CN100382796C - 用于提供谷氨酰胺的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过口服有效量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐向人提供谷氨酰胺补充的方法和组合物。可以将N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐掺入适合人体消耗的任意一种液体组合物中。适宜的组合物实例包括含水溶液例如用作口服的再水化溶液以及液体营养配方食品(包括肠配方食品、口服配方食品、成人用配方食品、儿童用配方食品和婴儿用配方食品)。N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐的用量可以随意变化，但是通常所述组合物应该含有足以获得至少140mg总谷氨酰胺/kg体重/天的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐。

Description

用于提供谷氨酰胺的方法和组合物
发明领域
本发明涉及通过口服有效量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺、或其营养上可接受的盐来提供谷氨酰胺补充的方法。
背景技术
谷氨酰胺是人体中最丰富的氨基酸。它占位于骨骼肌中的游离氨基酸的60％以上以及占总循环氨基酸的20％以上。谷氨酰胺牵涉很多机体功能，包括糖原异生、核苷酸合成、酸碱平衡以及其它关键的代谢过程。研究表明，谷氨酰胺是迅速复制各种细胞尤其是胃肠道和粘膜细胞所使用的重要代谢底物。谷氨酰胺在人活体内空肠(小肠的一部分)中可以被有效吸收。
由于谷氨酰胺实际上可以由机体的所有组织合成得到，因此它并未被认为是必需氨基酸。据信当机体处于正常的生理状态时，它可以产生足以维持机体所需量(也就是消耗谷氨酰胺的组织)的谷氨酰胺。然而众多研究显示，在异常的生理状态下(也就是疾病和代谢困难)，谷氨酰胺的生产变得不足以满足机体的需要。因此，可以更确切地把谷氨酰胺看作是一种有条件的必需氨基酸。例如，多项研究已经将谷氨酰胺归类到肠损伤的情形中。Souba，W.W.；Smith，R.J.；和Wilmore，D.J.：Glutamine Metabolism by the Intestinal Tract.JPEN 9(5)：608-617(1985)；Furst，P.；Albers，S和Stehle，P.：Evidence for a nutritional need for glutamine in catabolicpatients.Kidney Intl.36(Suppl.27)：S-287-S-292(1989)；Klimberg，V.S.，等人：Oral glutamine accelerates healing ofthe small intestine and improves outcome after whole abdominalradiation。已经表明谷氨酰胺是用于培养海拉细胞的主要能量来源。Reitzer，L.J.；Wice，B.M.；和Kennell，D.：Evidence thatglutamine，not sugar，is the major energy source for culturedHeLa cells.J.Biol.Chem.254(8)：2669-2676(1979)。另外，还表明谷氨酰胺可以优先被肿瘤细胞利用，导致谷氨酰胺在癌症患者中被逐渐损耗。Souba，W.W.：glutamine and Cancer.Ann.Surg.218(6)：715-728(1993)。
过去已经开始在各种营养配方食品中补充谷氨酰胺。补充就意味着向该配方食品中加入额外的谷氨酰胺(可以是游离氨基酸，也可以是其它相对浓缩的形式，例如水解后的小麦麸质)。作为天然存在的氨基酸，谷氨酰胺以一定的含量存在于所有的蛋白质中，因而在含有蛋白质的任何营养配方食品中它都具有一定的含量。然而，谷氨酰胺仅仅含有一定的少量最天然存在的蛋白质，因此为了制备含量超过一定水平的谷氨酰胺配方食品，必须加入补充形式的谷氨酰胺。这些补充了谷氨酰胺的配方食品中的一些在市场上是面向那些代谢困难的患者、GI功能受损的患者(例如由严重的多发性损伤、腹泻、炎性肠病、GI手术引起的GI功能受损、由于化学疗法或放射疗法引起的严重烧伤或损伤)、具有吸收不良症状和/或急性损伤的患者(例如克罗恩氏病)。
制备这种富含谷氨酰胺的补充制剂的最简便的方法是通过麸质的水解，麸质作为多肽的复合物的混合物，其特征在于含有大量的谷氨酰胺。由于其中麸质被水解成碎片的形式，因此这些产品在操作上被认为不含麸质。然而，使用这类富含谷氨酰胺的“无麸质”化合物存在潜在的危险，这是因为麸质是腹腔疾病的启动环境因子，已经表明麸朊的小碎片对于腹腔患者具有毒性作用。
腹腔疾病是一种自体免疫肠病，在易感个体中它通过摄取含麸质的谷类而被引发。小麦麸质中的麸朊部分以及其它谷类中的类似的醇溶性蛋白质是引起肠道损伤的环境因子。目前已经证实，腹腔疾病是对麸质摄取进行不适当T细胞调节免疫应答的结果。该疾病还与主要的组织相容性复合物中的人类白细胞抗原(HLA)有关。并且在持续存在麸质的条件下，这种疾病能够使自身长期存在。典型的肠道损伤的特征在于吸收性绒毛减少以及小囊增生，这完全可以通过从患者进食中排除含麸质的谷类而得到解决。最近统计表明，在全球人口中通常每100-300个个体中就有多达1个可能受到这种状况影响。腹腔疾病的特征进一步还在于一连串的明显妨碍生活质量的并发症，这些并发症在多数情形下还会威胁生命，例如粘膜淋巴瘤。
由于具有上述的医学优势，因此人们采取各种努力以将谷氨酰胺掺入营养产品中。困恼这种努力的一个问题在于谷氨酰胺在水溶液中的稳定性有限。已知游离的谷氨酰胺在含水介质中降解形成焦谷氨酸和谷氨酸。许多研究表明，焦谷氨酸是啮齿动物体内的神经毒素。C.F.deMello等人：Neurochemical effects of L-pyroglutamic acid.Neurochem.Res.20(12)：1437-1441(1995)；McGreer，E.G.和Singh，E.：Neurotoxic effects of endogenous materials：quinolinic acid，L-pyroglutamic acid，and thyroid releasinghormone(TRH).Exp.Neurol.16(3-4)：410-413(1984)；Rieke，G.K.等人：L-Pyroglutamate：an alternative neurotoxin for arodent model of Huntington′s disease.Exp.Neurol.104(2)：147-154(1989)。当进食这种营养配方食品时，这种降解既生成焦谷氨酸，同时还减少了体内可利用的谷氨酰胺含量。因此，游离谷氨酰胺作为营养源中的补充谷氨酰胺来源的用途主要局限于粉状配方食品，这种粉状配方食品在进食之前可以用水立即或者几乎立刻(24-48小时)再水化，并且再水化后最好在冰冻条件下储存。这类粉状配方食品包括(Ross Products Division of AbbottLaboratories)、
Figure C0282997600102
(Enjoy Foods)、和Vivonex
Figure C0282997600103
(Sandoz)。这些制剂可以分别提供大约25.4、20.1和14.5g谷氨酰胺/1500千卡热量(根据分析)。另外，Mawatari等人的欧洲专利申请EP 1097646公开了含有谷氨酰胺和/或含有谷氨酰胺的肽的改良奶粉组合物的用途。虽然这类产品对于患者的保健具有重要作用，但是粉状制品被美国多数卫生保健部门认为并不是最好的。由于在很多美国社区中缺乏经过培训的私人医生，因此卫生保健部门仍然非常希望现成进食的营养配方食品(RTF)。另外，这类营养配方食品必须具有至少12个月的贮藏寿命以被市场接受。因此，游离的谷氨酰胺因其稳定性有限而不适合于这类RTF产品。
研究人员继续寻找在溶液中具有长期稳定性的谷氨酰胺来源。例如，Guerrant等人在标题为“Stable Glutamine Derivatives forOral and Intravenous Rehydration and Nutrition Therapy”的美国专利5,561,111中公开了丙氨酸-谷氨酰胺扮演这种角色的用途。总的来说，Guerrant等人认为可以在谷氨酰胺上安置酰基保护基，但是并没有提供生物学数据以证明这种主张。另外，该文献也没有提供任何有关含有一定量的这类衍生物的口服或静脉内化合物的特殊制剂的指导。
正如Gandini等人在“HPLC Determinationof PyroglutamicAcid as a Degradation Product in Parenteral Amino AcidFormulations”Chromatographia，vol.36，pp.75-78(1993)中所指出的那样，这种疏忽对于这类溶液所存在的配制问题而言非常重要。在该文中，作者认为，为了解决谷氨酰胺降解为焦谷氨酸的问题，已经有人建议过使用二肽，但是问题在于这样导致所得到的溶液的氨基酸含量在质量上不均衡。作者还认为谷氨酰胺衍生物即乙酰基-谷氨酰胺具有低的生物利用度。
Gurrant等人缺乏生物学数据与该领域其它研究人员的工作非常相关。Palmerini等人给小鼠口服用放射性同位素标记的N-乙酰基-L-谷氨酰胺。“Uptake of Doubly-Labeled N-Acetyl-L-Glutamine inRat Brain and Intestinal Mucosa in Vivo”，Farmaco，vol.36(7)，pp.347-355(1981年7月)。Palmerini等人证实N-乙酰基L-谷氨酰胺(NAQ)是跨肠内粘膜被完整吸收的。由于谷氨酰胺的基本活性之一是营养内脏的上皮细胞，因此乙酰基官能团未被肠水解将会使本领域技术人员不把NAQ作为营养产品中谷氨酰胺的来源。这种官能团主要出现在氨基酸的肠内吸收过程中。
Magnusson等人在“Utilization of IntravenouslyAdministered N-Acetyl-L-Glutamine in Humans”Metabolism，vol.38(8)，suppl.1(8月)，pp.82-88(1989)中讨论了使用营养配方食品中的N-乙酰基-L-谷氨酰胺所存在的问题，他们发现在尿中排出了20-40％的通过静脉内给予的N-乙酰基-L-谷氨酰胺的剂量。Wallace等人也提到过尤其在小鼠中可能存在的其它问题，他们最后认为可能存在食欲不振以及不能充分利用乙酰化的肽类例如N-乙酰基-(丙氨酸)2的问题。“Uptake of acetylated peptides from the smallintestine in sheep and their nutritive value inrats”BritishJournal of Nutrition.v.80，pp.101-108(1998)。
发明概述
根据本发明，发现N-乙酰基L-谷氨酰胺具有作为人口服谷氨酰胺补充剂的效用。本发明者发现人体的肠组织可以利用作为N-乙酰基L-谷氨酰胺谷氨酰胺的来源。因此，可以将N-乙酰基-L-谷氨酰胺掺入计划供人体消耗的液体营养配方食品中。这些组合物具有长期的稳定性，并且可以以人体可生物利用的形式提供N-乙酰基-L-谷氨酰胺。该N-乙酰基L-谷氨酰胺可以以酸或其营养上可接受盐的形式给予。根据在非人类的其它动物身二完成的早期研究成果，上述发现是预先所预料不到的。
可以将N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐掺入适合人体消耗的任意一种液态组合物中。适宜的组合物的实例包括含水溶液例如口服的再水化溶液、以及液体营养配方食品(包括肠配方食品、口服配方食品、成人用配方食品、儿科患者用配方食品和婴儿用配方食品)。N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐的用量可以随意变化，但是通常所述组合物应该含有足以获得至少10mg总谷氨酰胺/kg体重/天的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐。
附图描述
图1以图表形式描述了N-乙酰基-L-谷氨酰胺在不同pH值和环境温度下的稳定性。对于pH5.0至pH8.0的样本，所有的值相同。
图2以图表形式描述了当在室温下保存N-乙酰基-L-谷氨酰胺水溶液180天之后，在该溶液中在2.0-8.0的pH范围内形成的降解产物。
图3以图表形式描述了在本文所述内科手术试验中在向分离的猪肠环中加入谷氨酰胺或N-乙酰基-L-谷氨酰胺后残留在肠腔中的该物质作为时间的函数。残留的被分析物以占计时起点时的被分析物的百分数表示。
图4以图表形式描述了在本文所述内科手术试验中在向分离的猪肠环中引入该物质后所加入的葡萄糖残留在肠腔中的量作为时间的函数。残留的葡萄糖以占计时起点时的量的百分数表示。
图5以图表形式描述了猪袢门血液中的谷氨酰胺含量(mcg/mL)作为给药后时间的函数，其中向这些猪的分离的肠环中引入不同的物质(葡萄糖盐水对照、谷氨酰胺的葡萄糖盐水溶液或者N-乙酰基-L-谷氨酰胺的葡萄糖盐水溶液)。
图6以图表形式描述了在本文所述的内科手术试验之后所测得的猪肠空肠粘膜中的谷氨酰胺和谷氨酸盐的含量(以mcg/克湿粘膜表示)。
图7示出了来自进食了ENSURE PLUS配方食品的健康猪(A、B组)以及进食了补充有酪蛋白酸盐(C、D组)、谷氨酰胺(E、F组)或NAQ(G、H组)的配方食品30天的蛋白质能量营养不良的猪的空肠的肠细胞的电子透射显微图，对其炎症信号例如清晰的细胞质间隙和淋巴细胞渗透现象进行了分析。
