KR20040103941A - 증식성 질병의 유전자 치료를 위한 미생물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포장되어진 미생물에 관한 것으로 이 미생물의 게놈에는 다음의 성분들이 삽입되어 있으며 그리고 다음과 같이 압착될 수 있다; I ) 직접적으로 또는 간접적으로 항 증식적으로 또는 세포질 독성적으로 활성적인 압착 제품 또는 다수의 압착제품들은 코드화 하는 뉴클레오티드배열, II) 기호화 하거나 또는 미생물에서 활성화 되어 질 수 있는 활성화 배열의 제어하에 혈장 단백질을 위하여 구성적으로 활성인 뉴클레오티드배열, III 선택적으로 기호화하거나 또는 미생물에서 활성화 되어 질 수 있는 활성화 배열의 제어하에 세포에 특정한 리갠드(ligund)에 대하여 구성적으로 활성인 뉴클레오티드 배열, IV) 성분 I ) 및 II) 그리고 선택적으로 III의 압착제품의 압착을 미생물의 외부표면에 유치하거나 또는 성분 I )의 압착제품의 압착의 분리를 유도하며 그리고 바람직하게는 구성적으로 활성인 운반시스템을 위한 뉴클레오티드 배열, V) 선택적으로 포유동물의 세포의 시토솔에서 미생물의 용해를 위하여 사용된 단백질에 대한 그리고 용해된 미생물에 포함된 적어도 하나의 또는 그 이상의 성분들 I ) 및 VI)을 가지는 플라스미드들의 내부세포의 방출을 위한 뉴클레오티드 배열, 그리고 VI) 성분 I)을 압착하기 위하여 미생물에 활성화되어 질 수 있으며 그리고/또는 조직에 특수한, 종양 세포에 특수한, 기능에 특수한 또는 세포에 특수하지 않은 활성화 배열이다. 본 발명의 미생물은 또 성분 I ) 내지 VI)의 어느것도 단일화 또는 몇회씩 나타날 수 있으며 그리고 동일하게 또는 상이할 수 있다.

Description

증식성 질병의 유전자 치료법을 위한 미생물{MICROORGANISM FOR GENETIC THERAPEUTIC TEATMENT OF PROLIFERATIVE DISEASES}

유전치료에는 낯선 핵산을 체외에서 조직세포로 주입시켜 환자에게 이 세포들을 처방하거나 미생물들을 환자들에게 주사로 주입시켜, 미생물들이 낯선 핵산들을 치료하고자 하는 조직세포로 운반해주길 기대한다.

미생물들은 미립자다. 생물체에 주입하면 이 미립자들은 말하자만 retikuloendothelial 체게에서 흡수된다. 이와 같은 소거메카니즘에도 불구하고 유전자운반을 담당했던 미생물을 목표조직에 도달하게 하기 위해 미생물들을 세포특유의 리간덴으로 처리했다. 지금까지는 retikuloendothelial 체게에 의해 미생물들이 흡수되는 소거상황을 조금만 줄일 수 있었다.

유전치료의 중점 연구목표는 번식성이 강한 질병인 예를 들어, 종양, 백혈병, 만성 감염, 자주면역 질병 그리고 이식받은 기관의 거부반응을 치료하는 것이다. 이들 질병의 치료는 성공적인 약물치료의 발달에도 불구하고 아직까지도 충분하지 않다.

뉴클리오티트 시퀀스의 미생물에 관한 발명이다. 뉴클리오티드 시퀀스로 번식하지 않거나 세포독 효과가 있는 익스프레션 결과물에 실험할 수 있다. 또한 이미생물을 의약품 생산에 사용할 수 있으며, 플라스미드, 미생물을 생산하는 과정 및 미생물의 활용에 관한 발명이다.

독성 때문에 축소된 altodanf, 예를 들어 유전자 변형 바이러스 또는 독성 때문에 약화된 박테리아들은 낯선 핵산시퀀스의 운반자로 유전치료 범위에서 점점 의미를 얻게 된다.

그 결과 증폭시스템을 개발하여, 증폭시스템의 도움으로 종양에서의 효능성분의 농도를 증폭시켰다.

증폭시스템의 목표는 종양에 신체의 나머지 부분으로는 이동할 수 없거나 낯선 요소로 인식되고, 종양에서 독성이 없는 세포분열억제제를 독성이 있는 세포분열억제제로 활성화시키거나 분열시키는 엔자임을 주입시키는 것이다. 엔자임을 종양에 주입시키는 것은 종양세포 특유의 리간덴을 이 엔자임에 결합시켜 주입시키는 것이다. (예를 들어 Antibody-Derived Enzyme- mediated Prodrug-Therapy ; ADEPT 의 형태로) 또는

엔자임을 위한 유전자를 종양세포 특유의 또는 특별하지 않은 벡터로 주입하는 방법이 있다 (Gene Derived Enzym-mediated Prodrug Therapy ; GDEPT) (Sed-lacek et al., Contributions to Oncology 43 : 1-145,1992 ; Sedlacek, Critical Reviews inOncology/Hematology 37 : 169-215,2001 ; McCormick Nature Reviews Cancer 1 : 130-141,2001 ; Carter, Nature Reviews Cancer 1 : 18-129,2001).

지금까지 ADEPT 또는 GDEPT 방법을 적용했던 임상실험에서는 그러나 아직도 불충분한 치료법적인 결과를 얻었다. 중점적인 문제점들은 1) 신체에 낯선 엔자임에 대한 면역성 (Immunogenit), 2) 항체 엔자인 결합체 (ADEPT)의 비교적 미비한 종양위치 도달률, 3) 인간화한 항세를 인간의 엔자임과 결합시켜 만든 단백질을 충분히 많은 양으로 그리고 지불할 수 있는 금액으로 생산하는 기술적인 문제, 4) 항체-엔자인-결합체 또는 유전자-벡터의 미비한 종양 침투 능력 그리고 5) 외부로부터의 적은 형질도입률, 즉 엔자임을 위한 유전자를 실험할 수 있는 종양노트의 종양세포 수는 종양치료의 효능을 실험하기 위해 너무 작았다.

예를 들어 외과치료, 방사선치료, 화학요법 그리고 또한 면역치료의 성공에도 불구하고 아직까지 종양을 치료하는데 있어 진전된 머리와 목, 중앙 신경계, 유선, 폐, 위와 장, 간, 침샘, 신장, 피부, 난소 그리고 전립선 종양을 치료할 수 없다.

이렇듯 종양을 치료하는데 성공률이 미비한 이유로는 다양한 이유가 있겠고, 아직 정확히 밝혀지지 않았다. 그러나 핵심적인 이유는 1) 이미 이전에 외부로부터 받는 집중적인 화학요법 그리고 면역치료의 방사선에 대해 종양세포들이 면역성을 보이고 있다. 2) 각각 받는 치료에 대해 면역성을 보인다. 이와 같은 2차적인 면역성은 종양세포의 유전적인 다양성에 기인한 것이다. 이러한 성격 때문에 종양치료를 받을 때 면역메카니즘을 개발해낼 수 있게 된다. 3) 지금까지 사용할 수 있는 pharmakokinetic 또는 phar-makodynamic 종양치료가 불충분하다. 따라서 종양이 있는 곳에서 치료를 할 때, 그 종양이 1차 종양, 재발 또는 전이 이건, 종양을 죽이기에는 절대적으로 불충분하다.

종양치료가 효과적이지 않은 것에는, 4) 분사범위가 너무 높고, 5) 종양, 또는 종양세포의 약물이 충분하게 도달하지 않고, 6) 종양에서 침투능력이 부족하며, 7) 전체 생물체에 독성효과가 있어서 종양이 있는 곳에 더 높은 농도의 약물이 도달할 수 있는 가능성을 제한시킨다.

과거에는 다양한 방법으로 종양치료를 직접 종양이 있는 곳에서 실행하려 노력했다.

종양세포 특유의 리간덴 (Liganden)은, 예를 들어 항체 또는 분해생성물이며 세포 분열 억제제, 종양을 제거하는 효과가 있는 시토킨 (Cytokine), 세포독 단백질 또는 동위체에 결합된 것인데, 종양에서 세포독 효능성분을 가져다 주는 효과가 일반 조직과 비교했을 때 있으나, 종양을 치료하는데 있어 그 효과는 부족한 것이었다. (참고: Sedlacek et al., Contributions to On- colosy 43 : 1-145,1992 ; Carter, Nature Reviews Cancer 1 : 118-129,2001).

또 다른 증폭시스템은 종양세포를 죽이는 면역반응을 유도하는 것이다. 즉, 특유의 항체를 생성하는 세포와 독성 세포를 번식시킴으로 했다. 면역반응을 유도하기 위해서는 종양 안티유전자를 적절한 상태로 마련하여 주입한다. 목표는 종양환자들의 종야에 대한 허술한 먼역치계와 종양이 환자의 면역체계에 대해 개발한 저항력을 없애는 것이다.

