 미숙)에서 글루타민을 보충하는 것도 도움이 될 수 있다. 또한 상기한 바의 복합적인 상황도 포함된다.

본 발명의 N-아세틸-L-글루타민은 사람이 소비하기에 적합한 어떠한 액체 용액을 이용하여서도 투여할 수 있다. 예를 들어, N-아세틸-L-글루타민을 물에 간단히 용해시킬 수 있다. 경우에 따라, 기호성을 향상시키기 위해 향미 음료에 이를 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 쿨레이드(Kool-Aid) 또는 소다(펩시 또는 콜라)에 혼입시킬 수 있다. 추가 양태에서, N-아세틸-L-글루타민을 스포츠 음료(게토레이드; Gator-Aid)에 혼입시킬 수도 있다.

그러나, 전형적으로는 경구 재수화 용액(ORS) 또는 액체 영양 제형을 통해 N-아세틸-L-글루타민을 투여한다. ORS와 같은 수용액에 혼입시킬 수 있는 N-아세틸-L-글루타민의 양은 매우 다양할 수 있다. 전형적으로 ORS는 용액 ℓ당 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 약 5.0mmol 이상 함유하며 추가로 최소한 물, 글루코스 및 나트륨을 함유한다. 보다 바람직하게는, ORS는 ℓ당 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 약 20 내지 약 300mmol 함유하며 보다 전형적으로는 약 25 내지 약 200mmol 함유한다. 쿨레이드 또는 게토레이드와 같은 액체를 사용하는 경우, N-아세틸-L-글루타민의 양은 ORS에서 기술한 바와 유사하다.

경구 재수화 용액은 당분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. 본 발명에 사용되는 ORS는 전형적으로 미국에서 판매되는 경구 재수화 제형에 대해 식품의약안전청이 요구하는 수준으로 모든 전해질을 함유한다. 나트륨(Na⁺), 칼륨(K⁺), 클로라이드(Cl^-) 및 시트르산염 이온 외에, 경구 재수화 용액은 글루코스, 프럭토스 또는 덱스트로스와 같은 탄수화물 공급원을 함유한다. 전형적으로 ORS는 물, 탄수화물, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 클로라이드 이온 및 시트르산염 이온을 함유한다.

당분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 ORS에 사용되는 나트륨 이온의 양은 매우 다양하다. 전형적으로 ORS는 약 30mEq/ℓ 내지 약 95mEq/ℓ의 나트륨을 함유한다. 추가 양태에서, 나트륨 함량은 약 30mEq/ℓ 내지 약 70mEq/ℓ, 보다 바람직하게는 약 40mEq/ℓ 내지 약 60mEq/ℓ로 다양할 수 있다. 적합한 나트륨 공급원에는 염화나트륨, 시트르산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 1밀리당량(mEq)은 소정의 용적중 농도에 의해 결정되는 바와 같이 용액중 이온수를 의미한다. 이러한 측정치는 리터당 밀리당량수(mEq/ℓ)로 표현한다. 밀리당량은 mEq에 무기질의 원자량을 곱한 다음, 이 수를 무기질 원자가로 나누어 밀리그램으로 전환시킬 수 있다.

또한 ORS는 칼륨 이온 공급원을 함유한다. 칼륨의 양은 매우 다양할 수 있다. 그러나 일반적인 기준으로 ORS는 전형적으로 약 10mEq/ℓ 내지 약 30mEq/ℓ의 칼륨을 함유한다. 추가 양태에서, ORS는 약 15mEq/ℓ 내지 약 25mEq/ℓ의 칼륨을 함유할 수 있다. 적합한 칼륨 공급원에는 시트르산칼륨, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 탄산칼륨, 수산화칼륨 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

또한 ORS는 탄수화물 공급원을 함유한다. 사용되는 탄수화물의 양은 상기한 바와 같이 중요하다. 이의 양은 약 3%w/w 이하, 보다 바람직하게는 약 2.5%w/w 이하로 유지되어야 한다. 약 3%w/w 내지 약 2.0%w/w 범위의 양이 적합하다. 과도한 탄수화물은 설사와 관련된 체액 및 전해질 손실을 악화시킨다.

당분야의 경구 재수화 용액에 사용되는 어떠한 탄수화물도 사용할 수 있다. 적합한 탄수화물에는 단순 및 복합 탄수화물, 글루코스, 덱스트로스, 프럭토올리고당, 프럭토스 및 글루코스 중합체, 옥수수 시럽, 고프럭토스 옥수수 시럽, 수크로스, 말토덱스트린 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

또한 ORS는 전형적으로 설사로 인한 손실을 대체하는 염기 공급원을 함유한다. 전형적으로 시트르산염을 경구 재수화 용액에 혼입시켜 이러한 결과를 얻을 수 있다. 시트르산염은 산-염기 균형 유지를 돕는 혈중 염기인 중탄산염과 동일한 양으로 대사된다. 시트르산염이 바람직한 염기 공급원이지만 재수화 용액에 일반적으로 혼입되는 다른 염기를 사용할 수도 있다.

당분야에 공지된 바와 같이 시트르산염의 양은 다양할 수 있다. 전형적으로 시트르산염 함량은 약 10mEq/ℓ 내지 약 40mEq/ℓ, 보다 바람직하게는 약 20mEq/ℓ 내지 약 40mEq/ℓ, 가장 바람직하게는 약 25mEq/ℓ 내지 약 35mEq/ℓ의 범위이다. 적합한 시트르산염 공급원에는 시트르산칼륨, 시트르산나트륨, 시트르산 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

또한 ORS는 클로라이드 공급원을 함유한다. 당분야에 공지된 바와 같이 클로라이드의 양은 다양하다. 전형적으로 ORS는 약 30mEq/ℓ 내지 약 80mEq/ℓ, 보다 바람직하게는 약 30mEq/ℓ 내지 약 75mEq/ℓ, 가장 바람직하게는 약 30mEq/ℓ 내지 약 70mEq/ℓ의 양으로 클로라이드를 함유한다. 적합한 클로라이드 공급원에는 염화나트륨, 염화칼륨 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

임의로, 난소화성 올리고당을 ORS에 혼입시킬 수 있다. 난소화성 올리고당은 GI관의 미생물군에 유익한 영향을 줄 수 있다. 이들은 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile)과 같은 병원성 유기체의 성장 억제를 돕는다. 이러한 올리고당은 비병원성 미생물군의 성장을 선택적으로 촉진시킨다. 이러한 경구 재수화 용액은, 본원에서 참조문헌으로 인용되는 1995년 4월 5일자로 출원된 미국 특허 제5,733,759호에 기술되어 있다. 전형적으로 올리고당은 프럭토올리고당, 이눌린(예: 라프틸로스) 또는 자일로올리고당이다. 이의 양은 다양하지만 수용액 리터당 1 내지 100g, 보다 전형적으로는 수용액 리터당 3 내지 30g의 범위일 수 있다.

또한 특히 소아군에서 ORS는 전형적으로 기호성을 향상시키는 풍미를 함유한다. 풍미는 수용액의 짠 맛을 차폐해야 한다. 유용한 풍미에는 복숭아, 버터피칸, 블루베리, 바나나, 체리, 오렌지, 포도, 프루트 펀치(fruit punch), 풍선껌, 사과, 나무딸기 및 딸기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 인공 감미료를 가하여 풍미를 보완하고 짠 맛을 차폐할 수 있다. 유용한 인공 감미료에는 사카린, 뉴트라스위트, 수크랄로스, 아세설판-K(ace-K) 등이 포함된다.

보존제를 가하여 저장 수명을 연장시킬 수 있다. 당분야의 숙련가라면 이러한 결과를 수득하기 위해 적정량의 적절한 보존제를 선택할 수 있을 것이다. 전형적인 보존제에는 솔빈산칼륨 및 벤조산나트륨이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

상기한 탄수화물 외에, ORS는 또한 쌀가루, 또는 설사 치료에 유익한 쌀의 다른 성분을 함유할 수 있다. 경구 재수화 용액에 보충되는 다수의 쌀이 문헌에 기술되어 있다. 경구 재수화 용액에 보충되는 이러한 쌀의 이용방법은 당분야에 익히 공지되어 있다. 경구 재수화 용액에 보충되는 쌀의 예에는 1996년 2월 6일자로 허여된 미국 특허 제5,489,440호에 기술된 것이 포함된다.

ORS는 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 일반적으로 기준으로 모든 성분을 함께 건식 블렌딩하고, 교반하면서 이를 물에 분산시킨 다음, 임의로 적절한 온도로 가열하여 모든 구성성분들을 용해시킬 수 있다. 그런 다음, 당분야에 공지된 바와 같이 식용 등급 기준에 따라 ORS를 포장하고 멸균시킨다.

ORS는 당분야에 공지된 바와 같이 환자의 선호도에 따라 여러가지 형태로 투여할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 아동들은 아이스캔디(Popsicle)형과 같이 냉동시킨 경우에 보다 용이하게 경구 재수화 용액을 소비할 수 있다. 경구 재수화 용액 아이스캔디는 미국 특허 제5,869,459호에 상세히 기술되어 있다. 또한 특히 소아군에서 환자의 순응성을 향상시키기 위해 경구 재수화 용액을 겔로 성형시킬 수 있다. 겔화된 재수화 조성물은 1999년 8월 4일자로 출원된 미국 특허원 제09/368,388호에 기술되어 있다. 이러한 겔은 또한 PCT 특허원 제99/15862호에 기술되어 있다. 개괄적으로 수용액은 유동성 겔로 성형시킬 수 있다. 또한 이를 자체 지지 겔 구조로 성형시킬 수도 있다. 이러한 결과는 적합한 겔화제를 수용액에 혼입시켜 수득할 수 있다.

수용액에 사용하기에 적합한 겔화제에는 한천, 알긴산 및 염, 아라비아고무, 아카시아고무, 탈하고무, 구아고무, 이오타 카라기난, 진두발, 카파 카라기난, 곤약분, 카라야고무, 람다 카라기난, 낙엽송고무/아라비노갈락탄, 로커스트 콩 고무, 펙틴, 타마린드씨고무, 타라고무, 트라가칸트고무, 천연 및 변형 전분, 잔탄고무 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 겔화제의 사용 비율은 약 0.05 내지 약 50w/w%의 범위이다.

상기한 바와 같이, N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염은 액체 영양 생성물로 투여할 수 있다. 액체 영양제에 혼입되는 N-아세틸-L-글루타민의 양은 다양하지만 상기한 바와 같은 용량 기준에 부합해야 한다. 액체 영양 제형에 사용되는 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 양은, 제형이 영양 공급원의 전부 또는 일부를 제공하는지, 제형이 다른 글루타민 공급원을 함유하는지, 1일을 기준으로 소비되는 제형의 양 및 제형이 필요한 환자의 유형(이는 또한 1일 소비되는 제형의 양에 영향을 미친다)을 포함한 여러가지 인자에 좌우된다. 다른 단백질 성분중에 함유된 글루타민과 배합하는 경우, 제형은 1일당 체중 ㎏당 140㎎ 이상의 총 글루타민을 제공하기에 충분한 양으로 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하는 것이 바람직하다. 또한 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 양은 단백질 칼로리의 %로서 표현할 수 있다. 이러한 표현법에 따르면, 영양 제형은 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 단백질 칼로리의 약 1 내지 약 100%로 함유한다. 퍼센트는 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 단백질 부분(즉, 글루타민 부분)을 기준으로 하여 계산하며, N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 비단백질 부분(즉, 아세테이트 또는 염 부분)이 기여하는 칼로리는 고려하지 않는다. 바람직하게는, 영양 제형이 성인용인 경우, 이는 단백질 칼로리의 약 10 내지 약 95%를 제공하기에 충분한 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유한다. 영양 제형이 비성인용으로 디자인되는 경우, N-아세틸-L-글루타민은 단백질 칼로리의 약 1 내지 약 12%를 공급하기에 충분한 양으로 존재한다.

액체 영양 제형에는 장 제형, 경구 제형, 성인용 제형, 소아 환자용 제형 및 유아용 제형이 포함된다. 예를 들어, 장 제형 및 영양 제형은 긴급 관리 병원 및 장기간 관리 기관(즉, 요양소)에서 환자 관리에 있어 중요한 성분이 된다. 차선의 영양 상태를 향상시키는데 보충제를 사용하는 것이 일반적이더라도, 상기한 제형은 장기간에 걸쳐 사람의 단독 영양 공급원으로서 작용할 수 있다. 따라서, 제형이 영양실조를 방지하기 위한 이의 일차적인 목적에 부합하려면 단백질, 지방, 무기질, 전해질 등을 상당량 함유해야 한다. 대상이 되는 환자의 상당 비율이 고형식을 소비할 수 없기 때문에 전형적으로 이러한 제형은 액체로서 환자에게 투여한다. 몇몇 환자가 제형을 음용할 수 있더라도 상당수는 비위관(NG관 또는 관 공급)을 통해 장 제형을 투여받는다.

액체 영양 제형은 제형의 총 칼로리 함량의 14 내지 35%를 제공하는 단백질 성분, 총 칼로리 함량의 36 내지 76%를 제공하는 탄수화물 성분 및 총 칼로리 함량의 6 내지 51%를 제공하는 액체 성분을 함유한다. 액체 영양 제형은 성인 제형, 소아 제형 또는 유아 제형일 수 있다(수용액을 성인, 소아 환자 또는 유아에게 투여할 수 있는 것과 같다). 고글루타민 적용의 경우, 액체 영양 제형은 바람직하게는 적어도 주요 영양 공급원을 제공한다. 그러나, 특히 대부분 비경구 영양 공급이 일반적으로 실시되는 경우(예: 자궁밖에서 처음 몇주에 걸쳐 서서히 경구 영양공급으로 바꾸는 극도의 미숙아), 본원에서 기술한 액체 영양 제형이 최소한의 영양 주 공급원외에 다른 것으로도 사용될 수 있다. 용어 최소한의 영양 주공급원은 제형을 투여받는 환자의 총 칼로리 및 영양 요구량의 적어도 절반을 제공하기에 충분한 양으로 제형이 공급됨을 의미한다. 이러한 정의에는 단독 영양 공급원으로서 공급되어 제형을 투여받는 환자의 총 칼로리 및 영양 요구량 전부를 제공하는 제형이 포함된다. 요구되는 영양 및 칼로리의 양은 환자에 따라 다양한데, 연령, 체중 및 신체 조건과 같은 여러 변수에 따라 좌우된다. 적절한 영양 및 칼로리의 양을 공급하는데 필요한 영양 제형의 양은 당분야의 숙련가가 결정할 수 있는데, 상기한 제형에 적절한 영양 및 칼로리의 양을 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 제형이 성인 제형인 경우, 단백질 성분은 상기 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 약 14 내지 약 35%를 구성할 수 있으며, 탄수화물 성분은 상기 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 약 36 내지 약 76%를 구성할 수 있고, 지질 성분은 상기 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 약 6 내지 약 41%를 구성할 수 있다. 영양 제형은 경구 영양공급용 제형 또는 장 공급용 제형일 수 있다. 다른 예로서 제형이 비성인용 제형인 경우, 단백질 성분은 상기 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 약 8 내지 약 25%를 구성할 수 있고, 탄수화물 성분은 총 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 약 39 내지 약 44%를 구성할 수 있으며, 지질 성분은 총 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 약 45 내지 약 51%를 구성할 수 있다. 이러한 범위는 단지 예로서 제공되며 본 발명을 한정하지는 않는다.