图8示出了来自进食ENSURE PLUS配方食品的健康猪(A、B组)以及进食补充有酪蛋白酸盐(C、D组)、谷氨酰胺(E、F组)或NAQ(G、H组)的相同配方食品30天的蛋白质能量营养不良的猪的回肠肠细胞的电子透射显微图，对其炎症信号例如清晰的细胞质间隙和淋巴细胞渗透现象进行了分析。
图9示出了不同产品/化合物对于在未接受治疗的腹腔疾病患者的粘膜上出现细胞凋亡和发炎的几率的影响。
图10示出了接受N-乙酰基谷氨酰胺(A)和P5(B)治疗的粘膜样本的上皮TUNEL表达模式。
图11示出了接受N-乙酰基谷氨酰胺(A)和P5(B)治疗的粘膜样本的上皮下区室中的CD25表达模式。
详细描述
在本申请中使用的下述术语具有下面指定的含义：
a)“总谷氨酰胺”是指来自任意来源的被表述为谷氨酰胺的可生物利用或可潜在利用的谷氨酰胺的总量。其可能包括以游离的谷氨酰胺形式提供的谷氨酰胺、作为肽或完整蛋白质的一部分的谷氨酰胺存在的谷氨酰胺以及其它可生物利用的谷氨酰胺来源，例如N-乙酰基-L-谷氨酰胺。不包括谷氨酰胺降解的副产物(例如焦谷氨酸等)。作为这种计算的实例，如下描述了一种假定的产品。
一种含有60克/升含完整和轻微水解蛋白质的蛋白质体系的营养产品，它包括：
i。1.1克/升的游离谷氨酰胺，按照本领域技术人员熟知的方法测量。
ii.含有50.0克/升蛋白质的完整和轻微水解的蛋白质的混合物，它通过已经公开的方法分析(例如通过如Fouques等人，“Study ofthe Conversion of Asparagine and Glutamine of proteins intoDiaminopropionic and Diaminobutyric Acids Using[Bis(trifluoroacetoxy)iodo]benzene Prior to Amino AcidDetermination.”Analyst，Volume 116，(May)，pp529-531(1991)的方法)，含有3.4克谷氨酰胺/100克蛋白质。
iii.11.6克/升的N-乙酰基-L-谷氨酰胺，它含有9.0克根据下式计算的谷氨酰胺：
Figure C0282997600141
因此，“总谷氨酰胺”为这三种来源的总和，即：1.1克/L(游离)+(3.4g/100g蛋白质×50g蛋白质/L)+9.0克/L(NAQ)＝11.8克。
b)“mmole”是指毫摩尔(也就是1摩尔的1/1000)
c)术语“营养上可接受盐”是指适合用于适合对人口服给药的液体组合物中的N-乙酰基-L-谷氨酰胺的盐。N-乙酰基-L-谷氨酰胺的营养上可接受盐是其中羧基上的氢被另一阳离子替代的盐。这类盐可以在N-乙酰基-L-谷氨酰胺的最终分离和纯化过程中制备得到或者单独地通过将羧基与适宜的碱例如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐、或碳酸氢盐或者与氨水或有机伯胺、仲胺或叔胺反应制备得到。营养上可接受的盐可以基于碱金属或碱土金属例如锂、钠、钾、钙、镁、和铝以及无毒的季氨和季胺阳离子例如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N，N-二苄基苯基胺、β-甲基氨基-α-苯基-苯乙醇(1-ephenamine)、以及N，N′-二苄基乙二胺。可用于形成碱式加成盐的其它代表性的有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。
d)说明书或权利要求书中涉及电解质用量的地方应该被解释为指电解质在口服的再水化溶液中的最终浓度。自来水通常含有残留的钠、氯等。在本申请中，钠值为40mEq是指存在于口服的再水化溶液中的全部钠等于40mEq，包括加入的钠以及用于制备口服的再水化溶液的水中所存在的钠。
e)本申请中涉及数字范围的地方应该被理解为其被形容词“大约”修饰。另外，任何数字范围均应该被认为给涉及该范围子集的权利要求提供了支持。例如，公开了1-10的范围应该被认为在说明书和权利要求书中给该范围内的任意子集提供了支持(也就是范围2-9、3-6、4-5、2.2-3.6、2.1-9.9等)。
本发明提供了通过口服有效量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐向人提供谷氨酰胺补充的方法和组合物。适合用于该营养配方食品中的N-乙酰基-L-谷氨酰胺可以利用众所周知的常规化学合成手段制备，例如在适宜的碱催化剂(例如吡啶)存在下用乙酸酐孵育游离的L-谷氨酰胺，接着进行合成，通过重结晶进行适当的纯化，这样可以得到适宜的食品级的纯化合物。实际上，很多精通氨基酸化学的化学公司都可以提供食品级的N-乙酰基-L-谷氨酰胺(例如KyowaHakko Kogyo Co，Ltd.，Tokyo，Japan或Flamma，s.p.a.，Italy)。或者，也可以利用其它方法(例如微生物发酵，参见JP 51038796、JP57001994、JP 57016796)制备适宜的食品级N-乙酰基-L-谷氨酰胺。N-乙酰基-L-谷氨酰胺的营养上可接受盐为其羧基上的氢被另一阳离子替代的盐。这类盐可以在N-乙酰基-L-谷氨酰胺的最终分离和纯化过程中制备得到或者单独地通过将羧基与适宜的碱例如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐、或碳酸氢盐或者与氨水或有机伯胺、仲胺或叔胺反应制备得到。营养上可接受的盐可以基于碱金属或碱土金属例如锂、钠、钾、钙、镁、和铝以及无毒的季氨和季胺阳离子例如铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N，N-二苄基苯基胺、β-甲基氨基-α-苯基-苯乙醇、以及N，N′-二苄基乙二胺。可用于形成碱式加成盐的其它代表性的有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、和哌嗪。如果需要的话，可以使用来自Sigma的适宜的药品级N-乙酰基-谷氨酰胺。
向人提供谷氨酰胺补充的方法包括口服有效量的N-乙酰基-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐。通常，N-乙酰基-L-谷氨酰胺可以以液体的形式服用，例如作为口服的再水化溶液、运动饮料、或者肠配方食品的一部分。
有效量的N-乙酰基-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐优选为足以提供大约10-50g总谷氨酰胺/天或者至少大约140mg总谷氨酰胺/kg体重/天的量、更优选为至少250mg总谷氨酰胺/kg体重/天(mg/kg/天)的量。N-乙酰基-L-谷氨酰胺可以由来自大约1-100％的患者每日基本消耗的总谷氨酰胺提供，优选由来自大约10-95％、更优选为大约75-90％的患者每日基本消耗的总谷氨酰胺提供。
如果N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐作为提供供患者消耗的谷氨酰胺的唯一来源，那么N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐的优选量优选为至少大约0.7毫摩尔/kg/天。更优选地，有效量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐可以为至少大约1.0毫摩尔/kg/天。尤其更优选有效量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺可以为至少大约1.5毫摩尔/kg/天。
如上所述，为了提供250mg/kg/天的总谷氨酰胺所需要的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐的用量随患者所消耗的所有其它蛋白质组分中的谷氨酰胺含量的改变而改变。作为一个总的原则，为了充分获得本发明的益处，患者应该消耗至少大约0.7至大约4.0毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐/kg/天。更低的用量可能也是有益的，这取决于蛋白质体系中其它组分的总谷氨酰胺含量。总的来说，应该向患者提供足够的N-乙酰基-L-谷氨酰胺，其递送量为至少大约140mg的总谷氨酰胺/kg体重/天，更优选为至少大约250mg总谷氨酰胺/kg体重/天。
可以采取方法向成人、儿童和婴儿提供谷氨酰胺补充。术语儿童是指年龄为1岁至大约16岁的(即成人期)人。术语婴儿是指包括所有年龄小于1岁的人，还包括早熟婴儿和轻微早产婴儿。术语早熟婴儿是指在怀孕的37周之前出生和/或出生时少于2500克的婴儿，术语轻微早产婴儿是指在怀孕的23-28周出生的婴儿。本文所使用的术语未成年人包括儿童和婴儿。
给成人、儿童和婴儿进食的谷氨酰胺等价物的浓度可以不同。其原因之一在于在不同应力环境下对热密度的需求存在很大变化。这种情形的实例是在例如患严重外伤的患者或者早熟婴儿只能承受极小体积的肠营养时产生的。在这类情形中，大部分营养在最初可以通过肠道外进食的方式提供。在这些情形中，极小量的肠营养是可以接受的，这对于供应尽可能多的谷氨酰胺等价物是有好处的。因此，可以使用极高浓度的N-乙酰基-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐。在另一应用中，为了支撑脏器功能，可以给标准婴儿配方食品补充N-乙酰基-谷氨酰胺或其营养上可接受盐，在这种情形中可以使用实质上较低的浓度。对于其中谷氨酰胺是有利的任何状况，都可以使用N-乙酰基-L-谷氨酰胺。这类状况至少包括：促进从胃肠道手术、胃肠道切除术、小肠移植恢复、以及其它术后的创伤中恢复、饥饿、急性疾病和损伤例如多发性外伤、短肠综合症、烧伤、骨髓移植、AIDS、口腔溃疡、腹腔疾病、克罗恩氏病、坏死性小肠结肠炎、脏器早熟，以及预防或降低随机感染例如脓血症的严重程度。谷氨酰胺补充还有助于预防与某些特定治疗(例如化学疗法或放射疗法)相关的脏器退化或者在某些口服进食受严重限制的情形中(例如极度早熟)也有用。另外还包括上面所述状况的组合。
本发明的N-乙酰基-L-谷氨酰胺可以使用任意适合于人体消耗的液体溶液给药。例如，可以简单地将N-乙酰基-L-谷氨酰胺溶解于水中。如果需要的话，可以将其掺入经过调味的饮料中以改善其可口性。例如，可以将其掺入Kool-Aid、或苏打水例如百事或可乐中。在优选的实施方案中，可以将N-乙酰基-L-谷氨酰胺掺入运动饮料例如Gator-Aid中。
然而，N-乙酰基-L-谷氨酰胺通常可以通过口服的再水化溶液(ORS)或者液体营养配方食品进行给药。掺入含水溶液例如ORS中的N-乙酰基-L-谷氨酰胺用量可以随意变化。通常ORS可以含有至少大约5.0mmole的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐/升溶液，另外还含有少量的水、葡萄糖和钠。更优选的是，ORS可以含有大约20至大约300mmole/升的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐，更优选为大约25至大约200mmole。如果使用液体例如Kool-Aid或Gator-Aid的话，则N-乙酰基-L-谷氨酰胺的用量应该与针对ORS所描述的用量相当。
口服的再水化溶液是本领域众所周知的。用于本发明中的ORS通常应该含有FDA对于在美国销售的口服的再水化制剂所要求的符合其浓度的所有电解液。除了钠(Na+)、钾(K+)、氯(Cl-)和柠檬酸离子之外，该口服的再水化溶液还含有碳水化合物源，例如葡萄糖、果糖和右旋糖。典型的是，该ORS含有水、糖类、钠离子、钾离子、氯离子、和柠檬酸离子。
如本领域技术人员已知的那样，在ORS中使用的钠离子量可以随意变化。通常，ORS应该含有大约30mEq/L至大约95mEq/L的钠。在优选的实施方案中，钠含量可以为大约30mEq/L至大约70mEq/L，更优选为大约40mEq/L至大约60mEq/L。适宜的钠源包括但并不仅仅限于氯化钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、及其混合物。本文所使用的一毫当量(mEq)是指溶液中的离子数目，其通过在给定体积中的离子浓度来测量。测量值以毫当量/升(mEq/L)的数目表示。通过将mEq乘以无机离子的原子量然后用该数值除以无机离子的化合物，可以将毫当量转化为毫克。
ORS还应该含有钾离子来源。钾的用量可以随意变化。然后，作为一个总的原则，ORS通常应该含有大约10mEq/L至大约30mEq/L的钾。在优选的实施方案中，它们含有大约15mEq/L至大约25mEq/L的钾。适宜的钾源包括但并不仅仅限于柠檬酸钾、氯化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钾、及其混合物。
ORS还应该含有碳水化合物源。如上所述，所用碳水化合物的用量非常重要。其用量必须保持在小于大约3％w/w，更优选小于大约2.5％w/w。处于大约3％w/w至大约2.0％w/w之间的用量是适宜的。过量的碳水化合物会加剧与腹泻相关的液体和电解液损失。
可以使用现有技术中在口服的再水化溶液中所使用的任何碳水化合物。适宜的碳水化合物包括但并不仅仅限于简单和复杂的碳水化合物、葡萄糖、右旋糖、果糖低聚糖、果糖和葡萄糖聚合物、玉米糖浆、高果糖玉米糖浆、蔗糖、麦芽糖糊精、及其混合物。
ORS通常还应该包括用于替换腹泻损失的碱来源。通常为了获得上述结果，应该将柠檬酸盐掺入口服的再水化溶液中。柠檬酸盐被代谢成当量的碳酸氢盐，它有助于保持酸碱平衡。尽管柠檬酸盐是优选的碱来源，但是也可以使用通常被掺入再水化溶液中的任意碱。