지난 몇십년 간 다양한 종양 안티유전자 결합물질을 통해서 다양한 기술적인종양백신화치료법을 실험했다.

그러나 종양치료에 희망했던 돌파구를 마련해주지는 못했다. 보조 물질이 있는 면역성의 종양 특유 안테 유전자 결합물, 종양 특유의 안티유전자를 실고 있는 dentritisch 세포, 또는 종양 특유의 안티 유전자를 코드화시키는 뉴클레오티드 시퀀스를 주입하는 새로운 시도들은 처음으로 희망적인 결과들을 낳았다. 그러나 지금까지는 이 분야에서도 아직 종양치료의 돌파구를 관찰할 수 없다다.

박테리아에 핵산 시퀀스를 주입한 익스프레션 생산물을 박테리아의 세포막에 실험하거나 박테리아가 분비하게 하는 기술을 개발했다. 이 기술의 기본은 그람 음성 박테리아의 분비시스템 타입1의 프로토타입을 이루는 Escherichia coli Hamolysinsystems HlyAs다. HlyAs의 도음으로 Sekretionsvektoren를 개발했다. 시크리션벡터는 Samonella enterica, Yersinia enterocolitica 그리고 Vibrio cholerae에 있는 단백질 안티 유전자를 효과적으로 추출할 수 있다.

이와 같은 분비벡터는 모든 단백질 안티 유전자의 DNA를 뉴클레오티드 시퀀스에 결합하여 HlyA-Signalpeptid, Hamolysin-Sekretionsapparat, hlyB와 hlyD 그리고 denhly-spezifischen Promoter를 위해 포함하고 있다. 이 세크레션벡터로 박테리아의 표면에 단백질을 실험할 수 있게 된다. 이런 방식으로 유전자 조작된 박테리아들은 주입된 핵산으로부터 만들어진 단백질이 세포안에 들어있는 박테리아보다 면역체계를 강화시키는데 대해 더 좋은 백신효과를 유도한다. (Donner et al EP 1015023 A, Gentschev et al, Gene, 179 : 133-140,1996 ; Vac- cine 19 : 2621-2618, 2001, Hess et al PNAS 93 : 1458-1463, 1996). 그러나 이 시스템의 단점은hly-spezifischen Promoters를 사용하면서 박테리아의 표면에서 배출된 단백질의 양이 매우 적다는 것이다.

Salmonella 와 Listeria monorytogenes와 같은 운반박테리아를 통해 모세포에 플라스미드 DNA를 주입시키는 기술이 개발되었다. 이 플라스미드에 포함된 유전자는 모세포에서 eukaryonitc Promotor의 관리를 받을 때도 실험할 수 있었다. Listeria monocytogenes 포자에는 아무 안티 유전자가 아무 eukaryontic Promotor의 관리를 받는 뉴클레오티드 시퀀스를 주입시켰다. 특별한 Lysis=유전자를 위한 뉴클레오티드 시퀀스 주입으로 Listeria monocytogenes 포자가 안티 유전자를 선보이는 세포의 Zytosol에서 분해되고 그들의 플라스미드를 방출하는 효과를 볼 수 있었다. 이에 이어 Expression, Prozessing 그리고 플라스미드 코드화된 단백질의 프리젠테이션이 이뤄졌다. 단배질의 면역성이 현저히 증가하는 것을 볼 수 있었다(Dietrich et al. Nat. Biotech- nol 16 : 181-185,1998 , Vaccine 19 ; 2506-2512,2001).

세포 내에 정착하는 박테리아의 독성이 약화된 종류를 개발했다. 예를 들어 Listeria monocytogenes, Salmonella enterica sv 등에서 개발했다.

Typhimurium, Typhi, 그리고 BCG, 이와 같은 변종들은 이미 티푸스와 결핵예방접정으로 사용된다. 이 박테리아들 및 독성을 약화시킨 변종들은 일반적으로 면역력을 자극하고 세포의 면역성을 강화시켜준다. 예를 들어 L. monocytogenes는 TH1 세포의 활성화를 통해 세포독의 Lymphozyten 번식을 자극한다. 이 박테리아들은 분리된 안티 유전자를 직접 Cytosol 안티 유전자를 선보이는 세포로

(APC ; Makrophagen과 Dendritische 세포) 운반한다. 이들 역시 동시에 분자들을 자극하여 T-세포를 효과적으로 자극하게 된다. Listeria 박테리아들은 부분적으로 phagosomalen Kompartimenten에서 분해되고 이 운반자 박테이라가 생성한 안티 유전자는 따라서 한편으로는 MHC Klasse II 분자로 선보일 수 있다. 그리고 이런 과정에서 T-도우미세포들의 유도를 이끌어낼 수 있다. 다른 한편으로는 Listeria 박테리아들은 APCs의 Cytosol에 있는 Phagosom에서 방출되는 것을 저항한다. 따라서 이 박테리아가 생성하고 분리한 안티 유전자는 MHC Klassel 방법으로 선보이는 것을 선호한다. 이 방법으로 CTL 답을 안티 유전자에 대해 유도할 수 있다. 더불어 Listeria와 Makrophagen의 Interaction으로 자연스러운 킬러세포 (NK)와 Neutrophilen Granulozyten가 Cytokine (TNF-alpha, IFN-gamma,I1-2, IL-12; Unanue, Curr. Opin

Immunol, 9 : 35-43,1997 ; Mata and Paterson, J Immunol 163 : 1449-14456, 1999) 의 Expression을 유도할 수 있다는 것을 밝힐 수 있었다. 이에 대해 종양을 없애주는 효과를 증명할 수 있었다. 이로써 종양 안티 유전자를 Expression 하기 위해 전이된 L. monocytogenes를 투입하는 것으로 실험대상 종양의 번식을 막을 수 있었다 (Pan et al Nat Med 1 : 471-477,1995, Cancer Res 59 : 5264-5269,1999 ; Voest et al . Natl Cancer Inst 87 : 581-586, 1995 ;Beatty and Paterson, J Immunol 165 : 5502-5508, 2000). 종양 안티 유전자를 코드화시키기 위해 뉴클레오티드 시퀀스를 주입한 독성을 줄인 Salmonella enterica 집군은종양안티 유전자 실험 박테리아 운반자로써 경구투여 후 다양한 종양에 대해 특별한 보호효과를 얻어낼 수 있었다. (Medina et al., Eur J Immunol 30 : 768-777,2000, Zoller und Christ J Immunol166 : 3440- 3450,2001 ; Xiang et al., PNAS 97 : 5492-5497,2000).

Rekombinante Salmonella prophylak-tic 백신으로 바이러스 감염 (HPV), 감염 (Benyacoub et al., Infect Immun 67 : 3674-3679, 1999) 그리고 종양바이러스로 (HPV) 인해 불멸의 마우스종양을 치료하는데 효과적이었다 (Revaz et al,, Virology 279 : 354-360,2001). 체계적인 종양치료법을 위해 특별히 선택한 종양조직에 정착하는 Salmonella-집군을 골라냈다 (Murray et al J Bacteriol 183 : 5554-5564,2001). 이 Salmonella- 집군과 Escherichia coli 집군에 특정 엔자임에 대해 코드화된 뉴클레오티드 시퀀스를 주입하여 외부에 의한 GEDPT 박테리아 운반자를 성공적으로 생성할 수 있었다. 그리고 또한 생체 내 실험한 종양체계에 투입되었다 (Pawelek et al Cancer Res 57 : 4537-4544,1997).

감염조직 그리고 특히 종양조직은 강화되고 종양에서는 대체로 혼란스럽게 이뤄지는 Angiogenese를 보인다. 이 새로 생성된 혈관에는 용해물질 또는 미세물질이 침착할 수 있다. 즉, 분사범위가 좁아 비교적 긴 보일 때 그런 경우가 발생한다. 침착되는 것은 (또는 Passive Targeting이라고도 표현한다), 치료방법에 사용할 수 있다 (Sedlacek, Critical reviews in Oncology/Hematology 37 : 169-215,2001).

개발의 기술적인 문제는 번식성 질병치료, 특히 종양치료에서 의학적인 성분을 제시하여 최고의 효과를 나타내주는 것이다.