실질적인 문제로서 상기한 생성물은 총 글루타민 함량의 대략 절반 또는 그 이상을 제공하기에 충분한 양의 N-아세틸-L-글루타민 및 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유한다. 또는, N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 유효량은 1000㎉당 mmol로 표현할 수 있다. 이러한 표현에 따르면, 표적 글루타민 양이 1일/㎏/1일 당 대략 300㎎의 글루타민이라면, 성인의 경우 바람직하게는 영양 제형은 영양 제형 1000㎉당 약 35mmol 이상의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하며, 아동, 유아 또는 미숙아(비성인)의 경우 영양 제형 1000㎉당 약 5.0mmol 이상의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 이러한 영양 제형은, 성인의 경우 영양 제형 1000㎉당 약 35 내지 약 160mmol의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하고, 아동의 경우 영양 제형 1000㎉당 약 5.0 내지 약 32mmol의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하며, 유아 또는 미숙아의 경우 영양 제형 1000㎉당 약 5.0 내지 약 26mmol의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유한다.

N-아세틸-L-글루타민 외에, 영양 제형은 영양 제형 제조 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이 적합한 탄수화물, 지질 및 단백질을 함유한다. 적합한 탄수화물에는 왁스형 또는 비왁스형의 옥수수, 타피오카, 쌀 또는 감자로부터의 가수분해된 전분, 완전 전분, 천연 및/또는 화학적으로 변형된 전분; 당(예: 글루코스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 고프럭토스 옥수수 시럽, 옥수수 시럽 고형물, 프록토올리고당); 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 말토덱스트린은, (예를 들어 옥수수 또는 쌀) 전분의 산 또는 효소 가수분해에 의해 수득된 다당이다. 이의 분류는 가수분해 정도를 기본으로 하며 덱스트로스 당량(DE)으로 언급한다. 영양 제형에 사용되는 임의의 말토덱스트린의 DE는 바람직하게는 약 18 내지 20 이하이다.

적합한 지질에는 코코넛유, 콩기름, 옥수수유, 올리브유, 잇꽃유, 고올레산 잇꽃유, MCT유(중쇄 트리글리세라이드), 해바라기유, 고올레산 해바라기유, 팜유, 팜 올레인, 카놀라유, 면실유, 어유, 팜핵유, 청어유, 대두유, 레시틴, 아라키돈산 및 도코사헥사엔산의 지질 공급원 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 아라키돈산 및 도코사헥사엔산의 지질 공급원에는 해양유, 달걀 난황유, 및 진균 또는 조류 오일이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 이러한 지방에 대한 다수의 공급원은 용이하게 구입할 수 있으며 당분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 콩기름 및 카놀라유는 아처 다니엘스 미드랜드(Archer Daniels Midland of Decatur, Illinois)부터 구입할 수 있다. 옥수수유, 코코넛유, 팜유 및 팜핵유는 프리미어 에디블 오일 코포레이션(Premier Edible Oils Corporation of Portland, Organ)으로부터 구입할 수 있다. 분별 코코넛유는 헨켈 코포레이션(Henkel Corporation of LaGrange, Illinois)으로부터 구입할 수 있다. 고올레산 잇꽃유 및 고올레산 해바라기유는 SVO 스페셜티 프로덕츠(SVO Specialty Products of Eastlake, Ohio)로부터 구입할 수 있다. 해양유는 모키다 인터내셔널(Mochida International of Tokyo, Japan)로부터 구입할 수 있다. 올리브유는 앤글리아 오일즈(Anglia Oils of North Humberside, United Kingdom)로부터 구입할 수 있다. 해바라기유 및 면실유는 카길(Cargil of Minneapolis, Minnesota)로부터 구입할 수 있다. 잇꽃유는 캘리포니아 오일즈 코포레이션(California Oils Corporation of Richmond, California)으로부터 구입할 수 있다.

이러한 식용 등급의 오일 외에, 경우에 따라서는 구조화 지질을 영양제에 혼입시킬 수 있다. 구조화 지질은 당분야에 공지되어 있다. 구조화 지질에 관한 간략한 설명은 다음 문헌에서 찾을 수 있다[참조문헌: INFORM, Vol.. 8, no. 10, page 1004, entitled Structured lipids allow fat tailoring (October 1997)]. 또한 미국 특허 제4,871,768호도 참조할 수 있다. 구조화 지질은 주로 동일한 글리세롤 핵상에 중쇄 및 장쇄 지방산의 혼합물을 포함한 트리글리세라이드이다. 구조화 지질 및 장 제형에서의 이의 용도는 또한 미국 특허 제6,194,37호 및 제6,160,007호에 기술되어 있다.

적합한 단백질 공급원에는 우유, 유장 및 유장 분획, 콩, 쌀, 육류(예: 쇠고기), 동물 및 식물(예: 완두콩, 감자), 달걀(달걀 알부민), 젤라틴 및 생선이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 적합한 완전 단백질 공급원에는 콩계 단백질, 유계 단백질, 카제인 단백질, 유장 단백질, 쌀 단백질, 쇠고기 콜라겐, 완두콩 단백질, 감자 단백질 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 적합한 단백질 가수분해물에는 콩 단백질 가수분해물, 카제인 단백질 가수분해물, 유장 단백질 가수분해물, 쌀 단백질 가수분해물, 감자 단백질 가수분해물, 생선 단백질 가수분해물, 달걀 알부민 가수분해물, 젤라틴 단백질 가수분해물, 동물 및 식물 단백질 가수분해물의 혼합물, 및 이들의 혼합물이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 가수분해된 단백질(단백질 가수분해물)은 짧은 펩타이드 단편 및 아미노산으로 가수분해된 또는 파괴된 단백질이다. 이러한 가수분해된 펩타이드 단편 및 유리 아미노산은 보다 용이하게 소화된다. 보다 넓은 의미에서 단백질은 하나 이상의 아미드 결합이 파괴된 경우에 가수분해된다. 아미드 결합의 파괴는, 예를 들어 가열 또는 전단으로 인해 제조하는 동안에 우연하게 또는 의도하지 않게 발생할 수 있다. 설명할 목적에서, 가수분해된 단백질은 의도된 방식으로 가공 또는 처리하여 아미드 결합을 파괴한 단백질을 의미한다. 의도한 가수분해는, 예를 들어 완전 단백질을 효소 또는 산으로 처리함으로써 실시할 수 있다. 본원에서 기술한 액체 영양 제형에 바람직하게 사용되는 가수분해된 단백질은, 아미노 질소(AN) 대 총 질소(TN)의 비가 약 0.1AN 대 약 1.0TN 내지 약 0.4AN 대 약 1.0TN, 바람직하게는 약 0.25AN 대 약 1.0TN 내지 약 0.4AN 대 약 1.0TN이다(가수분해물 단백질 단독의 경우에 AN:TN 비는 제시되어 있으며 최종 영양 제형에서 AN:TN 비를 나타내지는 않는다).

단백질은 유리 아미노산 형태로도 제공될 수 있다. 영양 제형에는 영양학적으로 보다 완벽하고 균형잡힌 제형을 제공하기 위해 다양한 아미노산을 보충시킬 수 있다. 적합한 유리 아미노산의 예에는, 단백질 시스템의 일부로서 일반적으로 간주되지만 특별하게는 영양학적 관점에서 필수 또는 조건부로 필수인 모든 유리 L-아미노산, 즉 트립토판, 티로신, 시스테인, 메티오닌, 아르기닌, 류신, 발린, 라이신, 페닐알라닌, 이소류신, 트레오닌 및 히스티딘이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 전형적으로 영양 생성물에 부가되는 다른 (비단백질) 아미노산에는 카르니틴 및 타우린이 포함된다. 몇몇 경우에서는 D형 아미노산이 L-형과 영양학적으로 동등하게 간주되며 비용을 낮추기 위해 이성체 혼합물을 사용한다(예: D,L-메티오닌).

또한 바람직하게는, 영양 제형은 제형을 투여받는 환자의 1일 영양 요구량을 충족시키도록 디자인된 양으로 비타민 및 무기질을 함유한다. 당분야의 숙련가라면, 생성물의 저장 수명에 걸쳐 1일 영양 요구량에 충족됨을 보장하기 위해 영양 제형에 종종 특정 비타민 및 무기질을 강화시킬 필요가 있음을 인지할 것이다. 또한 당분야의 숙련가라면 환자가 걸린 근본적인 질병 또는 질환에 따라 특정 마이크로 성분이 사람에게 잠재적인 잇점을 부여할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어 당뇨병에는 크롬, 카르니틴, 타우린 및 비타민 E와 같은 영양소들이 유익하다. 제형은 바람직하게는 칼슘, 인, 나트륨, 클로라이드, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 셀레늄, 요오드, 크롬, 몰리브덴, 조건부 필수 영양소인 m-이노시톨, 카르니틴 및 타우린, 비타민 A, C, D, E, K 및 B 복합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되지만 이에 제한되지는 않는 비타민 및 무기질을 함유한다.

유야용 액체 영양제인 경우, 특정 영양 기준은 유아용 제형(Infant Formula) Act 21 U.S.C. 350(a)섹션에서 찾을 수 있다. 이러한 규칙에서 볼 수 있는 영양 기준은 영양 요구와 관련된 추가 연구가 완성됨에 따라 지속적으로 개량하고 있다. 청구되는 영양 제형은 여기서 열거하지는 않은 비타민 및 무기질을 함유한 제형을 포함한다.

또한 액체 영양 제형은 섬유소 및 안정화제를 함유할 수 있다. 적합한 섬유소 및/또는 안정화제 공급원에는 잔탄 고무, 구아고무, 아라비아고무, 가티고무, 카라야고무, 트라가칸트고무, 한천, 푸르셀라란, 젤란고무, 로커스트 콩 고무, 펙틴, 저 메톡시 펙틴, 고 메톡시 펙틴, 귀리 및 보리 글루칸, 카라기난, 차전자, 젤라틴, 미정질 셀룰로스, CMC(나트륨 카복시메틸셀룰로스), 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 하이브록시프로필 셀룰로스, DATEM(모노글리세라이드 및 디글리세라이드의 디아세틸 타르타르산 에스테르), 덱스트란, 카라기난, FOC(프럭토올리고당) 및 이들의 혼합물이 포함된다. 가용성 식이 섬유소의 여러가지 공급원은 시판되고 있다. 예를 들어, 아라비아고무, 가수분해된 카복시메틸셀룰로스, 구아고무, 펙틴, 저메톡시 펙틴 및 고메톡시 펙틴은 TIC 검즈(TIC Gums, Inc. of Belcamp, Maryland)로부터 구입할 수 있다. 귀리 및 보리 글루칸은 마운틴 레이크 스페셜티 인그레디언츠, 인코포레이티드(Mountain Lake Specialty Ingredients, Inc. of Omaha, Nebraska)로부터 구입할 수 있다. 차전자는 미어 코포레이션(Meer Corporation of North Bergen, New Jersey)으로부터 구입할 수 있으며 카라기난은 FMC 코포레이션(FMC Corporation of Philadelphia, Pennsylvania)으로부터 구입할 수 있다.

혼입되는 섬유소는 또한 불용성 식이 섬유소일 수도 있는데, 이의 대표적인 예에는 귀리 꼬투리 섬유소, 완두콩 꼬투리 섬유소, 콩 꼬투리 섬유소, 콩 떡잎 섬유소, 사탕무 섬유소, 셀룰로스 및 옥수수겨가 포함된다. 불가용성 식이 섬유소의 여러가지 공급원은 시판되고 있다. 예를 들어 옥수수겨는 퀘이커 오얏츠(Quaker Oats of Chicago, Illinois), 귀리 꼬투리 섬유소는 카나디안 하비스트(Canadian Harvest of Cambridge, Minnesota)로부터 구입할 수 있고, 완두콩 꼬투리 섬유소는 우드스톤 푸즈(Woodstone Foods of Winnipeg, Canada), 콩 꼬투리 섬유소 및 귀리 꼬투리 섬유소는 더 파이브래드 그룹(The Fibrad Group of LaVale, Maryland)로부터 구입할 수 있고, 콩 떡잎 섬유소는 프로테인 테크놀로지즈 인터내셔널(Protein Technologies International of St. Louis, Missouri), 사탕무 섬유소는 델타 파이버 푸즈(Delta Fiber Foods of Minneapolis, Minnesota)로부터 구입할 수 있으며, 셀룰로스는 더 제임스 리버 코포레이션(James River Corp. of Saddle Brook, New Jersey)로부터 구입할 수 있다.

섬유소의 예와 제형으로의 이의 혼입에 관한 보다 상세한 논의는 가를레브 등(Garleb et al.)에게 허여된 미국 특허 제5,085,883호에서 찾을 수 있다.

제형에 사용되는 섬유소의 양은 다양하다. 사용되는 섬유소의 특정한 유형은 중요하지 않다. 사람이 소비하기에 적합하고 영양 제형의 매트릭스에서 안정한 어떠한 섬유소도 사용할 수 있다.

섬유소 외에, 또한 영양제는 프럭토올리고당(FOS) 또는 글루코올리고당(GOS)과 같은 올리고당을 함유할 수 있다. 올리고당은 대장에 상주하는 혐기성 미생물에 의해 신속하고 광범위하게 발효되어 단쇄 지방산이 된다. 이러한 올리고당은 대부분의 비피도박테리움(Bifidobacterium) 종이 선호하는 에너지원이지만 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 디피실리(Clostridium difficile) 또는 이. 콜라이(E. coli)와 같은 잠재적 병원성 유기체에 의해 이용되지는 않는다.