如本领域技术人员已知的那样，柠檬酸盐的用量可以不同。通常，柠檬酸盐为大约10mEq/L至大约40mEq/L，更优选为大约20mEq/L至大约40mEq/L，最优选为大约25mEq/L至大约35mEq/L。适宜的柠檬酸盐来源包括但并不仅仅限于柠檬酸钾、柠檬酸钠、柠檬酸及其混合物。
ORS通常还应该含有氯化物来源。如本领域技术人员已知的那样，氯化物的用量可以不同。通常，ORS应该含有用量为大约30mEq/L至大约80mEq/L的氯化物，更优选为大约30mEq/L至大约75mEq/L，最优选为大约30mEq/L至大约70mEq/L。适宜的氯化物来源包括但并不仅仅限于氯化钠、氯化钾及其混合物。
任选地，可以将不易消化的寡糖合掺ORS中。不易消化的寡糖可以给胃肠道中的微生物菌群带来有益影响。它们有助于抑制致病性有机体例如艰难梭菌的生长。这些寡糖选择性地促进了非致病性微生物菌群的生长。这类口服的再水化溶液已经描述在登记于1995年4月5日的美国专利5,733,759中，再次将其内容引入作为参考。通常，寡糖应该是果糖低聚糖、菊粉例如raftilose、或木糖寡糖。其用量可以随意变化，可以为1-100克/升含水溶液，更优选为3-30克/升含水溶液。
ORS通常还应该包括用于改善其可口性的调味剂，尤其是对儿科患者而言。调味剂可以掩盖该含水溶液的咸味。可使用的调味剂包括但并不仅仅限于桃、黄油桃、越橘、香蕉、樱桃、桔、葡萄、果汁、泡泡糖、苹果、悬钩子和草莓。可以加入人造甜味剂以补充味道和掩盖咸味。可使用的人造甜味剂包括糖精、营养甜、糖精苷、acesulfane-K(ace-K)等。
为了有助于延长贮存期，可以加入防腐剂。本领域专业人员能够选择适当用量的适宜防腐剂以实现上述目的。典型的防腐剂包括但并不仅仅限于山梨酸钾和苯甲酸钠。
除了上述碳水化合物之外，ORS还可以含有米粉，或者有利于腹泻治疗的米中的其它成分。现有文献中已经描述了很多种补充有米的口服的再水化溶液。使用这类补充有米的口服的再水化溶液的方法是本领域技术人员所众所周知的。这类补充有米的口服复水溶液的实例包括描述在公布于1996年2月6日的美国专利号5,489,440中的溶液。
ORS可以采用本领域技术人员所众所周知的技术制备得到。作为一个总的原则，可以将所有的组分干燥混合在一起；搅拌分散于水中；然后任选地加热至适当的温度以溶解所有的组分。然后将该ORS进行封装灭菌至本领域已知的食品级标准。
如本领域技术人员已知的那样，ORS可以以不同的剂型给药，这取决于患者的偏好。例如，如果冰冻的话例如以冰棒的形式，可能某些儿童更容易进食这种口服的再水化溶液。口服的再水化溶液冰棒详细描述在美国专利号5,869,459中。为了改善患者尤其是儿科患者的顺从性，还可以将口服的再水化溶液制成凝胶的形式。凝胶体的再水化组合物描述在登记于1999年8月4日的美国专利申请序列号09/368,388中。这种凝胶还描述在PCT申请号99/15862中。总的来说，可以将含水溶液制成可流动凝胶的形式。或者，也可以将其制成能自己支撑的凝胶结构。通过将适宜的胶凝剂掺入该含水溶液中，可以实现上述目的。
用于该含水溶液中的适宜胶凝剂包括但并不仅仅限于琼脂、褐藻酸和盐、涂胶、阿拉伯树胶、塔哈胶、纤维素衍生物、凝胶多糖、发酵树胶、帚叉藻聚糖胶、明胶、结冷胶、印度胶、瓜耳树胶、阿欧塔角叉菜胶、爱尔苔藓、卡帕角叉菜胶、魔芋粉、刺梧桐树胶、莱姆达角叉菜胶、松胶/阿拉伯半乳聚糖、刺槐豆胶、果胶、罗望子胶、塔拉豆胶、黄蓍胶、天然和改性淀粉、黄原胶及其混合物。所述胶凝剂的使用比例为大约0.05至大约50重量/重量％。
如上所述，N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐可以通过液体营养产品的形式给药。掺入液体营养配方食品中的N-乙酰基-谷氨酰胺可以随意变化，但应符合上述的剂量指南。用于液体营养配方食品中的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐的用量应当取决于各种因素，包括该制剂是否提供了大部分或主要的营养源、该制剂是否含有其它的谷氨酰胺来源、每天消耗的配方食品的量、以及打算施用该制剂的患者类型(其对每天消耗的制剂量也有影响)。当与包含在其它蛋白质组分中的谷氨酰胺进行合并时，为了获得至少140mg的总谷氨酰胺/kg体重/天，这种配方食品优选含有足够量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐。N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐的用量还可以表示为提供蛋白质热量的百分数形式。根据这种表达方式，营养配方食品可以含有大约1至大约100％的蛋白质热量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐。该百分数是根据N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐的蛋白质部分(也就是谷氨酰胺部分)计算得到的，没有考虑任何由N-乙酰基-谷氨酰胺或其营养上可接受盐中的非蛋白质部分(也就是乙酸酯或盐部分)贡献的热量在内。优选地，对于成人用营养配方食品，可以含有足以提供大约10至大约95％的蛋白质热量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐。如果该营养配方食品打算用于未成年人的话，那么N-乙酰基-L-谷氨酰胺应当以足以提供大约1至大约12％的蛋白质热量的用量存在。
液体营养配方食品包括肠制剂、口服配方食品、成人用配方食品、儿科患者用配方食品和婴儿用配方食品。例如，肠配方食品和营养配方食品是急性保健院和长期保健场所(即疗养院)中患者保健的重要部分。尽管补充这些配方食品通常是用于改善营养未达标的状态，但是它们也可以作为常人长期使用的唯一营养来源。因此，如果这类配方食品是为了满足预防营养不良的主要目的的话，那么它们必须含有足够量的蛋白质、脂肪、无机元素、电解液等。这些配方食品通常以液体的形式施用给患者，这是因为绝大部分目标患者不能进食固体食物。尽管有些患者能够饮服制剂，但是也有很多患者通过鼻吸管(NG管或者进食管)服用肠制剂。
液体营养配方食品含有提供占该配方食品总含热量的14-35％的蛋白质组分、提供占总含热量的36-76％的碳水化合物组分、以及提供占总含热量的6-51％的脂质组分。液体营养配方食品可以是成人配方食品、小儿科配方食品或婴儿配方食品(正如该含水溶液可以向成人、儿科患者或婴儿施用那样)。对于高谷氨酰胺应用，优选液体营养配方食品可以提供营养的至少大部分来源。当然，本文所述的液体营养配方食品也可以不是用作营养的至少大部分来源，特别是在那些大部分非肠道配方食品并非实践标准的情形中(在相当多的早熟婴儿中，它们在脱离子宫的最早数周内慢慢脱奶以口服进食)。术语营养的至少大部分来源是指打算进食的配方食品以足以提供服用该配方食品的患者所需的总热量和营养的至少一半的量进食。落入该定义内的是作为营养唯一来源的配方食品及其进食方法，通过这样提供了服用该配方食品的患者所需的全部总热量和营养。所需热量和营养的量可以随患者的不同而不同，这取决于各种变量例如年龄、体重、和身体情况。维持适当量的热量和营养所需的营养配方食品的用量可以由本领域普通技术人员确定，正如要向这类配方食品中掺入适当量的热量和营养那样。举例来说，如果该配方食品为成人用配方食品，其蛋白质组分可以含有所述液体营养配方食品的总含热量的大约14至大约35％；碳水化合物组分可以含有所述液体营养配方食品的总含热量的大约36至大约76％；脂质组分可以含有所述液体营养配方食品的总含热量的大约6至大约41％。该营养配方食品可以是用于口服进食的配方食品或者用于肠道进食的配方食品。再举一个例子，如果该制剂为未成年人用制剂，其蛋白质组分可以含有所述液体营养配方食品的总含热量的大约8至大约25％；碳水化合物组分可以含有所述液体营养配方食品的总含热量的大约39至大约44％；脂质组分可以含有所述液体营养配方食品的总含热量的大约45至大约51％。这些范围仅仅是用于举例说明，并不意味着构成限制。
由于客观原因，这类产品应该含有足以提供总谷氨酰胺含量的大约一半或更多的用量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐。或者，也可以将N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐的有效量表达为毫摩尔/1000千卡的形式。根据这种表达方式，如果谷氨酰胺的目标用量为大约300mg谷氨酰胺每天/kg/天的话，那么对于成人而言，营养配方食品应该优选含有至少大约35毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐/1000千卡营养配方食品，对于儿童、婴儿或早熟婴儿(未成年人)而言，应该含有至少大约5.0毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐/1000千卡营养配方食品。更优选地，这类制剂对于成人而言应该含有大约35至大约160毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐/1000千卡营养配方食品，对于儿童而言应该含有大约5.0至大约32毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐/1000千卡营养配方食品，对于婴儿或早熟婴儿而言含有大约5.0至大约26毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐/1000营养配方食品。
除了N-乙酰基-谷氨酰胺之外，该营养配方食品还应该含有对本领域技术人员来说是已知的制备营养配方食品的适宜碳水化合物、脂质和蛋白质。适宜的碳水化合物包括但并不仅仅限于蜡状或非蜡状形式的来源于玉米、木薯、米或马铃薯的水解后的、完整的、天然的和/或化学改性的淀粉；碳水化合物例如葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、富含果糖的玉米糖浆、玉米糖浆干粉、以及它们的混合物。麦芽糖糊精是由淀粉(例如来自玉米或大米的淀粉)进行酸或酶水解后得到的多糖。根据水解的程度对其进行分级，以右旋糖当量(DE)表示。该营养配方食品中所用的任何麦芽糖糊精的DE优选为低于大约18-20。
适宜的脂质包括但并不仅仅限于椰子油、大豆油、玉米油、橄榄油、红花油、富油性红花油、MCT油(中链甘油三酸酯)、向日葵油、富油性向日葵油、棕榈油、棕榈油精、低芥酸菜子油、鱼油、棕榈仁油、鲱油、豆油、棉籽油、卵磷脂、花生四烯酸和二十二碳六烯酸的脂质来源、及其混合物。花生四烯酸和二十二碳六烯酸的脂质来源包括但不仅仅限于海生动植物油(Marine oil)、蛋黄油、和真菌或海藻油。很多商品来源的脂肪是本领域技术人员所已知并可很方便得到的。例如，大豆和可可油可由Archer Daniels Midlandof Decatur，Illinois得到。玉米、椰子、棕榈和棕榈仁油可由Portland，Organ的Premier Edible Oils Corporation得到。分馏后的椰子油可由LaGrange，Illinois的Henkel Corporation得到。富油性红花油和富油性向日葵油可由Eastlake，Ohio的SVO Specialty Products得到。海生动植物油可由日本东京的Mochida International得到。橄榄油可由美国的Oils of North Humberside得到。向日葵和棉籽油可由明尼阿波利斯的Cargil得到。红花油可由加利福尼亚的Richmond的California Oils Corporation得到。
除了这些食品级的油类之外，如果需要的话还可以掺入结构脂质。结构脂质是本领域已知的。有关结构脂质的简要描述可参见INFORM，Vol..8，no.10，page 1004，标题为Structured lipids allow fattailoring(1997年10月)。另外还可参见美国专利号4,871,768。结构脂质优选在相同的甘油分子上含有中链和长链脂肪酸混合物的三酰基甘油。结构脂质及其在肠制剂中的用途还描述在美国专利号6,194,37和6,160,007中。
适宜的蛋白质来源包括但并不仅仅限于奶、乳清和乳馏分、大豆、大米、肉类(例如牛肉)、动植物(例如豌豆、马铃薯)、鸡蛋(鸡蛋白)、明胶和鱼。适宜的天然蛋白质来源包括但并不仅仅限于大豆基质、奶基质、酪蛋白、乳清蛋白、米蛋白质、牛肉胶原质、豌豆蛋白、马铃薯蛋白、及其混合物。适宜的蛋白质水解产物包括但并不仅仅限于大豆蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物、  米蛋白质水解产物、马铃薯蛋白水解产物、鱼蛋白水解产物、鸡蛋白水解产物、明胶蛋白水解产物、动植物蛋白水解产物的组合、以及它们的混合物。水解后的蛋白质(蛋白质水解产物)是指已经水解或者断裂成更短的肽碎片和氨基酸的蛋白质。这类水解肽碎片和游离氨基酸更容易消化。在广义上说，当一个或多个酰胺键断裂后蛋白质就已经被水解。酰胺键的断裂可以例如由于加热或剪切而有意或无意地发生在制造过程中。出于公开的目的，水解的蛋白质是指已经经过按照断裂酰胺键的方式进行加工或者处理过的蛋白质。可以有目的地进行水解，例如通过用酶或酸处理天然蛋白质。本文所述的优选用于该液体营养配方食品中的水解蛋白质为水解至下述程度的蛋白质，其中氨基氮(AN)与总氮的比值为大约0.1 AN比大约1.0 TN至大约0.4 AN比大约1.0 TN，优选为大约0.25 AN比大约1.0 TN至大约0.4 AN比大约1.0 TN。(AN∶TN比值是指单独的蛋白质水解产物，不表示最终营养配方食品中的AN∶TN比值)。