기술적인 문제를 해결하는데 있어 개발품은 게놈에 다음의 요소들을 주입하여 실험할 수 있는 enveloped 미생물을 내놓았다: 1) 직접 또는 간접, 번식하지 않거나 세포독 효과가 있는 익스프레션 결과물 또는 다양한 익스프레션 결과물을 위해 코드화된 뉴클레오티드 시퀀스, II) 혈액플라스마단백질을 위해 미생물 안에서 활성화시킬 수 있는 활성화시퀀스를 코드화시키거나 본질적으로 활성화된 뉴클레오티드 시퀀스, III) 선택적으로, 세포 특유의 리간데를 위해 미생물 안에서 활성화시킬 수 있는 활성화시퀀스를 코드화시키거나 본질적으로 활성화된 뉴클레오티드시퀀스, IV) I)과 II) 그리고 선택적으로 III) 구성성분의 익스프레션 결과물을 미생물의 외벽에 익스프레션 하거나 구성성분 I)의 익스프레션 결과물 그리고 구성성분 II) 및 선택적으로 III)의 익스프레션의 분비효과를 내거나 본질적으로 활성화시키는 운반시스템을 위한 뉴클레오티드 시퀀스, V) 선택적으로 모세포의 Cytosol에 있는 미생물의 Lyse의 단백질을 위한 뉴클레오디트 시퀀스 그리고 Lyse화 된 미생물 내에 세포 안으로 적어도 하나 이상의 구성성분 I)을 포함하고 있는 플라스미드를 방출하기 위한 뉴클레오티드 시퀀스, 마지막으로 Vl) 미생물에서 활성화 시킬수 있으며 조직세포 특유의, 종양세포 특유의, 기능별로 또는 세포 특유가 아닌 활성화시퀀스를 구성성문 I)을 표현한다.

이 때 구성성분 I)에서 VI)는 한번 또는 여러 번, 균등하게 또는 다양하게 표현될 수 있다.

발명된 것에서는 enveloped 미생물이 유전자 정보를 운반하고 enveloped 미생물을 Prophylaxe와 번식성 질병의 치료에 사용된다고 설명했다. 다음의 경험과기술적인 발전에 발명품이 기인한다.

발명의 대상은 enveloped 미생물로 번식성 질병을 치료하는데 사용하는 뉴클레오티드 씨퀀스 운반체다. 이때 미생물에 다음의 구성성분을 첨가했다: I) 적어도 하나의 뉴클레오티드 시퀀스. 이 뉴클레오티드 시퀀스는 적어도 하나의 직접 또는 간접, 번식하지 않는 또는 세포독성효과의 익스프레션 결과물을 위해 코드화되었다. II) 적어도 하나의 혈액 플라스마 단백질을 미생물에서 활성화시킬 수 있는 활성화시퀀드가 코드화되어 관리되는 뉴클레오티드 시퀀스, III) 선택적으로 적어도 하나의 뉴클레오티드 시퀀스, 적어도 하나의 미생물을 활성화시킬 수 있는 활성화 시퀀스가 암호화된 세포 특유의 리간데를 위한 뉴클레오드 시퀀스, IV) ) I)과 II) 그리고 선택적으로 III) 구성성분의 익스프레션 결과물을 미생물의 외벽에 익스프레션 하거나 구성성분 I)의 익스프레션 결과물 그리고 구성성분 II) 및 선택적으로 III)의 익스프레션의 분비효과를 내거나 본질적으로 활성화시키는 운반시스템을 위한 뉴클레오티드 시퀀스, V) 선택적으로 모세포의 Cytosol에 있는 미생물의 Lyse의 단백질을 위한 뉴클레오디트 시퀀스 그리고 Lyse화 된 미생물 내에 세포 안으로 적어도 하나 이상의 구성성분 I)을 포함하고 있는 플라스미드를 방출하기 위한 적어도 하나의 뉴클레오티드 VI) 적어도 하나의 미생물에서 활성화시킬 수 있는 또는 조직세포 특유의, 종양세포 특유의 또는 세포특유가 아닌 활성화 시퀀스를 구성성분을 표현하기 위해 :

구성성분 I : 구성성분 I)은 적어도 하나의 직접 또는 간접, 번식을 하지 않는 또는 세포독 효과를 가지고 있는 익스프레션 결과물에 대해 코드화된 뉴클레오티드 시퀀스다. 발명에 의해 생성되는 직접 번식을 하지 않는 효과의 익스프레션 결과물은 예를 들어 IFN-alpha, IFN-gamma, IFN- ss와 같은 인테페론, 면역세포와 종앙세포를 죽이는 IL-10, IL-12와 같은 Interleukine, proapoptotische Peptide 또는 TNF-alpha와 같은 단백질, FAS- Ligand, TNF-related apoptosis Inducing Ligand (TRAIL)와 같은 proapoptotische Peptide 또는 단백질, 면역세포, 종양세포 또는 종양이 생성된 세포를 죽이거나 세포에 독성을 주는 항체 또는 항체 조각들이다. 예를 들어 그 항체들은 i) 종양과 연관되어 있거나 종양인 안티 유전자, ii) Lymphozyten 위의 안티 유전자: 예를 들어 T-Zellrezeptor, B-Zellrezeptor, CD40Liganden을 위한 Rezeptor (B7.1 또는 B7. 2), IL-1,-2,-3,-4,-5,.-6,- 7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14,-15 또는-16와 같은 Interleukin을 위한 Rezeptor, Interferon을 위한 Rezeptor 또는 예를 들어RANTES,MCAF, MIP-alpha,MIP-ss, IL-8,MGSA/Gro, NPA-2 또는 IP-10와 같은 Chemokin을 위한 Rezeptor를 반대한다, iii)조직특유의 안티 유전자. 예를 들어 다음 세포에 대해 조직특유의 안티유전자를 반대한다. 유선, 신장, 모반, 전립선, 갑상선, 위점막, 난소, Cervix, 방광점막, 번식하지 않는 단백질, 예를 들어 Retinblastomprotein (pRb = p110)

또는 유사한 p107과p130 단백질 또는 이런 단백질의 번식력이 없는 변종. p53 단백질, 아나로그 단백질 또는 이런 단백질의 번식력이 없는 변종, p21 (WAF-1) 단백질, p27 단백질, p16 단백질, GAAD45 단백질, Bc12 집단의 번식력이 없는 단백질, 예를 들어 bad 또는 bak, zytotoxische 단백질 (Perforin, Granzym, Oncostatin, antisense RNA 또는 Ribozym), 세포의 성장이나 번식에 참여하고 있는NA, 예를 들어 특별히 RNA, Rezeptor에 대해 코드화 됨, 시그널을 전달하는 엔자임, 세포사이클에 참여하고 있는 단백질, Transskriptionsfaktor 또는 전달단백질을 위해. 간접적으로 번식력이 없는 효과의 단백질들은 만성 감연과 면역반응을 유도한다. 예를 들어 RANTES (MCP-2)와 같은 Chemokin, Monocyte chemotactic and activating factor (MCAF), IL-8, Macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1-alpha,-ss), Neutrophil activating Protein-2 (NAP-2), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5와 같은 Interleukine, Human Leukemia inhibitory factor (LIF), IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, GM-CSF, G-CSF, M-CSF와 같은 Cytokine, 세포독 물질에서 아직 활성화되지 않은 세포독 물질의 이전단계를 활성화시키는 엔자임. 이 엔자임은 Oxydoreduktase, Transferase, Hydrolase 또는 Lyase다.

이러한 효소들에는 베타-글루크로니다제, 베타-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 글루코시다제, ADH, 락토페록시다제, 유로키나제, TPA 카르복시 펩티다제, 시토신 데미나제, 디옥시시티딘 키나제, 티미딘 키나제, 리파제, 산성 포스파타제, 알칼리 포스파타제, 키나제, PNP, 글루코즈 옥시다제, 락토페록시다제, 락타톡시다제, 페니실린-V-아미다제, 페니실린-G-아미다제, 리소좀, 베타 락타마제, 아미노펩티다제, 카르복시펩티다제 A, B 혹은 G2, Nitroreduktase, 사이토크롬 p450 옥시다제가 있다.

발명에 따르면 효소는 바이러스, 박테리아, 효모, 연체동물, 곤충 혹은 포유동물로부터 생성된다. 특히 인간으로부터 생성된 효소가 선호되어 사용된다. 발명에서 선호되는 핵산가설은 특정세포 리간드의 세포융합생성물을 위해 효소와 함께 기호화하는 것이며 그리고/혹은 angiogenese를 억제하는 단백질, 예를 들면 플라스미노젠 활성자 저해자1(PAI-1), PAI-2 혹은 PAI-3, 앤지오스타틴 혹은 엔도스타틴, 알파 인터페론, 베타 인터페론, 혹은 감마 인터페론, 인터루킨 12, 혈소판인자 4, 트롬보스폰딘-1, 혹은 트롬보스폰딘-2, 베타 TGF, 알파 TGF 혹은 감마 TGF, VEGI이다. 발명에 따르면 구성요소(성분은) I은 하나 혹은 여러 뉴클레오티드 서열을 나타내고 하나 혹은 여러 개를 똑같이 혹은 다르게, 직접 혹은 간접 번식하지 않는 혹은 세포에 유독한 단백질을 기호화할 수 있다. 추가적인 상승작용을 제시하는 단백질 결합이 선호된다. 추가 혹은 상승효과는 가령 다음의 동일하게 효력을 발휘하지 않는 단백질의 결합에서 기대될 수 있다. 세포에 유독한 단백질과 proapoptotic 단백질, 효소 그리고 세포에 유독한 그리고/혹은 proapoptotic 단백질, antiangiogenetic 단백질 그리고 세포에 유해한 그리고/혹은 proapoptotic 단백질, 염증 유도물질과 효소 혹은 세포에 유해한 proapoptotic 단백질 그리고/혹은 antiangiogenetic 단백질이 바로 그것이다.