액체 영양 제형은 또한 기호성을 향상시키는 풍미를 함유한다. 유용한 풍미에는 초콜렛, 바닐라, 커피, 복숭아, 버터피칸, 블루베리, 바나나, 체리, 오렌지, 포도, 프루트 펀치, 풍선껌, 사과, 나무딸기 및 딸기가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 인공 감미료를 가하여 풍미를 보완하고 짠 맛을 차폐할 수 있다. 유용한 인공 감미료에는 사카린, 뉴트라스위트, 수크랄로스, 아세설판-K(ace-K) 등이 포함된다.

액체 영양 제형은 당분야의 숙련가에게 익히 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 다양한 가공 기술이 존재한다. 전형적으로 이러한 기술에는 수분, 및 탄수화물, 단백질, 지질, 안정화제, 비타민 및 무기질 중 하나 이상을 함유할 수 있는 하나 이상의 용액으로부터 슬러리를 형성시키는 방법이 포함된다. 슬러리를 유화시키고 균질화하여 냉각시킨다. 가공 전, 가공 후 또는 가공과 동시에 다양한 다른 용액을 슬러리에 가할 수 있다. 그런 다음, 가공한 제형을 멸균시키고, 바로 공급가능한(RTF) 기제에 사용하기 위해 희석시키거나 농축된 액체형으로 저장할 수 있다. 생성된 제형이 바로 공급가능한(RTF) 액체 또는 농축된 액체를 의미하는 경우, 멸균 전에 적정량의 물을 가한다.

본 발명은 또한 상기한 수용액 및 액체 영양제에 혼입되어 있는 NAQ를 투여함으로써 셀리악병으로부터 고통받는 환자의 장 점막 염증을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 실시예 5에서 본 발명자들은 상피 세포사멸(apoptosis)을 모니터하는데 마커 TUNEL을 사용하고 상피하 염증을 모니터하는데 CD25를 사용하였다. 본 발명자들은 마커 중 하나 또는 둘다를 유도하는 화합물/생성물을 발견하였는데, 이들 화합물/생성물은 셀리악병 환자의 점막에 대해 독성이 있는 것으로 간주되었다. 그러나, N-아세틸-L-글루타민은 비치료 셀리악 환자의 생검상에 분명한 영양 효과를 갖는다. 영양성은 다른 샘플에 비해 유의적으로 개선된 특정 상피세포에서 점막의 일반적인 향상으로 정의된다. N-아세틸-L-글루타민의 예상밖의 영양 효과는, 심지어 음성 대조군(배지 단독)에 비해서도 전체적인 점막 조건을 향상시키는 것으로 나타났다.

액체 영양 제형의 제조방법

청구의 범위에 부합하는 액체 영양 제형은 다음의 방법에 의해 제조할 수 있다. 이러한 실시예는 예시를 위해 설명하며 본 발명을 제한하는 것으로 해석해서는 안된다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다른 탄수화물, 지질, 단백질, 안정화제, 비타민 및 무기질을 사용할 수 있다.

실시예 1

N-아세틸-L-글루타민을 함유한 영양 제형의 제조방법

N-아세틸-L-글루타민을 함유한, 즉시 공급가능한 액체 생성물은 표 1에 열거한 무기질을 사용하여 제조한다. 생성물을 생산하는데 사용된 과정은 하기에 요약되어 있다.

바닐라향 생성물에 대한 재료 목록
성분명	양(1000kg당)
물	최종 질량이 되도록 하는 양
말토덱스트린	77.88kg
수크로스	52.80kg
콩 단백질 가수분해물	30.11kg
어유/중쇄 구조화 지질	16.14kg
카제인산나트륨	14.74kg
프럭토올리고당	5.792kg
카놀라유	4.842kg
대두유	4.842kg
45% 수산화칼륨	3.653kg
삼인산칼슘	2.866kg
N-아세틸-L-글루타민	10.03kg
L-아르기닌	2.425kg
시트르산나트륨	2.293kg
인공카르멜	1.500kg
N & A 바닐라향	1.000kg
유화제	1.076kg
인산마그네슘	0.948kg
염화마그네슘	0.860kg
아스코르브산	0.697kg
콜린클로라이드	0.474kg
젤란 고무	0.250kg
비타민 D, E, K 프리믹스(premix)¹	0.203kg
타우린	0.139kg
카르니틴	0.130kg
비타민 E(R,R,R)(81%)	0.123kg
미량의 무기질 프리믹스²	0.101kg
수용성 비타민 프리믹스³	0.0882kg
30% 베타카로틴	15.5g
비타민 A(55%)	5.07g
요오드산칼륨	0.194g
아셀렌산나트륨	0.132g
비타민 K	0.0617g
1. 비타민 D, E, K 프리믹스는 코코넛유(146.77g) 담체중 비타민 D3(0.0980g), d-알파-토코페릴 아세테이트(55.93g) 및 비타민 Kl(0.0338g)을 포함한다. 2. 미량의 무기질 프리믹스는 (최종 생성물 1000㎏당) 황산아연(46.3g), 황산제1철 (39.2g), 황산망간(11.4g) 및 황산구리(3.89g)를 제공한다. 3. 수용성 비타민 프리믹스는 덱스트로스(17.29g) 담체중 니아신아미드(33.07g), d-판토텐산칼슘(21.43g), 엽산(0.742g), 염화티아민 HCL(5.47g), 리보플라빈(4.27g), 피록시딘 HCL(5.26g), 시아노코발라민(0.0147g) 및 바이오틴(0.644g)을 포함한다.

과정: 상기한 액체 영양 제형은, 재료를 함께 블렌딩하여 3가지 슬러리를 제조하고 해양유/MCT 구조화 지질과 배합하여 열처리한 다음, 표준화하고 포장 및 멸균함으로써 만들 수 있다. 제조방법은 하기에서 상세히 설명할 것이다.

탄수화물/무기질 슬러리는, 먼저 적정량의 물을 교반하면서 약 65℃ 내지 약 71℃ 사이의 온도로 가열하여 제조한다. 그런 다음, 세게 교반하면서 시트르산나트륨, 미량의 무기질 프리믹스, 시트르산칼륨, 염화망간, 인산마그네슘, 삼인산칼슘 및 요오드산칼륨의 순서로 필요량의 무기질을 가한다. 그런 다음, 세게 교반하면서 필요량의 말토덱스트린(Maltring^R M-100; Grain Processing Corporation of Muscatine, Iowa)을 슬러리에 가하고, 온도를 약 71℃로 유지시키면서 이를 방치하여 용해시킨다. 그런 다음, 세게 교반하면서 필요량의 수크로스 및 프럭토올리고당(Nutriflora-P^R Fructo-oligosaccharide Powder; Golden Technologies Company of Golden, Colorado)을 가한다. 그런 다음, 필요량의 젤란고무(Kelcogel^R; 공급원: Kelco, Division of Merck and Company Incorporated of San Diego, California)를 1:5(젤란고무/수크로스 비)로 수크로스와 함께 건식 블렌딩시킨 다음, 세게 교반하면서 슬러리에 가한다. 그런 다음, 교반하면서 온수에 용해시킨 셀렌산나트륨을 슬러리에 가한다. 완성된 탄수화물/무기질 슬러리는 다른 슬러리와 블렌딩하기 전까지 최대 12시간 동안 약 65℃ 내지 약 71℃의 온도에서 교반한다.

오일 블렌드는 필요량의 대두유 및 카놀라유를 합하고, 교반하면서 약 55℃ 내지 약 65℃의 온도로 가열하여 제조한다. 교반하면서 필요량의 유화제, 모노디글리세라이드의 디아세틸 타르타르산 에스테르(Panodan^R; 공급원: Grindsted Products Incorporated of New Century, Kansas)를 가한 다음, 방치하여 용해시킨다. 그런 다음, 교반하면서 비타민 D, E, K 프리믹스, 55% 비타민 A 팔미테이트, D-알파-a-토코페롤 아세테이트(R, R, R형), 필로퀴논 및 30% 베타 카로틴을 가한다. 완성된 오일 블렌드는 다른 슬러리와 블렌딩하기 전까지 최대 12시간 동안 약 55℃ 내지 약 65℃의 온도에서 온화하게 교반한다.

수중 단백질 슬러리는 먼저 적정량의 물을 교반하면서 약 60℃ 내지 약 71℃ 사이의 온도로 가열하여 제조한다. 교반하면서 콩 단백질 가수분해물(공급원: MD Foods of Viby J., Denmark)을 가한다. 교반하면서 필요량의 N-아세틸-L-글루타민(Ajinomoto)을 가한다. 수산화칼륨 용액(45%)을 가하여 pH를 약 5.6으로 상승시킨다. 교반하면서 L-아르기닌을 서서히 가하고, 청정해질 때까지 용액을 교반한다(pH > 6.2). 그런 다음, 필요량의 부분 가수분해된 카제인산나트륨(Alnate^R 167; New Zealand Milk Products Incorporated of Santa Rosa, California)을 슬러리에 블렌딩한다. 이러한 완성된 수중 단백질 슬러리는 다른 슬러리와 블렌딩하기 전까지 최대 2시간 동안 약 60℃ 내지 약 71℃의 온도에서 온화하게 교반한다.

수중 단백질 슬러리 및 오일 블렌드는 교반하면서 혼합하고, 수득한 블렌딩 슬러리는 약 55℃ 내지 약 65℃ 사이의 온도로 유지시킨다. 1분 이상 기다린 후, 교반하면서 탄수화물/무기질 슬러리를 가하고, 수득한 블렌딩 슬러리는 약 55℃ 내지 약 65℃의 온도에서 유지시킨다. 그런 다음, 교반하면서 해양유/MCT 구조화 지질을 블렌딩된 슬러리에 가한다. 경우에 따라, 일정 속도로 도관을 통해 블렌드를 통과시키면서 해양유/MCT 구조화 지질을 계량하여 생성물에 서서히 가한다. 1분 이상 내지 2시간 이하의 시간 동안 기다린 후, 당분야의 숙련가에게 공지된 기술을 사용하여 블렌드 슬러리를 탈기시키고 초고온 처리하고 균질화한다. 블렌드를 약 1℃ 내지 약 7℃의 온도로 냉각시킨 후 교반하면서 약 1℃ 내지 약 7℃의 온도에서 보관한다. 바람직하게는, 상기 단계 완성후, 품질 관리를 위해 적절한 분석 시험을 실시한다. 품질 관리 시험의 분석 결과를 기본으로 하여, 최종 희석(표준화)를 위해 교반하면서 적정량의 물을 배치에 가한다.

비타민 용액은, 교반하면서 소량의 물을 약 43℃ 내지 약 66℃의 온도로 가열한 다음, 교반하면서 아스코르브산, 45% 수산화칼륨, 타우린, 수용성 비타민 프리믹스, 콜린 클로라이드 및 L-카르니틴을 가하여 제조한다. 이어서, 비타민 슬러리를 교반하면서 블렌딩된 슬러리에 가한다.

풍미 용액은 교반하면서 천연 및 인공 바닐라 풍미와 인공 카라멜 풍미를 적정량의 물에 가하여 제조한다. 그런 다음, 교반하면서 풍미 슬러리를 블렌딩된 슬러리에 가한다.

생성물의 pH는 최적 생성물 안정성을 수득하도록 조절할 수 있다. 완성된 생성물을 적합한 용기(이 경우, 8oz.금속캔)에 넣은 다음, 최종적으로 멸균시킨다(이 경우, 레토르트 멸균).

실시예 2

수성 N-아세틸-L-글루타민 안정성 연구

가열시, 다양한 pH 값, 및 액체 영양 유형 생성물에서 발견되는 것과 유사한 매트릭스에서 수용성 N-아세틸-L-글루타민의 안정성을 평가하기 위해 연구를 실시하였다.

수성 N-아세틸-L-글루타민 및 글루타민 가열 안정성

가열시 수성 N-아세틸-L-글루타민의 안정성을 시험하기 위해 하기의 과정을 수행한다. pH를 조절하지 않고 대략 1㎎/㎖의 N-아세틸-L-글루타민(공급원: Sigma, catalog no. A-9125) 및 글루타민(공급원: Aldrich, catalog no. G-320-2)의 수용액을 제조한다(각각 5.3mM 및 6.8mM). 생성된 N-아세틸-L-글루타민 용액의 pH는 2.9이고 글루타민 용액의 pH는 6.0이다. 용액은 밀봉된 4㎖들이 용기가 장착된 Reacti-Therm^TM 교반 열 블록을 사용하여 100℃에서 가열하는데, 각각의 시점 중 하나는 15분, 30분, 1시간 및 2시간이다. 샘플을 열 블록으로부터 제거하고 냉각될 때까지 즉시 빙상에 둔다. 각 샘플의 분취량은 HPLC로 분석하기 위해 0.45㎛ 필터(Millipore Millex^R-HV, 25㎜)를 통해 여과시킨다.

HPLC는 Inertsil^R C8, 5㎛, 4.6 x 250㎜ 칼럼(Keystone Scientific, Inc., Bellefonte, PA)을 이용하여 실시한다. 이동상은 HCl을 사용하여 pH를 2로 조절한다(1㎖/분에서 등용매). 주입 용적은 10㎕이다. 자외선 검출은 214nm에서 실시한다.

결과는 표 2에 나타내었다. 100℃에서 2시간 항온처리하는 동안 글루타민은 불안정하였다. pH 6.0 글루타민 용액을 1시간 동안 비등시킨 후의 주 분해 산물은 피로글루탐산이었다. 글루타민 용액을 2시간 동안 비등시킨 후에도 여전히 피로글루탐산이 주 분해 산물이었지만 글루탐산도 검출되었다.

N-아세틸-L-글루타민은 글루타민보다 훨씬 더 안정적이다. 체류시간에 의해 N-아세틸-L-글루탐산과 같은 주 분해 산물을 시험적으로 확인하였다. 이러한 확인은 질량 분광분석법(MS) 및 핵자기 공명 분석법(NMR)에 의해 명확해졌다. MS 및 NMR에 의해 확인된 바와 같이 두번째로 큰 피크는 2,6-디옥소피페리디닐아세트아미드이다. N-아세틸-L-글루타민 용액에서, 피로글루탐산은 0.2면적%의 낮은 수준으로 2시간 샘플에서만 검출되었다.