蛋白质还可以以游离氨基酸的形式提供。为了获得在营养上更完全和平衡的配方食品，可以给营养配方食品补充各种氨基酸。适宜的游离氨基酸的实例包括但并不仅仅限于通常被认为是蛋白质体系中的一部分的所有游离的L-氨基酸，但是尤其包括那些从营养学角度考虑被认为是必需或者在一定条件下为必需氨基酸的氨基酸，也就是：色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、以及组氨酸。通常向营养产物中加入的其它(非蛋白质)氨基酸包括肉毒碱和氨基乙磺酸。在某些情形中，氨基酸的D-形式被认为与L-形式在营养学上是相当的，为了降低成本可以使用异构体混合物(例如D、L-蛋氨酸)。
该营养配方食品优选还含有用量足以维持服用该配方食品的患者日常营养需要的维生素和无机元素。本领域技术人员认为，营养配方食品通常需要强化某些维生素和无机元素以保证它们在产品贮存期间能够满足日常的营养需要。本领域技术人员还认为，考虑到一些潜在的疾病或者患者所患的疾病，某些微量组分对于人群也具有潜在的好处。例如，例如铬、肉毒碱、牛磺酸、和维生素E对于糖尿病患者有益。配方食品优选包括但并不仅仅限于下面的维生素和无机元素：钙、磷、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘、铬、钼、肌醇、肉毒碱、牛磺酸、维生素A、C、D、E、K和B络合物、以及它们的混合物。
如果该营养配方食品打算用于婴儿的话，那么具体的营养指南可参见Infant Formula Act，21 U.S.C.section 350(a)。在该法令中的营养指南随着有关营养要求的进一步研究被完成而不断进行修订。权利要求中所请求保护的营养配方食品意味着包括含有那些并未在此列出的维生素和无机元素的配方食品在内。
该液体营养配方食品还可以含有纤维和稳定剂。适宜的纤维和/或稳定剂来源包括但并不仅仅限于黄原胶、瓜耳树胶、阿拉伯树胶、刺梧桐树胶、黄蓍胶、琼脂、帚叉藻聚糖胶、结冷胶、刺槐豆胶、果胶、甲氧基含量高和低的果胶、燕麦葡聚糖、角叉菜胶、psyllium、明胶、微晶纤维素、CMC(羧甲基纤维素钠)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、DATEM(甘油单酯和甘油二酯的二乙酰基酒石酸酯)、右旋糖苷、角叉菜胶、FOS(果糖低聚糖)、以及它们的混合物。很多商品来源的可溶性可食用纤维是可得到的。例如阿拉伯树胶、水解羧甲基纤维素、瓜尔树胶、果胶和甲氧基含量高和低的果胶可由马里兰Belcamp的TIC Gums，Inc.得到。燕麦葡聚糖可由内布拉斯加州奥马哈的Mountain Lake Specialty Ingredients，Inc.得到。Psyllium可由新泽西North Bergen的Meer Corporation得到，而角叉菜胶可由宾夕法尼亚州费城的FMC Corporation得到。
掺入的纤维还可以是可溶性的可食用纤维，其代表性实例包括燕麦果实纤维、豌豆纤维、大豆纤维、大豆子叶纤维、糖用甜菜纤维、纤维素和玉米麸。可溶性的可食用纤维的很多来源也是可得到的。例如。玉米麸可由伊利诺斯州芝加哥的Quaker Oats得到；燕麦果实纤维可由明尼苏达州剑桥的Canadian Harvest得到；豌豆纤维可由加拿大温尼伯湖的Woodstone Foods得到；大豆纤维可由马里兰LaVale的Fibrad Group得到；大豆子叶纤维可由密苏里州St.Louis的Protein Technologies International得到；糖用甜菜纤维可由明尼苏达州明尼阿波利斯的Delta Fiber Foods得到；纤维素可由新泽西Saddle Brook的James River Corp.得到。
关于纤维以及将其掺入配方食品中的实例的详细讨论可以参见Garleb等人的美国专利号5,085,883。
用于该配方食品中的纤维用量可以不同。所使用的具体类型的纤维并不重要。可以使用任何的适合人体消耗的且在营养配方食品基质中保持稳定的纤维。
除了纤维之外，该营养配方食品还可以含有低聚糖例如果糖低聚糖(FOS)或葡萄糖低聚糖(GOS)。将低聚糖进行快速和充分的发酵以通过抑制大肠的厌氧性微生物缩短脂肪酸链。这些低聚糖是大多数双歧杆菌类的优选能量来源，但是并未被致病性生物体例如产气荚膜梭菌、艰难酸菌、或者E.coli.所利用。
该液体营养配方食品还可以含有芳香剂以改善其可口性。可使用的芳香剂包括但并不仅仅限于巧克力、香草、咖啡、桃、黄油桃、越橘、香蕉、樱桃、桔、葡萄、果汁、泡泡糖、苹果、悬钩子和草莓。可以加入人造甜味剂以补充芳香和掩盖咸味。可使用的人造甜味剂包括糖精、营养甜、糖精苷、acesulfane-K(ace-K)等。
液体营养配方食品可以采用本领域技术人员众所周知的方法制备。已知很多种不同的制备方法。通常，这些方法包括由一种或多种含有水的溶液与一种或多种碳水化合物、蛋白质、脂质、维生素和无机元素形成浆状物。将该浆状物进行乳化、匀化并冷却。在处理之前、之后或者在这两个时间段都可以向该浆状物中加入各种其它的溶液。然后将处理后的配方食品灭菌，可以进一步稀释供现成进食用或者以浓缩的液体形式储存。如果所得到的配方食品打算制成供现成进食用或者浓缩的液体的话，可以在灭菌之前加入适宜量的水。
本发明还涉及一种减轻患有腹腔疾病的患者的肠内粘膜炎症的方法，它通过施用被掺入上述含水溶液和液体营养配方食品中的NAQ。在实施例5中，发明者利用TUNEL标记物监测上皮凋亡现象、利用CD25监测上皮下炎症、他们发现了诱导一种或者两种标记物的化合物/产品，认为这些化合物/产品对腹腔疾病患者的粘膜具有毒性。然而，N-乙酰基-谷氨酰胺对于未经治疗的腹腔疾病患者的活组织切片具有明显的营养效果。通过对特别是上皮细胞中的粘膜的改善情况来定义这种营养作用，相对于其它样本而言上皮细胞中的粘膜得到显著改善。N-乙酰基-谷氨酰胺的这种出人意料的营养活性使得粘膜的整体情况相对于甚至阴性对照(只有介质)而言均有所改善。
实施例
制备液体营养配方食品的方法
通过下面的步骤可以制备得到落入本发明权利要求书范围内的液体营养配方食品。例举这些实施例仅仅是用于解释说明，而不应该被理解为限制。只要不偏离本发明的范围，其它的碳水化合物、脂质、蛋白质、稳定剂、维生素和无机元素也是可以使用的。
实施例1
制备含有N-乙酰基-L-谷氨酰胺的液体营养配方食品的方法
使用表1所列出的原料制备得到含有N-乙酰基-L-谷氨酰胺的供现成进食的液体产品。用于制备该产品的步骤如下所述。
表1：用于加香草产品的原料单
组分名称 用量(/1000kg)
水 至全量
麦芽糖糊精 77.88kg
蔗糖 52.80kg
大豆蛋白水解产物 30.11kg
鱼油/中链结构脂质 16.14kg
酪蛋白酸钠 14.74kg
果糖低聚糖 5.792kg
低芥酸菜子油 4.482kg
大豆油 4.482kg
45％氢氧化钾 3.653kg
磷酸三钙 2.866kg
N-乙酰基-L-谷氨酰胺 10.03kg
L-精氨酸 2.425kg
柠檬酸钠 2.293kg
人造Carmel 1.500kg
N&A香草料 1.000kg
乳化剂 1.076kg
磷酸镁 0.948kg
氯化镁 0.860kg
柠檬酸钾 0.838kg
抗坏血酸 0.697kg
维生素B氯化物 0.474kg
结冷胶 0.250kg
维生素D、E、K预混物<sup>1</sup> 0.203kg
牛磺酸 0.139kg
肉毒碱 0.130kg
维生素E(R，R，R) 0.123kg
微量无机元素预混物<sup>2</sup> 0.101kg
水溶性微生物预混物<sup>3</sup> 0.0882kg
30％β胡萝卜素 15.5克
维生素A(55％) 5.07克
碘化钾 0.194克
亚硒酸钠 0.132克
维生素K 0.0617克
1.维生素D、E、K预混物包括在椰子油(146.77克)载体中的维生素D3(0.0980克)、d-α-生育酚基乙酸酯(55.93克)、和维生素K1(0.0338克)。
2.微量无机元素预混物(每1000kg终产品)输送硫酸锌(46.3克)、硫酸铁(39.2克)、硫酸镁(11.4克)、硫酸铜(3.89克)。
3.水溶性维生素预混物包括在右旋糖(17.29克)载体中的烟酰胺(33.07克)、d-泛酸钙(21.43克)、叶酸(0.742克)、硫胺氯化物HCL(5.47克)、核黄素(4.27克)、pyroxidine HCL(5.26克)、维生素B12(0.0147克)和维生素H(0.644克)。
步骤：通过制备三种混合在一起的预混物，然后与海产动植物油/MCT结构脂质混合，加热处理，定型，封装并灭菌制备得到上述的液体营养产品。下面详细描述其制备方法。
通过首先将适宜量的水搅拌加热至大约65℃至大约71℃的温度，制备得到碳水化合物/无机元素的浆状物。然后在剧烈搅拌下加入定单中所需量的无机元素：柠檬酸钠、微量无机元素预混物、柠檬酸钾、氯化镁、磷酸三钙和碘化钾。接下来，在剧烈搅拌下向该浆状物中加入所需量的麦芽糖糊精(Maltring M-100，由Grain ProcessingCorporation of Muscatine，Iowa提供)，在温度保持大约71℃的同时使其溶解。然后在剧烈搅拌下加入所需量的蔗糖和果糖低聚糖(Nutriflora-PS果糖低浆糖粉末，由Golden Technologies Companyof Golden，Colorado提供)。随后将所需量的结冷胶(KelcogelW，由Kelco，Division of Merck和Company Incorporated of San Diego，California提供)与蔗糖按照1∶5(结冷胶/蔗糖比例)进行干混，在剧烈搅拌下加入至浆状物中。接下来，在搅拌下将已经溶解于温水中的亚硒酸钠加入至浆状物中。所得到的碳水化合物/无机元素浆状物在温度为大约65℃至大约71℃下保持剧烈搅拌不超过气小时，直其与其它浆状物进行混合。
通过将所需量的大豆油和低芥酸菜子油在温度为大约55℃至大约65℃下剧烈搅拌进行混合得到油混物。然后在剧烈搅拌下加入所需量的乳化剂、单二甘油酸酯的二乙酰基酒石酸酯(Panodan，由GrindstedProducts Incorporated of New Century，Kansas提供)，使其溶解。然后搅拌加入维生素D、E、K预混物、55％维生素A棕榈酸酯、D-α-a-生育酚基乙酸酯(R、R、R形式)、维生素K和30％ β-胡萝卜素。所得到的油混物在温度为大约55℃至大约65℃下温和搅拌不超过12小时，直其与其它浆状物进行混合。
通过首先将适宜量的水搅拌加热至大约65℃至大约71℃的温度，制备得到蛋白质在水中的浆状物。搅拌加入大豆蛋白水解产物(由MDFoods of Viby J.，Denmark提供)。搅拌加入所需量的N-乙酰基-L-谷氨酰胺(来自Ajinomoto)。加入氢氧化钾溶液(45％)提高pH至大约5.6。慢慢搅拌加入L-精氨酸，溶液搅拌至澄清(pH＞6.2)。然后再浆状物中混合入所需量的部分水解的酪蛋白酸钠(Alanate 167，由NewZealand Milk Products Incorporated of Santa Rosa，California提供)。所得到的油混物在温度为大约60℃至大约71℃下温和搅拌不超过2小时，直到与其它浆状物进行混合。
将在水中的蛋白质浆状物与油混物搅拌混合，所得到的混合浆状物保持在大约55℃至大约65℃的温度下。放置至少一小时后，搅拌加入碳水化合物/无机元素浆状物，所得到的混合浆状物保持在大约55℃至大约65℃的温度下。然后将海生动植物油/MCT结构脂质搅拌加入至该混合的浆状物中。理想的是，将海生动植物油/MCT结构脂质按照恒定速率通过导管作为混合物形式计量加入产物中。放置不少于一分钟不多于两小时之后，将该混合浆状物按照本领域已知的方法脱氧，紫外线高温处理，匀化。然后冷却至大约1℃至大约7℃的温度，在大约1℃至大约7℃的温度下搅拌储存。优选地，在完成上述步骤之后，进行适当的分析测试以控制质量。基于该质量控制的分析结果，向样本中搅拌加入适量的水达到最终的稀释度(标定)。
通过将少量水搅拌加热至大约43℃至大约66℃的温度，然后搅拌加入下述组分：抗坏血酸、45％氢氧化钾、牛磺酸、水溶性维生素预混物、维生素B氯化物、和L-camitine，制备得到维生素溶液。然后向上述混合浆状物中搅拌加入该维生素浆状物。
通过向适宜量的水中搅拌加入天然和人造的香草料以及人造焦糖料制备得到芳香剂溶液。然后向上述混合浆状物中搅拌加入该芳香剂浆状物。
可以调节产物的pH以获得最佳的产物稳定性。然后将所得到的产品置于适宜的容器中(在该情形中使用8oz.金属罐)接受最后的灭菌(在该情形中使用蒸馏灭菌)。
实施例2
含水N-乙酰基-L-谷氨酰胺的稳定性研究
进行下述研究以评价含水N-乙酰基-谷氨酰胺经加热后在不同pH值下以及在类似于液体营养类型产品所使用的基质中的稳定性。
含水N-乙酰基-L-谷氨酰胺和谷氨酰胺的热稳定性
为了测试含水N-乙酰基-谷氨酰胺在加热后的稳定性，进行下述步骤。不调节pH，制备得到N-乙酰基-L-谷氨酰胺(来自Sigma，目录号A-9125)和谷氨酰胺(来自Aldrich，目录号G-320-2)的大约1mg/mL(分别为5.3mM和6.8mM)的含水溶液。所得到的N-乙酰基-L-谷氨酰胺溶液的pH为2.9，谷氨酰胺溶液的pH为6.0。溶液在100℃下使用具有密封的4mL导管的Reacti-ThermTM搅拌加热块进行加热，每个导管对应一个时间点：15分钟、30分钟、1小时和2小时。样本从加热块移走后立即置于冰水中直到冷却。每份样本的适量部分通过0.45微米过滤器(MilliporeMillex)-HV，25mm)过滤进行HPLC测定。
使用
Figure C0282997600311
C8,5微米，4.6×250mm柱(来自KeystoneScientific，Inc.，Bellefonte，PA)进行HPLC分析。移动相为水，用HC1调节pH为2.2(等时1mL/分钟)。注射体积为10微升。在214nm处进行紫外线检测。