구성요소 II : 구성요소 II는 뉴클레오티드 서열로서 적어도 하나의 혈장 단백질에 미생물에서 활성화될 수 있는 활성화 서열을 기호화한다. 선호되는 것은 인체의 혈장 단백질이다. 특히 24시간 이상의 중간정도의 혈액지속시간을 제시하는 현장 단백질이다. 여기에는 특히 Albumin (Nukleotide 1-2258, Hinchliffe et al, EP 0248637-A, 9.12.1987), Transferrin (Nukleotide 1-2346, Uzan etal, Biochem Bio- phys Res Commun 119 : 273-281 (1984) ; Yang et al, PNAS-USA, 81 : 2752-2756 (1984), Caeruloplasmin (Baranov et al, Chromosoma 96 : 60-66, (1987), Haptoglobin (Nukleotide 1-1412, Raugei et al, Nucleic Acids Res 11 : 5811-5819, (1983) ; Yang et al,PNAS-USA 80 : 5875-5879, (1983) ; Brune et al, Nucleic Acids Res 12 : 4531-4538 (1984), Haemoglobin alpha (Nukleotidel-576 ; Marotta et al, PNAS-USA 71 : 2300-2304 (1974) Chang et al, PNAS-USA 74 : 5145-5149 (1977), Haemoglobin ss (Nukleotide 1-626 ; Marotta et al, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 19 : 165-175(1976) ; Marotta et al,J Bil Chem 252 : 5019-5031(1977), alpha2Macroglobulin (Nukleotide 1-4599 ; WO 9103557-A, 21.03. 1991)이 포함된다. 그 밖에도 다른 혈장단백질 가령 Alphal Lipoprotein, Alpha2 Lipoprotein, ssl Lipoprotein이 포함된다. 발명에 적합한 미생물을 통한 이러한 혈장단백질들 중 적어도 한 개에 대한 표시는 미생물이 체계적 주입에 따라 특히 혈액순환체계에의 주입 후 - 소량의 식세포에 수용되고 그럼으로써 혈액내에서 더 오래 지체되고 종양 혈관계 혹은 만성적인 염증이 있는 혈관으로 축적될 수 있다.

구성요소 III : 구성요소 III 은 뉴클레오티드 서열로서 특정세포 리간드를 위해 미생물에서 활성화될 수 있는 활성화 서열 하에 기호화한다. 이러한 리가드의 특징은 증식될 수 있는 질병의 종류에 의존적이다. 이 질병들에는 미생물이 사용되며 치료효과를 목적으로 하기 위해 구성요소 I이 미생물 내에서 세포나 조직과 접촉되어야 한다. 따라서 예를 들어 종양 질환에서는 종양세포를 전문으로 하는 리간드가 사용된다. 즉, 각종 종양이 발생하는 종양과 연관있거나 특정 종양 항원 혹은종양내피세포 혹은 조직세포, 예를 들어 갑상선, 전립선, 난소, 유선, 신장, 위점막, 모반, Cervix, 방광 세포에는 이를 전문으로 하는 리간드가 사용되며 만성 염증, 세포와 관련한 자동면역 질환과 이식장기의 거부의 경우는 마크로파지, 질산세포, T리포좀 혹은 활성화 endothel 세포에 전문인 리간드가 사용된다. 이러한 리간드는 가령 특정 항체나 항체의 항원 연결된 조각, 성장인자, Interleukine, Cytokine 혹은 세포유착분자로서 종양세포, 백혈병세포, 종양 endothel 세포, 조직세포, 마크로파지, 질산세포, T리포좀 혹은 활성화 endothel 세포에 선택적으로 연결된다.

구성요소 IV : 구성요소 IV는 뉴클레오티드 서열로서 운송체계를 기호화하며 미생물의 표면에 구성요소 I), II) 혹은 III)의 표시를 가능하게 한다. 각각의 구성요소는 여기서 선택적으로 분비되거나 미생물 막 즉, 막 위에서 표현되어야 한다. 구성요소 II) 와 III) 은 특별이 막 위에서 표현된다. 이러한 운송체계는 가령 E. Coli 용혈운송기호 이다.

다음의 운송기호가 사용될 수 있다: 분비에서는 HlyB und HlyD의 존재, 단백질 C-terminale HlyA-운송기호; 막 위에서의 표현은 C-terminale HlyA-Transportsignal, HlyB-단백질 존재; Hamolysin운송기호 von E. coli (특정 hly 박테리아 촉진 하의 HlyA, HlyB und HlyD 함유의 뉴클리오티드 서열) ; Caulobacter crescentus 의 S- layer 단백질을 위한 (Rsa A) 운송기호; 분비와 막 위에서의 표시를 위한 C- terminale RsaA-운송기호 (Umelo-Njaka et al Vaccine, 19 : 1406-1415,2001) ; Escherichia coli과 Gent- schev et al의 TolC- 단백질을 위한 운송기호; 막 위에서의 표시를 위한 N- terminale 운송기호.

구성요소 V) : 구성요소 V) 는 뉴클레오티드 서열로서 적어도 하나의 lytic 단백질을 기호화하며 포유류 세포의 Cytosol에서 표현되고 숙주세포의 Cytosol 에서의 Plasmide 배출을 위해 미생물을 세포융해 한다. 이러한 세포융해성 단백질은 예를 들어 Listerien-specific Lysis-단백질과 같은 PLY551 (Loessner et al Mol Micro- biol 16 :1231-41, 1995), listeric Promoter 하의 Listeria-specific Holin 이다. 이러한 발명에 있어서 선호되는 수행방식은 다양한 구성요소 V)의 결합이다. 가령, Holin 과 Lysis-단백질의 결합이 그것이다.

구성요소 VI) : 구성요소 VI) 은 임의의 활성화 서열을 나타내는데, 이는 구성요소 I)의 표시를 제어한다. 미생물 표면의 구성요소 I) 의 표시를 위해 구성요소 VI)는 전문가에게 잘 알려진 것 중 하나이며, 박테리아 내에서 활성될 수 있는 활성화 서열이다. 이러한 활성화 서열에는 가령 본질적인 활성 Promotorregionen 즉 Promotorregion 과 beta-lactamase Gens von E. coli 의 "Ribosomal binding site" (RBS) 혹은 destetA gens (Busby and Ebright, Cell 79 : 743-746., 1994), 유발될 수 있는 Promotoren, 선호되는 Promotoren이 있으며, 이들은 세포에 수용되면 활성화된다. 끝으로 L. Monocytogenes의 actA Promoter (Dietrich etal., Nat. Biotechnol. 16 : 181-185,1998) 혹은 S. monocytogenes 의 derpagC Promoter(Bumann, Infect Immun 69 : 7493-7500., 2001)가 포함된다. 특히 활성화 서열 중에는 목표세포의 Zytosol에서 박테리아를 옮기는 것들의 Plasmide 배출이 이 세포에서 활성화되는 활성화 서열이 선호된다. 예를 들어 CMV-Enhancer, CMV-Promoter, SV40 Promoter 혹은 전문가에게 알려진 Promoter- 혹은 Enhancer-서열이 적용될 수 있다. 더불어 특정세포 혹은 특정기능의 활성화 서열이 선호된다. 특정세포 혹은 특정기능의 활성화 서열에 있어서의 선택은 세포나 조직 에 의해 좌우된다. 이들 세포나 조직은 박테리아를 옮기거나 박테리아를 옮기는 것으로부터 배출된 Plasmide로 구성요소 I)을 표시되어야 한다. 이러한 활성화 서열은 가령 종양 세포와 관련된 활성화 서열이며 (여기에는 Gene fidkine, GRP, TCF-4,MUC-1, TERT, MYC-MAX, surfactant Protein, alpha-Fetoprotein, CEA, Tyrosinase, Fibrillary acidic Protein, EGR-1, GFAP, E2F1, basischesMyelin, alpha-Lactalbumin, Osteocalcin,Thyroglobulin undPSA 의 활성화 서열이 포함되어 있다 (McCormick Nature Reviews Cancer 1 : 130-141, 2001) ), endothel 세포특유의 액티베이터 시퀀스 (이 시퀀스에는 단백질을 위한 유전자 액티베이터 시퀀스가 속한다. 이 중