100℃에서 가열한 글루타민 및 N-아세틸-L-글루타민의 수용액
	글루타민 용액(높이%)			N-아세틸-L-글루타민 용액(면적%)
시간(분)	GLN¹	GLU²	PGA³	NAQ⁴	2,6-DPA⁵	PGA³	NAE⁶
0	100.0	-	검출되지 않음	99.7	-	-	0.3
30	90.2	-	9.8	98.1	0.6	-	1.2
60	80.0	-	20.0	96.9	1.3	-	1.8
120	53.6	10.6	35.8	93.4	2.7	0.2	3.7
¹글루타민, ²글루타메이트, ³피로글루탐산, ⁴N-아세틸-L-글루타민, ⁵2,6-디옥소피페리디닐아세트아미드, ⁶N-아세틸-L-글루탐산

다양한 pH 값에서의 수용성 N-아세틸-L-글루타민 및 글루타민의 안정성

다양한 pH 값에서 수용액중 N-아세틸-L-글루타민의 안정성을 시험하기 위해 하기의 과정을 수행한다. pH 2.0에서 8.0까지 1 pH 단위씩 증가하도록 N-아세틸-L-글루타민 수용액을 제조한다. 경우에 따라서는 최종 희석 직전에 용액의 pH는 염산 또는 수산화나트륨으로 조절한다(최종 농도=1㎎/㎖ 또는 5.3mM N-아세틸-L-글루타민). 글루타민 단일 용액의 pH는 조절하지 않고(측정된 pH=6.0) 1㎎/㎖ 또는 6.8mM의 글루타민을 제조한다. 모든 용액을 오토샘플러(autosampler) 바이알내에서 멸균 여과시키고(Millipore Millex^R-GS, 25㎜, 0.22㎛ 공극 크기, 멸균) 주위 온도(17-25℃)에서 보관하기 위해 캡으로 막는다. 1일 내지 180일의 다양한 시점에서 HPLC로 N-아세틸-L-글루타민 샘플을 분석한다. 1 내지 45일의 유사한 시점에서 HPLC로 글루타민 샘플을 분석한다.

N-아세틸-L-글루타민의 안정성은 pH에 의존적인 것으로 밝혀졌다. 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다. 모든 pH 값에서 N-아세틸-L-글루타민은 7일에 걸쳐 분해되지 않았다. pH 5.0 내지 8.0에서, N-아세틸-L-글루타민은 6개월 이상 안정하였으며 99.6% 이상의 N-아세틸-L-글루타민이 잔류하였다. 6개월에 걸쳐 유일하게 지속적으로 검출된 분해 산물은 0.5% 이하의 N-아세틸-L-글루탐산이었다. pH 4.0에서는 6개월까지 97.9%의 잔류 N-아세틸-L-글루타민과 함께 N-아세틸-L-글루탐산 및 2,6-디옥소피페리디닐아세트아미드 각각이 검출되었다. pH 3.0에서는 90일에 걸쳐 N-아세틸-L-글루타민은 95% 이상이 잔류하였으며 4개월째 94.2%, 6개월째 90.4%로 감소하였다. pH 3.0 샘플에서 N-아세틸-L-글루탐산 및 2,6-디옥소피페리디닐아세트아미드는 대략 동일한 수준으로 검출되었으며, 15일째 약 0.15%에서 시작하여 30일째 약 1%, 6개월째 약 5%로 증가하였다. 6개월째 피로글루탐산이 0.5%로 검출되었다. pH 2.0에서 15일째 N-아세틸-L-글루타민은 97%이고 6개월째 단지 55.7%로 감소하였다. pH 2.0 샘플에서 N-아세틸-L-글루탐산은 주 분해 산물로 15일 샘플에서 2.5%, 6개월 샘플에서 37.2%였다. 2,6-디옥소피페리디닐아세트아미드는 15일째 0.5%에서 6개월째 4.9%로 증가하였다. pH 2.0의 N-아세틸-L-글루타민 샘플은, 30일째 피로글루탐산 값이 0.2%에서 6개월째 2.2%로 증가한 유일한 샘플이었다.

글루타민 용액(pH 6.0)에서, 피로글루탐산은 실온에서 3일이 지난 후 샘플에서 0.2%가 발견되었다. 45일 후, 이는 3.3%이었고 글루타민은 96.7%이었다. HPLC 분석 결과는 표 3에 높이%로서 나타내었다.

1㎎/㎖ 및 주위 온도에서 pH 6.0 수용액중 글루타민의 안정성
분석물	2일	3일	7일	15일	30일	45일
GLN¹	100.0	99.8	99.5	99.0	98.1	96.7
PGA²	검출되지 않음	0.2	0.5	1.0	1.9	3.3
¹글루타민, ²피로글루탐산

액체 영양형 생성물중 N-아세틸-L-글루타민 및 글루타민의 안정성

액체 영양형 생성물에서 발견되는 것과 유사한 매트릭스에서 N-아세틸-L-글루타민의 안정성을 시험하기 위해 하기의 과정을 수행한다. N-아세틸-L-글루타민(Ajinomoto)을 함유한 제형, 글루타민(Ajinomoto)을 함유한 제형(이론적인 농도는 각각 16.5㎎/㎖ 및 12.8㎎/㎖이고 중량을 기준으로 하여 단백질 부분을 대체한다) 및 대조 그룹(Optimental^R, Ross Products Division, Abbott Laboratories)과 같이 3가지 연구 생성물을 제형화한다. N-아세틸-L-글루타민을 함유한 생성물은 실시예 1에 기술한 과정에 따라 제조한다. 글루타민을 함유한 생성물은, 글루타민(7.79㎏)을 N-아세틸-L-글루타민으로 대체하는 것을 제외하고는 유사한 방법으로 제조한다. 생성물은, 액체 영양제 가공에서 전형적인 레토르트 멸균 과정(이 경우, 128℃에서 5분) 전과 후에 분해에 대해 평가한다. 생성물은 실온(20-22℃)에서 보관하고 1개월, 2개월 및 3개월째 분해 증거를 평가한다. 글루타민, N-아세틸-L-글루타민 및 피로글루탐산(존재하는 경우)를 각 과정 및 시점에서 정량한다.

HPLC에 의해 글루타민, N-아세틸-L-글루타민 및 피로글루탐산을 분석하는 경우, 샘플은 다음과 같이 여과시킨다. 5.0㎖ 분취량을 50㎖들이 용적 플라스크로 옮긴다. 1M 염산 20방울을 가하고 탈이온수로 샘플을 희석시킨다. 분취량은 0.45㎛ 필터(Millipore, Miilex^R-HV, 25㎜)를 통해 여과시킨다. 샘플은 상기한 바와 같이 HPLC로 분석한다(열 안정성 부분).

유리 피로글루탐산 및 N-아세틸-L-글루탐산 둘다를 함유한 단백질 제형에 존재하는 피로글루탐산의 총량은 하기의 방법에 의해 측정할 수 있다. 먼저 대략 총 단백질 18g/ℓ의 농도를 수용액으로서 샘플을 제조한다. 제조한 샘플 재료중 20㎕의 분취량을 1.5㎖들이 스크류캡 바이알에 넣고, 갓 제조한 효소 용액 980㎕(0.05M Tris, 0.005M 디티오트레이톨, 0.001M 이나트륨 에틸렌디아민테트라아세트산 이나트륨(EDTA), pH 8.0, 피로글루타메이트 아미노펩티다제 11단위/㎖ 함유)를 가한다. 바이알을 단단히 막은 다음, 실온(21-24℃)에서 24시간 동안 항온처리한다. 그런 다음, 하기하는 바와 같이 C-18 SPE 카트리지를 통해 용액을 가공한다. 유리 피로글루탐산을 측정하는 경우, 최초 샘플 용액을 탈이온수에 총 단백질 함량이 2-3g/ℓ가 되도록 희석시키고 C-18 SPE 카트리지를 통해 가공한다.

C-18 SPE(고상 추출) 카트리지(100㎎/㎖ 크기)는 버딕 & 잭슨사(Burdick & Jackson, Muskegon, MI)로부터 구입한다. SPE 카트리지는 2 x 5 용적의 메탄올을 사용하여 제조하고 2 x 5 용적의 탈이온수로 세정한다. 그런 다음, 샘플 1㎖를 서서히 가하고, 투과 재료를 1g 스크류캡 바이알에 수집한다. 2 x 500㎕ 탈이온수를 적용하여 용출을 완료시킨 후, 투과량을 동일 바이알에 수집한다. 용출물을 혼합한 다음, HPLC(25㎜, 0.45㎛ 필터; Gelman, Ann Arbor, MI)로 분석하기 전에 0.45㎛ 필터를 통해 분취량을 여과시킨다. 사용된 HPLC 시스템은 다음과 같은 매개변수를 갖는다: 펌프 모델 G1312A, 오토샘플러 모델 G1313A, 자동온도조절 칼럼 구획 모델 G1316A, 2극 진공관 배열 검출 모델 G1315A 및 피크 통합기/데이타 처리기 모델 G2170AA; Agilent Technologies, Palo Alto, CA. Column: 6.5 x 150㎜ ION-310, 8㎛; Interaction Chromatography, San Jose, CA. 시스템은 사용전 40℃에서 0.3㎖/분으로 이동상(5mN H₂SO₄)중에서 미리 평형화시킨다..

분석을 위해, 샘플 또는 표준물 분취량 10㎕를 주입하고, 칼럼은 40℃에서 0.3㎖/분으로 이동상과 함께 용출시킨다. 용출 물질은 210㎚ 및 220㎚에서의 UV 흡수에 의해 검출한다. 전개 시간은 45분이다.

미지의 샘플 농도는 표준물과 비교하여 결정한다. 일반적으로는 피로글루탐산(Fluka, Milwaukee, WI)의 3가지 수용액, 즉 10㎎/ℓ, 20㎎/ℓ 및 40㎎/ℓ의 수용액이 표준물로서 충분하다

액체 영양형 생성물중 N-아세틸-L-글루타민은 멸균하는 동안 또는 실온에서 3개월간 보관하는 동안에 분해되지 않았다. 결과는 표 4에 나타내었다. N-아세틸-L-글루탐산에 상응하는 작은 피크는 모든 시점에서 검출되었지만 대략 동일한 수준으로 잔류하는데, 이는 N-아세틸-L-글루탐산에 대해 측정가능한 분해가 없음을 지시한다.

글루타민 보충 생성물에서, 글루타민은 멸균 과정에 의해 원래의 농도의 대략 1/3로 감소되었으며 2개월째 글루타민은 검출되지 않았다.

상기 생성물에서, 피로글루탐산은 글루타민이 완전히 전환된 것과 일치하는 농도로 검출되었다.

가공 과정 및 실온에서 3개월에 걸쳐 보관하는 동안에 액체 영양형 생성물중 N-아세틸-L-글루타민 및 글루타민의 안정성 비교
	N-아세틸-L-글루타민을 함유한 생성물	글루타민을 함유한 생성물
분석물	N-아세틸-L-글루타민(mmol/L 생성물)	글루타민(mmol/생성물 L)	피로글루탐산(mmol/생성물 L)
이론치	87.7	87.6	-
멸균전	92.5	97.8	27.1*
멸균후	89.8	34.2	77.5*
1개월	89.8	13.7	92.9*
2개월	94.1	미량	79.8**
3개월	89.3	검출되지 않음	80.6**
는 글루타민 표준으로부터 반응 인자를 이용하여 계산한 것이다. 이 실험에서 적절한 표준을 입수할 수 없었다. *는 피로글루탐산 표준으로부터 반응 인자를 이용하여 계산한 것이다.

실시예 3

글루타민 및 N-아세틸-L-글루타민 생체이용률

돼지 모델에서 글루타민에 대해 생체이용가능한 N-아세틸-L-글루타민의 비율을 측정하기 위해 연구를 실시한다. 소장 고리 모델은, N-아세틸-L-글루타민 및 글루타민의 흡수 및 대사를 평가하기 위해 분리한 소장 단편을 사용한다. 공급 모델은 전형적인 식이요법에 공급되는 N-아세틸-L-글루타민 및 글루타민의 흡수를 평가한다.

소장 고리 모델

체중이 15 내지 20㎏인 22마리의 가축용 돼지를 4일에 걸쳐 실험실 조건에 적응시킨다. 돼지에게는 이러한 동물에 대한 에너지 요구량에 따른 표준 돼지 식이요법(Nutrient requirements of swine, 9^th, 1998, Subcommittee on Swine Nutrition, National Research Council)을 실시하고 임의로 물을 공급한다. 동물들은 무작위적으로 그룹 C(6마리의 돼지; 글루코살린 용액(Braun cat No 622647), 5% 글루코스, 0.9% NaCl 공급), 그룹 G(8마리의 돼지; 8g/ℓ의 Gln(Sigma cat No G- 3126)가 보강된 동일한 글루코살린 용액) 및 그룹 N(8마리의 돼지; 10g/ℓ의 NAQ(Sigma cat No A-9125)가 보강된 동일한 글루코살린 용액)으로 나눈다. 수술전 15시간 동안 동물을 금식시킨다. 실험 당일날, 동물의 체중을 측정하고, 스트레스닐(Stresnil^R) 및 펜토탈로 마취시킨다. 마취시킨 돼지는 복부의 정중면을 절개하여 개방한다. 트라이츠(Treitz) 인대로부터 약 1m에 있는 대략 1m의 근위 공장의 양끝을 겸자로 고정시키고 근위관을 삽입시킨 다음, 125㎖의 실험 용액을 50 내지 76㎖ 분으로 충전시킨다. 0분, 15분, 30분, 60분, 90분, 120분, 150분 및 180분에 주입된 소장에 구멍을 내어 소장 주입 용액 샘플을 채취한다. 샘플은 액체 질소에 냉동시키고 분석하기 전까지 -80℃에서 유지시킨다. 0분, 15분, 30분, 60분, 90분, 120분, 150분 및 80분에 항응고제가 있는 시험관내에서 문정맥에 구멍을 내어 문정맥혈 샘플을 채취한다. 샘플은, 혈장 및 적혈구 세포를 분리하기 위해 1500 x g에서 15분간 원심분리할 때까지 4℃에서 유지시킨다. 혈장은 분석하기 전까지 -20℃로 냉동시킨다. 목정맥혈 샘플은 0분, 60분, 120분 및 180분에 항응고제 및 수득한 혈장이 있는 시험관내에서 구멍을 내어 채취하고, 문정맥에서와 같이 보관한다. 3시간 후, 돼지를 죽이고 25㎝의 주입한 소장 단편으로부터 점막 샘플을 수득한다. 단편은 빙냉 염수로 전체적으로 세정하고 세로로 개방한 다음 닦아내어 건조시킨다. 점막은 유리 커버글라스로 전체 관 표면을 벗겨내어 제거한 다음, 액체 질소에 냉동시키고 -80℃에서 보관한다.