结果如表2所示。谷氨酰胺在2小时的100℃下孵育过程中不稳定。煮沸该pH为6.0的谷氨酰胺溶液1小时之后，主要的降解产物是焦谷氨酸。煮沸该谷氨酰胺溶液2小时之后，焦谷氨酸仍然是主要的降解产物，但是还检测到谷氨酸。
N-乙酰基-L-谷氨酰胺比谷氨酰胺更稳定。通过保留时间鉴定，主要的降解产物是N-乙酰基-谷氨酸；该鉴定通过质谱(MS)和核磁共振谱(NMR)确认。通过MS和NMR鉴定的第二最高峰为2，6-二氧代哌啶基乙酰胺。在N-乙酰基-L-谷氨酰胺溶液中，只在2小时的样本中检测到焦谷氨酸，而且只是具有极低的浓度，为0.2面积百分比。
表2：在100℃加热谷氨酰胺和N-乙酰基-L-谷氨酰胺的含水溶液
Figure C0282997600321
1谷氨酰胺；2谷氨酸盐；1焦谷氨酸；4N-乙酰基-L-谷氨酰胺；52，6-二氧代哌啶基乙酰胺；6N-乙酰基-L-谷氨酸。
含水N-乙酰基-L-谷氨酰胺和谷氨酰胺在不同pH值下的稳定性
为了测定N-乙酰基-L-谷氨酰胺的水溶液在不同pH值下的稳定性，进行下述步骤。制备得到pH为2.0-8.0且逐渐递增1个pH单位的N-乙酰基-L-谷氨酰胺水溶液。视需要，在最终的稀释之前，使用盐酸或者氢氧化钠调节溶液的pH(最终浓度＝1mg/mL或者5.3mM N-乙酰基-L-谷氨酰胺)。唯一一份谷氨酰胺溶液不调节pH(所测得的pH＝6.0)，制成含有1mg/mL或者6.8mM的谷氨酰胺。所有溶液经过滤灭菌(Millipore
Figure C0282997600322
-GS，25mm，0.22微米孔径，无菌)进入自动取样器中，在室温下(17-25℃)储存。N-乙酰基-L-谷氨酰胺样本通过HPLC在1-180天的不同时间点上进行测量。谷氨酰胺样本通过HPLC在类似的1-45天的时间点上进行测量。
发现N-乙酰基-L-谷氨酰胺的稳定性取决于pH。结果汇总在图1和2中。在所有的pH值下，N-乙酰基-L-谷氨酰胺在7天内未显示出降解现象。在pH5.0-8.0下，N-乙酰基-L-谷氨酰胺在六个月内稳定，超过99.6％的N-乙酰基-L-谷氨酰胺保持不变。始终检测到的降解产物是N-乙酰基-谷氨酸，其在六个月内低于0.5％。在pH4.0下，经过六个月放置，均检测到N-乙酰基-谷氨酸和2，6-二氧哌啶基乙酰胺，残留有97.9％的N-乙酰基-L-谷氨酰胺。在pH3.0下，N-乙酰基-L-谷氨酰胺经过90天放置，在第4个月降至94.2％，在第6个月降至90.4％。在pH3.0的样本中，检测到N-乙酰基-谷氨酸和2，6-二氧哌啶基乙酰胺具有大致相当的浓度，开始在第15天为大约0.15％，在第30天升至大约1％，在第6个月升至大约5％。在第6个月，检测到焦谷氨酸为0.5％。在pH为2.0时，N-乙酰基-L-谷氨酰胺在第15天为97.0％，在第6个月仅升至55.7％。N-乙酰基-谷氨酸是pH为2.0的样本中的主要降解产物，在第15天为2.5％，在第6个月为37.2％，2，6-二氧哌啶基乙酰胺由第15天的0 5％升至第6个月的4.9％。pH为2.0时的N-乙酰基-L-谷氨酰胺样本是唯一的显示出焦谷氨酸增加的样本：在第30天为0.2％，在第6个月升至2.2％。
在谷氨酰胺溶液(pH6.0)中，发现该样本在室温下放置3天后焦谷氨酸为0.2％。45天后，发现其为3.3％，谷氨酰胺为96.7％。HPLC分析结果以高度百分比表示记录在表3中。
表3：谷氨酰胺在室温下pH为6.0、浓度为1mg/mL的水溶液中的稳定性
分析物 2天 3天 7天 15天 30天 45天
GLN<sup>1</sup> 100.0 99.8 99.5 99.0 98.1 96.7
PGA<sup>2</sup> 0.2 0.5 1.0 1.9 3.3
1谷氨酰胺；2焦谷氨酸。
N-乙酰基-L-谷氨酰胺和谷氨酰胺在液体营养类型产品中的稳定性
为了测定N-乙酰基-L-谷氨酰胺在类似于液体营养类型产品所用基质中的稳定性，进行下述步骤。制备得到三种分析产品，一种含有N-乙酰基-L-谷氨酰胺(N-乙酰基-L-谷氨酰胺来自Ajinomoto)，一种含有谷氨酰胺(来自Ajinomoto)(理论浓度分别为16.5mg/mL和12.8mg/mL，以重量为单位替代部分蛋白质)、和对照组(
Figure C0282997600331
Ross Products Division，Abbott Laboratories)。根据实施例1所述的步骤制备得到含有N-乙酰基-L-谷氨酰胺的产品。根据与其相类似的方法制备得到含有谷氨酰胺的产品，除了用谷氨酰胺(7.79kg)替代N-乙酰基-L-谷氨酰胺之外。在蒸馏灭菌之前和之后测量它们的降解产物，蒸馏灭菌是液体营养配方食品常用的处理方法(本文使用在128℃下持续5分钟)。产品在室温下(20-22℃)储存，测量在第1、2和3个月时的降解产物。将谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺和焦谷氨酸(如果存在的话)在各方法和时间点上进行量化。
为了通过HPLC分析谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺和焦谷氨酸，将样本按照下述方法进行过滤。将5.0mL样本转移至50mL容量瓶中。加入20滴1M盐酸，用去离子水将样本稀释至一定体积。样本通过0.45微米过滤器(Millipore，Millexg-HV，25mm)过滤。样本按照上述方法进行HPLC分析(热稳定性部分)。
通过下述方法测定存在于该蛋白制剂中焦谷氨酸总量，包括游离焦谷氨酸和N-末端焦谷氨酸。首先，将样本制成水溶液形式，浓度为大约18g总蛋白质/L。20毫升的所制备得到的样本原料置于1.5mL螺帽小瓶中，加入980毫升新鲜酶溶液(0.05 M Tris、0.005 M二硫代苏糖醇、0.001 M乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，pH8.0，含有11单元的果糖葡萄糖氨基肽酶/mL)。小瓶紧紧密封，在室温下(21-24℃)孵育24小时。然后溶液按照下面详述的方法通过C-18 SPE药筒加工。为了测量游离的焦谷氨酸，将该最初的样本溶液稀释至总蛋白质含量在去离子水中为2-3g/L，然后通过C-18 SPE药筒加工。
C-18 SPE(固相萃取)药筒(100mg/1mL大小)来自Burdick&Jackson，Muskegon，MI。用2×5体积的甲醇制备得到SPE药筒供使用，然后用2×5体积的去离子水清洗。慢慢加入1mL样本，将通过的材料收集在1克螺帽小瓶中。通过加入2×500毫升去离子水，手机通过相同小瓶中的体积完成洗提。混合洗出液，然后一部分样本在HPLC分析之前通过0.45毫米过滤器(25mm，0.45毫米过滤器，来自Gelman，Ann Arbor，MI)过滤。所用HPLC系统具有下述参数：泵处理器G1312A，自动进样处理器G1313A，温度调节装置柱室处理器G1316A，二极管阵列检测器处理器G1315A，峰综合器/数据加工处理器G2170AA，均来自Agilent Technologies，Palo Alto，CA.柱子：6.5×150mm ION-310,8毫米，来自Interaction Chromatography，San Jose，CA。使用之前，系统预先在流动相(5mN H2SO4)中、40℃下、0.3mL/min平衡。
为了进行分析，注入10毫升样本或者标准品，柱子用0.3mL/min的移动相在40℃下洗脱。通过UV吸收在210nm和220nm处检测洗脱材料。流动时间为45分钟。
通过与标准品对照确定未知的样本浓度。三种焦谷氨酸的水溶液通常足以用作标准品，即10、20、和40mg/L(焦谷氨酸来自Fluka，Milwaukee，WI)。
N-乙酰基-L-谷氨酰胺在营养类型产品中在灭菌期间或者室温储存3个月以后没有显示出降解产物。结果汇总在表4中。在所有时间点上都检测到对应于N-乙酰基-谷氨酸的小峰，但是始终保持大约相同的浓度，这表明对于N-乙酰基-谷氨酸而言不存在可测出的降解产物。
在谷氨酰胺补充产品中，经过灭菌步骤，谷氨酰胺降低至最初浓度的1/3；在2个月后检测到没有谷氨酰胺。在该产品种，检测到焦谷氨酸的浓度与谷氨酰胺的完全转化相一致。
表4：对比液体营养配方食品中的N-乙酰基-L-谷氨酰胺和谷氨酰胺在加工过程和室温下储存3个月之后的稳定性。
*根据谷氨酰胺标准品的响应因子计算。在试验后期没有获得合适的标准品。
**根据焦谷氨酸标准品的响应因子计算。
实施例3
谷氨酰胺和N-乙酰基-L-谷氨酰胺的生物利用度
进行下面的研究以N-乙酰基-L-谷氨酰胺相对于谷氨酰胺在猪模型中的生物利用度比例。肠袢模型使用了离体肠的一部分以评价N-乙酰基-L-谷氨酰胺和谷氨酰胺的吸收和机理。该进食模型评价了在与往常一样进食之后对N-乙酰基-L-谷氨酰胺和谷氨酰胺的吸收情况。
肠环模型
在4天内使22只称重为15-20kg的驯养猪适应试验条件。随意给猪进食满足适合这些动物营养需求(Nutrient Requirements ofSwine，第9版，1998，Subcommittee on Swine Nutrition，NationalResearch Council)的标准猪食和水。随机将这些动物分成C组[6只猪，服用葡萄糖盐水溶液(Braun cat No 622647)、5％葡萄糖、0.9％NaCl]、G组[8只猪，服用相同的用8g/l Gln(Sigma cat No G-3126)加强的葡萄糖盐水溶液]、以及N组[8只猪，服用相同的用10g/l NAQ(Sigma cat No A-9125)加强的葡萄糖盐水溶液]。在手术之前，让动物绝食15小时。试验当天，给动物称重，用和penthotal麻醉。通过中腹矢状切割手术剖开麻醉后的猪。在大约1米的近空肠片段，大约1米的Treitz韧带，以50-75mL/min的速度填入125mL分析溶液。通过在第0、15、30、60、90、120、150和180分钟穿刺输注肠得到肠输注溶液样本。样本在液氮中冷冻，保持在-80℃下直到进行分析。通过在第0、15、30、60、90、120、150和180分钟穿刺门静脉在含有抗凝血剂的试管中获得门静脉血样本。样本保持在4℃下直到在1500×g下离心15分钟以分离血浆和红血细胞。血浆在-20℃冷冻直到进行分析。通过在第0、60、120和180分钟穿刺在含有抗凝血剂的试管中获颈静脉血样本。3小时后，猪死亡，从25cm输注肠片段获得粘膜样本。该部分使用冰冷的盐水溶液充分洗涤，沿长度方向摊开。通过使用玻璃刮刀刮擦肠内表面除去粘膜，然后在液氮中于-80℃下储存。
按照下面的方法对N-乙酰基-L-谷氨酰胺进行分析。对于肠输注溶液样本和血浆样本，将部分样本用0.05％全氯乙酸(PCA)的水溶液稀释1∶10(w/v)。对于粘膜样本，将0.2mg湿样本用5mL的0.05％ PCA水溶液匀化。离心(15,000×g，3分钟，环境温度)后，样本通过0.45毫米过滤器过滤，注入由2690 Separation Module、PDA监测器和LichroCart 250-4药筒(Purospher RP18e，250×4mm，5毫米)组成的HPLC色谱系统中，移动相由磷酸盐缓冲液0.1M、pH为2.7组成，流速为1mL/分钟。在210nm处检测N-乙酰基-L-谷氨酰胺的质量。
按照下面的方法对谷氨酰胺进行分析。除了样本用0.05％ PCA水溶液稀释1∶400(w/v)之外，按照上面的方法制备得到用于N-乙酰基-L-谷氨酰胺肠分析的输注溶液样本和血浆样本。样本通过0.45毫米过滤器过滤之后，20毫升混合物根据AccQ-Tag方法(Waters Corp.)衍化，用水稀释至1mL。将样本简单地用硼酸盐溶液缓冲，用20毫升反反应活性物质衍化。1分钟后，样本稀释至1mL，注入HPLC体系中，其由2690 Separation Module、荧光监测器和SupelcoSil LC-18柱(250×4mm，3毫升)组成。移动相由磷酸盐缓冲液0.1M、pH为7.5以及0.25％三乙胺和9％乙腈组成，流速为1mL/分钟。使用250nm的激发波长、在395nm监测激发，完成对谷氨酸酯和谷氨酰胺的检测和量化。
使用已经建立的耦合酶测定法对葡萄糖进行分析。简单地将样本葡萄糖用己糖激酶和ATP(三磷酸腺苷)磷酸化，所得到的葡萄糖-6-磷酸盐用葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶转化为6-膦酰基葡萄糖酸盐。在后者反应期间，NAD(烟碱腺嘌呤二核苷酸)转化为NADH(NAD的还原形式)，导致在340nm处的吸收增加，其为原样中重葡萄糖浓度的一部分。该测定法可作为临床化学试剂盒由Sigma Chemical Company，St.Louis，MO(current catalog number 16-20)购买得到。
结果
残留在肠内腔中的谷氨酰胺或N-乙酰基-L-谷氨酰胺比引入输注溶液之后的时间。残留在输注入含有等量谷氨酰胺或N-乙酰基-L-谷氨酰胺的猪肠内腔中谷氨酰胺或N-乙酰基-L-谷氨酰胺的残留百分比在最初的90分钟内非常相似。各组在120和180分钟时出现统计学上的显著差异。在t1/2(大约在45分钟时)，在谷氨酰胺或N-乙酰基-L-谷氨酰胺之间无显著性差异。图3以图表形式描述了所加入的谷氨酰胺或N-乙酰基-L-谷氨酰胺残留在肠腔中的量作为在本文所述内科手术试验中向离体猪肠环中引入该物质后的时间的函数。残留的分析物以占计时起点时的分析物的百分数表示。
图6以图表形式描述了在本文所述的内科手术试验之后所测得的猪肠空肠粘膜中的谷氨酰胺和谷氨酸盐的含量(以mcg/克湿粘膜表示)。
残留在肠内腔中的葡萄糖比引入输注溶液之后的时间。在任何时间C和G组之间均无显著性差异。除了在第15分钟之外，C和N组之间无显著性差异。G和N组从时间第120分钟后开始出现差异，尽管通过Bonferroni′s校准，其唯一差异出现在180分钟。图4以图表形式描述了所加入的葡萄糖残留在肠腔中的量作为在本文所述内科手术试验中向离体猪肠袢中引入该物质后的时间的函数。残留的葡萄糖以占计时起点时的量的百分数表示。