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Endothel 세포를 실험에 사용하는 것을 선호한다 (Sedlacek, Critical Reviews in Onco-logy/Hemtology 37 : 169-215,2001) 예를 들어 VEGF, 뇌 특유의 endothelialer Glucose-1-Transporter, Endoglin, VEGF-Rezeptoren, 특히 VEGF-R1, VEGF-R2 그리고 VEGF-R3, TIE-2, PDECGF-Rezeptor-en, B61, Endothelin-1, Endothelin B, Mannose-6-Phosphat-rezeptoren,VCAM-1 그리고 PECAM-1), 단백질을 위한 유전자 활성화 시퀀스, 이 단백질은 특히 종양에 걸린 환자에서 얻은 조직세포 안에서 실험된다, (여기에는 가슴조직 세포에서 실험되는 단백질이 속한다 (예를 들어 MUC-1, alpha-Lactalbumin), 갑상선 (예를 들어 Thyroglobulin), 전립선 (예를 들어 Kallikrein-2, Androgen-Rezeptoren, PSA), 난소, 모점 (예를 들어 Tyrosinase), 그리고 신장 세포에서 실험되는 단백질이 속한다), Makrophagen, Dentritischen Zellen 또는 Lymphozyten에 분비되는 단백질을 위한 유전자 활성화 시퀸스, 예를 들어 Interleukine, Cytokine, Chemokine, Adhions-moleke, Interferone, Interleukine을 위한 Receptor, Cytokine, Chemokine, 또는 Interferone, Hypoxie에서 활성화 되는 활성화 시퀀스, 예를 들어 VEGF 또는 Erythropoietin을 위한 활성화 시퀀스.

구성요소 I)에서 VI)까지 미생물에 주입시키는 것은 전문가가 잘 알고 있는 분자실험 방법으로 이뤄진다. 예를 들어 박테리아를 운반체로 사용하는 것, 즉 구성성분을 알맞은 플라스미드에 주입시키고 그 플라스미드를 다시 박테리아에 넣는 방법은 전문가들이 잘 알고 있는 방법이다.

발명에 따라 미생물들은 환자들에게 종양, 백혈병 또는 만성 감염, 자주면역질병 또는 이식 기관의 거부반응과 같은 번식성 질병의 예방 또는 치료에 투입된다.

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이러한 질병을 치료하기 위해 발명된 미생물들은 적절하게 준비하여 직접 질병의 위치에 또는 예를 들어 혈액순환계, 신체 내부, 기관, 관절 또는 결체조직에 체계적으로 투입된다.

체계적으로 투입 시 특히 혈액순환에 미생물들을 투입할 때 미생물들이 소위 말하자면 retikuloendotheliale 체계를 통한 원하지 않은 미생물 흡수로 구성성분II)의 효능이 감소하는 것을 피하기 위해, 그리고 혈액 속에 미생물들이 장기간 생존하게 하기 위해, 미생물을 혈액에 장기간 생존할 수 있는 여러 성분들 용액에 담가놓는다. 현탁액은 잠복기가 있다. 미생물의 현탁액과 잠복기는 예를 들어 혈장이나 혈청에서 이뤄질 수 있다. 현탁액과 잠복기는 그러나 성분들 용액 또는 다양한 성분들 용액에 치루는 것이 선호된다. 그렇게 되면 더욱 오래 혈액 속에 생존할 수 있게 된다. 그 성분들로는 예를 들어 Albumin, Transferrin,Prlbumin,Ho- globin, Haptoglobin,Alpha-1-Lipoprotein, Alpha-2-Lipo- protein,ss-1-Lipoprotein, alpha-2-Macroglobulin, Polyethylenglykol (PEG), Poly- ethylenimine, Dextrane, Polygeline, Hydroxyethylstke와 같은 천연 또는 합성 Polymere로 이뤄진 PEG 결합물이 있다..

이와 같은 용액에 담가놓고 잠복기를 가짐으로 발명된 미생물의 표면에 성분들이 흡수된다. 이 성분들로 미생물들을 씌우는 것은 그러나 접합으로도 이뤄질 수 있다. 접합의 방법은 Sedlacek et al Contributions to Oncology 32 : 1-132,1988에 잘 설명되어 있다.

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흡착을 이용한 코팅은 예를 들어, 주로 섭씨 4도씨에서 주로 10 분 ∼ 24 시간에 걸쳐 주로 0.1 ∼ 50 % 까지의 코팅 물질로 이루어진 용액 내 미생물의 부유를 통해 이루어진다.

본 발명에 따라 미생물로는, 전염성을 약화시킨 박테리아가 선호된다.

이 밖에도 Escherichia coli, Salmonella enterica, Yersiniaenterocolitica, Vibrio cholerae, Listeria monocy- togenes, Shigella 등의 박테리아를 선택한다.

본 발명의 범위 내에서 미생물은 특히 살아있거나 잔류하는 미생물의 멤브란껌질을 의미한다. 이런 종류의 멤브란 껌질은 예를 들어 EPA 0540525 에 따라 만들어진다.

본 발명의 대상은, 발명에 따른 미생물과, 세포 증식 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 의약품 조제의 이용을 포함하는 의약품 조제이다.

본 발명의 범위에서 말하는 세포 증식 질환은 과도하거나 통제가 되지 않는 세포 증식 질환, 예를 들어 악성 종양이나 악성 육종과 같은 암 질환, 백혈병, 만성 감염, 자율면역 질환, 또는 장기 이식 거부반응 등을 의미한다. 질환의 예방 또는 치료를 위해서는 본 발명에 따른 미생물을 의약품 조제 과정에서 주로 100 ~ 1억 개에 이르는 병원균 용량으로 환자에게 국부 또는 전신 처방한다.

또는 여러가지 분자 전술한 바와같이 가져올수 있다. 여기서, 기하학적인 피복정도 0.001과 1사이에 특히 0.01과 1사이 예를들면 0.1과 1사이에 놓여 있을 수 있다. 상기 기하학적인 또는 피복정도는 모든 분자의 전체면적의 비율로부터 미생물의 표면예서 반경방향의 돌출부에서의

477 bps Fragment는 NsiI의 소화된다 그리고 NsiI 소화된 Vektor pMOhly DD는 HlyA Gen 프레임에 투입된다. 이렇게 생성된 벡터 pMODD-fas (Fig. 6) 살모넬라군집으로의 Transformation을 생성한 다음 세포막의 Fas-Fragment를 만들어낸다. 이것은 적절하게 처리하면 FasL exprimierend 세포를 결합시킬 수 있다.

Enveloped란 의미는 미생물의 외벽에 동일하거나 다양한 분자 (하나 또는 여리 성격 I)에서 III)에 의거하여 표현되거나 분비된)가 전에 묘사된 바와 같이 부착될 수 있다는 것이다.

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이때 기하학적인 코팅정도는 0,001에서 1, 특히 0,01에서 1, 예를 들어 0,1에서 1 일 수 있다. 기하학적인 코팅정도는 모든 분자들의 전체 면적 수치로 계산될 수 있다. 반지름 (미생물의 중앙점을 기준으로) 투사로 미생물의 표면으로 그리고 미생물의 표면 수치로 계산한다. 일반적으로 단순하게 미생물의 표면이 구라고 전제하고 미생물의 덩치를 계산한다. "enveloped"라는 성격은 경우에 따라 자유로이 선택할 수 있는 것이다.

실시예 :

예 1 : Humanem Albumin과 Beta-Glucuronidase의 외벽이 튼튼한 Expression을 위한 박테리아 군집의 구조

이 예에서는 박테리아 군집 St21-bglu 을 얻는 방법이 묘사되어 있다. 약화된 Salmonella typhi Ty21a 군주는 (사람에 사용하는 운반박테리아로 허용됨) E.coli의 Hly Sekretionsmaschinerie의 도움으로 사람의 Beta-Glucuronidase 의 외벽이 튼튼한 주입단백질과 HlyA 그리고 사람의 Albumin과 HlyA를 표현한다. 구성은 이미 발표된 Plasmiden pMOhlyl (Gentschev etal., Be- hring Inst Mitt 57-66,1994)과 pGP704 (Miller andMekalanos, J Bacteriol 170 : 2575-2583,1988)에기반을 두고 있다. 군집은 수동적인 타게팅으로 (Bermudes etal., Adv Exp Med Biol 465 : 57-63,2000) 종양에서의 Beta-Glucuronidase, 그리고 이로써 Beta-Glucuronidase로 활성화 시킬 수 있는 Pro-Drugs의 종양조직 위의 제한된 분리를 축적할 수 있다.