N-아세틸-L-글루타민에 대한 분석은 다음과 같이 실시한다. 소장 주입 용액 샘플 및 혈장 샘플의 경우, 분취량을 물중에서 0.05% 퍼클로로아세트산(PCA) 용액과 1:10(w/v)으로 희석시킨다. 점막 샘플의 경우, 습윤한 점막 샘플 0.2㎎을 물중의 0.05% PCA 용액 5㎖와 함께 균질화시킨다. 원심분리(15,000 x g, 3분, 주위 온도) 후, 샘플을 0.45㎛ 필터로 여과시키고, 2690 분리 모듈, PDA 검출기 및 리크로카트(LichroCart) 250-4 카트리지(Purospher RP18 e, 250 x 4㎜, 5㎛)로 구성된 HPLC 크로마토그래피 시스템에 주입한다. 이동상은 유속이 1㎖/분인 pH 2.7의 0.1M 인산염 완충액이다. N-아세틸-L-글루타민의 검출 및 정량화는 210㎚에서 모니터한다.

글루타민 및 글루타메이트 분석은 다음과 같이 실시한다. 소장 주입 용액 샘플 및 혈장 샘플은, 샘플을 물중에서 0.05% PCA 용액과 1:400(w/v)으로 희석시키는 것을 제외하고는 상기한 N-아세틸-L-글루타민에서와 같이 제조한다. 샘플을 0.45㎛ 필터로 여과시킨 후, 혼합물 20㎕는 AccQ-Tag 방법(Waters Corp.)에 따라 유도체화한 다음, 물 1㎖로 희석시킨다. 요약하면, 샘플을 붕산염 용액으로 완충시키고 반응물 20㎖와 함께 유도체화한다. 1분 후, 샘플을 1㎖로 희석시키고, 2690 분리 모듈, 형광 검출기 및 수펠코실(SupelcoSil) LC-18 칼럼(250 x 4㎜, 3㎛)로 구성된 HPLC 시스템에 주입한다. 이동상은 유속이 1㎖/분이며, 0.25% 트리에틸아민 및 9% 아세토니트릴과 함께 pH 7.5의 0.1 M 포스폰산염 완충액으로 이루어져있다. 글루타메이트 및 글루타민의 검출 및 정량화는 250㎚의 여기 파장을 이용하고 395㎚에서의 방출을 모니터함으로써 실시할 수 있다.

글루코스는 잘 설정되어 있는 결합된 효소 분석을 이용하여 분석한다. 요약하면, 샘플 글루코스는 헥소카이나제 및 ATP(아데노신 트리포스페이트)를 사용하여 인산화시키고, 수득한 글루코스-6-포스페이트는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제를 사용하여 6-포스포글루코네이트로 전환시킨다. 후자의 반응 동안에, NAD(니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오타이드)는 NADH(NAD의 환원형)으로 전환되어, 원 샘플중 글루코스 농도에 비례하여 340㎚에서의 흡광도가 증가된다. 이 분석은 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; current catalog number 16-20)의 임상 화학 키트로서 구입할 수 있다.

결과

주입 용액의 도입후, 시간에 따라 소장내강에 잔류하는 글루타민 또는 N-아세틸-L-글루타민

등량의 글루타민 또는 N-아세틸-L-글루타민을 함유한 용액을 주입한 돼지의 소장 내용물중 글루타민 또는 N-아세틸-L-글루타민의 잔류%는 처음 90분 동안은 유사하였다. 120분 및 180분 그룹 사이에는 통계학적으로 유의차가 있었다. t_1/2(대략 45분)에서는 글루타민 또는 N-아세틸-L-글루타민 간에 유의차가 없었다. 도 3은 분석물을 도입한 후 시간에 따라 소장내강에 잔류하는 분석물(글루타민 또는 N-아세틸-L-글루타민)의 양을 그래프로 도시한 것이다. 분석물 잔류는 0시에 존재하는 분석물의 퍼센트로 표현하였다.

주입 용액의 도입후 시간에 따라 소장내강에 잔류하는 글루코스

어떠한 시간에서도 그룹 C 및 G 사이에 유의차가 없었다. 15분을 제외하고는 그룹 C와 N 사이에는 유의차가 없었다. 본페로니(Bonferroni) 보정에 의해 180분에서만 유의차가 있는 것으로 나타나더라도, 그룹 G와 N은 120분부터 달라지는 경향이 있다. 도 4는 용액을 도입한 후 시간에 따라 소장내강에 잔류하는 글루코스의의 양을 그래프로 도시한 것이다. 글루코스 잔류는 0시에 존재하는 양의 퍼센트로 표현하였다.

소장 고리에 시험 용액을 도입한 후 문맥혈중 글루타민

결과를 초기 농도의 %로서 나타내는 경우, 대조 그룹(C)과 글루타민(G) 그룹, C 그룹과 N-아세틸-L-글루타민(N) 그룹 사이에 유의차가 있었다(90분 및 150분에서 C 대 G; 및 90분, 120분, 150분 및 180분에서 C 대 N)). G와 N 사이에는 유의차가 없었다. 결과를 절대치로서 표현하는 경우, 120분을 제외하고는 그룹 C와 N 사이에 유의차가 없었다. 이를 모두 취합하면, G 및 N은 120분부터 실험 말기까지 C와 달라지는 경향이 있다. 도 5는 시험 용액을 소장 고리에 도입한 후 시간에 따른 문맥혈중 글루타민의 양(mcg/㎖)을 그래프로 도시한 것이다.

문맥혈중 글루코스에 대한 그룹과 말초혈중 글루타민 또는 글루코스에 대한 그룹간에는 유의차가 없었다. 실험 동안에서 어떠한 시점에서도 문맥혈 또는 말초혈중 검출되는 완전한 N-아세틸-L-글루타민의 수준은 무시할 만하였다(100만부당 1부).

공장 점막중 글루탐산(GLU) 및 글루타민(GLN)

그룹 G보다 그룹 N 및 C에서 글루타메이트 농도가 높았고, 그룹 N 및 G는 점막에서 글루타민이 높은 반면, 그룹 G는 그룹 N보다 실질적으로 글루타민이 높았다. 그러나, 총 글루타민+글루타메이트 농도는 그룹 G 및 N에서 유사하였는데, 이는 두가지 식이를 이용하여 점막 대사계로 글루타민 탄소 골격을 전달하는 것이 비교할만함을 제시하고 있다. 완전한 N-아세틸-L-글루타민은 점막 샘플에서 검출할 수 없었다. 도 6은 실험 완료 직후 공장 점막에서의 글루타민 및 글루타메이트(및 이의 총합)의 양을 그래프로 도시한 것이다(mcg/습윤한 점막 g으로 표현).

요약하면, N-아세틸-L-글루타민은 글루코스와는 유사하고 글루타민 보다는 극히 약간 낮은 생체이용률을 나타낸다. N-아세틸-L-글루타민은 흡수후 이용되는 것이 글루타민과 매우 유사하다. N-아세틸-L-글루타민은 흡수된 후 장세포 아실라제에 의해 신속하게 가수분해되어 정상 글루타민 대사로 들어가며, 동량의 글루타민 식이에 의해 달성되는 것만큼 높게 점막에서 글루타민+글루타메이트 농도를 이룬다. 과량의 글루타민은 문정맥으로 배출되는데, 여기에서 글루타민 농도는 동일하게 식이 글루타민을 투여한 후 발견되는 농도와 유사하다. 문정맥 혈장에서의 N-아세틸-L-글루타민 농도는 겨우 수 ppm으로, 이는 N-아세틸-L-글루타민이 혈류내로 최소한 완전히 흡수되었음을 나타낸다. N-아세틸-L-글루타민의 높은 흡수율뿐만 아니라 글루타민과의 대사 유사성은, 두 영양분이 유기체의 이화 상태하에 동일한 생물학적 거동을 가질 수 있음을 제시한다.

돼지 공급 모델

체중이 15 내지 20㎏인 15마리의 돼지는 보증된 농장에서 제공받는다. 돼지는 4일 동안 실험실 조건에 적응시킨다. 표준 돼지 식이요법을 실시하고 임의로 물을 공급한다. 적응 후, 돼지는 무작위적으로 그룹 C(5마리의 돼지; CR₂O₃ 3g/㎏이 추가된 표준 돼지 식이(Merck cat No 1.02483), 그룹 G(5마리의 돼지; 8g/㎏의 Gln이 추가된 식이 C(Ajimoto)) 및 그룹 N(5마리의 돼지; 10.5g/㎏의 N-아세틸-L-글루타민이 추가된 식이 C(Flamma))가 보강된 동일한 글루코살린 용액)으로 나눈다. 본 연구의 실험 기간 동안 각 그룹에 동물당 1일 각각 식이 1000g을 3회 나누어 공급하고 물은 임의로 공급한다. 본 연구의 실험 기간은 5일이다.

실험 당일, 동물의 체중을 측정하고 오전 7시에 표준 식이를 섭취시킨다(동물당 333g). 공급 3시간 후, 동물의 체중을 측정하고 진정제를 투여한 다음, 목정맥에 구멍을 내어 출혈시킨다. 동물은 복부의 정중면을 절개하여 신속히 개방하고 십이지장, 중간 공장(트라이츠 인대로부터 약 2m) 및 회장(회맹부 판막으로부터 30㎝)을 꺼내어 액체 질소에서 냉동시키고 동결건조시키며, 분석하기 전까지 -80℃에서 보관한다. 간 및 신장 샘플을 제거하고 가시적인 지방 및 결합 조직을 절개하고 액체 질소에서 냉동시키고, 분석하기 전까지 -80℃에서 보관한다. 소장 점막 샘플은 분리된 소장 고리 실험에서 기술한 바와 같이 수득하고, 분석하기 전까지 상기한 바와 같이 보관한다.

소장의 내용물은 글루타민, N-아세틸-L-글루타민 및 산화크롬(III)에 대하여 분석한다. N-아세틸-L-글루타민 분석의 경우, 동결건조시킨 소장 내용물 샘플을 물중에서 0.05% PCA와 1:20(w/v)으로 희석시킨 다음, 소장 고리 모델에서 상기한 바와 같이 HPLC로 분석한다.

글루타민 분석의 경우, 동결건조시킨 소장 내용물을 소장 고리 모델에서 상기한 바와 같이 처리하고 분석한다.

크롬은 원래의 식이 ㎏당 내용물을 반영하는 보정 인자를 제공하기 위해 식이에 혼입시킨다. 산화크롬(III) 분석의 경우, 다음의 과정을 이용한다. 대표적인 동결건조 소장 내용물 샘플을 니켈 도가니에 넣어 중량을 측정하고 전기로에 넣는다. 온도를 500℃까지 상승시키고 2시간 더 유지시킨다. 이를 냉각시킨 후, 융합 혼합물(Na₂CO₃, K₂CO₃, KNO₃, 10:10:4 w/w/w/)을 약 10회 샘플 재에 가하고 전체적으로 혼합한다. 융합 혼합물의 여분의 양을 가하여 상부에 박막을 형성시키고, 투명한 용융물이 수득될 때까지 가스 버너를 사용하여 불꽃상에서 30분 동안 융합시킨다. 도가니를 버너로부터 제거하여 냉각시키고, 약 20㎖의 물로 벽을 세척함으로써 용웅물을 추출한 다음, 약 30분 동안 핫플레이트상에서 온화하게 가열한다. 껍질이 전체적으로 느슨해지면 도가니를 물로 4회 세정하고 모든 세척액을 100㎖들이 용적 플라스크에 가한 다음, 용적에 맞추어 희석시킨다. 탈이온수에 대한 372㎚에서의 흡광도를 공시험으로 측정한다. 흡광도 판독 결과는 0㎕, 50㎕, 100㎕, 200㎕ 및 500㎕의 표준 크롬 용액을 분석하여 작성한 표준 곡선 식을 사용함으로써 Cr₂O₃ ㎎로 전환시킨다(K₂Cr₂0₇ 2.9034g/ℓ는 Cr₂O₃ 1.5g/ℓ에 상응)

아실라제에 대한 분석은 다음 과정에 따라 실시한다. 습윤한 점막, 간 또는 신장 200㎎을 차가운 물 5㎖중에서 균질화하고 5℃에서 5분 동안 400 x g로 원심분리한다. N-아세틸-L-글루타민 용액(5 g/ℓ, sigma catalog no. A-9125) 100㎕를 점막 균질물 100㎕와 혼합하고 37℃에서 시간 동안 항온처리한다. 공시험은 점막 100㎕ 및 물 100㎕를 사용한다. 효소 보정 곡선은 0.5IU 아실라제/㎖ 내지 100IU 아실라제/㎖를 사용하여 작성하고(아실라제 I, E. C. 3.5.1.14, Sigma catalog no. 8376), 상기한 바와 같이 N-아세틸-L-글루타민과 함께 항온처리한다. 유리 글루타민(효소 활성에 의해 방출)은 소장 고리 모델에서 상기한 바와 같이 측정한다. 각각의 샘플의 경우, 아실라제 활성은 효소에 대한 표준 반응 곡선과 비교하여 측정하고 적절한 희석 인자로 수치를 보정한다.

결과

흡수 데이타는 하기의 표 5에 나타내었다. 십이지장으로부터의 샘플은 정량하기에는 불충분한 수준의 산화크롬(II)을 함유하고 있었다. 원래의 식이 ㎏당 내용물을 반영하기 위해 분석 결과를 보정하지 않았다. 중간 공장은 본질적으로 동일한 수준의 글루타민(식이 G의 경우) 및 N-아세틸-L-글루타민(식이 N의 경우)을 함유하고 있는데, 이는 십이지장 및 근위 공장에서 흡수가 유사하다는 것을 제시한다. 그러나, 이들 식이는 또한 완전한 단백질을 함유하며, 대조 식이의 분석 결과가 나타내는 바와 같이 이들 단백질의 소화가 상당량의 유리 글루타민을 생성할 수도 있다. 이는 원래의 식이중 유리 글루타민 함량이 중간 공장 전에 거의 완벽하게 흡수됨을 제시하고 있다. 원위 회장의 내용물 분석은, 유리 글루타민 흡수가 중간 공장 및 원위 회장 사이에서 지속되지만 N-아세틸-L-글루타민의 흡수는 관찰되지 않음을 제시하고 있다. 그러나, 전체적인 흡수 데이타는 상기 모델에서 투여된 N-아세틸-L-글루타민이 대략 77%의 높은 수준으로 흡수되었음을 나타내고 있다.