在向肠袢中引入测试溶液之后入口血液中的谷氨酰胺。如果将结果表达为初浓度的百分数形式，那么在对照组(C)和(G)以及C和N-乙酰基-L-谷氨酰胺(N)组之间出现差异(在90和150分钟，C对G；以及在90、120、150和180分钟，C对N)。在G和N之间不存在显著性差异。如果结构表达为绝对值的形式的话，那么除了在120分钟之外，C和N之间不存在显著性差异。一起考虑，G和N从120分钟开始至试验结束不同于C。图5以图表形式描述了袢门血液中的谷氨酰胺含量(mcg/mL)作为向肠环中引入测试溶液之后的时间的函数。
在各组袢门血液中的葡萄糖以及外周血液中的谷氨酰胺或葡萄糖方面不存在显著性差异。在试验过程中，在袢门血液或外周血液中检测到的完整N-乙酰基-L-谷氨酰胺浓度在任何时刻只是存在可忽略不计的差异(百万分之几)。
空肠粘膜中的谷氨酸(GLU)和谷氨酰胺(GLN)
在N和C组中的谷氨酸盐浓度比G组中高，同时在N和G组的粘膜中还显示出更高的谷氨酰胺，G组基本上高于N组。然而，谷氨酰胺+谷氨酸盐浓度的加和与G和N组中相似，这表明采用这两种食物向粘膜代谢系统递送谷氨酰胺碳骨架是相当的。在粘膜样本中检测不到完整的N-乙酰基-L-谷氨酰胺。图6以图表形式描述了在本文所述的内科手术试验之后所测得的猪肠空肠粘膜中的谷氨酰胺和谷氨酸盐的含量(以mcg/克湿粘膜表示)。
总而言之，N-乙酰基-L-谷氨酰胺显示出与葡萄糖相似的生物利用度，但略微低于谷氨酰胺。在吸收后的利用方面，似乎N-乙酰基-L-谷氨酰胺非常类似于谷氨酰胺。被吸收后，N-乙酰基-L-谷氨酰胺迅速通过肠内酰基转移酶水解，进入正常的谷氨酰胺代谢系统，从而在粘膜中获得与进食等量谷氨酰胺所获得到的谷氨酰胺+谷氨酸盐浓度同样高的浓度。过量的谷氨酰胺被排泄至袢门血液中，此处的谷氨酰胺浓度与进食相等剂量的谷氨酰胺后所得到的浓度相当。袢门血液中的N-乙酰基-L-谷氨酰胺浓度仅有几个ppm，这表明很少被血液完整吸收。N-乙酰基-L-谷氨酰胺的高吸收比例以及与谷氨酰胺相似的代谢机理表明，在有机体分解代谢期各种营养成分具有相同的生物学作用。
进食猪模型
由指定农场提供15只重15-20kg的猪。让这些猪在2天内适应实验室条件。随意提供标准猪食和水。适应后，将这些猪随机分成C组[5只猪，服用标准猪食加3g/kg Cr2O3，(Merck cat Nol.02483)]、G组[5只猪，服用食物C加8g/kg Gln，(Ajimoto)]、和N组[5只猪，服用食物C加10.5g/kg N-乙酰基-L-谷氨酰胺，(Flamma)]。在试验研究期间，各组中的每只动物服用1000克与其相应的食物/天，分成3份进食，随意提供水。进食试验期持续5天。
在试验当天，给动物称重，然后在上午7:00服用标准摄入量的食物(每只动物333g食物)。进食后3小时，给动物称重，服用镇静剂，通过刺破颈静脉取血。通过中腹矢状切割手术迅速将猪剖开，取出十二指肠、空肠(大约2米的Treitz片断)和回肠(30cm回盲瓣)中的内容物，在液氮中冷冻，水解，储存于-80℃下直到分析。除去肝脏和肾脏样本，切开可看得见的脂肪和连接组织，在液氮中迅速冷冻并储存在-80℃下直到分析。按照在离体肠环试验中描述的方法，得到肠粘膜样本，在分析之前储存。
分析肠内容物的谷氨酰胺、N-乙酰基-L-谷氨酰胺和氧化铬(III)。为了分析N-乙酰基-L-谷氨酰胺，将水解后的肠内容物以1∶20(w/v)溶解于0.05％PCA的水溶液中，然后按照在上述肠环中描述的方法进行HPLC分析。
为了分析谷氨酰胺，将水解后的肠内容物进行处理，然后按照在上述肠环中描述的方法进行分析。
将铬掺入食物中以得到反映内容物/kg最初食物的校正因子。为了分析氧化铬(III)，进行下述步骤。将代表性的水解肠内容物称量入镍坩锅中，至于马弗炉中。温度升至500℃，继续保持2小时。冷却后，在样本灰的大约10倍重量加入熔融混合物(Na2CO3、K2CO3、KNO3，10∶10∶4 w/w/w)，充分混和。在加入额外量的熔融混合物在表面上形成薄层，在明火上使用煤气灶熔融30分钟，直到得到透明的熔融物。从火炉上除去坩锅，冷却，通过用大约20mL水洗涤锅壁，然后在平板电炉上轻微加热大约30分钟，从而充分提取出熔融物。当外壳充分松散时，将坩锅用水洗涤四次，所有的洗液加入至100mL容量瓶中，稀释至全体积。通过利用对0、50、100、200和500毫升标准铬溶液(2.9034g K2Cr2O7/L，相当于1.5g/L Cr2O3)进行分析得到的标准曲线，将读取的吸光度转化为Cr2O3的mg数。
结果
吸收度数据如下表5所示。十二指肠样本含有不足以进行测定的氧化铬(II)含量。分析结果不能被校准以反映出内容物/kg最初食物。中空肠含有基本上相当的谷氨酰胺浓度(在食物G的情形中)和N-乙酰基-L-谷氨酰胺(在食物N中)，这表明在十二指肠和近空肠中具有相似的吸收情况。然而，这些食物还含有完整的蛋白质，正如对照食物的分析结果所表明的那样，这些蛋白质的消化物可能也产生明显的游离谷氨酰胺。这表明，最初食物中的游离谷氨酰胺含量在中回肠之前几乎被完全吸收。对髂骨末梢的内容物进行分析，表明，尽管游离谷氨酰胺的吸收可以在中回肠和髂骨末梢之间持续，但是没有观察到N-乙酰基-谷氨酰胺的吸收。然而，所有的吸收数据表明，在该模型中大约有77％的N-乙酰基-L-谷氨酰胺被吸收。
表5：作为猪食物组分的N-乙酰基-L-谷氨酰胺和谷氨酰胺的吸收情况
   谷氨酰胺食物   N-乙酰基-L-谷氨酰胺食物    对照食物(C)
  十二指肠    N/D**   N/D    N/D
  中回肠    10.1±1.9   10.3±2.4    8.8±0.7
  髂骨末梢    1.2±0.6   12.8±2.1    2.1±0.7
*对于谷氨酰胺和对照食物，数据是指谷氨酰胺(毫摩尔/kg最初食物)。对于N-乙酰基-L-谷氨酰胺食物，数据是指N-乙酰基-L-谷氨酰胺(毫摩尔/kg最初食物)。最初食物是(谷氨酰胺＝54.8毫摩尔谷氨酰胺/kg食物、N-乙酰基-L-谷氨酰胺＝55.8毫摩尔N-乙酰基-L-谷氨酰胺/kg食物)。
**N/D＝未检测到。氧化铬(II)值低于该测定方法的数值极限，没有得到校正值。
在粘膜、肝脏和肾脏中的酰基转移酶活性-在对照猪的几个感兴趣组织(就营养可能具有的重要性而言)中测量了酰基转移酶的活性。测得了在所有测试组织包括空肠粘膜、肝脏和肾脏中的酰基转移酶活性。所测得浓度为在空肠粘膜中为948+300IU/g湿组织(17.3+7.0IU/mg蛋白质)，在肝脏中为12,770+1110IU/g湿组织(159+30IU/mg蛋白质)，在肾脏中为19,630+3020IU/g湿组织(302+47IU/mg蛋白质)。
总而言之，N-乙酰基-L-谷氨酰胺主要是在十二指肠和空肠上部吸收，上述部位吸收了至少77％的剂量。在N-乙酰基-L-谷氨酰胺和谷氨酰胺之间存在两个主要差异：N-乙酰基-L-谷氨酰胺摄取饱和出现较早而回肠吸收较低。
实施例4
N-乙酰基-L-谷氨酰胺对于因营养不良而引起的肠损伤的作用
进行下面的研究以评价N-乙酰基-L-谷氨酰胺与游离谷氨酰胺相比，对于猪中因蛋白质-能量营养不良而引起的肠损伤的作用。在本研究中，由指定农场提供了5周大的驯养猪。将这些猪随机分成1-2组。第三组随意进食ENSURE
Figure C0282997600411
(Ross Products Division，AbbottLaboratories)，持续30天。在第二组中，9只猪也进食了ENSURE
Figure C0282997600412
，但仅仅是第一组日摄取量的20％。将第二组分为3个小组，每组6只，均服用酪蛋白钙或者谷氨酰胺或N-乙酰基-L-谷氨酰胺作为日常补充。在研究初期，日平均能量和供给给对照组的蛋白质为3300千卡、138g蛋白质，到研究结束时为4500千卡、187g蛋白质。在第二组中，酪蛋白酸盐、谷氨酰胺和N-乙酰基-L-谷氨酰胺的补充提供了附加的1.32克氮当量/天(基本上每天补充6.89克L-谷氨酰胺、或8.87克N-乙酰基-L-谷氨酰胺或者8.42克酪蛋白质)。30天后，所有的猪绝食16小时。然后给这些动物称重，服镇静剂，麻醉，最后颈静脉穿刺使其死亡。
迅速除去整个小肠片段。来自Treitz韧带的60cm长小肠片段被认为是空肠近端。为了对空肠进行组织学分析，选择来自Treitz韧带的5cm长片段。最靠近盲肠瓣的60cm长度被认为是回肠末梢。为了对回肠进行组织学分析，选择来自盲肠瓣的5cm长片段。将这些肠片段用冰冷的盐水溶液充分洗涤，沿长度方向摊开。通过使用玻璃刮刀刮擦肠内表面除去粘膜，然后在液氮中于-80℃下储存直到进行生化分析。
将空肠和回肠粘膜在10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)中施用机械Potter匀浆器匀化进行蛋白质和DNA测定。为了测定受损、功能性和抗氧化剂防御系统的酶标记物，将粘膜匀浆在3000g下离心10分钟。所得到的上清液用于酶测定。为了测定总谷胱甘肽，浆粘膜在5％三氯乙酸中匀化，在8000g下离心5分钟。
在上述样本上进行生化分析和免疫学分析。分别采用Bradford方法(Analytical Biochemistry，Volume 72，pages 248-254，1976)和Labarca和Paigen方法(Analytical Biochemistry，Volume 102(2)，pages 344-352，1980)测得肠粘膜和DNA的浓度。因营养不良引起的肠损伤程度通过采用Goldstein方法(R.Goldstein，T.Klein，S.Freier和J.Mencze..American Journal of Clinical Nutrition24：1224-1231，1970)测量碱性磷酸酶活性进行评价。
通过测量谷胱甘肽还原酶(GR)、谷胱甘肽转移酶(GT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPOX)的活性以及非蛋白质巯基(主要是还原的谷胱甘肽(GSH))的浓度评价对抗氧化性损伤的防御系统。通过Carlberg和Mannervik的方法(I.Carlberg和B.Mannervik，Methods inEnzymology，Volume 113，pp484-490，1985)评价谷胱甘肽还原酶的活性。采用Habig等人的方法(W.H.Habig，M.J.Pabst和W.B.Jakoby，Journal of Biological Chemistry.294：7130-7139，1984)测定谷胱甘肽转移酶。通过Flohe和Gunzler的方法(L.Flohe和W.A.Gunzler，Methods in Enzymology，Volume 105，pp114-121，1984)测定谷胱甘肽过氧化物酶的活性，非蛋白质巯基含量(报道为还原的谷胱甘肽等价物)通过Anderson方法(M.E.Anderson，Methods inEnzymology，133：548-554，1985)测量。
如下面所详细描述的那样，按照Gautreaux等人的步骤(M.D.Gautreaux，E.A.Deitch和R.D.Berg，Infection and Immunity62(7)：2874-2884，1994)离体肠淋巴细胞。将分别来自空肠和回肠的小肠片段分离开，用磷酸盐缓冲盐水(PBS，Sigma St.Louis，MO，USA)洗脱掉镇静剂含量。切除掉可看得见的Peyer′s斑点，沿着长度方向将肠剖开，切成小块。为了分离小肠上皮细胞，将这些小块在37℃下的振摇水浴(每分钟摇动120次)中、在含有5mM dithiotreitol(DTT；Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN，USA)、2mM EDTA(Sigma，St.Louis，MO，USA)和25mM Tris缓冲液(Sigma，St.Louis，Mo，USA)的25ml Hanks平衡盐溶液(HBSS；Sigma，St.Louis，MO，USA)中孵育30分钟；轻轻倒出上清液，加入新鲜的HBSS-DTT-EDTA-Tris，重复上述孵育步骤。合并来自进行两次孵育得到的含有上皮细胞的上清液，细胞通过用含有5％(v/v)对热不敏感的胎肠血浆(Sigma，St.Louis，MO，USA)、20mM HEPES(Sigma，St.Louis，MO，USA)、2mML-谷氨酰胺、500U青霉素以及100FLg/ml链霉素(Sigma，St.Louis，MO，USA)的rpmi 1640培养基(完全培养基)洗涤。通过将肠碎片置于40ml含有胶原酶0.05U/ml、dispase0.30U/ml(Sigma，St Louis，MO，USA)和脱氧核糖核酸酶I500U/ml(Roche Molecular Biochemicals，Indianapolis，IN，USA)的完全培养基中于37℃的摇动水浴(每分钟摇动120次)中从残余沉淀物中分离得到纤层本体淋巴细胞(LPL)。切除掉的Peyer′s补丁置于完全培养基中，用解剖刀切开。然后将洁净的Peyer′s补丁用胶原酶按照在前面分离LPL释放出Peyer′s补丁淋巴细胞(PPL)中的方法处理(还原孵育时间60分钟)。
将由表皮细胞、纤层本体和Peyer′s补丁分离得到的所有类型细胞经过不连续的PercollTM(Sigma，St.Louis，MO，USA)密度梯度离心以富集淋巴细胞。该商购得到的PercollTM溶液用9％NaCl稀释9∶10，得到等渗的PercollTM溶液，将其用完全培养基稀释得到3种区别在于PercollTM浓度百分比的溶液(75％、40％和30％)，它们按照逐渐减少的顺序使用。将这些细胞再次悬浮于4ml完全培养基中，余下30％部分。在650g下离心20分钟后，除去75和40％层之间的界面，细胞通过在25ml完全培养基中离心进行洗涤。然后再次将细胞悬浮于4ml 40％PercollTM中，在650g下离心。收集到富集淋巴细胞(IEL、LPL和PPL)的细胞球，通过用PBS离心进行洗涤。