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외벽이 튼튼한 Expression은 Salmonellen균에서 단백질을 HlyA Sekretionsprotein의 C-terminus에 HlyB Protein이 있을 때 또는 완전히 기능하는 HlyD Protein이 없을 때 주입할 수 있다. 그러나 HlyD가 완전히 없어서는 안된다. 왜냐하면 그렇게 되면 Sekretionsmaschinerie와 ToIC Protein 사이에 외벽이 제대로 형성되지 못하기 때문이다 (Spreng etal., Mol. Microbiol. 31 : 1596-1598, 1999).

이 예에서는 외벽이 튼튼한 Expression의 가능한 HlyD Protein 변종이 제시되었다. 우선 기능적인 HlyD Protein이 생성되지 않는 벡터 pMOhly DD가 구성된다.

그러기 위해 Endonukleasen DraIII과 ApaI에 의해 Vektor pMOhlyl로부터 hlyD 유전자의 일부분을 제거한다.

Restriktion 소화 다음 끝부분들은 3'-5' Exonuklease으로 소화시킨다. 그리고 10923 bps 크기의 조각들을 없앤다. 다음으로 벡터에서 Beta- Glucuronidase 유전자를 hlyA 유전자로 복제한다. 이를 위해 cDNA Bank로부터 bglu의 cDNA (GenBank Accession (Gb) : M15182) 다음의 Primer를 Polymerase연쇄반응으로 (PCR) 확장한다 :

bglu5' : ATGCATTGCAGGGCGGGATGCTGTACC

bglu3' : ATGCATAAGTAAACGGGCTGTTTTCCAAAC.

beta-Glucuronidase의 cDNA 상호보완적인 부분들은 밑줄을 그었다. 생성된 Nsil 부분들은 이탤릭체로 표현됐다. (이 표현을 앞으로 계속 적용했다; Oligonukleotid 시퀀스도 표시됐다. 또한 5'-3'에서도 묘사됐다. Primer는 유전자가 시그널 시퀀스 없이도 확장될 수 있도록 선택했다.

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생성물 (1899 bps)을 적절한 "PCR Cloning Kit"로 하위복제했다. 그리고 Nsil Verdaudas-1890 bps를 통해 조각들을 Fragment 뽑아냈다. 다음으로 NsiI Fragment를 NsiI에 자른 Vektor pMOhly DD에 복제한다. 결과는 Vektor pMO DDbglu다(Fig 1). (Nsil Fragment를 NsiI에 자른 Vektor pMOhlyl로 복제하면, 플라스미드 pMO bglu가 생성된다. 이 플라스미드는 주입 단백질의 분비를 허용한다). 두번째 부분에서는 Albumin-HlyA Fusion의 염색체 완성을 위해 완성벡터를 생성한다. 한번에 VektorpMOhly alb 생성한다. pMOhlyl 기반의 벡터는 Albumin-cDNA와 HlyA유전자 Fusion을 포함하고 있다. 복제에는 Albumin-유전자의 cDNA를 (Gb: A06977)구입할 수 있는 cDNA Bank에서 PCR와 이어 Nsil을 생성하는 Primier의 도움으로 확장한다 : 5' : ATGCATGGGTAACCTTTATTTCCCTTC3': ATGCATAGCCTAAGGCAGCTTGACTTG-1830 bps 크기의 조각은 하위복제된다 그리고 이어 Nsil과 잘라진다. 1824 bps 조각은 NsiI 안에서 소화된 pMohlyl과 묶여진다. 완성된 플라스미드 pMOhly alb 는 이로써 HlyB, HlyD 그리고 Albumin과 HlyA로 된 Fusion 단백질을 표현한다. 체류기간에 대한 실험을 위해 Nsil 조각들을 대안적으로 벡터 pMO DD에 투입할 수 있다. 이 벡터의 이름은 pMO DDalb이다. 계속적으로 이미 묘사된 복제전략의 변형과정을 Salmonella 염색체에 Integration하기 위해 사용된다 (Miller and Mekalanos, J Bacteriol 170 : 2575-2583,1988). 이에 대해 우선 Salmonela의 aroA 유전자플 벡터 pUC18에 복제한다 (다음의 Primer의 PCR로 :

Primer5' :ATGGAATCCCTGACGTTACAACCC,

Primer3' :GGCAGGCGTACTCATTCGCGC

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1281 bps 조각을 pUC18의 HincII 슬롯에 "Blunt" 복제). 다음으로 HincII Verdau와 묶음을 통해서 341 bps 크기의 aroA에 있는 조각을 제거한다. 이 벡터는 pUC18aroA'라고 불린다. 이어 alb-hlyA Fusion 유전자를 pMOhly에 있는 Promotor 시퀀스와 함께 벡터 pUC18aroA'로 복제한다. Vektor pMOhly alb는 AacII와 SwaI로 소화되고 3'-5'Exonuklease로 처리한다. 3506 bps 크기의 Blunt 조각을 배출하고 Hin- cII에 소화한 pUC18aroA'에 묶는다. 이렇게 해서 벡터 pUCaro-alb가 생성된다. 다음으로는aroA로 둘러싼 alb-hlyA 조각들을 전체 활성화 시퀀스와 함께 벡터 pUCaro-alb로부터 벡터 pGP704로 복제한다. 이 과정에서 pUC aro-alb를 HindIII와 소화시키고 5'-3' Exonuklease로 처리한다 (Blunt). EcoRI와 소화시키고 4497 bps 조각을 EcoRI/ EcoRV (Blunt)에 소화한 벡터 pGP704 (EcoRI/RV Fragment : 6387 bps)와 묶는다. 결과는 Integration 벡터 pGParo-alb다 (Fig. 2). 벡터를 E. coli 군집 SMl0lpir 에 전이시킨다. 이 박테리아 군집은 벡터를 복제할 수 있게 해준다.이유는 복제에 필요한 p-단백질을 생성하기 때문이다. 벡터를 이제 접합을 통해 벡터의 복제를 허용하지 않는 수용 군집 Salmonella typhi Ty21a에 전달한다. 따라서 Tetrazyklin-Selektion을 통해 벡터를 염색체에 포함하고 있는 박테리아들만 선택한다. Zytoplasmatic Albuminproduktion 검사는 박테리아 Lysat의 WESTERN-Blot 분식을 통해서 이뤄진다. 군집 St21-alb는 alb-hlyA Fusion을 표현하기는 하나 이 형태에서 분비할 수도 외벽을 튼튼하게 표현할 수도 없다. 외벽이 튼튼한 Expression을 위해서는 추가로

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기능적인 HlyB (예를 들어 pMO DDbglu) 또는 기능적인 HlyB와 HlyD (예를 들어 pMO bglu)가 있는 플라스미드가 포함되어 있어야 한다.

이 예에서는 플라스미드 pMO DDbglu를 군집 St21-alb와 사용했다. 그 결과 군집 St21-albpM0 DDbglu가 생성됐고, Hly Sekretionssystem의 도움으로 인간의 humanes Albumin 및 인간의 beta-Glucuronidase를 외벽이 튼튼하게 표현할 수 있게된다. 이 군집은 Pro- Drug Konversion으로 환자에게 투여될 수 있다.

예 2 : Albumin-HlyA Fusion으로 enveloped된 박테리아 군집의 구성,

인간의 humaner Beta-glucuronidase 유전자 정보를 운반하기 위함.

이 예에서 제시된 박테리아 군집은 사람의 Beta- Glucuronidase에 대해 코드화된 DNA를 수동적인 Targeting의 도움으로 종양세포로 운반하게 된다. 그 다음 종앙세포에서 표현된다. 특히 쉽게 다룰 수 있는 군집을 얻기 위해서 이 예에서는 Albumin의 외벽 Expression을 위한 예1과 같이 쉽게 변형된 군집을 사용했다.

이때 Albumin-HlyA을 위해 코드화된 유전자와 HlyB를 위한 정보를 염색체에 표함시킨다. 이렇게 군집 본질적이고 외벽이 튼튼한 Albumin이 표현된다.

이런 목표에 달성하기 위해 위에서 언급한 벡터 pMOhly alb를 BsrBI와 EcoRI로 소화시킨 다음 5'-3'Exonuklease로 처리한다. 소화과정에시 Blunt-끝이 있는 5815 bps 크기의 조각이 생성된다. 이 조각은 완전한 prokaryotic 활성화 시퀀스와 유전자 hylC, alb-hlyA 그리고 hlyB을 포함하고 hlyD은 포함하고 있지 않다. 조각은 Blunt를 위에서 언급한 벡터 pUC18aroA'의 HincII 슬롯에 넣을 수 있게 된다.