돼지에서 식이 성분으로서 N-아세틸-L-글루타민 및 글루타민의 흡수

	글루타민 식이	N-아세틸-L-글루타민 식이	대조 식이(C)
십이지장	N/D**	N/D	ND
중간 공장	10.0±1.9	10.3±2.4	8.8±0.7
원위 회장	1.2±0.6	12.8±2.1	2.1±0.7
* 글루타민 및 대조 식이의 경우, 데이타는 글루타민에 대한 것이다(mmol/원래 식이 ㎏). N-아세틸-L-글루타민 식이의 경우, 데이타는 N-아세틸-L-글루타민에 대한 것이다(mmol/원래 식이 ㎏). 원래 식이: 글루타민 = 54.8mmol 글루타민/식이 ㎏, N-아세틸-L-글루타민 = 55.8mmol N-아세틸-L-글루타민/식이 ㎏. ** N/D = 측정되지 않음. 산화크롬(II) 값은 분석의 정량 한계치 이하여서 보정된 값을 구할 수 없었다.

소장 점막, 간 및 신장중 아실라제 활성

아실라제 활성은 대조 돼지의 몇몇 흥미로운(영양학적으로 중요한) 조직에서 측정한다. 아실라제 활성은, 공장 점막, 간 및 신장을 포함한 시험한 모든 조직에서 발견할 수 있다. 측정된 수준은 공장 점막에서는 948 ± 300IU/습윤 조직 g(17.3 ± 7.0IU/단백질 ㎎), 간에서는 12,770 ± 1110IU/습윤 조직 g(159 ± 30IU/단백질 ㎎) 및 신장에서는 19,630 ± 3020IU/습윤 조직 g(302 ± 47IU/단백질 ㎎)이었다.

요약하면, N-아세틸-L-글루타민은 십이지장 및 상부 공장에서 주로 흡수되며 투여량의 77% 이상이 흡수되었다. N-아세틸-L-글루타민과 글루타민 사이에는 2가지 주요한 차이가 있다; 보다 초기의 N-아세틸-L-글루타민 흡수 포화 및 낮은 회장 흡수.

실시예 4

영양 실조에 의해 유발되는 소장 손상에 대한 N-아세틸-L-글루타민의 효과

돼지에서 단백질 에너지 영양실조에 의해 유발되는 소장 손상에서 유리 글루타민에 대한 N-아세틸-L-글루타민의 잠재적인 효과를 평가하기 위해 연구를 실시하였다. 5주령된 가축용 돼지는 보증된 농장에서 제공받는다. 돼지는 무작위적으로 두 그룹중 한 그룹에 할당한다. 첫번째 그룹에서, 3마리의 돼지에게 30일 동안 인슈어 플러스(ENSURE PLUS^R; Ross Products Division, Abbott Laboratories)를 자유롭게 공급한다. 두번째 그룹에서는 9마리의 돼지에게도 인슈어 플러스(ENSURE PLUS^R)를 공급하지만 첫번째 그룹의 1일 섭취량의 20%만 공급한다. 두번째 그룹은 카제인산칼슘, 글루타민 또는 N-아세틸-L-글루타민을 매일 공급한 6마리의 돼지가 각각 있는 3개의 아그룹으로 나눈다. 대조 그룹에 보충된 단백질 및 1일 평균 에너지는 3300㎉에서 4500㎉까지이고 연구 시작시 단백질은 138g, 연구 말기에는 187g이었다. 두번째 그룹에서, 카제인, 글루타민 및 N-아세틸-L-글루타민의 보충은 1일당 1.32g의 질소 당량을 추가로 제공한다(기본적으로 1일당 6.89g의 L-글루타민, 8.87g의 N-아세틸-L-글루타민 또는 8.42g의 카제인 단백질이 공급된다). 30일 후, 모든 돼지를 16시간 동안 금식시킨다. 동물의 체중을 측정하고 진정제를 투여하고 마취한 다음, 목정맥에 구멍을 내어 말단 출혈시킴으로써 죽인다.

전체 소장은 신속하게 제거한다. 트라이츠 인대로부터 60㎝의 소장 단편을 근위 공장으로 간주한다. 공장의 조직학적 분석을 위해 트라이츠 인대로부터 5㎝ 길이의 단편을 선택한다. 회맹부 판막에 가장 근접한 60㎝는 원위 회장으로 간주한다. 회장의 조직학적 분석을 위해 회맹부 판막으로부터 5㎝의 단편을 선택한다. 소장 단편은 빙냉 염수로 전체적으로 세정하고, 세로로 개방한 다음 닦아내어 건조시킨다. 점막은 유리 커버글라스로 벗겨내어 차가운 페트리 접시에 담고 중량을 측정하고 액체 질소에 바로 냉동시킨 다음, 생화학적 분석 전까지 -80℃에서 보관한다.

공장 및 회장 점막은 단백질 및 DNA 분석용 기계적 포터 균질기(mechanical Potter homogenizer)를 사용하여 10mM 인산염 완충액(pH 7.4)중에서 균질화한다. 손상, 기능성 및 항산화 방어 시스템의 효소적 마커를 측정하기 위해, 점막 균질물은 3000g에서 10분 동안 원심분리하고 생성된 상층액을 효소 분속에 사용한다. 총 글루타티온을 측정하기 위해, 점막을 5% 트리클로로아세트산중에서 균질화하고 8000g에서 5분 동안 원심분리한다.

샘플상에서 생화학적 분석 및 면역학적 분석을 실시한다. 소장 점막 단백질 및 DNA의 농도는, 각각 브래드포드 방법(Bradford; Analytical Biochemistry, Volume 72, pages 248-254, 1976), 및 라브라카 및 페이젠 방법(Labarca and Paigen; Analytical Biochemistry, Volume 102 (2), pages 344-352, 1980)을 사용하여 측정한다. 영양실조에 의해 유발된 소장 손상 정도는 골드슈타인 방법(R. Goldstein, T. Klein, S. Freier and J. Menczel. American Journal of Clinical Nutrition 24: 1224-1231, 1970)을 사용하여 알칼린 포스파타제 활성을 측정함으로써 평가한다.

산화적 손상에 대한 방어 시스템은 글루타티온 리덕타제(GR), 글루타티온 트랜스퍼라제(GT) 및 글루타티온 퍼옥시다제(GPOX)의 활성을 측정함으로써 평가하고, 비단백질 설프하이드릴기(대부분 환원된 글루타티온(GSH)의 농도에 의해 평가한다. 글루타티온 리덕타제 활성은 카를버그 및 만너빅의 방법(I. Carlberg and B. Mannervik, Methods in Enzymology, Volume 113, pp 484-490, 1985)에 의해 평가한다. 글루타티온 트랜스퍼라제 활성은 하빅 등의 방법(W. H. Habig, M. J. Pabst and W. B. Jakoby, Journal of Biological Chemistry. 294: 7130-7139, 1984)을 사용하여 측정한다. 글루타티온 퍼옥시다제 활성은 플로헤 및 군즐러(L. Flohe and W. A. Gunzler, Methods in Enzymology, Volume 105, pp 114-121, 1984)의 방법에 의해 분석하고, 비단백질 설프하이드릴 함량(환원된 글루타티온 당량이라고도 함)은 앤더슨의 방법(M. E. Anderson, Methods in Enzymology, 133: 548-554, 1985)에 의해 측정한다.

소장 림프구는 하기하는 바와 같이 변형시킨 가우트레욱스 등의 과정(M. D. Gautreaux, E. A. Deitch and R. D. Berg, Infection and Immunity 62 (7): 2874-2884, 1994)에 따라 분리한다. 공장 및 회장 각각으로부터의 2개의 소장 단편을 분리하고 내강 내용물은 인산염 완충된 염수(PBS, Sigma St. Louis, MO, USA)로 씻어낸다. 가시적인 파이어소절(Peyer's patches)를 절개하고 소장을 세로로 개방한 다음, 작은 단편으로 절단한다. 소장 상피세포를 분리하기 위해, 상기한 단편들을 진탕 수욕(120스트로크/분)중 5mM 디티오트레이톨(DTT; Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA), 2mM EDTA(Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 25mM Tris 완충액(Sigma, St. Louis, Mo, USA)이 포함된 행크 균형 염용액(Hanks Balanced Salt Solution(HBSS); Sigma, St. Louis, MO, USA) 25㎖중에서 상기한 단편들을 37℃에서 30분 동안 항온처리하고, 상층액을 버리고 신선한 HBSS-DTT-EDTA-Tris를 가한 다음, 항온처리 과정을 반복한다. 2개의 항온처리물로부터 상피세포를 함유한 상층액을 수집하고, 5%(v/v) 열 불활성화된 송아지 태아 혈청(Sigma, St. Louis, MO, USA), 20mM HEPES(Sigma, St. Louis, MO, USA), 2mM L-글루타민, 500U 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 포함된 배양 배지(완전 배지)중에서 세포를 1640rpm으로 원심분리하여 세척한다. 고유판 림프구(LPL)는 120스크로크/분의 37℃ 진탕 수욕중에서, 콜라게나제 0.05U/㎖, 디스파제 0.30U/㎖(Sigma, St. Louis, MO, USA) 및 DN아제 I 500U/㎖(Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)가 포함된 완전 배지 40㎖중에 소장 파편을 30분 동안 넣어두어 잔류하는 침전으로부터 분리시킨다. 절개한 파이어소절은 완전 배지에 넣고 한쌍의 외과용 메스로 절개한다. 그런 다음, LPL의 경우에서 상기한 바와 같이 파이어소절 림프구(PPL)을 분리시키기 위해, 깨끗한 파이어소절을 콜라게나제로 처리한다(항온처리 시간을 60분으로 감소시킴).

상피세포로부터 분리한 모든 세포유형, 고유판 및 파이어소절은 림프구를 증가시키기 위해 불연속 퍼콜(Percoll^TM; Sigma, St. Louis, MO, USA) 밀도 구배 원심분리를 실시한다. 시판되는 퍼콜 용액은 9% NaCl과 함께 9:10으로 희석시켜 등장성 퍼콜 용액을 만들고, 이를 완전 배지로 희석시켜 퍼콜 농도%가 상이한 3가지 용액(75%, 40% 및 30%)을 만드는데, 이들은 감소되는 순서로 사용된다. 세포는 완전 배지 4㎖에 재현탁시키고 30% 이상의 분획을 넣는다. 650g에서 20분 동안 원심분리한 후, 75%와 40% 층 사이의 계면을 제거하고 세포는 완전 배지 25㎖중에서 원심분리하여 세척한다. 그런 다음, 세포를 40% 퍼콜 4㎖에 재현탁시키고 650g에서 원심분리한다. 림프구(IEL, LPL 및 PPL)가 풍부한 세포 펠릿을 수집하고 PBS와 함께 원심분리하여 세척한다.

분리한 림프구는, 하기하는 바와 같이 유동 세포계수기에 의해 정량된 단클론 항체로 염색시킨다: 각각의 림프구 제조물 100㎕(2 x 10⁶ 세포/㎖)를 단클론 항체(항CD1 FITC, 항CD3ε FITC, 항CD4a PE, 항CD8a PE, 항CD11b/Mac-1 APC, 항CD21 APC) 농도가 상이한 3㎖ 시험관에 넣고 암실에서 4℃에서 30분 동안 항온처리한다. 세포는 PBS로 세척하고 원심분리(500g, 5분)하여 펠렛을 수집한 다음, 350㎕의 PBS에 재현탁시킨다.

모든 세포 제조물의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석은 FACS칼리버(FACScalibur^TM) 유동 세포계수기(Becton Dickinson)상에서 실시한다. 비특이적 형광은 각각의 세포 제조물에 대해 준비된 3개의 대조 그룹(플루오레세인 이소티오시아네이트-FITC, 파이코에리트린-PE 및 알로파이코시아닌-APC)을 통해 측정한다.

소장 샘플의 조직학적 분석은 투과 전자현미경으로 실시한다. 공장 및 회장 샘플은 0.1mol/ℓ의 카코딜산나트륨 완충액(pH 7.3)중 30g/ℓ의 글루타르알데히드중에서 고정시키고, 이후에 15 g/ℓ의 사산화오스뮴에 고정시킨다. 그런 다음, 샘플을 아세톤중에서 탈수시키고 에폰(Epon) 812 수지에 봉입시킨다. 초박 단편은 아세트산우라닐 및 아세트산납으로 이중 염색시키고 제이스(Zeiss) 902 투과 전자현미경하에 조사한다(Zeiss, Oberkochen, Germany).

생화학적 결과

식이 섭취를 대조에 비해 20%로 감소시키면 성장이 완전히 멈춘다. 30일의 시험 기간 동안 영양실조 돼지는 총 체중의 2 내지 3㎏이 손실되었고 대조 돼지는 18㎏이 증가되었다. 영양실조의 결과로서 간의 중량, 및 공장 및 회장 점막의 길이당 중량 또한 심하게 감소하였다(표 6).

대조 및 단백질-에너지 영양실조 돼지의 간 및 소장 중량

	간 중량(g)	점막 중량/장 길이(g/cm)
	간 중량(g)	공장	회장
대조 돼지	731.4±26.5	0.092±0.008	0.070±0.007
영양실조 돼지	237.9±9.9*	0.035±0.005*	0.025±0.006*
* 대조 그룹에 대해 유의차(p<0.05)

점막 길이당 DNA 및 단백질의 양은 대조(데이타는 나타내지 않았음)에 비해 영양실조 돼지에서 상당히 낮았다(2 내지 3배). 그러나, 어떠한 소장 단편에서도 PEM에 의해 단백질/DNA 비가 영향받지 않았다. 이러한 결과는, 영양실조 돼지의 소장에서 단백질 및 DNA 합성의 전체 과정이 손상되었음을 의미한다. 단백질(공장 및 회장) 및 DNA(회장)의 소장 내용물은, 카제인 또는 글루타민을 소비하는 것에 비해 NAQ 보충제를 소비하는 영양실조 돼지에서 보다 높게 나타났다. 이러한 결과는, NAQ가 영양실조 기간 동안에 단백질 및 DNA 합성 과정을 부분적으로 유지한다는 것을 제시한다.