分离得到的淋巴细胞用按照下述方法进行流式血细胞计数的单克隆抗体标记：将100μl的各淋巴细胞制备液(2×106cel/ml)置于具有不同浓度的单克隆抗体(AntiCD1 FITC、Anti CD3s FITC、Anti CD4aPE、AntiCD8a PE、AntiCD1 1b/Mac-1 APC、Anti CD21 APC)的3-ml试管中，在暗处于4℃下孵育30分钟。细胞用PBS洗涤，通过离心(500g，5分钟)形成球状，再次悬浮于350ul PBS中。
在FACScaliburTM流式血细胞计数器(Becton Dickinson)上对细胞制备液进行荧光活化的细胞分类(FACS)分析。对于每种细胞制备液，通过3组对照(荧光素异硫代氰酸酯-FITC、藻红蛋白-PE和异种藻蓝蛋白-APC)测定非特异性荧光。
小肠样本的组织学分析通过电子透射显微镜完成。将空肠和回肠的样本固定在30g/L戊二醛的0.1mol/L甲次砷酸钠缓冲溶液中，pH7.3，然后再固定在15g/L四氧化锇中。然后样本在丙酮中脱水，植于Epon 812树脂中。极薄部分用乙酸铀酰和柠檬酸铅双层标记，在Zeiss 902电子透射显微镜(Zeiss，Oberkochen，Germany)下检查。
生化结果
进食摄取量减少至对照组的20％导致完全不能生长。这些营养不良的猪总的体重平均损失2-3kg，而对照组在30天的实验期间增长18kg。肝脏重量以及每长度的空肠和粘膜重量也因为营养不良而明显减轻(表6)。
表6：对照和蛋白质能量不足组的肝脏和小肠重量
Figure C0282997600441
*对对照组的显著性差异(p＜0.05)。
相对于对照组(数据未示出)，营养不良猪中的DNA和粘膜单位长度的蛋白质含量明显低(2-3倍)。然而，在任何肠片段中蛋白质/DNA的比例不受PEM影响。该结果表明，在营养不良猪的小肠中，整个蛋白质和DNA合成受到削弱。肠中的蛋白质(回肠和空肠)和DNA(回肠)含量在进食NAQ补充的营养不良猪中比在进食酪蛋白酸盐或谷氨酰胺的猪种高。该结果表明，在营养不良期间NAQ部分保护了蛋白质和DNA的合成过程。
作为肠损伤标记物的碱性磷酸盐片段的活性在营养不良猪中显著地比在对照空肠片段(数据未示出)中低(2-3倍)。在回肠片段中，碱性磷酸盐较少受营养不良的影响。此外，进食谷氨酰胺或者NAQ补品的营养不良猪在回肠中具有比进食添加了酪蛋白酸盐的猪高的AP活性。
谷胱甘肽是整个抗氧化性防御系统的中心部分。它是有效的自由基清道夫，同时也与其它代谢功能相关，包括维持还原态的蛋白质巯基、GT和GPX共促因子、氨基酸转运、以及蛋白质和DNA合成。在营养不良猪和对照组的肠片段中的总谷胱甘肽浓度显著降低。然而，在进食NAQ的营养不良猪的肠粘膜中的GSH含量略微比在进食酪蛋白酸盐或谷氨酰胺补品的猪中的高，当然这种差异还未构成显著性差异。
发现分别负责醛解毒和谷胱甘肽还原的谷胱甘肽转移酶和谷胱甘肽还原酶在小肠中的活性因为营养不良的缘故均有所降低(又是2-3倍)。谷胱甘肽转移酶活性的降低可能通过醛类、环氧化物以及其它含有亲电子中心的产物堆积在粘膜中而使肠功能进一步恶化。发现这种活性在进食添加了N-乙酰基-L-谷氨酰胺的猪中较少受营养不良的影响。谷胱甘肽还原酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的活性在小肠片段中由于营养不良均降低了2-3倍。
谷胱甘肽还原酶还与谷胱甘肽由其氧化形式再生有关。谷胱甘肽过氧化物酶氧化两个还原谷胱甘肽分子来解毒过氧化物。还原谷胱甘肽在进食N-乙酰基-L-谷氨酰胺补品的猪的肠粘膜中具有较高的趋势，这与在相同组中谷胱甘肽过氧化物酶活性较高有一定关系。
总而言之，营养不良对于抗氧化剂防御系统的不利作用在进食N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充的动物中似乎比在进食酪蛋白酸盐或谷氨酰胺补品的动物中更不明显。
免疫学结果
作为营养不良结果的小肠peyer′s补丁淋巴细胞总数目有所减少。在回肠中，peyer′s补丁淋巴细胞总数目在补充酪蛋白酸盐和谷氨酰胺的猪中显著比在补充N-乙酰基-谷氨酰胺或者对照组中的总数目低。在空肠中，也出现这样一种趋势，那就是peyer′s补丁淋巴细胞总数目在补充N-乙酰基-谷氨酰胺也显著比在补充酪蛋白酸盐和谷氨酰胺的猪中的总数目高。另一方面，空肠外表皮淋巴细胞的总数目在所有营养不良组中显著比对照组中的高。对于所有实验组而言，没有发现在小肠纤层中的淋巴细胞数目方面存在差异。
在所有营养不良组中，表达B细胞标志物(CD1和CD21)的peyer′s补丁淋巴细胞比在健康组中的低′尤其是在CD1+淋巴细胞的情形中。CD21+peyer′s补丁淋巴细胞数目在回肠中有所降低，其在对照组与酪蛋白酸盐和谷氨酰胺补充组之间出现显著性差异，而不是N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充组。在空肠中也出现相同的趋势，但没有达到显著性差异。在空肠和回肠中的CD11b+peyer′s补丁淋巴细胞数目降低也显示出这样一种趋势，那就是N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充组比酪蛋白酸盐或谷氨酰胺补充组低。
空肠和回肠peyer′s斑点淋巴细胞中的T细胞(CD3+细胞)由于营养不良有所减少。这种减少是因为助手(CD4+)和细胞毒素(CD8+)T细胞。然而这种T细胞的减少具有这样一种趋势，那就是N-乙酰基-L-谷氨酰胺补克组比酪蛋白酸盐或谷氨酰胺补充组低。在有些情形例如回肠中的CD4+和CD8+细胞中，在对照组和酪蛋白酸盐或谷氨酰胺补充组之间而不是对照组和N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充组之间观察到出现显著性差异。
如上所述，营养不良促使了空肠中上皮内淋巴细胞的总数增加。这种增加在两类人群B细胞(CD21+)和T细胞(CD3+)中均观察到。在B细胞中，CD1+淋巴细胞数目在N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充组中显著高于其它组。在T细胞中，T细胞毒素亚人群(CD8+)在营养不良组中显著高于对照组。然而，T协助子(CD4+)亚人群在谷氨酰胺和N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充组中(而不是酪蛋白补充组)显著高于对照组。这表明，谷氨酰胺和N-乙酰基-L-谷氨酰胺对于T协助子(CD4+)亚人群具有选择性作用。对于回肠上皮内淋巴细胞的所有淋巴细胞亚人群，没有观察到存在显著性差异。
没有观察到在纤层本体淋巴细胞方面由于营养不良出现较明显的重要变化。相对于对照组而言，CD21+细胞(B细胞)在酪蛋白酸盐补充组中有所降低，但这种降低在谷氨酰胺或者N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充组中均没有观察到。此外，N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充组而不是谷氨酰胺补充组显著不同于酪蛋白酸盐补充组。
总而言之，N-乙酰基-L-谷氨酰胺补充组表现均比谷氨酰胺或者酪蛋白酸盐补充组好，显示出统计学上显著的差异，可以降低因为营养不良而引起的小肠免疫学变化，尤其是在B和T协助子亚人群的总细胞数目方面。
组织学结果
来自健康猪和营养不良猪的空肠肠细胞的电子透射显微图如图7所示。在对照猪(A、B组)，空肠肠细胞显示出规则的微绒毛、狭窄的细胞间隙、规则的核以及含有高浓度粘液素的小球突细胞。在进食补充有酪蛋白酸盐的ENSURE PLUS配方食品的营养不良猪的肠粘膜中(C、D组)，显示出严重的萎缩现象和微绒毛减少、细胞间隙敞开、规则的核以及具有多泡体的清晰细胞质区带。在该组中，细胞脱落和材料挤入肠内腔的现象也是明显的。在营养不良期间进食补充有谷氨酰胺的ENSURE PLUS配方食品的营养不良猪的空肠粘膜(E、F组)中，显示出缩短的微绒毛、膨胀的细胞间隙、以及规则的小碎片核。在营养不良的谷氨酰胺猪的空肠粘膜中还发现存在丰富的上皮内淋巴细胞。进食补充有NAQ的ENSURE PLUS配方食品的猪空肠粘膜(G、H组)更不易受蛋白质能力营养不良的影响。在该组中，空肠肠细胞显示出微绒毛大小、核形状、以及与对照猪空肠粘膜相接近的细胞间隙。与营养不良的酪蛋白酸盐和谷氨酰胺组相比，在营养不良的NAQ组的空肠粘膜中出现的上皮内淋巴细胞渗透现象是罕见的。图8示出了来自健康猪和营养不良猪的回肠肠细胞的电子透射显微图。在对照猪(A、B组)中，回肠淋巴细胞显示出规则分布的微绒毛、具有不可见膨胀的细胞间隙、均匀且稠密的细胞质以及具有大量分泌颗粒的小球突细胞。进食补充有酪蛋白酸盐的ENSURE PLUS配方食品的猪回肠粘膜(C、D组)显示出微绒毛减少、某些细胞间隙膨胀、具有多泡体的处于挤出过程中的清晰细胞质区带。在该组中，宽的淋巴细胞渗透现象在回肠上皮细胞中也是明显的。在营养不良期间进食补充有谷氨酰胺的ENSUREPLUS配方食品的猪回肠粘膜(E、F组)显示出微绒毛减少、宽的细胞间隙、以及强烈的淋巴细胞渗透现象。与空肠粘膜一样，进食补充有NAQ的ENSURE PLUS配方食品的猪回肠粘膜(G、H组)更不易受蛋白质能量不足的影响。其显示出低的微绒毛变形、无可见膨胀的细胞间隙、在肠上皮细胞顶端部分发现罕见的淋巴细胞渗透现象以及丰富的含有高含量分泌颗粒的杯状细胞。
结论
在正常生理条件下，在氧衍生的游离基的生成及其对细胞抗氧化体系的贡献之间存在稳态。在本研究中，由于蛋白质能量营养不良使得肠平衡被打破，导致谷胱甘肽减少。此外，肠内免疫应答应为蛋白质能量营养不良而大受削弱。
尽管在预防因小肠营养不良而引起的生化和免疫学变化方面，没有观察到谷氨酰胺具有明显的效果，这可能是因为营养不良非常严重，但是N-乙酰基-L-谷氨酰胺对于降低这种变化的严重程度具有积极作用。
本研究表明，N-乙酰基-L-谷氨酰胺对于小肠细胞具有积极作用，甚至超过谷氨酰胺。另外，如图7所示的来自健康和营养不良猪的电子透射显微图表明，N-乙酰基-L-谷氨酰胺在预防胃肠道上皮内层发炎方面比谷氨酰胺更有效。
实施例5
利用未接受治疗的腹腔疾病患者的组织培养物测试富含谷氨酰胺制剂对于本文所述腹腔疾病的毒性
本研究的目的在于评价几种不含麸质的富含谷氨酰胺产品对于具有胃蛋白酶-胰蛋白酶的麸质制剂的潜在毒性，已知具有胃蛋白酶-胰蛋白酶的麸质制剂可以诱导腹腔疾病中的粘膜病变。另外还对由麸质得到的富含谷氨酰胺或者谷氨酰胺改良产品进行研究，以评价后者是否能够诱导对腹腔疾病患者的粘膜破坏作用。
本研究以随机方式进行。使用腹腔的组织培养模型进行该研究。为了实现该项目目的，使用了未曾治疗的腹腔疾病患者的小肠活组织碎片。
招募十二名被诊断为潜在的未治疗腹腔疾病患者的成年患者。它们的疾病通过出现大量的抗组织转谷氨酰胺酶的临床症状以及对小肠活组织切片的组织学分析加以确认。
有关组织培养终点的描述
采用描述在Maiuri，L.等人，Gastroenterology 110，1368-1378.(1996)中的标准方法制备组织培养物。简单地将小片活组织切片(大约1mm×1mm)装在不锈钢筛网上在补充有不同化合物的介质中培养24小时。在本研究中采用了标准阳性和阴性对照。阳性对照为1mg/ml的麸朊胃蛋白酶一胰蛋白酶。阴性对照为单独的介质。所使用的所有测试化合物的最终浓度为40μg/ml。测试化合物/产品为N-丙氨酰基-谷氨酰胺；N-乙酰基-谷氨酰胺；来自Nutricia，Boca Raton，Florida的
Figure C0282997600491
(P1)；来自Fresenius Kabi，Runcorn，Cheshire，UK的
Figure C0282997600492
(P2)；来自B.Braun，Bethleham，PA的Nutricomp
Figure C0282997600493
(P3)；来自Hormel Health Labs，Plymouth，MN的
Figure C0282997600494
(P4)；来自Novartis，White Plains，NY的
Figure C0282997600495
(P5)；来自Ross Products，Columbus，Ohio的
Figure C0282997600496
加NAQ(P6)；来自Ross Products，Columbus，Ohio的
Figure C0282997600497
加水解小麦麸质(P7)。24小时后，停止培养，给活组织切片植入O.C.T.化合物(Tissue Tek，Miles Laboratories，Elkhart，IN，USA)，迅速在液氮中冷冻，储存于-70℃直到低温吸附。使用低温态制备得到5微米切片。
免疫组织化学
使用下述标记物进行本研究：TUNEL用于监测上皮凋亡，CD25用于监测上皮内炎症。按照下述步骤使用下述试剂。
检测DNA碎片
按照描述在Maiusri，L.等人.DNAfragmentation is a featureof cystic fibrosis epithelial cells：a disease withinappropriate apoptosis？FEBS Letter 408，225-31(1997)以及Maiuri，L.等人.FAS engagement drives apoptosis of enterocytesof celiac patients.Gut 48，418-24(2001)中的方法测定组织切片中的DNA碎片。