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이 과정에서 벡터 pUCaro-alb-B가 생성된다. EcoRI-NruI 소화의 6548 bps 조각을 다시 EcoRI-EcoRV에 소화한 벡터 pGP704에 넣을 수 있게 된다 (Fig. 3). 그 다음 과정 (복제와 S. typhiTy21a에 Integration)은 위에서 언급한 전략과 동일하다. 이 과정에서 생성된 군집 St21-alb-B는 본질적으로 외벽이 튼튼한 Albumin-HlyA Fusion 단백질을 표현한다. HlyD 코드화된 벡터가 전이되면, Albumin-HlyA Fusion 단백질이 분비된다. Beta- Glucuronidase 코드화된 DANN의 전달을 담당하는 플라스미드는 상업적인 벡터 pCMVbeta (Clontech)에 기반을 두고 있다. 구성을 이루기 위해서는 우선 bglu 유전자를 Sekretion 시그널과 Fusion을 해아 한다. 이 예에서 tPA Precursor 분자의 Signalpeptid를 사용하게 된다.

Signalpeptid로 특별히 효율적으로 Fusion 단백질을 생성하고 분비할 수 있다. Fusion의 복제를 위해서 한번에 tPAcDNA (Gb E02027)의 5'UTR를 Signalpeptid 코드화된 부분의 끝까지 다음의 Primer를 PCR로 확장한다 (확장은 "Blunt" 생성하는 Polymerase로) :

5' : GCGGCCGCAGGGAAGGAGCAAGCCGTGAATTT

3' : AGCTTAGATCTGGCTCCTCTTCTGAATC

생성된 166 bp 조각은 HindIII에 소화되고 5'-3' Exonuklease로 처리된 상업 Vektor pCDNA3 (Invitrogen)와 묶는다. 묶음은 "Forwad" 방량으로 이뤄진다. 이것으로 tPA 시그널 시퀀스 코드화된 부분이 NotI 소화로 완전히 생성된 플라스미드 pCDNAtp에서 꺼낼 수 있게 된다. 237 bps 조각은 벡터 pCMVbeta의 3760 bps 조각과 NotI 소화 다음에 (벡터 Backbone을 포함하고 있다) 묶여진다. 미성된 플라스미드 pCMVtp

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(3972 bps)는 이제 heterologer Fusion 단백질 Expression에 사용될 수 있다. 플라스미드 pCMV bglu의 생성을 위해 다음의 SpeI을 생성하는 Primer로 bglu 유전자 (Gb M15182)의 bps 조각을 (Signalpeptid에 대한 시퀀스 없이) 적절한 DNA은행에서 확장한다:

5': ACTAGTCAGGGCGGGATGCTGTACCCCCAG

3' : ACTAGTCTTGCTCAAGTAAACGGGCTGTTTTC.

SpeI 소화 후 1899 bps 조각을 SpeI 소화된 벡터 pCMVtp와 묶는다. 생성된 플라스미드 pCMVtp bglu는 이제 tPA Signalpeptid의 N-terminale Fusion을 위해 코드화되었고, Beta-Glucuronidase의 mature 단백질 범위에 있다. 적절한 위치를 확인한 후 플라스미드 pCMVtp bglu (Fig. 4)를 군집 St21-alb-B에 전이한다. 이 군집은 DNA를 수동적인 Targeting으로 종양조직에 전달할 수 있다. 그리고 전이된 종양세포를 통한 DNA Expression은 적절한 Pro-Drug의 변환을 허용한다.

예 3 : Albumin-TolC Fusion으로 코팅된 군집을 FAS의 세포외 범위의 외벽이 탄탄한 Expression 구성과 ProDrug 변환된 엔자임의 운반

이 예에서 언급되는 군집은 예2에서 보여준 성격과 복합된다. 적절히 (종양)세포에 Targeting을 하여 Fas-Ligand (FasL)을 표현한다. 이 군집으로 예를 들어 특정한 흉부 종양과 같은 FasL 표현하는 종양세포들을 (IIerrnring etal., Histochem Cell Biol 113 : 189-194,2000) 공격할 수 있다. 종양세포를 통한 FasL Expression은

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잠재적인 면역 Escape 메커니즘으로 요구되었다. 왜냐하면 세포들이 능동적으로 공격하고 Fas를 표현하는 Lymphozyt를 제거할 수 있기 때문이다 (Muschen elal., J Mol Med 78 : 312-325,2000). 여기서 보여준 군집은 치료할 때 문제를 일으키는 종양세포를 정확히 공격하여 Apoptose 독립 메커니즘으로 제거할 수 있다.

운반군집은 이 예에서 Albumin과 E. coli의 TolC 단백질 결합물에 기반을 두고 있다. 이로써 Albumin의 외벽이 탄탄한 Expression을 이룰 수 있게 된다. Fas의 세포외 범위의 외벽이 튼튼한 Expression은 PlasmidpMOhlyDD로 이뤄지고 위에 언급된 플라스미드 pCMV-bglu 운반에 사용된다.

처음 수행하는 단계로는 TolC-Albumin을 표현하는 운반군집을 생성하는 것이다. 이에 대해 우선 Fusion 단백질 유전자를 생성한다. 그리고 이어 위에서 언급한예에서와 같이 PUCaroA'und pGP704에서 점차적인 복제를 통해 Salmonella 유전자에 포함된다. E. coli를 위한 전체 자연적인 Promotor를 포함하는 TolC 유전자는 플라스미드 pBRtolC에 있다. 이것은 다음의 Sall을 생성하는 Primer의 도움으로 벡터 pAX629로부터 (유전자 tolC를 포함하고 있다, 벡터의 범위는 Gb X54049 Pos. 18-1914에 해당한다) 확장됐다:5'tol :TAACGCCCTATGTCGACTAACGCCAACCTT,3'tol :AGAGGATGTCGACTCGAAATTGAAGCGAGA.

1701 bps 조각은 Sall invers와의 분리 후 벡터 pBR322 (Gb J01749)의 Sall 슬롯과 묶여진다. 이로써 tet 유전자가 중단된다. 잘 알려진 'TolC의 크리스탈 구조 때문에 (Koronakis etal., Nature 405 : 914-919., 2000) heterologer DANN를 tolC 유전자의 singulae KpnI 슬롯에 부착하는 것이 외부벽 위의 세포외 묶음에 있는 코드화된 heterologen Fusion 단백질의 Expression을 허용한다.

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Albumin을 표현하기 위해 dercDNA (Gb A06977)에서 Albumin 유전자를 다음의 Kpnl 생성하는 Primer의 도움으로 확장한다:5': GGTACCCGAGATGCACACAAGAGTGAGG3' : GGTACCTAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC.

1770 bps 조각의 KpnI 소화 다음 DNA를 KpnI 슬롯된 벡터 pBRtolC에 주입할 수 있게 된다. 반대의 방향성으로 (Frame에서 tolC로) 벡터 pBRtolC-alb가 구성된다. tolC-Albumin Fusion을 위한 유전자는 EcoRV와 PshAI (Fragment 3970 bps)를 통해 반대 방향으로 벡터 pUCaroA'l의 HincII 슬롯에 연결될 수 있다. 생성된 벡터 pUCaro-alb-tol (7596 bps)는 이제 HindIII과 일직선화되고, 5'-3'Exonuklease로처리되며 이어 EcoRI와 소화시킨다. 4961 bps 조각은 다음으로 EcoRI-EcoRV 소화된 벡터 pGP704에 투입된다 (Fig.5).

접합 후 (예 1에 의거하여) 군집 St21-tol-alb이 생성된다. 이제 플라스미드는 E. coli Typ I Sekretionsmaschinerie HlyB 구성성분의 도움으로 Fas (CD95)-HlyA Fusion 단백질의 외벽이 튼튼한 Expression이 된다. 이에 대해 우선 세포외 범위에 대해 코드화된 Fas 유전자 부분을 (Gb : M67454) 다음의 Nsil을 생성하는 Primer로 확장한다 :5' : ATGCATTATCGTCCAAAAGTGTTAATGC3' : ATGCATTAGATCTGGATCCTTCCTCTTTGC.

477 bps Fragment는 NsiI로 소화된다 그리고 NsiI 소화된 Vektor pMOhly DD는 HlyA Gen 프레임에 투입된다. 이렇게 생성된 벡터 pMODD-fas (Fig. 6) 살모넬라군집으로의 Transformation을 생성한 다음 세포막의 Fas-Fragment를 만들어낸다. 이것은 적절하게 처리하면 FasL exprimierend 세포를 결합시킬 수 있다.

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이로써 살모넬라는 예를 들어 종양세포와 같은 FasL exprimierend 세포에 활용될 수 있다.

FasL 종양세포를 죽이기 위해 Plasmid pCMV bglu (예 2)를 살로넬라에 투입된다. 위에서 언급한 예와 같이 종양세포를 통한 Beta-Glucuronidase Expression 후 ProDrug-Drug 종양치료가 가능하다. 앞서 언급한 예와 위에서 언급한 예를 비교했을 때 더 좋은 효능은 결정적으로 Fas의 extrazellulaere 도메인 접힘에 달려있다. Fas 대신 특유의 Fab-Fragmente monok- lonaler 항체를 (박테리아 안에서 정확히 접힌다) 여기에서 설명된 동일한 방법으로 사용해도 된다. 언급한 예에서 볼 수 있듯이 이 기술로 거의 모든 세포에 의해 적절한 특정 Fab-Fragmente 사용으로 집군을 구성할 수 있게 된다.