소장 손상의 마커로서 알칼린 포스파타제 단편 활성은 공장 단편에서 대조(데이타는 나타내지 않았음)에 비해 영양실조 돼지에서 상당히 낮았다(2 내지 3배). 회장 단편에서, 알칼린 포스파타제 활성은 영양실조 과정에 의해 영향을 덜 받았다. 또한 글루타민 또는 NAQ 보충제를 소비하는 영양실조 돼지는 카제인 보충제를 소비하는 돼지에 비해 공장에서의 AP 활성이 높게 나타났다.

글루타티온은 전체 항산화 방어 시스템의 핵심 성분이다. 이는 유효한 유리 라디칼 스캐빈저로, 환원 상태에서 단백질 설프하이드릴기의 유지, GT 및 GPX 대한 보조인자, 아미노산 전달, 및 단백질 DNA 합성을 포함한 광범위한 다른 대사 기능에도 수반된다. 총 글루타티온 농도는 대조 그룹에 비해 영양실조 돼지의 소장 단편 둘다에서 상당히 감소하였다. 그러나, NAQ를 소비하는 영양실조 돼지의 소장 점막중 GSH의 양은, 그 차이가 유의적이지는 않더라도 카제인 또는 글루타민 보충제를 소비하는 돼지보다 약간 높게 나타났다.

알데히드 해독 및 글루타티온 환원을 각각 책임지는 글루타티온 트랜스퍼라제 및 글루타티온 리덕타제 효소 활성은 영양실조의 결과로서 소장에서 감소된 것으로 나타났다(2 내지 3배). 글루타티온 트랜스퍼라제 활성의 저하는, 알데히드, 에폭사이드, 및 점막내에 전자친화핵을 포함한 다른 산물의 축적에 의한 소장의 기능부전을 악화시킨다. 이러한 활성은 N-아세틸-L-글루타민 보충제를 소비하는 돼지에서는 영양실조 과정에 의해 영향을 덜 받는 것으로 나타났다. 글루타티온 리덕타제 및 글루타티온 퍼옥시다제의 활성은 소장 단편 둘다에서 영양실조에 의해 2 내지 3배 감소하였다. 글루타티온 리덕타제는 이의 산화형으로부터 글루타티온을 재생하는데 수반되며 글루타티온 퍼옥시다제는 2개의 환원된 글루타티온 분자를 산화시켜 퍼옥사다제를 해독시킨다. N-아세틸-L-글루타민 보충제를 공급한 돼지의 소장 점막에서 환원된 글루타티온이 보다 높아지는 경향은 동일 그룹에서 글루타티온 퍼옥시다제 활성이 보다 높아지는 경향과 연관되어 있다.

요약하면, 항산화 방어 시스템에 대한 영양실조의 유해한 효과는 카제인 또는 글루타민 보충제를 소비하는 동물보다 N-아세틸-L-글루타민 보충제를 소비하는 동물의 소장에서 보다 미약하게 나타난다.

면역학적 결과

영양실조의 결과로서 소장 파이어소절의 총 림프구수가 감소하였다. 회장에서는, N-아세틸-L-글루타민 보충 돼지 또는 대조 그룹보다 카제인 및 글루타민 보충 돼지에서 소장 파이어소절의 총 림프구수가 상당히 낮았다. 공장에서는, 카제인 및 글루타민 보충 그룹보다 N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹에서 파이어소절의 총 림프구수가 높은 경향을 나타내었다. 반면, 공장내 상피세포의 총 림프구수는 대조 그룹에 비해 모든 영양실조 그룹에서 상당히 높았다. 어떠한 실험 그룹에서도 소장의 고유판의 림프구수는 차이가 없었다.

모든 영양실조 그룹에서, B 세포 마커(CD1 및 CD21)를 발현하는 파이어소절의 림프구수는 건강한 그룹보다 낮았는데, 특히 CD1+ 림프구의 경우에 상당히 낮았다. 회장에서는 대조 그룹에 비해 감소된 CD21+ 파이어소절 림프구수가 카제인 및 글루타민 보충 그룹에서 상당히 상이하지만, N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹에서는 그렇지 않았다. 공장에서도 동일한 경향이 나타났지만 통계학적으로 유의적인 수준은 아니었다. 공장 및 회장에서의 CD11b+ 파이어소절 림프구수의 감소는 카제인 및 글루타민 보충 그룹 그룹보다 N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹에서 낮은 경향을 나타내었다.

공장 및 회장 파이어소절 림프구의 총 T 세포(CD3+ 세포)수는 영양실조와 함께 감소되었다. 감소는 보조(CD4+) 및 세포독성(CD8+) T 세포 둘다에 기인한다. 그러나, 카제인 및 글루타민 보충 그룹보다 N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹에서 PPL중 T 세포의 일반적인 감소 경향이 낮았다. 회장의 CD4+ 및 CD8+ 세포와 같은 몇몇 경우에서는, 대조 그룹과 카제인 및 글루타민 보충 그룹간에 유의차가 검출되지만 대조 그룹과 N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹간에는 유의차가 검출되지 않았다.

상기한 바와 같이, 영양실조는 공장에서 상피세포내 총 림프구수 증가를 촉진시킨다. 이러한 증가는 B 세포(CD21+) 및 T 세포(CD3+) 집단 모두에서 검출된다. B 세포에서, N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹의 CD1+ 림프구수는 나머지 그룹에 비해 상당히 높았다. T 세포에서, T 세포독성 아집단(CD8+)은 대조 그룹보다 모든 영양실조 그룹에서 상당히 높았다. 그러나, T 보조(CD4+) 아집단은 대조 그룹보다 N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹에서 상당히 높았지만 카제인 보충 그룹에서는 그렇지 않았다. 이는 T 보조(CD4+) 아집단에 대한 글루타민 및 N-아세틸-L-글루타민의 선택적인 효과를 지시한다. 회장 상피세포내 림프구중 어떠한 림프구 아집단에 대해서도 유의차가 검출되지 않았다.

영양실조에 기인하여 고유판 림프구에서는 실질적으로 중요한 변화가 없었다. 대조 그룹에 비해 카제인 보충 그룹에서는 CD21+ 세포(B 세포)수가 감소하였지만 글루타민 또는 N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹에서는 감소가 검출되지 않았다. 또한, N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹은 카제인 보충 그룹과 상당히 차이가 났지만 글루타민 보충 그룹은 그렇지 않았다.

요약하면, N-아세틸-L-글루타민 보충 그룹은 글루타민 또는 카제인 보충 그룹보다 훨씬 잘 작동하며, 특히 B 아집단 및 T 보조 아집단의 총 세포수에 있어 영양실조에 의해 촉진되는 소장의 면역학적 변화를 감소시키는데 있어 통계학적으로 유의차를 나타낸다.

조직학적 결과

건강한 돼지 및 영양실조 돼지의 공장세포의 투과 전자현미경 사진은 도 7에 나타내었다. 대조 돼지(A 및 B 패널)에서, 공장세포는 규칙적인 미세융모, 협소한 세포내강, 규칙적인 핵, 및 높은 수준의 점액을 함유한 배상세포를 보여준다. 카제인이 보충된 인슈어 플러스(INSURE PLUS) 제형을 소비하는 영양실조 돼지의 소장 점막(C 및 D 패널)은 미세융모의 심각한 위축 및 손실, 세포내강의 개방, 불규칙한 핵, 및 다소포체가 있는 투명한 세포질 영역을 보여준다. 또한 이 그룹에서는 세포 박리, 및 소장내강으로의 물질 유출이 명백하다. 영양실조 기간 동안 글루타민이 보충된 인슈어 플러스(ENSURE PLUS) 제형을 공급한 돼지의 공장 점막(E 및 F 패널)은 짧아진 미세융모, 팽창된 세포내강 및 불규칙한 소엽 핵을 보여준다. 영양실조 글루타민 돼지의 공장 점막에서 많은 상피세포내 림프구 침윤도 관찰되었다. NAQ가 보충된 인슈어 플러스(ENSURE PLUS) 제형을 소비하는 돼지의 공장 점막(G 및 H 패널)은 단백질-에너지 영양실조의 영향을 덜 받는다. 이 그룹에서 공장세포는 대조 돼지의 공장세포와 유사한 미세융모 크기, 핵형 및 세포내강을 보여준다. 상피세포내 림프구 침윤은 영양실조 카제인 및 글루타민 그루에 비해 영양실조 NAQ 그룹의 공장 점막에서 드물었다. 도 8은 건강한 돼지 및 영양실조 돼지의 회장세포의 투과 전자현미경 사진을 나타낸 것이다. 대조 돼지(A 및 B 패널)에서, 회장세포는 규칙적으로 분포된 미세융모, 가시적인 팽창이 없는 세포내강, 균질하게 밀도높은 세포질, 및 다량의 분비과립을 함유한 배상세포를 보여준다. 카제인이 보충된 인슈어플러스(ENSURE PLUS) 제형을 소비하는 영양실조 돼지의 회장 점막(C 및 D 패널)은 미세융모의 손실, 몇몇 세포내강의 팽창, 다소포체가 있는 투명한 세포질 영역, 및 유출 과정에 있는 세포를 보여준다. 또한 이 그룹에서는 회장 상피세포에서 광범위한 림프구 침윤이 명백하다. 영양실조 기간 동안 글루타민이 보충된 인슈어플러스(ENSURE PLUS) 제형을 공급한 돼지의 회장 점막(E 및 F 패널)은 미세융모 손실, 광범위한 세포내강 및 격렬한 림프구 침윤을 보여준다. 공장 점막에서와 같이, NAQ가 보충된 인슈어플러스(ENSURE PLUS) 제형을 소비하는 돼지의 공장 점막(G 및 H 패널)은 단백질-에너지 영양실조의 영향을 덜 받는다. 이는 미세융모 끝의 적은 변화, 가시적인 팽창이 없는 세포내강, 소장 상피세포의 끝 부분에서의 드문 림프구 침윤 및 분비 과립을 다량 함유한 풍부한 배상세포를 보여준다.

결론

정상적 생리학적 조건하에서는 세포 항산화 시스템에 의해 산소 유래의 유리 라디칼 생산 및 이의 파괴 사이에는 정상상태 균형이 이루어진다. 본 연구에서, 소장 균형은 단백질-에너지 영양실조에 의해 전복되어 글루타티온 및 효소적 항산화 방어 시스템이 감소된다. 또한, 소장 면역반응은 단백질-에너지 영양실조에 의한 심각한 손상을 받는다.

소장의 영양실조에 의해 유도되는 생화학적 및 면역학적 변화를 방지하는데 있어 글루타민의 확실한 효과가 검출되지 않았더라도, 영양실조가 특히 심각하다는 사실에 기인하면 이러한 변화의 심각성을 감소시키는데 N-아세틸-L-글루타민이 명백한 효과를 갖는다.

본 연구는 N-아세틸-L-글루타민이 소장의 세포에 대해 심지어 글루타민보다 명백한 효과를 갖는다는 것을 제시하고 있다. 또한, 도 7 및 도 8에 나타낸 건강한 돼지 및 영양실조 돼지의 장세포 세포질에 대한 투과 전자현미경 사진은, 위장관의 상피세포 내층에서 명백한 염증 징후를 방지하는데 있어 N-아세틸-L-글루타민이 글루타민보다 훨씬 효과적임을 보여준다.

실시예 5

비치료 셀리악 환자의 기관 배양물을 사용하여 셀리악병과 관련된, 글루타민이 풍부한 제조물의 독성 시험

본 연구의 목적은 셀리악병에서 점막 변형을 유발하는 것으로 공지된 글루텐의 펩신-트립신 제조물과 함께, 몇몇 글루텐 비함유 글루타민 풍부 생성물의 잠재적인 독성을 평가하는 것이다. 글루텐으로부터 유도되지 않은, 글루타민이 풍부한 생성물 또는 글루타민이 변형된 생성물이 셀리악 환자의 점막에 대해 유발 손상을 갖는지를 평가하기 위해 또한 이들을 시험하였다.

본 연구는 맹검 방식으로 실시한다. 본 연구를 위해서는, 글루텐의 독성에 노출되어 셀리악병의 점막 손상이 확인되었으며 또한 널리 사용되는 셀리악의 기관 배양물 모델을 사용한다. 본 프로젝트의 목적을 위해서는, 셀리악병을 치료하지 않은 환자의 소장 생검 단편을 사용한다. 상피 세포사멸 유발 및 점막 염증 증가를 포함한 점막 손상의 양태를 모니터하는데는 비치료 셀리악 환자의 생검이 이상적이다.

잠재적인 비치료 셀리악 환자로서 진단된 12명의 성인 환자를 모집한다. 이들의 질환은 임상적 징후, 항조직 트랜스글루타미나제의 높은 역가 및 소장 생검의 조직학적 분석에 의해 확인한다.

기관 배양 종료 시점의 설명

기관 배양은 마이우리 엘 등(Maiuri, L. et al)이 기술한 표준 방법을 사용하여 실시한다[참조문헌: Gastroenterology 110, 1368-1378 (1996)]. 요약하면, 작은 생검 단편(약 1㎜ x 1㎜)을 스테인레스강 메쉬위에 놓고 상이한 화합물이 보충된 배지중에서 24시간 동안 배양한다. 셀릭악 환자 및 생검의 시험관내 시험군을 포함하여 연구에 사용되는 표준 양성 및 음성 대조를 이용한다. 양성 대조는 1㎎/㎖의 펩신-트립신 분해된 글리아딘이다. 음성 대조는 배지 단독이다. 시험할 모든 화합물은 40㎍/㎖의 최종 농도로 사용한다. 시험하는 화합물/생성물은 N-알라닌-L-글루타민, N-아세틸-L-글루타민, 스트레손(Stresson^R; Nutricia, Boca Raton, Florida(PI)), 레콘반(Reconvan^R; Fresenius Kabi, Runcorn, Cheshire, UK(P2)), 뉴트리콤프 이뮨(Nutricomp Immun^R; B. Braun, Bethleham, PA(P3)), 글루타소브(Glutasorb^R; Hormel Health Labs, Plymouth, MN(P4)), 임팩트(Impact^R; Novartis, White Plains, NY(P5)), 옵티멘탈 플러스 NAQ(Optimental^R plus NAQ; Ross Products, Columbus, Ohio(P6)) 및 옵티멘탈 플러스 가수분해 밀 글루텐(Optimental^R plsu wheat gluten; Ross Products, Columbus, Ohio P7))이다. 24시간 후, 배양을 정지시키고 생검 단편을 배열한 후 O.C.T 화합물에 봉입시키고 액체질소에 냉각시킨 이소펜탄중에서 잠깐 냉각시킨 후, 동결 절편을 만들 때까지 -70℃에서 보관한다. 그런 다음, 저온 유지 장치를 사용하여 5㎛의 절편을 만든다.