检测CD25+细胞
通过免疫组织化学按照描述在Maiuri，L.等人.Blockage ofT-cell costimulation inhibits T-cell action in Celiac disease.Gastroenterology 115，564-72.(1998)中的方法在冷冻的组织切片上进行抗原检测，使用mAbs抗-CD25(Dako 1:30)，采用根据前面在该相同参开文献中描述的碱性磷酸盐着色技术。
对于每个样本，对至少5个玻片进行肓性评估。利用针对不合适的血液组抗原的小鼠IgG或IgM进行特异性对照试验，同时分析属于同一个体的不同的培养样本。
形态学分析
TUNEL+肠细胞的总数目是指肠细胞的百分比。测量落入1mm2范围内的标准区域内的CD25+纤层本体中的细胞总数。在后面对这些数据进行比较。
结果
如图9所示，这些化合物诱导了由上皮下区室中TUNEL和CD25上调所定义的上皮细胞损伤的不同模式。某些制剂同时诱导了在上皮内隔室中CD25表达的增加以及细胞凋亡的诱导。这些化合物因而可作为阳性对照(按照1mg/ml使用的胃蛋白酶-胰蛋白酶麸质制剂)。其它化合物诱导了对上皮细胞凋亡或者上皮细胞隔室中的CD25的诱导的某些选择性改变。其它与在仅仅暴露于单独的介质(阴性对照)中的培养物中所观察到的凋亡模式或者CD25诱导没有区别。在图10a和b中显示了使用化合物N-乙酰基-谷氨酰胺或者含有谷氨酰胺(p5)的产品Impact诱导上皮细胞凋亡的实例。图11a和b描述了通过相同化合物诱导CD25的模式。
结论
本研究的结果表明，很多测试化合物在未接受治疗的腹腔疾病患者的小肠中产生了显著的变化。有些能够诱导上皮细胞凋亡和促进表皮内发炎，而其它的化合物在诱导粘膜发炎方面更有效。可以诱导两种或者一种标记物的化合物被认为是对于腹腔疾病患者的粘膜具有毒性。这些化合物中的某些并不诱导任何效应，尤其是化合物N-乙酰基-L-谷氨酰胺。该化合物对于未接受治疗的腹腔疾病患者的活组织还具有明显的营养作用。这种营养效果通常表现为使得粘膜尤其是上皮细胞粘膜得到改善，相对于其它样本而言其获得明显改善。
本研究清楚地表明，大多数测试化合物给未接受治疗的腹腔疾病患者的粘膜带来了一定变化。最令人感兴趣的，也是最出人意料的在于N-乙酰基-L-谷氨酰胺具有营养活性。在该产品的第一实施例中，甚至相对于单独的介质，它使得粘膜的整体情况有所改善。
前面已经对落入按照权利要求书所限定的本发明范围之内的各种具体实施方案进行了描述。这些实施方案并不意味着将本发明范围限定于所公开的具体形式。本发明应该覆盖落入本发明的主旨和范围之内的所有各种修饰和替代。

Claims (46)

1.N-乙酰基L-谷氨酰胺、或其营养上可接受的盐在制备人用口服补剂方面的应用。
2.根据权利要求1的应用，其中所述补剂施用于人以提供至少0.7毫摩尔/kg/天的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐。
3.根据权利要求1的应用，其中所述补剂施用于人以提供至少1.0摩尔/kg/天的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受盐。
4.根据权利要求1的应用，其中所述补剂施用于人以提供至少1.5毫摩尔/kg/天的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐。
5.根据权利要求1的应用，其中所述营养上可接受的盐选自：锂、钠、钾、钙、镁、铝、铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N，N-二苄基苯乙胺、β-甲基氨基-α-苯基-苯乙醇、N，N′-二苄基乙二胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪、以及它们的混合物。
6.根据权利要求1的应用，其中所述人罹患选自下述的病症：胃肠道手术、胃肠道切除术、小肠移植、手术后创伤、饥饿、严重疾病和损伤、多发性外伤、短肠综合症、烧伤、骨髓移植、AIDS、口腔粘膜炎、癌症、腹腔疾病、克罗恩氏病、坏死性小肠结肠炎、脏器早熟、随机感染、与特定治疗相关的脏器退化、口服进食受限、以及它们的组合。
7.一种含水溶液，它含有：
a)每升30mEq至95mEq的钠；
b)每升10mEq至30mEq的钾；
c)每升10mEq至40mEq的柠檬酸盐；
d)少于3.0重量/重量％的一种碳水化合物；以及
e)每升溶液至少5.0毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上的等价盐，
其中该溶液不含游离的谷氨酰胺。
8.根据权利要求7的含水溶液，每升溶液含有20毫摩尔至300毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上的等价盐。
9.根据权利要求7的含水溶液，每升溶液含有25毫摩尔至200毫摩尔的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上的等价盐。
10.根据权利要求7的含水溶液，其中所述营养上的等价盐选自：锂、钠、钾、钙、镁、铝、铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N，N-二苄基苯基胺、β-甲基氨基-α-苯基-苯乙醇、N，N′-二苄基乙二胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪、以及它们的混合物。
11.根据权利要求7的含水溶液，其中所述含水溶液进一步含有氯化物。
12.根据权利要求7的含水溶液，其中所述碳水化合物为右旋糖和葡萄糖的混合物。
13.根据权利要求7的含水溶液，其中所述钠选自氯化钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠及其混合物。
14.根据权利要求7的含水溶液，其中所述钾以10mEq/L至30mEq/L的量存在。
15.根据权利要求7的含水溶液，其中所述钾选自柠檬酸钾、氯化钾、碳酸氢钾、碳酸钾、氢氧化钾及其混合物。
16.根据权利要求11的含水溶液，其中所述氯化物以30mEq/L至80mEq/L的量存在。
17.根据权利要求11的含水溶液，其中所述氯化物选自氯化钾、氯化钠、和氯化锌。
18.根据权利要求7的含水溶液，其中所述柠檬酸盐以20mEq/L至40mEq/L的量存在。
19.根据权利要求7的含水溶液，其中所述柠檬酸盐选自柠檬酸钾、柠檬酸钠、和柠檬酸。
20.根据权利要求7的含水溶液，它进一步含有至少一种调味剂。
21.根据权利要求7的含水溶液，它进一步含有至少一种人造甜味剂。
22.根据权利要求7的含水溶液，它进一步含有至少一种选自琼脂、褐藻酸和盐、金合欢胶、阿拉伯树胶、塔哈胶、纤维素衍生物、凝胶多糖、发酵树胶、帚叉藻聚糖胶、明胶、结冷胶、印度胶、瓜耳树胶、阿欧塔角叉菜胶、爱尔兰苔藓、卡帕角叉菜胶、魔芋粉、刺梧桐树胶、菜角叉菜胶、松胶/阿拉伯半孔聚糖、刺槐豆胶、果胶、罗望子胶、塔拉豆胶、黄著胶、天然的和改性的淀粉、黄原胶的胶凝剂，其含量足以支撑自身的三维结构。
23.根据权利要求7的含水溶液，它进一步含有米粉。
24.根据权利要求7的含水溶液，它进一步含有不易消化的寡糖。
25.一种液体营养配方食品，它含有：
a)蛋白质组分，其占所述液体营养配方食品总含热量的8-35％；
b)碳水化合物组分，其占所述液体营养配方食品总含热量的36-76％；
c)脂质组分，其占所述液体营养配方食品总合热量的6-51％；以及
占蛋白质组分的热量的1-25％的N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐形式，
其中该液体营养配方食品不含游离的谷氨酰胺。
26.一种成人液体营养配方食品，它含有：
a)蛋白质组分，其占所述液体营养配方食品总含热量的14-35％；
b)碳水化合物组分，其占所述液体营养配方食品总含热量的36-76％；
c)脂质组分，其占所述液体营养配方食品总含热量的6-51％；以及
至少35毫摩尔的N-乙酰基L-谷氨酰胺、或其营养上可接受的盐/1000千卡营养配方食品，
其中该液体营养配方食品不含游离的谷氨酰胺。
27.如权利要求26中定义的营养配方食品，其中所述配方食品含有35毫摩尔至160毫摩尔N-乙酰基-L-谷氨酰胺、或其营养上可接受的盐/1000千卡营养配方食品。
28.一种非成年病人用液体营养配方食品，它含有：
a)蛋白质组分，其含有所述液体营养配方食品总合热量的8-25％；
b)碳水化合物组分，其占所述液体营养配方食品总含热量的39-44％；
c)脂质组分，其占所述液体营养配方食品总合热量的45-51％；以及
至少5.0毫摩尔N-乙酰基L-谷氨酰胺、或其营养上可接受的盐/1000千卡营养配方食品
其中该液体营养配方食品不含游离的谷氨酰胺。
29.如权利要求28甲定义的营养配方食品，其中所述制剂含有5.0毫摩尔至32毫摩尔N-乙酰基-L-谷氨酰胺、或其营养上可接受的盐/1000千卡营养配方食品。
30.根据权利要求2 5的液体营养配方食品，其中所述营养上可接受的盐选自：锂、钠、钾、钙、镁、铝、铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二乙胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N，N-二苄基苯基胺、β-甲基氨基-α-苯基-苯乙醇、N，N′-二苄基乙二胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪、以及它们的混合物。
31.根据权利要求2 5的液体营养配方食品，它含有少于1.0g焦谷氨酸/1500千卡配方食品。
32.根据权利要求25的液体营养配方食品，其中所述配方食品为成人配方食品，并且蛋白质组分占所述液体营养配方食品总含热量的14-35％；碳水化合物组分占所述液体营养配方食品总含热量的36-76％；脂质组分占所述液体营养配方食品总含热量的6-41％；该N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐占蛋白质热量的1-25％。
33.根据权利要求225的液体营养配方食品，其中所述配方食品用于未成年人，并且蛋白质组分占所述液体营养配方食品总含热量的8-25％；碳水化合物组分占所述液体营养配方食品总含热量的39-44％；脂质组分占所述液体营养配方食品总含热量的45-51％；该N-乙酰基-L-谷氨酰胺或其营养上可接受的盐占蛋白质热量的1-12％。
34.根据权利要求25的液体营养配方食品，其中所述液体营养配方食品是通过口服给药的。
35.根据权利要求25的液体营养配方食品，其中所述液体营养配方食品是通过肠道给药的。
36.根据权利要求25的液体营养配方食品，它进一步含有选自钙、磷、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘、铬、钼、肌醇、肉毒碱、牛磺酸、维生素A、C、D、E、K和B配合物、以及它们的混合物的维生素和无机元素。
37.根据权利要求25的液体营养配方食品，其中所述脂质组分选自椰子油、酱油、玉米油、橄榄油、红花油、富油性红花油、中链甘油三酸酯、向日葵油、富油性向日葵油、棕榈油、棕榈油精、低芥酸菜子油、鱼油、棕榈仁油、鲱油、豆油、棉籽油、卵磷脂、花生四烯酸和二十二碳六烯酸的脂质源、结构脂质、以及它们的混合物。
38.根据权利要求25的液体营养配方食品，其中所述蛋白质组分含有选自豆油基蛋白、奶基蛋白，酪蛋白、乳清蛋白、米蛋白、牛肉胶原、豌豆蛋白、马铃薯蛋白、以及它们的混合物的完整蛋白质。
39.根据权利要求25的液体营养配方食品，其中所述蛋白质组分含有选自大豆蛋白水解产物、酪蛋白水解产物、乳清蛋白水解产物、米蛋白水解产物、马铃薯蛋白水解产物、鱼蛋白水解产物、鸡蛋白水解产物、明胶蛋白水解产物、动植物蛋白水解产物的组合、以及它们的混合物的水解蛋白质。
40.根据权利要求25的液体营养配方食品，其中所述蛋白质组分含有选自色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、精氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、组氨酸、肉毒碱、牛磺酸、甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸胱氨酸、甲状腺氨酸天门冬氨酸、天门冬氨酸谷氨酸谷氨酰胺羟基赖氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸以及它们的混合物的游离氨基酸。
41.根据权利要求25的液体营养配方食品，其中所述碳水化合物组分选自蜡状或非蜡状形式的来源于玉米、木薯、米或马铃薯的水解后的、完整的、天然的和化学改性的淀粉；糖类；以及它们的混合物。
42.根据权利要求41的液体营养配方食品，其中所述糖类选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、富含果糖的玉米糖浆和玉米糖浆干粉。
43.权利要求7的含水溶液在制备用于减轻患有腹腔疾病的患者的肠内粘膜炎症的液体营养配方食品方面的用途。
44.权利要求25的液体营养配方食品在制备用于减轻患有腹腔疾病的患者的肠内粘膜炎症的口服补剂方面的用途。
45.权利要求26的液体营养配方食品在制备用于减轻患有腹腔疾病的患者的肠内粘膜炎症的口服补剂的用途。
46.权利要求28的液体营养配方食品在制备用于减轻患有腹腔疾病的患者的肠内粘膜炎症的口服补剂的用途。
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