이로써 살모넬라는 예를 들어 종양세포와 같은 FasL exprimierend 세포에 활용될 수 있다.

FasL 종양세포를 죽이기 위해 Plasmid pCMV bglu (예 2)를 살로넬라에 주입된다. 위에서 언급한 예와 같이 종양세포를 통한 Beta-Glucuronidasc Expression 후 ProDrug-Drug 종양치료가 가능하다. 앞서 언급한 예와 위에서 언급한 예를 비교했을 때 더 좋은 효능은 결정적으로 Fas의 extrazellulaer 도메인 접힘에 달려있다. Fas 대신 특유의 Fab-Fragmente monok- lonaler 항체를 (박테리아 안에서 정확히 접힌다) 여기에서 설명된 동일한 방법으로 사용해도 된다. 언급한 예에서 볼 수 있듯이 이 기술로 거의 모든 세포에 의해 적절한 특정 Fab-Fragmente 사용으로 집군을 구성할 수 있게 된다.

Claims (19)

1. 피막성 미생물에 있어서,

   상기 피막성 미생물의 게놈 내에 다음 컴포넌트들이 삽입되고 발현될 수 있으며:

   I ) 직접적으로 또는 간접적으로, 항증식성 또는 세포독성적으로 활성인 반현 산물을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 다수의 상기 발현 산물,

   II) 상기 미생물 내에서 활성화될 수 있는 활성화 서열의 통제 하에서 혈액플라스마 단백질에 대하여 암호화하거나 또는 구성적으로 활성인 뉴클레오티드 서열,

   III) 선택적으로, 상기 미생물 내에서 활성화될 수 있는 활성화 서열의 통제하에서 세포-특이성 리간드에 대하여 암호화하거나 또는 구성적으로 활성인 뉴클레오티드 서열,

   IV) 상기 미생물의 외부 표면 상에서 컴포넌트 I) 및 II) 그리고 선택적으로 III) 의 발현 산물의 발현을 유도하거나, 또는, 컴포넌트 I ) 및 II) 그리고 선택적으로 III) 의 발현 산물의 분비를 유도하며, 바람직하게는 구성적으로 활성인 전달 시스템에 대한 뉴클레오티드 서열.

   V) 선택적으로, 포유류 세포의 시토졸 내에서 상기 미생물의 용해에 사용되고, 상기 용해된 미생물 내에 포함된 적어도 1 또는 그 이상의 컴포넌트 1 ) 및 IV) 를 가지고 플라스미드의 세포내 유리에 사용되는 단백질에 대한 뉴클레오티드서열,

   VI) 상기 미생물 내에서 활성화될 수 있고, 및/또는 컴포넌트 I ) 의 발현에 대하여, 조직-특이성, 종양 세포-특이성, 기능-특이성을 갖거나 또는 세포-특이성을 갖지 않는 활성화 서열,

   추가적으로, 컴포넌트 I ) 내지 VI) 중 어느 것이 일회 또는 수회 제공될 수 있고, 동일하거나 또는 상이할 수있는 것을 특징으로 하는 특징으로 하는 피막성 미생물.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 미생물은 바이러스, 박테리아 또는 단세포 기생충인 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 독성인자는 미생물을 감소시키는 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항에 있어서,

   상기 미생물은 그람-양성 또는 그람-음성 박테리아인 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   상기 미생물은 대장균, 살모넬라, 예르시니아 엔테로콜리티카, 비브리오 콜레라, 리스테리아 모노시토게네스, 및 시겔라로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   상기 미생물은 박테리아의 커버링인 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   상기 컴포넌트 I)은 "인터페론; 인터루킨; 프로아폽토티슈 단백질; 면역세포, 종양세포, 또는 상기 종양세포가 나오는 섬유세포에 대한 억제력을 가지거나 또는 세포독성을 가지는 항체 또는 항체단편; 항증식성 작용 단백질; 세포독성 단백질; 염증 유발인자, 특히, 인터루킨, 시토킨 또는 케모킨; 세포증식 억제 약물속으로 세포증식 억제 약물의 비활성 예비단계의 활성화 또는 분리를 위한 바이러스성, 박테리아성, 이스트성, 부드러운 동물성, 포유류성 또는 인간으로부터 나오는 효소, 세포-특이성 리간드 및 효소의 윱합 산물; 및 안지오게네스의 저해제" 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
8. 제 1 항 내지 제 7 항에 있어서,

   상기 컴포넌트 II) 는 "알부민, 트랜스페린, 헵토글로빈, 헤모글로빈, 알파1리포프로테인, 알파2 리포프로테인, β 1 리포프로테인 및 알파2 마크로글로불린"으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 혈액 플라스마 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

   상기 컴포넌트 III) 은 "종양세포; 종양내피세포; 종양이 나오는 섬유세포; 활성화된 내피세포; 마크로 파아지; 덴트리티스케 세포; 림포지텐" 으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 목표 기관에 특이적인 적어도 하나의 리간드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

    상기 컴포넌트 III) 은 "티로이드, 체스트 글란드, 살리바리 글란드, 림프드루제, 체스트 글란드, 가스트릭 무코사, 키드니, 오바르, 프로스타타, 세르빅스, 블레이더 무스코우스 막, 및 뮤테르말" 로 구성되는 그룹으로 부터 선택되는 섬유의 섬유 세포의 일 유형에 대해 특이적인 적어도 하나의 리간드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 피막성 미생물.
11. 제 1 항 내지 제 10항에 있어서,

    성분들 IV)는 대장균의 용혈운반신호를 줄기 점진부의 S-층 (Rsa A), 그리고 또는 대장균의 톨크 단백질을 대하여 코드화 하는 것을 특징으로 하는 미생물.
12. 제 1항 내지 제 11항에 있어서,

    성분들 D는 그람 양성의 박테리아의 세포용해 단백질에 대하여, 리스테리아모노시토진의 세포용해 단백질에 대하여, 라스테리아 모노시토진의 PLY 551에 대하여 그리고/또는 라스테리아 모노시토진의 홀린에 대하여 코드화 하는 것을 특징으로 하는 미생물.
13. 제 1항 내지 제 12항 중의 한항에 있어서,

    이 미생물에는 하나의 물질이 결합되어 있으며, 이 물질은 긴 혈액지속시간으 가지며, 특히 "알부민, 전송자, 프리알부민, 헤모글로빈, 합토글로빈, 알파-1-림포프로테인, 알파-2-림포 포르데인, ㅠ-1-립포프로테인, 알파-2-매크로 글로부린, 폴리에칠렌글리콜(PEG), 예를들면 폴리에칠렌이민, 덱스트린, 폴리제인, 하이드로에 칠전분 및 상기 재료들의 혼합물로 부터 되어 있는 그룹으로 부터 선택된 적어도 하나의 물질이 결합되어 있으며, 여기서 이 물질들은 물리적 흡수, 화학적흡수에 의하여 또는 등가적으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 미생물.
14. 성분 I ), II) 및 VI를 포함하고 그리고 또 선택적으로 성분들 III) 및 V의 하나 또는 다수를 포함하는 플라스미드 또는 압착벡터.
15. 제 1항 내지 제 3항중의 한항에 의한 유기물의 제조방법에 있어서,

    플라스미드는 제 14항에 의하여 제조디며 그리고 상기한 플리스미드를 가지고 미생물에 변환되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
16. 약품 조성물의 제조를 위하여 청구범위 제 1 항 내지 제 13항의 하나에 의한 미생물의 이용.
17. 특히 종양질환, 예를 들면 갑상선종양, 난소종양, 유방종양, 위종양, 신장종양, 임파선종양, 흑색종양, 자궁경부종양, 방광종양, 타액선종양 및/또는 임파선종양, 백혈병, 염증, 기관리펄션, 및 도는 자가면역질환과 같은 제어되지 않은 세포분열에 의해 야기되는 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 의약 조성물의 제조를 위한 미생물의 이용.
18. 종양이 나오고 있는 역시 건강한 조직과 같은 종양의 제거를 위한 청구범위제 17항에 의한 이용.
19. 제 16항 내지 제 18항 중의 한항에 의한 약품의 조성물의 제조방법에 있어서,

    구강의 i.m, i.v., 또는 i.p 투약량을 위하여 하나의 또는 다수의 생리적으로 친화할 수 있는 담체재료를 가지고 생리적으로 유효한 분량으로 청구범위 제 1항 내지 제 13항에 의한 피복된 미생물의 제조되어 질 수 있는 것을 특징으로 하는방법.