면역조직화학

본 연구를 위해서는 하기의 마커를 사용한다: 상피 세포사멸을 모니터하기 위한 TUNEL 및 상피하 염증을 모니터하기 위한 CD25. 하기의 과정에 따라 하기하는 시약을 사용한다.

DNA 단편화 검출

조직 단편의 DNA 단편화는 말단 데옥시뉴클레오타딜 트랜스퍼라제(TdT) 매개된 dUTP-디곡시게닌 닉 말단 표지화(TUNEL)에 의해 마이우리 엘 등(Maiuri, L. et al.)이 기술한 바에 따라 분석한다[참조문헌: DNA fragmentation is a feature of cystic fibrosis epithelial cells: a disease with inappropriate apoptosis? FEBS Letter 408,225-31 (1997) and Maiuri, L. et al. FAS engagement drives apoptosis of enterocytes of celiac patients. Gut 48, 418-24 (2001)].

CD25+ 세포의 검출

상기와 동일한 문헌에서 이미 기술한 방법에 따른 알칼린 포스파타제 염색 기술에 의해, mAbs 항-CD25(Dako 1:30)를 사용하여 마이우리 엘 등이 기술한 바와 같이 면역조직화학법에 따라 냉동 조직 단편상에서 항원을 검출한다[참조문헌: Blockage of T-cell costimulation inhibits T-cell action in Celiac disease. Gastroenterology 115,564-72. (1998)]. 각 샘플에 대해 적어도 5개의 슬라이드를 맹검으로 평가한다. 부적절한 혈액 그룹 항원에 대한 IgG 또는 IgM을 이용하고 이와 동시에 동일 개체에 속하는 상이한 배양 샘플을 분석하여 특이성 대조 실험을 실시한다.

형태학적 분석

TUNEL+장세포의 총 수는 장세포%라 한다. 고유판중 CD25+ 세포의 총 수는 1㎟의 표준 참조 영역내에서 측정한다. 점막(muscolaris mucosae)에 대해 평행하게 정렬된 보정된 안구 격자선과 함께 현미경하에서 수를 측정하고 2명의 관찰자가 독립적으로 분석한다; 결과는 나중에 비교한다.

결과

도 9에 나타낸 바와 같이, 화합물은 상피하 구획에서 TUNEL 및 CD25 상위조절에 의해 정의되는 상이한 패턴의 상피세포 손상을 유발한다. 몇몇 제조물은 상피 세포사멸뿐만 아니라 상피하 구획에서의 CD25의 강력한 발현 증가도 유발한다. 따라서, 이러한 화합물은 양성 대조(1㎎/㎖의 펩신-트립신 글루텐 제조물)로서 거동한다. 다른 화합물은 상피 세포사멸 및 상피하 구획에서의 CD25 유발의 몇몇 선택적인 변형을 유발한다. 다른 것들은 배지 단독(음성 대조)에만 노출시킨 배양물에서 관찰되는 세포사멸 또는 CD25 유발 패턴과 상이하지 않았다. 도 10a 및 10b는 글루타민(p5)을 함유한 생성물 임팩트(Impact) 또는 화합물 N-아세틸-L-글루타민을 사용하여 상피 세포사멸을 유발하는 예를 나타낸 것이다. 도 11a 및 b는 동일 화합물에 의한 CD25 유발 패턴을 나타낸 것이다.

결론

본 연구 결과는 시험 화합물의 다수가 비치료 셀리악 환자의 소장에 상당한 변형을 일으킨다는 것을 제시하고 있다. 몇몇은 상피 세포사멸 및 증가된 상피하 염증을 유발할 수 있으며, 다른 것은 점막 염증을 보다 효율적으로 유발한다. 마커 둘다 또는 하나를 유발하는 화합물은 셀리악 환자의 점막에 대해 독성이 있는 것으로 간주되었다. 화합물중 몇몇은 어떠한 효과도 유발하지 않았는데, 특히 화합물 N-아세틸-L-글루타민이 그러하였다. 또한 이 화합물은 비치료 셀리악 환자의 생검상에 분명한 영양 효과를 나타내었다. 이러한 영양성은, 다른 샘플과 비교시 상당히 개선된, 특정 상피 점막의 일반적인 개선으로 정의된다.

본 연구는 비치료 셀리악 환자의 점막에서 시험 화합물중 대부분이 실질적인 변화를 일으킨다는 것을 분명히 보여준다. 예상치 못한 바와 같이, 가장 흥미로운 점은 N-아세틸-L-글루타민의 영양 활성 측면이었다. 우선 이 생성물은 심지어는 배지 단독보다 점막의 전체적인 상태를 개선시키는 것으로 나타났다.

청구항에서 제시한 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 범주내에 포함되는 특정한 양태를 기술하고 있다. 이러한 양태는 상기한 특정 형태로 본 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다. 본 발명의 본 발명의 요지 및 범주에 부합하는 모든 변형 및 대안을 포함할 수 있다.

Claims

유효량의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 경구 투여함을 포함하여, 사람에게 글루타민을 보충하는 방법.
제1항에 있어서, N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 적어도 0.7mmol/㎏/일로 사람에게 투여하는 방법.
제1항에 있어서, N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 적어도 1.0mmol/㎏/일로 사람에게 투여하는 방법.
제1항에 있어서, N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 적어도 1.5mmol/㎏/일로 사람에게 투여하는 방법.
제1항에 있어서, 영양학적으로 허용되는 염이 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민, 트리부틸아민, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민, 프로카인, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 사람이 위장관 수술, 위장관 절개, 소장 이식, 수술후 외상, 기아, 심각한 질환 및 손상, 다발성 외상, 소장증후군, 화상, 골수 이식, AIDS, 구강점막염, 암, 셀리악병, 크론병, 괴사성 소장결장염, 장 미숙, 기회감염, 특정 치료와 관련된 장 악화, 제한된 경구 영양공급 및 이들의 복합적인 것으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 상태로 고통받는 방법.
a) 리터당 30mEq 내지 95mEq의 나트륨;

b) 리터당 10mEq 내지 30mEq의 칼륨;

c) 리터당 10mEq 내지 40mEq의 시트르산염;

d) 3.0w/w% 미만의 한가지 탄수화물 및

e) 용액 리터당 5.0mmol 이상의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하는 수용액.
제7항에 있어서, 용액 리터당 20mmol 내지 300mmol의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하는 수용액.
제7항에 있어서, 용액 리터당 25mmol 내지 200mmol의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하는 수용액.
제7항에 있어서, 영양학적으로 허용되는 염이 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민, 트리부틸아민, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민, 프로카인, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 수용액.
제7항에 있어서, 수용액이 추가로 클로라이드를 함유하는 수용액.
제7항에 있어서, 탄수화물이 덱스트로스 및 프럭토스의 혼합물인 수용액.
제7항에 있어서, 탄수화물이 3.0w/w% 미만의 양으로 존재하는 수용액.
제7항에 있어서, 나트륨이 30mEq/ℓ 내지 95mEq/ℓ의 양으로 존재하는 수용액.
제7항에 있어서, 나트륨이 염화나트륨, 시트르산나트륨, 중탄산나트륨, 탄산나트륨, 수산화나트륨 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 수용액.
제7항에 있어서, 칼륨이 10mEq/ℓ 내지 30mEq/ℓ의 양으로 존재하는 수용액.
제7항에 있어서, 칼륨이 시트르산칼륨, 염화칼륨, 중탄산칼륨, 탄산칼륨, 수산화칼륨 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 수용액.
제11항에 있어서, 클로라이드가 30mEq/ℓ 내지 80mEq/ℓ의 양으로 존재하는 수용액.
제11항에 있어서, 클로라이드가 염화칼륨, 염화나트륨 및 염화아연으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 수용액.
제7항에 있어서, 시트르산염이 20mEq/ℓ 내지 40mEq/ℓ의 양으로 존재하는 수용액.
제7항에 있어서, 시트르산염이 시트르산칼륨, 시트르산나트륨 및 시트르산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 수용액.
제7항에 있어서, 하나 이상의 풍미를 추가로 함유하는 수용액.
제7항에 있어서, 하나 이상의 인공 감미료를 추가로 함유하는 수용액.
제7항에 있어서, 한천, 알긴산 및 염, 아라비아고무, 아카시아고무, 탈하고무, 셀룰로스 유도체, 커들란, 발효 고무, 푸르셀라란, 젤라틴, 젤란고무, 가티고무, 구아고무, 이오타 카라기난, 진두발, 카파 카라기난, 곤약분, 카라야고무, 람다 카라기난, 낙엽송고무/아라비노갈락탄, 로커스트 콩 고무, 펙틴, 타마린드씨고무, 타라고무, 트라가칸트고무, 천연 및 변형 전분, 잔탄고무로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 겔화제를, 3차원 구조를 자체적으로 지지하기에 충분한 양으로 추가로 함유하는 수용액.
제7항에 있어서, 쌀가루를 추가로 함유하는 수용액.
제7항에 있어서, 소화할 수 없는 올리고당을 추가로 함유하는 수용액.
a) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 8 내지 35%를 구성하는 단백질 성분;

b) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 36 내지 76%를 구성하는 탄수화물 성분 및

c) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 6 내지 51%를 구성하는 지질 성분과 , 단백질 성분의 칼로리를 기본으로 하여 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염의 형태를 1 내지 23%로 포함하는 액체 영양 제형.
a) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 14 내지 35%를 구성하는 단백질 성분;

b) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 36 내지 76%를 구성하는 탄수화물 성분 및

c) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 6 내지 51%를 구성하는 지질 성분과, 영양 제형 1000㎉당 35mmol 이상의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 성인용 액체 영양 제형.
제28항에 있어서, 영양 제형 1000㎉당 35mmol 내지 160mmol의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 액체 영양 제형.
a) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 8 내지 25%를 구성하는 단백질 성분;

b) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 39 내지 44%를 구성하는 탄수화물 성분 및

c) 액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 45 내지 51%를 구성하는 지질 성분과, 영양 제형 1000㎉당 5.0mmol 이상의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는, 비성인 환자용 액체 영양 제형.
제30항에 있어서, 영양 제형 1000㎉당 5.0mmol 내지 32mmol의 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 영양학적으로 허용되는 염이 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 알루미늄, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 디에틸아민, 에틸아민, 트리부틸아민, 피리딘, N,N-디메틸아닐린, N-메틸피페리딘, N-메틸모르폴린, 디사이클로헥실아민, 프로카인, 디벤질아민, N,N-디벤질펜에틸아민, 1-에펜아민, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 피페리딘, 피페라진 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 제형 1500㎉당 1.0g 미만의 피로글루탐산을 함유하는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 성인용 제형이며,

액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 14 내지 35%를 구성하는 단백질 성분;

액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 36 내지 76%를 구성하는 탄수화물 성분;

액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 6 내지 41%를 구성하는 지질 성분 및

단백질 성분의 칼로리를 기본으로 하여 1 내지 25%를 구성하는 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 포함하는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 비성인용 제형이며,

액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 8 내지 25%를 구성하는 단백질 성분;

액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 39 내지 44%를 구성하는 탄수화물 성분;

액체 영양 제형의 총 칼로리 함량의 45 내지 51%를 구성하는 지질 성분 및

단백질 성분의 칼로리를 기본으로 하여 1 내지 12%를 구성하는 N-아세틸-L-글루타민 또는 영양학적으로 허용되는 이의 염을 함유하는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 경구 투여되는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 장으로 투여되는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 칼슘, 인, 나트륨, 클로라이드, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 셀레늄, 요오드, 크롬, 몰리브덴, m-이노시톨, 카르니틴, 타우린, 비타민 A, C, D, E, K 및 B 복합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 비타민 및 무기질을 추가로 함유하는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 지질 성분이 코코넛유, 콩기름, 옥수수유, 올리브유, 잇꽃유, 고올레산 잇꽃유, MCT유(중쇄 트리글리세라이드), 해바라기유, 고올레산 해바라기유, 팜유, 팜 올레인, 카놀라유, 어유, 팜핵유, 청어유, 대두유, 면실유, 레시틴, 아라키돈산 및 도코사헥사엔산의 지질 공급원, 구조화 지질 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 단백질 성분이 콩계 단백질, 유계 단백질, 카제인 단백질, 유장 단백질, 쌀 단백질, 쇠고기 콜라겐, 완두콩 단백질, 감자 단백질 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 완전 단백질을 함유하는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 단백질 성분이 콩 단백질 가수분해물, 카제인 단백질 가수분해물, 유장 단백질 가수분해물, 쌀 단백질 가수분해물, 감자 단백질 가수분해물, 생선 단백질 가수분해물, 달걀 알부민 가수분해물, 젤라틴 단백질 가수분해물, 동물 및 식물 단백질 가수분해물의 배합물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 가수분해된 단백질을 함유하는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 단백질 성분이 트립토판, 타이로신, 시스테인, 메티오닌, 아르기닌, 류신, 발린, 라이신, 페닐알라닌, 이소류신, 트레오닌, 히스티딘, 카르니틴, 타우린, 글리신, 알라닌, 세린, 시스틴, 티록신, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산, 글루타민, 하이드록실라이신, 프롤린, 하이드록시프롤린 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 유리 아미노산을 포함하는 액체 영양 제형.
제27항에 있어서, 탄수화물 성분이 왁스형 또는 비왁스형의 옥수수, 타피오카, 쌀 또는 감자로부터의 가수분해된 전분, 완전 전분, 천연 전분 및 화학적으로 변형된 전분; 글루코스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 고프럭토스 옥수수 시럽, 옥수수 시럽 고형물과 같은 당; 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 액체 영양 제형.
제7항에 따른 수용액을 셀리악병으로 고통받는 환자에게 투여하여 셀리악병으로 고통받는 환자의 소장 점막 염증을 감소시키는 방법.
제27항에 따른 액체 영양 제형을 셀리악병으로 고통받는 환자에게 투여하여 셀리악병으로 고통받는 환자의 소장 점막 염증을 감소시키는 방법.
제28항에 따른 액체 영양 제형을 셀리악병으로 고통받는 환자에게 투여하여 셀리악병으로 고통받는 환자의 소장 점막 염증을 감소시키는 방법.
제30항에 따른 액체 영양 제형을 셀리악병으로 고통받는 환자에게 투여하여 셀리악병으로 고통받는 환자의 소장 점막 염증을 감소시키는 방법.